CN101680889A - 用于检测特异性免疫球蛋白g类抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于通过测定确定样品中的分析物的方法,所述测定可以一步形式进行而无需进行洗涤步骤。该方法包括第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体,其中所述第一分析物特异性受体含有至少一个分析物结合位点(例如颗粒上的多个抗体),所述第二分析物特异性受体能够选择性结合至少两个分析物分子的排列,所述至少两个分析物分子结合于第一受体。描述了夹心免疫测定,其中所述检测基于电化学发光。
Description
本发明涉及一种用于通过一步方式进行而无须洗涤步骤的测定确定样品中的分析物的方法。
作为对引入外来物质的应答,哺乳动物生物体的免疫系统产生抗体,抗体又名免疫球蛋白。它们充当针对外来物质的防御,外来物质也称为抗原。所述免疫球蛋白可以分为五种不同的类型。人们将免疫球蛋白区分为M、G、A、E和D类。这五种免疫球蛋白类型的区别在于重链的组成,所述重链分别称为μ、γ、α、ε和δ链。
每个免疫球蛋白类型在生物体中具有不同的功能。M类免疫球蛋白在第一次与抗原接触(所谓的初次免疫)的过程中发生。然而,随着感染的进行,这些免疫球蛋白的浓度快速降低。G类免疫球蛋白首先在初次免疫的过程中缓慢地形成,并且在以同样的抗原进行第二次感染时大量存在。A类免疫球蛋白在生物体粘膜表面被发现,负责局部防御过程。E类免疫球蛋白主要负责过敏反应。迄今为止,D类免疫球蛋白的精确功能仍是未知的。
血液中各免疫球蛋白类型以非常不同的浓度存在。因此,G类免疫球蛋白(IgG)是正常人血清中最丰富的类型,比例为约75%,相当于8-18mg/ml的血清含量。第二最常见的免疫球蛋白是IgA,其平均血清浓度为0.9-4.5mg/ml。M类免疫球蛋白以0.6-2.8mg/ml的浓度存在,D类免疫球蛋白以0.03-0.4mg/ml的浓度存在。IgE抗体的比例是最低的;它们仅以0.02-0.05μg/ml的浓度存在于血清中。
在现有技术中描述了多种用于检测针对抗原具有特异性的特定类型的抗体的方法。因此,样品中特定类型的抗原特异性抗体的检测经常通过将特异性抗体结合到包覆有所述特异性抗原的固相上进行。通过将特异性地针对特定类型的人Ig的抗体结合到待检测的Ig分子上,来检测对所述抗原具有特异性并且正结合于所述固相的免疫球蛋白(Ig)。为针对人Ig的抗体提供标记,通过该标记进行检测。然而,这样的测试过程(间接测试形式)只有在如下情况下才是可能的:如果在与针对人Ig的类别特异性的标记抗体反应之前,通过洗涤除去所有非特异性、未结合的Ig。因此,一步测试方法,例如自动化系统经常需要的方法,不可能是这种形式的。
所谓的桥测试(bridge test)开启了在一步测试中进行抗体检测的可能性。在EP-A-0280211中描述了桥测试的概念。在这种方法中,将能够特异性结合待测定抗体(例如抗原)的第一结合配偶体(partner)结合于固相。待测定抗体则与结合于固相的抗原结合。另一种具有标记的特异性抗原也存在于测试混合物中。通过该标记来检测所述抗体。如果不同类型但具有相同特异性的免疫球蛋白存在于样品中,则该测试不能在不同类型之间进行区分。
EP 0 944 838 B1披露了一种桥测试检测方法,该方法能够选择性确定样品中的抗原特异性IgG抗体,该样品中也含有具有相同特异性的IgM。为此,所述抗原以单体形式使用。所述单体抗原具有如下效果:具有相同特异性的IgM抗体不能与所述抗原反应或仅能与其微弱地反应。
特异性抗体测试在感染血清学中至关重要,在所述感染血清学中,检测了针对病原体的抗原结构的免疫反应。虽然用于获得病原体的抗原的不同来源是现有技术(原核和真核系统中的重组表达;病原体的控制性培养,从天然来源分离抗原),但并不总是可以获得单体形式的抗原,从而以一步形式进行IgG-选择性免疫测定。
EP 0 957 360 B1描述了在用于测定分析物的方法中使用类风湿因子来降低Hook效应。
EP 1 098 198 A1描述了一种用于测定人IgG抗体的免疫测定。在该案例中,使用了一种特殊的单克隆抗体,其针对结合于抗原的人IgG的Fc片段的构象表位。该抗体用于选择性检测IgG,并且可以区分结合于抗原的IgG和不结合抗原的IgG。然而,未结合的IgG的存在会干扰并导致信号损失。
EP 1 653 233 A1描述了一种用于测定IgG类型的抗原特异性抗体的测试方法,其中使样品与结合了抗原的固相接触。在该方法中,使用单克隆抗体,该单克隆抗体区分未特异性结合于固相的免疫球蛋白和结合于所述抗原的免疫球蛋白。使样品与固相接触后,将其洗去并随后施加单克隆抗体。
在专利申请WO 99/15898(Chien等)中描述了一种用于以一步形式检测抗原特异性免疫球蛋白G的免疫测定,其可以使用自动分析仪进行。其中,使用了对人免疫球蛋白G的恒定部分具有特异性的抗体。在该测定中,存在游离的非特异性IgG的显著干扰,没有充分区分游离的IgG与复合的IgG。
因此,现有技术的用于检测IgG的一步法不能够充分区分游离的IgG与结合的IgG。为了区分具有相同特异性的IgG和IgM,抗原必须是单体的,而这是一个经常不能满足的要求。
因此,本发明的目的在于开发一种用于检测样品中的分析物、特别是G类免疫球蛋白的抗原特异性抗体的方法,该方法可以一步法进行,从而其可以有利地用于自动化系统。此外,本发明的目的为至少部分地克服现有技术的缺点。为此,有必要充分区分游离的分析物与结合的分析物。
第一方面,本发明涉及一种确定样品中的分析物的方法,该方法包括以下步骤:
(a)使样品与第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体接触,其中两种受体之一结合于固相或能够结合于固相,而另一种受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团,以及
(b)通过确定所述固相上产生信号的基团,检测所述分析物的存在或/和量,
其特征在于第一分析物特异性受体含有所述分析物的至少两个结合位点,而第二分析物特异性受体能够选择性地结合于至少两个分析物分子的排列,所述至少两个分析物分子结合于第一受体。
意外地发现,样品中存在类风湿因子并不干扰本发明的方法。
本发明的方法适于检测样品中的任何分析物。优选的是,所述分析物是抗原特异性抗体,例如G、M、A、D或/和E类的抗原特异性抗体。更优选,所述分析物是G类抗原特异性抗体,例如针对病原体、肿瘤抗原或/和自身抗原的G类抗原特异性抗体。
含有分析物的样品优选为液体样品。所述液体样品可以是任何液体样品,例如含水的样品。样品可以是生物样品或/和临床样品例如体液如血液、血清、尿、唾液、脓等等。样品可以更优选含有类风湿因子。
在优选实施方式中,所述第一和第二分析物特异性受体彼此不同。
在本发明的方法中,第二受体能够选择性结合至少两个分析物分子的排列,所述至少两个分析物分子结合于第一受体。“至少两个分析物分子的排列”意为至少两个分析物分子一起具有如下结构:第二受体可以选择性结合于该结构,即其可被第二受体识别,并且第二受体可以将其与单一分析物分子、特别是未结合于第一受体的单一分析物分子区分开。“能够选择性结合”也表示与单一分析物分子相比,第二受体可以更强地结合于至少两个分析物分子的排列。排列还可以是包含结合于第一受体的至少两个分析物分子(特别是抗体)的免疫复合物。第一受体可以包含具有至少两个表位的抗原。
“排列”优选含有彼此“聚集”并结合于第一受体的至少两个分析物分子。在本发明意义上,“聚集的”或“聚集”表示结合于所述受体的分析物分子彼此处于某一距离,选择这样的距离使得第二分析物特异性受体结合所述至少两个分析物分子,其中所述至少两个分析物分子结合于第一受体。因此,结合于第一受体的分析物分子在空间上彼此接近。通过所述受体中结合位点之间的距离来确定结合于第一受体的分析物分子之间的距离。在本发明的意义上,“聚集的”或“聚集”包括结合于第一受体的分析物分子彼此不是化学结合或者彼此之间具有化学键例如共价键或非共价键例如氢键或抗原-抗体结合。
第一分析物特异性受体含有针对所述分析物的至少两个结合位点。第一分析物特异性受体可以含有至少两个不同的结合位点、至少两个相同的结合位点或者不同的和相同的分析物结合位点的组合。
在另一种进一步优选的实施方式中,第一受体是寡聚体受体或多聚体受体。在本发明的意义上,“寡聚体”或“多聚体”表示第一受体含有针对所述分析物的多个结合位点,优选至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少50个或至少100个结合位点。第一受体优选含有多至200个、多至100个、多至50个、多至20个、多至10个或者多至5个结合位点。在本发明的意义上,“寡聚体”或“多聚体”也包括如下含义:第一受体可以是寡聚体或者结构单元(building block)的多聚体,其中各结构单元可以没有结合位点、具有一个结合位点或者多个结合位点。“寡聚体”或“多聚体”还包括“低价的”或“多价的”。
在进一步优选的实施方式,以受体前体的形式提供第一受体。优选地,提供至少两种受体前体。受体前体优选地彼此联合或者彼此结合以形成第一受体。所述受体前体可以具有如下性质:它们可以在本发明方法的步骤(a)中彼此联合或结合,以形成第一受体。它们也可以具有如下性质:它们可以在本发明方法的步骤(a)之前彼此联合或结合。所述至少两种受体前体可以具有如下性质:两种受体前体的任一种包含针对分析物的所有结合位点或者两种受体前体均包含针对分析物的至少一个结合位点。
所述至少两个受体前体可以彼此联合或通过化学键彼此结合,其中所述键可以是共价键或非共价键。本领域技术人员已知的任何结合系统都可以用于所述联合或结合。优选本文中描述的X/抗-X结合系统,例如抗生物素蛋白(avidin)/抗生蛋白链菌素(streptavidin)生物素系统。因此,所述至少两个受体前体中的一个可以含有生物素基团,而另一个受体前体含有抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素基团。例如,携带针对所述分析物的至少一个结合位点的生物素化分子例如肽可以通过结合于涂敷有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的珠或与所述珠联合而形成第一受体,其中所述受体含有针对所述分析物的至少两个结合位点。所述珠也可以是生物素化的,并且携带至少一个结合基团的分子可以与抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素联合。
因此,第一受体可以包含珠,该珠携带针对所述分析物的至少两个结合位点的排列。优选第一受体包含珠,该珠包含至少10个、至少50个或至少100个结合位点。
在本发明方法的另一进一步优选的实施方式中,第一受体包含抗原,该抗原含有至少两个表位作为针对分析物的结合位点。在该实施方式中,所述分析物是抗体,优选G、M、A、D或/和E类抗体,更优选G类抗体。
本发明的抗原可以是寡聚体或多聚体抗原。所述至少两个表位可以是相同的或不同的。所述抗原可以包含至少两个不同的表位、至少2个相同的表位或相同的和不同的表位的组合。所述抗原可以包含重复表位。所述抗原可以包含多个表位,优选至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个或至少50个表位。所述抗原可以含有多至100个、多至50个、多至20个、多至10个或者多至5个表位。
本发明的抗原可以具有任何具有不同的结构特征和组成的表位。所述抗原可以包括微生物、细胞、细胞器、细胞区室(compartment)或其裂解物或制备物例如膜制备物。所述抗原可以是分离自天然来源的抗原或通过在原核或/和真核生物中重组表达或/和通过化学合成而制备的抗原。抗原的寡聚化或多聚化可以任选地通过天然组装或聚集、或者靶向吸附或共价连接、或吸附或共价缀合而进行。
在进一步优选的实施方式中,所述第二分析物特异性受体包含抗体。更优选具有类风湿因子样性质的抗体,其可优选地结合聚集的或寡聚化免疫球蛋白而不是单一的免疫球蛋白。
同样地优选第二受体包含抗体,所述抗体对于结合分析物具有低亲和力。本发明抗体的亲和力定义为抗体上的各抗原结合位点和各表位之间的所有非共价相互作用的强度。具有低亲和力的抗体微弱结合并快速解离,而高亲和力抗体则结合更强,并且可以保持结合更长的时间。
结合位点处的亲和力不总是反映抗原-抗体相互作用的实际强度,例如具有至少两个结合了分析物分子(例如抗原特异性抗体)的表位的作为第一受体的本发明的抗原和例如作为第二受体的具有多个结合位点的抗体之间的相互作用的实际强度。在一个位点上抗原和抗体的抗原结合位点之间的相互作用增加了同一抗体的第二抗原结合位点处反应的可能性,这可导致相互作用配偶体的交联。多价抗体和抗原之间的这种多重相互作用的强度称为抗体亲抗原性(avidity)。在这方面,高抗体亲抗原性补偿了例如在五聚体免疫球蛋白IgM的情况下的低亲和力。
在一种优选实施方式中,第二受体是包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个和特别优选10个或更多互补位的抗体。
在本发明中,第二受体更优选包含针对所述分析物具有低亲和力和高抗体亲抗原性的抗体,例如包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个并且特别优选10个或更多互补位的抗原特异性抗体。更优选的第二受体是免疫球蛋白IgM或IgG免疫球蛋白彼此交联的抗原特异性抗体。抗体<h-agg.IgG>IgM是最强烈优选的。
本发明的低亲和力抗体的亲和系数为高于10-8M、优选高于10-7M、更优选高于10-6M。
本发明的作为第二受体的低亲合力抗体优选地识别分析物分子,尤其是抗原特异性抗体,其例如以足够的密度、以排列或/和作为聚集体结合于第一受体。未结合的分析物分子或松散且不规则分布的非特异性结合于第一受体的分析物分子优选不被识别或仅以微不足道的程度被识别。因此,本发明的这种第二分析物特异性受体能够选择性结合其上结合了至少两个分析物分子的第一受体。
IgM类抗体具有一般的类风湿抗体类的性质,即它们优选地结合免疫球蛋白类IgG的抗原特异性结合抗体,因为它们仅识别在免疫测定的多聚体抗原上足够密集地包装的抗原特异性抗体。非复合的、游离的免疫球蛋白G,具体而言其对抗原不具有特异性,不被识别或仅以微不足道的程度被识别。
通过这样的方式,可以例如在存在具有相同抗原特异性的其他类型的免疫球蛋白的情况下以及还在存在非特异性IgG而不损失灵敏度(这将损害所述测定)的情况下检测抗原特异性IgG。使用本发明的第二受体实现了特异性结合抗原的免疫球蛋白G和非抗原特异性的游离IgG之间待实现的高辨别力。此外,本发明的第二受体优选识别在本发明的抗原上特异性结合并彼此邻近定位的免疫球蛋白分子,并且可以被寡聚化,但其不识别或以微不足道的程度识别游离的、未复合的抗原特异性免疫球蛋白。
因此,确保了以一步形式在存在过量存在的天然产生的、非抗原特异性IgG分子的情况下检测样品中的G类抗原特异性免疫球蛋白。
“一步法”理解为表示分析物与本发明的反应物的反应可以在一种反应混合物中进行,特别是不需通过一或多个洗涤步骤来将所述混合物的组分彼此分开。
“一步法”或“在一种反应混合物中的反应”包括下列可能性:同时/连续将反应物添加至反应混合物(样品),或/和同时/连续添加其他辅助物质(例如缓冲液、盐等)。
优选的“一步法”是无需洗涤步骤而进行的。
在另一个优选实施方式中,本发明方法中的步骤(a)是在一种反应混合物中进行而无需洗涤步骤。更优选,步骤(a)和(b)是在一种反应混合物中进行而无需洗涤步骤。本发明方法实现了以一步形式检测免疫球蛋白G类的抗原特异性抗体。这些抗体试验在体外诊断传染病和自身免疫疾病中非常重要。
在其它实施方式中,本发明方法可以包含洗涤步骤。
在最优选的实施方式中,本发明方法中的第一受体为本发明的抗原,第二受体为类风湿因子样抗体、特别是M类免疫球蛋白,而分析物为抗原特异性免疫球蛋白G。因此,多个特异性免疫球蛋白G结合于抗原结合配偶体是可能的,这转而引起IgG分子的寡聚化,即两个或多个IgG可以在空间上彼此邻近,从而能够结合类风湿因子样受体。
在另一种进一步优选的实施方式中,本发明方法为诊断方法,特别是用于检测生物样品,特别是临床样品中的抗体的诊断方法。在本发明的诊断方法中,例如可以检测针对抗原(例如病毒或微生物)、肿瘤抗原或/和自身抗体的抗体。特别地,可以检测抗病毒例如风疹、CMV、HAV、HBV、HCV的抗体。
在本发明的方法中,抗体片段也可以用作受体。抗体的片段化是本领域技术人员已知的,并按照常规方法进行。蛋白酶剪切和/或重组产生的片段的实例包括Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv和单链抗体(scFv),其含有V[L]和/或V[H]结构域,具有肽接头。所述scFv可以共价或非共价连接以形成具有两个或多个结合位点的抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、可以通过重组产生的嵌合抗体或人源化抗体。优选的是第二受体是单克隆抗体。
本发明的抗体优选是单克隆抗体、特别是IgM类,其具有针对IgG、特别是人IgG的低亲和力和高抗体亲抗原性。通过高抗体亲抗原性,该抗体可以选择性地确保通过多点结合而在复合状态下识别人IgG。
根据本发明,两种受体中的一种结合于固相或能够结合固相,而两种受体中的另一种携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。在一个优选实施方式中,第一受体结合于固相或能够结合固相,而第二受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。在另一优选实施方式中,第二受体结合于固相或能够结合固相,而第一受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
本领域技术人员熟悉的所有产生信号的基团均可用作产生信号的基团。优选使用直接可检测的基团,例如化学发光基团、荧光基团或放射性基团,或者金属溶胶(metal sole)、乳胶或金颗粒。产生信号的基团可以本领域技术人员已知的方式被检测到。
能够结合的第一或第二受体优选是可溶的,并优选携带起到结合受体作用的标记。X/抗-X结合系统的配偶体优选作为标记,例如组合的配偶体选自生物素/抗生物素蛋白、生物素/抗生蛋白链菌素、生物素/抗生物素(antibiotin)、半抗原/抗半抗原、抗体的Fc片段和针对该Fc片段的抗体、抗抗体或碳水化合物和凝集素。结合系统的另一反应配偶体结合于载体或结合于产生信号的基团。结合系统的配偶体可以按照本领域技术人员已知的常规方法被结合。在这方面,共价结合以及吸附结合是适宜的。
在进一步的实施方式中,标记是本文中所描述的产生信号的基团。优选,使用直接可检测的基团作为标记。用于标记受体的方法已知为现有技术。通过测量产生信号的基团,可以本身已知的方式直接检测标记。
标记也可以通过间接的方式进行检测。在这种情况下,进一步的结合配偶体特异性结合受体、受体上的标记、抗原或/和抗原上的标记,而该结合配偶体自身则缀合于产生信号的基团。
本发明方法的最优选实施方式是一种通过以一步形式进行免疫测定来检测样品中的免疫球蛋白G类的抗原特异性抗体的方法,该方法包括以下步骤:
(a)使含有对抗原具有特异性的免疫球蛋白G类抗体的样品与第一受体和第二受体接触,所述第一受体包含寡聚体或多聚体形式的抗原并携带产生信号的基团,所述第二受体选择性结合抗原结合的、聚集的免疫球蛋白G并携带标记,其中接触条件为形成由抗原、特异性结合抗原的免疫球蛋白G和第二受体组成的免疫复合物;
(b)使来自(a)的反应混合物与固相接触,所述固相含有针对第二受体的标记的固定化结合配偶体,其中接触条件为来自(a)的免疫复合物通过所述第二受体结合于所述固相;
(c)通过所述产生信号的基团检测来自(b)的结合复合体。
本发明方法的另一种最优选实施方式是通过以一步形式进行免疫测定来检测样品中的免疫球蛋白G类的抗原特异性抗体的方法,该方法包括以下步骤:
(a)使含有对抗原具有特异性的免疫球蛋白G类抗体的样品与第一受体和第二受体接触,所述第一受体包含寡聚体或多聚体形式的抗原,其中第一受体携带标记,所述第二受体选择性结合抗原结合的、聚集的免疫球蛋白G并携带产生信号的基团,其中接触条件为形成由抗原、特异性结合抗原的免疫球蛋白G和第二受体组成的免疫复合物;
(b)使来自(a)的反应混合物与固相接触,所述固相含有针对第一受体的标记的固定化结合配偶体,其中接触条件为来自(a)的免疫复合物通过所述第一受体结合于所述固相;
(c)通过所述产生信号的基团检测来自(b)的结合复合体。
本发明的另一主题是试剂盒,其适用于包括优选实施方式的本文中所描述的本发明方法。
优选试剂盒包含第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体,其中两种受体之一结合于固相或能够结合于固相,而另一种受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团,其特征在于第一分析物特异性受体含有至少两个针对分析物的结合位点,而第二分析物特异性受体能够选择性结合至少两个分析物分子的排列,所述至少两个分析物分子结合于第一受体。
更优选的是本发明的试剂盒中第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体配制成用于一种反应混合物中。
一种更强优选的实施方式涉及试剂盒,其中第一受体结合于固相或能够结合固相,而第二受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
另一种也是更强优选的实施方式涉及试剂盒,其中第二受体结合于固相或能够结合固相,而第一受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
在进一步优选的实施方式,第一受体也可以受体前体的形式提供于本发明的试剂盒中。结合本发明方法,在本文中描述了受体前体。特别地,所述试剂盒可以含有珠作为受体前体和另外的受体前体例如肽。
本发明的试剂盒也可以包含珠作为第一受体,该珠包含至少10个、至少50个或至少100个结合位点。
本发明的另一方面涉及分析物特异性受体在确定样品中的分析物的方法中的用途,其中所述分析物特异性受体含有至少两个针对分析物的结合位点。该方法优选为本文中描述的方法、更优选为本文中描述的诊断方法。
本发明通过以下实施例进行说明。各实施例包含本发明的数据和使用现有技术方法获得的比较数据。
实施例
实施例1:根据本发明方法检测人血清中的抗风疹特异性免疫球蛋白G,并比较本发明方法与含有洗涤步骤的以间接测试形式进行的现有技术的免疫测定的灵敏性
1.1.本发明方法
使用自动化分析仪(Roche Diagnostics GmbH)免疫学检测原血清中的抗风疹IgG。使用本发明的抗体作为捕获抗体进行测量。该抗体的生物素缀合物固定化在涂敷了抗生蛋白链菌素的磁珠表面上,因此结合来自样品的结合于多聚体样粒子(RLP)的抗风疹IgG。通过结合于RLP的钌化单克隆抗体检测该复合物。中的信号检测是基于电化学发光。
在铂电极上激发后,在存在特异性免疫球蛋白分析物和620nm发射光的情况下将生色的钌复合物结合于固相。以任意单位表示光信号。使用来自具有混合滴度和两个血清转化板的板的抗风疹IgG阳性样品进行测量。
1.2现有技术
进行现有技术的两步免疫测定(Cobas Core,风疹IgG recomb II)用于比较。
具有混合滴度的板
血清转化板
血清转化板中的阳性滴度可以分别在第21和18天以一步法被检测到,而直到分别在28天和24天才以两步法被检测到。
本发明的免疫测定形式比现有技术的两步免疫测定更灵敏,因为可以在较早的时间检测阳性滴度。
实施例2:比较具有本发明的性质(低亲和力、选择性结合聚集的人IgG)的抗人IgG抗体受体和具有现有技术性质(高亲和力、同样强地结合聚集的和非聚集的IgG)的抗人IgG抗体受体。
使用实施例1的免疫学方法测试Master校准仪(MC)、阴性血清和阳性血清的抗风疹IgG抗体。
在本实施例中,测试了对游离IgG干扰本发明的测试的敏感性。左侧结果栏表明总是存在于人血清样品中的游离IgG不干扰测试,从而实现了高测试灵敏性。针对人的聚集的IgG并具有低亲和力的捕获抗体不结合游离IgG或者仅以微不足道的程度结合游离IgG。因此,只有聚集的IgG结合于固相,其随后可以通过结合于多聚体/多价风疹(“风疹样粒子(particle)”)进行检测和通过钌化抗风疹MAB被检测为抗风疹特异性IgG。
与此对比,现有技术的测试方法的结果示于实施例2的右手栏。在现有技术中,捕获抗体不区分聚集的和非聚集的抗体(即游离IgG)。因此,游离IgG和聚集IgG均结合于固相。在随后的结合风疹抗原和检测反应中,这明显地减低了测试的灵敏性。对于本发明的测试方法,样品MC4值为24.79,而使用现有技术的方法,同样的样品仅达到值1.71,即仅勉强地超过截止指数1。
在结果表的最后两行、特别是最后一行中,差异变得非常清晰。使用本发明的方法,血清“pos.1851”明显是抗风疹阳性的(值:8.07),而现有技术方法分类相同的样品为阴性的,即假阴性的(值0.47,即在截止指数1之下)。
现有技术方法缺乏灵敏性因此具有致命后果,因为阳性样品被错误地检测为阴性。
结果清楚地表明使用本发明的受体抗体与现有技术的受体抗体相比,能够更灵敏地检测风疹抗体。
实施例3:检测含有类风湿因子的人血清样品中的抗风疹IgG抗体
使用实施例1中描述的本发明方法检测市售的含有类风湿因子的人血清样品(Bioclinical Partners)。
进行现有技术的两步免疫测定(Cobas Core,风疹IgG recomb II)作为比较试验。
结果清楚地表明:尽管存在类风湿因子,本发明的方法仍正确地分类样品。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于确定样品中的分析物的方法,包括以下步骤:
(a)使样品与第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体接触,其中两种受体之一结合于固相或能够结合于固相,而另一种受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团,以及
(b)通过确定所述固相上产生信号的基团检测所述分析物的存在或/和量,
其特征在于:
所述第一分析物特异性受体含有所述分析物的至少两个结合位点,而所述第二分析物特异性受体能够选择性地结合于至少两个分析物分子的排列,所述至少两个分析物分子结合于所述第一受体,其中所述结合于第一受体的至少两个分析物分子是聚集的。
2.权利要求1的方法,其特征在于所述分析物是抗原特异性抗体、特别是免疫球蛋白G类抗原特异性抗体。
3.权利要求1或2的方法,其中所述第一受体结合于固相或能够结合固相,而所述第二受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
4.权利要求1或2的方法,其中所述第二受体结合于固相或能够结合固相,而所述第一受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
5.权利要求1至4任一项的方法,其特征在于所述第一受体含有针对所述分析物的至少两个不同的结合位点、至少两个相同的结合位点或不同的和相同的结合位点的组合。
6.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第一受体是寡聚体受体或多聚体受体。
7.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第一受体包含抗原,所述抗原含有至少两个表位作为所述分析物的结合位点。
8.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第一受体包含珠。
9.前述权利要求任一项的方法,其中所述第一受体以受体前体的形式提供。
10.权利要求9的方法,其中所述受体前体具有这样的性质:它们可以在步骤(a)中或步骤(a)之前彼此联合或结合,以形成所述第一受体。
11.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第二受体是类风湿因子样抗体。
12.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第二受体是具有至少两个互补位的抗体。
13.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第二受体是免疫球蛋白M类的抗体。
14.前述权利要求任一项的方法,其中所述第二受体是针对所述分析物具有低亲和力和高抗体亲抗原性的抗体。
15.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第二受体是单克隆抗体。
16.前述权利要求任一项的方法,其中步骤(a)是在一种反应混合物中进行的,而无需洗涤步骤。
17.前述权利要求任一项的方法,其为诊断方法。
18.试剂盒,其包含第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体,其中两种受体之一结合于固相或能够结合于固相,而另一种受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团,
其特征在于:
所述第一分析物特异性受体含有至少两个针对分析物的结合位点,而所述第二分析物特异性受体能够选择性结合至少两个分析物分子的排列,所述至少两个分析物分子结合于第一受体,其中所述结合于第一受体的至少两个分析物分子是聚集的。
19.权利要求18的试剂盒,其中所述第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体被配制成用于一种反应混合物中。
20.权利要求18或19的试剂盒,其中所述第一受体结合于固相或能够结合固相,而所述第二受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
21.权利要求18或19的试剂盒,其中所述第二受体结合于固相或能够结合固相,而所述第一受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
22.分析物特异性受体在用于确定样品中的分析物的方法中的用途,所述分析物特异性受体含有至少两个针对所述分析物的结合位占
23.权利要求22的用途,其用于诊断方法。
Claims (24)
1.用于确定样品中的分析物的方法,包括以下步骤:
(a)使样品与第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体接触,其中两种受体之一结合于固相或能够结合于固相,而另一种受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团,以及
(b)通过确定所述固相上产生信号的基团检测所述分析物的存在或/和量,
其特征在于
所述第一分析物特异性受体含有所述分析物的至少两个结合位点,而所述第二分析物特异性受体能够选择性地结合于至少两个分析物分子的排列,所述至少两个分析物分子结合于所述第一受体。
2.权利要求1的方法,其特征在于所述分析物是抗原特异性抗体,特别是免疫球蛋白G类抗原特异性抗体。
3.权利要求1或2的方法,其中所述第一受体结合于固相或能够结合固相,而所述第二受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
4.权利要求1或2的方法,其中所述第二受体结合于固相或能够结合固相,而所述第一受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
5.权利要求1至4任一项的方法,其中所述结合于第一受体的至少两个分析物分子是聚集的。
6.权利要求1至5任一项的方法,其特征在于所述第一受体含有针对所述分析物的至少两个不同的结合位点、至少两个相同的结合位点或不同的和相同的结合位点的组合。
7.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第一受体是寡聚化或多聚化受体。
8.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第一受体包含抗原,所述抗原含有至少两个表位作为所述分析物的结合位点。
9.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第一受体包含珠。
10.前述权利要求任一项的方法,其中所述第一受体以受体前体的形式提供。
11.权利要求10的方法,其中所述受体前体具有这样的性质:它们可以在本发明方法的步骤(a)中或步骤(a)之前彼此联合或结合,以形成所述第一受体。
12.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第二受体是类风湿因子样抗体。
13.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第二受体是具有至少两个互补位的抗体。
14.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第二受体是免疫球蛋白M类的抗体。
15.前述权利要求任一项的方法,其中所述第二受体是针对所述分析物具有低亲和力和高抗体亲抗原性的抗体。
16.前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述第二受体是单克隆抗体。
17.前述权利要求任一项的方法,其中步骤(a)在一种反应混合物中进行而无需洗涤步骤。
18.前述权利要求任一项的方法,其为诊断方法。
19.试剂盒,其包含第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体,其中两种受体之一结合于固相或能够结合于固相,而另一种受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团,
其特征在于:
所述第一分析物特异性受体含有至少两个针对所述分析物的结合位点,而所述第二分析物特异性受体能够选择性结合至少两个分析物分子的排列,所述至少两个分析物分子结合于第一受体。
20.权利要求19的试剂盒,其中所述第一分析物特异性受体和第二分析物特异性受体配被制成用于一种反应混合物中。
21.权利要求19或20的试剂盒,其中所述第一受体结合于固相或能够结合固相,而所述第二受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
22.权利要求19或20的试剂盒,其中所述第二受体结合于固相或能够结合固相,而所述第一受体携带产生信号的基团或能够结合于产生信号的基团。
23.分析物特异性受体在用于确定样品中的分析物的方法中的用途,所述分析物特异性受体含有至少两个针对所述分析物的结合位点。
24.权利要求23的用途,其用于诊断方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103197077A (zh) * | 2013-03-20 | 2013-07-10 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 一种检测微量牛免疫球蛋白g的试剂盒 |
CN112218720A (zh) * | 2017-06-12 | 2021-01-12 | Essenlix公司 | 均相测定 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2629096A1 (en) * | 2012-02-20 | 2013-08-21 | Roche Diagniostics GmbH | HBV immunocomplexes for response prediction and therapy monitoring of chronic HBV patients |
WO2019079970A1 (zh) * | 2017-10-24 | 2019-05-02 | 上海药明生物技术有限公司 | 一种治疗性抗体的放行检测方法 |
CN109696461B (zh) * | 2017-10-24 | 2023-05-26 | 上海药明生物技术有限公司 | 一种治疗性抗体的放行检测方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4945042A (en) * | 1987-02-23 | 1990-07-31 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the determination of an antibody |
EP0485347B1 (en) * | 1990-11-05 | 1994-09-14 | SORIN BIOMEDICA S.p.A. | Recombinant hepatitis delta antigen, process for the purification and use thereof |
CN1105181A (zh) * | 1993-04-14 | 1995-07-12 | 国际莫莱斯技术公司 | 免疫测定法 |
CN1245561A (zh) * | 1996-11-29 | 2000-02-23 | 罗赫诊断器材股份有限公司 | 抗原特异性lgG的检测 |
CN1766621A (zh) * | 2004-10-30 | 2006-05-03 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 在检测已经以抗原-特异性方式结合的特定免疫球蛋白类型的抗体时降低阵列测试形式中空白值的免疫复合物特异性抗体 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4537861A (en) * | 1983-02-03 | 1985-08-27 | Elings Virgil B | Apparatus and method for homogeneous immunoassay |
DE4309393A1 (de) * | 1993-03-23 | 1994-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verringerung des Hook-Effekts in Immuntests mit teilchenförmigem Trägermaterial |
US6207369B1 (en) * | 1995-03-10 | 2001-03-27 | Meso Scale Technologies, Llc | Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing |
US6319670B1 (en) * | 1995-05-09 | 2001-11-20 | Meso Scale Technology Llp | Methods and apparatus for improved luminescence assays using microparticles |
DE19637418A1 (de) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Homogene Nachweisverfahren zur Bestimmung von Subpopulationen eines Analyten |
ATE354800T1 (de) | 1997-09-22 | 2007-03-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Verfahren zum nachweiss von antikörpern in einer probe |
ATE221657T1 (de) | 1998-05-06 | 2002-08-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Entstörung durch rheumafaktoren |
US6613513B1 (en) * | 1999-02-23 | 2003-09-02 | Caliper Technologies Corp. | Sequencing by incorporation |
IT1315254B1 (it) | 1999-11-05 | 2003-02-03 | Diesse Diagnostica Senese Spa | Metodo per la determinazione qualitativa e quantitativa di anticorpiumani di classe igc. |
-
2008
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-
2010
- 2010-06-17 US US12/817,469 patent/US9267953B2/en active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4945042A (en) * | 1987-02-23 | 1990-07-31 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the determination of an antibody |
EP0485347B1 (en) * | 1990-11-05 | 1994-09-14 | SORIN BIOMEDICA S.p.A. | Recombinant hepatitis delta antigen, process for the purification and use thereof |
CN1105181A (zh) * | 1993-04-14 | 1995-07-12 | 国际莫莱斯技术公司 | 免疫测定法 |
CN1245561A (zh) * | 1996-11-29 | 2000-02-23 | 罗赫诊断器材股份有限公司 | 抗原特异性lgG的检测 |
CN1766621A (zh) * | 2004-10-30 | 2006-05-03 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 在检测已经以抗原-特异性方式结合的特定免疫球蛋白类型的抗体时降低阵列测试形式中空白值的免疫复合物特异性抗体 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103197077A (zh) * | 2013-03-20 | 2013-07-10 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 一种检测微量牛免疫球蛋白g的试剂盒 |
CN112218720A (zh) * | 2017-06-12 | 2021-01-12 | Essenlix公司 | 均相测定 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2008135274A2 (de) | 2008-11-13 |
CA2686427A1 (en) | 2008-11-13 |
WO2008135274A4 (de) | 2009-05-07 |
WO2008135274A3 (de) | 2009-03-05 |
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