JP7052967B2 - β-1,6-グルカナーゼ変異体とβ-1,6-グルカンの測定方法 - Google Patents
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Description
(1)β-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)の変異体であって、配列番号1の第321番Glu(E)に対応する位置のGlu(E)が、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、 Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)からなる群より選択されるアミノ酸残基Xに置換されていることを特徴とするβ-1,6-グルカナーゼ変異体E321X。
(2)β-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)の変異体であって、配列番号1の第225番と第321番のGlu(E)に対応する位置のGlu(E)が、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、 Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)からなる群より選択されるアミノ酸残基Xに置換されていることを特徴とするβ-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321X。
(3)前記発明(1)に記載のβ-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xまたは請求項2に記載のβ-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321Xと結合したβ-1,6-グルカンを測定することを特徴とするβ-1,6-グルカンの測定方法。
(4)前記発明(1)に記載のβ-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xまたは請求項2に記載のβ-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321Xを含むβ-1,6-グルカン測定試薬。
(5)前記発明(1)に記載のβ-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xに標識物質を付加した標識化変異体E321Xまたは請求項2に記載のβ-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321Xに標識物質を付加した標識化変異体E225X/E321Xを含むβ-1,6-グルカン測定試薬。
(6)前記発明(4)に記載の試薬と、前記発明(5)に記載の試薬を含むβ-1,6-グルカン測定キット。
(7)β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xおよび/またはE225X/E321Xが不溶性担体に固定化されている前記発明(6)のβ-1,6-グルカン測定キット。
既報(Oyama S, et. al., Biosci Biotechnol Biochem. 2002 Jun;66(6):1378-81.)に従い、アカパンカビ(Neurospora crassa NBRC 6068)のcDNAから、β-1,6-グルカナーゼをコードする遺伝子配列をPCRにより増幅し、酵素活性を制御するアミノ酸残基[配列番号1のアミノ酸配列における第225番および/または第321番のグルタミン酸(Glu: E)]をグルタミン(Gln: Q)に置換した。この改変酵素遺伝子配列をpColdIベクター(タカラバイオ社製)に挿入し、大腸菌Shuffle(New England Biolabs社製)に形質転換後、Ampicillin添加LB培地にて×6ヒスチジンタグ(His-Tag)融合タンパク質として大量発現させた。TALON(R) Metal Affinity Resin(タカラバイオ社製)を用いて精製後、SDS-PAGEにて精製タンパク質の存在を確認した(図1)。配列番号1の第225番Glu(E)をGln(Q)に置換したβ-1,6-グルカナーゼ変異体をE225Q、第321番Glu(E)をGln(Q)に置換したβ-1,6-グルカナーゼ変異体をE321Q、その両方を置換したβ-1,6-グルカナーゼ変異体をE225Q/E321Qとした。
実施例2:β-1,6-グルカナーゼ変異体のβ-1,6-グルカン切断活性と結合活性
天然型のβ-1,6-グルカナーゼ(BGase)、各変異体E225Q、E321QおよびE225Q/E321Q(各1または10 μg/mL)とβ-1,6-グルカンであるPustulan (Umbilicaria papullosa由来、Calbiochem社製、水溶性画分)(1 mg/mL)を50mM Acetate buffer(pH6.0)中で混合し、37℃で1時間反応させた後、Somogyi-Nelson法によって切断により生じた還元末端量を測定した。その結果、BGaseはタンパク質添加濃度依存的に還元末端の量が増加したのに対し、各変異体E225Q、E321QおよびE225Q/E321Qはいずれもβ-1,6-グルカンに対する切断活性を示さなかった(図2)。
実施例3:β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Qの熱およびpH安定性
PBSに希釈した変異体E321Qをマイクロチューブに分注し、20-90℃の各温度で5分間処理し、BPBSTで希釈後(0.5 μg/mL)、実施例2のELISA法に準じてPustulan(500 ng/mLを固相化)との結合能を評価した。その結果、変異体E321Qは40℃まで安定性を示し、50℃以上での処理によってβ-1,6-グルカン結合活性が消失することが明らかとなった(図4A)。
実施例2のELISA法に準じてPustulan(500 ng/mL)でコートしたELISAプレートに、予め各種グルカン(20 or 100 ug/mL)と混合した変異体E321Q(0.5 ug/mL)を添加し、競合ELISA法によって、各種グルカンと変異体E321Qとの反応性を評価した。反応に用いた各種グルカンは表1に、それぞれの出展を表2に示す。変異体E321Qは、長鎖β-1,6-グルカンを有する試料(Pustulan、Islandican、ACWS、AgHWE、AgCAS、AgHAS、CAWS、HKCA、CSBG、ASBG、SCL、Pachymanなど)とのみ反応性を示し、β-1,6-グルカンを持たないグルカン(Curdlan、Barley βG、Paramylon、Pullulan、Mannan、Dextranなど)や、β-1,6-グルカンがモノグリコシド結合しているβ-1,3-glucan(Laminarin、SPGなど)との反応性は認められなかった(図5)。また、β-1,6-グルカンが2つ連結したGentiobioseとの反応性も認められず、一定数のグルコースがβ-1,6-結合していなければ、変異体E321Qと結合しないと推測された。これらの結果は、β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Qが血中に存在する高分子量β-グルカンに特異的に反応し、非特異的な反応(偽陽性)が生じにくいことを示唆している。
変異体E321Qを市販のビオチン化試薬(DOJINDO社製:製品コードB306)でビオチン標識した。はじめに未標識のE321Q(2 ug/mL)をELISAプレートにコートし、BPBSTでブロッキング後、BPBSTに段階希釈したPustulan (0-4000 ng/mL)を添加し、1時間室温で反応させた。PBSTで洗浄後、BPBSTで希釈したビオチン化E321Q(1 ug/mL)を加え、1時間室温で反応させた後、洗浄後にBPBSTで希釈したストレプトアビジン-HRP(BioLegend社製)を加えた。30分後、十分な洗浄後にTMB溶液を加え、適度に発色させた。反応停止液(1Nリン酸)を添加し、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度(測定波長450nm/対照波長630nm)を測定した。その結果、未標識E321Qとビオチン化E321QのサンドイッチELISA様試験によって、可溶性Pustulanの濃度(約10-4000 ng/mL)を測定することが可能であった(図6A)。さらに高感度な検出を実現するため、上記の試験を、ELISA用ブラックプレート(Greiner Bio-One社製)を用いて実施した。HRP検出には化学発光試薬であるイムノスター(R)(Wako社製)またはSuperSignalTM ELISA Pico/Femto Substrate(Thermo Fisher Scientific社製)を用い、検出機としてGloMax(R)(プロメガ社製)を使用した。その結果、これまでの吸光度測定法に比べ、測定領域の拡張が認められ、可溶性Pustulanとして約0.6-5000 ng/mLを定量することが可能となった(図6B)。
実施例6:真菌培養上清中β-グルカンの高感度検出とリムルス試験法との比較
臨床上しばしば問題となるCandida albicansの血清添加培地による培養上清中のβ-グルカンを、変異体E321Qを用いてELISA用試験により測定した。C. albicans NBRC1385株(NITE)はYPD寒天培地にて前培養し、形成されたコロニーをD-PBSに懸濁後、1×10^6個を10%FBS添加RPMI1640液体培地(Gibco社製)(10 mL)に植菌し、37℃で24時間培養した(図8A)。菌を含まない上清を回収し、一部を80℃で5分間加熱してE321Qを用いたサンドイッチELISA様試験(実施例5のSuperSignalTM ELISA Femto Substrateを用いた試験と同様、ただしプレートはホワイトプレートを使用した)により測定した。また一部は加熱せずに、リムルス試験(ファンギテックMKII)によって解析した。その結果、E321Qを用いたELISA法では2000倍以上希釈しても検出可能であった(図8B)。一方、LAL法では500倍希釈まで検出可能であったが、1000倍希釈以上希釈すると検出不可となった(図8C)。
実施例7:不溶性担体とルシフェラーゼ融合E321Qを用いたβ-1,6-グルカンの迅速検出
実施例6では病原性真菌培養上清よりβ-グルカンを高感度に検出することに成功したが、検出までに数時間を要するという欠点が残されていた。検出までの時間を短縮するためビオチン化したE321Qをストレプトアビジン標識磁気ビーズ(ベリタス社製)に結合させた。さらに小型のルシフェラーゼであるNanoLuc(プロメガ社製)をE321Qに融合させ、大腸菌を用いて発現させたもの(E321Q-NL)を調整し、SDS-PAGE(CBB染色)でその存在を確認した(図9A-B)。標準β-1,6-グルカン(Pustulan)とE321Q-NLはBPBSTにそれぞれ希釈し、真菌培養上清(CA(+))または真菌非添加のブランク溶液(CA(-))は80℃で5分間加熱後、BPBSTで1000倍希釈して本試験に用いた。96 Wellホワイトプレート(Thermo Scientific社製)は予めBPBSTでブロッキング処理し、ビオチン化E321Q(50 ng)を固定した磁気ビーズ(5 μg)を各Wellに添加し、PustulanまたはC.albicans培養上清(CA(+))あるいはブランク溶液(CA(-))を加え、十分に撹拌したのちマグネットセパレーター(Luminex社製)で磁気ビーズを固定し、BPBSTで洗浄した。続いて可溶性のE321Q-NL(0.1 ng)を添加し、撹拌後に同様の洗浄を行い、ルシフェラーゼ基質であるFurimazine(プロメガ社製)の添加により、概ね30分以内に高感度に検出された(図9C)。しかし、本試験法では精製されたβ-1,6-グルカンであるPustulanの検出は可能としたが、真菌培養上清中の糖-タンパク質複合体の高感度な検出は困難であった(図9C)。従って、本法は精製されたβ-1,6-グルカンの検出には優れているが、複雑な構造を持つ細胞外放出多糖の検出にはNanoLuc融合E321Qは不向きであることが認められた。
実施例8:高アフィニティ活性を持つβ-グルカナーゼ変異体の作成
β-グルカナーゼ変異体のβ-1,6-グルカンに対する結合活性をより強いものとするため、求核触媒基である321番目 Glu(E)を他の各アミノ酸に変換し、同様に大腸菌で発現させ、精製後にタンパク質濃度を統一し、SDS-PAGE(銀染色)でその存在を確認した(図10A)。天然型のβ-グルカナーゼ以外の変異体はβ-1,6-グルカン(Pustulan)切断能を持たないことを、その還元末端量を指標にSomogyi-Nelson法によって証明した(図10B)。一方、β-1,6-グルカンに対する結合能を、ビオチン化Pustulanを固定したストレプトアビジンセンサーチップを用いたバイオレイヤー干渉法(Pall ForteBio社製)、または実施例2のELISA法に準じて、Pustulanを固相化したELISA様試験によって評価した。各変異体(1 μg/mL)の糖鎖結合力は変換したアミノ酸種によって大きく異なり、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、 Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)では結合能を示すが、その他のアミノ酸に置換した場合では、強い結合能は認められない結果となった(図10C)。さらにリガンドとの親和性を示すKD値は変換したアミノ酸種によって異なる値を示し、最も強い親和性(低KD値)を示す酵素変異体はAla(A)に置換したE321Aであった(図10D)。また、Pustulanを固相化した直接法によるELISA様試験によっても結合活性を有するものと、結合しないものが認められ、同様の傾向が確認された(図10E)。
実施例9:不溶性担体と低分子量タグ融合E321Qを用いたβ-1,6-グルカンの迅速検出
実施例7では公知のNanoLucシステム(プロメガ社製)を応用し、E321Q-NLを用いたβ-1,6-グルカンの迅速検出を可能としたが、病原性真菌培養上清中のβ-グルカンを高感度に検出することは困難であった。そこでE321QまたはE321Aに公知のペプチドタグを融合発現し、新たにE321Q-SBP1およびE321A-HiBiTを作成した。SBP1タグはアミノ酸配列がMDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREPから成るストレプトアビジンバインディングタグであり、文献(Wilson DS, et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Mar 27;98(7):3750-5.)を参考にして作成した。HiBiT(プロメガ社製)は11アミノ酸からなるルシフェラーゼ断片ペプチドタグであり、実施例7で使用したNanoLucの立体的な障害を軽減させるために選択し、より強い糖鎖結合力を持つE321Aに融合させ、大腸菌によって発現させた後、SDS-PAGE(銀染色)でその存在を確認した(図11A-B)。実施例7の方法を改良し、よりβ-グルカナーゼ変異体に適したpHの緩衝液を新たに調整した。1%BSA/0.05% Tween20を含む50mM Acetate buffer(pH5.5)(AcBT)にE321Q-SBP1(50 ng)およびストレプトアビジン標識磁気ビーズ(5 μg)(ベリタス社製)を混合し、担体にE321Q-SBP1を固定したのち、予めブロッキングした96Wellホワイトプレートの各Wellに加えた。固定されたE321Q-SBP1によって精製β-1,6-グルカンであるPustulan及びC. albicans培養上清中β-グルカンを捕捉し、適度に洗浄後、可溶性のE321A-HiBiT(2 ng)をビーズ上のβ-グルカンに結合させ、HiBiTタグと高親和性を持つLgBiT及びそれらの基質であるFurimazine(プロメガ社製)を添加し、発光レベルを測定した。その結果、精製されたPustulanのみならず、実施例7では検出に失敗した真菌培養上清中のβ-グルカンも高感度に、かつ短時間(30分以内)のうちに検出することに成功した(図11C)。
実施例10:血中β-1,6-グルカンのモニタリング
実施例9と同様の方法を用いて、マウス血中のβ-1,6-グルカンの検出を試みた。実施例6と同様の方法で調整したC. albicans培養上清500 uLを5週齢の雌性ICRマウス(日本SLC)の尾静脈に投与した(n=3)。投与から1分、10分、30分、60分、1440分(24時間)後に、ヘパリン処理採血管(Wako社製)を用いて尾静脈血を回収し、AcBTで10倍から20倍に希釈後、80℃で5分間加熱処理したものの上清を血中濃度測定に用いた。C. albicansに由来するβ-1,6-グルカンは投与直後から60分後までは検出可能であったが、血中濃度は比較的短時間のうちに減少し、24時間後には検出限界以下となった(図12)。本発明によって構築された試験が深在性真菌症の診断補助のみならず、抗真菌薬使用中における治
療の終了時期を判断する材料としても使用できる可能性が示された。
Claims (7)
- β-1,6-グルカンの切断活性を持たず、かつ、β-1,6-グルカンに対する特異的結合活性を有するβ-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)の変異体であって、
Saccharophagus degradans,Aspergillus fumigatus,Lentinulaedodes,Neurospora crassaおよびTrichoderma harzianumのうちのいずれかに由来し、
配列番号1の第321番Glu(E)に対応する位置のGlu(E)が、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸であるアミノ酸残基Xに置換されている変異を含むことを特徴とするβ-1,6-グルカナーゼ変異体E321X。 - β-1,6-グルカンの切断活性を持たず、かつ、β-1,6-グルカンに対する特異的結合活性を有するβ-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)の変異体であって、
Saccharophagus degradans,Aspergillus fumigatus,Lentinulaedodes,Neurospora crassaおよびTrichoderma harzianumのうちのいずれかに由来し、
配列番号1の第225番と第321番のGlu(E)に対応する位置のGlu(E)が、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸であるアミノ酸残基Xに置換されている変異を含むことを特徴とするβ-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321X。 - β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xまたはβ-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321Xと結合したβ-1,6-グルカンを測定する、β-1,6-グルカンの測定方法であって、
前記β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xは、β-1,6-グルカンの切断活性を持たず、かつ、β-1,6-グルカンに対する特異的結合活性を有するβ-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)の変異体であって、
Bacteroides thetaiotaomicron, Saccharophagus degradans,Aspergillus fumigatus,Lentinulaedodes,Neurospora crassaおよびTrichoderma harzianumのうちのいずれかに由来し、
配列番号1の第321番Glu(E)に対応する位置のGlu(E)が、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸であるアミノ酸残基Xに置換されている変異を含む変異体であり、
前記β-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321Xは、β-1,6-グルカンの切断活性を持たず、かつ、β-1,6-グルカンに対する特異的結合活性を有するβ-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)の変異体であって、
Bacteroides thetaiotaomicron, Saccharophagus degradans,Aspergillus fumigatus,Lentinulaedodes,Neurospora crassaおよびTrichoderma harzianumのうちのいずれかに由来し、
配列番号1の第225番と第321番のGlu(E)に対応する位置のGlu(E)が、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸であるアミノ酸残基Xに置換されている変異を含む変異体
であることを特徴とするβ-1,6-グルカンの測定方法。 - β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xまたはβ-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321Xを含むβ-1,6-グルカン測定試薬であって、
前記β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xは、β-1,6-グルカンの切断活性を持たず、かつ、β-1,6-グルカンに対する特異的結合活性を有するβ-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)の変異体であって、
Bacteroides thetaiotaomicron, Saccharophagus degradans,Aspergillus fumigatus,Lentinulaedodes,Neurospora crassaおよびTrichoderma harzianumのうちのいずれかに由来し、
配列番号1の第321番Glu(E)に対応する位置のGlu(E)が、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸であるアミノ酸残基Xに置換されている変異を含む変異体であり、
前記β-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321Xは、β-1,6-グルカンの切断活性を持たず、かつ、β-1,6-グルカンに対する特異的結合活性を有するβ-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)の変異体であって、
Bacteroides thetaiotaomicron, Saccharophagus degradans,Aspergillus fumigatus,Lentinulaedodes,Neurospora crassaおよびTrichoderma harzianumのうちのいずれかに由来し、
配列番号1の第225番と第321番のGlu(E)に対応する位置のGlu(E)が、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸であるアミノ酸残基Xに置換されている変異を含む変異体
であることを特徴とするβ-1,6-グルカン測定試薬。 - β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xに標識物質を付加した標識化変異体E321Xまたはβ-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321Xに標識物質を付加した標識化変異体E225X/E321Xを含むβ-1,6-グルカン測定試薬であって、
前記β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xは、β-1,6-グルカンの切断活性を持たず、かつ、β-1,6-グルカンに対する特異的結合活性を有するβ-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)の変異体であって、
Bacteroides thetaiotaomicron, Saccharophagus degradans,Aspergillus fumigatus,Lentinulaedodes,Neurospora crassaおよびTrichoderma harzianumのうちのいずれかに由来し、
配列番号1の第321番Glu(E)に対応する位置のGlu(E)が、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸であるアミノ酸残基Xに置換されている変異を含む変異体であり、
前記β-1,6-グルカナーゼ変異体E225X/E321Xは、β-1,6-グルカンの切断活性を持たず、かつ、β-1,6-グルカンに対する特異的結合活性を有するβ-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)の変異体であって、
Bacteroides thetaiotaomicron, Saccharophagus degradans,Aspergillus fumigatus,Lentinulaedodes,Neurospora crassaおよびTrichoderma harzianumのうちのいずれかに由来し、
配列番号1の第225番と第321番のGlu(E)に対応する位置のGlu(E)が、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Leu(L)、Tyr(Y)、Met(M)、Ser(S)、Asn(N)およびHis(H)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸であるアミノ酸残基Xに置換されている変異を含む変異体
であることを特徴とするβ-1,6-グルカン測定試薬。 - 請求項4に記載の試薬と、請求項5に記載の試薬を含むβ-1,6-グルカン測定キット。
- 前記β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Xおよび/またはE225X/E321Xが不溶性担体に固定化されている請求項6のβ-1,6-グルカン測定キット。
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