KR20100101248A

KR20100101248A - 리스테리아 오염 탐지용 특이단백질 부위 및 그에 대한 항체제조법과 활용

Info

Publication number: KR20100101248A
Application number: KR1020090019638A
Authority: KR
Inventors: 이기성; 김영호; 이광수; 길민석
Original assignee: 이기성
Priority date: 2009-03-09
Filing date: 2009-03-09
Publication date: 2010-09-17

Abstract

본 발명은 최근 국내에서는 수입식품이 개방화되고, 공장, 학교 등 단체 급식이 증가함에 따라 식품 위해 미생물에 의한 식중독 사고가 빈번하게 일어나고 있다. Listeria 는 동물과 사람에게 병원성을 갖고 있어 수막염(meningitis), 패혈증(septicemia), 자궁내 폐혈증 등의 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. Listeria을 검출하기 위한 특이 단백질로는 Listeria의 prfA 단백질을 선정하여, prfA유전자를 클로닝하고 과대발현시킨 후 분리 정제하는 데 성공하였으며, 정제된 25kDa 크기의 단백질을 수획하였다. 또한 특이 단백질인 prfA의 주요 domain의 펩타이드 서열을 검색하여 항원성과 특이성이 높은 지역의 서열을 펩타이드 합성하여 항원으로 이용하여 항체를 제작하였다. 이와 같이 제작된 항체를 바이오센서칩에 공정화하여 Listeria를 탐지할 수 있다. 제작된 골드칩은 비표지 방식인 SPR방식을 통해 Listeria를 검출하였다. 본 발명에서 수행한 Listeria의 특이 항체인 Listeria prfA rabbit polyclonal antibody는 다양한 바이오센서에 적용을 할 수 있고 병원성 미생물의 존재를 신속하게 검출할 수 있을 것이다.

리스테리아(Listeria), SPR(Surface plasmon resonance), 면역바이오센서, Listeria prfA rabbit polyclonal antibody, AFM, SPR(Surface plasmon resonance)

Description

리스테리아 오염 탐지용 특이단백질 부위 및 그에 대한 항체제조법과 활용 {Specific Protein Domain for the Detection of Listeria Contamination and its Antibody Manufacture Method and also their utilization}

본 발명은 장관감염으로 인체 병원성을 유발하는 Listeria속을 검출하기 위해 제작한 항체를 비표지 면역바이오센서칩의 분석·측정 방법인 SPR를 통해 신속한 반응과 높은 특이성을 측정하였고 보다 신속 정확한 Listeria속 세균 검출능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

기존 미생물 검출은 선택배지를 이용하여 배양한 후 세균의 성장 및 형태를 보고 감염여부를 판단하는 방법은 보통 pre-enrichment media, selective enrichment media, isolation on selective media를 사용하였고 생물학적 방법과 혈청학적 방법에 의해 추정적인 근거를 확인했다. 그러나 이러한 방법은 분석시간이 오래 걸리기 때문에 Listeria속의 존재를 검출하기 위해 병원균에 대한 특이적 검출 방법과 보다 신속한 검출방법을 확립하기 위한 방향으로 ELISA를 기본으로 하 는 항원-항체 반응실험, polynucleotide 또는 oligonucleotide probes를 사용하는 DNA hybridization assays와 PCR(polymerase chain reaction)를 통한 DNA 검출 기법 등 많은 방법들이 개발되었다. 특히 PCR를 기본으로 특정유전자를 검출, 증폭하는 방법은 병원성 세균 탐색에 있어서 높은 특이성을 갖는 것으로 보고되었다. 그러나 PCR을 이용한 방법들도 기존의 검출방법에 비해 높은 검출 특이성을 갖지만, 특정부위의 유전자를 증폭하는데 2시간~4시간이 걸린다. 또한 radio-immunoassay, fluorescence labeled antibody assay와 enzyme-link immunosorbent assays(ELISA)등과 같은 많은 immunoassay 기술이 개발되었지만 검출 비용이 고가이고 시간 오래 걸릴 뿐만 아니라, 전처리 과정이 복잡하다(Oh Byung-Keun. 2004 Surface plasmon resonance immunosensor for the detection of Salmonella typhimurium. Biosensors and Bioelectronics. 19:1497-1504).

한편 Surface plasmon resonance(SPR) 기술은 생체분자간의 상호작용을 측정하는 기술로 잘 알려져 있으며 high specificity과 sensitivity하게 복잡한 생물학적 매체 시료를 짧은 시간에 간단하게 탐색할 수 있는 장점을 가지고 있어 Listeria monocytogenes(Paul Leonard. 2004. A generic approach for the detection of whole Listeria monocytogenes cells in contaminated samples using surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 19:1331-1335), Vibrio cholerae O1(Jyoung Jy-Young. 2006. Immunosensor for the detection of Vibrio cholerae O1 using surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 21:2315-319), Salmonella((Oh Byung-Keun. 2004 Surface plasmon resonance immunosensor for the detection of Salmonella typhimurium. Biosensors and Bioelectronics. 19:1497-1504) 등의 다양한 병원성 세균 검출에 사용되고 있다. 그러나 국내환경에 서식하는 Listeria속에 대한 특이항체 및 적용가능한 면역바이오센서는 부족한 실태이다. 이에 본 발명에서 이를 해결하고자 하였다.

Listeria속 미생물검출은 생물학적 방법, 혈청학적 방법, DNA hybridization assays, PCR 등의 방법은 오랜 시간이 걸린며, 또한 radio-immunoassay, fluorescence labeled antibody assay, enzyme-link immunosorbent assays(ELISA)등은 검출비용의 고가, 오랜 소요시간, 전처리과정의 복잡, 숙련된 인력 필요 등 문제점이 있다. 또한 최신의 방법인 면역바이오센서는 부족한 실태이다.

Listeria에 대한 특이적 반응을 나타내는 항체를 새로이 제작하여 비표지 방법인 SPR을 통하여 리스테리아균을 검출하였다. 항체제작은 리스테리아균의 특이 단백질인 prfA protein을 domain search 및 peptide prediction을 통하여 prediction 1 peptide(17 mer ; KKYLETNGIKPKQFHK-C)로 결정하여 펩타이드 합성을 하였다. 합성한 펩타이드는 carrier 단백질과 융합하여 peptide-carrier complex 제작하여 이를 항원으로 사용하여 rabbit에 항체를 제작하였다. 이 항체를 이용한 비표지 면역바이오센서의 적용을 통한 Listeria의 검출하였다.

본 발명에서 수행한 Listeria의 특히 항체인 Listeria prfA rabbit polyclonal antibody는 다양한 바이오센서에 적용을 할 수 있고 병원성 미생물의 존재를 신속하게 검출할 수 있을 것이다.

Listeria의 prfA 단백질의 peptide 서열에 대한 domain search를 위하여 특이 항원성이 높은 부위의 peptide를 선택하였다. 선택된 peptide region의 hydrophobicity와 antigenecity를 검색하였다. 또한, 본 발명은 Peptide 항원이 항원가가 올라가기 힘들기 때문에 항체가를 상승시키기 위해 carrier 단백질을 결합시켜 면역하였다. carrier로 KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin)을 사용하였으며 BSA를 이용하여 결합시켰다. carrier와 결합시킨 peptide를 이용하여 emulsion을 제조하여 면역시켰다. 토끼 1마리당 emulsion 500㎍/0.5㎖씩 피하주사를 시행하였으며, 항원면역반응 측정을 위한 1차, 2차 3차 boosting은 각각 4주, 6주, 8주째에 동일한 항원을 IFA(Incomplete Freund’s adjuvant, Difco, Rockford)와 동일하게 혼합하여 토끼 1마리 당 200㎍/0.5㎖씩 피하주사 하였다. 각 boosting 단계마다 소량의 피를 채취하여 serum을 얻었고, 항체 생성여부 및 titer를 측정하였다. 3차 boosting 1주일 후 전채혈을 하였다. 소량의 피를 채취할 때는 꼬리 끝을 자른 후 피를 채취하며, 전채혈 시에는 심장채혈을 하였다.

항원의 주사로 유도된 면역반응은 토끼의 혈청에 존재하는 항체의 정도를 ELISA를 수행하여 결정하였다. 항체정제는 항원을 affinity-gel에 부착하여 column을 제작하여 항체를 분리하는 방법과 protein A를 이용한 column 방법을 통하여 정제하였고, 최종적으로 dialysis을 하였다. 그 결과 CTA는 15㎖(0.25㎎/㎖)를 CTB는 15㎖(1㎎/㎖)를 수획하였다. 제조된 항체는 50% glycerol이 포함된 PBS buffer에 녹여 -20℃에 보관하였고, Listeria에 특이적으로 반응하는 Ab로 사용하였다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> PCR에 의한 유전자 증폭

Listeria 균주에서 추출한 genomic DNA를 template DNA로 사용하였고, PCR 증폭은 Gene Cycle^TM(BIO-RAD Co.)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응용액은 제작된 primer(10pmol)를 각각 3㎕씩 첨가, template DNA(10ng Genomic DNA) 5㎕, 멸균증류수 39㎕를 PCR Mixer (Bioneer Co. Korea)에 첨가하여 혼합한 후 mineral oil을 첨가하였다. PCR 반응조건은 94℃ 4분간 denaturation을 1cycle, 94℃ 1min 동안 denaturation, 60℃ 1분간 annealing 72℃ 1min 30sec간 elongation과정을 30cycle 시행한 후, 72℃에서 10분 동안 final extension을 하였다. 증폭된 DNA는 0.8% agarose gel로 전기영동하여 확인하였다. 도1에 그 결과를 나타내었다.

1-1 primer

prfA-Up : (Pst/NdeⅠ) : 5'-gatcctgcagcatatgaacgctcaagcagaagaattc -3'

prfA-down : (Xho/SalⅠ) : 5'-gatcctcgaggtcgacattttcccaagtagcaggacatgc -3'

< 실시예 2> 항원 단백질의 클로닝 및 과대발현

Listeria의 genomic DNA를 추출하여 PCR 기법으로 증폭하여, 약 prfA(714bp) 크기의 유전자 조각을 획득하였다. 획득된되 유전자조각은 pBliscriptSK(+) 클로닝하여, E. coli인 DH5α 숙주에 형질 전환시켰다. 형질전환된 host cell를 배양하여 plasmid를 추출하여 overexpression vector인 pET22b(+)에 재클로닝하였다. prfA유전자가 클로닝되었음을 확인하였고, BL21(DE3)Lys competent cell에 형질전환시켜 숙주세포를 IPTG를 첨가하여 과발현을 유도 배양후, 항원단백질을 6시간 과대발현시켰다. 그 결과 prfA 단백질은 25kDa 크기의 단백질이 과대발현되었음을 확인하였다. 도2에 그 결과를 나타내었다.

2-1 Nucleotide sequence and amino acid sequence of the Listeria .

prfA gene .

< 실시예 3> His - Tag 을 이용한 prfA 의 분리정제

pET expression system을 이용하여 Listeria sp. 단백질인 prfA를 과발현한 후, Ni-NTA spin kit(Qiagen Co. Inc)를 사용하여 분리 정제하였다. SDS-PAGE를 시행하여 25kDa의 prfA 단백질을 분리정제하였다. 도3에 그 결과를 나타내었다.

< 실시예 4> peptide 의 제작

Listeria속을 검출하기 위한 특이 단백질로 결정한 prfA의 peptide 서열을 분석하여, 항체형성에 가장 적합한 peptide domain을 찾아 peptide 합성을 하였다.

Listeria의 prfA의 아미노산 서열에 대한 domain search에서는 유사성이 높은 특정 domain 부위로 peptide antibody를 만들 경우, 다른 비특이적 단백질을 검출할 수 있으므로 일반적인 domain 부위는 제외하였다. 또한 glycosylation site와 myristoylation site를 포함하는 region은 합성된 peptide와 expression된 단백질이 동일하지 않으므로 합성 peptide로 제작한 antibody로 detection 될 확률이 매우 낮아 제외하였다. 또한 Hydrophobicity가 낮고 antigenicity가 높은 지역이 일반적으로 specific antibody의 제작 가능성이 높으며, 3차 구조에서 외부로 노출되어 있을 가능성이 높은 지역을 선정하기 위해 prfA whole protein의 hydrophobicity와 antigenicity를 확인한 결과, prfA는 prediction 1부위가 가장 우수하였다.

Prediction한 peptide region이 다른 protein에 대한 homology search로 분 석한 결과, prfA prediction 1번에서 peptide antibody 제작에 좋은 위치이고, antigenicity와 hydrophobicity가 높은 위치이며, 다른 species에서 homology가 낮기 때문에 cross reactivity는 없을 것으로 판단됨에 따라 prfA은 prediction 1번으로 결정하여 펩타이드로 합성하였다. 도4에 그 결과를 나타내었다.

A. prfA

prediction 1 : KKYLETNGIKPKQFHK -C (17 mer )

prediction 2 : C- YVIKINELKELLSK (15 mer )

prediction 3 : GKETPDGIKITLDN -C (15 mer )

prediction 4 : SKLKQEKVIVYKNSC (15 mer )

prediction 5 : CFYVQNLDYLKRYAPK (16 mer )

< 실시예 5> 항체의 고정

SPR sensor chip CM5는 유리로 이루어진 판에 50nm의 두께로 금박이 입혀져 있으며 금박부분에는 dextran이 도포되어 있다. 실험재료 중 하나는 dextran표면에 고정되어 사용된다. Dextran면은 미세 유로 장치의 flow-cell부분과 접촉하여 유로 장치를 흘러가는 시료와 반응하게 된다. 센서칩 표면의 기종에 따라 둘 또는 네 개의 독립적인 유로 장치의 셀과 접촉하며, 필요에 따라 각 셀 별로 서로 다른 고정화 리간드를 사용하여 다양한 실험을 할 수 있다. 본 실험에서는 일반적으로 사용되는, 용액과 접촉하는 센서칩 표면에는 carboxyl기가 음성전하를 갖으며, dextran 은 glucose의 직선형 중합체로서 생체 물질과의 비특이적인 결합이 거의 없고, 용액 중 생체 물질의 농도가 매우 낮아도 매우 효과적으로 리간드를 고정화할 수 있는 CM5 chip을 사용하여 실험을 했다. 실험에 앞서 최적의 항체고정화를 위해 10mM Sodium aetate(pH4.5-5.0)에 preconcentration하고 EDC/NHS를 injection하여 Sensor chip 표면을 활성화시켰다. 항체를 10mM sodium acetate(pH5.0)에서 100ug/ml로 희석하여 1분(5μl/min) 동안 injection했고. 1M ethanolamine(pH 8.5)으로 미반응 활성기들을 Blocking하고 CM5 chip 항체를 고정화하였고 고정화값은 도5 에 나타내었다.

< 실시예 6> Listeria cell 의 농도별 굴절률 변화

Cell농도를 PBS beffer에 희석해서 sensor chip surface에 15분(1μl/min)동안 interaction을 했다. 그 결과를 도6 에 나타내었다. 세포 농도의 변화에 따라 매우 비례적으로 바이오 센서칩이 작용하였다.

< 실시예 7> AFM ( Atomic force microscopy analysis )

Aantibody와 cell의 binding의 surface topography를 연구하기 위해 atomic force microscopy를 사용하였다. 세균세포가 바이오센서칩에 반응·결합된 상태가 AFM의 2차원(도7), 3차원(도8) 영상에 잘 일치되었다.

도 1은 본 발명의 Listeria 특이유전자를 증폭과정을 도식화하여 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 Listeria를 검출하기 위한 protein을 과발현시키는 과정을 도식화하여 나타낸 것이고,

도 3은 Listeria의 항체제작을 위해 특이단백질을 순수분리정제하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이고,

도 4는 Listeria의 항체제작을 위한 과정을 도식화하여 나타낸 것이고,

도 5는 골드칩에 제작한 항체를 고정화시키는 과정을 도식화하여 나타낸 것이고,

도 6은 고정화된 항체에 Cell과 Ag을 흘려 반응하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이고,

도 7은 항체와 Cell과의 surface topography을 확인하는 AFM 2차원 결과를 도식화하여 나타낸 것이고,

도 8은 항체와 Cell과의 surface topography을 확인하는 AFM 3차원 결과를 도식화하여 나타낸 것이다.

Claims

Listeria prfA의 prediction 1 peptide(17 mer ; KKYLETNGIKPKQFHK-C) 항체제작과 이의 활용.