JP2020508983A5 - - Google Patents
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Description
そうでないことが明確に示されていない限り、２つ以上の工程または行為を含む本特許請求の範囲に記載の任意の方法において、方法の工程または行為の順序は方法の工程または行為が記載されている順序に限定されないことも理解されるべきである。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
膜中に配置された修飾セクレチンナノポアであって、前記修飾セクレチンナノポアはシス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含み、前記内腔表面が１つ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾セクレチンナノポア。
［２］
前記１つ以上のアミノ酸修飾が、荷電改変修飾を含む、上記［１］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［３］
前記荷電改変修飾が、正に荷電したアミノ酸での負に荷電したアミノ酸の置換である、上記［２］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［４］
前記１つ以上のアミノ酸修飾が、疎水性アミノ酸での中性アミノ酸の置換を含む、上記［１］または［２］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［５］
前記シス開口部が、６０Å〜１２０Åの範囲の直径を有する、上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［６］
前記トランス開口部が、４０Å〜１００Åの範囲の直径を有する、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［７］
前記セクレチンナノポアが、約７．５Å〜２５Åの直径を有する狭窄部を含む、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［８］
前記セクレチンがＩＩ型分泌系である、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［９］
前記セクレチンがＧｓｐＤである、上記［８］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１０］
配列番号３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含むサブユニットポリペプチドを含む、上記［９］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１１］
配列番号３４または３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記［９］または［１０］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１２］
前記ＧｓｐＤがキャップゲートを含まない、上記［９］〜［１１］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１３］
前記ＧｓｐＤの中央ゲートが、アミノ酸をより小さな側基を有するアミノ酸で置換するように、かつ／または負に荷電したアミノ酸を中性アミノ酸もしくは正に荷電したアミノ酸で置換するように修飾されている、上記［９］〜［１２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１４］
配列番号３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含むサブユニットポリペプチドを含み、（ｉ）Ｄ５５もしくはＴ５６〜Ｔ７７のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、Ｋ６０、Ｄ６４、Ｒ７１、およびＥ７３のうちの１つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに／またはＤ５５、Ｔ５６、Ｔ７７、およびＫ７８のうちの１つ以上がＰで置換され、かつ／あるいは（ｉｉ）Ｆ１５６がより小さいアミノ酸で置換され、Ｎ１５１および／またはＮ１５２がより小さいアミノ酸で置換され、Ｄ１５３が荷電していないアミノ酸で置換され、Ｇ１３７およびＧ１６５がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはＡもしくはＶで置換されている、上記［１３］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１５］
Ｙ６３〜Ｒ７１が欠失されおよび／またはＧＳＧもしくはＳＧＳで置換され、Ｆ１５６がＡで置換され、Ｄ１５３がＳで置換され、かつ／あるいはＮ１５１およびＮ１５２がそれぞれ独立してＧまたはＳで置換されている、上記［１４］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１６］
前記セクレチンがＩＶ型分泌系である、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１７］
前記セクレチンがＰｉｌＱである、上記［１６］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１８］
前記セクレチンがＩＩＩ型分泌系である、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１９］
前記セクレチンがＹｓｃＣである、上記［１８］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［２０］
前記セクレチンがＩｎｖＧである、上記［１８］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［２１］
（Ｎ１またはＮ０ドメインを有しないＩｎｖＧのアミノ酸配列に対応する）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記［２０］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［２２］
前記内腔表面が、前記内腔内の狭窄部をさらに画定し、前記狭窄部が、配列番号１のアミノ酸Ｄ２８、Ｅ２２５、Ｒ２２６、および／またはＥ２３１において１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変修飾）を有する、上記［２０］または［２１］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［２３］
前記狭窄部の前記１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変修飾）が、以下のうちの１つ以上を含む、上記［２２］に記載の修飾セクレチンナノポア：
ｉ．Ｄ２８Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ２２５Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉｉ．Ｒ２２６Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ｖ、
ｉｖ．Ｅ２２５の欠失、
ｖ．Ｒ２２６の欠失、および
ｖｉ．Ｅ２３１Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｋ。
［２４］
前記内腔表面が、アミノ酸Ｅ４１、Ｑ４５、またはＥ１１４において１つ以上のアミノ酸修飾を有する捕捉部分を含む、上記［２０］〜［２２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［２５］
前記捕捉部分が、以下のアミノ酸修飾のうちの１つ以上を含む、上記［２４］に記載の修飾セクレチンナノポア：
ｉ．Ｑ４５Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ４１Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、および
ｉｉｉ．Ｅ１１４Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ。
［２６］
（Ｎ１またはＮ０ドメインを有しないＩｎｖＧのアミノ酸配列に対応する）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドが、配列番号１のＤ２８、Ｅ４１、Ｅ１１４、Ｑ４５、Ｅ２２５、Ｒ２２６、およびＥ２３１から選択されるアミノ酸（複数可）において１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変アミノ酸修飾）を含む、修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド。
［２７］
前記１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変アミノ酸修飾）が、以下のうちの１つ以上を含む、上記［２６］に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド：
ｉ．Ｄ２８Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ２２５Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉｉ．Ｒ２２６Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ｖ、
ｉｖ．Ｅ２２５の欠失、
ｖ．Ｒ２２６の欠失、および
ｖｉ．Ｅ２３１Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｋ。
［２８］
以下のアミノ酸修飾のうちの１つ以上を含む、上記［２６］または［２７］に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド：
ｉ．Ｑ４５Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ４１Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、および
ｉｉｉ．Ｅ１１４Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ。
［２９］
（Ｎ１およびＮ０ドメインを含むＷＴ ＩｎｖＧのアミノ酸配列に対応する）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドが、配列番号２のＤ１９９、Ｅ２１２、Ｅ２８５、Ｑ２１６、Ｅ３９６、Ｒ３９７、およびＥ４０２から選択されるアミノ酸（複数可）において１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変アミノ酸修飾）を含み、かつ／またはエンドペプチダーゼ切断部位が配列番号２の１７０位と１７１位との間もしくは１７１位と１７２位との間に挿入されている、修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド。
［３０］
前記１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変アミノ酸修飾）が、以下のうちの１つ以上を含む、上記［２９］に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド：
ｉ．Ｄ１９９Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ３９６Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉｉ．Ｒ３９７Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ｖ、
ｉｖ．Ｅ３９６の欠失、
ｖ．Ｒ３９７の欠失、および
ｖｉ．Ｅ４０２Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｋ。
［３１］
以下のアミノ酸修飾のうちの１つ以上を含む、上記［２９］または［３０］に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド：
ｉ．Ｑ２１６Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ２１２Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、および
ｉｉｉ．Ｅ２８５Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ。
［３２］
配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含む、修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチド。
［３３］
配列番号３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記［３２］に記載の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチド。
［３４］
前記ＧｓｐＤがキャップゲートを含まない、上記［３２］または［３３］に記載の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチド。
［３５］
前記ＧｓｐＤの中央ゲートが、アミノ酸をより小さな側基を有するアミノ酸で置換するように、かつ／または負に荷電したアミノ酸を中性もしくは正に荷電したアミノ酸で置換するように修飾されている、上記［３２］〜［３４］のいずれか一項に記載の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチド。
［３６］
配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含み、（ｉ）Ｄ５５もしくはＴ５６〜Ｔ７７のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、Ｋ５９、Ｋ６０、Ｒ６３、Ｑ６６、Ｑ６９、Ｋ７１、Ｑ７４、およびＱ７５のうちの１つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに／またはＤ５５、Ｔ５６、Ｔ５７、およびＫ３９４のうちの１つ以上がＰで置換され、かつ／あるいは（ｉｉ）Ｆ１５７がより小さいアミノ酸で置換され、Ｎ１５２および／またはＮ１５３がより小さいアミノ酸で置換され、Ｄ１５４が荷電していないアミノ酸で置換され、Ｇ４５３およびＧ４８１がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはＡもしくはＶで置換されている、上記［３２］〜［３５］のいずれか一項に記載の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチド。
［３７］
Ｙ３７９−ＧＳＧ−Ｒ３８７またはＹ３７９−ＳＧＳ−Ｒ３８７、Ｆ４７２Ａ、Ｄ４６９Ｓ、Ｎ４６７Ｇ／Ｎ４６８Ｓ、Ｎ４６７Ｓ４６８Ｇ、Ｎ４６７Ｇ／Ｎ４６８Ｓ／Ｄ４６９Ｓである、上記［１４］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［３８］
上記［２６］〜［３１］のいずれか一項に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドまたは上記［３２］〜［３７］のいずれか一項に記載の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
［３９］
上記［２６］〜［３１］のいずれか一項に記載の複数の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドまたは上記［３２］〜［３７］のいずれか一項に記載の複数の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチドを含む、修飾セクレチンナノポア。
［４０］
９〜２０個の前記修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドを含む、上記［３９］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［４１］
各モノマーが、上記［２６］〜［３１］または［３２］〜［３７］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドである、上記［４０］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［４２］
異なるモノマーを含み、前記モノマーのうちの少なくとも１つが上記［２６］〜［３１］または［３２］〜［３７］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドである、上記［４０］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［４３］
セクレチンナノポアを含む膜が内部に配置された水溶液を収容するチャンバを含む装置であって、前記セクレチンナノポアがシス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含む、装置。
［４４］
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアであり、前記内腔表面が１つ以上のアミノ酸修飾を含む、上記［４３］に記載の装置。
［４５］
前記修飾セクレチンナノポアが、上記［１］〜［２５］および［３９］〜［４２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記［４４］に記載の装置。
［４６］
前記水溶液中に存在する分析物をさらに含む、上記［４３］〜［４５］のいずれか一項に記載の装置。
［４７］
前記分析物がポリヌクレオチドである、上記［４６］に記載の装置。
［４８］
前記ポリヌクレオチドに結合したポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、上記［４７］に記載の装置。
［４９］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはポリメラーゼである、上記［４８］に記載の装置。
［５０］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記膜の前記シス側にある、上記［４８］または［４９］に記載の装置。
［５１］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記シス開口部と接触または共有結合している、上記［５０］に記載の装置。
［５２］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記膜の前記トランス側にある、上記［４８］または［４９］に記載の装置。
［５３］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記トランス開口部と接触または共有結合している、上記［５２］に記載の装置。
［５４］
上記［４３］〜［４５］のいずれか一項に記載の装置を得ることと、分析物を前記膜の前記シス側または前記トランス側で前記水溶液に添加することと、を含む、方法。
［５５］
前記分析物がポリヌクレオチドである、上記［５４］に記載の方法。
［５６］
ポリヌクレオチド結合タンパク質を前記膜の前記シス側で前記水溶液に添加することをさらに含み、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記ポリヌクレオチドに結合する、上記［５５］に記載の方法。
［５７］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記シス開口部と接触もしくは共有結合しているか、または前記ナノポアのシス玄関部内にある、上記［５６］に記載の方法。
［５８］
ポリヌクレオチド結合タンパク質を前記膜の前記トランス側で前記水溶液に添加することをさらに含み、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記ポリヌクレオチドに結合する、上記［５５］に記載の方法。
［５９］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記トランス開口部と接触もしくは共有結合しているか、または前記ナノポアのトランス玄関部内にある、上記［５８］に記載の方法。
［６０］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはポリメラーゼである、上記［５４］〜［５９］のいずれか一項に記載の方法。
［６１］
前記膜にわたって電圧勾配を印加することによって前記ナノポアを通るイオン電流フローを誘導することをさらに含む、上記［５４］〜［６０］のいずれか一項に記載の方法。
［６２］
前記印加された電圧勾配下で前記ナノポアを通るイオン電流フローを検出することをさらに含む、上記［６１］に記載の方法。
［６３］
前記検出されたイオン電流フローに基づいて前記分析物の存在を決定することをさらに含む、上記［６２］に記載の方法。
［６４］
セクレチンナノポアおよび前記セクレチンナノポアのシスまたはトランス玄関部内に提供される酵素を含む、組成物。
［６５］
前記セクレチンナノポアが野生型セクレチンナノポアである、上記［６４］に記載の組成物。
［６６］
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアである、上記［６４］に記載の組成物。
［６７］
前記修飾セクレチンナノポアが、上記［１］〜［２５］および［３９］〜［４２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記［６６］に記載の組成物。
［６８］
前記ナノポアが、膜内に提供され、シス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する、上記［６４］〜［６７］のいずれか一項に記載の組成物。
［６９］
分析物の検出および／または特徴付けのための、セクレチンナノポアの使用。
［７０］
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアである、上記［６９］に記載の使用。
［７１］
前記修飾セクレチンナノポアが、上記［１］〜［２５］および［３９］〜［４２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記［７０］に記載の使用。
［７２］
試料中の分析物の有無を検出し、かつ／または試料中の分析物を特徴付ける方法であって、膜中に配置されたセクレチンナノポアを前記試料と接触させることと、前記膜にわたって電圧勾配を印加することと、前記ナノポアを通るイオン電流フローを検出することと、を含む、方法。
［７３］
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアである、上記［７２］に記載の方法。
［７４］
前記修飾セクレチンナノポアが、上記［１］〜［２５］および［３９］〜［４２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記［７３］に記載の使用。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
膜中に配置された修飾セクレチンナノポアであって、前記修飾セクレチンナノポアはシス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含み、前記内腔表面が１つ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾セクレチンナノポア。
［２］
前記１つ以上のアミノ酸修飾が、荷電改変修飾を含む、上記［１］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［３］
前記荷電改変修飾が、正に荷電したアミノ酸での負に荷電したアミノ酸の置換である、上記［２］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［４］
前記１つ以上のアミノ酸修飾が、疎水性アミノ酸での中性アミノ酸の置換を含む、上記［１］または［２］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［５］
前記シス開口部が、６０Å〜１２０Åの範囲の直径を有する、上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［６］
前記トランス開口部が、４０Å〜１００Åの範囲の直径を有する、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［７］
前記セクレチンナノポアが、約７．５Å〜２５Åの直径を有する狭窄部を含む、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［８］
前記セクレチンがＩＩ型分泌系である、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［９］
前記セクレチンがＧｓｐＤである、上記［８］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１０］
配列番号３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含むサブユニットポリペプチドを含む、上記［９］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１１］
配列番号３４または３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記［９］または［１０］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１２］
前記ＧｓｐＤがキャップゲートを含まない、上記［９］〜［１１］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１３］
前記ＧｓｐＤの中央ゲートが、アミノ酸をより小さな側基を有するアミノ酸で置換するように、かつ／または負に荷電したアミノ酸を中性アミノ酸もしくは正に荷電したアミノ酸で置換するように修飾されている、上記［９］〜［１２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１４］
配列番号３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含むサブユニットポリペプチドを含み、（ｉ）Ｄ５５もしくはＴ５６〜Ｔ７７のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、Ｋ６０、Ｄ６４、Ｒ７１、およびＥ７３のうちの１つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに／またはＤ５５、Ｔ５６、Ｔ７７、およびＫ７８のうちの１つ以上がＰで置換され、かつ／あるいは（ｉｉ）Ｆ１５６がより小さいアミノ酸で置換され、Ｎ１５１および／またはＮ１５２がより小さいアミノ酸で置換され、Ｄ１５３が荷電していないアミノ酸で置換され、Ｇ１３７およびＧ１６５がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはＡもしくはＶで置換されている、上記［１３］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１５］
Ｙ６３〜Ｒ７１が欠失されおよび／またはＧＳＧもしくはＳＧＳで置換され、Ｆ１５６がＡで置換され、Ｄ１５３がＳで置換され、かつ／あるいはＮ１５１およびＮ１５２がそれぞれ独立してＧまたはＳで置換されている、上記［１４］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１６］
前記セクレチンがＩＶ型分泌系である、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１７］
前記セクレチンがＰｉｌＱである、上記［１６］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１８］
前記セクレチンがＩＩＩ型分泌系である、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［１９］
前記セクレチンがＹｓｃＣである、上記［１８］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［２０］
前記セクレチンがＩｎｖＧである、上記［１８］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［２１］
（Ｎ１またはＮ０ドメインを有しないＩｎｖＧのアミノ酸配列に対応する）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記［２０］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［２２］
前記内腔表面が、前記内腔内の狭窄部をさらに画定し、前記狭窄部が、配列番号１のアミノ酸Ｄ２８、Ｅ２２５、Ｒ２２６、および／またはＥ２３１において１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変修飾）を有する、上記［２０］または［２１］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［２３］
前記狭窄部の前記１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変修飾）が、以下のうちの１つ以上を含む、上記［２２］に記載の修飾セクレチンナノポア：
ｉ．Ｄ２８Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ２２５Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉｉ．Ｒ２２６Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ｖ、
ｉｖ．Ｅ２２５の欠失、
ｖ．Ｒ２２６の欠失、および
ｖｉ．Ｅ２３１Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｋ。
［２４］
前記内腔表面が、アミノ酸Ｅ４１、Ｑ４５、またはＥ１１４において１つ以上のアミノ酸修飾を有する捕捉部分を含む、上記［２０］〜［２２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
［２５］
前記捕捉部分が、以下のアミノ酸修飾のうちの１つ以上を含む、上記［２４］に記載の修飾セクレチンナノポア：
ｉ．Ｑ４５Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ４１Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、および
ｉｉｉ．Ｅ１１４Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ。
［２６］
（Ｎ１またはＮ０ドメインを有しないＩｎｖＧのアミノ酸配列に対応する）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドが、配列番号１のＤ２８、Ｅ４１、Ｅ１１４、Ｑ４５、Ｅ２２５、Ｒ２２６、およびＥ２３１から選択されるアミノ酸（複数可）において１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変アミノ酸修飾）を含む、修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド。
［２７］
前記１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変アミノ酸修飾）が、以下のうちの１つ以上を含む、上記［２６］に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド：
ｉ．Ｄ２８Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ２２５Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉｉ．Ｒ２２６Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ｖ、
ｉｖ．Ｅ２２５の欠失、
ｖ．Ｒ２２６の欠失、および
ｖｉ．Ｅ２３１Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｋ。
［２８］
以下のアミノ酸修飾のうちの１つ以上を含む、上記［２６］または［２７］に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド：
ｉ．Ｑ４５Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ４１Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、および
ｉｉｉ．Ｅ１１４Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ。
［２９］
（Ｎ１およびＮ０ドメインを含むＷＴ ＩｎｖＧのアミノ酸配列に対応する）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドが、配列番号２のＤ１９９、Ｅ２１２、Ｅ２８５、Ｑ２１６、Ｅ３９６、Ｒ３９７、およびＥ４０２から選択されるアミノ酸（複数可）において１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変アミノ酸修飾）を含み、かつ／またはエンドペプチダーゼ切断部位が配列番号２の１７０位と１７１位との間もしくは１７１位と１７２位との間に挿入されている、修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド。
［３０］
前記１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変アミノ酸修飾）が、以下のうちの１つ以上を含む、上記［２９］に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド：
ｉ．Ｄ１９９Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ３９６Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉｉ．Ｒ３９７Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ｖ、
ｉｖ．Ｅ３９６の欠失、
ｖ．Ｒ３９７の欠失、および
ｖｉ．Ｅ４０２Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｋ。
［３１］
以下のアミノ酸修飾のうちの１つ以上を含む、上記［２９］または［３０］に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチド：
ｉ．Ｑ２１６Ｒ／Ｋ、
ｉｉ．Ｅ２１２Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、および
ｉｉｉ．Ｅ２８５Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ。
［３２］
配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含む、修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチド。
［３３］
配列番号３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記［３２］に記載の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチド。
［３４］
前記ＧｓｐＤがキャップゲートを含まない、上記［３２］または［３３］に記載の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチド。
［３５］
前記ＧｓｐＤの中央ゲートが、アミノ酸をより小さな側基を有するアミノ酸で置換するように、かつ／または負に荷電したアミノ酸を中性もしくは正に荷電したアミノ酸で置換するように修飾されている、上記［３２］〜［３４］のいずれか一項に記載の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチド。
［３６］
配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含み、（ｉ）Ｄ５５もしくはＴ５６〜Ｔ７７のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、Ｋ５９、Ｋ６０、Ｒ６３、Ｑ６６、Ｑ６９、Ｋ７１、Ｑ７４、およびＱ７５のうちの１つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに／またはＤ５５、Ｔ５６、Ｔ５７、およびＫ３９４のうちの１つ以上がＰで置換され、かつ／あるいは（ｉｉ）Ｆ１５７がより小さいアミノ酸で置換され、Ｎ１５２および／またはＮ１５３がより小さいアミノ酸で置換され、Ｄ１５４が荷電していないアミノ酸で置換され、Ｇ４５３およびＧ４８１がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはＡもしくはＶで置換されている、上記［３２］〜［３５］のいずれか一項に記載の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチド。
［３７］
Ｙ３７９−ＧＳＧ−Ｒ３８７またはＹ３７９−ＳＧＳ−Ｒ３８７、Ｆ４７２Ａ、Ｄ４６９Ｓ、Ｎ４６７Ｇ／Ｎ４６８Ｓ、Ｎ４６７Ｓ４６８Ｇ、Ｎ４６７Ｇ／Ｎ４６８Ｓ／Ｄ４６９Ｓである、上記［１４］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［３８］
上記［２６］〜［３１］のいずれか一項に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドまたは上記［３２］〜［３７］のいずれか一項に記載の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
［３９］
上記［２６］〜［３１］のいずれか一項に記載の複数の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドまたは上記［３２］〜［３７］のいずれか一項に記載の複数の修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチドを含む、修飾セクレチンナノポア。
［４０］
９〜２０個の前記修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドを含む、上記［３９］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［４１］
各モノマーが、上記［２６］〜［３１］または［３２］〜［３７］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドである、上記［４０］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［４２］
異なるモノマーを含み、前記モノマーのうちの少なくとも１つが上記［２６］〜［３１］または［３２］〜［３７］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドである、上記［４０］に記載の修飾セクレチンナノポア。
［４３］
セクレチンナノポアを含む膜が内部に配置された水溶液を収容するチャンバを含む装置であって、前記セクレチンナノポアがシス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含む、装置。
［４４］
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアであり、前記内腔表面が１つ以上のアミノ酸修飾を含む、上記［４３］に記載の装置。
［４５］
前記修飾セクレチンナノポアが、上記［１］〜［２５］および［３９］〜［４２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記［４４］に記載の装置。
［４６］
前記水溶液中に存在する分析物をさらに含む、上記［４３］〜［４５］のいずれか一項に記載の装置。
［４７］
前記分析物がポリヌクレオチドである、上記［４６］に記載の装置。
［４８］
前記ポリヌクレオチドに結合したポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、上記［４７］に記載の装置。
［４９］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはポリメラーゼである、上記［４８］に記載の装置。
［５０］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記膜の前記シス側にある、上記［４８］または［４９］に記載の装置。
［５１］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記シス開口部と接触または共有結合している、上記［５０］に記載の装置。
［５２］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記膜の前記トランス側にある、上記［４８］または［４９］に記載の装置。
［５３］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記トランス開口部と接触または共有結合している、上記［５２］に記載の装置。
［５４］
上記［４３］〜［４５］のいずれか一項に記載の装置を得ることと、分析物を前記膜の前記シス側または前記トランス側で前記水溶液に添加することと、を含む、方法。
［５５］
前記分析物がポリヌクレオチドである、上記［５４］に記載の方法。
［５６］
ポリヌクレオチド結合タンパク質を前記膜の前記シス側で前記水溶液に添加することをさらに含み、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記ポリヌクレオチドに結合する、上記［５５］に記載の方法。
［５７］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記シス開口部と接触もしくは共有結合しているか、または前記ナノポアのシス玄関部内にある、上記［５６］に記載の方法。
［５８］
ポリヌクレオチド結合タンパク質を前記膜の前記トランス側で前記水溶液に添加することをさらに含み、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記ポリヌクレオチドに結合する、上記［５５］に記載の方法。
［５９］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記トランス開口部と接触もしくは共有結合しているか、または前記ナノポアのトランス玄関部内にある、上記［５８］に記載の方法。
［６０］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはポリメラーゼである、上記［５４］〜［５９］のいずれか一項に記載の方法。
［６１］
前記膜にわたって電圧勾配を印加することによって前記ナノポアを通るイオン電流フローを誘導することをさらに含む、上記［５４］〜［６０］のいずれか一項に記載の方法。
［６２］
前記印加された電圧勾配下で前記ナノポアを通るイオン電流フローを検出することをさらに含む、上記［６１］に記載の方法。
［６３］
前記検出されたイオン電流フローに基づいて前記分析物の存在を決定することをさらに含む、上記［６２］に記載の方法。
［６４］
セクレチンナノポアおよび前記セクレチンナノポアのシスまたはトランス玄関部内に提供される酵素を含む、組成物。
［６５］
前記セクレチンナノポアが野生型セクレチンナノポアである、上記［６４］に記載の組成物。
［６６］
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアである、上記［６４］に記載の組成物。
［６７］
前記修飾セクレチンナノポアが、上記［１］〜［２５］および［３９］〜［４２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記［６６］に記載の組成物。
［６８］
前記ナノポアが、膜内に提供され、シス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する、上記［６４］〜［６７］のいずれか一項に記載の組成物。
［６９］
分析物の検出および／または特徴付けのための、セクレチンナノポアの使用。
［７０］
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアである、上記［６９］に記載の使用。
［７１］
前記修飾セクレチンナノポアが、上記［１］〜［２５］および［３９］〜［４２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記［７０］に記載の使用。
［７２］
試料中の分析物の有無を検出し、かつ／または試料中の分析物を特徴付ける方法であって、膜中に配置されたセクレチンナノポアを前記試料と接触させることと、前記膜にわたって電圧勾配を印加することと、前記ナノポアを通るイオン電流フローを検出することと、を含む、方法。
［７３］
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアである、上記［７２］に記載の方法。
［７４］
前記修飾セクレチンナノポアが、上記［１］〜［２５］および［３９］〜［４２］のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記［７３］に記載の使用。
Claims (32)
- 試料中の分析物の有無を検出し、かつ／または試料中の分析物を特徴付ける方法であって、膜中に配置されたセクレチンナノポアを前記試料と接触させることと、前記膜にわたって電圧勾配を印加することと、前記ナノポアを通るイオン電流フローを検出することと、を含む、方法。
- 前記セクレチンナノポアが、シス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含む修飾セクレチンナノポアであり、前記内腔表面が１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の方法。
- − 前記シス開口部が、６０Å〜１２０Åの範囲の直径を有する；および／または
− 前記トランス開口部が、４０Å〜１００Åの範囲の直径を有する；および／または
− 前記セクレチンナノポアが、約７．５Å〜２５Åの直径を有する狭窄部を含む、
請求項１または２に記載の方法。 - 前記セクレチンナノポアが、１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾セクレチンナノポアであり、前記１つ以上のアミノ酸修飾が、荷電改変修飾を含む、請求項２または３に記載の方法。
- 前記荷電改変修飾が、正に荷電したアミノ酸での負に荷電したアミノ酸の置換である、請求項４に記載の方法。
- 前記セクレチンナノポアが、１つ以上のアミノ酸修飾を含む修飾セクレチンナノポアであり、前記１つ以上のアミノ酸修飾が、疎水性アミノ酸での中性アミノ酸の置換を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セクレチンナノポアがＩＩ型分泌系である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セクレチンナノポアがＧｓｐＤである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セクレチンナノポアが、
（ｉ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含むサブユニットポリペプチド；または
（ｉｉ）配列番号３３、３４または３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチド
を含む、請求項８に記載の方法。 - （ｉ）前記ＧｓｐＤがキャップゲートを含まない、および／または
（ｉｉ）前記ＧｓｐＤの中央ゲートが、アミノ酸をより小さな側基を有するアミノ酸で置換するように、かつ／または負に荷電したアミノ酸を中性アミノ酸もしくは正に荷電したアミノ酸で置換するように修飾されている、
請求項８または９に記載の方法。 - 前記セクレチンナノポアが、配列番号３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含むサブユニットポリペプチドを含み、ここで、
（ｉ）Ｄ５５もしくはＴ５６〜Ｔ７７のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、Ｋ６０、Ｄ６４、Ｒ７１、およびＥ７３のうちの１つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに／またはＤ５５、Ｔ５６、Ｔ７７、およびＫ７８のうちの１つ以上がＰで置換されている；かつ／または
（ｉｉ）Ｆ１５６がより小さいアミノ酸で置換され、Ｎ１５１および／またはＮ１５２がより小さいアミノ酸で置換され、Ｄ１５３が荷電していないアミノ酸で置換され、Ｇ１３７およびＧ１６５がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはＡもしくはＶで置換されている；かつ／または
（ｉｉｉ）Ｙ６３〜Ｒ７１が欠失されおよび／またはＧＳＧもしくはＳＧＳで置換され、Ｆ１５６がＡで置換され、Ｄ１５３がＳで置換され、かつ／あるいはＮ１５１およびＮ１５２がそれぞれ独立してＧまたはＳで置換されている
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。 - 前記セクレチンナノポアが、配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含み、ここで、
（ｉ）Ｄ５５もしくはＴ５６〜Ｔ７７のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、Ｋ５９、Ｋ６０、Ｒ６３、Ｑ６６、Ｑ６９、Ｋ７１、Ｑ７４、およびＱ７５のうちの１つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに／またはＤ５５、Ｔ５６、Ｔ５７、およびＫ３９４のうちの１つ以上がＰで置換されている；かつ／または
（ｉｉ）Ｆ１５７がより小さいアミノ酸で置換され、Ｎ１５２および／またはＮ１５３がより小さいアミノ酸で置換され、Ｄ１５４が荷電していないアミノ酸で置換され、Ｇ４５３およびＧ４８１がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはＡもしくはＶで置換されている；かつ／または
（ｉｉｉ）前記セクレチンサブユニットポリペプチドが、
− Ｙ３７９−ＧＳＧ−Ｒ３８７またはＹ３７９−ＳＧＳ−Ｒ３８７、
− Ｆ４７２Ａ、
− Ｄ４６９Ｓ、
− Ｎ４６７Ｇ／Ｎ４６８Ｓ、
− Ｎ４６７Ｓ／Ｎ４６８Ｇ、または
− Ｎ４６７Ｇ／Ｎ４６８Ｓ／Ｄ４６９Ｓを含む、
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。 - 前記セクレチンナノポアがＩＶ型分泌系である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セクレチンナノポアがＰｉｌＱである、請求項１３に記載の方法。
- 前記セクレチンナノポアがＩＩＩ型分泌系である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セクレチンナノポアがＹｓｃＣまたはＩｎｖＧである、請求項１５に記載の方法。
- 前記セクレチンナノポアが、（Ｎ１またはＮ０ドメインを有しないＩｎｖＧのアミノ酸配列に対応する）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む修飾ＩｎｖＧである、請求項１６に記載の方法。
- 前記セクレチンナノポアが、配列番号１のＤ２８、Ｅ４１、Ｑ４５、Ｅ１１４、Ｅ２２５、Ｒ２２６、および／またはＥ２３１のアミノ酸において１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変修飾）を含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変修飾）が、以下のうちの１つ以上を含む、請求項１８に記載の方法：
ｉ． Ｄ２８Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉ． Ｅ２２５Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉｉ． Ｒ２２６Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ｖ、
ｉｖ． Ｅ２２５の欠失、
ｖ． Ｒ２２６の欠失、
ｖｉ． Ｅ２３１Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｋ、
ｖｉｉ． Ｑ４５Ｒ／Ｋ、
ｖｉｉｉ．Ｅ４１Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、および
ｉｘ． Ｅ１１４Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ。 - 前記セクレチンナノポアが、（Ｎ１およびＮ０ドメインを含むＷＴ ＩｎｖＧのアミノ酸配列に対応する）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、修飾ＩｎｖＧであって、前記修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドが、配列番号２のＤ１９９、Ｅ２１２、Ｅ２８５、Ｑ２１６、Ｅ３９６、Ｒ３９７、およびＥ４０２から選択されるアミノ酸（複数可）において１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変アミノ酸修飾）を含み、かつ／またはエンドペプチダーゼ切断部位が配列番号２の１７０位と１７１位との間もしくは１７１位と１７２位との間に挿入されている、請求項１６に記載の方法。
- 前記１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、荷電改変アミノ酸修飾）が、以下のうちの１つ以上を含む、請求項２０に記載の方法：
ｉ． Ｄ１９９Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉ． Ｅ３９６Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｒ／Ｋ、
ｉｉｉ． Ｒ３９７Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ｖ、
ｉｖ． Ｅ３９６の欠失、
ｖ． Ｒ３９７の欠失、
ｖｉ． Ｅ４０２Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｋ、
ｖｉｉ． Ｑ２１６Ｒ／Ｋ、
ｖｉｉｉ．Ｅ２１２Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、および
ｉｘ． Ｅ２８５Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｓ／Ｇ／Ｒ／Ｋ。 - 請求項１１、１２、１８、１９、２０および２１のいずれか一項に記載の複数の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドを含む、修飾セクレチンナノポア。
- 請求項１１、１２、１８、１９、２０および２１のいずれか一項に記載の修飾ＩｎｖＧナノポアサブユニットポリペプチドまたは修飾ＧｓｐＤナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
- セクレチンナノポアを含む膜が内部に配置された水溶液を収容するチャンバを含む装置であって、前記セクレチンナノポアがシス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含む、装置。
- 前記セクレチンナノポアが、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、請求項２４に記載の装置。
- 前記水溶液中に存在する分析物をさらに含む、請求項２４または２５に記載の装置。
- 前記分析物がポリヌクレオチドである、請求項２６に記載の装置。
- 前記ポリヌクレオチドに結合したポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、請求項２７に記載の装置。
- 前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはポリメラーゼである、請求項２８に記載の装置。
- 前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記シス開口部またはトランス開口部と接触または共有結合している、請求項２８または２９に記載の装置。
- 分析物の検出および／または特徴付けのための、セクレチンナノポアの使用。
- 前記セクレチンナノポアが、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、請求項３１に記載の使用。
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