CN117586990A - Cas12f1突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种Cas12f1突变体及其应用，主要包括四种点突变蛋白，分别为在野生型Cas12f1蛋白上发生K173A、K186A、K196A、K198A氨基酸位点突变，本发明中的CRISPR‑Cas12f1系统(含有突变的Cas12f1蛋白)可应用于体内外基因编辑中，降低对细胞内RNA的非特异性脱靶效应，也可应用于分子检测中，避免检测中错误结果的出现；CRISPR‑Cas12f1系统(含有突变的12f1蛋白K173A、K186A、K196A、K198A)可实现与CRISPR‑Cas13a联合使用，互不干扰，用于检测两种不同的靶核酸。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为Cas12f1a蛋白及其用途。
背景技术
CRISPR-Cas系统是由成簇规则间隔的短回文重复序列(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein，Cas)组成，存在于大部分的古细菌和细菌中。CRISPR-Cas作为古细菌和绝大多数细菌的获得性免疫系统，发挥抵御外源核酸、质粒和病毒入侵的功能。按照Cas蛋白的组成可以将CRISPR-Cas系统可分为两类：第1类系统依赖的Cas蛋白为多亚基蛋白复合物，第2类系统依赖的Cas蛋白为单一效应蛋白。最为常用的CRISPR-Cas9，CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13系统均属于第二类系统。对CRISPR-Cas系统的免疫机制进行研究和改造后，实现了将其应用于特异性分子靶标检测，发展出了基于CRISPR-Cas系统的分子检测技术。基于Cas12和Cas13的核酸检测方法依赖于Cas蛋白的反式切割活性，当Cas蛋白与gRNA(guide RNA，向导RNA)、靶核酸序列形成效应复合物时，其附属切割活性被激活，对已被标记的DNA或RNA探针序列进行切割，从而释放出信号达到检测效果。
Cas12f1(又称Cas14a1)是迄今为止记录的最小的第2类CRISPR-Cas效应子，长度在400到700个氨基酸之间。与其他常用Cas蛋白(Cas9,Cas13a，Cas12a和Cas12b)不同，Cas12f1的功能发挥需要二聚化过程。两个拷贝的Cas12f1与一个crRNA和一个tracrRNA 结合，从而识别靶向DNA底物。crRNA与tracrRNA可人工改造融合成一个单向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)。Cas12f1的二聚化可能是为了弥补Cas12f1蛋白的有限大小，从而能够识别约20碱基对的靶标DNA序列。最初发现Cas12f1特异性靶向ssDNA(single-strand DNA，单链DNA)。不过，最近的报道表明，Cas12f1也能识别含有5'T-rich PAM的dsDNA(double-strand DNA，双链DNA)。与其他Cas12a和Cas12b类似，Cas12f1与互补靶DNA结合后，也能激发其非特异性的反式裂解ssDNA活性。
CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13是最常用的基于CRISPR原理的分子检测系统，如何快速、简便、廉价、精确的检测仍然是改进检测技术的重要方向，尤其是如何对核酸进行多重检测，是急待解决的问题。现有的研究认为，CRISPR-Cas12f1系统特异性地靶向DNA并激活其反式DNase活性，且不具有RNase活性，从而只切割标记的ssDNA探针序列。CRISPR-Cas13a系统特异性地靶向RNA并激活其反式RNase活性，且不具有DNase活性，从而只切割标记的RNA探针序列。如结合使用这两个系统，就可实现单管同时检测两种靶标而不互相干扰。但是我们的研究表明，Cas12f1具有自主性的RNase活性，该活性不依赖于靶标核酸或sgRNA的激活，其蛋白本身自主存在。这使得如果结合使用CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas12a两种系统，Cas13a反式RNase活性与Cas12f1自主RNase活性相互干扰，导致错误的检测结果。
如何消除Cas12f1自主RNase活性而只保留可激活的反式DNase活性，是CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas12a能结合使用的前提。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种检测灵敏度、准确性更好以及检测时间短的试剂盒以及其使用方法。
本发明提供一种Cas12f1蛋白突变体，所述Cas12f1蛋白突变体在野生型上发生K173A、K186A、K196A、K198A中的一种突变，所述Cas12a蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子包含如上所述的Cas12f1蛋白突变体的核酸序列，序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核酸分子。
本发明还提供一种CRISPR-Cas12f1系统，所述CRISPR-Cas12f1系统包括第一向导RNA和如上所述的Cas12f1蛋白突变体。
本发明提供的CRISPR-Cas12f1系统用于可应用于体内外基因编辑中，降低对细胞内RNA的非特异性脱靶效应或者制备治疗疾病的药物中的用途。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一向导RNA、如上所述的蛋白突变体和第一检测核酸。
本发明还提供一种双重检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂盒包含第一向导RNA、如上所述的蛋白突变体、第一检测核酸、第二向导RNA、Cas13a蛋白和第二检测核酸。
进一步的，所述试剂盒中还包括两种不同标记的核酸(ssDNA，RNA)探针。
本发明还提供非疾病诊断目的的对样品中的靶核酸进行双重检测的方法，将样品包括将样品与如上所述的试剂盒中的检测组合物接触，检测由Cas蛋白切割核酸探针产生的可检测信号，从而检测靶核酸。
进一步的，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。
进一步的，所述检测探针的5’端和3’端分别设置不同的报告基团
进一步的，所述靶核酸来源于病毒核酸、细菌核酸或与疾病相关的特异核酸。
进一步的，所述靶核酸包括单链核酸、双链核酸。
本发明中的可检测信号可以是当切割检测核酸时产生的任何信号，例如，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，基于荧光信号的检测，胶体相变/分散，电化学检测，基于半导体的传感。所述可检测信号可通过任何合适的方式读出，包括但不限于：可检测的荧光信号的测量，凝胶电泳检测(通过检测凝胶上的条带的变化基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异(例如，基于金纳米颗粒)以及电信号的差异。
本发明中的可检测信号可以是定量的，也可以是定性的。
本发明中，检测核酸两端加的标签为分别设置的荧光基团和猝灭基团，当检测核酸被被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。
本发明中的双重检测试剂盒用于检测两种不同的靶核酸，试剂盒中所使用的核酸探针也是不同的，第一核酸探针两端分别设置第一荧光基团、第一淬灭基团和第一核酸寡聚物；第二核酸探针两端分别设置第二荧光基团、第二淬灭基团和第二核酸寡聚物。
本发明中提供的检测靶核酸的方法可以实现对于样品中核酸的双重检测，第一靶核酸和第二靶核酸的第一靶序列和第二靶序列可以是针对同一靶核酸或同一基因的不同位点设计的靶序列，或者是，针对不同靶核酸或不同基因设计的靶序列。
本发明中所述“靶核酸”是指从生物样品(待测样品)中提取的多核苷酸分子。所述生物样品是从任何生物体获得、排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物，例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物(例如植物或动物，包括来自健康或表面健康的人类受试者或受待诊断或调查的病症或疾病影响的人类患者的样品，例如病原微生物例如病原细菌或病毒的感染)。例如，生物样品可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液、渗出液(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的液体)中获得的生物液体或从关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或脓毒性关节炎)获得的液体，或皮肤或粘膜表面的拭子。样品也可以是从任何器官或组织获得的样品(包括活组织检查或尸体解剖标本，例如肿瘤活检)或者可以包含细胞(原代细胞或培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调理的培养基。示例性的样品包括但不限于，细胞、细胞裂解物、血涂片、细胞离心制剂、细胞学涂片、体液(例如血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、支气管肺泡灌洗、精液等)、组织活检(例如肿瘤活组织检查)、细针抽吸物和/或组织切片(例如低温恒温器组织切片和/或石蜡包埋的组织切片)。
本发明中所述的“gRNA”又称为guide RNA或导向RNA，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成单向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)。一般而言，crRNA可以包含直接重复序列(directrepeat，DR)和间隔序列(Spacer)，或者基本上由或由直接重复序列和间隔序列(spacer)组成。在某些情况下，间隔序列是与靶序列(本发明中所述特征序列)具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列，通常具有12-30nt的序列长度。所述的直接重复序列和tracrRNA可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的间隔序列不需要与特征序列(靶序列)100％互补。所述的间隔序列不与核酸探针互补。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明中的CRISPR-Cas12f1系统(含有突变的Cas12f1蛋白K173A、K186A、K196A、K198A)可应用于可应用于体内外基因编辑中，降低对细胞内RNA的非特异性脱靶效应，也可应用于分子检测中，避免检测中错误结果的出现；
2、本发明中的CRISPR-Cas12f1系统(含有突变的12f1蛋白K173A、K186A、K196A、K198A)可实现与CRISPR-Cas13a联合使用，互不干扰，用于检测两种不同的靶核酸；
3、本发明中发现野生的Cas12f1蛋白本身存在RNase活性，并且发现了几个关键位点可以用于抑制RNase活性的关键位点，以此达到与CRISPR-Cas13a联合使用的目的，来达到对于靶核酸双重检测的目的。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1为Cas12f1具有自主性的RNase活性图
图2为Cas12f1的RNase活性并不受gRNA和靶标核酸的影响图
图3为D213A Cas12f1突变体质粒图谱
图4为D326A Cas12f1突变体质粒图谱
图5为K173A Cas12f1突变体质粒图谱
图6为K186A Cas12f1突变体质粒图谱
图7为K196A Cas12f1突变体质粒图谱
图8为K198A Cas12f1突变体质粒图谱
图9为K267A Cas12f1突变体质粒图谱
图10为R261A Cas12f1突变体质粒图谱
图11为突变体蛋白DS-PAGE凝胶电泳/考马斯亮蓝染色结果图
图12为突变体Cas12f1(K173A、K186A、K196A、K198A、D213A、R261A和D326A)Cas12f1对自主RNase的活性影响图
图13为突变体Cas12f1(K173A、K186A、K196A、K198A、D213A、R261A和D326A)Cas12f1对反式DNase的活性影响图
图14为Cas12f1与Cas13a联合检测使用示意图
图15为Cas12f1/WT与Cas13a联合检测结果图
图16为Cas12f1/K173A与Cas13a联合检测结果图
图17为Cas12f1/K186A与Cas13a联合检测结果图
图18为Cas12f1/K196A与Cas13a联合检测结果图
图19为Cas12f1/K198A与Cas13a联合检测结果图
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明中所使用的DNA和RNA均可从基因合成服务公司化学合成所获得。
本发明中检测核酸RNA寡核苷酸和荧光基团/淬灭基团标记的核酸探针分别从百力格生物科技(上海)股份有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成；检测核酸DNA寡核苷酸和基因片段为PAGE纯化级，分别购自北京祥鸿生物科技有限公司和生工生物技术有限公司(上海)。DNA 和RNA寡聚体溶解于不含DNase/RNase的水中，定量至100uM的储备液。
实施例1Cas12f1具有不依赖于激活的自主性RNase活性
1.1序列设计及获取
SEQ ID NO 9：Cas12f1/sgRNA：特异性识别人HERC2基因片段(HECT andRLDdomain containing E3 ubiquitin protein ligase 2[Homo sapiens](HERC2)，GeneID:8924)
5’-ACCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAGAAAGGAAUGCAACACUUGACACUUAAUGCUCAA-3’
SEQ ID NO 10:Cas12f1/ssDNA：人HERC2基因片段，待检测单链DNA序列5’-AGAGGCGAGGCCAGTTTCATTTGAGCATTAAGTGTCAAGTTCTGCACGCTATCATCATC-3’
SEQ ID NO 14:RNA荧光探针：5’-UUUUUUUUU-3’(两端标记：5`6-FAM，3`BHQ1)
2.2反应体系和荧光检测
按照图1所示意各组(I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII)主要成分，RNA核酸探针，Cas12f1/sgRNA和靶标核酸Cas12f1/ssDNA)配置反应体系：Cas蛋白(100nM终浓度)、Cas12f1/sgRNA(序列9，100nM终浓度)、荧光/淬灭基团标记RNA探针(序列3，500nM终浓度)、缓冲液(50mM醋酸钾、20mM Tris-醋酸、10mM醋酸镁、100μg/mlBSA)、RNase抑制剂(4U，Vazyme Biotech，南京，中国，产品目录编号：DD4102-PA)、ROX参考染料(500nM终浓度，Sangon Biotech，上海，中国，产品目录编号：B541010)，以及靶核酸底物(序列10，100nM)，最后加入无核酸酶水将反应总体积调至20ul。然后将含有反应体系的48孔反应板放入StepOneTMReal-Time PCR系统(AppliedBiosystemsTM)中，在37℃下孵育2小时，每隔2分钟采集一次荧光信号，总时长120分钟。反应结束后，使用仪器输出原始荧光强度数据，使用统计软件Graph Prism 9进行分析和可视化。
2.3检测结果
数据表明，在没有gRNA和靶标核酸条件下，相比于Cas13a、Cas12a和Cas12b，Cas12f1具有自主性的RNase活性(图1)。并且该RNase活性并不受gRNA和靶标核酸的影响(图2)。
实施例2Cas12f1蛋白突变体的制备
2.1质粒序列及图谱
分别构造如图3-图10所示的质粒。
2.2蛋白表达与纯化
含有表达Un1Cas12f1细菌表达载体pET28a质粒按照生产商提供的方法将质粒产物转化到BL21(DE3)高效细胞(天源公司，中国北京，产品目录号：CB105)中。这些含有表达质粒细胞先在37℃的LB液体培养基中培养，然后在25℃和0.4mM IPTG诱导下表达16小时。在色谱纯化之前，用高压匀浆器破坏细胞。使用HisTrap FF(NiSepharose 6Fast Flow)(Cytiva，产品目录编号:17525501)和HiLoad(Cytiva，产品目录编号:28989335)色谱柱纯化重组蛋白，透析后浓缩到20mM Tris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl、1mMDTT、0.1mM EDTA和50％甘油中，并在-80℃下保存。取2ulCas蛋白浓缩液，加入2ul 5x蛋白上样缓冲液(索莱宝，北京，产品目录号：P1040)和6ul无核酸酶水，煮沸变性后，使用8％SDS-PAGE凝胶电泳后，使用考马斯亮蓝染色(索莱宝，北京，产品目录号：P1305)，观察蛋白的表达纯化情况。
2.3检测结果
我们对可能影响Cas12f1的RNase活性的7个氨基酸位点(K173A、K186A、K196A、K198A、D213A、R261A、K267A)进行了点突变。此外，我们也对D326位点进行了突变，之前已证实该位点会抑制Cas12f的反式DNase活性。由SDS-PAGE凝胶电泳/考马斯亮蓝染色结果可以看出，8个Cas12f1突变蛋白表达纯化结果良好。如图11所示。
实施例3八种Cas12f1蛋白突变体对反式RNase活性的影响
3.1序列设计及获取
SEQ ID NO 9：Cas12f1/sgRNA：特异性识别人HERC2基因片段(HECT andRLDdomain containing E3 ubiquitin protein ligase 2[Homo sapiens](HERC2)，GeneID:8924)
5’-ACCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAGAAAGGAAUGCAACACUUGACACUUAAUGCUCAA-3’
SEQ ID NO 10：Cas12f1/ssDNA：人HERC2基因片段，待检测单链DNA序列5’-AGAGGCGAGGCCAGTTTCATTTGAGCATTAAGTGTCAAGTTCTGCACGCTATCATCATC-3’
序列15:RNA荧光探针：5’-UUUUUUUUU-3’(两端标记：5`6-FAM，3`BHQ1)
序列16:DNA荧光探针：5’-TTTTTTTTTTTT-3’(两端标记：5`6-FAM，3`BHQ1)
3.2反应体系和荧光检测
按照图3所示意的主要成分(Cas12f1蛋白，核酸探针，Cas12f1/sgRNA和靶标核酸Cas12f1/ssDNA)配置反应体系：Cas12f1蛋白(100nM终浓度)、Cas12f1/sgRNA(序列1，100nM终浓度)、荧光/淬灭基团标记RNA探针(序列15，500nM终浓度)或荧光/淬灭基团标记DNA探针(序列16，500nM终浓度)、缓冲液(50mM醋酸钾、20mM Tris-醋酸、10mM醋酸镁、100μg/mlBSA)、RNase抑制剂(4U，Vazyme Biotech，南京，中国，产品目录编号：DD4102-PA)、ROX参考染料(500nM终浓度，Sangon Biotech，上海，中国，产品目录编号：B541010)，以及靶核酸底物(序列10，100nM)，最后加入无核酸酶水将反应总体积调至20ul。然后将含有反应体系的48孔反应板放入StepOneTMReal-Time PCR系统(Applied BiosystemsTM)中，在37℃下孵育2小时，每隔2分钟采集一次荧光信号，总时长120分钟。反应结束后，使用仪器输出原始荧光强度数据，使用统计软件Graph Prism 9进行分析和可视化。
3.3检测结果
结果表明，四个特定位点的突变(K173A、K186A、K196A、K198A)对Cas12f1的自主RNase活性有显著的抑制作用，而D213A、R261A和D326A有促进作用(图12)，同时Cas12f1/K173A和K198A突变对也有一定的抑制(图13)。
实施例4CRISPR/Cas12a(Cas12f1/WT，Cas12f1/K173A,Cas12f1/K186A或Cas12f1/K196A、Cas12f1/K198A)和CRISPR/Cas13a系统双重检测实验
4.1序列设计及获取
SEQ ID NO 9：Cas12f1/sgRNA：特异性识别人HERC2基因片段(HECT andRLDdomain containing E3 ubiquitin protein ligase 2[Homo sapiens](HERC2)，GeneID:8924)
5’-ACCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAGAAAGGAAUGCAACACUUGACACUUAAUGCUCAA-3’
SEQ ID NO 10：Cas12f1/ssDNA：人HERC2基因片段，待检测单链DNA序列5’-AGAGGCGAGGCCAGTTTCATTTGAGCATTAAGTGTCAAGTTCTGCACGCTATCATCATC-3’
SEQ ID NO 11：Cas13a/crRNA:特异性识别甲型流感病毒(H1N1)第4段血凝素(HA)基因5’-GAUUUAGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACUGGGUGUUUGACAAGUUGUAUUGCAAUC-3’
SEQ ID NO 12:Cas13a/RNA:待检测RNA序列,甲型流感病毒(H1N1)第4段血凝素(HA)基因片段5’-UCCACGAUUGCAAUACAACUUGUCAAACACCCAAGGGU-3’
SEQ ID NO 17:RNA荧光探针：5’-UUUUUUUUU-3’(两端标记：5`6-FAM，3`BHQ1)
SEQ ID NO 18:DNA荧光探针：5’-TTTTTTTTTTTT-3’(两端标记：5`VIC，3`BHQ1)
4.2反应体系和荧光检测
按照图14所示意的主要成分(Cas12f1蛋白，Cas12f1/sgRNA,靶标核酸Cas12f1/ssDNA,Cas13a蛋白，Cas13a/crRNA,靶标核酸Cas13a/RNA)配置各反应体系(I，II，III，IV)：Un1Cas12f1蛋白(100nM终浓度)、LbuCas13a蛋白(100nM终浓度)、Cas12f1/sgRNA(序列9，100nM终浓度)、Cas13a/crRNA(序列11，100nM终浓度)、荧光/淬灭基团标记RNA探针(序列17，500nM终浓度)、荧光/淬灭基团标记DNA探针(序列18，500nM终浓度)、缓冲液(50mM醋酸钾、20mM Tris-醋酸、10mM醋酸镁、100μg/ml BSA)、RNase抑制剂(4U，Vazyme Biotech，南京，中国，产品目录编号：DD4102-PA)、ROX参考染料(500nM终浓度，Sangon Biotech，上海，中国，产品目录编号：B541010)，以及不同靶核酸底物(DNA底物，10nM终浓度，序列10；RNA底物，1nM终浓度，序列12)组合或使用无核酸酶水替代靶核酸底物作为背景荧光对照(“V.Blank”)，最后加入无核酸酶水将反应总体积调至20ul。然后将含有反应体系的48孔反应板放入StepOneTMReal-Time PCR系统(Applied BiosystemsTM)中，在37℃下孵育2小时，每隔2分钟采集一次荧光信号，总时长120分钟。反应结束后，使用仪器输出原始荧光强度数据，使用统计软件Graph Prism 9进行分析和可视化。
4.3检测结果
我们在单个反应体系中，使用CRISPR/Cas12f1(Cas12f1/WT，Cas12f1/K173A,Cas12f1/K186A,Cas12f1/K196A或Cas12f1/K198A)和CRISPR/Cas13a系统分别检测DNA(HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2[Homo sapiens](HERC2)，Gene ID:8924)和RNA(Influenza A virus(ACalifornia072009(H1N1)hemagglutinin(HA)NC_026433.1)，并分别使用不同荧光基团(FAM，VIC)标记的ssDNA和RNA报告物作为检测信号(图14)。结果显示，Cas12 f1野生型蛋白(Cas12f1/WT)、不同突变位点Cas12f1蛋白(Cas12f1/K173A,Cas12f1/K186A,Cas12f1/K196A，Cas12f1/K198A)和Cas13a蛋白均能很好地检测到各自核酸靶标(图15-19)。但含有DNA核酸靶标存在而无RNA核酸靶标(II.Cas12f1-sgRNA-DNA Cas13a-crRNA)的条件下,使用Cas12f1/WT反应体系会出现明显的RNA核酸探针荧光信号，表明Cas12f1/WT的自主性的RNase活性切割FAM/Quencher标记的RNA核酸探针，释放荧光信号，从而导致检测RNA靶标的“假阳性”结果(图15，使用“*”标记)。而使用了RNase失活的Cas12f1突变蛋白(Cas12f1/K173A,Cas12f1/K186A,Cas12f1/K196A，Cas12f1/K198A)则显著性降低了“假阳性”荧光信号(图图16-19)。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (12)
1.一种Cas12f1蛋白突变体，其特征在于：所述Cas12f1蛋白突变体在野生型上发生K173A、K186A、K196A、K198A中的一种突变，所述Cas12f1蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
2.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包含编码权利要求1所述的Cas12f1蛋白突变体的核酸序列，序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种CRISPR-Cas12f1系统，其特征在于：所述CRISPR-Cas12f1系统包括第一向导RNA和权利要求1所述的Cas12f1蛋白突变体。
5.权利要求4所述的CRISPR-Cas12f1系统用于可应用于体内外基因编辑中，降低对细胞内RNA的非特异性脱靶效应或者制备治疗疾病的药物中的用途。
6.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含第一向导RNA、权利要求1所述的蛋白突变体和第一核酸探针。
7.一种双重检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含第一向导RNA、权利要求1所述的蛋白突变体、第一核酸探针、第二向导RNA、Cas13a蛋白和第二核酸探针。
8.一种非疾病诊断目的的对样品中的靶核酸进行双重检测的方法，其特征在于：所述方法包括将样品与权利要求7中所述的试剂盒中的检测组合物接触，检测由Cas蛋白切割核酸探针产生的可检测信号，从而检测靶核酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述核酸探针的5’端和3’端分别设置不同的报告基团。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述靶核酸来源于病毒核酸、细菌核酸或与疾病相关的特异核酸。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于：靶核酸包括单链核酸、双链核酸。
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