CN115219558A - 一种蛋白分子与dna结合位置定位方法及设备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白分子与DNA结合位置定位方法，通过在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素，得到待固定DNA分子；利用所述固定素将所述待固定DNA分子种植在玻片上；利用所述结合引导素与纳米孔芯片的腐蚀窗内的超顺磁性小球相连，控制磁场使所述超顺磁性小球将种植在所述玻片上的待固定DNA分子拉直并穿过所述腐蚀窗；所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度匀速下降，扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息；根据所述蛋白电学信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。本发明显著提升定位的精度及定位的效率。本发明同时还提供了一种具有上述有益效果的DNA结合位置定位。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种蛋白分子与DNA结合位置定位方法及设备。
背景技术
基因测序技术作为人类探索生命秘密的重要手段之一，对生物、生命科学、医学等领域的技术发展起到了巨大的推动作用。而固态纳米孔测序技术具有低成本、高读长、易集成等优势，因此已成为基因测序领域公认的下一代技术。目前的固态纳米孔基因测序技术，是通过在固态氮化硅薄膜芯片上制作出纳米级孔径，使DNA链条穿过固态纳米孔以获得DNA碱基序列。
而这种技术也能更应用到检测蛋白分子与DNA结合位置定位的领域，通过检测蛋白质分子穿过纳米孔时引发的但目前的固态纳米孔测序技术，不能保证DNA在过孔后的形态，DNA分子可能会出现卷曲、折叠、多个碱基对同时经过纳米孔的情况，甚至可能会卡在纳米孔上，造成检测效率低下，检测准确率低的问题。
因此，如何保证待检测DNA分子在检测过程中的处于拉直状态，就成了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白分子与DNA结合位置定位方法及设备，以解决现有技术中的蛋白分子与DNA结合后DNA难以保持伸直状态，造成检测效率底下，检测精度不高的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供一种蛋白分子与DNA结合位置定位方法，包括：
在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素，得到待固定DNA分子；
利用所述固定素将所述待固定DNA分子种植在玻片上；
利用所述结合引导素与纳米孔芯片的腐蚀窗内的超顺磁性小球相连，控制磁场使所述超顺磁性小球将种植在所述玻片上的待固定DNA分子拉直并穿过所述腐蚀窗；
利用所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息；
根据所述蛋白电学信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。
可选地，在所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法中，在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素之前，还包括：
在待检测DNA上间隔设置多个标记探针；
相应地，所述利用所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息包括：
利用所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息及探针反应时间信息；
相应地，所述根据所述蛋白电学信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息包括：
根据所述蛋白电学信息、所述探针反应时间信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。
可选地，在所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法中，所述在待检测DNA上间隔设置多个标记探针包括：
在待检测DNA上间隔设置多种标记探针。
可选地，在所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法中，在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素之前，还包括：
通过清洗剂清洗所述纳米孔芯片。
可选地，在所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法中，所述清洗剂为食人鱼溶液。
可选地，在所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法中，所述固定素为氨基、马来酰胺、羧基、炔基及抗地高辛中至少一种。
可选地，在所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法中，所述结合引导素为生物素。
可选地，在所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法中，所述第一速度的范围为0.025微米每秒至2.5微米每秒，包括端点值。
一种蛋白分子与DNA结合位置定位设备，所述DNA测序设备用于执行如权利要求1至8中任一项所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法。
可选地，在所述的蛋白分子与DNA结合位置定位设备中，所述DNA序列检测设备的纳米孔芯片的厚度的范围为12纳米至30纳米，包括端点值。
本发明所提供的蛋白分子与DNA结合位置定位方法，通过在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素，得到待固定DNA分子；利用所述固定素将所述待固定DNA分子种植在玻片上；利用所述结合引导素与纳米孔芯片的腐蚀窗内的超顺磁性小球相连，控制磁场使所述超顺磁性小球将种植在所述玻片上的待固定DNA分子拉直并穿过所述腐蚀窗；所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度匀速下降，扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息；根据所述蛋白电学信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。
本发明通过所述固定素将所述待检测DNA的一端与玻片相连，另一端通过所述结合引导素与所述超顺磁性小球相连当检测开始时，通过调整环境内磁场对所述超顺磁性小球施力，使所述超顺磁性小球拉直所述待检测DNA，而由于所述待测试DNA在定位过程中始终处于拉直状态，因此避免了待测试DNA分子卷曲、折叠的情况，显著提升定位的精度及定位的效率。本发明同时还提供了一种具有上述有益效果的DNA结合位置定位。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的蛋白分子与DNA结合位置定位方法的一种具体实施方式的流程示意图；
图2为本发明提供的蛋白分子与DNA结合位置定位方法的另一种具体实施方式的流程示意图；
图3为本发明提供的蛋白分子与DNA结合位置定位方法的又一种具体实施方式的流程示意图；
图4至图5为本发明提供的蛋白分子与DNA结合位置定位方法的一种具体实施方式的工艺流程图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的核心是提供一种蛋白分子与DNA结合位置定位方法，其一种具体实施方式的流程示意图如图1所示，称其为具体实施方式一，包括：
S101：在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素，得到待固定DNA分子。
所述固定素为氨基、马来酰胺、羧基、炔基及抗地高辛中至少一种；上述固定素举例所对应的的设置于玻片上的接受受体依次为醛基、巯基、环氧化物、叠氮、地高辛，当然，也可根据实际需要选择其他固定素。
另外，所述结合引导素为生物素，对应地所述超顺磁性小球也为经过链霉亲和素修饰的小球，同样可根据实际情况选择其他结合引导素。
当然，在进行步骤S101之前，被测的目标蛋白质已经结合在所述待检测DNA上了。
S102：利用所述固定素将所述待固定DNA分子种植在玻片上。
S103：利用所述结合引导素与纳米孔芯片的腐蚀窗内的超顺磁性小球相连，控制磁场使所述超顺磁性小球将种植在所述玻片上的待固定DNA分子拉直并穿过所述腐蚀窗。
通过磁场对所述超顺磁性小球施加一个垂直玻片向上的力。
S104：利用所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息。
所述蛋白电学信息指目标蛋白质经过所述纳米孔芯片时得到的电学信息，包括了蛋白质对硬件的电流变化示意图及对应的蛋白反应时间信息，所述蛋白反应时间指从开始检测到接收到目标蛋白质对应的电信号经过的时间信息。
所述第一速度的范围为0.025微米每秒至2.5微米每秒，包括端点值，如0.0250微米每秒、0.5980微米每秒或2.5000微米每秒，所述第一速度越慢，测得的结果的精度越高，但测试的效率也会下降，上述速度范围是经过大量理论计算及实际检验得出的最佳范围，也可以根据实际情况作调整。
S105：根据所述蛋白电学信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。
得知了所述纳米孔芯片开始扫描时的起始位置，又知扫描的第一速度，还知道经过多长时间才扫描到目标蛋白质，自然可知所述目标蛋白质与起始位置的距离，进而可对所述蛋白定位信息。
当然，所述待检测DNA上可包括多个目标蛋白质，则最终可得到多个所述蛋白质反应时间，而如果多个目标蛋白质的结构不同，检测到的对应的电信号也会不同，根据不同电信号确定此时所述纳米孔芯片正在扫描的不同目标蛋白质，并得到不同目标蛋白质对应的不同蛋白反应时间。
本发明所提供的蛋白分子与DNA结合位置定位方法，通过在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素，得到待固定DNA分子；利用所述固定素将所述待固定DNA分子种植在玻片上；利用所述结合引导素与纳米孔芯片的腐蚀窗内的超顺磁性小球相连，控制磁场使所述超顺磁性小球将种植在所述玻片上的待固定DNA分子拉直并穿过所述腐蚀窗；所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度匀速下降，扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息；根据所述蛋白电学信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。本发明通过所述固定素将所述待检测DNA的一端与玻片相连，另一端通过所述结合引导素与所述超顺磁性小球相连当检测开始时，通过调整环境内磁场对所述超顺磁性小球施力，使所述超顺磁性小球拉直所述待检测DNA，而由于所述待测试DNA在定位过程中始终处于拉直状态，因此避免了待测试DNA分子卷曲、折叠的情况，显著提升定位的精度及定位的效率。
在具体实施方式一的基础上，进一步对所述待检测DNA做修饰，得到具体实施方式二，其流程示意图如图2所示，包括：
S201：在待检测DNA上间隔设置多个标记探针。
所述标记探针在经过所述纳米孔芯片时，会产生已知波形的探针信号。
S202：在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素，得到待固定DNA分子。
S203：利用所述固定素将所述待固定DNA分子种植在玻片上。
S204：利用所述结合引导素与纳米孔芯片的腐蚀窗内的超顺磁性小球相连，控制磁场使所述超顺磁性小球将种植在所述玻片上的待固定DNA分子拉直并穿过所述腐蚀窗。
S205：利用所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息及探针反应时间信息。
所述探针反应时间指从开始检测到接收到标记探针对应的电信号经过的时间信息。
S206：根据所述蛋白电学信息、所述探针反应时间信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。
本具体实施方式中，为所述待检测DNA增加修饰了多个标记探针，所述标记探针会与所述待检测DNA上的特定序列相结合，且具有独特的波形信号，也就是说，所述标记探针可充当检测过程中的“里程碑”，本具体实施方式中，不仅可以通过所述第一速度、所述起始位置及所述蛋白反应时间确定目标蛋白质所在位置，还可以通过所述探针反应时间进行校正，甚至更进一步计算出所述目标蛋白质连接于所述待检测DNA的第几个碱基对上，大大提升了定位检测的精度，同时，由于有所述标记探针辅助，可在保证准确率的情况下，提升所述第一速度，进而提高检测效率。纳米尺度下电学信号受孔内物质形态大小等因素影响大，灵敏度高，响应快；通过确认已知探针信号可快速得到与DNA结合的目标蛋白质的精确位置信息
更进一步地，在待检测DNA上间隔设置多种标记探针，由于所述标记探针起到“里程碑”的作用，自然其位置分布越均匀，越密集，检测的准确度就越高，而DNA分子结构复杂，单凭一种碱基序列可能不能达到既均匀又密集的效果，因此，可在所述待检测DNA上设置多种标记探针，进一步提升检测准确度与精度。
在具体实施方式二的基础上，进一步对所述待检测DNA做预处理，得到具体实施方式三，其流程示意图如图3所示，包括：
S301：通过清洗剂清洗所述纳米孔芯片。
作为一种优选实施方式，所述清洗剂为食人鱼溶液，所述食人鱼溶液是浓硫酸和30％过氧化氢的混合物，主要目的在于清洗芯片并使纳米孔表面亲水化，当然，也可根据实际情况选择其他清洗剂。
S302：在待检测DNA上间隔设置多个标记探针。
S303：在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素，得到待固定DNA分子。
S304：利用所述固定素将所述待固定DNA分子种植在玻片上。
S305：利用所述结合引导素与纳米孔芯片的腐蚀窗内的超顺磁性小球相连，控制磁场使所述超顺磁性小球将种植在所述玻片上的待固定DNA分子拉直并穿过所述腐蚀窗。
S306：利用所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息及探针反应时间信息。
S307：根据所述蛋白电学信息、所述探针反应时间信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。
本具体实施方式中，增设了对所述纳米孔芯片的清洗步骤，清洗后的所述纳米孔芯片，可去除附着在其上的杂质，同时更加亲水化，有利于后续修饰，提高测试成功率。
下面提供一种实际操作中的蛋白分子与DNA结合位置定位方法的具体步骤，包括：
(1)将制备好的固态纳米孔芯片放入食人鱼进行处理，主要目的在于清洗芯片并使纳米孔表面亲水化。
(2)待测样品制备：该技术主要研究DNA上结合蛋白的位置信息，所以待测样品为已经结合蛋白分子的已知序列DNA。在已知序列DNA上设计并修饰上探针，这些探针在测序过程中的电学信号变化特征已知，示意图如图4所示，图4中上半部分为所述待检测DNA，包括已知序列DNA及蛋白分子，即前文中的目标蛋白，需要注意的是，之所以选用已知序列的DNA，是为了后续步骤中设置所述标记探针，若是方案中没有用到所述标记探针，则已知序列的DNA不是必要条件，图4箭头指向的下半部分为修饰上所述标记探针后的所述待检测DNA，探针1至探针4为不同种的探针，即其各自对应的碱基序列不同，检测中得到的探针信号也不同，能更好地反应测试进度。
(3)样品的固定：将制备好的样品DNA两端进行化学修饰，一端修饰氨基，另一端修饰生物素。其中氨基可与醛基进行连接，DNA将被种植在制备好的醛基玻片(后简称为玻片)上；生物素将和链霉亲和素相连，保证DNA另一端与磁珠结合。
(4)测试：在纳米孔芯片腐蚀窗内放入链霉亲和素修饰的磁珠，将种植好样品DNA的玻片紧贴处理好的纳米孔芯片，芯片和DNA都处于1M KCl溶液中。在芯片上下加电压后，DNA会受电场力穿过纳米孔，并与磁珠连接。在磁珠上方施加磁场，拉直样品DNA后，通过控制纳米移动平台移动纳米孔芯片，读取DNA过孔信号。测试系统示意图如图5所示，图中磁珠即为所述超顺磁性小球。
(5)获得蛋白分子位点信息：由于在DNA片段上修饰已知位点的探针，所以当纳米孔上下移动读取整个样品DNA过孔信号时，可以得到包含已知的特定探针信号和未知的蛋白分子信号。通过分析距离未知蛋白分子信号最近的两端已知探针信号，可以快速得到蛋白分子的位点信息和蛋白特异结合DNA的碱基信息。
本发明同时还提供了一种蛋白分子与DNA结合位置定位设备，所述DNA测序设备用于执行如上述任一种所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法。本发明所提供的蛋白分子与DNA结合位置定位方法，通过在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素，得到待固定DNA分子；利用所述固定素将所述待固定DNA分子种植在玻片上；利用所述结合引导素与纳米孔芯片的腐蚀窗内的超顺磁性小球相连，控制磁场使所述超顺磁性小球将种植在所述玻片上的待固定DNA分子拉直并穿过所述腐蚀窗；所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度匀速下降，扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息；根据所述蛋白电学信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。本发明通过所述固定素将所述待检测DNA的一端与玻片相连，另一端通过所述结合引导素与所述超顺磁性小球相连当检测开始时，通过调整环境内磁场对所述超顺磁性小球施力，使所述超顺磁性小球拉直所述待检测DNA，而由于所述待测试DNA在定位过程中始终处于拉直状态，因此避免了待测试DNA分子卷曲、折叠的情况，显著提升定位的精度及定位的效率。
作为一种优选实施方式，所述DNA序列检测设备的纳米孔芯片的厚度的范围为12纳米至30纳米，包括端点值，如12.0纳米、23.0纳米或30.0纳米中任一个，所述纳米孔芯片的厚度越薄，也就意味着测试的精度越高，但越薄成品率也越低，长时间工作的可靠性也会下降，上述范围为经过大量理论计算与实际检验后的到的最佳值，当然，也可根据实际情况做改进。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
需要说明的是，在本说明书中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上对本发明所提供的蛋白分子与DNA结合位置定位方法及设备进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种蛋白分子与DNA结合位置定位方法，其特征在于，包括：
在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素，得到待固定DNA分子；
利用所述固定素将所述待固定DNA分子种植在玻片上；
利用所述结合引导素与纳米孔芯片的腐蚀窗内的超顺磁性小球相连，控制磁场使所述超顺磁性小球将种植在所述玻片上的待固定DNA分子拉直并穿过所述腐蚀窗；
利用所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息；
根据所述蛋白电学信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。
2.如权利要求1所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法，其特征在于，在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素之前，还包括：
在待检测DNA上间隔设置多个标记探针；
相应地，所述利用所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息包括：
利用所述纳米孔芯片从预设的起始位置以第一速度扫描拉直后的待检测DNA，得到蛋白电学信息及探针反应时间信息；
相应地，所述根据所述蛋白电学信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息包括：
根据所述蛋白电学信息、所述探针反应时间信息、所述第一速度及所述起始位置，确定蛋白定位信息。
3.如权利要求2所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法，其特征在于，所述在待检测DNA上间隔设置多个标记探针包括：
在待检测DNA上间隔设置多种标记探针。
4.如权利要求1所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法，其特征在于，在待检测DNA两端分别修饰固定素及结合引导素之前，还包括：
通过清洗剂清洗所述纳米孔芯片。
5.如权利要求4所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法，其特征在于，所述清洗剂为食人鱼溶液。
6.如权利要求1所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法，其特征在于，所述固定素为氨基、马来酰胺、羧基、炔基及抗地高辛中至少一种。
7.如权利要求1所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法，其特征在于，所述结合引导素为生物素。
8.如权利要求1至7任一项所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法，其特征在于，所述第一速度的范围为0.025微米每秒至2.5微米每秒，包括端点值。
9.一种蛋白分子与DNA结合位置定位设备，其特征在于，所述DNA测序设备用于执行如权利要求1至8中任一项所述的蛋白分子与DNA结合位置定位方法。
10.如权利要求9所述的蛋白分子与DNA结合位置定位设备，其特征在于，所述DNA序列检测设备的纳米孔芯片的厚度的范围为12纳米至30纳米，包括端点值。
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| US11892445B2 (en) | 2021-12-08 | 2024-02-06 | Western Digital Technologies, Inc. | Devices, systems, and methods of using smart fluids to control translocation speed through a nanopore |
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