JP2015051013A - ナノポアを使用するための組成物、デバイス、システム、及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】デバイス及び方法は、フィードバック制御下で、またはポリヌクレオチド及びナノポア間の相互作用により生成された信号を使用して、ポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列を迅速に(約>50Hz)決定するためにも使用される。分子生物学、構造生物学、細胞生物学、分子スイッチ、分子回路、及び分子計算デバイス、並びにそれらの製造の分野に特に有用である。
【選択図】図22
Description
別の実施形態では、本発明は、ポリマーに対する酵素の結合を制御するための方法であって、2つの別々の隣接した媒質の貯留と、一方の貯留から他方の貯留に一度に1つのモノマーのみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する2つの貯留間の界面とを準備すること;ポリマーに対する結合活性を有する酵素を準備すること;2つの貯留の1つにポリマーを導入すること;2つの貯留の1つに酵素を導入すること;2つの貯留間に電位差を印加し、それにより第1の極性を生成させること;最初に電位差を反転させ、第2の極性を生成させること;2度目に電位差を反転させて第1の極性を生成し、それによりポリマーに対する酵素の結合を制御することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、媒質は導電性である。より好ましい実施形態では、媒質は水溶液である。別の好ましい実施形態では、上記方法は、2つの貯留間の電流を測定するステップと;第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値(I1)を、第1の極性が2度目に誘導された際に取得された電流値(I2)と比較するステップと;I1及びI2間の差を決定し、それにより差値dIを取得するステップとを更に含む。別の好ましい実施形態では、上記方法は、2つの貯留間の電流を測定するステップと;第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値(I1)を、後で取得された電流値(I2)と比較して、I1及びI2間の差を決定し、それにより差値dIを取得するステップとを更に含む。より好ましい実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、リガーゼ、及びリアーゼからなる群から選択される。別の代替的な実施形態では、上記方法は、酵素活性を開始させる試薬を準備するステップと;ポリヌクレオチド複合体を含む貯留に試薬を導入するステップと;適温で貯留をインキュベートするステップとを更に含む。より好ましい実施形態では、試薬は、活性化因子及び補助因子からなる群から選択される。更により好ましい実施形態では、活性化因子は、補助因子を導入する前に貯留に導入される。更にまた好ましい実施形態では、活性化因子は、ATP、NAD+、NADP+、ジアシルグリセロール、ホスファチジルセリン、エイコサノイド、レチノイン酸、カルシフェロール、アスコルビン酸、神経ペプチド、エンケファリン、エンドルフィン、4−アミノ酪酸(GABA)、5−ヒドロキシトリプタミン(5−HT)、カテコールアミン、アセチルCoA、及びS‐アデノシルメチオニンからなる群から選択される。別の更により好ましい実施形態では、補助因子は、Mg2+、Mn2+、Ca2+、ATP、NAD+、及びNADP+からなる群から選択される。別のより好ましい実施形態では、ポリマーは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、リン脂質、ポリサッカライド、及びポリケチドからなる群から選択される。1つの実施形態では、酵素は、ポリマーと同じ貯留に導入される。代替的な実施形態では、酵素は、反対側の貯留に導入される。
別の実施形態では、本発明は、部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する酵素の結合を制御するための方法であって、2つの別々の隣接した媒質の貯留と、一方の貯留から他方の貯留に一度に1つのポリヌクレオチドのみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する2つの貯留間の界面とを準備すること;部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する結合活性を有する酵素を準備すること;第1のポリヌクレオチド及び第2のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド複合体であり、ポリヌクレオチド複合体の一部は二本鎖であり、第1のポリヌクレオチドは、第2のポリヌクレオチドと適合しない部分を更に含むポリヌクレオチド複合体を準備すること;2つの貯留の1つにポリヌクレオチド複合体を導入すること;2つの貯留の1つに酵素を導入すること;2つの貯留間に電位差を印加し、それにより第1の極性を生成させること;最初に電位差を反転させて第2の極性を生成させること;2度目に電位差を反転させて第1の極性を生成し、それにより部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する酵素の結合を制御することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、媒質は導電性である。より好ましい実施形態では、媒質は水溶液である。好ましい実施形態では、上記部分は、ペプチド核酸、2’−O−メチル基、蛍光化合物、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、上記方法は、2つの貯留間の電流を測定するステップ;第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、第1の極性が2度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む。別の好ましい実施形態では、上記方法は、2つの貯留間の電流を測定するステップ;第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む。より好ましい実施形態では、酵素は、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、DNAリガーゼ、DNase、ウラシルDNAグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、及びアセチラーゼからなる群から選択される。別の代替的な実施形態では、上記方法は、酵素活性を開始させる少なくとも1つの試薬を準備するステップと;ポリヌクレオチド複合体を含む貯留に試薬を導入するステップと;適温で貯留をインキュベートするステップとを更に含む。より好ましい実施形態では、試薬は、デオキシリボヌクレオチド及び補助因子からなる群から選択される。更により好ましい実施形態では、デオキシリボヌクレオチドは、補助因子を導入する前に貯留に導入される。別の更により好ましい実施形態では、補助因子は、Mg2+、Mn2+、Ca2+、ATP、NAD+、及びNADP+からなる群から選択される。1つの実施形態では、酵素は、ポリヌクレオチドと同じ貯留に導入される。代替的な実施形態では、酵素は、反対側の貯留に導入される。
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドに対する酵素の結合を制御するための方法であって、2つの別々の隣接した媒質の貯留と、一方の貯留から他方の貯留に一度に1つのポリペプチドのみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する2つの貯留間の界面とを準備すること;ポリペプチドに対する結合活性を有する酵素を準備すること;修飾可能なアミノ酸残基を含むポリペプチドを準備すること;2つの貯留の1つにポリペプチドを導入すること;2つの貯留の1つに酵素を導入すること;2つの貯留間に電位差を印加し、それにより第1の極性を生成させること;最初に電位差を反転させ、第2の極性を生成させること;2度目に電位差を反転させて第1の極性を生成し、それによりポリペプチドに対する酵素の結合を制御することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、媒質は導電性である。より好ましい実施形態では、媒質は水溶液である。好ましい実施形態では、上記部分は、ペプチド核酸、2’−O−メチル基、蛍光化合物、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、上記方法は、2つの貯留間の電流を測定するステップ;第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、第1の極性が2度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む。別の好ましい実施形態では、上記方法は、2つの貯留間の電流を測定するステップ;第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む。より好ましい実施形態では、酵素は、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、DNAリガーゼ、DNase、ウラシルDNAグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、及びアセチラーゼからなる群から選択される。別の代替的な実施形態では、上記方法は、酵素活性を開始させる少なくとも1つの試薬を準備するステップと;ポリヌクレオチド複合体を含む貯留に試薬を導入するステップと;適温で貯留をインキュベートするステップとを更に含む。より好ましい実施形態では、試薬は、活性化因子及び補助因子からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、活性化因子は、ATP、NAD+、NADP+、ジアシルグリセロール、ホスファチジルセリン、アセチルCoA、及びS−アデノシルメチオニンからなる群から選択される。更により好ましい実施形態では、活性化因子は、補助因子を導入する前に貯留に導入される。別の更により好ましい実施形態では、補助因子は、Mg2+、Mn2+、Ca2+、ATP、NAD+、及びNADP+からなる群から選択される。1つの実施形態では、酵素は、ポリペプチドと同じ貯留に導入される。代替的な実施形態では、酵素は、反対側の貯留に導入される。
a)マイクロフルイディクス。酵素活性を誘導する因子は、酵素−ポリヌクレオチド複合体が細孔により捕捉された後でのみ添加することができる。そのポリヌクレオチドが処理された後で槽を洗い流すことができ、添加されたポリヌクレオチド標的の新しい集団は、誘導因子を欠如する。その後、このサイクルが繰り返される。
b)タンパク質工学。酵素を細孔に共有結合で結合するによって、システムに酵素を1つのみ有することが可能であり得るし、酵素は細孔に直接隣接するであろう(これを達成するための幾つかの方法は、米国出願第10/739,585号明細書に明示されている)。
c)複合体をナノポアに捕捉することによってのみ遊離される作用剤を使用して、バルク相の酵素活性を阻止する。これは、図面中(図1及び2)の例によって例示され、本明細書中で記述されている。
d)トランス側からシス側(酵素を含有する)へと、細孔を通して補助因子を送達する。これにより、細孔に直接隣接している容積に対し、必要とされる因子を有効に制限することができる。一例は、Mg2+である。これは、図面中(図3)の例により例示され、本明細書中で記述されている。
e)ssDNAテンプレートを、トランス側から、酵素を含有するシス側へと細孔を通して送達する。これにより、テンプレートの酵素処理を、細孔に捕捉された分子に効果的に制限することができる。他の全てのテンプレート鎖は、チャネルを支える不透過層(例えば、二重層)により酵素から隔離される。
これは、単一DNA分子を配列決定するための技術である。この技術は、合成による従来の配列決定法(SBS)の特徴を、電子的及び生化学的フィードバック制御下での単一DNA分子の新規なナノポア分析と組み合せる。この技術は、3’ターミネーター技術、特に可逆的なターミネーター技術に依存する。
1)ヌクレオチド付加及び可逆的ターミネーター除去は、個々の標的鎖上で直接測定することができる。
2)このシステムは、ヌクレオチド付加及び脱保護ステップは、それらが成功するまで、迅速に繰り返すことができるように、電気的及び生化学的の両方で制御される。
3)非常に長いDNA分子を、無期限の間細孔に捕捉、操作、及び定量的に保持することができる。
4)使用される試薬の容積を非常に小さくすることができ(約100μlのオーダー)、所定の容積を何百回も再利用できる可能性がある。更に開発を続ければ、ナノポアオリフィスでの脱保護ステップの活性化及び不活性化を制御することが可能であり得る。これは、灌流の必要性を完全に排除するだろう。
(1)ナノポアデバイスは、DNA配列決定に重要な応用を有するエキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼ等の酵素のターンオーバーをモニターするために使用することができる。
図6Aは、細孔開口部に隣接して結合した化合物(3)を有する基材又は構造物(2)中に細孔開口部(1)を含むナノポアデバイスを例示し、基材又は構造物はシス側及びトランス側を定義する。図6Aは、分子又は巨大分子(4)がポリマー(5)と結合して巨大分子/ポリマー複合体を生成し、ポリマーは、不完全に合成された部分(6)を更に含むことを更に示す。
図7Aは、細孔開口部に隣接して結合した化合物(3)を有する基材又は構造物(2)中に細孔開口部(1)を含むナノポアデバイスを例示し、基材又は構造物はシス側及びトランス側を定義する。図7Aは、分子又は巨大分子(4)がポリマー(5)と結合して巨大分子/ポリマー複合体を生成し、巨大分子は、リガンド(10)に対する高親和性結合部位(9)を更に含むことを更に示す。
図8Aは、細孔開口部に隣接して結合した化合物(3)を有する基材又は構造物(2)中に細孔開口部(1)を含むナノポアデバイスを例示し、基材又は構造物はシス側及びトランス側を定義する。図8Aは、分子又は巨大分子(4)が第一のポリマー(5)と結合して、巨大分子/ポリマー複合体を生成することを更に示す。
単一チャネル薄膜デバイス及びそれを使用するための方法が提供される。対象デバイスは、混合信号半導体ウェーハと、少なくとも1つの電気化学的層であり、電気化学的層が二酸化ケイ素等のような半導体材料を含み、半導体材料が、炭化水素等の表面改質剤を更に含み、電気化学的層が複数のオリフィスを定義し、オリフィスがチャンバー及び頚部を含み、オリフィスのチャンバーが混合信号半導体ウェーハの第1の金属組成物と共局在し、オリフィスの一部が第2の金属、例えば銀で塞がれており、第2の金属が第1の金属と電気的に連通しており、オリフィスがリン脂質二重層等の薄膜を更に含み、薄膜がオリフィスの頚部で溶媒不透過性の密閉を形成し、薄膜が細孔を更に含み、オリフィスが水相及びガス相を取り囲む電気化学的層とを含む。好ましい実施形態では、金属被膜層は、それらに限定されないが、ニッケル、金、銅、及びアルミニウム等の金属又は金属合金を含む。
ナノポア開口部の時間依存的な輸送特性は、任意の好適な技術により測定することができる。輸送特性は、ポリヌクレオチドを輸送するために使用される媒質、液体中の溶質(例えばイオン)、ポリヌクレオチド(例えば、モノマーの化学構造)、又はポリヌクレオチド上の標識の関数であり得る。典型的な輸送特性には、電流、コンダクタンス、抵抗、キャパシタンス、電荷、濃度、光学特性(例えば、螢光及びラマン散乱)、及び化学構造が含まれる。望ましくは、輸送特性は電流である。
1.mRNA、rRNA、及びtRNAによって示されるような相対的又は絶対的な遺伝子発現レベルのアッセイ。これには、天然、変異、及び病原性核酸並びにポリヌクレオチドが含まれる。
2.対立遺伝子発現のアッセイ。
3.染色体内の多SNPのハプロタイプアッセイ及びフェージング。
4.DNAメチル化状態のアッセイ。
5.mRNA選択的スプライシング及びスプライス変異体レベルのアッセイ。
6.RNA輸送のアッセイ。
7.mRNA、rRNA、及びDNAのタンパク質核酸複合体のアッセイ。
8.DNA、rRNA、又はmRNAによる、食物及び環境試料中の微生物又はウイルス内容物の存在アッセイ。
9.DNA、rRNA、又はmRNAによる、食物及び環境試料中の微生物又はウイルス内容物の同定。
10.植物、ヒト、微生物、及び動物のDNA、rRNA、又はmRNAによる病理の同定。
11.医学的診断における核酸のアッセイ。
12.定量的核流出アッセイ。
13.免疫応答に見出される遺伝子再編成を含むがそれに限定されない、DNA及びRNAレベルにおける遺伝子再編成のアッセイ。
14.微生物、ウイルス、及びミトコンドリアにおける遺伝子移入のアッセイ。
15.遺伝的進化のアッセイ。
16.法医学的アッセイ。
DNA単独、並びにDNA、DNAポリメラーゼのクレノー断片(KF)、及び相補的dNTPを用いた定電圧実験は、最終ステップ、即ちDNAからのKF/dNTPの解離を検出するために使用される閾値を決定するために使用できる。イオン電流振幅のフィルタリングされた導関数は、フィルタリングされた振幅(filtered amplitude)に加えて、最終ステップを検出するために使用できる。実際上、フィルタリングされた振幅は、本明細書中に開示されたように閾値化され、フィルタリングされた導関数は、設定閾値を越えた偏向(deflection)についてモニターされる。指数加重平均フィルタ(exponentially weighted mean filter)を使用した予備分析では、フィルタリングされた振幅に適用されたフィルタリングされた導関数が、最終ステップの存在下で1オーダー分だけ偏向することが示された。フィルタリングされた振幅及びフィルタリングされた導関数の両方を使用した実験が実施され、KF解離の頑健な検出を保証するために導関数フィルタ及び偏向閾値を調整した。
(I)DNA−DNA:Tm(℃)=81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)−0.62(%ホルムアミド)−500/L
(II)DNA−RNA:Tm(℃)=79.8+18.5(log[Na+])+0.58(%G+C)+0.12(%G+C)2−0.5(%ホルムアミド)−820/L
(III)RNA−RNA:Tm(℃)=79.8+18.5(log[Na+])+0.58(%G+C)+0.12(%G+C)2−0.35(%ホルムアミド)−820/L
式中、Lは形成された二本鎖の長さであり、[Na+]は、ハイブリダイゼーション又は洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、%G+Cは、ハイブリッドにおける(グアニン+シトシン)塩基のパーセントである。不完全に一致したハイブリッドの場合、融解温度を下げるためには、各1%のミスマッチにつき、およそ1℃が必要とされる。
65℃での6XSSC;
42℃での50%ホルムアミド、4XSSC;又は
65℃での0.5XSSC、0.1%SDSで;
例えば各10〜30分の洗浄ステップを2回行う。これらの条件についての有用な変異は、当業者であれば容易に明白であろう。
配列決定
1つの実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドの配列分析を実施するために使用できる。上記分析は、単一の分析が単一の部位で実施できるという点で、従来技術及び現行技術より優れており、それにより試薬、基質、及びリポーター分子等の相当なコスト削減に帰着する。追加的な重要性は、配列決定反応及び信号生成の迅速性であり、それにより従来技術の向上に帰着する。
本発明の配列は、当技術分野で公知の種々のPCRに基づく方法を使用して伸長できる。例えば、XL−PCRキット(PE Biosystems社)、ネステッドプライマー、市販のcDNA又はゲノムDNAライブラリーを使用して、ポリヌクレオチド配列を伸長できる。PCRに基づく方法の場合は全て、プライマーは、OLIGO4.06プライマー分析ソフトウェア(National Biosciences社、プリマス、米国ミネソタ州)等の市販のソフトウェアを使用して、長さが約22から30個のヌクレオチドであり、約50%以上のGC含量を有し、約55℃から約68℃までの温度で標的分子にアニーリングするように設計できる。配列を伸長して調節エレメントを回収する場合は、cDNAライブラリーではなくゲノムを使用するのが好ましい。
ハイブリダイゼーション
ポリヌクレオチド及びその断片は、種々の目的のために、ハイブリダイゼーション技術に使用することができる。プローブは、5’調節領域等の固有の領域から、又は受容体シグネチャー(receptor signature)等の保存されたモチーフから設計又は誘導することができ、ポリヌクレオチドタンパク質、対立遺伝子変異体、又は関連分子をコードする天然分子を同定するための手順に使用できる。プローブはDNA又はRNAであってよく、通常は一本鎖であり、ポリヌクレオチド配列のいずれかに対して少なくとも50%の配列同一性を有すべきである。ハイブリダイゼーションプローブは、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、又は標識ヌクレオチドの存在下でのPCR増幅を使用して産生することができる。ポリヌクレオチド又はその断片を含有するベクターは、RNAポリメラーゼ及び標識ヌクレオチドの添加により、mRNAプローブをin vitroで産生するために使用できる。これらの手順は、Amersham Pharmacia Biotech社により提供されるキット等の市販キットを使用して実施できる。
多種多様な標識及び抱合技術が、当業者に公知であり、種々の核酸、アミノ酸、及び抗体アッセイに使用できる。標識分子の合成は、32P−dCTP、Cy3−dCTP、又はCy5−dCTP等の標識ヌクレオチド、又は35S−メチオニン等のアミノ酸の組み込み用のPromega社製(マディソン 米国ウィスコンシン州)又はAmersham Pharmacia Biotech社製のキットを使用して達成できる。ヌクレオチド及びアミノ酸は、BIODIPY又はFITC(Molecular Probes社、ユージーン 米国オレゴン州)等の試薬を使用して、蛍光物質、化学発光物質、又は発色性物質等を含む多様な物質を用いて、アミン、チオール、及び分子に存在する他の基に化学的に抱合させることにより直接標識できる。
この節では、クレノー断片(KF)ポリメラーゼの基本的機序、及びそのDNAテンプレートからのKFの解離が、細孔電流振幅及び事象滞留時間をモニターすることで、どのように検出できるのかについて説明する。更に、KFにより付加される次の塩基の同一性は、長滞留時間事象(例えば、>20ミリ秒等であるが、それに制限されない)の存在を介して判別することができる。その後、長滞留時間事象は、有限状態機械(FSM)を使用し、動的な電圧制御を使用して、検出及び反応させることができる。
ポリヌクレオチド、断片、オリゴヌクレオチド、相補的RNA及びDNA分子、並びにPNAは、遺伝子発現の変化、mRNA発現の非存在/存在対過剰を検出及び定量するために、又は治療介入中のmRNAレベルをモニターするために使用することができる。発現の変化に関連した健康状態、疾患、又は障害には、特発性肺動脈高血圧症、二次性肺高血圧、細胞増殖障害、特に退形成希突起神経膠腫、星状細胞腫、乏突起星状細胞腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経節腫、ニューロン新生物、多発性硬化症、ハンチントン病、乳腺癌、前立腺腺癌、胃腺癌、転移性神経内分泌癌、非増殖性線維嚢胞性乳腺疾患及び増殖性線維嚢胞性乳腺疾患、胆嚢の胆嚢炎及び胆石症、変形性関節症、並びに関節リウマチ;後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック‐東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、変形性関節症、骨粗しょう症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合免疫不全症(SCID)、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、血液透析、体外循環、ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性、原生動物性、及び蠕虫性感染;プロラクチン産生疾患、卵管疾患、排卵異常、及び子宮内膜症を含む不妊症、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜又は卵巣腫瘍、子宮類線維症、自己免疫障害、子宮外妊娠、及び奇形発生;乳癌、線維嚢胞性乳腺疾患、及び乳汁漏出症;精子形成障害、異常な精子生理、良性前立腺肥大症、前立腺炎、ペロニー病、インポテンス、女性化乳房症;光線性角化症、動脈硬化症、滑液嚢炎、肝硬変、肝炎、混合性結合組織疾患(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間血色素尿症、真性赤血球増加症、原発性血小板血症、癌合併症、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、及び特に副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。
ポリヌクレオチド又はその断片は、試料からリガンドを精製するために使用できる。ポリヌクレオチド又はその断片を使用してリガンドを精製する方法は、特異的結合を可能にする条件下でポリヌクレオチド又はその断片を試料と混合すること、特異的結合を検出すること、結合したタンパク質を回収すること、及び適切な作用剤を使用して、精製されたリガンドからポリヌクレオチドを分離することを伴うであろう。
1.細孔又は細孔開口部
2.基材又は構造物
3.化合物
4.巨大分子
5.第1のポリマー
6.不完全に合成されたポリマーの一部
7.モノマー
8.実質的に完全に合成されたポリマー
9.高親和性結合部位
10.リガンド
11.産生物
12.第2のポリマー
13.第3のモノマー
14.細孔分子又はチャネル分子
15.混合信号ウェーハ
16.電気化学的層
17.オリフィス
18.金属被膜組成物
19.金属
20.薄膜又は脂質二重層
21.閉じ込められたガス(例えば窒素)
22.脂質単層
23.液体又は水溶液(第1)
24.チャンバー又はウェル
25.液体又は水溶液(第2)
26.金電極(自由選択的)
DNA又はRNAに結合又は修飾する酵素(エキソヌクレアーゼ、キナーゼ、及び他のポリメラーゼ)と、ナノポアに捕捉されたDNA又はRNAとの相互作用を探究する目的について、本発明者らは、本明細書中で開示されている本発明が、以下の技術的な影響を有するであろうと考える:
*データスループットの相当な増加。係留構成では、負電圧がフィッシングモードで使用され、正電圧はプローブモードに使用される。プローブモードでは、イオン電流に含有されている全ての情報は、任意の所望のプローブ電圧で、ポリマー単独又はポリマー−酵素相互作用の特徴付けに使用できる。非係留構成では、独立事象(捕捉、ナノポアの封鎖、及び最終的なポリマーの移動を含む)は、ポリマー単独又はポリマー−酵素相互作用の分析に関する情報を含有する。十分な電圧が各分子の捕捉に必要であり、事象間の時間は制御可能ではなく、より低い捕捉電圧は事象間の時間を増加させる。したがって、係留構成は、同じ期間中に分析可能な事象の数を増加させることにより、及びプローブ電圧の範囲を増加させることにより、分析可能なデータのスループットを増加させる。
*分析不能なデータの低減。プローブモードでは、イオン電流は、係留ポリマー単独又は係留ポリマーに結合した酵素の相互作用に関する情報を含有する。非係留構成では、実験で記録された事象の50%までは、対象の動力学と無関係である場合がある。例えば、DNAヘアピンのds末端がプローブのシス側と接触することにより引き起される短時間の封鎖は、非係留構成のデータには含まれるが、係留構成のデータには含まれないだろう。
*シスチャンバーにおける生物学的成分の付加をリアルタイムで検出するナノポアセンサーの感度の相当な増加。実験後の分析により、Mg2+補助因子及びKFの相補的dNTPの存在を検出するためのナノポアセンサーの感度が実証される。両方の場合、検出は、二元/三元事象のKF結合部分の滞留時間の増加に基づく。事象のKF結合部分の滞留時間をリアルタイムでモニターすることにより、係留構成は、Mg2+及び相補的dNTP構成要素のシスチャンバーへの添加をオンライン検出するための新しい能力を提供する。同じ能力は、他の酵素及びそれらの対応する事象感受性構成要素を用いても利用できる。KFを用いる本発明者らの今後の係留DNA実験では、リアルタイム検出能力は、フィッシング時間、dNTP濃度、Mg2+濃度、及びプローブ電圧の関数として探究されるだろう。
この方法に関する例示については、図1(a)から図1(g)を参照されたい。(a)このシナリオでは、阻止プライマーは、バルク相でプライマー/テンプレートに結合している。三元複合体の構造は、第1のヌクレオチドが組み込まれるであろう、標的DNAのdsDNAとssDNAセグメントとの間の結合部に対する酵素の結合を妨げる。(b)阻止されたプライマー/テンプレートを印加電圧(トランス側が正)下で捕捉すると、ssDNAが細孔に係留され、dsDNAが前庭上部に留められる。阻止プライマーの末端のループは、大きすぎて前庭に進入できない。電流はこの状態で複合体の捕捉を報告する。(c)印加電圧下で、ssDNAセグメントは、トランス側に向かって細孔を前進し、阻止プライマー及びテンプレート間の塩基対を徐々に解体する。各塩基対を個別に遊離させるエネルギーコストは少なく(約2.5kcal/mol)、したがって力を加えると遊離は急速に進行する。この解体過程の間、電流は、dsDNAセグメントが前庭に進入できないため(b)と同じである。(d)解体後、阻止プライマーは遊離する。阻止プライマーが存在しない場合、標的DNAのdsDNAセグメントは、細孔前庭に進入することができる。これは、阻止プライマーの遊離及び標的DNA活性化の信号を送る電流の測定可能な低減に帰着する。(e)電圧反転により、酵素結合用の活性化dsDNA/ssDNA接合部位が露出する。電圧を反転することにより、負に荷電しているDNAはシス区画へ押し返される。(f)阻止プライマーが存在しない場合、酵素は、標的位置(この例では、dsDNA/ssDNA接合部位)でDNAに結合することができる。(g)結合した酵素又はDNA修飾をプローブする。定義された長さの時間(典型的には、数百マイクロ秒から数秒)の後、その元の極性にもう一度電圧を反転させ、それによりDNAをナノポアに引き戻すことができる。電流測定値を使用して、酵素が結合したか(示されている)又はDNA二本鎖末端が修飾されたかどうか(示されていない)を決定することができる。結果が陰性の場合、ステップ(e)〜(g)を繰り返すことができる。
この方法に関する例示については、図2(a)から図2(g)を参照されたい。(a)このシナリオでは、阻止プライマーは、バルク相でプライマー/テンプレートに結合している。三元複合体の構造は、酵素が標的DNAに結合することを可能にするが、テンプレートに沿った触媒及びプロセシングを妨げる。(b)阻止されたプライマー/テンプレートが印加電圧(トランス側が正)下で捕捉すると、ssDNAが細孔に係留され、dsDNAが前庭上部に留められる。これは、阻止プライマーの末端のループが大きすぎて前庭に進入できないために起こる。電流はこの状態で複合体の捕捉を報告する。(c)印加電圧下で、ssDNAセグメントはトランス側に向かって細孔を前進し、阻止プライマー及びテンプレート間の塩基対を徐々に解体する。各塩基対を個別に遊離させるエネルギーコストは少なく(約2.5kcal/mol)、したがって力を加えると遊離は急速に進行する。解体過程中、電流は、dsDNAセグメントが前庭に進入できないため(b)と同じである。(d)解体後の阻止プライマーの遊離は複合体の活性化に帰着する。図1で開示されたシナリオと異なり、標的DNAのdsDNAセグメントは、結合した酵素が大きすぎて進入できないため、阻止物が解離しても細孔前庭に進入できない。したがって、平均電流は変化しない。(e)印加電圧の低減は、酵素が前進することを可能にする。分析に十分なイオン電流は残存する。(f)テンプレート鎖は完成に複製される。(g)複合体は解離し、ナノポアは、この時点で別のDNA標的を捕捉及び活性化するための準備が整っている(ステップaを参照)。
この方法に関する例示については、図3(a)から図3(c)を参照されたい。(a)この例のシナリオでは、シス区画は、Mg2+を除き、DNAポリメラーゼ活性に必要な成分を全て含有している。したがって、触媒作用は起こらない。(b)電圧が印加されると(トランス側+)、Mg2+は細孔を横切ってシス区画に推進される。(c)DNA−ポリメラーゼ複合体が細孔で捕捉される際には、細孔に直接隣接している容積中のMg2+濃度は十分に高く、Mg2+が酵素の触媒部位の2つの重要位置を占有するのを可能にする。その後、複製された鎖の重合が起こりえる。バルク相の三元複合体は、細孔から遠位のMg2+濃度が本質的にゼロであるため、DNA合成を触媒できない。このシナリオは、DNA合成に必要であり、制御された条件下でナノポアを透過できるほど十分に小さい他の物質に適用できる。
DNAポリメラーゼIのポリメラーゼ活性は、クレノー断片と呼ばれるより小さな構造物に大部分が含有されている。この応用では、クレノー断片は、定義された塩基配列のプライマーと相補的塩基対合を起こしたDNAの一方の鎖(テンプレート)に結合することが可能である。このタンパク質は細孔に引き込まれ、細孔を通るイオン電流はそれにより低減される。2つの異なる酵素機能をモニターすることができる。1)タンパク質が、プライマー−テンプレート複合体上のその結合部位から遊離すると、イオン電流の特徴的な一時的低減が引き起こされる。2)適切なdNTP基質が酵素に供給されると、酵素の細孔滞留時間の特徴的な延長が引き起こされる。不正なdNTP基質は、滞留時間を変化させない。
架橋剤により産生される共有結合等の適切な共有結合の形成により、細胞質エストラジオール受容体を、ポリアスパラギン酸の100merに共有結合で連結する。受容体を、その負イオン形態のポリアスパラギン酸に作用する電場により、3nm直径の窒化ケイ素細孔に位置決めする。細孔は、細孔上の金層に付着された二機能性硫化アルキルの単層を有する。位置決めの後、細孔のアルキル基と受容体のシステイン基とのジスルフィド結合の形成により、受容体を細孔に共有結合で結合させる。エストラジオールが存在する場合、それは受容体の高親和性部位に結合し、細孔を通るイオン電流を変化させ、それにより単一分子の感度でこのステロイドホルモンを検出する手段を提供する。
実施例2において概説された手順に従って、グルコースオキシダーゼ分子を、窒化ケイ素の細孔に結合させる。グルコースが存在する場合、グルコースが活性部位に結合、酸化、及び産生物を遊離するにつれて、酵素作用は、細孔を通るイオン電流に検出可能な一時的変化を作り出す。
リボソーム調製物を、大腸菌の細胞質ゾル抽出物等の、一般的に使用される翻訳系の存在下で特定のmRNAと接触させる。この系は、リボソーム機能を阻害するために0℃近くで維持する。或いは、リボソームは、伸長因子又はtRNA等の必要な補助因子の除外により不活性化してもよい。単一リボソームは、mRNAに結合すると、100mV以上の膜貫通電圧の作用により細孔を通してmRNAを引き込むことによって、細孔に位置決めされる。その後、タンパク質合成又は必要な補助因子の付加を開始させるために、混合物を25℃に急速に暖める。その後、タンパク質合成の個々のステップを、mRNAがリボソーム作用により細孔を通して引き込まれることにより作り出されるイオン電流と、翻訳ステップの進行に伴うリボゾームの周期的な立体構造変化とに対する複合効果によりモニターする。
七量体形態のアルファ溶血素チャネルを、リポソーム膜中に構築する。構築が完了した後、1つの末端に1つのストレプトアビジン分子を有するDNA100merを添加し、リポソーム膜を横切って内部が正になるように一時的な膜電位を作り出す。これを行う1つの方法は、溶血素チャネルを透過できる正イオンと、その大きさのため不透過性の負イオンとを有する塩を添加することである。膜電位により、ヘアピンの遊離末端が細孔に引き込まれる。ストレプトアビジン構造のため、DNAは細孔を通り抜けることができないが、その代り溶血素との複合体を形成する。その後、DNA鎖が結合した七量体を、公開されている手順により単離し、5nmの細孔を有する窒化ケイ素膜のシス側に添加する。100mV以上の電圧を印加し、電気泳動により、溶血素七量体の幹部から突き出ているDNA鎖を細孔に引き込む。その後、実施例に記述されているように、溶血素七量体を細孔に共有結合で結合する。その後、印加電圧の極性を反転することによりガイドDNA鎖を除去し、その後、溶血素−窒化ケイ素膜を、高解像度ナノポアとしてバイオセンサー応用に使用することができる。
生物学的ナノポア構成では、平面状の脂質二重層を、KCl溶液中で50〜100μmのテフロン開口部を横切って生成し、単一α溶血素タンパク質チャネルを平面状脂質に自己挿入させる。チャネル(細孔)は、長さが15nmであり、直径は様々である。細孔のシス開口は、幅が2.6nmであり、基部始まりで1.5nmの限界幅に狭くなる前に3.6nmの前庭へと開口している。トランス開口までの基部の残りは、幅が2nmである。前庭は十分に大きくて二本鎖DNA(dsDNA)が進入するが、限界基部は、一本鎖DNA(ssDNA)がちょうどの通り抜けるほどの広さである。AgCl電極を使用して、細孔を通るイオン電流を生成する電位を、二重層を横切って印加する(図12)。この電圧により生成された電場は、ssDNA又はRNAの負に荷電したリン酸骨格を細孔を通して引き込み、トランス側電圧が正である細孔のシス側からトランス側に通過させる。分子が移動すると共に、細孔は、移動する分子により部分的に封鎖され、電流の低下を引き起こす。これらの移動事象は、減衰した(遮断された)電流の振幅と、滞留時間として定義される、分子が細孔で費やす時間とにより特徴付けることができる。ナノポアシステム及び例示的なDNA移動事象の模式図を図13に示す。図13に示されているDNAは、二本鎖セグメントが20塩基対ヘアピン(20bphp)である一本鎖及び二本鎖セグメントを有する。DNAは、一本鎖の末端でナノポアに捕捉され、いったん電圧場力により前庭内でヘアピンが解体すると移動する。この構成は、本発明の一部に対して有用性を有する。手短かに言えば、二本鎖セグメントの有用性は、電圧がセグメントを一本鎖DNAへとせん断しDNAが移動するまで、二本鎖セグメントがDNAの滞留時間(移動を停止させることによる)を延長するということである。更に、より長い二本鎖セグメントは、所定の電圧においてより長い滞留時間を生み出す。対照的に、ssDNA又はRNAの場合、移動の速度は、捕捉レベルの電圧下では移動の際に停止せずに、2ヌクレオチド/μ秒にまで達する。
最近、本発明者らは、生物学的ナノポアを使用して、捕捉されたDNA分子と酵素との相互作用をプローブした。印加電圧下では、酵素結合DNAのssDNA末端はナノポアに捕捉され、ナノポアの上部に居留する酵素は大きすぎてナノポアを通って転位置できない。ssDNAに結合する大腸菌エキソヌクレアーゼI(ExoI)の動力学は、ナノポアに基づく力分光法の電圧勾配を使用して定量化した。具体的には、ssDNAの捕捉を検出すると、電圧が自動化されて、ssDNA−ExoI複合体を短時間保持し、その後Exolが解離し、ssDNAが細孔を通って転位置するまで電圧勾配を実施する。次いで、印加電圧勾配下の解離時間を、結合速度定数を推定するために使用する。
この手法では、電圧制御論理は、Lab VIEW 8ソフトウェア内で有限状態機械(FSM)を使用してプログラムし、FSM論理は、フィールドプログラマブルゲートアレイ(field−programmable gate array、FPGA)ハードウェアシステムに実装する。FSM/FPGA電圧制御の本発明者らの第1の実装は、特徴的な23pAの振幅及び少なくとも20ミリ秒の滞留時間に基づいた、個々の三元複合体の効果的な自動検出を実証した。21.2〜26.8pAの閾値範囲内に20ミリ秒間続いた全事象の場合、酵素の解離及びDNAのトランス側への転位置を待つのではなく(中央値100ミリ秒より長い滞留時間)、電圧を反転させて複合体をシスチャンバーに押し返す。この制御論理は、検出された三元複合体事象の滞留時間を、FSM/FPGA制御を用いない123ミリ秒(235ミリ秒の四分位範囲(IQR))の中央値滞留時間から、FSM/FPGA制御を用いた23ミリ秒(0.3ミリ秒のIQR)の中央値滞留時間に集中させる効果を有した。DNA及び二元事象の2%未満が20ミリ秒より長かったため、20ミリ秒の待機期間は、ほぼ全ての制御された事象が三元複合体であることを保証した。
パッチクランプ増幅器、Molecular Devices社製AxoPatch 200Bにより、印加電圧を調節し、チャネルを通るイオン電流を測定する。データは、Molecular Devices社製Digidata 1440Aデジタイザを使用して記録し、50kHzでサンプリングし、4極ベッセルフィルタ(four−pole Bessel filter)を用いて5kHzでローパスフィルタリングした。本発明者らの装置の1つでは、異なるパッチクランプ、A−M Systems社製モデル2400を使用する。
電圧制御論理は、Lab VIEW 8ソフトウェア内で有限状態機械(FSM)を使用してプログラムする。FSM論理は、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)ハードウェアシステム、National Instruments社製PCI−7831Rに実装する。FPGAは、迅速な測定及び電圧反応時間(1μsec出力サンプリング時間)を可能にする再編成可能なハードウェアプラットフォームである。FSMは、プログラム実行が一連の個々の状態に分割される論理構築体である。各状態はそれに関連するコマンドを有し、状態間の転移はシステム測定の関数である。細孔電流の測定は、入力として処理されFSMに渡される。必要に応じてFSM制御論理の変更を行なうが、FPGA上で実行するために設計を再コンパイル及び迂回させる必要はない。これは、システムが1マイクロ秒オーダーで事象に反応することが可能になる一方、必要に応じて実験間で制御論理を再構成することも可能になることによって、速度と柔軟性とのバランスを達成する。
本発明者らの制御論理は、DNA単独又はKF結合DNAに起因するイオン電流遮断(事象)の効率的な検出を必要とする。更に、この論理は、これら2つの事象タイプ間を効率的に区別できなければならない。180mVでは、DNA単独及びKF結合DNAの平均振幅は、それぞれ20pA及び23pAであり、差は3pAである。DNA単独とKF結合DNA事象をリアルタイムに区別するために、FPGA上の入力電流信号をフィルタリング及び閾値化する。
FPGAは、5.3μsec毎にイオン電流をサンプリングし、0.75ミリ秒の窓サイズを使用して窓平均振幅を計算する。平均が選択された閾値範囲に入域すると、FPGAは入力を検出し、平均をモニターし続け、0.2ミリ秒毎に閾値を再検査する。平均が連続4回の検査で閾値範囲内に留まると、FSM論理は、この遮断を、選択された閾値と一致することが知られている事象タイプとして判断する。
実験後の分析により、本発明者らの平均フィルタは、三元事象内の最終ステップを誤検出することが示された。具体的には、FSM/FPGAは、三元レベル振幅を検出し、検出最終ステップまで待機し、最終ステップを検出すると、電圧を反転させて未結合DNAをシスチャンバーに押し出すようにプログラムされていた。データを検討すると、三元事象における最終ステップの存在は、電圧反転がないと高いが(97%)、最終ステップが明らかに存在しなかった多数の事象で電圧反転が示された。
それぞれフィルタリングされていない電流信号及びフィルタリングされた電気信号であり、tはサンプリング数である。最終ステップ検出実験からのデータを、α=0.9を用いてオフラインでフィルタリングすることにより、誤検出に対する頑健性が平均フィルタより相当に向上することが示された。平均フィルタを用いた場合のように、閾値検査間で0.2ミリ秒待機して、連続4回の閾値検査を事象判断に使用するだろう。
膜を横切る電圧の振幅が変化する際に、容量性遷移現象を、測定されたイオン電流に重ね合わせる。電圧変化を伴うα溶血素ナノポア研究全てに存在する遷移現象(例えば、上記のBatesら(2003年)を参照)は、各事象の定義された扱いやすいセグメントについて測定された電流における幾つかの情報を、必然的に覆い隠す。本発明者らの発明では、遷移現象が意味するのは、電圧変化後に事象タイプを判断するように制御論理がプログラムされている場合、フィルタリングされた電流振幅は、遷移現象が十分に収束するまで、事象判断用に選択された閾値(複数可)には入域しないだろうということである。
本発明者らの初期係留DNA実験では、単一DNA20bphpを細孔に捕捉し、電圧制御下で細孔を前後に通り抜けさせて、KFをシスチャンバーのss−ds接合部位に繰り返して結合及び解離させた。この実験では、1μMの100merDNA、5mMのMgCl2、2μMのKF、及び200μMのdGTPが、細孔のシスウェルに存在した。したがって、各事象は、ナノポアに捕捉されたDNA単独又は三元複合体に起因する。
生物学的ナノポア構成では、平面状脂質二分子膜は、KCl溶液中で20μmのTELON開口部を横切って生成する。単一α溶血素タンパク質チャネルを平面状脂質に挿入する。チャネル(細孔)は、長さが15nmであり、直径は様々である。細孔のシス開口は、幅が2.6nmであり、幹部の始まりで1.5nmの限界幅に狭くなる前に3.6nmの前庭へと開口している。トランス開口までの基部の残りは、幅が2nmである。前庭は十分に大きく、二本鎖DNA(dsDNA)は進入するが、限界基部は、ssDNAがちょうどの通り抜けるほどの幅である。AgCl電極を使用して、細孔を通るイオン電流を生成する電位を、二重層を横切って印加する(図12)。この電圧により生成された電場は、ssDNA又はRNAの負に荷電したリン酸骨格を細孔を通して引き込み、トランス側電圧が正である細孔のシス側からトランス側に通過させる。分子が移動すると共に、細孔は、移動する分子により部分的に封鎖され、電流の瞬間的低下を引き起こす。これらの移動事象は、封鎖電流の振幅と、滞留時間として定義される、分子が細孔で費やす時間とにより特徴付けることができる。ここで提示された実験で使用されたDNAは、ssDNA及びdsDNAセグメントで構成される。具体的には、本明細書中で開示された非FPGA実験の場合、合計の長さが67ヌクレオチドの14塩基対ヘアピン(14bphp)を使用した。残りの実験では、20bphpを有する合計の長さが79ヌクレオチドであるDNAオリゴマーを使用した。ヘアピンは、それ自体に3’末端を折り重ねることにより形成され、14又は20塩基対を生成した。したがって、ヘアピンは、14及び20bphpの両方の場合、一本鎖セグメントが35ヌクレオチドの長さである二本鎖セグメントである(4個の不対塩基が二本鎖末端ループにある)。ssDNA末端が捕捉されると、ヘアピンは細孔前庭に進入し、ヘアピンが解体するまで留まる。ナノポアシステムの模式図及び例示的な20bphp移動事象を、図13に例示する。
ナノポアシステムは、0.3mMKCl溶液における構成である。パッチクランプ増幅器、Molecular Devices社製AxoPatch 200Bが印加電圧を調節し、チャネルを通るイオン電流を測定する。データは、Molecular Devices社製Digidata 1440Aデジタイザを使用して記録し、50kHzでサンプリングし、4極ベッセルフィルタを用いて5kHzでローパスフィルタリングした。
封鎖電流及び滞留時間により定量化される封鎖事象は、FSM/FPGAを使用してリアルタイムに検出及びモニターできる。FPGAの入力電流信号に適用される平均フィルタは、ピーク間雑音の大部分を除去する。具体的には、FPGAは、5.3μsec毎にイオン電流をサンプリングし、窓平均振幅を計算する。FPGAは、平均が事前指定範囲内にあれば、最初の検出後0.2ミリ秒毎に平均を検査し続ける。4回の連続検査で平均がこの範囲内に入域及び留まる場合、FSM論理は、封鎖をDNAヘアピン事象と判断する。DNA移動事象とDNA移動事象判断との間の時間遅延は、通常1.35ミリ秒;最初に17.2から22.8pAの範囲に入域する窓平均に0.75ミリ秒、及び更なる3回の確認検査に0.6ミリ秒、及び計算遅延に0.65ミリ秒である。フィルタリングされた電流の平均は、DNA事象判断に使用され、FSM制御論理の状態間の遷移を開始する。
DNAと大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノー断片(KF)との相互作用は、ナノポアシステムでプローブすることができる。KFの非存在下で、一定180mVにおける20bphpの捕捉及びその後の解体により、20pAの平均振幅及び4ミリ秒の滞留時間中央値での電流封鎖が明らかにされる。KFと、KF触媒部位のDNAテンプレート塩基に相補的なdNTPとの添加は、三元(DNA/KF/dGTP)複合体に起因する、封鎖滞留時間の相当な増加を生み出した(dGTPの場合、110ミリ秒中央値の存続時間)。そのような封鎖をより綿密に調査すると、97%を越える封鎖で2ステップパターンが明らかにされ、第1のステップは24pAの平均振幅であり、第2の(最終)ステップは20pAの平均振幅であり、ヘアピン動力学のみと一致して4ms続く。ステップ1からステップ2への転移は、まずKFがDNAから解離することに帰着し、その後ヘアピンは解体が起こるまで細孔前庭に入り込むことが実証された。酵素結合DNAの電圧制御における初期努力として、個々の三元複合体の効率的自動検出(<3ミリ秒)を、特徴的な24pA振幅と、20ミリ秒後の電圧反転による封鎖時間の切捨てとに基づいて実証した。正しいdNTPの存在下では事象の60%が20ミリ秒より長く、正しいdNTPを欠く検出範囲では、事象の2%だけが20ミリ秒より長いので、20ミリ秒のカットオフを使用し、20ミリ秒より長い事象は、通常三元複合体事象に対応することを示した(図14)。検出は、信号の1.5ミリ秒前と17.2から22.8pAの検出範囲とを使用して窓平均を計算するための、節1.2.2に記述されている機序に基づいていた。この範囲を選ぶ根拠は、約20pAが、180mVでの14及び20bphp事象、並びに最終ステップの振幅中央値であるということである(図19)。
迅速な検出(<2ミリ秒)は、イオン電流の最後の0.75ミリ秒に基づいて、フィルタリングされた平均振幅をリアルタイムで計算することと、DNAヘアピン封鎖と一致する振幅範囲(20±2.8pA)と比べて平均値をモニターすることに基づく。検出に際して、電圧制御の2つの方法を実証した。
ナノポア中の単一DNA分子の直接FSM/FPGA制御の実証をこれから記述する。最初の実験では、目的は、DNAヘアピン事象を一度に1分子ずつ効率的に検出し、検出の際に180mVから150mVに印加電圧を低下させることにより、封鎖滞留時間を増加させることであった。これを「滞留時間延長制御」と呼ぶ。この目的を達成した後、延長された封鎖滞留時間の凝集を、150mVで10ミリ秒後に電圧を−50mVに反転させることを使用してDNAを押し出すことにより求めた。これを「滞留時間凝集制御」と呼ぶ。動機は、名目上のヘアピン滞留時間を増加させるがヘアピンを解体する前に、分子を押し出すことだった。延長された滞留時間事象の分布とは対照的な、凝集された滞留時間事象のより狭い分布は、目的が満たされたことを示すだろう。
フィルタリングされた電流の平均を使用してDNAヘアピン事象を判断する際には、ヘアピンが解体し、DNAが細孔を通って移動するまで、コマンド電圧を150mVに低減させる。捕捉に180mVを使用すると、150mVより多くの事象に帰着し、150mVに低減すると、ヘアピンの寿命が延長される。また、滞留時間延長は、機械学習法による配列決定に有用である。延長された時間は、平均が各状態に対応する振幅閾値内に留まらなければならない時間を増加させることにより、DNA又はDNA酵素構成(状態)を正確に検出する可能性を増加させるために使用することができる。各転位置の後、FPGAは電圧を180mVに再設定する。代表的な事象を図21bIに示す。事象プロット(図21bII)パターンは、約1.4ミリ秒の名目上の判断時間より迅速な事象が延長制御により影響を受けず、より長い滞留時間を有する事象は、予想通り約15pAの平均振幅に集中することを示す。凹形の傾向は、各事象の平均振幅計算とも一致している。特に、21pAで1.4ミリ秒の事象と15pAでχミリ秒の事象の場合、
であり、χが約24ミリ秒の場合、図21bIで示されているように、
サブセット範囲13から18pA内の事象の割合は41%に増加し、確率(黒塗りバー)ヒストグラムに重ねられた白抜きバーヒストグラムに示されている(図21bIII)。
目的は、ヘアピン事象の判断時に10ミリ秒の間150mVを印加し、その後5ミリ秒の間−50mVに電圧反転することにより、延長された事象の滞留時間を凝集することだった。5ミリ秒の反転時間は、チャネルからDNAを十分に取り除き、次の事象のための細孔を準備するのに十分であることが知られている。凝集制御は、個々の分子事象の制御に加えて、事象の分布を制御する尺度を意味するであろう。代表的な事象を図21cIに示す。上記のように、事象プロット(図21cII)パターンは、約1.4ミリ秒の名目上の判断時間より迅速な事象が、凝集制御により影響されないことを示す。上記の等式を使用すると、21pAで1.4ミリ秒の事象及び15pAで10ミリ秒の事象の場合、近似的な事象平均振幅は
13から18pAのサブセット範囲内では、中央値は、0.7pAのIQRを有する16pAであり、まさに近似的平均計算の通りである。サブセット範囲13から18pA内の事象の割合は55%に増加し、黒塗りバー確率ヒストグラムに重ねられた白抜きバーヒストグラムに示されている(図21cIII)。事象のサブセットの場合、12.4ミリ秒の滞留時間中央値は、ヘアピン状態を判断するために必要な短時間の遅延と10ミリ秒の延長時間との合計に相応している。白抜きバーサブセットヒストグラムのIQRが0.1であることは、凝集目的が達成されたことを示す。事象分布の制御の影響に関して、図21cIIの全事象の43%は、12〜13ミリ秒の滞留時間範囲内及び13〜18pAの振幅範囲内に入る。
予備実験は、KFを20塩基対DNAヘアピン(20bphp)に結合させて実行した。単一20bphpは、KFがDNAと複数回結合するように、細孔を前後に通り抜ける。この実験では、1μMの100mer ssDNA、5mMのMgCl2、2μMのKF、及び200μMのdGTPが、細孔のシスウェルに存在していた。ssDNAオリゴマーは、20merのヘアピンが3’末端で形成するように設計した。トランス側には、シス側のDNAヘアピンの5’末端の配列に相補的な20塩基対(20mer)プライマーが2μM存在した。
上記で提示されたデータでは、酵素の解離は、ナノポア電流信号を平均フィルタリングし、それが選択された振幅範囲内にあるかどうかを検査することにより検出する。この平滑化法は、多数の誤検出を生み出した。このフィルタリング体系の改良として、指数加重移動平均(EWMA)フィルタは、FPGAが使用した平均フィルタを置換することができる。EWMAフィルタは、電気工学的応用における信号平滑化に一般に使用されるアナログRCフィルタのデジタル実装である。このフィルタは、過去のサンプリングにより少ない有意性を課す移動平均を計算する。EWMAフィルタリングはまた、その再帰的実装によって単純移動平均より効率的に信号平滑化を実施する。しかしながら、ナノポア電流信号分析用のフィルタを調整するために、実験的試験を行う必要がまだあるだろう。
最終ステップの振幅及び継続期間と印加電圧との間に、より定量的な関連性を作ることができる。ここでの目標は、最終ステップの再現性を明らかにし、その構造が、異なる電圧でDNA単独とどのように一致するかを示すことである。最終ステップの詳細な特徴付けにより、最終ステップのより良好な制御が可能になる。定電圧実験は、4つの異なる電圧でDNA単独及びDNA/KF/dNTP三元複合体を用いて、飽和レベルの各基質(それぞれ1μM、2μM、及び200μM)を使用して実行する。電圧は、220、200、180、及び160mVである。高電圧で滞留時間を延長する他の係留実験で使用される20bphpではなく、24bphpを使用する。高電圧を最初に実行して、検出可能な最終ステップ事象継続期間(1ミリ秒)を生み出す印加電圧の実用的な上限を決定する。
上述のように、最終ステップを正確に検出及び反応することを示すことが必要である。先に述べたように、酵素結合事象の97%が最終ステップを示し、したがってこれが理論的な最大検出率である。最終ステップの検出及び反応は、検出時の電圧反転により示され、最終ステップ継続期間を凝集するだろう。上記で使用されたような高プローブ電圧は、結合及び未結合電流レベル間のより高い分解能を示す。飽和レベルの各基質を使用し、DNA単独及びDNA/KF/dNTP三元複合体を用いて実験を実行する。偽陽性に対する頑健性は、オフラインで正確な検出を確認することにより示すことができる。
上記で達成されたものの反復を実施するが、係留DNAを用いてである。フィッシング時間の滴定を実施して、非係留DNA実験における比率に匹敵する、三元複合体事象に対するDNA単独事象の比率を再現する。この情報は、フィッシング時間の限度設定を支援し、シスウェル内容物の代表的サンプリングを維持する。飽和レベルの各基質を使用し、DNA単独及びDNA/KF/dNTP三元複合体を用いて実験を実行する。
KF及びdGTPの滴定を実施する。長期事象の割合を、KF及びdGTP濃度の関数として記録する。上記と同じ高捕捉電圧で実験を実行する。Benner et al(2007)Sequence specific detection of DNA polymerase binding using a nanopore−based state machine.Nature Methodsに投稿中の追録と同じKF及びdGTPの濃度間隔:(KF=[0、0.25、0.5、1.0、2.0、2.0、2.0、2.0、2.0、2.0、2.0、2.0]μM;dGTP=[0、0、0、0、0、2.5、7.5、15、30、60、120、200]μM)を使用する。
FPGA/FSMナノポアシステムは、他の酵素研究にも使用することができる。DNA/酵素複合体の捕捉時に電圧勾配を印加すると、電圧力分光法を使用して結合エネルギー地形を計算するためのデータを生成することができる。また、DNAと細孔との相互作用は、印加電圧のフィードバック制御を使用して特徴付けることができる。酵素触媒作用の調節は、細孔を占めるDNAに張力を適用して、酵素の前進力を打ち消すことにより達成できる。
肺カテーテルによって患者から血液試料(2〜3ml)を収集し、使用まで−80℃のEDTA含有チューブで保存する。ゲノムDNAを、メーカーの説明書に従いDNA単離キット(PUREGENE、Gentra Systems社、ミネアポリス、米国ミネソタ州)を使用して、血液試料から抽出する。DNA純度は、Beckman社製分光光度計で測定した、260及び280nmにおける吸光度の比率(1cmの光路;A260/A280)として測定する。
患者のDNA試料に由来する遺伝子の領域を、その領域に特異的に設計したプライマーを使用して、PCRにより増幅する。PCR産物を、上記で開示されていたような方法を使用して配列決定する。配列トレースに同定されたSNPは、Phred/Phrap/Consedソフトウェアを使用して確認し、NCBI SNPデータバンクに寄託されている公知のSNPと比較する。
cDNAライブラリーを、哺乳動物組織から単離されたRNAを使用して構築する。冷凍組織は、イソチオシアン酸グアニジン溶液中で、POLYTRONホモジナイザー(Brinkmann Instruments社、ウェストベリー、米国ニュージャーシー州)を使用してホモジナイズし及び溶解する。溶解産物を、周囲温度で18時間25,000rpmで、L8−70M超遠心機(Beckman Coulter社、フラートン 米国カリフォルニア州)のSW28ローターを使用して、5.7MCsClクッション上で遠心分離する。RNAは、酸フェノール、pH4.7で抽出し、0.3M酢酸ナトリウム及び2.5容積のエタノールを使用して沈殿させ、無RNAse水に再懸濁し、37℃でDNAse処理し、RNA抽出及び沈殿を上記のように繰り返す。mRNAは、OLIGOTEXキット(Qiagen社、チャッツワース 米国カリフォルニア州)で単離し、cDNAライブラリーを構築するために使用する。
cDNAは、DNA ENGINEサーマルサイクラー(MJ Research社)と組み合せて、MICROLAB2200(Hamilton社、リーノー、米国ネバダ州)を使用して調製し、PRISM377型又は373型DNA配列決定システム(ABI社)を使用して、サンガー及びクールソン法(1975;J.Mol.Biol.94:441−448)により配列決定する。リーディングフレームは、標準的技術を使用して決定する。
cDNAは、cDNAクローン及びオリゴヌクレオチドプライマーを使用して伸長する。一方のプライマーは、公知の断片の5’伸長を開始するように、他方は、公知の断片の3’伸長を開始するように合成する。初期プライマーは、プライマー分析ソフトウェアを使用して、長さが約22から30個のヌクレオチドであり、約50%以上のGC含量を有し、約68℃から約72℃の温度で標的配列にアニーリングするように設計する。ヘアピン構造及びプライマー間の二量体化に帰着するであろう、あらゆる1つ続きのヌクレオチドを回避する。
ポリヌクレオチド組み立てに使用されるポリヌクレオチドの少なくとも1つは、オリゴヌクレオチドプライマーを使用したcDNAクローンの伸長により産生する。一方のプライマーは、公知の断片の5’伸長を開始するように、他方は、公知の断片の3’伸長を開始するように合成する。初期プライマーは、OLIGO4.06プライマー分析ソフトウェア(National Biosciences社)を使用して、長さが約22から30個のヌクレオチドであり、約50%のGC含量を有し、約55℃から約68℃の温度で標的配列にアニーリングするように設計する。ヘアピン構造及びプライマー間の二量体化に帰着するであろう、あらゆる断片を回避する。選択されたヒトcDNAライブラリーを、分子を伸長するために使用する。複数回の伸長が必要な場合、一式の追加的プライマー又はネステッドプライマーを設計する。
核酸を生物学的供給源から単離し、下記方法の1つにより、標準的ハイブリダイゼーション手順用の基材に添加する。標的核酸、ゲノムDNAの制限消化物の混合物を、1×TAE[トリス−アセテート−エチレンジアミン四酢酸(EDTA)]ランニング緩衝液中での0.7%アガロースゲルによる電気泳動により分画し、20×生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)を使用して毛細管移動によりナイロン膜に移動させる。或いは、標的核酸を個々にベクターへライゲーションし、ライブラリーを形成するために細菌宿主細胞に挿入する。下記方法の1つにより、標的核酸を基材上に配置する。第1の方法では、個々のクローンを含有する細菌細胞を、ロボット制御でピックし、ナイロン膜上に配置する。細菌増殖培地、カルベニシリンを含有するLB寒天上に膜を配置し、16時間37℃でインキュベートする。細菌コロニーを変性、中和、及びプロテイナーゼKで消化する。STRATALINKER紫外線架橋剤(Stratagene社)中で、ナイロン膜を紫外線照射に曝露させて、DNAを膜に架橋させる。
ポリヌクレオチドに相補的な分子、またはその断片を、遺伝子発現を検出、減少、又は阻害するために使用する。約15から約30個までの塩基対で構成されるオリゴヌクレオチドの使用を記述するが、同じ手順は、より大きい断片若しくはより小さな断片、又はそれらの誘導体(例えば、ペプチド核酸、PNA)で使用される。オリゴヌクレオチドは、OLIGO4.06プライマー分析ソフトウェア(National Biosciences社)及び配列番号1〜163を使用して設計する。転写因子のプロモーターへの結合を防止することにより転写を阻害するために、相補的オリゴヌクレオチドは、もっとも好ましくはオープンリーディングフレームの開始コドン前の約500から10ヌクレオチドで、最も固有な5’配列に結合するように設計する。翻訳を阻害するために、相補的オリゴヌクレオチドは、哺乳類タンパク質をコードするmRNAへのリボソームの結合を防止するように設計する。
ポリヌクレオチド及びその結合タンパク質の複合体を含む抱合体は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を使用して精製し、マウス又はウサギの免疫に使用する。抗体は、下記の手順を使用して産生する。ウサギを完全フロインドアジュバント中の複合体で免疫する。免疫は、その後ある間隔で不完全フロイントアジュバント中で繰り返す。マウスの場合は最低7週、又はウサギの場合は12週後に、抗血清を採取し、抗ペプチド活性を検査する。検査には、ペプチドをプラスチックに結合させること、1%ウシ血清アルブミンでブロッキングすること、ウサギ抗血清と反応させること、洗浄すること、及び放射性ヨウ素標識ヤギ抗ウサギIgGと反応させることを伴う。当技術分野で周知の方法を使用して、抗体価及び複合体形成量を決定する。
ポリヌクレオチド又はその断片を、32P−dCTP、Cy3−dCTP、若しくはCy5−dCTP(Amersham Pharmacia Biotech社)、又はBIODIPY若しくはFITC(Molecular Probes社、ユージーン 米国オレゴン州)でそれぞれ標識する。同様に、ポリヌクレオチド及びその結合タンパク質の複合体を含む抱合体は、放射性核種又は蛍光プローブで標識することができる。事前に基材上に配置された候補分子又は化合物のライブラリーを、標識ポリヌクレオチド又はタンパク質の存在下でインキュベートする。ポリヌクレオチド又はアミノ酸分子のいずれかの条件下でインキュベーションした後、基材を洗浄し、特異的結合又は複合体形成を示す、標識を保持する基材上の任意の位置をアッセイし、リガンドを同定する。異なる濃度のポリヌクレオチド又はタンパク質を使用して取得したデータを使用して、標識ポリヌクレオチド又はタンパク質と結合分子との親和性を計算する。
Claims (57)
- 部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する酵素の結合を制御するための方法であって:2つの別々の隣接した媒質の貯留、一方の貯留から他方の貯留に一度に1つのポリヌクレオチドのみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する前記2つの貯留間の界面を準備すること;部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する結合活性を有する酵素を準備すること;第1のポリヌクレオチド及び第2のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド複合体であり、前記ポリヌクレオチド複合体の一部は二本鎖であり、前記第1のポリヌクレオチドは、前記第2のポリヌクレオチドと適合しない部分を更に含むポリヌクレオチド複合体を準備すること;前記2つの貯留の1つに前記ポリヌクレオチド複合体を導入すること;前記貯留の1つに前記酵素を導入すること;前記2つの貯留間に電位差を印加し、それにより第1の極性を生成させること;最初に前記電位差を反転させて、それにより第2の極性を生成させること;2度目に前記電位差を反転させて前記第1の極性を生成し、それにより前記部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する前記酵素の結合を制御することを含む方法。
- 前記2つの貯留間の電流を測定するステップ;前記第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、前記第1の極性が2度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記2つの貯留間の電流を測定するステップ;前記第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後に取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記部分が、ペプチド核酸、2’−O−メチル基、蛍光化合物、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素が、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、DNAリガーゼ、DNase、ウラシルDNAグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、及びリボゾームからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 酵素活性を開始させる少なくとも1つの試薬を準備するステップと;前記ポリヌクレオチド複合体を含む前記貯留に前記試薬を導入するステップと;適温で前記貯留をインキュベートするステップとを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試薬が、デオキシリボヌクレオチド及び補助因子からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記デオキシリボヌクレオチドが、前記補助因子を導入する前に前記貯留に導入される、請求項7に記載の方法。
- 前記補助因子が、Mg2+、Mn2+、Ca2+、ATP、NAD+、NADP+、及びS−アデノシルメチオニンからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記媒質が導電性である、請求項1に記載の方法。
- 前記媒質が水溶液である、請求項10に記載の方法。
- 少なくとも2つの化合物の結合を検出するためのデバイスであって、混合信号半導体ウェーハ、少なくとも1つの電気化学的層であり、前記電気化学的層が半導体材料を含み、前記半導体材料が表面改質剤を更に含み、前記電気化学的層が複数のオリフィスを定義し、前記オリフィスがチャンバー及び頚部を含み、前記オリフィスの前記チャンバーが前記混合信号半導体ウェーハの金属被覆組成物と共局在し、前記オリフィスの一部が金属で塞がれており、前記金属が前記金属被覆組成物と電気的に連通しており、前記オリフィスが薄膜を更に含み、前記薄膜が前記オリフィスの前記頚部で溶媒不透過性の密閉を形成し、前記薄膜が細孔を更を含み、前記細孔が細孔開口部を更に含む電気化学的層を含むデバイス。
- 前記化合物が生体化合物である、請求項12に記載のデバイス。
- 前記生体化合物が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、リン脂質、ポリサッカライド、ポリケチド、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、リガーゼ、及びリアーゼからなる群から選択される、請求項13に記載のデバイス。
- 前記半導体材料が二酸化ケイ素である、請求項12に記載のデバイス。
- 前記表面改質剤が炭化水素である、請求項12に記載のデバイス。
- 前記金属被膜組成物が、ニッケル、金、銅、及びアルミニウムからなる群から選択される、請求項12に記載のデバイス。
- 前記金属が銀である、請求項12に記載のデバイス。
- 前記薄膜がリン脂質二重層である、請求項12に記載のデバイス。
- 前記オリフィスの大きさが約0.5から3μmである、請求項12に記載のデバイス。
- 前記オリフィスの大きさが約1から2μmである、請求項12に記載のデバイス。
- 前記オリフィスの大きさが約1.25から1.5μmである、請求項12に記載のデバイス。
- 前記細孔が生体分子である、請求項12に記載のデバイス。
- 前記生体分子が、イオンチャネル、ヌクレオシドチャネル、ペプチドチャネル、糖輸送体、シナプスチャネル、膜貫通受容体、及び核膜孔からなる群から選択される、請求項23に記載のデバイス。
- 前記生体分子がα溶血素である、請求項23に記載のデバイス。
- 前記細孔開口部の大きさが約0.5から8nmである、請求項12に記載のデバイス。
- 前記細孔開口部の大きさが約0.5から4nmである、請求項26に記載のデバイス。
- 前記細孔開口部の大きさが約1から2nmである、請求項27に記載のデバイス。
- 電圧フィードバック制御を使用してポリヌクレオチドに対する酵素の結合を制御するための方法であって:前記ポリヌクレオチドによる前記酵素の捕捉及び解離の繰り返しに帰着する方法であり、媒質を含む2つの別々の隣接したチャンバー、前記チャネルのシス側から前記チャネルのトランス側に一度に1つのポリヌクレオチド鎖のみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する前記2つのチャンバー間の界面を準備するステップ;ポリヌクレオチドに対する結合活性を有する酵素を準備するステップ;保護デオキシリボヌクレオチドを準備するステップ;ポリヌクレオチド結合性化合物を準備するステップ;ポリヌクレオチド複合体の一部が二本鎖であり一部が一本鎖である前記ポリヌクレオチド複合体を準備するステップ;前記ポリヌクレオチド複合体を前記2つのチャンバーの1つに導入するステップ;前記2つのチャンバー間に電位差を印加し、それにより第1の極性を生成し、前記第1の極性が前記ポリヌクレオチドの前記一本鎖部分を、前記チャネルを通して前記トランス側に移動させるステップ;前記保護デオキシリボヌクレオチドを同じチャンバーに導入するステップ;前記酵素を同じチャンバーに導入するステップ;前記酵素が前記ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ;前記保護デオキシリボヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ;前記チャネルを通る電流を測定し、それにより前記ポリヌクレオチドに対する前記酵素及び前記保護デオキシリボヌクレオチドの結合を検出するステップ;前記ポリヌクレオチド結合性化合物を前記2つのチャンバーの他方に導入するステップ;最初に前記電位差を減少させ、それにより第2の極性を生成させるステップ;前記ポリヌクレオチド結合性化合物が前記一本鎖ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ;前記電位差を反転させ、それにより第3の極性を生成させるステップ;二度目に前記電位差を反転させるステップ;前記チャネルを通る電流を測定し、それによりポリヌクレオチド単独、又は前記酵素及び前記保護デオキシリボヌクレオチドに結合したポリヌクレオチドを検出するステップ;前記ステップのいずれか1つを繰り返し、それにより前記ポリヌクレオチドに対する前記酵素の結合を制御するステップを含む方法。
- 前記2つのチャンバー間の電流を測定するステップ;前記第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、前記第1の極性が2度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 前記2つのチャンバー間の電流を測定するステップ;前記第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド結合性化合物が、前記ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記酵素が、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、DNAリガーゼ、DNase、ウラシルDNAグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、及びリボゾームからなる群から選択される請求項29に記載の方法。
- 酵素活性を開始させる少なくとも1つの試薬を準備するステップと;前記ポリヌクレオチド複合体を含む前記チャンバーに前記試薬を導入するステップと;酵素活性を維持するのに十分な温度で前記チャンバーをインキュベートするステップとを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 前記試薬が補助因子である、請求項34に記載の方法。
- 前記補助因子が、Mg2+、Mn2+、Ca2+、ATP、NAD+、NADP+、及びS−アデノシルメチオニンからなる群から選択される、請求項35に記載の方法。
- 前記媒質が導電性である、請求項29に記載の方法。
- 前記媒質が水媒質である、請求項29に記載の方法。
- 前記保護デオキシリボヌクレオチドが、dATP、dGTP、TTP、dCTP、UTP、及びdUTPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記試薬が、ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP、及びddUTPからなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
- 電圧フィードバック制御を使用してポリヌクレオチドに対する酵素の結合を制御するための方法であって:ポリヌクレオチド配列の同定に帰着する方法であり、媒質を含む2つの別々の隣接したチャンバー、前記チャネルの前記シス側から前記チャネルの前記トランス側に一度に1つのポリヌクレオチド鎖のみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法の前記チャネルを有する前記2つのチャンバー間の界面を準備するステップ;ポリヌクレオチドに対する結合活性を有する酵素を準備するステップ;保護デオキシリボヌクレオチドを準備するステップ;ポリヌクレオチド結合性化合物を準備するステップ;ポリヌクレオチド複合体の一部が二本鎖であり一部が一本鎖である前記ポリヌクレオチド複合体を準備するステップ;前記ポリヌクレオチド複合体を前記2つのチャンバーの1つに導入するステップ;前記2つのチャンバー間に電位差を印加し、それにより第1の極性を生成し、前記第1の極性が前記ポリヌクレオチドの前記一本鎖部分を、前記チャネルを通して前記トランス側に移動させるステップ;前記保護デオキシリボヌクレオチドを同じチャンバーに導入するステップ;前記酵素を同じチャンバーに導入するステップ;前記酵素が前記ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ;前記保護デオキシリボヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ;前記チャネルを通る電流を測定し、それにより前記ポリヌクレオチドに対する前記酵素及び前記保護デオキシリボヌクレオチドの結合を検出するステップ;前記ポリヌクレオチド結合性化合物を前記2つのチャンバーの他方に導入するステップ;最初に前記電位差を減少させ、それにより第2の極性を生成させるステップ;前記ポリヌクレオチド結合性化合物が前記一本鎖ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ;前記電位差を反転させ、それにより第3の極性を生成させるステップ;二度目に前記電位差を反転させるステップ;前記チャネルを通る電流を測定し、それによりポリヌクレオチド単独、又は前記酵素及び前記保護デオキシリボヌクレオチドに結合したポリヌクレオチドを検出するステップ;上記ステップのいずれか1つを繰り返し、それにより前記ポリヌクレオチドに対する前記酵素の結合を制御するステップを含む方法。
- 前記2つのチャンバー間の電流を測定するステップ;前記第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、前記第1の極性が2度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項41に記載の方法。
- 前記2つのチャンバー間の電流を測定するステップ;前記第1の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項41に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド結合性化合物が、前記ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記酵素が、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、DNAリガーゼ、DNase、ウラシルDNAグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、及びリボゾームからなる群から選択される、請求項41に記載の方法。
- 酵素活性を開始させる少なくとも1つの試薬を準備するステップと;前記ポリヌクレオチド複合体を含む前記チャンバーに前記試薬を導入するステップと;酵素活性を維持するのに十分な温度で前記チャンバーをインキュベートするステップとを更に含む、請求項41に記載の方法。
- 前記試薬が補助因子である、請求項46に記載の方法。
- 前記補助因子が、Mg2+、Mn2+、Ca2+、ATP、NAD+、NADP+、及びS−アデノシルメチオニンからなる群から選択される、請求項47に記載の方法。
- 前記媒質が導電性である、請求項41に記載の方法。
- 前記媒質が水媒質である、請求項41に記載の方法。
- 前記保護デオキシリボヌクレオチドが、dATP、dGTP、TTP、dCTP、UTP、及びdUTPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記試薬が、ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP、及びddUTPからなる群から選択される、請求項46に記載の方法。
- 電気的連通手段により接続されているシス及びトランスチャンバーであり、前記シス及びトランスチャンバーが、少なくとも1つの細孔又はチャネルを含む薄膜により隔てられており、前記細孔又はチャネルが、ポリマーを通過させるのに好適な寸法を有する形状及び大きさに作られているシス及びトランスチャンバーと、前記シス及びトランスチャンバー間に電場を印加するための手段と、前記シス及びトランスチャンバー間の電流を検出するための手段とを含む有限状態機械。
- 前記薄膜が、疎水性領域及び親水性領域を有する化合物を含む、請求項53に記載の有限状態機械。
- 前記薄膜がリン脂質を含む、請求項53に記載の有限状態機械。
- 前記細孔又はチャネルが、前記ポリマーの相当な部分を収納する、請求項53に記載の有限状態機械。
- 前記細孔又はチャネルが生物活性を有する、請求項53に記載の有限状態機械。
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