JPWO2010107068A1 - β−グルカンの測定方法及びそれに用いられるβ−グルカン結合性蛋白質 - Google Patents
β−グルカンの測定方法及びそれに用いられるβ−グルカン結合性蛋白質 Download PDFInfo
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Abstract
Description
G因子はセリンプロテアーゼ前駆体で、βGが結合することで活性化され、G因子系のプロテアーゼカスケードが始まる。そして活性化されたG因子により凝固酵素前駆体が活性化され、最終的にゲルを生じる。そこで、医学、薬学、微生物学の分野ではカブトガニ血球抽出物のこの性質を利用したβG検出法が開発された。
(1)下記の方法で行う、βGの測定方法、
(i)試料と、配列番号4、6、8、10、14、16、18又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質1(以下、「βG結合性蛋白質1」と略記する。)と、配列番号4、6、8、10、14、16、18又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質2(以下、「βG結合性蛋白質2」と略記する。)とを接触させて、βG結合性蛋白質1と試料中のβGとβG結合性蛋白質2との複合体を形成させ、
(ii)該複合体の量を測定し、
(iii)得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(2)配列番号4、6、8、10、14又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質を含有する、βG測定用試薬。
(3)下記を構成成分として含んで成るβG測定用キット
(i)配列番号4、6、8、10、14、16、18又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質1を含有する試薬
(ii)配列番号4、6、8、10、14、16、18又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質2を含有する試薬。
(4)配列番号4、6、8、10、14又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質。
(5)配列番号1、3、5、7、9、13又は19のいずれかで表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する、核酸分子。
(6)配列番号2、4、6、8、10、14又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質、をコードする、核酸分子。
(7)上記(5)又は(6)に記載の核酸分子が組み込まれた組換え体。
(8)上記(7)に記載の組み換え体により形質転換又は形質導入された形質転換体又は形質導入体。
(9)上記(8)に記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られた培養物から蛋白質を分離することを特徴とする、配列番号2、4、6、8、10、14又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質、の製造方法。
・Limulus属カブトガニG因子αサブユニット断片a(以下、単に「断片a」と記載する場合がある。)、
・Limulus属カブトガニG因子αサブユニット断片b(以下、単に「断片b」と記載する場合がある。)、
・Limulus属カブトガニG因子αサブユニット断片c(以下、単に「断片c」と記載する場合がある。)、
・Limulus属カブトガニG因子αサブユニット断片d(以下、単に「断片d」と記載する場合がある。)
である。
・Tachypleus属カブトガニG因子αサブユニット断片e(以下、単に「断片e」と記載する場合がある。)、
・Tachypleus属カブトガニG因子αサブユニット断片f(以下、単に「断片f」と記載する場合がある。)、
・Tachypleus属カブトガニG因子αサブユニット断片g(以下、単に「断片g」と記載する場合がある。)、
・Tachypleus属カブトガニG因子αサブユニット断片h(以下、単に「断片h」と記載する場合がある。)
である。
(1)試料と、βG結合性蛋白質1と、βG結合性蛋白質2とを反応させて、βG結合性蛋白質1と試料中のβGとβG結合性蛋白質2との複合体を形成させ、
(2)該複合体の量を測定し、
(3)得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβG量を測定する、
ことにより達成される。
(i)試料と、(不溶性担体に固定化されていない)遊離のβG結合性蛋白質1と、(不溶性担体に固定化されていない)遊離のβG結合性蛋白質2とを接触させて、βG結合性蛋白質1と試料中のβGとβG結合性蛋白質2との複合体を形成させ、
(ii)該複合体の量を測定し、
(iii)得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と、(不溶性担体に固定化されていない)遊離のβG結合性蛋白質1とを接触させて、試料中のβGとβG結合性蛋白質1との複合体−1を形成させ、次いで
(ii)該複合体−1と(不溶性担体に固定化されていない)遊離のβG結合性蛋白質2とを接触させて、βG結合性蛋白質1と試料中のβGとβG結合性蛋白質2との複合体−2とを形成させ、次いで
(iii)該複合体−2の量を測定し、
(iv)得られた該複合体−2の量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と、不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1と、遊離の非標識βG結合性蛋白質2とを接触させて、不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1と試料中のβGと非標識βG結合性蛋白質2との複合体を形成させ、
(ii)該複合体の量を測定し、
(iii)得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1とを接触させて、不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1と試料中のβGとの複合体−1を形成させ、次いで
(ii)該複合体−1と遊離の非標識βG結合性蛋白質2とを接触させて、複合体−1と非標識βG結合性蛋白質2との複合体−2を形成させ、次いで
(iii)該複合体−2の量を測定し、
(iv)該複合体−2の基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と、遊離のβG結合性蛋白質1と、標識物質で標識した遊離のβG結合性蛋白質2とを接触させて、βG結合性蛋白質1と試料中のβGと標識βG結合性蛋白質2との複合体を形成させ、
(iii)該複合体中の標識物質量を測定し、
(iv)得られた標識物質量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と遊離のβG結合性蛋白質1とを接触させて、試料中のβGとβG結合性蛋白質1との複合体−1を形成させ、次いで
(ii)該複合体−1と、標識物質で標識した遊離の標識βG結合性蛋白質2とを接触させて、複合体−1と標識βG結合性蛋白質2との複合体−2を形成させ、次いで
(iii)該複合体−2中の標識物質量を測定し、
(iv)得られた標識物質量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と、不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1と、標識物質で標識した遊離の標識βG結合性蛋白質2とを接触させて、不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1と試料中のβGと標識βG結合性蛋白質2との複合体を形成させ、
(iii)該複合体中の標識物質量を測定し、
(iv)得られた標識物質量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1とを接触させて、不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1と試料中のβGとの複合体−1を形成させ、次いで
(ii)該複合体−1と標識物質で標識された遊離の標識βG結合性蛋白質2とを接触させて、複合体−1と標識βG結合性蛋白質2との複合体−2を形成させ、次いで
(iii)該複合体−2中の標識物質量を測定し、
(iv)得られた標識物質量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と、標識物質で標識した遊離のβG結合性蛋白質1と、標識物質で標識した遊離のβG結合性蛋白質2とを接触させて、βG結合性蛋白質1と試料中のβGと標識βG結合性蛋白質2との複合体を形成させ、
(iii)該複合体中の標識物質量を測定し、
(iv)得られた標識物質量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と標識物質で標識した遊離のβG結合性蛋白質1とを接触させて、試料中のβGと標識βG結合性蛋白質1との複合体−1を形成させ、次いで
(ii)該複合体−1と、標識物質で標識した遊離の標識βG結合性蛋白質2とを接触させて、複合体−1と標識βG結合性蛋白質2との複合体−2を形成させ、次いで
(iii)該複合体−2中の標識物質量を測定し、
(iv)得られた標識物質量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と、ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1と、ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質2とを接触させて、ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1と試料中のβGとラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質2との複合体を形成させ、
(iii)該複合体の量を測定し、
(iv)得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
(i)試料と不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1とを接触させて、ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1と試料中のβGとの複合体−1を形成させ、次いで
(ii)該複合体−1とラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質2とを接触させて、複合体−1とラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質2との複合体−2を形成させ、次いで
(iii)該複合体−2中の量を測定し、
(iv)得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβG量を測定する。
また、その粒径は特に限定されないが、通常0.05〜0.5μm、好ましくは0.1〜0.4μmの平均粒径のものが好ましい。
(1)配列番号4、6、8、10、14、16、18又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質1(βG結合性蛋白質1)を含有する試薬、及び
(2)配列番号4、6、8、10、14、16、18又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質2(βG結合性蛋白質2)を含有する試薬、
を構成要件として含んでなるものが挙げられる。
(1)cDNAの調製
カブトガニ血球細胞より常法によりtotal RNAを回収し、例えばmRNAの持つpoly (A)鎖でつり上げる常法等を利用することにより、精製mRNAを得る。得られた精製mRNAを鋳型として、常法による逆転写反応によってcDNAを合成する。このcDNAは、カブトガニG因子αサブユニット遺伝子を含むcDNAライブラリーとして、以下のPCRの際の鋳型として、用いられる。
1)カブトガニG因子αサブユニット遺伝子を含む配列を組み込んだ発現用組み換えベクターの調製
例えば常法によりカブトガニG因子αサブユニットをコードするcDNAの塩基配列(配列番号1又は11)の3'-末端側領域から選ばれた任意の位置から設計したリバースプライマー(Rプライマー)、配列番号1又は11の5'-末端側領域から開始コドンまでの間の任意の位置から設計したフォワードプライマー(Fプライマー)及び鋳型としてカブトガニG因子αサブユニット遺伝子を含むcDNAライブラリー(上記したcDNAライブラリー等)を用いたPCR等の核酸増幅法により、目的とするカブトガニG因子αサブユニット遺伝子を含む配列(例えば配列番号1又は11)のDNA断片を増幅させる。得られたPCR産物を、常法に従い適当な発現用ベクターDNAに組み込み、発現用組み換えベクターを得る。
まず、例えば常法によりカブトガニG因子αサブユニットをコードするcDNAの塩基配列(配列番号1又は11)の3'-末端側領域から選ばれた任意の位置から設計したRプライマー、配列番号1又は11の5'-末端側領域から開始コドンまでの間の任意の位置から設計したFプライマー及び鋳型としてカブトガニG因子αサブユニット遺伝子を含むcDNAライブラリー(cDNA等)を用いたPCR等の核酸増幅法により、カブトガニG因子αサブユニット遺伝子又を含む配列(例えば配列番号1又は11)のDNA断片を増幅させる。得られたPCR産物を、常法に従い適当なベクターDNAに組み込み、組み換えベクターを得る。
必要に応じ、発現用組み換えベクターに組み込まれたDNA断片の塩基配列を解析し、目的とするカブトガニG因子αサブユニット由来断片遺伝子を含む配列が組み込まれていることを確認する。
例えば常法によりカブトガニG因子αサブユニット由来断片をコードするcDNAの塩基配列(配列番号3、5、7、9、13、15、17、19)の3'-末端側領域から選ばれた任意の位置から設計したRプライマー、同配列の5'-末端側領域から開始コドンまでの間の任意の位置から設計したFプライマー及び鋳型としてカブトガニG因子αサブユニット由来断片の遺伝子を含むcDNAライブラリー(cDNA等)を用いたPCR等の核酸増幅法により、目的とするカブトガニG因子αサブユニット由来遺伝子を含む配列(配列番号3、5、7、9、13、15、17、19)のDNA断片を増幅させる。得られたPCR産物を、常法に従い適当な発現用ベクターDNAに組み込み、目的のカブトガニG因子αサブユニット由来断片遺伝子を含む配列を組み込んだ発現用組み換えベクターを得る。
本発明の形質転換体(形質導入体)は、得られた発現用組み換えベクターを用いて、適当な宿主細胞を形質転換(形質導入)することにより調製することができる。
本発明に係るβG結合性蛋白質は、上記のようにして得られたβG結合性蛋白質遺伝子を含む配列を組み込んだ発現用プラスミドベクターで形質転換した形質転換体を、栄養培地中で培養し、リコンビナントβG結合性蛋白質を生成させることにより得ることができる。
4.リコンビナントβG結合性蛋白質の回収
(1)RNAの回収
RNA抽出用試薬ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用い、その製品付属のプロトコルに従って、下記の通り、Limulus属カブトガニ血球細胞よりtotal RNAを回収した。
OligotexTM-dT30<Super>(タカラバイオ社製)を用い、下記の方法で、mRNAを精製した。
1)cDNA
上記(2)で得られた精製mRNAを鋳型として用い、オリゴ(dT)12-18(和光純薬工業製)とReverscript II(ニッポンジーン製)を用いた通常の逆転写反応を行って、cDNAを合成した。
Limulus属G因子αサブユニットをコードする遺伝子配列は、決定されていなかった。そこで、Tachypleus属G因子αサブユニットをコードする塩基配列から、Tachypleus属G因子αサブユニットをコードする遺伝子配列を増幅させるPCRプライマーを設計し、このプライマーを用いたPCRを行えば、Limulus属G因子αサブユニットをコードする塩基配列を増幅できると考え、以下の通り実施した。
プライマー配列
primer F1 5'-gcaatgttggtgttgc-3' (配列番号21)
primer R1 5'-gaagaaacaacagctgttgacc-3' (配列番号22)
PCR反応条件
滅菌水 12μl
cDNA 2μl
primer F1 1μl
primer R1 1μl
0.2mMdNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物)(ニッポンジーン社製) 2μl
2×TOPOTAQ Amplification Buffer with 6 mM MgCl2 (和光純薬工業製) 20μl
TOPOTAQ DNA Polymerase(和光純薬工業製) 2μl
pGEM−T Easy(Promega Co.製)0.1μgに、上記(3)2)で得られた精製PCR産物 約5μg、DNA ligation kit Ver.2 (宝酒造製)I液5μLを混合後、滅菌蒸留水で総量10μLにした。次いで、16℃で1時間、ライゲーション反応を行って、組換えベクターを得た。得られた組換えベクターは、上記(3)1)で得られたcDNAと同じ塩基配列、すなわち、Limulus属G因子αサブユニットをコードする塩基配列が挿入されている。そこで、得られたこの組換えベクターを、「Limulus属G因子α/pGEM−T」と命名した。
得られたシークエンス反応物[上記(3)1)で得られたcDNAと同じ塩基配列を持つ]の塩基配列の解読を、BaseStation(バイオラッドラボラトリーズ(株))を用いて行った。解読によって得られたLimulus属G因子αサブユニットをコードする塩基配列を配列番号1に、その塩基配列から推定される、この塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号2にそれぞれ示す。
まず、上記(4)で得られた組換えベクターLimulus属G因子α/pGEM−Tを鋳型として用いてPCR反応を行った。プライマーは、上記(5)で明らかになった塩基配列(配列番号1)から下記のプライマー配列を設計し、シグマ社にて、常法の合成法により合成したものを使用した。このプライマーを用いたPCRにより、上記(5)で明らかとなったLimulus属G因子αサブユニットをコードする配列番号1で表される塩基配列のうちの、5'末端から696番目から1947番目までの塩基配列、即ち「配列番号2で表されるLimulus属G因子αサブユニットのアミノ酸配列の233番目(アスパラギン)〜649番目(バリン)までのアミノ酸配列」をコードする塩基配列を、増幅することができる。
プライマー配列
primer F2 5'-aatacaccttctcctgttgacg-3' (配列番号23)
primer R2 5'-ctggattaagattacaaaggtt-3' (配列番号24)
PCR反応条件
滅菌水 12μl
Limulus属G因子α/pGEM−T 2μl
primer F2 1μl
primer R2 1μl
0.2mMdNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物)(ニッポンジーン(株)製)2μl
2×TOPOTAQ Amplification Buffer with 6 mM MgCl2 (和光純薬工業(株)製) 20μl
TOPOTAQ DNA Polymerase (和光純薬工業(株)製) 2μl
上記(6)で選択した形質転換体であるLimulus属G因子αサブユニット由来断片a(233−649aa)/DH5αを一晩前培養した。100 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地1 Lに、その培養液(5 mL)を接種し、37℃で4時間撹拌培養した。菌体のOD600nmが0.8に達した時点で最終濃度1mMのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)(和光純薬工業(株)製)を培地に添加し、更に20℃、48時間攪拌培養した。
まず、上記(7)で精製した発現蛋白質(リコンビナントLimulus属G因子αサブユニット由来断片a)を、ポリアクリルアミドゲル(和光純薬工業(株)製)を用いたSDS−PAGEにかけた後、iBlot(インビトジェン社製)を用いてPVDF膜に転写した。PVDF膜を1%ブロックエースにてブロッキング処理後、ペルオキシダーゼで標識した抗His抗体(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を室温で1時間反応させた。反応後のPVDF膜をPBS−T(ポリオキシエチレン20ソルビタンモノラウレート0.05%含有)(和光純薬(株)工業製)で3回洗浄後、ECLplus(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いて発光させ、X線フイルム(GEヘルスケア バイオサイエンス製)に感光させた。
(1)各種βG結合性蛋白質の調製
1)カブトガニ(Limulus属)G因子αサブユニット由来断片a
実施例1で得られた、リコンビナントLimulus属G因子αサブユニット由来断片aを用いた。
Ochiai M. et al., J. Biol. Chem., vol.275, No.7, p.4995-5002 (2000)のFig.3には、カイコ由来のβ-1,3-グルカン認識蛋白質(β-1,3-glucan recognition protein)のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列が記載されている。該蛋白質は、アミノ酸479個からなる蛋白質で、1575bpの塩基配列でコードされている。上記文献に記載された方法と上記実施例1に記載の方法に従い、上記文献のFig.3に開示されたカイコ由来のβ-1,3-グルカン認識蛋白質(以下、本明細書では「カイコ由来βG認識蛋白質(1−479aa)」と記載する。)を得た。
Proc.Natl.Acad.Sci. USA vol.93, p.7888-7893 (1996)のFig. 3には、カイコ由来のグラム陰性菌結合性蛋白質(Gram-negative bacteria-binding protein)のアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列が記載されている。該蛋白質は、アミノ酸467個からなる蛋白質で、2257bpの塩基配列でコードされている。上記文献に、該蛋白質の構造が「グルカナーゼ様ドメインを含み、G因子αドメインと類似している。」と記載されていることから、この蛋白質はβGと結合する性質があると推測した。
ノシメマダラメイガ(Plodia interpunctella)のヘモリンパ(hemolymph)には、βG認識蛋白質(β-1,3-glucan recognition protein)が存在する。Fabrick J.A., et al., Insect Biochem. Mol. Biol., vol.33, p.579-594, 2003には、そのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列が記載されている。それは、471個のアミノ酸からなり、C末端側にグルカナーゼ様部分(glucanase-Like domain)を持つ(Fabrick J.A. et al., J. Biol. Chem., vol.279, No.25, p.26605-26611, 2004、Fig.1)。
その他、βG結合性蛋白質として、下記のものを用いた。
・マウス由来デクチン−1(R&D SYSTEMS社製)
・マウス由来抗(1,3)βG抗体(Biosupplies Australia Pty Ltd製)
Peroxidase Labeling Kit -NH2((株)同仁化学研究所製)を使用し、キットに添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(1)で調製した各βG結合性蛋白をペルオキシダーゼで識標した。
1)βG結合性蛋白質固定化ELISA用マイクロプレートの調製
上記(1)で調製したβG結合性蛋白質を、それぞれ50mM MOPS緩衝液(pH7.0)で5μg/mLに調製し、ELISA用マイクロプレート(Nunk社製)の各ウェルに50μL分注し、10℃で16時間静置して、該マイクロプレートに各βG結合性蛋白質を固定化した(βG結合性蛋白質として約250ng/ウェル)。
上記(2)で得られたペルオキシダーゼ標識βG結合性蛋白質を、それぞれ50mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.0)に溶解した1%ブロックエース溶液で、8000倍に希釈した。
β−グルカンテストワコー「β−グルカン標準品」(和光純薬工業(株)製)を、50mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.0)に溶解した1%ブロックエース溶液で、レンチナン換算値1000pg/mLに調製した。これを試料として用いた。
上記3)で調製した試料50μL(レンチナン換算値 50pg)を、上記1)で調製したβG結合性蛋白質固定化ELISA用マイクロプレートの各ウェルに添加し、37℃で1時間反応させた。次いで各ウェルをPBS-T(和光純薬工業製)で3回洗浄した。上記2)で調製したペルオキシダーゼ標識βG結合性蛋白質(2μg/mL)をそれぞれ各ウェルに50μl ずつ分注し、37℃で1時間反応させた。各ウェルをPBS-T で3 回洗浄後、蒸留水で1回洗浄し、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)溶液(和光純薬工業(株)製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃、30分間反応させた。その後、反応停止液(1Mりん酸溶液)を各ウェルに50μL ずつ添加して反応を停止させた。450nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
尚、レンチナン換算値 0pg/mLの試料を用いて同様に測定を行い、ブランク値とした。
得られた結果を、表3に示す。
i: カイコ由来βG認識蛋白質
ii: カイコ由来βG認識結合蛋白質
iii: Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a
iv: ノシメマダラメイガ由来βG認識蛋白質
v: マウス由来デクチンI
vi: マウス由来抗(1,3)βG抗体
○: OD450nm(×1000)が100以上且つ、S/Nが1.5以上
△: OD450nm(×1000)が50〜99又は、S/Nが1.0以上
×: OD450nm(×1000)が0〜49又は、S/Nが1.0以上
(1)Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片のデザイン
実施例1(5)で得られたLimulus属カブトガニG因子αサブユニットのアミノ酸配列(配列番号2)を基に、下記4種のLimulus属G因子αサブユニット由来断片をデザインした。尚、各断片の模式図を、Limulus属カブトガニG因子αサブユニットの模式図と比較できるように、図1に併せて示した。
NCBI(National Center for Biotechnology Information)データベースに開示された、Tachypleus属G因子αサブユニットの遺伝子配列(配列番号11)をもとに、下記4種のTachypleus属G因子αサブユニット由来断片をデザインした。尚、各断片の模式図を、Tachypleus属カブトガニG因子αサブユニットの模式図と比較できるように、図2に併せて示した。
上記(1)及び(2)でデザインした各断片のアミノ酸配列をコードする各塩基配列から、各断片をコードする塩基配列を増幅させるPCRプライマーを設計した。
Peroxidase Labeling Kit−SH((株)同仁科学研究所製)を使用し、キットに添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(3)で得られたLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来の各断片、及びTachypleus属カブトガニG因子αサブユニット由来の各断片それぞれをペルオキシダーゼで標識した。
1)カブトガニG因子αサブユニット由来各断片固定化ELISA用マイクロプレートの調製
上記(3)で調製したLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来の各断片、及びTachypleus属カブトガニG因子αサブユニット由来の各断片をβG結合性蛋白質として用いる以外は、実施例2(3)1)と同様の方法で、Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来の各断片、又はTachypleus属カブトガニG因子αサブユニットの各断片を固定化したELISA用マイクロプレートをそれぞれ調製した。
上記(4)で調製したLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来の各断片のペルオキシダーゼ標識物、及びTachypleus属カブトガニG因子αサブユニット由来の各断片のペルオキシダーゼ標識物を、それぞれ50mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.0)に溶解した1%ブロックエース溶液で、8000倍に希釈した。
実施例2(3)3)と同じ試薬を用い、同じ方法で試料を調製した。
上記3)で調製した試料50μL(レンチナン換算値50pg)を上記1)で調製した各マイクロプレートの各ウェルに添加した。以後は、実施例2(3)4)と同様の方法で、450nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
尚、レンチナン換算値0pg/mLの試料を用いて同様に測定を行い、ブランク値とした。
得られた結果を、表7に示す。
また、表7において、それぞれの記号は下記カブトガニG因子αサブユニット由来断片を用いた場合の結果である。
b:Limulus属カブトガニG因子αサブユニット断片b
c:Limulus属カブトガニG因子αサブユニット断片c
d:Limulus属カブトガニG因子αサブユニット断片d
e:Tachypleus属カブトガニG因子αサブユニット断片e
f:Tachypleus属カブトガニG因子αサブユニット断片f
g:Tachypleus属カブトガニG因子αサブユニット断片g
h:Tachypleus属カブトガニG因子αサブユニット断片h
表7のデータの読み方は、表3の場合と同様である。
○: OD450nm(×1000)が100以上且つ、S/Nが1.5以上
△: OD450nm(×1000)が50〜99又は、S/Nが1.0以上
×: OD450nm(×1000)が0〜49又は、S/Nが1.0以上
NT: not test
(1)カブトガニG因子αサブユニット由来断片の調製
1)Limulus属G因子αサブユニット由来断片b及びTachypleus属G因子αサブユニット由来断片gの調製
形質転換用の大腸菌株としてプロテアーゼ欠損株でB株派生のBL21(DE3)を用いる以外は、実施例3(3)と同様の方法を実施して、Limulus属G因子αサブユニット由来断片b及びTachypleus属G因子αサブユニット由来断片gを発現させ、精製した。
Tachypleus属G因子αサブユニット由来断片gの(547aa-673aa)のN末端にシステイン1残基を導入したTachypleus属G因子αサブユニット由来断片g/Cysを設計した。次いで、プライマーFとして配列番号45に記載の塩基配列(5'-tgttctaaattaattcaggcag-3')を持つプライマー、プライマーRとして配列番号36に記載の塩基配列を持つプライマーを用いる(プライマーF及びプライマーRは、シグマ社に委託して合成した。)以外は、実施例3(3)と同様の方法を実施して、Tachypleus属G因子αサブユニット由来断片g/Cysを発現させ、精製した。
1)βG結合性蛋白質固定化ELISA様マイクロプレート
実施例3(5)1)で調製したのと同じものを用いた。
2)ペルオキシダーゼ標識発現断片の調製
Peroxidase Labeling Kit−SHを使用し、キットに添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(1)で得られた各断片をペルオキシダーゼで標識した。
3)試料:実施例2(3)3)と同じ試薬を用い、同じ方法で試料を調製した。
4)測定
上記3)で調製した試料50μL(レンチナン換算値50pg)を上記(2)1)で調製した各マイクロプレートの各ウェルに添加した。以後は、実施例2(3)4)と同様の方法で、450nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
尚、レンチナン換算値0pg/mLの試料を用いて同様に測定を行い、ブランク値とした。
得られた結果を、下記の表10及び表11に示す。
表10は、ペルオキシダーゼ標識断片として、上記(1)1)で得られたLimulus属G因子αサブユニット由来断片bのペルオキシダーゼ標識物又はTachypleus属G因子αサブユニット由来断片gのペルオキシダーゼ標識物を用いた場合の結果を示す。
Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片aのN末端にシステイン1残基を導入したLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysを設計した。次いで、プライマーFとして配列番号46に記載の塩基配列(5'-tgtctggattaagattacaaagg-3')を持つプライマー、プライマーRとして配列番号24に記載の塩基配列を持つプライマーを用いる以外は(プライマーF及びプライマーRは、シグマ社に委託して合成した。)、実施例1(6)〜(8)と同様の方法を実施して、Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysを発現させ、精製した。
Peroxidase Labeling Kit−SHを使用し、添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(1)で得られたリコンビナントLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysをベルオキシダーゼで標識した。
これを、50mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.5)に溶解したカゼイン含有の1%ブロックエース溶液で8000倍に希釈したものを、測定に用いた。
βG測定用キットであるβ−グルカンテストワコーに添付の「β−グルカン標準品」(和光純薬工業製)を、50mM PBS(pH7.5)に溶解した0.5%血清アルブミンで希釈し、レンチナン換算値(「βG標準品」に添付の現品説明書に記載:表示値35pgはレンチナン1ngに相当)1000pg/mLに調製した。そして、更に50mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7)に溶解した0.5%血清アルブミンでレンチナン換算値0、20、50、100、250、400、500pg/mLに調製した。これを試料として用いた。
実施例3で得られたリコンビナントLimulus属G因子αサブユニット由来断片bを、50mM MOPS緩衝液(pH7.0)で5μg/mLに調製し、ELISA用マイクロプレートの各ウェルに50μLずつ分注し、10℃で16時間静置して、該マイクロプレートにLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片bを固定化した。
上記(4)で調製したマイクロプレートの各ウェルに、上記(3)で調製した各レンチナン濃度の試料をそれぞれ50μLずつ添加し、37℃で1時間反応させた。次いで各ウェルをPBS-T(和光純薬工業製)で3回洗浄した。上記(2)で調製したペルオキシダーゼ標識Limulus属カブトガニG因子αサブユニット断片aを各ウェルに50μl ずつ分注し、37℃で1時間反応させた。各ウェルをPBS-T で3 回洗浄後、蒸留水で1回洗浄した。次いでTMB溶液(和光純薬工業製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃で30分間反応させた。その後、キットの反応停止液(1Mりん酸溶液)を各ウェルに50μL ずつ添加し、反応を停止させた。波長450nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
得られた検量線を図4に示す。図4において、エラーバーは2SDの値を示す。
R2=0.9989
(1)βG結合性蛋白質
実施例1で得られたリコンビナントLimulus属G因子αサブユニット由来断片a、及び実施例3で得られたリコンビナントLimulus属G因子αサブユニット由来断片bを用いた。
上記(1)のβG結合性蛋白質を、それぞれ50mM MOPS緩衝液(pH7.0)にて0、3、4、5、6、7μg/mLに調製し、ELISA用マイクロプレートの各ウェルに50μL分注した。10℃で16時間静置して、マイクロプレートに各βG結合性蛋白質を固定化した。
(1)ペルオキシダーゼ活性の測定
実施例1で得られたリコンビナントLimulus属G因子αサブユニット由来断片aの10μg/mL溶液(50mM MOPS緩衝液(pH7.0))中に、エチレンジアミン四酢酸・2Na(EDTA)を終濃度70m、又はNaN3を終濃度0.05%となるように混合し、25℃、1時間インキュベートした。対照としてこれら金属キレート剤を含有しないLimulus属G因子αサブユニット由来断片aの10μg/mL溶液を調製した。
得られた結果を、図6に示す。
(1)Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysの調製
Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片aのN末端にシステイン1残基を導入したLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysを設計した。次いで、プライマーFとして配列番号46に記載の塩基配列(5'-tgtctggattaagattacaaagg-3')を持つプライマー、プライマーRとして配列番号24に記載の塩基配列を持つプライマーを用いる以外は(プライマーF及びプライマーRは、シグマ社に委託して合成した。)、実施例1(6)〜(8)と同様の方法を実施して、Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysを発現させ、精製した。
(i)標識用の250bpDNA断片の調製
プライマー1(5'-gcctagcaaactcggaagatt-3'、配列番号47)と、あらかじめ5‘末端にC6アミノリンカー(シグマ社製)が導入されたプライマー2(塩基配列は5'-atctatgactgtacgccaatgtccctag-3'、配列番号48)をシグマ社に委託して合成した。このプライマーペアを用い、λDNA(株式会社日本ジーン製)を鋳型として用いてPCRを行ない、一方の末端にC6アミノリンカーを持つ250bpDNA断片を調製した。このPCR産物をDEAEイオン交換クロマトグラフィーおよびイソプロパノール沈殿により精製し、標識用250bpDNA断片を得た。
DNA断片に導入されたC6アミノリンカーのNH2基と、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミドエステル(EMCS)リンカー(サーモフィシャー社製)とをEMCS添付説明書記載の方法により反応させた後、ゲル濾過処理を行い、未反応EMCSリンカーを除去してEMCSリンカーが結合したDNA断片を得た。このEMCSリンカー結合DNA断片と上記(1)の断片aとをEMCS添付説明書記載の方法で反応させた。得られた反応物をDEAEイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片aのDNA標識体を得た。
HiLyte Fluor 647 C2 maleimide(AnaSpec,Inc.製)を使用し、添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(1)で得られた断片a/CysをHiLyte Fluor 647で蛍光識標した。
βG測定用キットであるβ−グルカンテストワコーに添付の「β−グルカン標準品」(和光純薬工業製)を、キット添付のβ−グルカン標準溶解液で溶解し標準液(原液)を調製した。更にキット添付のβ−グルカン標準溶解液で希釈しレンチナン換算濃度で0、25、50、100、200、400、800pg/mLに調製した。これを試料として用いた。
1)キャピラリーチップ
図7に示すレイアウトを有するキャピラリーチップを、「マイクロ科学チップの技術と応用」185〜217頁[北森武彦ほか 2004年出版(丸善株式会社)]に記載の方法に従い、以下のように作製した。
上記(2)で得られたLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/CysのDNA標識体、および上記(3)で得られたLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysの蛍光標識体を用いて、以下の組成の反応用試液を調製した。
6nM Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysの蛍光標識体
150mM BisTris
100mM 塩化マグネシウム
0.56% pDMA22(ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド))
3.33% グリセロール
0.056% Tween20
0.01% BSA
1% ヘパリンリチウム
pHを7.0に調製
a) トレーリングバッファー:75mM Tris base, 0.5% pDMA 22, 3% Glycerol, 0.05% Tween20, 0.01% BSAを含む125mM HEPES
b) リーディングバッファー:50mM NaCl, 0.5% pDMA22, 3% Glycerol, 0.05% Tween20, 0.01% BSA, 1% Heparin Liを含む75mM Tris-HCl (pH8.0)
図7のSウェル(泳動用試料導入用ウェル)に前記2)で得られた泳動用試料10μLを、R1ウェル(試液導入用ウェル)にトレーリングバッファー10μLを、L1ウェル及びL2ウェルにリーディングバッファー10μLをそれぞれを滴下し、W1(ドレイン用ウェル)−W2(ドレイン用ウェル)間に100秒間、−5psiの圧力を印加して、泳動用試料及びリーディングバッファーをチャンネルに導入した。
図7のR1ウェル−L1ウェル間に2500Vの電圧を印加して、30℃で、R1→L1方向に泳動用試料を濃縮させながら電気泳動を行なった。L1ウェル−L2ウェル間の電圧をモニターすることで、L2チャンネルとメインチャンネルとのクロス部分の通過を確認し、通過したところでL2ウェル−L1ウェル間に1500Vの電圧を120秒間印加して、L2→L1方向に泳動して当該試料中の未反応のLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysの蛍光標識体と、試料中のβGとLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/CysのDNA標識体およびLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysの蛍光標識体の複合体とを分離し、該複合体量の検出を行った。
得られた検量線を図8に示す。図8において、エラーバーは2SDを示す。
また、測定値から最小2乗法で求めた回帰直線式と相関係数は下記の通りである。
y=0.0370x+5.1
R2=0.9999
(1)Limulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cys
実施例8で得られたリコンビナントLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysを用いた。
Peroxidase Labeling Kit−SHを使用し、添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(1)のリコンビナントLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a/Cysをベルオキシダーゼで標識した。
これを、50mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.5)に溶解したカゼイン含有の1%ブロックエース溶液で8000倍に希釈したものを、測定に用いた。
ヒト血漿を、50mM PBS (pH7.5, 0.5%血清アルブミン含有)で10倍希釈し、その半量を70℃で10分間温浴中で加熱処理(前処理)した。
前処理した血漿と、前処理しなかった血漿を夫々血漿試料として用いた。
実施例1で得られたリコンビナントLimulus属G因子αサブユニット由来断片aを、50mM MOPS緩衝液(pH7.0)で5μg/mLに調製し、ELISA用マイクロプレートの各ウェルに50μLずつ分注し、10℃で16時間静置して、該マイクロプレートにLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片aを固定化した。
次いで、非特異的吸着を減少させるためのブロッキング操作として、50mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.0)に溶解した0.5%血清アルブミンを各ウェルに0.2ml ずつ分注し、室温で1 時間静置後、各ウェルを洗浄する処理を行った。
上記(4)で調製したマイクロプレートの各ウェルに、上記(3)で調製した血漿試料をそれぞれ50μLずつ添加し、37℃で1時間反応させた。次いで各ウェルをPBS-T(和光純薬工業製)で3回洗浄した。上記(1)で調製したペルオキシダーゼ標識Limulus属カブトガニG因子αサブユニット断片aを各ウェルに50μl ずつ分注し、37℃で1時間反応させた。各ウェルをPBS-T で3 回洗浄後、蒸留水で1回洗浄した。次いでTMB溶液(和光純薬工業製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃で30分間反応させた。その後、反応停止液(1Mりん酸溶液)を各ウェルに50μL ずつ添加し、反応を停止させた。波長450nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
別にβ−グルカン標準品を、実施例5(3)の方法で調製した試料を用いて同様に測定を行い、検量線を作成した。
血漿試料を用いて得られた吸光度値を、該検量線に当てはめることによって、血漿試料中のβG量を算出した。
また本実施例の方法によるβG測定法は、血漿中に含まれるヘパリンの影響を受けないことを確認している。
得られた結果を表12に示す。
(1)血漿試料
実施例9で用いた、前処理した血漿試料を用いた。
上記(1)の血漿試料のβG濃度を、βG測定用キットである市販のβ−グルカン テストワコー(和光純薬工業(株)製)を用い、当該キットのパンフレットに記載の操作法に従い、比濁時間分析法の常法に従って以下のようにβGの測定を行った。
すなわち、前処理した血漿試料200μLを、キットのリムルス試薬(凍結乾燥品。カブトガニ血球抽出物(AL)を含有する。)に添加し、ボルテックスミキサーにより数秒間攪拌した後、37℃保温下に、トキシノメーターMT−5500(和光純薬工業(株)製)を用いて、上記混合液の透過光量が、測定開始から5%減少するまでの時間(以下、Tgと略記する。)を測定した。別に、蒸留水と濃度既知のβG溶液を用いて同様の測定を行い、βG濃度とTgとの関係を表す検量線を作成した。この検量線に基づいて、試料中のβGの濃度を算出した。
得られた結果を表12に併せて示す。
このことから、本発明のβG測定法を実施すれば、試料の前処理を行わずにβGの測定を行えることが判る。また、以上の結果は、本発明のβGの測定法は、臨床試料中のβGを検出するための新しい検出系になり得ることを示唆するものである。
(1)本発明のサンドイッチ測定
1)ペルオキシダーゼ標識Limulus属G因子αサブユニット由来断片a/Cys
実施例9で調製したペルオキシダーゼ標識Limulus属G因子αサブユニット由来断片a/Cysを用いた。
実施例9で調製したLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片a固定化ELISA用マイクロプレートを用いた。
市販のβ−グルカンテストワコー(和光純薬工業(株))を用いた測定で、βG濃度がカットオフ辞意かであることを確認したヒト血漿(N=50)を、実施例9と同じ方法で前処理したものを血漿試料として用いた。
実施例9と同じ機器を用い、同様の測定条件で測定を行い、血漿試料中のβG量を算出した。
血漿試料として、上記(1)3)と同じものを用いる以外は比較例1と同様の方法で、血漿試料中のβG量を算出した。
本発明のサンドイッチ測定法により得られたβG濃度(本発明のβG測定法)と、市販のキットを用いた従来のカブトガニ血球抽出物を用いた測定法により得られたβG濃度(従来の測定法)との相関図を図9に示す。
y=0.506x+6.248
R=0.933
(1)ペルオキシダーゼ標識Limulus属G因子αサブユニット由来断片a/Cys
実施例9で調製したペルオキシダーゼ標識Limulus属G因子αサブユニット由来断片a/Cysを用いた。
実施例5(4)で調製したLimulus属カブトガニG因子αサブユニット由来断片b固定化ELISA用マイクロプレートを用いた。
βG測定用キットであるβ−グルカンテストワコーに添付の「β−グルカン標準品」(和光純薬工業製)を、キット添付のβ−グルカン標準溶解液で溶解し標準液(原液)を調製した。更にキット添付のβ−グルカン標準溶解液で希釈しレンチナン換算濃度で0、1、5、10,17,50,100pg/mLに調製した。これを試料として用いた。
上記(2)のマイクロプレートの各ウェルに、上記(3)で調製した試料をそれぞれ50μLずつ添加し、37℃で1時間反応させた。次いで各ウェルをPBS-T(和光純薬工業製)で3回洗浄した。上記(1)のペルオキシダーゼ標識Limulus属カブトガニG因子αサブユニットa/Cysを各ウェルに50μl ずつ分注し、37℃で1時間反応させた。各ウェルをPBS-T で3 回洗浄後、蒸留水で1回洗浄した。次いでSuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo scientific製)を加え、キットに添付の取扱説明書に従って、反応させた。
Ultra Evolution(TECAN Group Ltd.製)を用いて、発光量(cps, count per second)を測定した。
結果を図10に示す。図10において、エラーバーは1SDの値を示す。
図10から明らかな如く本発明に係るβG結合性蛋白質を用いて、蛍光測定でβGの測定を行った場合、レンチナン濃度の下限が1pg/mLまで有意に検出可能であることが確認できた。
R1 トレーリングバッファー導入用ウェル
S 泳動用試料導入用ウェル
W1、W2 ドレイン用ウェル
Claims (21)
- 下記の方法で行う、β−グルカン(以下、「βG」と略記する。)の測定方法、
(1)試料と、配列番号4、6、8、10、14、16、18又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質1(以下、「βG結合性蛋白質1」と略記する。)と、配列番号4、6、8、10、14、16、18又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質2(以下、「βG結合性蛋白質2」と略記する。)とを接触させて、βG結合性蛋白質1と試料中のβGとβG結合性蛋白質2との複合体を形成させ、
(2)該複合体の量を測定し、
(3)得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβ−グルカン量を測定する。 - βG結合性蛋白質1が不溶性担体に固定化されている、請求項1に記載の測定方法。
- βG結合性蛋白質2が標識物質で標識されている、請求項1に記載の測定法。
- 下記の方法で行う、請求項1に記載の測定方法、
(1)試料と、βG結合性蛋白質1とを接触させて、試料中のβGとβG結合性蛋白質1との複合体−1を形成させ、次いで
(2)該複合体−1と、βG結合性蛋白質2と接触させて、βG結合性蛋白質1と試料中のβGとβG結合性蛋白質2との複合体−2とを形成させ、次いで
(3)該複合体−2の量を測定し、
(4)得られた該複合体−2の量に基づいて、試料中のβG量を測定する。 - 下記の方法で行う、請求項1に記載の測定方法、
(1)試料と、不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1とを接触させて、試料中のβGと不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1との複合体−1を形成させ、次いで
(2)該複合体−1と、βG結合性蛋白質2とを接触させて、複合体−1とβG結合性蛋白質2との複合体−2を形成させ、次いで
(3)該複合体−2の量を測定し、
(4)得られた該複合体−2の量に基づいて、試料中のβ−グルカン量を測定する。 - 下記の方法で行う、請求項1に記載の測定方法、
(1)試料と、不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1とを接触させて、試料中のβGと不溶性担体に固定化されたβG結合性蛋白質1との複合体−1を形成させ、次いで
(2)該複合体−1と、標識物質で標識された標識βG結合性蛋白質2とを接触させて、複合体−1と標識βG結合性蛋白質2との複合体−2を形成させ、次いで
(3)該複合体−2中の標識物質量を測定し、
(4)得られた標識物質量に基づいて、試料中のβG量を測定する。 - βG結合性蛋白質1及びβG結合性蛋白質2を、不溶性担体に固定化することなく用いる、請求項1に記載の測定法。
- 複合体を形成させた後、該複合体と、遊離のβG結合性蛋白質1及び遊離のβG結合性蛋白質2を、キャピラリー電気泳動で分離する、請求項7に記載の測定法。
- 配列番号4、6、8、10、14又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質を含有する、βG測定用試薬。
- βG結合性蛋白質が不溶性担体に固定化されている、請求項9に記載の試薬。
- βG結合性蛋白質が標識物質で標識されている、請求項9に記載の試薬。
- 下記を構成成分として含んで成るβ−グルカン測定用キット
(1)配列番号4、6、8、10、14、16、18又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質1を含有する試薬
(2)配列番号4、6、8、10、14、16、18又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質2を含有する試薬。 - βG結合性蛋白質1が不溶性担体に固定化されている、請求項12に記載のキット。
- βG結合性蛋白質2が標識物質で標識されている、請求項12に記載のキット。
- 配列番号4、6、8、10、14又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質。
- 配列番号1、3、5、7、9、13又は19のいずれかで表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する、核酸分子。
- 配列番号2、4、6、8、10、14又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質、をコードする、核酸分子。
- 核酸分子がDNAである、請求項16又は17に記載の核酸分子。
- 請求項16又は17に記載の核酸分子が組み込まれた組換え体。
- 請求項19に記載の組み換え体により形質転換又は形質導入された形質転換体又は形質導入体。
- 請求項20に記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られた培養物から蛋白質を分離することを特徴とする、配列番号2、4、6、8、10、14又は20のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβGに対する結合性を有する蛋白質、の製造方法。
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