JPH09301995A - 新規なポリペプチド及びそれを用いる生体成分測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生体試料中の測定対象物質と、該測定対象物
質に対して結合能（親和性）を有する物質（以下、結合
能物質と略記する。）との相互作用の結果生じる複合体
と、遊離の結合能物質等や該複合体の検出に影響を与え
る恐れのある共存物質とをＨＰＬＣを用いて分離する際
に、該複合体と遊離の結合能物質等とをより効果的に分
離するために用いることのできる新規なポリペプチド
と、このポリペプチドを使用した生体試料中の測定対象
物質の測定方法の提供。 【解決手段】 （１）強酸由来の酸残基を少なくとも３
個有するポリペプチド、（２）該ポリペプチドと結合能
物質との結合物、及び（３）生体試料と、該ポリペプチ
ドと結合能物質との結合物を含んでなる試薬とを反応さ
せ、次いで生じた複合体を陰性電荷を利用する方法によ
り分離し、該複合体量若しくは遊離の該結合物量に基づ
いて生体試料中の測定対象物質量を求めることを特徴と
する生体成分測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、強酸由来の酸残基
を有する新規なポリペプチド及び該ポリペプチドを利用
した、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リン
パ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中の測定対
象物質の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ある特定の物質同士、例えば抗原と抗
体、プロテアーゼとその蛋白性プロテアーゼインヒビタ
ー、糖鎖とレクチン、酵素とそれに対する基質や補酵
素、ホルモン等の生理活性物質とそれに対するレセプタ
ーや輸送蛋白、２本鎖ＤＮＡの１対のポリヌクレオチド
鎖等は、互いに強い相互作用を及ぼしあい（即ち、互い
に親和性を示し）、強固な複合体を形成することが知ら
れている。

【０００３】このような相互作用を利用した試料中の測
定対象物質の測定方法としては、固相上に上記した如き
組合せの物質同士の反応により生ずる複合体を形成させ
た後に、該固相を利用して所謂Ｂ／Ｆ分離を行う、例え
ば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）（例えば特開平1ー2270
61号公報、特開平3ー44399号公報等に記載の方法）等
や、本発明者等の一部が開発した高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を用いて複合体と遊離の測定対象物
質との分離、所謂Ｂ／Ｆ分離を行う方法（例えば特開平
2−28557号公報、特開平3−206964号公報、特開平3−22
1865号公報、特開平6ー66800号公報等に記載の方法）等
が挙げられる。

【０００４】このような測定方法に於いては、Ｂ／Ｆ分
離をいかに効率よく行うかによって測定の精度や分析に
要する時間がある程度左右されるため、該Ｂ／Ｆ分離方
法について種々の検討がなされている。例えば、特開平
1ー227061号公報、特開平3ー44399号公報等の固相を利用
してＢ／Ｆ分離を行う方法や、特開平6ー66800号公報等
に開示されたＨＰＬＣを用いてＢ／Ｆ分離を行う方法に
於いては、例えば生体試料中の測定対象物質に対する抗
体等にアニオン性物質を予め結合させておき、所謂Ｂ／
Ｆ分離を、該測定対象物質とこれに対する抗体との複合
体中の該アニオン性物質の性質（陰イオン性）を利用し
て行っている。

【０００５】これらの方法は、Ｂ／Ｆ分離を従来よりも
効率よく行うことができる方法ではあるが、使用されて
いるアニオン性物質は何れに於いてもポリアミノ酸に由
来するものであって、そのカルボキシル基由来のアニオ
ン性を利用してＢ／Ｆ分離を行っているため、本願発明
者らが開発したＨＰＬＣを用いてＢ／Ｆ分離を行う方法
に於いては若干問題のある方法等であった。

【０００６】即ち、ＨＰＬＣを用いる方法に於いてはＢ
／Ｆ分離と共に、該複合体を試料中に共存する測定に影
響を与える恐れのある物質や遊離の抗体等と分離する必
要があるが、このような分離をポリアミノ酸由来のカル
ボキシル基のアニオン性を利用して充分に行うために
は、該アニオン性物質中にカルボキシル基を約200個程
度（アミノ酸残基として200個程度）は導入しなければ
ならなかった。そのため、先ず、該アニオン性物質の調
製に手間が掛かるという問題、更には均一の分子量を有
するアニオン性物質を大量に調製することが困難なた
め、このようなアニオン性物質を利用してＨＰＬＣによ
りＢ／Ｆ分離を行うと、分離の際にピークがテーリング
又はリーディングして、測定の精度が低下する場合があ
るという問題があった。また、ポリグルタミン酸等のカ
ルボキシル基を有するポリアミノ酸を分離のために用い
た場合、非特異的反応が生じ、盲検値（ブランク値）や
測定値が上昇する等の現象が起こる場合があるので、こ
れを防止するために、例えばγ-ポリグルタミン酸等の
適当なポリマーアニオンを添加する必要が生じる等の問
題もあった。そのため、更なる改良が求められている現
状にある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如
き状況に鑑みなされたもので、生体試料中の測定対象物
質と、該測定対象物質に対して結合能（親和性）を有す
る物質（以下、結合能物質と略記する。）との相互作用
の結果生じる複合体と、遊離の結合能物質等や該複合体
の検出に影響を与える恐れのある共存物質とを陰性電荷
を利用する方法を用いて分離する際に、該複合体と遊離
の結合能物質等とをより効果的に分離するために用いる
ことのできる新規なポリペプチド並びにこのポリペプチ
ドを使用した生体試料中の測定対象物質の測定方法を提
供することをその目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、強酸由来の酸
残基を少なくとも３個有するポリペプチドの発明であ
る。また、本発明は、該ポリペプチドと、生体試料中の
測定対象物質に対して結合能を有する物質との結合物の
発明である。更にまた、本発明は、該ポリペプチドのＮ
末端にスペーサーを介してマレイミド基が結合した化合
物の発明である。更にまた、本発明は、該ポリペプチド
と、生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有する
物質との結合物を含んでなる、生体試料中の測定対象物
質測定用試薬の発明である。更にまた、本発明は、生体
試料と、該ポリペプチドと生体試料中の測定対象物質に
対して結合能を有する物質との結合物を含んでなる試薬
とを反応させ、次いで生じた複合体を陰性電荷を利用す
る方法により分離し、該複合体量に基づいて生体試料中
の測定対象物質量を求めることを特徴とする生体成分測
定方法の発明である。

【０００９】即ち、本発明者らは、生体試料中の測定対
象物質と結合能物質との相互作用の結果生じる複合体
と、遊離の結合能物質［又は遊離の測定対象物質。尚、
該測定対象物質は、何らかの方法により検出可能な物質
（以下、検出物質と略記する。）により標識されていて
もよい。］等の該複合体の検出に影響を与える恐れのあ
る共存物質との分離を陰性電荷を利用する方法を用いて
行なう際に、該複合体と遊離の結合能物質等とをより明
確に分離し得る方法を求めて鋭意研究の途上、該複合体
に更に該複合体の性質を変化させ得る適当な性質を有す
る物質（以下、分離向上物質と略記する。）を結合さ
せ、且つ該分離向上物質の性質に基づいて該複合体と遊
離の結合能物質（又は遊離の測定対象物質）等の該複合
体の検出に影響を与える恐れのある共存物質との分離操
作を行った場合には、分離向上物質を適宜選択して用い
ることにより該複合体の溶出位置を自在に調節すること
が可能となること、言い換えれば、適当な分離向上物質
を該複合体に結合させることにより該複合体と遊離の結
合能物質等とをより明確に分離し得ることを見出し、先
に特許出願している（特開平6-66800号公報）。しかし
ながら、この方法に於いて、該複合体にアニオン性の分
離向上物質を結合させて該複合体の分離を行おうとした
場合には、上で述べた如き問題が生ずる場合があった。
このような問題が生ずることのないアニオン性分離向上
物質を見出すべく、本発明者らが更に鋭意研究を行った
結果、強酸由来の酸残基を少なくとも３個有するポリペ
プチドをアニオン性分離向上物質として用いることによ
り、上で述べた如き問題を解消し得ることを見出し本発
明を完成するに至った。

【００１０】本発明のポリペプチドは、強酸由来の酸残
基を少なくとも３個有するポリペプチドであればよく、
構成するアミノ酸残基の種類及び数は特に限定されない
が、合成の容易さ等を考慮すると、アミノ酸残基の総数
は通常３〜30程度、好ましくは５〜15程度の範囲から適
宜選択される。また、強酸としては、pKaが３以下の
酸、例えば塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸が挙げ
られる。本発明に於ける強酸由来酸残基とは、該強酸に
由来する酸残基を意味する。また、本発明に於ける酸残
基とは、該強酸から水素原子がとれたものをいう。アミ
ノ酸残基とは、アミノ酸のＮ末端の水素原子とＣ末端の
水酸基がとれたものをいう。

【００１１】本発明のポリペプチドに於いて、上記した
如き酸残基は通常ポリペプチドの反応活性基に導入され
るが、該反応活性基としては、ポリペプチド中の例えば
遊離の水酸基、アミノ基、イミノ基、チオール基等が挙
げられる。尚、ポリペプチドの主鎖のアミノ基（ポリペ
プチドのＮ末端のアミノ基）も該反応活性基として使用
可能であるが、該ポリペプチドを分離向上物質として使
用する場合には、該アミノ基には該酸残基を導入しない
方が好ましい。即ち、ポリペプチドのＮ末端のアミノ基
を、ポリペプチドと結合能物質とを結合させる際に利用
すれば、ポリペプチドと結合能物質との結合様式をある
程度一定にできるので、このようにして得られたポリペ
プチド（即ち、分離向上物質）が結合した結合能物質を
生体試料中の測定対象物質の測定に用いれば、より精度
よく目的の測定を実施し得るからである。

【００１２】本願発明のポリペプチドとしては、例えば
下記一般式［Ｉ］ Ａ−（Ｒ）m−Ｂ ［Ｉ］ （式中、ｍは３以上の整数を表し、好ましくは３〜30、
より好ましくは３〜20、更に好ましくは４〜20、更によ
り好ましくは５〜15であり、ｍ個のＲの内少なくとも３
個は強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸残基であ
り、残りのＲは強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸
残基又は当該強酸由来の酸残基が導入されていないアミ
ノ酸残基の何れかを表す。尚、Ｒとして表される強酸由
来の酸残基が導入されたアミノ酸残基及び当該強酸由来
の酸残基が導入されていないアミノ酸残基の種類は、同
一でも異なっていてもよく、また、側鎖の反応活性基に
保護基等が導入されていてもよく、その結合順序も任意
である。Ａは水素原子、強酸由来の酸残基又はアミノ酸
のＮ末端アミノ基の保護基を表し、Ｂは水酸基又はアミ
ノ酸のＣ末端カルボキシル基の保護基を表す。）、一般
式［II］ Ａ−（Ｒ¹）m'−Ｂ ［II］ ［式中、Ｒ¹は強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸
残基を表し、ｍ'は３以上の整数を表し、好ましくは３
〜30、より好ましくは３〜20、更に好ましくは４〜20、
更により好ましくは５〜15であり、Ａ及びＢは前記に同
じ。尚、ｍ個のＲ¹（強酸由来の酸残基が導入されたア
ミノ酸残基）の種類は、同一でも異なっていてもよく、
その結合順序も任意である。］、一般式［III］ Ａ−（Ｒ¹）m'−（Ｒ²）n−Ｂ ［III］ ［式中、Ｒ²は強酸由来の酸残基を有さないアミノ酸残
基を表し、ｎは自然数を表し、Ｒ¹、ｍ'、Ａ及びＢは前
記に同じ。尚、ｎ個のＲ²（アミノ酸残基）の種類は、
同一でも異なっていてもよく、その結合順序も任意であ
る。また、ｍ個のＲ¹とｎ個のＲ²の結合順序も任意であ
る。また、（m'＋n）は通常４〜31、好ましくは４〜2
1、より好ましくは５〜21、更に好ましくは６〜16であ
る。］、で示されるもの等が挙げられる。

【００１３】本発明のポリペプチド（上記の一般式で表
されるものを含む）を生体試料中の測定対象物質を測定
する際の分離向上物質として使用する場合には、該ポリ
ペプチドに於ける強酸由来の酸残基は、例えば硫酸、リ
ン酸等の多価強酸由来の酸残基が好ましい。尚、生体試
料中にはホスファターゼが共存する可能性もあるので中
でも、特にポリペプチドを分離向上物質として使用する
場合には、硫酸残基が望ましい。また、該酸残基は、本
発明のポリペプチド中に少なくとも３個存在していれば
よいが、該酸残基の数が多すぎると分離向上物質とし使
用し難い（例えば、陰イオン交換法による分離の際に分
離やカラム等からの溶出が難しくなる）ので、分離向上
物質として使用する場合の該酸残基の数としては、通常
３〜30個、好ましくは３〜20個、より好ましくは４〜20
個、更に好ましくは５〜15個の範囲から適宜選択され、
アミノ酸残基の総数としては、合成の容易さ等を考慮す
ると、通常３〜30程度、好ましくは３〜20個程度、より
好ましくは４〜20個、更に好ましくは５〜15程度の範囲
から適宜選択される。尚、該酸残基が３個よりも少ない
と、分離向上物質に基づく分離のピークと血清成分由来
の溶出ピークとが重なり測定（分析）精度が低くなる、
という問題が生ずる。また、分離向上物質に基づく分離
のピークと血清等の生体試料中の成分に由来する溶出ピ
ークとの重なりを排除し、より測定精度を高めるために
は、該酸残基数は４個以上、好ましくは５個以上である
ことが望ましい。更にまた、強酸由来の酸残基として硫
酸残基を導入する場合には、硫酸残基導入後の水溶液中
での安定性を考慮すると、チロシン残基のフェノール性
水酸基を利用して導入することが望ましい。

【００１４】本発明のポリペプチドに於いて、強酸由来
の酸残基が導入されたアミノ酸残基としては、遊離の反
応活性基を有するアミノ酸残基であって該反応活性基に
強酸由来の酸残基が導入されたものであればよく特に限
定されない。より具体的には、例えばチロシン，セリ
ン，トレオニン等の遊離の水酸基を有するアミノ酸残
基、例えばリジン，アルギニン等の遊離のアミノ基を有
するアミノ酸残基、例えばヒスチジン，トリプトファ
ン，プロリン，オキシプロリン等の遊離のイミノ基を有
するアミノ酸残基、例えばシステイン等の遊離のチオー
ル基を有するアミノ酸残基であって、これらの例えば水
酸基，アミノ基，イミノ基，チオール基等の遊離の反応
活性基に強酸由来の酸残基が導入されたもの等が挙げら
れる。尚、強酸由来の酸残基の導入のし易さ等を考慮す
ると、例えばセリン、トレオニン、チロシン等のアミノ
酸残基が好ましく挙げられる。また、本発明のポリペプ
チドに於ける強酸由来の酸残基を有さないアミノ酸残基
としては、通常ペプチド化学の分野でアミノ酸残基と認
められるものであればよく特に限定されないが、例えば
アラニン、グリシン、βーアラニン等のアミノ酸の残基
が好ましいものとして挙げられる。

【００１５】本発明のポリペプチドは、適当な数の遊
離の活性反応基を有するポリペプチドの少なくとも３個
の遊離の活性反応基に強酸由来の酸残基を導入する方法
（J.Chem.Soc.Perkin Trans I,(1990),1739-1744等）、
強酸由来の酸残基が導入されたアミノ酸を合成原料と
して、強酸由来の酸残基を少なくとも３個有するポリペ
プチドを合成する方法（Chem.Pharm.Bull.,41(2),(199
3),376-380等）、等により合成すればよい。尚、目的の
ポリペプチドの収率等を考慮すると、上記の方法の内、
の方法の方が好ましい（特に、アミノ酸残基数が多く
なった場合。）。但し、上記の方法では、硫酸化反応
を行う必要がないので、得られたポリペプチドのＮ末端
に、例えばマレイミドカプロン酸残基等の、抗体等の結
合能物質と結合し得る官能基を直接導入することができ
るので、得られたポリペプチドをすぐに結合能物質と結
合させることができるという利点はある。

【００１６】ポリペプチド又はアミノ酸の遊離の活性反
応基に、強酸由来の酸残基を導入する方法としては、例
えば水酸基、アミノ基、イミノ基、チオール基等の遊離
の反応活性基に強酸由来の酸残基を導入し得る方法であ
ればよく特に限定されない。より具体的には、例えばチ
ロシン，セリン，トレオニン等の遊離の水酸基を有する
アミノ酸（又はこれらアミノ酸の残基を有するポリペプ
チド）と、該アミノ酸（残基）の遊離の水酸基に対して
１〜20倍当量の例えばHSO₃・Cl，HSO₃・シ゛メチルホルムアミト゛，HS
O₃・ヒ゜リシ゛ン等の硫酸化剤や例えば塩化ホスホリル，三塩
化リン等のハロゲン化リン等のリン酸化剤とを、例えば
ジメチルホルムアミド（DMF），ジメチ ルスルホキシド
（DMSO）等の溶媒（無水）中、例えばピリジン，トリエ
チルアミン，NaH等のアルカリ性物質を触媒として０〜4
0℃、１〜24時間反応させて、該アミノ酸残基の水酸基
に強酸由来の酸残基を導入する方法、例えばリジン，ア
ルギニン等の遊離のアミノ基を有するアミノ酸（又はこ
れらアミノ酸の残基を有するポリペプチド）或は例えば
ヒスチジン，トリプトファン，プロリン，オキシプロリ
ン等の遊離のイミノ基を有するアミノ酸（又はこれらア
ミノ酸の残基を有するポリペプチド）と、該アミノ酸
（残基）の遊離のアミノ基（又は／及びイミノ基）に対
して１〜20倍当量の例えばHSO₃・Cl，HSO₃・シ゛メチルホルムアミト
゛，HSO₃・ヒ゜リシ゛ン等の硫酸化剤や例えば塩化ホスホリル，
三塩化リン等のリン酸化剤とを、例えばジメチルホルム
アミド（DMF），ジメチルスルホキシド（DMSO）等の溶
媒（無水）中、例えばピリジン，トリエチルアミン，Na
H等のアルカリ性物質を触媒として０〜40℃、１〜24時
間反応させて、該アミノ酸残基のアミノ基（又は／及び
イミノ基）に強酸由来の酸残基を導入する方法等が挙げ
られる。尚、合成の容易さや導入された酸残基の水溶液
中での安定性や生体試料中に存在する例えばフォスファ
ターゼ等の酵素等に対する安定性等を考慮すると、本発
明に係る強酸由来の酸残基としては、硫酸残基がより好
ましい。

【００１７】また、本発明のポリペプチドの原料とな
る、例えば水酸基、アミノ基、イミノ基、チオール基等
の遊離の反応活性基を有するポリペプチドは、市販品を
用いてもよいし、ペプチド化学の分野で汎用される常
法、例えば活性エステル法、混合酸無水物法、アジド法
等（「ペプチド合成の基礎と実験」、89〜142頁、泉屋
信夫等著、昭和60年１月20日、丸善(株)）により合成し
たものを用いてもよい。尚、このようなポリペプチドを
合成するに際して、Ｎ末端のアミノ基の保護基として
は、次の硫酸化工程で安定なもの（酸性条件ではずれる
保護基は不適当）が好ましく、例えばアルカリ性条件で
はずれる9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基
等のウレタン型保護基等が好ましく挙げられる。また、
アミノ酸（残基）の側鎖の反応活性基の保護基は、例え
ばポリペプチドの合成条件、強酸由来の酸残基の導入条
件等を考慮して適宜選択すればよく、例えばt-ブチル
基、ベンジル基等が好ましく挙げられる。

【００１８】本発明に係る結合能物質としては、測定対
象となる生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有
する物質であれば特に限定されることなく挙げられる。
具体的には、例えば生体試料中の測定対象物質に対して
結合能を有する例えば抗体、抗原、例えばコンカナバリ
ンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダ
ツラレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、例え
ばアミラーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），グルタミ
ン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵
素に対するインヒビター、測定対象物質としての核酸鎖
に相補的なポリヌクレオチド、例えば甲状腺刺激ホルモ
ン，アセチルコリン，グルタミン酸等に対するレセプタ
ー等が好ましく挙げられる。

【００１９】本発明に係る結合能物質と本発明のポリペ
プチドの結合物（以下、本発明の結合物、と略記す
る。）の調製方法は、該結合能物質の特定反応基と該ポ
リペプチドの特定反応基とを結合させる方法、該結合能
物質の特定反応基を該ポリペプチドで置換する方法、該
結合能物質に対して結合能のある物質（例えば抗体、レ
クチン、抗原、インヒビター、ＤＮＡ等）を介して該結
合能物質と該ポリペプチドとを結合させる方法等が挙げ
られる。具体的には、例えば１）自体公知の酵素免疫測
定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）或は
蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等に於いて一般に行われてい
る自体公知の標識物質と抗体との結合方法（例えば、医
学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書
店、1971；図説蛍光抗体、川生明著、第１版、(株)ソフ
トサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河
合忠、宮井潔編、第２版、医学書院、1982、等）、２）
自体公知の物質の修飾および結合方法（例えば、蛋白質
の化学修飾〈上〉〈下〉、瓜谷郁三、志村憲助、中村道
徳、船津勝編集、第１版、(株)学会出版センター、198
1；ポリエチレングリコール修飾タンパク質、稲田祐二
他、生化学、第62巻、第11号、P1351ー1362、(社)日本生
化学会、1990；DNA PROBES, George H.K. and Mark M.
M. STOCKTON PRESS,1989等）等が何れも例外なく挙げら
れ、これらの方法に準じて行えばよい。

【００２０】該結合能物質の特定反応基と該ポリペプチ
ドの特定反応基とを結合させる方法の具体例を挙げる
と、例えば、先ず、本発明のポリペプチドのＮ末端にス
ペーサーを介してマレイミド基が結合した化合物（以
下、本発明のマレイミド化合物と略記する。）と、常法
により調製した抗体のFab'のＳＨ基とを反応させて、本
発明のポリペプチドと結合能物質（抗体）との結合物を
調製する方法が挙げられる。ここで用いられる本発明の
マレイミド化合物は、例えば下記の如き一般式[IV]〜[V
I]で表される化合物である。 一般式［IV］ Ｄ−Ｅ−（Ｒ）m−Ｂ ［IV］ （式中、Ｄはマレイミド基を表し、Ｅはスペーサーを表
し、Ｒ、ｍ及びＢは前記に同じ。） 一般式［V］ Ｄ−Ｅ−（Ｒ¹）m'−Ｂ ［V］ （式中、Ｄ、Ｅ、Ｒ¹、ｍ'及びＢは前記に同じ。） 一般式［VI］ Ｄ−Ｅ−（Ｒ¹）m'−（Ｒ²）n−Ｂ ［VI］ （式中、Ｄ、Ｅ、Ｒ¹、Ｒ²、ｍ'、ｎ及びＢは前記に同
じ。） ここに於いて、これら一般式中でＥで表されるスペーサ
ーとしては、本発明のポリペプチドのＮ末端とマレイミ
ド基とをその両端に結合させ得る性質と、本発明のマレ
イミド化合物が本発明に係る結合能物質（抗体）と結合
するのを妨げない性質とを有するものであれば良く特に
限定されないが、例えば−Ｒ⁴−ＣＯ−で示される基
（式中、Ｒ⁴は２価の炭化水素基を表す。）、より具体
的には例えば下記一般式[VII]〜［IX］ −（ＣＨ₂）p−ＣＯ− [VII] （式中、ｐは１〜１０の整数を表す。）

【化１】 （式中、ｑ及びｒは０又は１〜５の整数を表す。）

【化２】 （式中、ｑ及びｒは前記に同じ。）で示される基が挙げ
られる。尚、一般式［VII］〜［IX］中のアルキレン
基、フェニレン基及びシクロヘキシレン基には置換基が
導入されていてもよく、そのような置換基としては、例
えばメチル基，エチル基，プロピル基，ブチル基等の炭
素数１〜４の低級アルキル基（直鎖状、分枝状の何れに
ても可。）、例えば水酸基，カルボキシル基，スルホ
基，アミノ基等の親水性を有する基等が挙げられる。本
発明のマレイミド化合物は、例えば以下の方法により容
易に得ることができる。即ち、本発明のポリペプチド
と、該ポリペプチドのＮ末端のアミノ基に対して１〜10
0倍モル、好ましくは１〜50倍モル、より好ましくは1.2
〜10倍モルの２価性架橋剤（一方の末端にマレイミド基
を有し、他方にアミノ基と反応し得る基を有する化合
物）、要すれば該アミノ基に対して２〜５倍モルの反応
促進剤とを、pH６〜９の適当な緩衝液若しくは適当な有
機溶媒中で、４〜37℃で0.2〜10時間反応させた後、反
応液を適当なカラムクロマトグラフィーにより精製する
ことにより本発明のマレイミド化合物を得ることができ
る。上記反応に於いて用いられる２価性架橋剤として
は、最終的にマレイミド基を本発明のポリペプチドのＮ
末端に導入し得るものであれば特に限定されないが、例
えばマレイミド基とスクシンイミド基とを有する架橋剤
等が挙げられ、より具体的にはスクシイミジル-N-4-マ
レイミドブチレート、スクシイミジル-N-6-マレイミド
カプロイレート、スクシイミジル-N-8-マレイミドカプ
リレート、スクシイミジル-N-11-マレイミドウンデカノ
エート、スクシイミジル-N-4-(2-マレイミドエトキシ)
スクシニレート、スルホスクシイミジル-N-4-マレイミ
ドブチレート、スルホスクシイミジル-N-6-マレイミド
カプロイレート、スルホスクシイミジル-N-8-マレイミ
ドカプリレート、スクシイミジル-N-11-マレイミドウン
デカノエート、スクシイミジル-4-(N-マレイミドメチ
ル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホスクシ
イミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カ
ルボキシレート、スクシミジル-m-マレイミドベンゾエ
ート、スルホスクシイミジル-m-マレイミドベンゾエー
ト、スクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレ
ート、スルホスクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニ
ル)ブチレート等が好ましく挙げられる。また、反応促
進剤としては、例えばトリエチルアミン、ピリジン等の
塩基が挙げられる。反応時の溶媒として用いられるpH６
〜９の緩衝液としては、例えばこのようなpＨを有する
リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝液、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシ
ン（Bicine）緩衝液、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピ
ペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）緩衝液、3-モル
ホリノプロパンスルホン酸（MOPS）緩衝液等のグッド緩
衝液等が挙げられ、有機溶媒としては例えばジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）等が挙げられる。また、反応終了後に本発明のマレ
イミド化合物を精製するために用いられるクロマトグラ
フィーとしては、例えばゲルカラムクロマトグラフィ
ー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、オクタデシ
ルシリカゲル（ＯＤＳ）カラム液体クロマトグラフィー
等が挙げられる。尚、反応時の溶媒としては有機溶媒の
方が好ましい。即ち、有機溶媒中での方がマレイミド基
の分解が少ないため、結果的に高収率で本発明のマレイ
ミド化合物を得ることができるからである。また、精製
もＯＤＳカラム液体クロマトグラフィーにより行う方
が、過剰な２価性架橋剤と本発明のマレイミド化合物と
をより明確に分離し得るので望ましい。上記の如くして
得られた本発明のマレイミド化合物は、例えば濃縮乾
固、凍結乾燥等により処理することにより、安定に保存
可能であるので、本発明のポリペプチドを本発明に係る
適当な結合能物質（抗体）に結合するための中間体とし
て極めて有用性の高いものである。また、本発明のマレ
イミド化合物と本発明に係る結合能物質とを結合させて
本発明のポリペプチドと結合能物質との結合物を得る方
法としては、例えば以下の如く行えばよい。即ち、本発
明のマレイミド化合物と、常法により調製した抗体のFa
b'のＳＨ基とを、該抗体の性質を失わせしめないような
溶液（例えば免疫学的測定法の分野で通常用いられる緩
衝液等）中で４〜37℃で１〜16時間反応させることによ
り、本発明のポリペプチドと結合能物質（抗体）との結
合物を調製することができる。

【００２１】また、本発明のポリペプチドのアミノ基と
結合能物質のアミノ基とを結合させる方法としては、例
えば自体公知のグルタールアルデヒド法等が挙げられ、
本発明のポリペプチドのアミノ基と結合能物質の糖鎖と
を結合させる方法としては、例えば該糖鎖を過ヨウ素酸
で処理してアルデヒド基を形成させこのアルデヒド基と
本発明のポリペプチドのアミノ基とを結合させる自体公
知の過ヨウ素酸法等が挙げられる。

【００２２】尚、結合能物質に、本発明のポリペプチド
を結合させる場合、該ポリペプチドの側鎖の反応活性基
を利用して行ってもよいが、Ｎ末端のアミノ基を利用し
て行うことが望ましい。

【００２３】即ち、Ｎ末端のアミノ基は通常は一つしか
ないので、これを利用して結合能物質と結合させると、
本発明のポリペプチドと結合能物質との結合モル比は
１：１となる。そのため、該結合物を使用して測定対象
物質の分離を行うと、１のピークとして分離されてくる
から、目的の測定の精度をより向上させることができる
からである。尚、本発明のマレイミド化合物は、このよ
うな結合物を調製するために有用な物質である。

【００２４】また、Ｎ末端のアミノ基を利用して本発明
の結合物を調製する場合、本発明のポリペプチドのＮ末
端のアミノ酸残基には強酸由来の酸残基を導入しない方
が望ましい。即ち、このような本発明のポリペプチドと
結合能物質とを結合させる方が、目的の結合物の収率が
高くなるからである。

【００２５】本発明の結合物を利用した生体成分の測定
方法（以下、「本発明の測定方法」と略記する。）とし
ては、本発明の結合物を用いて目的の測定を実施し得る
方法であれば特に限定されないが、具体的には例えば以
下のような方法が挙げられる。 (1)非競合反応を利用した生体試料中の測定対象物質量
の測定方法（測定方法(1)） 先ず測定対象物質を含む生体由来の試料と、検出物質に
より標識された結合能物質（以下、「標識結合能物質」
と略記する。）と、本発明の結合物（測定対象物質に於
ける、標識結合能物質の結合部位と、本発明の結合物の
結合部位とは異なっている）とを、要すれば適当な緩衝
液中に添加、混合して反応させ、生体試料中の測定対象
物質と、標識結合能物質と、本発明の結合物とが結合し
た複合体を形成させた後、該複合体と遊離の標識結合能
物質とを、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン交
換クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬ
Ｃ装置装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有す
る反応チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具
等（陰イオン交換法）を使用して分離する。次いで、分
離された該複合体に含まれる検出物質の量を、検出物質
の性質に応じた測定方法により求める。別に、測定対象
物質濃度既知の試料を用い同様の方法により測定を行な
い、生体試料中の測定対象物質量と該複合体中の検出物
質の量との関係を表わす検量線を作成し、これを用い
て、複合体中の検出物質の量に対応する生体試料中の測
定対象物質量を求めれば、生体試料中の測定対象物質量
が求められる。 上記反応に於て、複合体を形成させる
際の標識結合能物質及び本発明の結合物の使用濃度とし
ては、生体試料中の測定対象物質の検量限界をどの程度
に設定するかによっても変動はあるが、通常は反応液中
に於て、設定された検量限界濃度に相当する生体試料中
の測定対象物質全てと結合し得る濃度以上、好ましくは
その２倍濃度以上、より好ましくは５倍濃度以上、更に
好ましくは10倍以上が反応液中に存在していることが望
ましい。尚、測定対象物質自身が何らかの方法により測
定（検出）可能な物質である場合には、標識結合能物質
を用いずに上記の反応を行ない、得られた複合体中の測
定対象物質の性質に応じた測定方法により求めることに
よっても、同様に試料中の生体試料中の測定対象物質量
を求めることができる。

【００２６】(2)競合反応を利用した生体試料中の測定
対象物質量の測定方法（測定方法(2)） 先ず測定対象物質を含む生体由来の試料、検出物質によ
り標識された測定対象物質（以下、標識測定物質と略記
する。）、本発明の結合物とを、要すれば適当な緩衝液
中に添加、混合して反応させ、生体試料中の測定対象物
質と本発明の結合物との複合体、及び標識測定物質と本
発明の結合物との複合体（以下、標識複合体と略記す
る。）を形成させた後、標識複合体と、遊離の標識測定
物質とを、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン交
換クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬ
Ｃ装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反
応チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等を
使用して分離する。次いで、分離された標識複合体に含
まれる検出物質の量を、検出物質の性質に応じた測定方
法により求める。別に、測定対象物質濃度既知の試料を
用いて同様の方法により測定を行ない、生体試料中の測
定対象物質量と標識複合体中の検出物質の量との関係を
表わす検量線を作成し、これを用いて標識複合体中の検
出物質の量に対応する生体試料中の測定対象物質量を求
めれば、試料中の生体試料中の測定対象物質量が求めら
れる。上記の反応に於て、標識複合体を形成させる際の
本発明の結合物の使用濃度及び標識測定物質の使用濃度
は、生体試料中の測定対象物質の検量限界や測定感度を
どの程度に設定するかによって適宜設定すればよく、特
に限定されない。但し、標識測定物質の使用濃度は、反
応液中に存在する本発明の結合物全てと結合し得る濃度
以上に設定しておかなければならないことは言うまでも
ない。

【００２７】(3)生体試料中の測定対象物質が同一の作
用を有し、且つ同一の検出可能な化学特性を有する２以
上の物質である測定方法（測定方法(3)） 先ず、測定対象物質を含む生体由来の試料と、生体試料
中の測定対象物質の少なくとも１つと特異的に結合する
がこれらのうちの少なくとも１つとは結合しない性質を
有し且つ本発明のポリペプチドが結合した物質（以下、
「本発明の結合物Ａ」と略記する。）とを、要すれば適
当な緩衝液中に添加、混合して反応させ、特定の生体試
料中の測定対象物質と本発明の結合物Ａとの複合体を形
成させた後、該複合体と遊離の生体試料中の測定対象物
質とを、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン交換
クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣ
装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反応
チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等を使
用して分離する。次いで、分離された複合体に含まれる
生体試料中の測定対象物質の量又は／及び遊離の生体試
料中の測定対象物質の量を、生体試料中の測定対象物質
の性質に応じた測定方法により求める。別に、例えば測
定対象物質濃度既知の試料を用い同様の方法により測定
を行ない、生体試料中の測定対象物質量と該複合体中の
測定対象物質の検出可能な性質に基づく測定値との関係
を表わす検量線を作成し、これを用いて測定値に対応す
る生体試料中の測定対象物質量を求めれば、試料中の生
体試料中の測定対象物質の何れかの量が求められる。上
記の反応に於て、複合体を形成させる際の本発明の結合
物Ａの使用濃度は、測定対象物質の検量限界や測定感度
をどの程度に設定するかによって適宜設定すればよく、
特に限定されない。

【００２８】(4)生体試料中の測定対象物質が、同一の
作用を有する２以上の物質又は類似した構造を有するが
異なる作用を有する２以上の物質である測定方法（測定
方法(4)） 先ず、測定対象物質を含む生体由来の試料
と、生体試料中の測定対象物質の全てに対する結合能物
質（以下、「結合能物質Ａ」と略記する。）を検出物質
で標識したもの（以下、「標識結合能物質Ａ」と略記す
る。）及び生体試料中の特定の測定対象物質に対する結
合能を有し且つ本発明のポリペプチドが結合した物質
（以下、「本発明の結合物Ｂ」と略記する。）を、要す
れば適当な緩衝液中に添加、混合して反応させ、生体試
料中の測定対象物質と標識結合能物質Ａとの複合体（以
下、複合体Ａと略記する。）及び生体試料中の特定の測
定対象物質と標識結合能物質Ａと本発明の結合物Ｂとの
複合体（以下、複合体Ｂと略記する。）を形成させた
後、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の標識結合能物質Ａと
を、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン交換クロ
マト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣ装
置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反応チ
ューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等を使用
して分離する。次いで、分離された複合体Ａ中に含まれ
る検出物質の量又は／及び分離された複合体Ｂ中に含ま
れる検出物質の量を、検出物質が保有する性質に応じた
測定方法により求める。別に、例えば測定対象物質濃度
既知の試料を用い同様の方法により測定を行ない、生体
試料中の測定対象物質量と該複合体Ａ中に含まれる検出
物質の量又は／及び複合体Ｂ中に含まれる検出物質の量
との関係を表わす検量線を作成し、これを用いて、複合
体中の検出物質の量に対応する生体試料中の測定対象物
質量を求めれば、試料中の生体試料中の測定対象物質の
何れかの量が求められる。尚、結合能物質Ａ自身が何ら
かの方法により測定（検出）可能な物質である場合に
は、検出物質により標識されていない結合能物質Ａを用
いて上記の反応を行ない、得られた複合体中の結合能物
質Ａの量を結合能物質Ａの性質に応じた測定方法により
求めることによっても、同様に試料中の生体試料中の測
定対象物質量を求めることができる。

【００２９】(5)生体試料中の測定対象物質が、同一の
作用を有する２の物質又は類似した構造を有するが異な
る作用を有する２の物質である測定方法（測定方法
(5)） 先ず、測定対象物質を含む生体由来の試料と、標識結合
能物質Ａ、生体試料中の測定対象物質１に対する結合能
を有し且つ本発明のポリペプチド１が結合した物質（以
下、「本発明の結合物Ｃ」と略記する。）及び生体試料
中の測定対象物質２に対する結合能を有し且つ本発明の
ポリペプチド２が結合した物質（以下、「本発明の結合
物Ｄ」と略記する。）を、要すれば適当な緩衝液中に添
加、混合して反応させ、生体試料中の測定対象物質１と
本発明の結合物Ｃと標識結合能物質Ａとの複合体（以
下、複合体Ｃと略記する。）及び生体試料中の測定対象
物質２と本発明の結合物Ｄと標識結合能物質Ａとの複合
体（以下、複合体Ｄと略記する。）を形成させた後、複
合体Ｃ、複合体Ｄ及び遊離の標識結合能物質Ａとを、ポ
リペプチド１及び２の性質の差に基づいて、陰性電荷を
利用する方法、例えば陰イオン交換クロマト用充填剤を
充填したカラムを装着したＨＰＬＣ装置、陰イオン交換
膜、陰イオン交換作用を有する反応チューブ等の陰イオ
ン交換作用を有する機械器具等を使用して分離する。次
いで、分離された複合体Ｃ中に含まれる検出物質の量又
は／及び複合体Ｄ中に含まれる検出物質の量を、検出物
質が保有する性質に応じた測定方法により求める。別
に、例えば測定対象物質濃度既知の試料を用い同様の方
法により測定を行ない、生体試料中の測定対象物質１
（又は２）量と該複合体Ｃ中に含まれる検出物質の量又
は／及び複合体Ｄ中に含まれる検出物質の量との関係を
表わす検量線を作成し、これを用いて、複合体中の検出
物質の量に対応する生体試料中の測定対象物質量を求め
れば、試料中の生体試料中の測定対象物質の何れかの量
が求められる。尚、結合能物質Ａ自身が何らかの方法に
より測定（検出）可能な物質である場合には、検出物質
により標識されていない結合能物質Ａを用いて上記の反
応を行ない、得られた複合体中の結合能物質Ａの量を結
合能物質Ａの性質に応じた測定方法により求めることに
よっても、同様に試料中の生体試料中の測定対象物質量
を求めることができる。

【００３０】(6)生体試料中の測定対象物質が、糖鎖構
造は異なるが蛋白質構造は実質的に同一な２以上の糖蛋
白質である測定方法（測定方法(6)） 先ず、測定対象の糖蛋白質を含む生体試料と、測定対象
の糖蛋白質の少なくとも１つの特定の糖鎖構造を認識す
るレクチンと、測定対象の糖蛋白質全てに結合する性質
を有するが該レクチンが結合した測定対象の糖蛋白質へ
の結合が妨げられる性質を有する抗体と本発明のポリペ
プチドとの結合物（以下、「ポリペプチド結合抗体」と
略記する。）、該レクチンが結合した測定対象の糖蛋白
質を含む測定対象の糖蛋白質全てに結合し得る性質を有
し且つ検出物質が結合した抗体（以下、「標識抗糖蛋白
質抗体」と略記する。）とを反応させて、糖蛋白質とレ
クチンと標識抗糖蛋白質抗体との複合体と、糖蛋白質と
ポリペプチド結合抗体と標識抗糖蛋白質抗体との複合体
とを形成させた後、これら複合体と遊離の標識抗糖蛋白
質抗体とを、陰性電荷を利用する方法、例えば陰イオン
交換クロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰ
ＬＣ装置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する
反応チューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等
を使用して分離する。次いで、分離されたこれら複合体
中に含まれる検出物質の量を、検出物質が保有する性質
に応じた測定方法により求める。別に、例えば測定対象
の糖蛋白質濃度既知の試料を用い同様の方法により測定
を行ない、生体試料中の測定対象の糖蛋白質量とこれら
複合体中に含まれる検出物質の量との関係を表わす検量
線を作成し、これを用いて、これら複合体中の検出物質
の量に対応する生体試料中の測定対象の糖蛋白質量を求
めれば、試料中の生体試料中の測定対象の糖蛋白質の何
れかの量が求められる。尚、測定対象の糖蛋白質自身が
何らかの方法により測定（検出）可能な物質である場合
には、標識抗糖蛋白質抗体を使用しなくとも上記の測定
が実施し得ることはいうまでもない。

【００３１】本発明を利用した測定方法(1)及び(2)によ
り測定可能な生体試料中の測定対象物質としては、i)生
体試料中の測定対象物質と互いに強い相互作用を及ぼし
あい、強固な複合体を形成し得る物質が存在し、該物質
がそれ自身何らかの方法により測定（検出）可能である
か、又は何らかの検出物質により標識可能なもの、であ
るか、若しくはii)測定対象物質自体が何らかの検出物
質により標識可能なものであって、生体試料中の測定対
象物質と互いに強い相互作用を及ぼしあい、強固な標識
複合体を形成し得る物質が存在するもの、であれば、特
に限定することなく挙げられるが、例えば血清，血液，
血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等
の生体由来の試料中に含まれる蛋白質、ペプチド、核
酸、糖鎖、脂質、ホルモン、薬物等が代表的なものとし
て挙げられる。更に具体的には、例えばα−フェトプロ
テイン（ＡＦＰ），ＣＡ１９−９，前立腺特異抗原（Ｐ
ＳＡ），癌胎児性抗原（ＣＥＡ），癌細胞の産生する特
殊な糖鎖を有する物質等の癌マーカー、例えば免疫グロ
ブリンＡ（ＩｇＡ），免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ），免
疫グロブリンＧ（ＩｇＧ），β₂−ミクログロブリン，
アルブミン，フェリチン等の血清蛋白質、例えばＣ−ペ
プチド，アンジオテンシンＩ等のペプチド、例えばアミ
ラーゼ，アルカリホスファターゼ，γ−グルタミルトラ
ンスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ）等の酵素、例えばルベラ
ウイルス，ヘルペスウイルス，肝炎ウイルス，ＡＴＬウ
イルス，ＡＩＤＳウイルス等臨床的に注目されているウ
イルスに対する抗ウイルス抗体、ウイルス等の病原体の
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）或は
これら核酸を構成する１本鎖ポリヌクレオチド、ウイル
ス等の病原体に由来する抗原性物質、例えばスギその他
の草木の花粉や室内塵等のアレルゲンに反応する抗体、
例えばリポ蛋白質等の脂質、例えばトリプシン，プラス
ミン，セリンプロテアーゼ等のプロテアーゼ、例えばイ
ンシュリン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ），サ
イロキシン（Ｔ₄），トリヨードサイロニン（Ｔ₃），プ
ロラクチン，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）等のホルモ
ン、例えばジゴキシン，フェニトイン，モルヒネ，ニコ
チン等の薬物、例えば甲状腺刺激ホルモン，アセチルコ
リン，グルタミン酸等に対するレセプター等が挙げられ
る。

【００３２】本発明を利用した測定方法(1)に係る、標
識結合能物質を調製するために用いられる生体試料中の
測定対象物質に対する結合能物質としては、これら生体
試料中の測定対象物質と互いに強い相互作用を及ぼしあ
い、強固な複合体を形成する物質で、要すれば、それ自
身何らかの方法により測定（検出）可能であるか、或は
測定（検出）可能な何らかの検出物質により標識可能な
もの（生体試料中の測定対象物質自身が何らかの検出物
質により標識可能なものである場合にはこの限りではな
い。）であれば特に限定することなく挙げられるが、例
えば抗原性を有する物質（ハプテンを含む。）に対する
抗体、抗体に対する抗原、特定構造の糖鎖に対して結合
能を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチ
ン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽
レクチン等のレクチン類、例えばトリプシンに対するα
₁−アンチトリプシン，プラスミンに対するα₂−マクロ
グロブリン，セリンプロテアーゼに対するα₂−マクロ
グロブリンやα₁−アンチキモトリプシン等の特定の酵
素に対するインヒビター類、生体試料中の測定対象物質
である１本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオ
チド鎖、ホルモンに対するレセプター等が挙げられる。

【００３３】本発明を利用した測定方法(1)及び(2)に係
る、本発明の結合物を調製するために用いられる生体試
料中の測定対象物質に対する結合能物質としては、これ
ら生体試料中の測定対象物質（又は標識測定対象物質、
或は測定対象物質と標識結合能物質との複合体）と互い
に強い相互作用を及ぼしあい、強固な複合体を形成する
物質であれば特に限定することなく挙げられるが、例え
ば抗原性を有する物質（ハプテンを含む。）に対する抗
体、抗体に対する抗原、特定構造の糖鎖に対して結合能
を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチ
ン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽
レクチン等のレクチン類、例えばトリプシンに対するα
₁−アンチトリプシン，プラスミンに対するα₂−マクロ
グロブリン，セリンプロテアーゼに対するα₂−マクロ
グロブリン等の特定の酵素に対するインヒビター類、生
体試料中の測定対象物質である１本鎖ポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチド鎖等（但し、標識結合能物
質を調製するために用いた結合能物質とは結合部位が異
なるもの。）が挙げられる。

【００３４】本発明を利用した測定方法(3)により測定
可能な生体試料中の測定対象物質としては、それ自身が
何らかの方法により測定（検出）可能であって、且つ生
体試料中の測定対象物質の少なくとも１つとは互いに強
い相互作用を及ぼしあい、強固な複合体を形成するが、
それらの少なくとも１つとは結合しない性質を有する物
質が存在するものであれば、特に限定することなく挙げ
られるが、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、
リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含
まれる酵素等が代表的なものとして挙げられる。更に具
体的には、例えばアミラーゼ，アルカリホスファター
ゼ，酸性ホスファターゼ，γ−グルタミルトランスフェ
ラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ
（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オ
キザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン
酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，
プロテインキナーゼ（ＰＫ），チロシンキナーゼ等の酵
素等が挙げられる。

【００３５】本発明を利用した測定方法(3)に係る、本
発明の結合物Ａを調製するために用いられる生体試料中
の特定の測定対象物質に対する結合能物質としては、生
体試料中の測定対象物質の少なくとも１つとは互いに強
い相互作用を及ぼしあい、強固な複合体を形成するが、
生体試料中の測定対象物質の少なくとも１つとは結合し
ない物質であれば特に限定することなく挙げられるが、
例えば抗原性を有する物質（ハプテンを含む。）の特定
の部分構造或は抗原決定部位に対する抗体、特定構造の
糖鎖に対して結合能を有する例えばコンカナバリンＡ，
レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレ
クチン，ヒイロチャワンタケレクチン，ヒママメレクチ
ン，ピーナッツレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチ
ン類、例えばアミラーゼ，クレアチンキナーゼ（Ｃ
Ｋ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
（ＧＯＴ）等の酵素に対するインヒビター等が挙げられ
る。

【００３６】本発明を利用した測定方法(4)により測定
可能な生体試料中の測定対象物質としては、測定対象
物質の全てと結合し、且つそれ自身が何らかの方法によ
り検出可能な性質を有しているか又は検出物質により標
識が可能な物質、及び生体試料中の測定対象物質の少
なくとも１つとは互いに強い相互作用（affinity；親和
力或は親和性）を及ぼしあい、強固な複合体を形成する
が、それらの少なくとも１つとは結合しない物質、が存
在するものであれば、特に限定することなく挙げられる
が、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ
球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれる
酵素、生理活性物質、癌関連抗原、糖鎖を有する物質等
が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例
えばアミラーゼ，アルカリホスファターゼ，酸性ホスフ
ァターゼ，γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ−Ｇ
ＴＰ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸
脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トラ
ンスアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸ト
ランスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナ
ーゼ，チロシンキナーゼ等の酵素類、例えばステロイド
ホルモン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ），プロ
ラクチン，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホ
ルモン（ＬＨ）等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗
原（ＰＳＡ），α₂-マクログロブリン，癌胎児性抗原
（ＣＥＡ），α-フェトプロテイン等の癌関連抗原等が
好ましく挙げられる。

【００３７】本発明を利用した測定方法(4)に係る、標
識結合能物質Ａを調製するために用いられる生体試料中
の測定対象物質に対する結合能物質としては、生体試料
中の測定対象物質の全てと結合し得、且つそれ自身が何
らかの方法により検出可能な性質を有しているか又は検
出物質により標識し得る物質であれば特に限定すること
なく挙げられる。具体例としては、例えば抗原性を有す
る物質（ハプテンを含む。）の特定の部分構造或は抗原
決定部位に対する抗体や特定構造の糖鎖に対して結合能
を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチ
ン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，ヒイロチ
ャワンタケレクチン，ヒママメレクチン，ピーナッツレ
クチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、或はアミラ
ーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸オキ
ザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の 酵素に対
するインヒビター等が挙げられる。

【００３８】本発明を利用した測定方法(4)に係る、本
発明の結合物Ｂを調製するために用いられる、生体試料
中の特定の測定対象物質に対して結合能を有する結合能
物質としては、生体試料中の特定の測定対象物質と遊離
の標識結合能物質Ａとの複合体形成反応及び複合体中の
検出物質（又は結合能物質Ａ）を検出する反応を阻害し
ないものであって、生体試料中の特定の測定対象物質に
対して結合能を有する物質、或は標識結合能物質Ａに検
出物質が結合している場合には該検出物質に対して結合
能を有する物質であれば特に限定されることなく挙げら
れる。具体的には、例えば生体試料中の特定の測定対象
物質に対して結合能を有する例えば抗体、例えばコンカ
ナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレクチ
ン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類
（但し、結合能物質Ａとは結合部位が異なるもの。）
等、或は結合能物質Ａ又は該検出物質に対して結合能を
有する例えば抗体、例えばコンカナバリンＡ，レンズマ
メレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，
小麦胚芽レクチン等のレクチン類等が好ましく挙げられ
る。

【００３９】本発明を利用した測定方法(5)により測定
可能な生体試料中の測定対象物質としては、測定対象
物質の全てと結合し、且つそれ自身が何らかの方法によ
り検出可能な性質を有しているか又は検出物質により標
識が可能な物質、及び生体試料中の測定対象物質１と
は互いに強い相互作用（affinity；親和力或は親和性）
を及ぼしあい、強固な複合体を形成するが、測定対象物
質２とは結合しない物質、生体試料中の測定対象物質
２とは互いに強い相互作用（affinity；親和力或は親和
性）を及ぼしあい、強固な複合体を形成するが、測定対
象物質１とは結合しない物質が存在するものであれば、
特に限定することなく挙げられるが、例えば血清，血
液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞
類等の生体由来の試料中に含まれる酵素、生理活性物
質、癌関連抗原、糖鎖を有する物質等が代表的なものと
して挙げられる。更に具体的には、例えばアミラーゼ，
アルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，γ-グ
ルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパー
ゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（Ｌ
ＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナー
ゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ，チロシン
キナーゼ等の酵素類、例えばステロイドホルモン，ヒト
絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ），プロラクチン，甲状
腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ）
等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ），
α₂-マクログロブリン，癌胎児性抗原（ＣＥＡ），α-
フェトプロテイン等の癌関連抗原等が好ましく挙げられ
る。

【００４０】本発明を利用した測定方法(5)に係る、標
識結合能物質Ａを調製するために用いられる生体試料中
の測定対象物質に対する結合能物質としては、生体試料
中の測定対象物質の全てと結合し得る、且つそれ自身が
何らかの方法により検出可能な性質を有しているか又は
検出物質により標識し得る物質であれば特に限定するこ
となく挙げられる。具体例としては、例えば抗原性を有
する物質（ハプテンを含む。）の特定の部分構造或は抗
原決定部位に対する抗体や特定構造の糖鎖に対して結合
能を有する例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチ
ン，インゲンマメレクチン，ダツラレクチン，ヒイロチ
ャワンタケレクチン，ヒママメレクチン，ピーナッツレ
クチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類、或はアミラ
ーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸オキ
ザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の 酵素に対
するインヒビター等が挙げられる。

【００４１】本発明を利用した測定方法(5)に係る、本
発明の結合物Ｃ又はＤを調製するために用いられる、生
体試料中の特定の測定対象物質１又は２に対して結合能
を有する結合能物質としては、生体試料中の測定対象物
質１又は２と遊離の標識結合能物質Ａとの複合体形成反
応及び複合体中の検出物質（又は結合能物質Ａ）を検出
する反応を阻害しないものであって、生体試料中の特定
の測定対象物質１又は２に対して結合能を有する物質で
あれば特に限定されることなく挙げられる。具体的に
は、例えば生体試料中の測定対象物質１又は２に対して
結合能を有する例えば抗体、例えばコンカナバリンＡ，
レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，ダツラレ
クチン，小麦胚芽レクチン等のレクチン類（但し、結合
能物質Ａとは結合部位が異なるもの。）等、或は結合能
物質Ａ又は該検出物質に対して結合能を有する例えば抗
体、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，イ
ンゲンマメレクチン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチ
ン等のレクチン類等が好ましく挙げられる。

【００４２】本発明を利用した測定法(6)に於いて用い
られるレクチンとしては、種々のレクチン、例えばコン
カナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマメレク
チン，ダツラレクチン，小麦胚芽レクチン等の中から目
的の糖鎖構造を認識し得る性質を有するものを適宜選択
して用いればよく、特に限定されない。

【００４３】本発明を利用した測定法(6)に於いて用い
られる、ポリペプチド結合抗体や標識抗糖蛋白質抗体を
調製するために用いられる抗体としては、上記した如き
性質を有する抗体であれば、常法、例えば「免疫実験学
入門、第２刷、松橋直ら、(株)学会出版センター、198
1」等に記載の方法に準じて、例えば馬、牛、羊、兎、
山羊、ラット、マウス等の動物に測定対象を免疫して作
製されるポリクローナル性抗体でも、或はまた常法、即
ちケラーとミルスタイン（Nature,256巻,495頁,1975）
により確立された細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ライ
ンからの細胞と測定対象物質で予め免疫されたマウスの
脾細胞とを融合させて得られるハイブリドーマが産生す
る単クローン性抗体でも何れにてもよく、これらを単独
で或はこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意であ
る。

【００４４】本発明を利用した測定法(6)により分別測
定可能な糖蛋白質の具体例としては、例えば血清，血
液，血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞
類等の生体由来の試料中に含まれる、糖鎖構造は異なる
が蛋白質構造は実質的に同一な糖蛋白質が存在するもの
であって、測定対象の糖蛋白質の少なくとも１つの特定
の糖鎖構造を認識するレクチンと、ポリペプチド結合抗
体を調製し得る抗体とが存在するものであれば、特に限
定されることなく挙げられるが、例えばアミラーゼ，ア
ルカリホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，γ-グル
タミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ，
クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（ＬＤ
Ｈ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナー
ゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ，チロシン
キナーゼ等の酵素類、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン
（ｈＣＧ），甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成
ホルモン（ＬＨ）等の生理活性物質、例えば前立腺特異
抗原（ＰＳＡ），α₂-マクログロブリン，癌胎児性抗原
（ＣＥＡ），α-フェトプロテイン等の癌関連抗原、例
えばＣＡ１９−９，ＣＡ１２５等の糖鎖抗原等が好まし
く挙げられる。

【００４５】本発明の測定法(6)に於ける試薬類の使用
濃度等について以下に説明する。即ち、先ずレクチンの
使用濃度は、使用するレクチンの種類、測定対象の糖蛋
白質の性質等により変動するが、設定された測定対象糖
蛋白質の検出限界濃度の通常10倍以上、好ましくは100
倍以上、より好ましくは1000倍以上の濃度で反応時に共
存させておくことが望ましい。

【００４６】また、ポリペプチド結合抗体の使用濃度
は、測定対象糖蛋白質の検出限界をどの程度に設定する
かによっても変動するが、レクチンとポリペプチド結合
抗体の測定対象糖蛋白質に対する結合定数の違いを考慮
した上で設定することが望ましい。例えば、測定対象糖
蛋白質、レクチンの種類やその物性、ポリペプチド結合
抗体の物性等により変動するものの、下記に示す一般式
等を利用して設定することが望ましい。 ポリペプチド結合抗体濃度≦（レクチンの結合定数）÷（ポ
リペプチド結合抗体の結合定数）×（レクチン濃度） 尚、上記の一般式に係わる結合定数とは、下記（１）式
の如き平衡反応に於ける結合定数を示し、下記（２）式
により求められる定数である。 ［Ａ］＋［Ｂ］←→［Ａ・Ｂ］ （１） 結合定数＝［Ａ・Ｂ］／（［Ａ］×［Ｂ］） （２） ［Ａ］：平衡状態に於けるレクチン又はポリペプチド結
合抗体の濃度（Ｍ）。 ［Ｂ］：平衡状態に於ける遊離の測定対象糖蛋白質濃度
（Ｍ）。 ［Ａ・Ｂ］：レクチン（又はポリペプチド結合抗体）と
測定対象糖蛋白質との複合体の濃度（Ｍ）。

【００４７】より具体的に述べれば、例えばレクチンの
測定対象糖蛋白質への結合定数が１×10⁶Ｍ^ー1で、ポリ
ペプチド結合抗体の測定対象糖蛋白質への結合定数が１
×10⁸Ｍ^ー1である場合には、ポリペプチド結合抗体濃度
はレクチン濃度の100分の１以下、好ましくは1000分の
１以下ということになる。尚、ポリペプチド結合抗体の
使用濃度は、設定した検出限界濃度の測定対象糖蛋白質
の全てと結合し得る濃度以上である方が望ましいが、そ
れ以下（例えば１／１０程度）であってもよい。

【００４８】また、標識抗糖蛋白質抗体の使用濃度は、
測定対象糖蛋白質の検出限界をどの程度に設定するかに
よって変動するが、反応液中の濃度として、設定した検
出限界濃度の測定対象糖蛋白質の全てと結合し得る濃度
以上、好ましくはその２倍濃度以上、より好ましくはそ
の５倍濃度以上、更に好ましくはその10倍濃度以上とし
ておくことが望ましい。尚、以上述べた本発明を利用し
た測定方法(1)〜(6)を実施するに当たり、複合体を、遊
離の結合能物質（標識されているものも含む）、測定対
象物質（標識されているものも含む）等から分離する際
には、上記した如きＨＰＬＣの代わりに、陰性電荷を利
用する方法であって、通常この分野で用いられる物質の
陰性電荷の違いに基づいてこれらを電気的に分離する方
法、例えば分離用担体を使用しない界面動電分離方法
（特公平7-111398号公報等）、分離用担体を使用する電
気泳動法、キャピラリー電気泳動法、例えば核酸のハブ
リダイゼイション、抗原抗体反応等を電荷の違いを利用
して促進した後遊離の核酸鎖や抗体等を電気的に分離す
る方法（国際公開第95/12808号公報等）等を利用して行
っても良い。また、これらの内、分離用担体を使用する
電気泳動法等で使用する担体も通常この分野で用いられ
る担体（例えば濾紙、例えば寒天ゲル、アガーゲル、ア
ガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、デンプンゲル
等のゲル、セルロースアセテート膜等）であれば特に限
定されることなく使用可能である。

【００４９】本発明の測定方法に於いて用いられる検出
物質としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に於い
て用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガラクトシ
ダーゼ，パーオキシダーゼ，マイクロパーオキシダー
ゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱
水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水
素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられる^99mＴc，¹³¹Ｉ，¹²⁵
Ｉ，¹⁴Ｃ，³Ｈ等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測
定法（ＦＩＡ）で用いられるフルオレセイン，ダンシ
ル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或は
これらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，
イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリ フロロ
フェニル)オキザレート等の発光性物質、例えばフェノ
ール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等
の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6
-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,
5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブ
チル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサ
ジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基
を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての
性質を有する物質等が挙げられるが、これらに限定され
るものではないことは言うまでもない。

【００５０】結合能物質に、上記した如き検出物質を標
識する方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或はＦ
ＩＡ等に於いて一般に行われている自体公知の標識方法
（例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第
１版、中山書店、1971；図説蛍光抗体、川生明著、第１
版、(株)ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、
石川栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書院、1982
等）が何れも例外なく挙げられ、これらに準じて行えば
よい。また、標識方法として、アビジン（又はストレプ
トアビジン）とビオチンの反応を利用した常法を利用し
ても良いことは言うまでもない。

【００５１】本発明に係る、それ自身何らかの方法によ
り測定（検出）可能な結合能物質の例としては、例えば
酵素、蛍光性物質、発光性物質或は紫外部に吸収を有す
る物質等のように、それ自身上記した如き検出物質とし
ての性質を有しているものが挙げられる。

【００５２】本発明の測定方法に於いては、本発明のポ
リペプチドの種類（導入される強酸由来の酸残基の種類
や数、構成アミノ酸残基の種類等）により複合体の溶出
時間を自由に調節できるので、この性質を利用すれば、
分別測定も可能である。

【００５３】即ち、強酸由来の酸残基数の異なる本発明
のポリペプチドを２種以上用い、且つ各ポリペプチドを
結合させる結合能物質の種類を適宜選択することによ
り、複数の測定対象物質の同時測定（分別測定）を行う
ことが可能となるのである。

【００５４】また、測定に影響を与える血清成分が複数
の場合でも、本発明のポリペプチドを用いて複合体のイ
オン性をこれら血清成分が有するイオン性よりも大きく
しておけば、血清成分が測定に及ぼす影響を避けること
ができるという効果が生ずる。この場合、ステップワイ
ズグラジエントを利用することにより分析に要する時間
を短縮することができるという効果が生ずる。

【００５５】更にまた、陰イオン交換法に於いて用いら
れるクロマトグラフィー用の担体（ゲル担体、メンブラ
ン担体、ガラス担体等）は、一般に交換能（イオン性物
質の絶対吸着能）が高いので、血清等の生体由来試料の
如くイオン性の共存物質の絶対量が多い試料の分析を行
う場合であっても、本発明の結合物が結合した複合体を
全て吸着することができるので、該複合体を共存物質に
よる影響を殆ど回避できる位置に溶出させることが可能
である。また、本発明の測定方法に利用される本発明の
ポリペプチドは、水に対する溶解度が高いので、これが
結合した複合体の水溶性は結合前のそれよりも高くなる
ので、本発明の測定方法に於いては、分離向上物質（ポ
リペプチド）が結合した複合体の形成反応時に測定対象
物質の変性、失活が起こる可能性は殆どない。

【００５６】また、本発明のポリペプチドのアニオン性
を利用して目的物とその他の共存物質とを分離するため
に陰イオン交換法で使用される担体としては、アニオン
交換能を有している担体であれば特に限定されることな
く挙げられるが、例えばジエチルアミノエチル（DEAE）
基、第四級アンモニウム基（例えばＱ基、QAE基等）等
のアニオン交換基を有する担体、より具体的には例えば
DEAE-MCIゲル（三菱化成(株)商品名)、QAE MCIゲル（三
菱化成(株)商品名)、ワコービーズDEAEゲル（和光純薬
工業(株)商品名)等のアニオン交換クロマトグラフィー
用充填剤やメンブランを用いたメムセップDEAE（日本ミ
リポアリミテッド(株)商品名）等が挙げられる。尚、市
販のクロマトグラフィー用担体、或は樹脂やガラスでで
きた容器の表面に上記した如きアニオン交換基を常法に
より結合させたものを自製して使用してもよいことはい
うまでもない。

【００５７】本発明の結合物を用いる生体成分の測定方
法は、陰性電荷を利用する方法を用いた方法であるが故
に優れた測定方法である。即ち、例えば、ゲル濾過法を
利用して生体成分の測定方法を実施するためには適当な
長さのカラムを用いることが必要であるので、ゲル濾過
法を利用した場合には、陰性電荷を利用する方法を用い
た場合に比較して分離時間が長くなるという欠点があ
る。それ故、分離時間の短縮が要求されるときには、陰
性電荷を利用する方法であって、例えば陰イオン交換ク
ロマト用充填剤を充填したカラムを装着したＨＰＬＣ装
置、陰イオン交換膜、陰イオン交換作用を有する反応チ
ューブ等の陰イオン交換作用を有する機械器具等の陰イ
オン交換法を利用する方が好ましい。さらに、ゲル濾過
法には、非常に高い分子量（分子の大きさが約1000オン
グストローム以上）を持つ生体試料中の測定対象物質の
分離には適していない、という欠点もある。

【００５８】また、疎水分離法の場合、生体試料中の測
定対象物質がタンパク質のような高次構造を持つ生理活
性物質であるときには、分離操作の際に使用する有機溶
媒により高次構造が破壊されて複合体中の生体試料中の
測定対象物質の活性が失われるという問題が生じる場合
がある。

【００５９】一方、陰イオン交換法は、イオン性の微妙
な違いに基づいて、より効果的に生体試料中の測定対象
物質を分離することができる。更に、陰イオン交換法に
よれば、様々なイオン性を持つ本発明のポリペプチドを
任意に選択することができるので、最適ｐＨ条件下で生
体試料中の測定対象物質の分離を行うことができる。更
にまた、本発明のポリペプチドは、それ自体高い水溶性
を持つので、これを生体試料中の測定対象物質に結合さ
せても、生体試料中の測定対象物質の沈澱が起こる恐れ
は殆どなく、安定な状態で分離操作を実行することがで
きる。

【００６０】本発明の測定方法を用いて生体試料中の測
定対象物質の測定を行った場合には、目的の生体試料中
の測定対象物質のピークを血清や尿等の成分の影響を受
けない位置に移動させることができる。そればかりか、
生体試料中の測定対象物質に応じて適宜適当な性質を有
する本発明の結合物を選択して用いることにより、種々
の生体試料中の測定対象物質を含む複合体の溶出位置を
一致させることができるので、同一分析条件下の陰イオ
ン交換法（例えばＨＰＬＣ）を用いて、多種の生体試料
中の測定対象物質の測定を行うことができるという効果
も生ずる。

【００６１】本発明の測定方法に於いて、陰性電荷を利
用する方法により分離された複合体（標識複合体）中に
含まれる検出物質（結合能物質、結合能物質Ａ又は生体
試料中の測定対象物質）の量の測定は、検出物質（結合
能物質、結合能物質Ａ又は生体試料中の測定対象物質）
が有している、何らかの方法により検出し得る性質に応
じて夫々所定の方法に従って実施される。例えば、その
性質が酵素活性の場合にはＥＩＡの常法、例えば「酵素
免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣
・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜63頁、共立出
版(株)、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準
じて測定を行えばよく、検出物質が放射性物質の場合に
はＲＩＡの常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種
類及び強さに応じて液浸型ＧＭカウンター，液体シンチ
レーションカウンター，井戸型シンチレーションカウン
ター，ＨＰＬＣ用カウンター等の測定機器を適宜選択し
て使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、
第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971等参
照。）。また、その性質が蛍光性の場合には蛍光光度計
等の測定機器を用いるＦＩＡの常法、例えば「図説 蛍
光抗体、川生明著、第１版、(株)ソフトサイエンス社、
1983」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、
その性質が発光性の場合にはフォトンカウンター等の測
定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質
核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫 ・辻章夫
・石川榮治編集、252〜263頁、共立出版(株)、1987年９
月10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えば
よい。更に、その性質が紫外部に吸収を有する性質の場
合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測
定を行えばよく、検出物質がスピンの性質を有する物質
の場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば
「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北
川 常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271
頁、共立出版(株)、1987年９月10日発行」等に記載され
た方法に準じて夫々測定を行えばよい。

【００６２】本発明の測定方法に於いて、生体試料中の
測定対象物質と本発明の結合物（結合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ
等を含む）、要すれば標識された或はされない結合能物
質（結合能物質Ａを含む。）とを反応させて、複合体を
形成する際の反応条件、或は生体試料中の測定対象物質
と標識測定物質と本発明の結合物とを反応させて、標識
複合体を形成する際の反応条件としては、複合体（又は
標識複合体）の形成反応を妨げる様な条件でなければ特
に限定されないが、常法、例えばＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩ
Ａ，アフィニティクロマトグラフィー等の自体公知の方
法に於いて複合体等を形成させる際の反応条件に準じて
行えばよい。例えば、反応時に緩衝液を用いる場合に
は、使用される緩衝剤やその他の試薬はこれら自体公知
の方法に於いて用いられるものを適宜選択して用いれば
よい。また、反応時のｐＨとしては、複合体（又は標識
複合体）の形成反応を妨げない範囲であれば特に限定さ
れるものではないが、通常２〜10、好ましくは５〜９の
範囲が挙げられる。反応時の温度も、複合体（又は標識
複合体）の形成反応を妨げない範囲であれば特に限定さ
れるものではないが、通常０〜50℃、好ましくは20〜40
℃の範囲が好ましく挙げられる。反応時間は、複合体
（又は標識複合体）が形成されるのに要する時間が、生
体試料中の測定対象物質と本発明の結合物、及び標識結
合能物質等との反応性、或は本発明の結合物及び標識測
定物質との反応性により異なるので、各々の性質に応じ
て数秒間乃至数時間適宜反応させればよい。

【００６３】本発明の測定方法に於いて陰イオン交換法
を実施するために用いられるＨＰＬＣとしては、装置自
身は通常分析の分野に於いて用いられているもので定流
速が得られるものであれば特に問題なく用いることがで
きる。本発明の測定方法をＨＰＬＣを用いて行う場合、
測定対象物質の測定は、ピーク面積又はピークの高さを
利用して行えばよい。

【００６４】陰イオン交換法、より具体的にはＨＰＬＣ
により複合体（又は標識複合体）や遊離の標識結合能物
質等との分離を行う際に用いられる溶媒（溶離液）とし
ては、形成された複合体（又は標識複合体）等が再び生
体試料中の測定対象物質や標識結合能物質等とに分解さ
れるようなことがなく、且つ複合体（又は標識複合体）
に含まれる結合能物質等や検出物質が有している、何ら
かの方法により検出し得る性質を失わしめるようなもの
でなければ特に限定されることなく挙げられるが、通常
は例えばＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，アフィニティクロマ
トグラフィー等の自体公知の方法に於いて緩衝液として
用いられているようなものが好ましく用いられる。具体
例としては、例えばリン酸塩，酢酸塩，クエン酸塩，グ
ッド(Good)の緩衝剤，トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン等の緩衝剤、例えば塩化ナトリウム，塩化カリ
ウム，硫酸アンモニウム等の塩類、例えばメタノール，
エタノール，イソプロピルアルコール，アセトニトリ
ル，テトラヒドロフラン等の極性有機溶媒類及び界面活
性剤等を、複合体（又は標識複合体）や遊離の標識結合
能物質等の性質に応じて適宜選択し、添加、混合して調
製された、ｐＨ２〜10の緩衝液が好ましく用いられる。

【００６５】尚、溶離液中に適当な界面活性剤を適宜添
加することにより、複合体（又は標識複合体）のピーク
のテーリングを防止すると共に、複合体（又は標識複合
体）や遊離の標識結合能物質等の溶出位置を更に自由に
調整することが可能となる。このような目的で使用可能
な界面活性剤としては、複合体（又は標識複合体）や遊
離の標識結合能物質等の性質に応じて適宜選択されれば
よくその種類は特に限定されないが、例えばn-ドデシル
トリメチルアンモニウムブロマイド、塩化 1-ラウリン
ピリミジウム等の陽イオン系界面活性剤、例えばラウリ
ルベタイン、ラウリル酸アミドプロピルベタイン、ヤシ
油脂肪酸アミドプロピルベタイン、2-アルキル-N-カル
ボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリウムベタ
イン、2-ウンデシル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシ
エチルイミダゾリウムベタイン、N-ラウロイル-N-メチ
ル-βーアラニンナトリウム等の両性系界面活性剤が好ま
しく挙げられる。また、このような目的で溶離液中に界
面活性剤を添加する場合の添加濃度としては、目的の効
果が生じる濃度で有れば特に限定されず界面活性剤の種
類により若干変動するが、通常0.01〜２％、好ましくは
0.05〜１％の範囲から適宜選択される。

【００６６】また、本発明の測定方法に於て、ＨＰＬＣ
による分離後の測定方式としては、例えば「最新液体ク
ロマトグラフィ、原昭二・辻章夫編、第１版、92〜104
頁、南山堂、1978年２月１日発行」等に記載されている
ような、 ＨＰＬＣのカラムからの流出液をそのまま検
出部に導き、流出液中の複合体（又は標識複合体）中に
含まれる検出物質（又は、結合能物質や測定対象物質）
の量を直接測定する方式が、測定が迅速に行えるのでよ
り好ましい。この場合に、結合能物質（又は測定対象物
質）が、或は標識結合能物質等（又は標識測定物質）に
保持されている検出物質が有している、何らかの方法に
より検出し得る性質が、例えば酵素活性であれば、ＨＰ
ＬＣのカラムと検出部との間に、酵素活性測定用の試薬
を添加し流出液と反応させる、所謂ポストカラム法の反
応部を設ける必要があることは言うまでもない。検出物
質（又は、結合能物質等又は測定対象物質）の該性質が
酵素活性である場合に該反応部に於いて用いられる酵素
活性測定用の試薬は、常法、例えば「酵素免疫測定法、
蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・
辻章夫・石川 榮治編集、51〜63頁、共立出版(株)、198
7年９月10日発行」等に記載された方法に準じて調製し
たものを用いてもよいし、市販されている臨床検査用キ
ットの試薬を適宜選択して利用してもよい。また、検出
物質（又は、結合能物質等又は測定対象物質）の該性質
が酵素活性以外の場合に於いても、検出感度を増加させ
る目的で所定の試薬を添加、反応させるために、ＨＰＬ
Ｃのカラムと検出部との間に適当な反応部を設けること
は任意である。

【００６７】本発明の測定方法に於いて用いられるＨＰ
ＬＣの溶離液として成分の異なるものを複数用いる場合
には、その操作法としては濃度勾配法（リニアグラジエ
ント法）により行ってもステップワイズ法により行って
も何れにても良いが、ステップワイズ法には、操作が簡
便であること、実際の分析時間を短くすることができる
こと、目的のピークがシャープになること等の利点があ
るので、より望ましい。また、本発明の生体試料中の測
定対象物質測定用試薬としては、本発明のポリペプチド
と、生体試料中の測定対象物質に対して結合能を有する
物質との結合物を含んでなるものが挙げられ、その他必
要に応じて例えば標識測定対象物質、標識結合能物質、
緩衝剤、界面活性剤等を適宜含有するものである。尚、
夫々の構成要素の好ましい態様、具体例等は上で述べた
とおりである。以下に実施例を挙げて、本発明を更に具
体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定され
るものではない。

【００６８】

【実施例】実施例で使用する略号は夫々以下のものを示
す。 Ala；アラニン、βAla；βーアラニン、Ser；セリン、Ty
r；チロシン、Asp；アスパラギン酸、Fmoc；9-フルオレ
ニルメトキシカルボニル基、Alko；p-アルコキシベンジ
ルアルコール、tBu；t-ブチル基、TFA；トリフルオロ酢
酸、BOP；ベンゾチアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジ
メチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイ
ト、HOBt；N-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール、DM
F；N,N-ジメチルホル ムアミド、DIEA；N,N-ジイソプロ
ピルエチルアミン。

【００６９】実施例１．Ala-(Ser(SO₃H))₅-βAla（ポリ
ペプチド３）の合成 （１）Fmoc-Ala-(Ser)₅-βAlaの合成 Fmoc-βAla-Alko 樹脂（100〜200mesh，渡辺化学工業
(株)社製）2.3g(βAlaとして1.5mmol)を出発原料とし、
文献（J.Org.Chem., 53, 617-624(1988)）記載の方法
（BOP/HOBt法）に従って、固相法により合成した。即
ち、先ず、Fmoc-βAla-Alko 樹脂をピペリジンにより処
理してFmoc基を除去した。これと、樹脂上のβAlaに対
して３倍当量の所定のアミノ酸を含むDMF溶液、３倍当
量のBOP、３倍当量のHOBt及び5.3倍当量のDIEAを加え、
室温で２時間カップリング反応（２回）を行う操作によ
り、順次アミノ酸を導入した。尚、導入したアミノ酸の
順序はFmoc-Ser(tBu)（和光純薬工業(株)社製）、Fmoc-
Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(t
Bu)、Fmoc-Ala（和光純薬工業(株)社製）であった。全
アミノ酸を導入後、樹脂をMeOH洗浄し、TFA：アニソール（9
5：5）混液20mlを加えて室温で１時間攪拌反応させて、
目的のポリペプチドを樹脂から切断すると同時にtBu 基
（Serの水酸基の保護基）を切断させた。反応終了後、
樹脂を濾去し、濾液を 減圧濃縮後エーテルを加え反応
生成物を沈澱させた。沈澱を集め、デシケータで乾燥さ
せ、Fmoc-Ala-(Ser)₅-βAla 0.84gを得た。 （２）Ala-(Ser(SO₃H))₅-βAla（ポリペプチド３）の合
成 （１）で合成したFmoc-Ala-(Ser)₅-βAla 547mg(0.67mm
ol)をDMF40mlに溶解し、更にDMF・SO₃溶液30ml［DMF・SO₃
（Fluka社製）2.57gをDMF：ピリジン（4：1）混液30ml
に溶解したもの］を加え、４℃で１晩反応させた。反応
液に更に同量のDMF・SO₃溶液を加え、４℃、１晩更に反
応させた。反応終了後、反応液をアセトン400mlに加
え、生じた沈澱を濾取し、沈澱をDMF40mlに溶かしてピ
ペリジン8mlを加え、室温で４０分間攪拌反応させてFmo
c基を切断させた。反応液をアセトン500mlに加え、生じ
た沈澱を濾取し、アセトン、エーテル洗浄後デシケータ
で乾燥させた。得られた沈澱を、陰イオン交換クロマト
グラフィー、次いでゲル濾過に供しAla-(Ser(SO₃H))₅-
βAla（ポリペプチド３） 210mgを得た。反応生成物の
アミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィーの結果を
表１に示す。尚、アミノ酸分析は、ワコー ＰＴＣ−ア
ミノ酸分析システム（和光純薬工業(株)社製）により行
った（以下、同じ。）。

【００７０】実施例２．Ala-Tyr(SO₃H)₃-βAla（ポリペ
プチド11）の合成 Fmoc-βAla-Alko 樹脂 0.77g(0.5mmol)を出発原料と
し、実施例１（１）と同じ試薬を用い、同様の操作を行
って所定のアミノ酸を導入した。尚、導入したアミノ酸
の順序はFmoc-Tyr(SO₃Na)（Bachem社製）、Fmoc-Tyr(SO
₃Na)、Fmoc-Tyr(SO₃Na)、Fmoc-Alaであった。反応終了
後、樹脂をMeOH洗浄し、DMF：ピペリジン（4:1）混液50
mlを加え、室温で１時間攪拌反応を行って、Fmoc基を切
断させた。溶媒を濾去し、樹脂をMeOH洗浄した後、TF
A：H₂O：m-クレソ゛ール（45：5：2）を加え、窒素ガス置換後
４℃、16時間攪拌反応させて、目的のポリペプチドを樹
脂から切断させた。反応液から樹脂を濾去し、濾液を減
圧濃縮後エーテルで反応生成物を沈澱させた。沈澱を、
陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでゲル濾過に供
し、Ala-Tyr(SO₃H)₃-βAla（ポリペプチド11）180mgを
得た。反応生成物のアミノ酸分析並びにイオンクロマト
グラフィーの結果を表１に併せて示す。

【００７１】実施例３．Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla（ポリ
ペプチド14）の合成 （１）Fmoc-Ala-(Tyr)₅-βAlaの合成 Fmoc-βAla-Alko Resin 2.3g(1.5mmol)を出発原料と
し、実施例１（１）と同じ試薬を用い、同様の操作を行
って所定のアミノ酸を導入した。尚、導入したアミノ酸
の順序はFmoc-Tyr(tBu)（渡辺化学社製）、Fmoc-Tyr(tB
u)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Tyr(tBu)、F
moc-Alaであった。反応終了後、樹脂をMeOH洗浄し、TF
A：チオアニソール：1,2-エタンシ゛チオール（95：5：1）混液を加え室
温で１時間攪拌反応させて、ポリペプチドを樹脂から切
断すると同時にtBu基（Tyrの水酸基の保護基）を切断さ
せた。反応終了後、樹脂を濾去し、得られた濾液を減圧
濃縮後エーテルを加え反応生成物を沈澱させた。沈澱を
濾取し、デシケータで乾燥させ、Fmoc-Ala-(Tyr)₅-βAl
a 1.71gを得た。 （２）Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla（ポリペプチド14）の合
成 （１）で得られたFmoc-Ala-(Tyr)₅-βAla 0.5gをDMF3ml
と混合したものに、DMF・SO₃溶液15ml（DMF・SO₃ 3.2gをD
MF：ピリジン（4：1）15mlに溶解したもの）を加え、４
℃、１晩反応させた後エーテルを加えて反応生成物を沈
澱させた。沈澱をDMF10mlに溶かし、ピペリジン2.5mlを
加え、室温で１時間攪拌反応させた。反応液にエーテル
150mlを加えた後に、生じた沈澱を濾取した。得られた
沈澱を水４mlに溶かし、反応生成物をODSカラム液体ク
ロマトグラフィーで分取した［カラム：Wakosil ₁₀C
₁₈(2.0φx25cm)（和光純薬工業(株)社製）、溶離条件：
10mMAcONa(pH6.0)，2→60%アセトニトリル］。得られた目的物
を含む画分を、更にゲルろ過により処理して、Ala-(Tyr
(SO₃H))₅-βAla（ポリペプチド14）203mgを得た。反応
生成物のアミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィー
の結果を表１に併せて示す。

【００７２】実施例４．硫酸化ポリペプチド（ポリペプ
チド1,2,4〜9、18及び20〜22）の合成 実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作を行って、表１
に記載のポリペプチド1,2,4〜9,18及び20〜22を合成し
た。また、実施例２と同じ試薬を用い、同様な操作を行
って、表１に記載のポリペプチド10を合成した。尚、ポ
リペプチド６を合成する際の出発原料としてはFmoc-Ser
(tBu)-O-polymer（国産化学(株)製）を用い、ポリペプ
チド21及び22を合成する際の出発原料としてはFmoc-Tyr
(tBu)-Alko Resin（100〜200 mesh,渡辺化学工業(株)
製）を用いた。得られた各種ポリペプチドのアミノ酸分
析並びにイオンクロマトグラフィーの結果を表１に併せ
て示す。

【００７３】実施例５．硫酸化ポリペプチド（ポリペプ
チド12,13,15〜17及び19）の合成 実施例３と同じ試薬を用い、同様の操作を行って、表１
に記載のポリペプチド12,13,15〜17及び19を合成した。
尚、ポリペプチド12,16を合成する際の出発原料として
はFmoc-βAla-Alko 樹脂（100〜200mesh，渡辺化学工業
(株)社製）を用い、ポリペプチド13,15,17,19を合成す
る際の出発原料 としてはFmoc-Tyr(tBu)-Alko Resin（1
00〜200 mesh,渡辺化学工業(株)製）を用いた。反応生
成物のアミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィーの
結果を表１に併せて示す。

【００７４】実施例６．Ala-(Tyr(PO₃H₂))₅-βAla（ポ
リペプチド23）の合成 Fmoc-βAla-Alko Resin 780mg(0.5mmol)を出発原料と
し、実施例１（１）と同じ試薬を用い、同様の操作を行
って所定のアミノ酸を導入した。尚、導入したアミノ酸
の順序はFmoc-Tyr(PO₃H₂)（Nova biochem社製）、Fmoc-
Tyr(PO₃H₂)、Fmoc-Tyr(PO₃H₂)、Fmoc-Tyr(PO₃H₂)、Fmoc
-Tyr(PO₃H₂)、Fmoc-Alaであった。反応終了後樹脂をMeO
H洗浄し、次いでDMF：ピペリジン（4:1）混液50mlを加
え、室温で１時間攪拌反応させてFmoc基を切断させた。
反応終了後、樹脂を濾取し、MeOHで洗浄した後、TFA：フ
ェノール：H₂O：チオアニソール：エタンシ゛オール（33：2：2：2：1）混液
20mlを加え室温で１時間攪拌反応させてポリペプチドを
樹脂から切断させた。反応終了後、樹脂を濾去し、濾液
にエーテルを加えて反応生成物を沈澱させた。得られた
沈澱を、陰イオンカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過
に供して、Ala-(Tyr(PO₃H₂))₅-βAla（ポリペプチド2
3）760mgを得た。反応生成物のアミノ酸分析並びにイオ
ンクロマトグラフィーの結果を表１に併せて示す。

【００７５】実施例７．4-マレイミト゛フ゛チリル-Ala-(Tyr(PO
₃H₂))₅-βAla（ポリペプチド24）の合成 Fmoc-βAla-Alko Resin 780mg(0.5mmol)を出発原料と
し、実施例１（１）と同じ試薬を用い、同様の操作を行
って所定のアミノ酸を導入した。尚、導入したアミノ酸
の順序はFmoc-Tyr(PO₃H₂)（Nova biochem社製）、Fmoc-
Tyr(PO₃H₂)、Fmoc-Tyr(PO₃H₂)、Fmoc-Tyr(PO₃H₂)、Fmoc
-Tyr(PO₃H₂)、Fmoc-Ala、マレイミドブチリル酸であっ
た。反応終了後、樹脂をMeOHで洗浄し、これをTFA：ア
ニソール（95：5）混液で処理してポリペプチドを樹脂
から切断させた。樹脂を濾去し、得られた濾液にエーテ
ルを加えて沈澱を生じさせた。得られた沈澱を、ODSカ
ラム［カラム：Wakosil₅C₁₈(2.0φx25cm)（和光純薬工
業(株)社製）、溶離条件：0.1% TFA，0→10%アセトニトリ
ル］、次いでゲル濾過に供し、4-マレイミト゛フ゛チリル-Ala-(Tyr
(PO₃H₂))₅-βAla（ポリペプチド24） 820mgを得た。反
応生成物のアミノ酸分析並びにイオンクロマトグラフィ
ーの結果を表１に併せて示す。

【００７６】

【表１】

【００７７】実施例８．陰イオン交換カラムでのアニオ
ン性ポリペプチドの溶出位置の検討 （試料）実施例１〜７で得られたポリペプチド１〜24を
夫々5mg/ml含有する水溶液を試料とした。尚、対照とし
て(Asp)₉-βAla（以下、「Asp9」と略記する。BOP/HOBt
法により自製した。）、平均分子量6000のポリアスパラ
ギン酸（以下、「Asp6K」と略記する。シグマ社製）又
は平均分子量50000のポリアスパラギン酸（以下、「pAs
p」と略記する。シグマ社製）を夫々5mg/ml含有する水
溶液も試料として調製した。 （分析条件） カ ラ ム：POROS-DEAE(4.6φx10mm、パーセプティブ社
製)。 溶離液Ａ：50mM リン酸緩衝液（pH7.6）。 溶離液Ｂ：50mM リン酸緩衝液（pH7.6、5M NaCl含
有）。 流 速：1ml/min。 検 出：硫酸化セリン残基含有ポリペプチドについ
て；UV220nm。 硫酸化チロシン残基含有ポリペプチドについて；UV260n
m。 リン酸化チロシン残基含有ポリペプチドについて；UV26
0nm。 グラジエント条件：０→５min Ａ＝100％ ５→30min Ｂ＝０→100％ 30→35min Ｂ＝100％ （測定操作）試料20μlを上記条件のＨＰＬＣにより分
析した。 （結果）各ポリペプチドの溶出に要する塩濃度（以下、
「溶出塩濃度」と略記する。）を図１に示す。尚、図１
中、●は溶出ピーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶出し
始めと終わりの塩濃度の範囲，すなわち、ピーク幅を示
す。また、図の横軸の各記号及び番号はポリペプチドの
種類（表１のポリペプチドNo.及び略号）を示す。 図
１の結果から以下のようなことが判る。 強酸由来の酸残基（硫酸基、リン酸基）数を増加させ
ることにより、溶出塩濃度が高くなることが判る。 ポリペプチド3（硫酸残基数：５）及び11（硫酸残基
数：３）はAsp9と同等の溶出塩濃度を示し、ポリペプチ
ド6（硫酸残基数：10）、8（硫酸残基数：９）、9（硫
酸残基数：10）、12,13（硫酸残基数：４）及び14,15
（硫酸残基数：５）はAsp6KやpAspと同等の溶出塩濃度
を示すこと、言い換えれば、本発明のポリペプチドは、
従来のカルボン酸残基を有するポリペプチドよりも短い
鎖長のもの（アミノ酸残基数が少ないもの）で、同等の
効果（陰イオン交換カラムへ保持される強さの程度が同
等であるという効果）が得られることが判る。 陰イオン交換カラムへ保持される強さの程度は、強酸
由来の酸残基の種類や数、該酸残基を導入するアミノ酸
残基の種類、カラム充填剤の性質等により変化する。例
えば、硫酸化セリン残基を有するポリペプチド２〜９に
ついての結果と硫酸化チロシン残基を有するポリペプチ
ド10〜20についての結果とを比較すると、強酸由来の酸
残基数が同じ場合には、硫酸化チロシン残基を有するポ
リペプチドの方が溶出塩濃度が高くなることが判る。
尚、この結果は、今回使用したカラム充填剤の基材が若
干疎水性を有するものであるため、ベンゼン環を有する
チロシン残基を保有するポリペプチドの方がカラムに保
持され易く、その結果見かけの溶出塩濃度が高くなっ
た、と考えられる。また、硫酸残基を５個有するポリペ
プチド３及び14についての結果とリン酸残基を５個有す
るポリペプチド23及び24の結果との比較から、硫酸残基
を有するポリペプチドの方が溶出塩濃度が高くなること
が判る。これらの結果から、導入する酸残基の種類や
数、構成アミノ酸残基の種類、カラム充填剤の種類等を
適宜選択することにより、任意の溶出塩濃度を有するポ
リペプチドを選択し得ることが判る。 強酸由来の酸残基を導入するアミノ酸残基の種類や
数、並びに該酸残基の種類や数が同じであっても、ポリ
ペプチド中のその他のアミノ酸残基の存在によって、陰
イオン交換カラムへ保持される強さの程度は変化する。
例えば、硫酸化チロシン残基を有するポリペプチド12〜
19の結果から、硫酸化チロシン残基数が同じでも、β-
アラニン残基の有無により、溶出塩濃度が変動する（β
-アラニン残基を導入することにより溶出塩濃度は低く
なる）ことが判る。この結果から、該酸残基を導入した
アミノ酸残基以外に適当なアミノ酸残基を導入すること
によっても、任意の溶出塩濃度を有するポリペプチドを
調製し得ることが判る。 比較例のpAsp-1及びpAsp-2（製造ロットの異なるpAs
p）により得られた結果から、従来のカルボン酸残基を
有するポリペプチドでは、製造ロットにより溶出塩濃度
が変化すること、言い換えれば、目的のピークのテーリ
ングの状況が変化すること、即ち均一の分子量を有する
ポリペプチドを得難いということが判る。これに対し、
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成により均一のも
のを容易に得られるので、pAspに於けるこのような問題
は生じない。

【００７８】実施例９ 抗体−硫酸化ポリチロシン結合
物の調製 （１）4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO₃
H))₈-βAlaの調製 実施例４で調製したAla-(Tyr(SO₃H))₈-βAla １mgを 0.
1M リン酸緩衝液（pＨ7.0）500μlに溶解し、これにス
ルホスクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレ
ート（ピアス・ケミカル社製）1.2mgを加え37℃で３時
間反応させた。この反応液をスーパーデックス・ペプチ
ド カラム（16mm ID×30cm：ファルマシア社製）で処理
して、余剰の試薬を除き4-(p-マレイミドフェニル)ブチ
リルAla-(Tyr(SO₃H))₈-βAla0.84mgの水溶液を得た（収
率７５％）。 （２）Fab'フラグメントの調製 抗ＡＦＰモノクローナル抗体・Ａ４−４（以下、「AFP-
A4-4」と略記する。和光純薬工業(株)製） 10mgを常法
に従って処理して、Ｆ（ab’）₂フラグメントとし（５m
g。収率８０％）、更にこれを常法により処理してFab'
フラグメント（以下、「AFP-A4-4・Fab'」と略記す
る。） 3.1mgを得た（収率６２％）。 （３）Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結
合物の調製 上記（１）で得た4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAl
a-(Tyr(SO₃H))₈-βAla3.1mgと、上記（２）で得たAFP-A
4-4・Fab'3.1mgとを0.1M リン酸緩衝液（pＨ7.0）中で、
４ ℃で16時間反応させた。この反応液を、スーパーデ
ックス 200pg カラム(26mmID×60cm：ファルマシア社
製）に供して余剰の4-(p-マレイミドフェニル)ブチリル
Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAlaを除去し、更にDEAE TOYOPEARL
カラム（10mmID×２cm： 東ソー(株)製）で処理して吸
着画分を回収し、Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAlaとAFP-A4-4・F
ab'との結合物１mgを得た（収率１５％）。

【００７９】実施例１０．抗体−硫酸化ポリチロシン結
合物の調製 （１）4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO₃
H))₈の調製 実施例４で調製したAla-(Tyr(SO₃H))₈（ポリペプチド 1
9）25 mgを ＤＭＦ3mlに溶解し、これにスルホスクシイ
ミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート（ピアス
・ケミカル社製）10 mgを加え室温で１時間反応させ
た。この反応混液をODSカラム［カラム：Wakosil ₅C
₁₈(2.0φx25cm)（和光純薬工業(株)社製）、溶離条件：
50mM酢酸アンモニウム pH6，2→60%アセトニトリル］で処理
し、得られた目的物を含む画分を濃縮乾固し4-(p-マレ
イミドフェニル)ブチリルAla-(Tyr(SO₃H))₈26.5 mgを得
た（収率９５％）。得られた4-(p-マレイミドフェニル)
ブチリルAla-(Tyr(SO₃H))₈のＮＭＲデータを以下に示
す。¹ H-NMR(270 MHz,DMSO-d₆) δppm:7.16 (s,2H マレイミト゛フ゜ロ
トン) また、実施例９（１）の結果との比較から、この方法の
方がマレイミド基をＮ末端に導入したポリペプチドを収
率良く得ることができることが判る。更に、この方法に
より得られた4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAla-(T
yr(SO₃H))₈は、15℃以下で保存すれば分解することなく
安定に保存し得ることも判ったので、実施例９（１）の
方法で得られたもの（水溶液状態のもの。一日程度で殆
ど分解する。）よりも使用し易いことも判った。 （２）Fab'フラグメントの調製 抗ＡＦＰモノクローナル抗体・Ａ４−４（以下、「AFP-
A4-4」と略記する。和光純薬工業(株)製） 30mgを常法
に従って処理して、Ｆ（ab'）₂フラグメントとし（１６
mg。収率８０％）、更にこれを常法により処理してFab'
フラグメント（以下、「AFP-A4-4・Fab'」と略記す
る。）11.1mgを得た（収率７０％）。 （３）Ala-(Tyr(SO₃H))₈とAFP-A4-4・Fab'との結合物の
調製 上記（１）で得た4-(p-マレイミドフェニル)ブチリルAl
a-(Tyr(SO₃H))₈1mgと、上記（２）で得たAFP-A4-4・Fab'
11.1mgとを 50 mM リン酸緩衝液 pH 6.5で、４℃ 16時
間反応させた。この反応液を、POROS DEAEカラム（6mmI
D×1cm：パーセプティブ社製）で、Ala-(Tyr(SO₃H))₈と
AFP-A4-4・Fab'との結合物を分画し6mgを得た（収率６０
％）。この結果と実施例９（３）の結果との比較から、
本実施例（１）の方法で得られたマレイミド基がＮ末端
に導入されたポリペプチドを用いることにより、本発明
のポリペプチドとFab'との結合物を効率よく得ることが
できることが判る。尚、この理由については明らかでは
ないが、実施例９（１）では遊離のスルホスクシイミジ
ル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレートの除去をスー
パーデックス・ペプチド カラムを用いて行っており、
本実施例（１）では、これをＯＤＳカラムを用いている
ためではないかと考えられる。即ち、マレイミド基を導
入した本発明のペプチドと遊離のスルホスクシイミジル
-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレートの分子量差が小
さいため、スーパーデックス・ペプチド カラムではこ
れらを充分に分離することができず、Fab'との反応の際
に遊離のスルホスクシイミジル-4-(p-マレイミドフェニ
ル)ブチレートがFab'と反応したため、結果的にAla-(Ty
r(SO₃H))₈-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結合物の収率が低
下した、と考えらえれる。

【００８０】実施例１１．アニオン性ポリペプチドと抗
体との結合物の陰イオン交換クロマト溶出位置の検討 （試料）実施例９と同じ試薬を用い同様の操作を行っ
て、表１に記載の各種アニオン性ポリペプチドとAFP-A4
-4・Fab'との結合物を調製し、これを１mg/ml含有する水
溶液を試料とした。但し、ポリペプチド24はN末端にマ
レイミド基が結合しているため、4-(p-マレイミドフェ
ニル)ブチレート化処理を行わずに、そのままAFP-A4-4・
Fab'と結合させた。また、対照として、市販のpAsp（2L
ot）についても実施例９と同じ試薬を用い同様の操作を
行って、AFP-A4-4・Fab'との結合物とし、これを１mg/ml
含有する水溶液を調製して試料とした。尚、ポリペプチ
ド22については、目的のAFP-A4-4・Fab'との結合物は得
られなかった。これは、ポリペプチドのN末端にアニオ
ン性アミノ酸残基が存在すると電荷的な原因により抗体
との結合（より正確にはポリペプチドと架橋剤との結
合）効率が低下するためと考えられる。 （分析条件及び測定操作）実施例８と同様に行った。但
し、検出は何れの場合もUV280nmで行った。 （結果）各種ポリペプチドとAFP-A4-4・Fab'との結合物
の溶出塩濃度並びにピーク幅を図２に示す。尚、図２
中、●は溶出ピーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶出し
始めと終わりの塩濃度の範囲（即ち、ピーク幅）を示
す。また、図の横軸の各記号はポリペプチドの種類（表
１のポリペプチドNo.及び略号）を示す。図２の結果か
ら以下のことが判る。 抗体と結合させることにより、溶出塩濃度は、ポリペ
プチド単独の場合よりも若干下がるが、各種ポリペプチ
ド間並びにpAspの溶出塩濃度との相対関係は、実施例８
で得られたそれと同一であることが判る。 図２には示していないが、POROS-DEAE(4.6φx10mm、
陰イオン交換カラム)を用いて実施例８の分析条件で血
清成分の分析を行った場合、血清中の共存物質の溶出ピ
ーク頂点での塩濃度は、0.3 Ｍ付近であった。このこと
から、ポリペプチド１（硫酸残基数：１）と抗体との結
合物を分離向上物質として用いた場合には、目的のピー
クが血清中の共存物質のピークと重なり測定（分析）の
精度が低下することが判った。また、図２の結果から
は、ポリペプチド１程ではないが、ポリペプチド２（硫
酸残基数：３）、ポリペプチド１０（硫酸残基数：１）
及びポリペプチド１１（硫酸残基数：３）と抗体との結
合物を分離向上物質として用いた場合にも、若干血清中
の共存物質の影響により測定（分析）の精度が低下する
ことが示唆された。尚、今回使用した充填剤である POR
OS-DEAE は、基材が若干疎水性を有するものであるた
め、硫酸化チロシン残基を有するポリペプチド10〜20と
抗体との結合物の方が、硫酸化セリン残基を有するポリ
ペプチドと抗体との結合物に比較して見かけの溶出塩濃
度が高くなっている。そのため、硫酸残基を１個しか有
さないがチロシン残基を有しているポリペプチド10と抗
体との結合物の見かけの溶出塩濃度は、硫酸化セリン残
基を３個有するポリペプチド２と抗体との結合物のそれ
と同程度である。しかしながら、使用する充填剤を、そ
の基材が親水性のものに変更して上記と同様の実験を行
うと、硫酸化チロシン残基を１個しか有さないポリペプ
チド10と抗体との結合物の見かけの溶出塩濃度は、硫酸
化セリン残基を１個しか有さないポリペプチド１と抗体
との結合物のそれと同程度となって、血清中の共存物質
のピークと重なり測定（分析）の精度が低下すると予想
される。これらの結果から、分離向上物質としては、強
酸由来の酸残基が少なくとも３個、好ましくは４個以
上、より好ましくは５個以上有するポリペプチドが望ま
しいことも判る。

【００８１】実施例12．硫酸化セリン含有ポリペプチド
と硫酸化チロシン含有ポリペプチドの水溶液中での安定
性の検討 Ala-(Ser(SO₃H))₈-βAla（ポリペプチド４）又はAla-(T
yr(SO₃H))₅-βAla（ポリペプチド14）を、pH6〜10の緩
衝液中、40℃で保存し、安定性の検討を行った。 （試料）ポリペプチド４又は14を下記緩衝液に各々終濃
度１mg/mlとなるように溶解したものを試料とした。 緩衝液: pH 6.0 2ーモルホリノエタンスルホン酸（MES）。 pH 7.0 3ーモルホリノフ゜ロハ゜ンスルホン酸（MOPS）。 pH 8.0 N-トリス(ヒト゛ロキシメチル)メチルー3ーアミノフ゜ロハ゜ンスルホン酸（TAP
S）。 pH 9.0 TAPS。 pH10.0 N-シクロヘキシルー2ーヒト゛ロキシー3ーアミノフ゜ロハ゜ンスルホン酸（CAPS
O）。 尚、緩衝液濃度は全て50mMとした。 （保存方法）各試料を40℃で所定日数保存した。 （結果）保存６日目と19日目での試料中のポリペプチド
残存率（％）を、実施例８の分析条件及び操作方法によ
り求めた、調製直後の試料に於けるポリペプチドのピー
ク面積と所定日数保存後の試料に於けるポリペプチドの
ピーク面積とに基づいて求めた。ポリペプチド４につい
ての測定結果を図３に、ポリペプチド14についての測定
結果を図４に夫々示す。尚、各図中、黒棒は保存６日目
の試料について得られた結果を、また、白棒は保存19日
目の試料について得られた結果を夫々示す。図３の結果
から、ポリペプチド４については、保存時のpＨが上が
るにつれて分解が促進されることや、一番安定であった
pＨ６に於いても16日間保存後には１割以上が分解され
ること等が判る。一方、図４の結果から、ポリペプチド
14は全てのpHで安定であることが判る。これらの結果か
ら、チロシン残基に導入された硫酸基は、セリン残基に
導入された硫酸基よりもpHの影響を受けにくく安定であ
ること、即ち分離向上物質として使用する場合により好
ましい性質を有していることが判る。

【００８２】実施例13.ＴＳＨ（Thyroid stimulating h
ormone,甲状腺刺激ホルモン）の測定 （パーオキシダーゼ標識抗ＴＳＨ抗体Fab'フラグメント
の調製）抗ＴＳＨ抗体（以下、「TSH-1」と略記する。
和光純薬工業(株)製）を常法 により処理してFab'フラ
グメントとし、これに常法によりパーオキシダーゼ（東
洋紡社製）を結合させてパーオキシダーゼ標識抗ＴＳＨ
抗体Ｆab'フラグメント（以下、「TSH-1・Fab'-POD」と
略記する。）を調製した。 （抗体液１）TSH-1・Fab'-PODを５nM含有する50mM MOPS
緩衝液（pH 7.5）を調製し、抗体液１とした。 （抗体液２）TSH-1と認識部位が異なることが確認され
ている抗ＴＳＨモノクローナル抗体（以下、「TSH-2」
と略記する。和光純薬工業(株)製）を常法により処理し
て Fab'フラグメント（以下、「TSH-2・Fab'」と略記す
る。）とし、これと、Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla（ポリペ
プチド14）又はAla-(Ser(SO₃H))₅-βAla（ポリペプチド
３）との結合体を、実施例９（３）と同様の操作により
調製した。これらの何れかを50nM含有する50mM MOPS 緩
衝液（pH 7.5）を調製し、抗体液２とした。 （試料）市販のＴＳＨ（genzyme社製）を50mM MOPS緩衝
液（pH 7.5、0.5％牛血清アルブミン含有）に70pMとな
るように添加したものを試料とした。 （HPLCの使用条件） カラム：0.46¢x1.0cm。 充填剤：POROS-DEAEゲル（パーセプティブ社商品名）。 溶離液Ａ：50mM MOPS 緩衝液 pH7.5。 溶離液Ｂ：50mM MOPS 緩衝液 pH7.5、3M 塩化ナトリウ
ム。 基質液：25mM 4-N-アセチルアミノフェノール（同仁化
学研究所(株)社製）水溶液。 流 速：溶離液Ａ＋溶離液Ｂ；1.0ml/min、基質液；0.1
ml/min。 反応部：0.025¢x1000cm （60℃保温）。 検 出：励起波長 328nm、蛍光波長 432nmで測定した。 グラジエント条件：０→10min Ｂ＝０→100％ （測定操作）抗体液１ 100μl、試料50μl及び抗体液２
50μlを混合し、25℃で30分間放置した後、該混合液の
10μlを上記条件のＨＰＬＣにより測定（分析）した。 （結果）ＨＰＬＣ分析の結果、各種物質の溶出塩濃度
（塩化ナトリウム濃度）は以下の如くであった。 ・TSH-1・Fab'-POD及びTSH-1・Fab'-PODとＴＳＨとの複合
体：０〜0.1M。 ・TSH-1・Fab'-POD、ＴＳＨ及び、TSH-2・Fab'とAla-(Tyr
(SO₃H))₅-βAla（ポリペプチド14）の結合物との複合
体：0.5〜1.2M。 ・TSH-1・Fab'-POD、ＴＳＨ及び、TSH-2・Fab'とAla-(Ser
(SO₃H))₅-βAla（ポリペプチド３）の結合物との複合
体：0.25〜0.45M。 以上の結果より、硫酸化ポリペプチドと抗体との結合物
を使用することにより、共存する遊離のPOD標識抗体と
測定対象物質を含む複合体とをより明確に分離すること
ができるようになることや、硫酸化ポリペプチドの種類
を適宜選択することにより、目的の複合体の溶出位置を
自由に調節することができるようになること等が判る。
尚、硫酸化ポリペプチドが結合した複合体のピークを利
用することにより、試料中のＴＳＨについて良好な検量
線が得られること、言い換えればＴＳＨ量の定量が可能
となることも判った。

【００８３】実施例14. Fab'とアニオン性ポリペプチ
ドとの結合物を用いたAFPの測定 （パーオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体Fab'フラグメント
の調製）AFP-A4-4とは異なるエピトープを認識する抗Ａ
ＦＰ抗体・ＷＡ−１（以下、「AFP-WA-1」と略記する。
和光純薬工業(株)製）を常法により処理してＦab'フラ
グメントとし、これに常法によりパーオキシダーゼ（東
洋紡社製）を結合させてパーオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ
抗体Fab'フラグメント（以下、「AFP-WA-1・Fab'-POD」
と略記する。）を調製した。 （試薬）実施例11で調製した、表１に記載の各種アニオ
ン性ポリペプチドとAFP-A4-4・Fab'との結合物のうちの
所定のものを 200nM、AFP-WA-1・Fab'-PODを 100nM及び
ポリビニルアルコール（アルドリッチ社製）を0.2(W/V)
%含有するMOPS緩衝液（pH7.5）を調製し、試薬とした。 （試料）市販のAFPを50mM MOPS緩衝液（pH7.5、0.2(W/
V)%ポリビニルアルコール含有）に100ng/mlとなるよう
に添加、溶解したものを試料とした。 （ＨＰＬＣ条件） カラム：POROS-DEAE（4.6φX10mm）。 溶離液Ａ：50mM MOPS緩衝液（pH7.5）。 溶離液Ｂ：50mM MOPS緩衝液（3M NaCl含有。pH7.5）。 基質液：50mM MOPS緩衝液（90mM 4-N-(4-カルホ゛フ゛チリル)アミノ
フェノール及び20mM H₂O₂含有。pH7.5）。 流 速：Ａ＋Ｂ液 1ml/min（基質液は0.1ml/min）。 反応部：0.025φX1000cm。 温 度：60℃。 検 出：励起波長 328nm／蛍光波長 432nm。 グラジェント条件：実施例８と同じ。 （測定方法）試薬 100μlと試料 10μlとを混合し、8
℃、10分間反応させた後、混合液の20μlを上記条件のH
PLCにより分析した。 （結果）各種ポリペプチドとAFP-A4-4・Fab'との結合
物、AFP-WA-1・Fab'-POD及びAFPとの複合体（抗原抗体複
合体）の溶出塩濃度並びにピーク幅を図５に示す。尚、
図５中、●は溶出ピーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶
出し始めと終わりの塩濃度の範囲（即ち、ピーク幅）を
示す。また、図の横軸の各記号はポリペプチドの種類
（表１のポリペプチドNo.及び略号）を示す。図５の結
果から、以下のことが判る。 AFP-A4-4・Fab'に結合したポリペプチドの種類によ
り、抗原抗体複合体の溶出塩濃度（溶出位置）が変化す
る。尚、各抗原抗体複合体の溶出される順序は、AFP-A4
-4・Fab'とポリペプチドとの結合物の溶出される順序
（実施例１１及び図２参照。）と同じであった。また、
この結果から、ポリペプチドの種類を適宜選択すること
により、目的の抗原抗体複合体の溶出塩濃度を適宜設定
し得ることも判る。 遊離のAFP-WA-1・Fab'-PODの溶出塩濃度は0〜0.1Mであ
ったので、何れのポリペプチドを用いた場合でも、遊離
のAFP-WA-1・Fab'-PODと抗原抗体複合体とを完全に分離
することができた。特に、ポリペプチド４〜９、11〜21
を用いた場合には、抗原抗体複合体の溶出塩濃度を0.3M
以上とすることができるので、これらポリペプチドを分
離向上物質として用いることにより、血清中の共存物質
による測定への影響をより確実に回避することができ
る。尚、既に述べたように、今回使用した充填剤である
POROS-DEAEは、基材が若干疎水性を有するものである
ため、硫酸化チロシン残基を有するポリペプチド10〜20
と抗体との結合物から形成された抗原抗体複合物の方
が、硫酸化セリン残基を有するポリペプチドと抗体との
結合物から形成されたそれらに比較して見かけの溶出塩
濃度が高くなっているため、硫酸残基を１個しか有さな
いがチロシン残基を有しているポリペプチド10と抗体と
の結合物から形成される抗原抗体複合物の見かけの溶出
塩濃度は、硫酸化セリン残基を３個有するポリペプチド
２と抗体との結合物から形成される抗原抗体複合物のそ
れと同程度となっている。しかしながら、使用する充填
剤を、その基材が親水性のものに変更して上記と同様の
実験を行うと、硫酸化チロシン残基を１個しか有さない
ポリペプチド10と抗体との結合物から形成される抗原抗
体複合物の見かけの溶出塩濃度は、硫酸化セリン残基を
１個しか有さないポリペプチド１と抗体との結合物から
形成される抗原抗体複合物のそれと同程度となって、血
清中の共存物質のピークと重なり測定（分析）の精度が
低下すると予想される。 以上の結果から、ポリペプチドを分離向上物質として
用いるためには、ポリペプチド中の強酸由来の酸残基数
は３〜20個、好ましくは４〜30個、より好ましくは５〜
15個と考えられる（酸残基数を多くするとカラムからの
溶出塩濃度が高くなりすぎるので、測定操作上好ましく
ない。）。 溶出塩濃度の異なるポリペプチドを２種以上組み合わ
せて（例えばポリペプチド４〜７、８、９、11〜14の何
れかと、ポリペプチド７、16〜21の何れかの組み合わ
せ）、夫々を適当な結合能物質と結合させて用いること
により、類似構造を有する２以上の物質（例えば、糖鎖
構造等構造の一部のみが異なる２以上の物質、アイソザ
イム、１つの抗原に対して異なるエピトープを認識する
２以上の抗体等）の分別測定を実施することが可能にな
る。 ポリペプチドとしてpAsp-1及びpAsp-2（製造ロットの
異なるpAsp）を用いた場合の結果から、従来のカルボン
酸残基を有するポリペプチドでは、製造ロットにより溶
出塩濃度が変化し、目的のピークのテーリングの状況が
変化すること、言い換えれば、均一の分子量を有するポ
リペプチドを得難いという問題を有することが示唆され
た。これに対し、本発明のポリペプチドは、ペプチド合
成により均一のものを容易に得られるので、pAspに於け
るこのような問題は生じない。尚、実施例11で調製し
た、抗体液１ 100μl、試料50μl及び抗体液２［TSH-2・
Fab'とAla-(Ser(SO₃H))₅-βAla（ポリペプチド３）の結
合物含有］ 50μlとを混合し、25℃で30分間放置して得
た混合液の20μlを上記条件のＨＰＬＣにより測定（分
析）したところ、ポリペプチド３を用いてAFPの測定
（分析）を行った場合の抗原抗体複合体の溶出塩濃度で
目的の抗原抗体複合体が溶出された（図５の「ポリペプ
チドの略号TSH」の項に、溶出塩濃度のデータを併せて
示す。）。この結果から、本発明のポリペプチドを分離
向上物質として用いることにより、測定対象物質が異な
る場合であっても一定の分析条件のＨＰＬＣを用いて目
的の測定（分析）を実施し得ることが判る。

【００８４】実施例15．本発明のポリペプチドを用い
た、糖鎖構造の異なるＡＦＰの分別測定法 （試液１）抗体として抗ＡＦＰモノクローナル抗体・Ｗ
Ａ−２（以下、「AFP-WA-2」と略記する。和光純薬工業
(株)製。尚、この抗体の抗原認識部位は、AFP-WA-1及び
AFP-A4-4のそれとは異なっている。）を、また、ポリペ
プチドとしてAla-(Tyr(SO₃H))₅-βAlaを用いた以外は実
施例９と同じ試薬を用い、同様の操作を行って調製した
AFP-WA-2・Fab'とAla-(Tyr(SO₃H))₅-βAlaの結合物を 13
9nM、レンズ豆レクチン（以下、「ＬＣＡ」と略記す
る。和光純薬工業(株)製）を１mg/ml、塩化マグネシウ
ムを１mM及び塩化カルシウムを１mM含有する50mM MES緩
衝液（pＨ6.5）を調製し、試液１とした。 （試液２）実施例12で調製したAFP-WA-1・Fab'-PODを 14
7nM、実施例９で調製したAla-(Tyr(SO₃H))₈-βAlaとAFP
-A4-4・Fab'との結合物を 156nM、及びポリビニルアルコ
ールを0.2(W/V)%含有する 50nM MOPS緩衝液（pＨ7.5）
を試液２とした。 （試料）ヒト肝細胞癌由来ＡＦＰをＬＣＡ固定化カラム
を用いてＬＣＡ非結合性ＡＦＰとＬＣＡ結合性ＡＦＰに
分画した。これらの何れかを、ＡＦＰを含まないヒト血
清中に100ng/mlとなるように添加して、試料１（ＬＣＡ
非結合性ＡＦＰ含有）及び試料２（ＬＣＡ結合性ＡＦＰ
含有）とした。 （ＨＰＬＣ条件） ・カラム ：POROS-DEAE(4.6mmID×10mm)。 ・緩衝液Ａ：50mM TAPS緩衝液（pＨ8.5、0.25M NaCl含
有）。 緩衝液Ｂ：50mM TAPS緩衝液（pＨ8.5、３M NaCl含
有）。 ・基質液 ：50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5、90mM 4-N-(4-
カルボブチリル)アミノフェノール及び20mM Ｈ₂Ｏ₂含
有）。 ・グラジェント条件：緩衝液Ａ＋Ｂ、流速２ｍｌ／分。 ０→２分 Ｂ＝０％ ２→4.5分 Ｂ＝13％ 4.5→８分 Ｂ＝100％ ８→8.5分 Ｂ＝０％ ・ポストカラム：ＰＯＤ基質添加（基質液、0.1ml/mi
n）。60℃、30秒間反応 ・検出：励起波長 328nm／蛍光波長 432nm。 （測定操作）試液１ 100μlと、試料１又は試料２ 10μ
lとを混合し、８℃で10分間反応させた。次いで、これ
に試液２ 10μl加え、更に20分間反応させた。この反応
混液80μlを上記条件のＨＰＬＣで測定（分析）した。 （結果）測定結果を図６に示す。尚、図中、実線（−）
は試料１について得られたデータを、また、点線（---
-）は試料２について得られたデータを夫々示す。図６
の結果から、ＡＦＰ、AFP-WA-2・Fab'とAla-(Tyr(SO₃H))
₅-βAlaの結合物及びAFP-WA-1・Fab'-PODとの抗原抗体複
合体（複合体１）は2.9分の位置に、また、複合体１に
更にAla-(Tyr(SO₃H))₈-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結合
物が結合した抗原抗体複合体（複合体２）は5.8分の位
置に溶出され、夫々は明確に分離されることが判る。ま
た、図６の結果から、ＬＣＡ非結合性ＡＦＰを含む試料
１に於いては、生成する抗原抗体複合体は、Ala-(Tyr(S
O₃H))₈-βAlaとAFP-A4-4・Fab'との結合物が結合した複
合体２が主であり、ＬＣＡ結合性ＡＦＰを含む試料２に
於いては、生成する抗原抗体複合体は、複合体１が主で
あることも判る。この結果は、Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAla
とAFP-A4-4・Fab'との結合物はＬＣＡとの競合反応によ
りＡＦＰとの反応が阻害されることを示している。ま
た、生成する両複合体量に対する複合体１量比（複合体
１比）を求めたところ（表２参照）、この値が試料中の
ＬＣＡ結合性ＡＦＰ比率を反映すること、言い換えれ
ば、この値を利用することにより試料中のＬＣＡ結合性
ＡＦＰ比率を測定し得ることも判明した。

【００８５】比較例 AFP-WA-2・Fab'とAla-(Tyr(SO₃H))₅-βAlaの結合物の代
りにAFP-WA-2・Fab'と平均分子量6,000のアスパラギン酸
ポリマーとの結合物を、また、Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAla
とAFP-A4-4・Fab'の結合物の代りにAFP-A4-4・Fab'と平均
分子量28,800のアスパラギン酸ポリマーとの結合物を用
いた以外は、実施例15と同じ実験を行い、複合体１比を
求めた。尚、ここで使用した試液１に、平均分子量55万
のγ−ポリグルタミン酸を100μg/mlとなるように添加
したものを用いても上記と同じ実験を行い複合体１比を
求めた。結果を表２に併せて示す。

【００８６】

【表２】 ＊γPGA：平均分子量55万のγ−ポリグルタミン酸。

【００８７】表２の結果から、比較例の方法（ポリアス
パラギン酸を用いる方法）では試料１で複合体１比が高
めにでる傾向があること、言い換えれば非特異的反応が
生じる傾向がみられ、この現象を抑制するためにγPGA
等の陰イオン性添加剤を添加する必要が あることが判
る。これに対し、本発明のポリペプチドを使用した場合
には、このような添加剤は不要である。従って、本発明
のポリペプチドを分離向上物質として用いる測定方法
は、従来から分離向上物質として用いられていたポリア
スパラギン酸等のカルボキシル基を有するポリマーを用
いる測定方法に比較して、この点でも優れた測定方法で
あることが判る。尚、このような現象が起こる理由につ
いては明らかではないが、例えば以下のように推測され
る。即ち、ポリアスパラギン酸のような陰イオン性高分
子では分子が比較的大きいために電荷や立体障害等によ
る抗原抗体反応の阻害が起こって上記のような現象が生
じ、一方、本願のポリペプチドは、分子が小さいが故に
抗原抗体反応への影響は殆ど発生しないと推測される。

【００８８】実施例16．溶離液への界面活性剤の添加効
果の検討 （測定用試薬）実施例９で調製したポリペプチド18とAF
P-A4-4 Fab'との結合物を200nM及び実施例14で調製した
AFP-WA-1・Fab'-PODを100nM含有する 50mM MOPS緩衝液
（pＨ7.5）を測定用試薬とした。 （試料）実施例14と同じ。 （ＨＰＬＣ条件） ・カラム：POROS-DEAE(4.6mmID×10mm)。 ・緩衝液Ａ：50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5。所定の界面活
性剤を0.1(W/V)%含有）。 緩衝液Ｂ：50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5、３M NaCl及び所
定の界面活性剤を0.1(W/V)%含有）。 ・基質液：50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5、90mM 4-N-(4-カ
ルボブチリル)アミノフェノール及び20mM Ｈ₂Ｏ₂含
有）。 ・グラジェント条件：緩衝液Ａ＋Ｂ、流速１ｍｌ／分。 ０→５min Ａ＝100％ ５→30min Ｂ＝０→100％ 30→35min Ｂ＝100％ ・ポストカラム：ＰＯＤ基質添加（基質液、0.1ml/mi
n）。60℃、30秒間反応 ・検 出：励起波長 328nm／蛍光波長 432nm。 尚、溶離液中に添加した界面活性剤の種類を表３に示
す。

【００８９】

【表３】

【００９０】（測定操作）測定用試薬 100μlと、試料
10μlとを混合し、８℃で10分間反応させた。次いで、
この反応液20μlを上記条件のＨＰＬＣで測定（分析）
した。 （結果）各種界面活性剤を添加した溶離液について得ら
れた、AFPの抗原抗体複合物の溶出塩濃度並びにピーク
幅を図７に示す。尚、図７中、●は溶出ピーク頂点での
塩濃度を示し、Ｉは溶出し始めと終わりの塩濃度の範囲
（即ち、ピーク幅）を示す。また、図の横軸の各記号は
界面活性剤の種類（表３の界面活性剤No.）を示す。図
７の結果から、以下のことが判る。 界面活性剤を添加することにより、ピーク幅を狭くす
ることができること、言い換えれば、溶出時のピークの
テーリングを防止し得ること、更に言い換えれば、測定
精度を向上させることができることが判る。また、この
効果は、陽イオン系界面活性剤及び両性系界面活性剤で
顕著に現れることも判る。 界面活性剤を添加することにより、溶出塩濃度（溶出
位置）が変動すること、言い換えれば、界面活性剤の種
類を適宜選択することにより目的の抗原抗体複合物の溶
出塩濃度を適宜設定し得ることが判る。

【００９１】実施例17．電気泳動での分離 （試料）実施例10で作製したAFP-A4・Fab'、Ala-(Tyr(SO
₃H))₈とAFP-A4-4・Fab'の結合物、実施例15で作製したAF
P-WA2・Fab'、Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAlaとAFP-WA2・Fab'の
結合物を各々１mg／mlとなるように50mM MOPS緩衝液(pH
7.5)で希釈したものを試料とした。 （測定操作）１％アガロースゲルの試料溝に各々の試料
４μlをアプライし、試料溝側を陰極として電圧200Vで3
0分電気泳動を行った後、Quick-CBB（和光純薬工業(株)
商品名）を用いてタンパク質の染色を行い、各々の試料
のRf値を測定した。 （結果）各々のRf値は、AFP-A4・Fab' 0.38、Ala-(Tyr(S
O₃H))₈とAFP-A4-4・Fab'の結合物 0.66、AFP-WA2・Fab'
0.06、Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合物
0.22であった。この結果より、硫酸化ペプチドを結合す
ることにより、陰性電荷が増え、移動度が大きくなるこ
とが判る。また、硫酸化ペプチドの硫酸残基数が多いほ
ど移動度が大きくなることも判る。

【００９２】実施例18．硫酸化ペプチド結合抗体と抗原
反応物の分離 （試料）実施例 50mM MOPS緩衝液（pＨ7.5）で0.5mg／m
lになるように調製したAFP 50μlに、実施例17で調製し
たAla-(Tyr(SO₃H))₈とAFP-A4-4・Fab'の結合物（１mg／m
l）50μl、又はAla-(Tyr(SO₃H))₅-βAlaとAFP-WA2・Fab'
の結合物（１mg／ml）50μl、又はMOPS緩衝液（pＨ7.
5）50μlを加え、37℃で30分間反応させたものを試料と
した。 （測定操作）１％アガロースゲルの試料溝に各々の試料
４μlをアプライし、試料溝側を陰極として電圧200Vで3
0分間電気泳動を行った後、抗AFP抗体を結合したニトロ
セルロース膜で抗体親和転写（ブロッティング）を室温
で30分行った。この膜を洗浄液(0.9％ NaCl）で２回洗
浄した。この膜を抗AFP抗体液中に37℃で30分間浸した
後、洗浄液で２回洗浄した。次にこの膜をPOD標識抗IgG
抗体液中に37℃で30分浸した後、洗浄液で２回洗浄し
た。更にこの膜を発色液（0.37mM ニトロテトラゾリウ
ムブルー,2.6mM β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド還元型,0.01％過酸化水素）中で発色させ、抗原抗
体反応物のRf値を測定した。 （結果）Ala-(yr(SO₃H))₈とAFP-A4・Fab'の結合物とAFP
の抗原抗体反応物のRf値は0.63、Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βA
laとAFP-WA2・Fab'の結合物とAFPの抗原抗体反応物のRf
値は0.20、AFPのみのRf値は0.85であった。上記の結果
並びに実施例17の結果から明らかな如く、Ala-(Tyr(SO₃
H))₈とAFP-A4-4・Fab'の結合物とAFPの抗原抗体反応物の
Rf値と、Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合
物とAFPの抗原抗体反応物のRf値は、夫々Ala-(Tyr(S
O₃))₈とAFP-A4-4・Fab'の結合物のRf値及びAla-(Tyr(SO₃
H))₅-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合物のRf値と殆ど同じで
あった。このように、AFPの陰性電荷は、Ala-(Tyr(SO
₃H))₈とAFP-A4-4Fab'の結合物とAFPの抗原抗体反応物の
Rf値やAla-(Tyr(SO₃H))₅-βAlaとAFP-WA2・Fab'の結合物
とAFPの抗原抗体反応物のRf値には殆ど影響を及ぼさな
いことが判る。

【００９３】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、生体試料中
の測定対象物質と、結合能物質との相互作用の結果生じ
る複合体と、遊離の結合能物質等や該複合体の検出に影
響を与える恐れのある共存物質とを陰性電荷を利用する
方法を用いて分離する際に、該複合体と遊離の結合能物
質等とをより効果的に分離するために用いることのでき
る新規なポリペプチド並びにこのポリペプチドを使用し
た生体試料中の測定対象物質の測定方法を提供するもの
であり、本発明の測定方法を利用して血清等の生体試料
中の微量成分の測定を行った場合には、従来のＥＩＡや
ＲＩＡ等の測定法、或は、分離向上物質としてカルボキ
シル基を有するポリマーを利用する方法等に比較して容
易に且つ極めて短時間で高精度の測定が行な得るという
顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ
大なる発明である。

【００９４】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例８で得られた、アニオン交換カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるア
ニオン性ポリペプチドの溶出位置を示したものである。

【図２】実施例11で得られた、アニオン交換カラムを用
いたＨＰＬＣによる、抗体のFab'フラグメントとアニオ
ン性ポリペプチドの結合物の溶出位置を示したものであ
る。

【図３】実施例12で得られた、硫酸化セリン残基を有す
るポリペプチドの各種pＨ溶液中での保存安定性のデー
タを示すものである。

【図４】実施例12で得られた、硫酸化チロシン残基を有
するポリペプチドの各種pＨ溶液中での保存安定性のデ
ータを示すものである。

【図５】実施例14で得られた、アニオン交換カラムを用
いたＨＰＬＣによる、各種抗原抗体複合体の溶出位置を
示したものである。

【図６】実施例15に於て得られたＨＰＬＣによる試料の
測定（分析）溶出パターンを示す。

【図７】実施例16に於て得られた、アニオン交換カラム
を用いたＨＰＬＣによる、各種抗原抗体複合体の溶出位
置を示したものである。

【符号の説明】

図１、図２及び図５中、●は溶出ピーク頂点での塩濃度
を示し、Ｉは溶出し始めと終わりの塩濃度の範囲（即
ち、ピーク幅）を示す。また、図の横軸の各記号はポリ
ペプチドの種類（表１のポリペプチドNo.及び略号）を
示す。図３及び図４中、黒棒は保存６日目の試料につい
て得られた結果を、また、白棒は保存19日目の試料につ
いて得られた結果を夫々示す。図６中、実線（−）は試
料１について得られたデータを、また、点線（----）は
試料２について得られたデータを夫々示す。図７中、●
は溶出ピーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶出し始めと
終わりの塩濃度の範囲（即ち、ピーク幅）を示す。ま
た、図の横軸の各記号は界面活性剤の種類（表３の界面
活性剤No.）を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年８月８日

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８２】実施例１３．ＴＳＨ（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｓ
ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ，甲状腺刺激ホ
ルモン）の測定（パーオキシダーゼ標識抗ＴＳＨ抗体Ｆ
ａｂ’フラグメントの調製） 抗ＴＳＨ抗体（以下、「ＴＳＨ−１」と略記する。和光
純薬工業（株）製）を常法により処理してＦａｂ’フラ
グメントとし、これに常法によりパーオキシダーゼ（東
洋紡社製）を結合させてパーオキシダーゼ標識抗ＴＳＨ
抗体Ｆａｂ’フラグメント（以下、「ＴＳＨ−１・Ｆａ
ｂ’−ＰＯＤ」と略記する。）を調製した。 （抗体液１）ＴＳＨ−１・Ｆａｂ’−ＰＯＤを５ｎＭ含
有する５０ｍＭ ＭＯＰＳ 緩衝液（ｐＨ ７．５）を
調製し、抗体液１とした。 （抗体液２）ＴＳＨ−１と認識部位が異なることが確認
されている抗ＴＳＨモノクローナル抗体（以下、「ＴＳ
Ｈ−２」と略記する。和光純薬工業（株）製）を常法に
より処理してＦａｂ’フラグメント（以下、「ＴＳＨ−
２・Ｆａｂ’」と略記する。）とし、これと、Ａｌａ−
（Ｔｙｒ（ＳＯ_３Ｈ））_５−βＡｌａ（ポリペプチド１
４）又はＡｌａ−（Ｓｅｒ（ＳＯ_３Ｈ））_５−βＡｌａ
（ポリペプチド３）との結合体を、実施例９（３）と同
様の操作により調製した。これらの何れかを５０ｎＭ含
有する５０ｍＭ ＭＯＰＳ 緩衝液（ｐＨ ７．５）を
調製し、抗体液２とした。 （試料）市販のＴＳＨ（ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を５０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ ７．５、０．５％牛血清ア
ルブミン含有）に７０ｐＭとなるように添加したものを
試料とした。 （ＨＰＬＣの使用条件） カラム：０．４６φ×１．０ｃｍ。 充填剤：ＰＯＲＯＳ−ＤＥＡＥゲル（パーセプティブ社
商品名）。 溶離液Ａ：５０ｍＭ ＭＯＰＳ 緩衝液 ｐＨ７．５。 溶離液Ｂ：５０ｍＭ ＭＯＰＳ 緩衝液 ｐＨ７．５、
３Ｍ 塩化ナトリウム。 基質液：２５ｍＭ ４−Ｎ−アセチルアミノフェノール
（同仁化学研究所（株）社製）水溶液。 流 速：溶離液Ａ＋溶離液Ｂ；１．０ｍｌ／ｍｉｎ、基
質液；０．１ｍｌ／ｍｉｎ。 反応部：０．０２５φ×１０００ｃｍ（６０°Ｃ保
温）。 検 出：励起波長３２８ｎｍ、蛍光波長４３２ｎｍで測
定した。 グラジエント条件：０→１０ｍｉｎ Ｂ＝０→１００％ （測定操作）抗体液１ １００μｌ、試料５０μｌ及び
抗体液２ ５０μｌを混合し、２５゜Ｃで３０分間放置
した後、該混合液の１０μｌを上記条件のＨＰＬＣによ
り測定（分析）した。 （結果）ＨＰＬＣ分析の結果、各種物質の溶出塩濃度
（塩化ナトリウム濃度）は以下の如くであった。 ・ＴＳＨ−１・Ｆａｂ’−ＰＯＤ及びＴＳＨ−１・Ｆａ
ｂ’−ＰＯＤとＴＳＨとの複合体：０〜０．１Ｍ。 ・ＴＳＨ−１・Ｆａｂ’−ＰＯＤ、ＴＳＨ及び、ＴＳＨ
−２・Ｆａｂ’とＡｌａ−（Ｔｙｒ（ＳＯ_３Ｈ））_５−
βＡｌａ（ポリペプチド１４）の結合物との複合体：
０．５〜１．２Ｍ。 ・ＴＳＨ−１・Ｆａｂ’−ＰＯＤ、ＴＳＨ及び、ＴＳＨ
−２・Ｆａｂ’とＡｌａ−（Ｓｅｒ（ＳＯ_３Ｈ））_５−
βＡｌａ（ポリペプチド３）の結合物との複合体：０．
２５〜０．４５Ｍ。 以上の結果より、硫酸化ポリペプチドと抗体との結合物
を使用することにより、共存する遊離のＰＯＤ標識抗体
と測定対象物質を含む複合体とをより明確に分離するこ
とができるようになることや、硫酸化ポリペプチドの種
類を適宜選択することにより、目的の複合体の溶出位置
を自由に調節することができるようになること等が判
る。尚、硫酸化ポリペプチドが結合した複合体のピーク
を利用することにより、試料中のＴＳＨについて良好な
検量線が得られること、言い換えればＴＳＨ量の定量が
可能となることも判った。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８３】実施例１４． Ｆａｂ’とアニオン性ポリ
ペプチドとの結合物を用いたＡＦＰの測定（パーオキシ
ダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体Ｆａｂ’フラグメントの調製） ＡＦＰ−Ａ４−４とは異なるエピトープを認識する抗Ａ
ＦＰ抗体・ＷＡ−１（以下、「ＡＦＰ−ＷＡ−１」と略
記する。和光純薬工業（株）製）を常法により処理して
Ｆａｂ’フラグメントとし、これに常法によりパーオキ
シダーゼ（東洋紡社製）を結合させてパーオキシダーゼ
標識抗ＡＦＰ抗体Ｆａｂ’フラグメント（以下、「ＡＦ
Ｐ−ＷＡ−１・Ｆａｂ’−ＰＯＤ」と略記する。）を調
製した。 （試薬）実施例１１で調製した、表１に記載の各種アニ
オン性ポリペプチドとＡＦＰ−Ａ４−４・Ｆａｂ’との
結合物のうちの所定のものを２００ｎＭ、ＡＦＰ−ＷＡ
−１・Ｆａｂ’−ＰＯＤを１００ｎＭ及びポリビニルア
ルコール（アルドリッチ社製）を０．２（Ｗ／Ｖ）％含
有するＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を調製し、試薬と
した。 （試料）市販のＡＦＰを５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．５、０．２（Ｗ／Ｖ）％ポリビニルアルコール含
有）に１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加、溶解したも
のを試料とした。 （ＨＰＬＣ条件） カラム：ＰＯＲＯＳ−ＤＥＡＥ（４．６φ×１０ｍ
ｍ）。 溶離液Ａ：５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）。 溶離液Ｂ：５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（３Ｍ ＮａＣｌ
含有。ｐＨ７．５）。 基質液：５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（９０ｍＭ ４−Ｎ
−（４−カルボブチリル）アミノフェノール及び２０ｍ
Ｍ Ｈ_２Ｏ_２含有。ｐＨ７．５）。 流 速：Ａ＋Ｂ液 １ｍｌ／ｍｉｎ（基質液は０．１ｍ
ｌ／ｍｉｎ）。 反応部：０．０２５φ×１０００ｃｍ。 温 度：６０℃。 検 出：励起波長３２８ｎｍ／蛍光波長４３２ｎｍ。 グラジェント条件：実施例８と同じ。 （測定方法）試薬１００μｌと試料１０μｌとを混合
し、８℃、１０分間反応させた後、混合液の２０μｌを
上記条件のＨＰＬＣにより分析した。 （結果）各種ポリペプチドとＡＦＰ−Ａ４−４・Ｆａ
ｂ’との結合物、ＡＦＰ−ＷＡ−１・Ｆａｂ’−ＰＯＤ
及びＡＦＰとの複合体（抗原抗体複合体）の溶出塩濃度
並びにピーク幅を図５に示す。尚、図５中、●は溶出ピ
ーク頂点での塩濃度を示し、Ｉは溶出し始めと終わりの
塩濃度の範囲（即ち、ピーク幅）を示す。また、図の横
軸の各記号はポリペプチドの種類（表１のポリペプチド
Ｎｏ．及び略号）を示す。図５の結果から、以下のこと
が判る。 ＡＦＰ−Ａ４−４・Ｆａｂ’に結合したポリペプチド
の種類により、抗原抗体複合体の溶出塩濃度（溶出位
置）が変化する。尚、各抗原抗体複合体の溶出される順
序は、ＡＦＰ−Ａ４−４・Ｆａｂ’とポリペプチドとの
結合物の溶出される順序（実施例１１及び図２参照。）
と同じであった。また、この結果から、ポリペプチドの
種類を適宜選択することにより、目的の抗原抗体複合体
の溶出塩濃度を適宜設定し得ることも判る。 遊離のＡＦＰ−ＷＡ−１・Ｆａｂ’−ＰＯＤの溶出塩
濃度は０〜０．１Ｍであったので、何れのポリペプチド
を用いた場合でも、遊離のＡＦＰ−ＷＡ−１・Ｆａｂ’
−ＰＯＤと抗原抗体複合体とを完全に分離することがで
きた。特に、ポリペプチド４〜９、１１〜２１を用いた
場合には、抗原抗体複合体の溶出塩濃度を０．３Ｍ以上
とすることができるので、これらポリペプチドを分離向
上物質として用いることにより、血清中の共存物質によ
る測定への影響をより確実に回避することができる。
尚、既に述べたように、今回使用した充填剤であるＰＯ
ＲＯＳ−ＤＥＡＥは、基材が若干疎水性を有するもので
あるため、硫酸化チロシン残基を有するポリペプチド１
０〜２０と抗体との結合物から形成された抗原抗体複合
物の方が、硫酸化セリン残基を有するポリペプチドと抗
体との結合物から形成されたそれらに比較して見かけの
溶出塩濃度が高くなっているため、硫酸残基を１個しか
有さないがチロシン残基を有しているポリペプチド１０
と抗体との結合物から形成される抗原抗体複合物の見か
けの溶出塩濃度は、硫酸化セリン残基を３個有するポリ
ペプチド２と抗体との結合物から形成される抗原抗体複
合物のそれと同程度となっている。しかしながら、使用
する充填剤を、その基材が親水性のものに変更して上記
と同様の実験を行うと、硫酸化チロシン残基を１個しか
有さないポリペプチド１０と抗体との結合物から形成さ
れる抗原抗体複合物の見かけの溶出塩濃度は、硫酸化セ
リン残基を１個しか有さないポリペプチド１と抗体との
結合物から形成される抗原抗体複合物のそれと同程度と
なって、血清中の共存物質のピークと重なり測定（分
析）の精度が低下すると予想される。 以上の結果から、ポリペプチドを分離向上物質として
用いるためには、ポリペプチド中の強酸由来の酸残基数
は３〜２０個、好ましくは４〜２０個、より好ましくは
５〜１５個と考えられる（酸残基数を多くするとカラム
からの溶出塩濃度が高くなりすぎるので、測定操作上好
ましくない。）。 溶出塩濃度の異なるポリペプチドを２種以上組み合わ
せて（例えばポリペプチド４〜７、８、９、１１〜１４
の何れかと、ポリペプチド７、１６〜２１の何れかの組
み合わせ）、夫々を適当な結合能物質と結合させて用い
ることにより、類似構造を有する２以上の物質（例え
ば、糖鎖構造等構造の一部のみが異なる２以上の物質、
アイソザイム、１つの抗原に対して異なるエピトープを
認識する２以上の抗体等）の分別測定を実施することが
可能になる。 ポリペプチドとしてｐＡｓｐ−１及びｐＡｓｐ−２
（製造ロットの異なるｐＡｓｐ）を用いた場合の結果か
ら、従来のカルボン酸残基を有するポリペプチドでは、
製造ロットにより溶出塩濃度が変化し、目的のピークの
テーリングの状況が変化すること、言い換えれば、均一
の分子量を有するポリペプチドを得難いという問題を有
することが示唆された。これに対し、本発明のポリペプ
チドは、ペプチド合成により均一のものを容易に得られ
るので、ｐＡｓｐに於けるこのような問題は生じない。
尚、実施例１１で調製した、抗体液１ １００μｌ、試
料５０μｌ及び抗体液２［ＴＳＨ−２・Ｆａｂ’とＡｌ
ａ−（Ｓｅｒ（ＳＯ_３Ｈ））_５−βＡｌａ（ポリペプチ
ド３）の結合物含有］５０μｌとを混合し、２５℃で３
０分間放置して得た混合液の２０μｌを上記条件のＨＰ
ＬＣにより測定（分析）したところ、ポリペプチド３を
用いてＡＦＰの測定（分析）を行った場合の抗原抗体複
合体の溶出塩濃度で目的の抗原抗体複合体が溶出された
（図５の「ポリペプチドの略号ＴＳＨ」の項に、溶出塩
濃度のデータを併せて示す。）。この結果から、本発明
のポリペプチドを分離向上物質として用いることによ
り、測定対象物質が異なる場合であっても一定の分析条
件のＨＰＬＣを用いて目的の測定（分析）を実施し得る
ことが判る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｇ０１Ｎ 33/538 Ｇ０１Ｎ 33/538 33/566 33/566 (72)発明者 里 村 慎 二 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内 (72)発明者 中 村 賢 治 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】強酸由来の酸残基を少なくとも３個有する
   ポリペプチド。
2. 【請求項２】遊離の反応活性基を有するアミノ酸残基を
   ３個以上有し且つ該反応活性基の３個以上に強酸由来の
   酸残基が導入されている、請求項１に記載のポリペプチ
   ド。
3. 【請求項３】請求項１に記載のポリペプチドと、生体試
   料中の測定対象物質に対して結合能を有する物質との結
   合物。
4. 【請求項４】請求項１に記載のポリペプチドのＮ末端に
   スペーサーを介してマレイミド基が結合した化合物。
5. 【請求項５】請求項１に記載のポリペプチドと、生体試
   料中の測定対象物質に対して結合能を有する物質との結
   合物を含んでなる、生体試料中の測定対象物質測定用試
   薬。
6. 【請求項６】生体試料と、請求項３に記載の結合物を含
   んでなる試薬とを反応させ、次いで生じた複合体を陰性
   電荷を利用する方法により分離し、該複合体量に基づい
   て生体試料中の測定対象物質量を求めることを特徴とす
   る生体成分測定方法。
7. 【請求項７】陰性電荷を利用する方法が陰イオン交換法
   である、請求項６に記載の生体成分測定方法。
8. 【請求項８】陰イオン交換法による分離の際に用いられ
   る溶離液中に界面活性剤を共存させる、請求項７に記載
   の生体成分測定方法。