CN1766621A - 在检测已经以抗原-特异性方式结合的特定免疫球蛋白类型的抗体时降低阵列测试形式中空白值的免疫复合物特异性抗体 - Google Patents
在检测已经以抗原-特异性方式结合的特定免疫球蛋白类型的抗体时降低阵列测试形式中空白值的免疫复合物特异性抗体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及通过阵列形式的免疫测定检测样品中特定免疫球蛋白类型的抗原-特异性抗体的方法,所述免疫测定中多种结合配偶体Bnx结合在支持物的不同的离散的区域,每种情况下的Bnx包含能特异结合所检抗体的多种抗原,该方法包括将样品和携带标记的结合配偶体B2与支持物一起孵育,随后检测多个离散的区域上的标记,其中B2特异性结合于已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及通过阵列形式的免疫测定检测样品中特定免疫球蛋白类型的抗原-特异性抗体的方法,所述免疫测定中多种结合配偶体Bnx结合在支持物的不同的离散的区域,每种情况下的Bnx包含能特异结合所检抗体的多种抗原,该方法包括将样品和携带标记的结合配偶体B2与支持物一起孵育,随后检测多个离散的区域上的标记,其中B2特异性结合于已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体。
本发明尤其涉及降低用于检测抗原-特异性抗体的阵列形式的免疫测定中由于非特异性结合的非-抗原特异性抗体引起的空白值的方法。
背景技术
哺乳动物体的免疫系统产生作为对外来物质进入的应答的抗体,也称为免疫球蛋白。其用于抵御外来物质,也称为抗原。免疫球蛋白可分为五个不同类型。区分为M、G、A、E和D类型免疫球蛋白。这五种免疫球蛋白类型的重链的组成互不相同,称为μ、γ、α、ε或δ链。
生物体中每种免疫球蛋白类型具有不同的功能。M类型的免疫球蛋白在首次接触抗原,称为初次免疫时出现。然而,在感染过程中,这些免疫球蛋白的浓度很快降低。G类型免疫球蛋白在初次免疫时首先缓慢形成且当存在同样抗原的二次感染时大量出现。A类型免疫球蛋白发现于生物体粘膜表面且对该处出现的防御过程起作用。E类型免疫球蛋白主要对过敏反应起作用。D类型免疫球蛋白的确切功能至今未知。
各个免疫球蛋白类型以很不相同的浓度存在于血液中。因此G类型免疫球蛋白(IgG)在人血清中最常出现,以约75%的比例,相当于8至18mg/ml的血清含量存在。第二常见的免疫球蛋白为IgA,其平均血清浓度为0.9至4.5mg/ml。M类型免疫球蛋白以0.6至2.8mg/ml的浓度存在而D类型免疫球蛋白以0.003至0.4mg/ml的浓度存在。IgE抗体以最低的比例存在且仅以血清中0.02至0.05μg/ml的浓度存在。
对于许多疾病的不同诊断,检测特异于某些抗原的一种或多种非常特定的免疫球蛋白类型的抗体是很重要的。在对病毒情况的满意的诊断中,细菌和寄生虫感染只能通过类型-特异的抗体检测或通过排除某些免疫球蛋白类型的存在(例如,检测到IgG和IgA抗体但未检测到IgM抗体)而评估。区分刚有的或急性感染和较早的感染以及临床监控感染进程尤其重要。抗体的类型-特异性检测对于HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、弓形体病、风疹和衣原体感染特别重要。某些抗原的特异性抗体的类型-特异性检测在测定保护抗体的滴度时以及对于检查免疫是否成功也是必要的。
现有技术中记载了各种检测抗原特异性的特定类型抗体的方法。因此特定类型的抗原特异性抗体常通过将特异性抗体结合于包被特异性抗原的固相支持物而检测。抗原特异性的且已结合于固相的免疫球蛋白(Ig)通过将特异性针对某些类型人Ig的抗体结合于所检的Ig分子而检测。提供针对人Ig的抗体,其带有用于检测的标记。然而,该测试过程仅在与类型-特异的针对人Ig的标记抗体反应前通过洗涤除去非特异性的、未结合的Ig时才是可行的。因此,例如当检测样品中特异的IgG分子时,存在相当大量的(4-20mg/ml)非特异性IgG,其可不同程度地特异性吸附样品且非特异性地结合于固相。如果使用抗IgG的检测抗体,这些非特异性结合的免疫球蛋白也将被识别且结合。此导致了增高的背景信号以及降低的灵敏度。
降低背景信号的一种方法是修饰固相以避免免疫球蛋白的非特异性结合以及使用特定的缓冲添加剂,其也试图阻止免疫球蛋白结合于固相(实例:HydroGelTM固相(Perkin Elmer)、FastTM Slides(Schleicher & Schüll)、去污剂、离液盐)。固相的修饰是困难且昂贵的。此外,已显示缓冲添加剂可降低一些抗体的反应性而因此降低信号。由非特异性结合的免疫球蛋白诱发的背景信号提高了空白值,其使得尤其在小型测试系统中检测某些免疫球蛋白类型的特异性抗体更加困难,如阵列形式的免疫测定,其在一个反应容器的一些不同测试形式的情形中包含多个特异性测试。固此,例如某些去污剂的添加能抑制抗体的非特异性结合,但同样的去污剂在同样的阵列系统另外的测试中可能没有作用或甚至有反作用。
EP0222146B1中公开了凝血因子C1q的用途,其为具有在免疫测定中降低背景信号的进一步可能性的第一补体成分的亚单位。结合于支持物的蛋白C1q此处用于通过体外免疫吸收方法体外从血液中选择性地除去循环的免疫复合物,其中结合于蛋白C1q的免疫复合物通过分离固相而从体液中分离。US5698449A1中公开了用于选择性地从血液中除去免疫复合物以及用于检测和定量免疫复合物的C1q片段。在另外的US4062935A1中记载了添加类风湿因子或C1q至样品以及所得免疫复合物的结合和定量。然而,此处记载的现有技术没有显示任何用于阵列形式免疫测定的应用。
阵列形式免疫测定的一个特征在于固相。在所述方法中,固相优选由已定位的测试区组成,所述测试区包括确定的、离散的固相区域,且优选通过插入区而与其他测试区空间隔离。定义为点的这些已定位的测试区优选具有10μm至1cm的直径且尤其优选100-200μm的直径。优选具有一些测试区的固相,其也称作阵列系统。所述阵列系统例如在Ekins和Chu(Clin.Chem.37(1995),1955-1967)以及美国专利5,432,099、5,516,635和5,126,276中描述。阵列系统具有可对一个样品同时进行多个分析测定的优点。因此,可以应用多个结合配偶体如抗原-特异性抗体至测试区。该阵列系统的固相可优选包被EP0939319(Hornauer等)公开的链亲合素或亲合素。样品组分以及尤其是非特异性IgG可结合于所有这些固相。在这里使用通用缓冲添加剂以降低背景信号是不可能的或者由于每个单独的结合配偶体需要非常特定的缓冲添加剂,其只有在付出大量努力时才是可能的。对一种结合配偶体具有积极作用的缓冲添加剂可能甚至对其他配偶体具有不利作用。对大量不同的结合配偶体修饰固相支持物也是非常困难的。因此当几个至许多不同的测试组合在一个阵列固相上时,在实际努力程度下使用上述方法以优化空白值是不可能的。
因此,目的在于开发一种以阵列形式执行免疫测定以检测抗原-特异性抗体的方法,其很大程度上避免了现有技术的不足以及尤其是降低了因非特异性结合的免疫球蛋白引起的背景信号。
发明内容
该目的通过本发明的方法实现,该方法通过阵列形式的免疫测定检测样品中特定免疫球蛋白类型的抗原-特异性抗体,所述免疫测定中多种结合配偶体Bnx结合在支持物的不同的离散的区域,每种情况下的Bnx包含能特异结合所检抗体的多种抗原,该方法包括将样品和携带标记的结合配偶体B2与支持物一起孵育,随后检测各个离散的区域上的标记,其中B2特异性结合于已以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体。
其令人惊奇的结果为按照本发明B2的使用提供了在阵列形式的免疫测定点中某些免疫球蛋白类型的抗原-特异性抗体的高灵敏度。按照本发明B2的使用导致主要是已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体的特异性结合。在这方面,B2优先识别阵列形式的免疫测定中更致密地结合于点上的抗原-特异性抗体,而非特异性结合于固相的免疫球蛋白检测不到或仅达到可忽略的程度。
本发明的方法包括步骤:
-提供在多个离散的区域上具有包被的测试区的阵列测试支持物,每个测试区包含能特异性结合所检抗体的多种抗原Bnx,
-将包含所检分析物,优选抗原-特异性抗体的样品与测试区一起孵育,
-除去过量的免疫球蛋白,
-与带有标记的且仅与已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体特异性结合的结合配偶体B2一起孵育,
-检测结合于所检分析物的结合配偶体B2。
本发明的另一个主题为结合配偶体B2在用于检测抗原-特异性抗体的阵列形式的免疫测定中降低空白值的用途,所述结合配偶体B2带有标记且特异性结合于已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体。
本发明方法中抗体优选用作结合配偶体B2,其特异性结合已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体。抗体包含一个或优选几个针对所需确定的抗原-特异性抗体的结合位点(也称为抗原互补位,抗原决定簇或结合位点),即与所需确定的IgG抗体发生特异性免疫反应的结构。B2优选结合以高密度存在于阵列形式的免疫测定点上的某些免疫球蛋白类型的聚集的和/或寡聚的特异性结合的抗体。非特异性结合于固相支持物的抗体(其主要单独存在或松散分布)未由B2检测到或仅达到可忽略的程度。
现有技术中已多次描述免疫复合物-特异性抗体用于检测免疫球蛋白。免疫复合物-特异性抗体为类风湿因子样抗体,其优选结合聚集的或寡聚的免疫球蛋白,但不结合单体的免疫球蛋白。EP1098198(Berti等)公开了一种在酶免疫测定中人IgG抗体定性或定量测定的方法。该情形中使用特异结合于已结合特异性抗原的人IgG抗体的单克隆抗体。当抗原结合于特异性抗体时形成新的表位或结合位点(称为新-表位)。然而,该文献描述的方法中需要注意的是选择性结合于IgG分子与信号损失相关联。此外,没有显示例如尤其在阵列形式的免疫测定中所需的自动化系统的应用。该方法中没有描述因抗体非特异性结合于固相引起的背景信号的降低。
在本发明的方法中,对结合抗原-特异性抗体具有低亲和性的抗体优选用于B2。抗体对表位的亲和性定义为抗体上各个抗原结合位点与各个表位之间所有非-共价相互作用的强度。低亲和性的抗体结合弱且很快解离而高亲和性抗体结合更强且维持更长时间的结合。结合位点的亲和性例如在具有多个重复抗原决定簇的复杂抗原和具有几个结合位点的互补抗体的情形中并不总是反应抗原-抗体相互作用的真实强度。在一个位点的抗原和抗体的抗原结合位点(或表位)的相互作用提高了该同样的抗体第二个抗原结合位点的反应可能性,其导致反应配偶体的交联。多价抗体和抗原间的多重反应强度称为亲合力。例如在五聚体免疫球蛋白IgM情形中高亲合力补偿了低亲和性。在本发明的方法中,优选使用对抗原-特异性抗体具有低亲和性的抗体,其具有一些,即至少两个,优选至少四个且特别优选十个和更多的抗原互补位,如相互交联的免疫球蛋白IgM或IgG免疫球蛋白。此类实例有类风湿因子,其通常由IgM分子以及较少见由IgG、IgA和IgE分子组成。类风湿因子与抗体的Fc部分反应。
本领域技术人员了解可以通过由Langmuir模型确定的亲和系数而确定结合配偶体,优选抗体的亲和性的值。预测非常高亲和性的亲和系数为约10-9-10-11,中等亲和性的亲和系数为约10-8,低亲和性的亲和系数为约10-7,非常低的亲和性的亲和系数为约10-6。本发明的结合配偶体B2具有低的亲和性,亲和系数为约10-7-10-8,这是通过分析研究中的反应确定的。
如果使用结合配偶体B2的所述低亲和性抗体,则B2仅识别致密结合在点上的阵列形式的免疫测定的抗原-特异性抗体。松散并且不均一分布的非特异性结合在固相上的免疫球蛋白将检测不到或仅达到可忽略的程度。
如果所检的特异结合的抗体例如由于样品非常稀而未以特定密度存在于点中,就可使用B2抗体,其特异性结合于已经特异性结合了抗原的抗体。当抗原结合于特异性抗体,就很明显地形成新的表位或结合位点(称为新-表位)。所述针对抗原结合抗体的抗体例如在EP1098198中公开。根据本发明的情形,可通过B2结合于已经以抗原-特异性方式结合的抗体而暴露新-表位。在非特异性结合于固相的抗体情形中未形成此新-表位-特异性键,而只在已结合于阵列形式免疫测定点的抗原-特异性抗体情形中形成。
在本发明的方法中,也可优选使用B2的抗体片段以结合抗原-特异性抗体。抗原的片段化为本领域技术人员所知且以常规方法进行。根据其有用性的抗体片段的选择以针对完整抗体的同样方式进行。抗体片段由能选择性地与某些蛋白质反应的抗体分子的蛋白水解切割或重组产生的组分组成。蛋白水解切割和/或重组产生的片段的实例为Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv和包含V[L]和/或V[H]域以及肽接头的单链抗体(scFv)。scFv’s可共价或非-共价结合形成具有两个或更多结合位点的抗体。本发明还包含多克隆或单克隆抗体或抗体的其他纯化制剂以及重组产生的抗体。
在本发明的方法中,优选对B2使用单克隆人抗体<H-Agg.-IgG>M3.022.5-IgG-Dig。该IgM免疫球蛋白类型的抗体具有类风湿抗体常见的分类特性,即由于其仅识别阵列形式免疫测定的点上致密填塞的抗原-特异性抗体,其优先强结合已经以抗原-特异性方式结合的IgG免疫球蛋白类型的抗体。抗体<H-Agg.-IgG>M3.022.5-IgG-Dig的特征在于导致空白值的非特异性结合于阵列固相的非抗原特异性的免疫球蛋白未被识别或仅达到可忽略的程度。<H-Agg.-IgG>M3.022.5-IgG-Dig的使用显著降低了阵列上的背景信号且将其设置为样品至样品间的恒量。
此外,可对B2使用源自小鼠、绵羊或其他物种的免疫球蛋白类型IgM或IgG的单克隆抗体(MAB)。这些是本领域技术人员所知的。也可使用不同物种来源的多克隆抗体(PAB),前提是所有的情形中只有已经以抗原-特异性方式结合的抗体可被识别而非特异性结合于固相的抗体不被识别。
因此本发明的另一个主题为降低阵列形式的免疫测定中空白值的方法,特征在于使用结合配偶体作为B2,其特异性结合已经以抗原-特异性方式结合的特定免疫球蛋白类型的抗体。
抗体B2的普遍使用使得几个至大量不同的测试能组合在阵列固相上。该方面的最大优点是只需要简单的和通用的缓冲组合物。在本发明实施例2中,2个间接测试形式的测试与高灵敏度的夹心测定法TSH测试组合。TSH(甲状腺刺激激素)为参与甲状腺功能调节的激素。当TSH以夹心形式检测时,使用针对该抗原的标记的抗体。
TSH测试需要对灵敏度的高要求;第三代测试可检测最高达10-14M的浓度。该高灵敏度显著受背景信号的影响,其应当尽可能的低以及优选为零。如果背景信号提高,则区分低浓度和引起灵敏度损失的背景将是不可能的。因此,TSH测试为优化空白值的理想测定参量。
测试过程中对结合配偶体B2使用抗IgG的抗体如单克隆抗体<H-IgG PAN>M-R10Z8E9-IgG-Dig。在TSH测试中以及未应用点的聚苯乙烯支持物的对照位点利用该抗体测定到高的背景信号。另外在两个间接测试形式Jo-1和Sc170中利用该抗体,阴性对照和阴性干扰样品产生甚至更高的背景信号。
抗体<H-IgG PAN>M-R10Z8E9-IgG-Dig为可从不同公司获得的商业化抗-人IgG抗体的实例。例如Birmingham大学的MAB R10Z8E9识别所有抗-人IgG的亚类。此外,特异性针对小鼠所有亚类的MAB<h-IgG>从Pierce Order No.37300ZZ获得,且识别小鼠亚类IgG1、2和3的MAB<h-IgG>可从Calbiochem,Order No.411128获得。
令人惊奇地发现通过使用结合配偶体B2,例如针对聚集的IgG的本发明抗体<H-Agg.-IgG>M3.022.5-IgG-Dig,可将非特异性结合降至背景信号在高灵敏度的TSH夹心测定法和间接测试形式中降低至令人满意的程度。利用该结合配偶体B2,背景信号得到相当程度的降低或甚至在对照“背景总体”、阴性对照和阴性干扰样品中不再存在。
在本发明的方法中,阵列形式的免疫测定中应用多个结合配偶体(Bnx),其中每种情形的Bnx包含不同的抗原,其能特异性结合于所检抗体。该方法也称为间接测试形式或抗原-下降形式。在本发明的方法中,阵列优选由金属、玻璃、塑料或聚苯乙烯制成的支持物组成。聚苯乙烯支持物优选用于本发明的方法中,其为本领域技术人员所知且例如在EP0939319(Hornauer等)中描述。
结合配偶体固定在支持物的离散的区域,其定义为相互空间隔离的测试区。包含含有同样结合配偶体Bnx的一个或多个点的测试区优选存在于支持物上,例如可以形成包含由几个相同的点组成的线。固定结合配偶体Bnx的方法为本领域技术人员熟知且例如在EP0939319(Hornauer等)中公开。此处描述的方法涉及提供空间严格限定的用于结合测定的测试区的方法。对于分析物可靠的定性和定量检测,以可重复的方式以及以受体分子的精确定量产生结合测定的测试区是必要的。EP0939319(Hornauer等)描述了通过应用多层包被物就可能获得空间严格限定的用于结合测定的测试区。包被物包括在固相支持物的试剂区应用预包被物,洗涤预包被的支持物且应用包括能结合于预包被物的受体分子的第二包被物。预包被物优选包含高亲和性结合对的第一配偶体如链亲合素、亲合素或生物素以及上述物质的类似物、衍生物和偶联物或抗体如抗-小鼠抗体。然而,可应用共价结合于第二包被物(如包含胺、硫化物或甲硅烷基的分子)的分子作为预包被物。此外,在EP0939319(Hornauer等)中显示可再生的、均一的测试点可通过用低离子强度的缓冲液洗涤预包被的支持物而获得。将包含能结合预包被物的受体分子的第二包被物应用至已洗涤的以空间限定的区域的形式存在于试剂区的预包被物。受体分子优选包含结合对的第二配偶体,其能经受高亲和性的相互作用,例如免疫反应、链亲合素/亲合素的相互作用或类似的或者与用作预包被的结合对的第一配偶体共价结合。因此例如链亲合素或亲合素可用作预包被物而受体分子包含生物素组分。
在本发明的方法中,整个测试区所有结合配偶体或所检抗原的总数定义为Bnx(Bnx=Bn1+Bn2+Bn3,…等等)。因此每个测试区包含某种类型的Bnx,例如测试区1包含抗原Bn1的结合配偶体,测试区2包含抗原Bn2的结合配偶体,测试区3包含抗原Bn3的结合配偶体,等等。因此每个测试区并不包含不同抗原Bnx的混合物,而是包含结合配偶体的特定类型。特定结合配偶体可存在于数个测试区,例如在一行中,以使存在几个同样的点。如果需要也可以使用混合的点,即测试区中包含不同的抗原。因此由于能与多个结合配偶体(Bnx)特异性结合的抗原-特异性抗体仅可用一个结合配偶体B2检测,本发明的方法提供一种通用的检测方法。
在本发明的实施例中,例如检测到抗-核抗原Jo-1和Sc170的自体抗体。抗Jo-1的抗体直接抗组氨酰-tRNA合成酶,而Sc170为硬皮病的标记。
抗核抗体(ANA)为抗例如在内脏红斑狼疮中称为LE因子的各种细胞组分的自身抗体。抗核因子(ANF)的特异性是非常不同的;至今已知超过30种与ANF反应的抗原。此为本领域技术人员熟知且例如在Biotest-免疫学字典第145页描述。本发明的方法也可用于检测自身抗体,即一般的自身免疫抗体和抗-甲状腺抗原、抗-胰岛细胞抗原等等。此外,该方法也可测定特定病原体如弓形体病、风疹和衣原体感染的抗体。
在本发明的方法中通过本领域技术人员已知的方法检测结合配偶体B2。为此,将标记结合于结合配偶体B2。可以使用所有为本领域技术人员熟知的标记,其允许点的位点特异性标记。优选将直接可检测到的物质用作标记如化学发光物质、荧光物质或放射性物质或金属溶胶、乳胶或金颗粒。标记结合配偶体B2的方法为本领域技术人员所熟知且此处不需进一步的说明。通过测定化学发光物质、荧光物质或放射性物质,或金属溶胶、乳胶或金颗粒以已知的方式直接检测标记,且在US0017616(Karl等)、0304202B1、EP0736176B1、EP0608370B1(Ekins等。)、EP0939319(Hornauer等)中描述。
标记也可间接检测。这种情形下另一种的自身依次偶联至信号-生成基团的结合配偶体特异性结合于B2的标记例如象地高辛的半抗原。信号-生成基团,例如化学发光物质、荧光物质或放射性物质或酶或金颗粒通过本领域技术人员熟知的方法检测。例如可使用特异性结合于B2的标记的抗体或抗体片段作为进一步的结合配偶体,例如针对地高辛或半抗原的抗体。
在本发明的方法中,结合配偶体Bnx结合于固相。在该情形下Bnx可直接结合于固相。Bnx通过本领域技术人员已知的方法直接结合于固相。Bnx也可通过特异性结合系统间接结合于固相。该情形下Bnx为包含抗原和异性结合系统的反应配偶体的偶联物。该情形下特异性结合系统理解为能相互特异性反应的两种配偶体。该情形下其结合能力可以基于免疫反应或另外的特异性反应。该反应配偶体以及其在免疫测定中用特异性抗原或抗体包被测试支持物的用途是本领域技术人员已知的。优选将生物素和亲合素或生物素和链亲合素的组合作为特异性结合系统。其他优选的组合为生物素和抗生物素、半抗原和抗半抗原、抗体的Fc片段和抗该Fc片段的抗体或碳水化合物和凝集素。该特异性结合对的一个反应配偶体为形成结合配偶体Bnx的偶联物的一部分。该特异性结合系统的另一个反应配偶体结合于支持物。可使用本领域技术人员已知的常规方法将该特异性结合系统的另一个反应配偶体结合于支持物。该情形下共价结合和吸附性结合是适用的。
所有本领域技术人员已知的生物流体均可用作样品。可优选体液如全血、血清、血浆、尿、唾液、分泌液等等用作样品。
除样品外,固相和上述受体测试混合物可包含应用所需的添加剂如缓冲液、盐、去污剂、蛋白添加剂如BSA。所需的添加剂为本领域技术人员所知或可以简单的方式由其找出。
此外,本发明涉及通过阵列形式的免疫测定检测样品中某些免疫球蛋白类型的抗原-特异性抗体的检测试剂盒,其包含其上不同的离散的区域结合了各种结合配偶体Bnx的支持物、各个分离容器中的检测试剂以及带有标记的结合配偶体B2,所述结合配偶体B2特异性结合于已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体。检测试剂盒还包含对照和标准品以及在一种或多种包含本领域技术人员已知的常用测试添加剂如缓冲液、盐、去污剂等等的溶液中的试剂。
具体实施方式
本发明通过下列实施例进一步说明。
实施例1
具有类风湿因子样特异性的单克隆小鼠IgM抗体的生产
免疫原:H-IgG聚合物
10mg人IgG1(Sigma Company)溶解于0.6ml 25mM pH9.5的碳酸氢盐缓冲液中。加入3.5μl 12.5%戊二醛溶液后,室温孵育两小时。随后冰浴冷却,用50mM pH8.0的三乙醇胺溶液调节至pH8.3且加入0.15ml新鲜制备的氢化硼钠溶液(8mg氢化硼/ml水)。0℃下2.5小时后制备物用10mM pH7.5的磷酸钾缓冲液/0.2M NaCl在4℃透析16小时。包含IgG聚合物的透析液等分保存于-80℃或用于免疫和杂交瘤细胞培养物上清液中特异性的测试。
以类似的方式从人IgG3(Sigma Company)生产H-IgG3聚合物。
小鼠的免疫
12周龄的雌性Balb/c小鼠用100μg H-IgG1或IgG3聚合物以及佐剂CFA(完全弗氏佐剂)经腹膜首次免疫。8天后用CFA中100μg的各IgG聚合物进行再次免疫。初始免疫后13天,200μg的各IgG聚合物不带佐剂经腹膜给药,初始免疫后14和15天,经腹膜和经静脉各给药100μg。16天后进行融合。
杂交瘤克隆的产生
融合和克隆
根据Galfré,Methods in Enzymology 73,1981,3的方法,免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。约1×108免疫小鼠的脾细胞与2×107骨髓瘤细胞(P3X63-Ag8-653,ATCC CRL 1580)混合且离心(4℃ 300g 10min)。细胞随后用无胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基洗涤一次且再次在50ml锥形试管中400g离心。加入1ml PEG(聚乙二醇)(分子量4000,Merck,Darmstadt)且用吸管混合。37℃水浴1min后,逐滴加入5ml无FCS的RPMI 1640,混合,用培养基(RPMI1640+10%FCS)加至50ml而随后离心。沉淀的细胞加入含有10%FCS的RPMI 1640培养基且分散于次黄嘌呤重氮丝氨酸选择培养基中(RPMI1640+10%FCS中100mmol/l的次黄嘌呤,1μg/ml的重氮丝氨酸)。白介素6(100U/ml)作为生长因子加入培养基。约10天后,测试原代培养物的特定抗体的合成。通过96孔细胞培养板中荧光-激活细胞分选器克隆显示与聚集的人IgG1阳性反应而不与单体的IgG交叉反应的原代培养物。白介素6(100U/nl)作为生长添加剂加入培养基中。
以以下方式获得下列杂交瘤克隆:
表
MAB名称 | 免疫原 | 亚类特异性 |
MAB<H-Agg.-IgG>M-3.022.5-IgM | H-IgG1聚合物 | IgG1>IgG3>IgG4>IgG2 |
MAB<H-Agg.-IgG>M-1.010.2-IgM | H-IgG1聚合物 | IgG1>IgG3>IgG4>IgG2 |
MAB<H-Agg.-IgG>M-1.1.7-IgM | H-IgG3聚合物 | IgG1>IgG3>IgG2>IgG4 |
对聚集的人IgG具有特异性的单克隆抗体的筛选试验。
用生物素化的人IgG1或IgG3包被链亲合素包被的MTP。随后在细胞培养物上清液中与单克隆抗体一起孵育。此后结合的抗体以利用抗-鼠-IgM-POD的常规方法通过与POD底物反应而检测。
利用结合于固相的人IgG检测亚类特异性
为了检测杂交瘤细胞培养物上清液中抗体的特异性,重组的链亲合素(MicroCoat Company,Order No.12-K96N)包被的MTP用1μg/ml亚类1或2或3或4的生物素化的h-IGG(=H-IGG-Bi)在孵育缓冲液中包被。由于IgG通过生物素结合于固相表现得类似于聚集的、聚合的IgG,该试验方法可用于测定亚类的特异性。对此,每孔100μlH-IgG-Bi溶液室温振荡孵育60分钟随后用0.9% NaCl/0.05%Tween20洗涤3次。
接下来的步骤中,所需检测的100μl抗体溶液(培养物上清液)加至已包被的孔且室温振荡孵育1小时。用0.9% NaCl/0.05%Tween20洗涤3次后,加入100μlPOD-标记的来自于山羊抗小鼠IgM(Dianova Company,Order No.115-036-075,使用0.16μg/ml孵育缓冲液的浓度)的多克隆抗体(Fab’)2的片段以检测样品中的结合抗体,该样品室温振荡孵育1小时随后用0.9% NaCl/0.05%Tweenz20洗涤3次。
最后,加入100μl/孔ABTS底物(Roche Diagnostics GmbH,Order No.1684302)且室温下30分钟后在Dynatech公司的MR700Microplate读数器上测定405/492nm处的吸光度。
孵育缓冲液:40mM磷酸钠,pH7.4
200mM酒石酸钠
0.1%Tween 20
0.2%牛血清白蛋白
与单体人IgG1的反应性/交叉反应的检测
为了检测与单体的非聚集H-IgG1的反应性/交叉反应,所检的单克隆抗体在上述测试中与浓度增加的或过量的单体、非聚集的IgG1一起预孵育。如果检测的信号保持高水平未变,则无交叉反应。如果检测的信号降低,则出现交叉反应。
用重组链亲合素包被的微量滴定板(MTP)(MicroCoat Company,Order No.12-K96N)在孵育缓冲液中用1μl生物素化的H-IgG1(=H-IgG1-Bi)包被。每孔使用100μlH-IgGl-Bi溶液且室温振荡孵育60分钟随后用0.9%NaCl/0.05%Tween20洗涤3次。
测试交叉反应的单克隆抗体与最高达1μg/ml的系列浓度的单体、非聚集IgG1一起预孵育。预孵育在未包被的96-孔MTP中室温振荡进行1小时。
接下来的步骤中100μl该溶液(抗体+过量非聚集的单体IgG1)加至包被的孔且室温振荡孵育1小时。用0.9%NaCl/0.05%Tween20洗涤3次后,加入100μlPOD-标记的来自山羊抗小鼠IgM(DianovaCompany,Order No.115-036-075,使用0.16μg/ml孵育缓冲液的浓度)的多克隆抗体的(Fab’)2片段以检测样品中的结合抗体,该样品室温振荡孵育1小时随后用0.9% NaCl/0.05% Tween20洗涤3次。
最后,加入100μl/孔ABTS底物(Roche Diagnostics GmbH,Order No.1684302)且室温下30分钟后在Dynatech公司的MR700Microplate读数器上测定405/492nm处的吸光度值。
适于本发明的单克隆类风湿因子样结合抗体识别所有的人IgG亚类且在竞争实验中呈现与单体H-IGG少于10%的交叉反应。如果H-IgG1聚合物用于检测反应性,测定的信号显著降低。表1显示了所发现的单克隆抗体的主要特性。
发酵杂交瘤克隆以分离单克隆抗体
获得的杂交瘤细胞以每毫升1×105细胞的密度分散于包含10%FCS的RPMI 1640培养基中且发酵罐(Thermodux Company,Wertheim/Main,model MCS-104XL,Order No.144-050)中增殖7天。在培养物上清液中达到每毫升100μg单克隆抗体的平均浓度。
单克隆MAB<H-Agg.-IgG>M-3.022.5-IgM的分离
70g精细研磨的聚乙烯乙二醇6000(Merck Company)在室温加入包含>50μg/ml发酵的单克隆IgM的1L培养物上清液中。45分钟后沉淀的IgM通过离心沉淀且溶解于50mlTRIS缓冲液(20mM TRIS/0.2MNaCl/25mM甘氨酸/2%蔗糖,pH8)中。IgM利用6.5%聚乙二醇6000二次沉淀且通过离心沉淀。沉淀物溶解于5ml TRIS缓冲液中且用同样的缓冲液透析。
透析液离心至澄清且经具有350ml床体积的Superose 6柱(Amersham Biosciences Company)色谱分析。操作缓冲液为75mMHEPES/0.25M NaCl/3%蔗糖。合并具有9000000分子量的IgM峰的级分且通过超滤法浓缩至5mg/ml。IgM溶液等分保存在-80℃。
生物素化H-IGG(=H-IgG-Bi)的制备
5mg溶解于2ml 0.1M pH8.3磷酸钠缓冲液的亚类1或2或3或4(Sigma Company)的H-IgG与50μl 2.67mM生物素氨基-3,6-二氧杂辛氨基羰基庚酸-N-羟基丁二酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液混合且25℃搅拌60分钟。IgG和活化的生物素比率为1∶4。形成的IgG-Bi在4℃用pH7.5的20mM磷酸钾缓冲液/0.1M NaCl/3%蔗糖透析。透析的IgG-Bi等分保存在-80℃。
MAB<H-Agg.-IgG>M-3.022.5-IGM-地高辛(IgM-Dig)的制备
5mg MAB<H-Agg.-IgG>M-3.022.5-IgM用pH8.6的0.1M
磷酸钠缓冲液调至总体积2ml。50μl 1.11mM的地高辛-3-0-甲基-羰基-ε-氨基己酸-N-羟基丁二酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液加至该溶液且随后25℃搅拌60分钟。IgM和活化的地高辛比率为1∶10。形成的IgM-地高辛用pH7.5的20mM磷酸钾缓冲液/0.1M NaCl/3%蔗糖透析。透析的IgM-Dig等分保存在-80℃。
实施例2
链亲合素包被应用于在黑染的聚苯乙烯支持物上约2.5×6mm测试区的整个区域。包含生物素化抗原的每条约20个均一点的线以喷墨(ink-jet)方法应用于测试区;每个点的直径约150μm。随后样品用样品稀释缓冲液以1∶10的比率稀释且40μl稀释的样品人工移至阵列的各个测试区中。剩下的测定过程在实验室的试验台洗涤器-培养箱上进行。
使用下列测试-特异性试剂:
样品稀释缓冲液:50mM Tris,pH7.6;150mM NaCl;0.1%去污剂(聚癸醇);
0.6%BSA;0.2%防腐剂(oxypyrion和盐酸甲基异噻唑啉酮(MIT))
洗涤缓冲液:10mM Tris,0.01%聚癸醇,0.001%oxypyrion,0.001%MIT
样品:人血清,阳性样品商业可得;阴性样品为内部供体
使用天然的Jo1和天然的Sc170作为生物素化抗原。以间接的检测形式检测这些抗核抗原的自身抗体。100μg/ml各自的生物素化抗原用于每个点的溶液中。此外还在样品中进行TSH测试以验证该创造性的优点。TSH测试对检测系统的灵敏度具有最高的要求,因此是优化空白值的理想参数。
测试过程的说明:
样品37℃孵育6min。吸出样品且用洗涤缓冲液洗涤测试区后,其与标记了地高辛的抗体即结合配偶体B2在37℃一起孵育3min,随后洗涤。与荧光标记的<Dig>抗体37℃一起孵育3min且随后洗涤和抽干测试区后,通过CCD相机检测信号。样品用样品稀释缓冲液1∶10稀释用于测量。
表2:使用单克隆人抗体<H-IgG PAN>M-R10Z8E9-IgG-Dig时的检测结果:
点测定形式 | MAB<TSH>夹心 | Jo-1间接 | Sc170间接 | 背景总体 |
阴性对照 | 406 | 2123 | 25 | 226 |
阴性干扰样品 | 293 | 3107 | 59 | 660 |
Jo-1阳性9501 | 763 | 26551 | 0 | 272 |
Sc170阳性5510 | 161 | 716 | 10654 | 401 |
通过使用单克隆抗体<H-IgG PAN>M-R10Z8E9-IgG-Dig达到表2中所显示的信号。使用该抗体时,在TSH测试中以及聚苯乙烯支持物的位置上(其未应用点(“背景总体”,表2的右栏))发现极高的背景信号。在两个间接测试形式Jo-1和Sc170中阴性对照和阴性干扰样品使用该抗体也显示甚至更高的背景信号。作为这些非常高背景信号的结果,由于弱阳性样品的低信号被背景信号覆盖,因此测定低浓度分析物是不可能的。作为结果,使用抗体<H-IgG PAN>M-R10Z8E9-IgG-Dig的测试的灵敏度不足以常规的诊断试验应用。
表3:使用单克隆人抗体<H-Agg.-IgG>M3.022.5-IgM的检测结果
点测定形式 | MAB<TSH>夹心 | Jo-1间接 | Sc170间接 | 背景总体 |
阴性对照 | 29 | 364 | 7 | 38 |
阴性干扰样品 | 4 | 449 | 21 | 41 |
Jo-1阳性9501 | 0 | 28487 | 0 | 74 |
Sc170阳性5510 | 0 | 41 | 9623 | 54 |
通过使用抗体Mab<H-Agg.-IgG>M3.022.5-IgM达到表3中所显示的信号。该试验中,背景信号显著降低且样品和样品间为一致的水平,灵敏度达到了期望的限度。在夹心测定(TSH)和间接测试(Jo-1和Sc170)中非特异性结合不再检测到或在阴性对照和阴性干扰样品中仅达到可忽略的程度。并且“背景总体”的背景信号也通过该抗体得到相当程度的降低。
Claims (10)
1.通过阵列形式的免疫测定检测样品中特定免疫球蛋白类型的抗原-特异性抗体的方法,所述免疫测定中多种结合配偶体Bnx结合在支持物的不同的离散的区域,每种情况下的Bnx包含能特异性结合所检抗体的多种抗原,该方法包括将样品和携带标记的结合配偶体B2与支持物一起孵育,随后检测各个离散的区域上的标记,其特征在于结合配偶体被用作B2,其特异性结合于已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体,而非特异性结合于固相的免疫球蛋白检测不到或仅达到可忽略的程度。
2.权利要求1的方法,特征在于B2为抗体。
3.权利要求2的方法,特征在于B2为新-表位-特异性抗体。
4.权利要求2的方法,特征在于B2为具有低亲和性的抗体,其具有至少两个,优选至少四个且特别优选十个和更多的抗原互补位。
5.以上权利要求1-4任一项的方法,特征在于生物素/链亲合素、生物素/亲合素、半抗原/抗半抗原、抗体的Fc片段/抗该Fc片段的抗体或碳水化合物/凝集素被用作将Bnx结合于固相的特异性结合系统。
6.以上权利要求1-5任一项的方法,特征在于结合配偶体B2用化学发光物质、荧光物质或放射性物质标记。
7.在阵列形式的免疫测定中降低空白值的方法,特征在于将结合配偶体用作B2,其特异性结合于已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体。
8.结合配偶体B2在用于检测抗原-特异性抗体的阵列形式的免疫测定中降低空白值的用途,所述结合配偶体B2带有标记且特异性结合于已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体。
9.权利要求8的结合配偶体B2的用途,特征在于B2为新-表位-特异性抗体或具有至少两个,优选至少四个且特别优选十个和更多的抗原互补位的低亲和性的抗体。
10.用于通过阵列形式的免疫测定检测样品中某些免疫球蛋白类型的抗原-特异性抗体的试剂盒,其包含其上不同的离散的区域结合多种结合配偶体Bnx的支持物、各个分离容器中的检测试剂以及带有标记的结合配偶体B2,所述结合配偶体B2特异性结合于已经以抗原-特异性方式结合的某些免疫球蛋白类型的抗体。
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