JPH08507374A

JPH08507374A - 担体両性電解質を使用しない等電点電気泳動方法及び装置

Info

Publication number: JPH08507374A
Application number: JP6519418A
Authority: JP
Inventors: パウリスジン，ジャヌーズ，ビー
Original assignee: パウリスジン，ジャヌーズ，ビー
Priority date: 1993-03-05
Filing date: 1994-03-02
Publication date: 1996-08-06
Anticipated expiration: 2018-05-26
Also published as: WO1994020843A1; DE69403071D1; CA2157373A1; EP0687358A1; EP0687358B1; CA2157373C; JP3410099B2; US5759370A

Abstract

(57)【要約】緩衝液中の両性電解質を等電点電気泳動するための方法および装置は、陽極が毛管の径の小さい端部に連結され陰極が径の大きい端部に連結された円錐形の毛管を用いるものである。緩衝液にかかる電位によって温度勾配が生じ、さらにこれからｐＨ勾配が生じる。また、電流によって、両性電解質を等電点電気泳動する電界の勾配が生じる。従来の装置および方法は、温度勾配を得るために担体の両性電解質を用いるまたは恒温槽を用いるものであった。

Description

【発明の詳細な説明】担体両性電解質を使用しない等電点電気泳動方法及び装置技術分野本発明は、緩衝液に含まれる両性電解質の等電点電気泳動用の装置および方法に関する。その電気泳動は、両性電解質成分の分画を容易にするものである。背景技術等電点電気泳動は、従来、等電点の相違に基づいて、たんぱく質などの両性電解質検体を分離するために使用されていた電気泳動法である。検体は、明瞭なｐＨ勾配をもつアガロースゲルなどの培地に作られた静電領域に置かれる。検体は、最初に、検体が存在する緩衝液のｐＨに依存してプロトン化および脱プロトン化され、正味の電荷が零であり、したがってその移動性が皆無であるそれぞれの等電点に向かって、静電領域中を移動する。両性電解質検体は、しばしば検体帯間に０．０１ｐＨ単位以上の良好な分解能を与える狭い領域に濃縮され等電点電気泳動される。毛管を用いる等電点電気泳動は、速度が速く、さらに極めて小さな試料の分析を可能とする５ｍ程度の小さな内径を備えることが可能なので、ゲル形態に有利である。毛管を使用する場合には、ｐＨ勾配は、ポリアミノポリカルボン酸である担体両性電解質を用いて作られる。これらの担体両性電解質は高価であり、たんぱく質の精製が煩雑となる。さらに、それらは、紫外線検出を妨害する。また、分離容器の両端部に取り付けられた異なる温度の２つの循環槽系を用いることにより、温度勾配から結果としてｐＨ勾配を作ることは公知である。しかし、残念なことに、温度はジュール熱に起因して不安定であり、この方法は極めて不便である。担体両性電解質を用いない従来技術の方法の全てにおいて、ｐＨ勾配は、両性電解質の実質的な分離または分画に用いられる電流とは別に作られる。発明の開示本発明の目的は、電流が分離容器に沿って温度勾配を作るために使用されており、さらに同じ電流が等電点電気泳動および分画用の電場勾配を作るために使用されることを特徴とする等電点電気泳動および分画の装置並びに方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、温度勾配が、一定電流を発生する電源を用いた分離容器の物性に起因して生ずることを特徴とする等電点電気泳動および分画の装置並びに方法を提供することにある。緩衝液に含まれる両性電解質の等電点電気泳動に用いられる装置は、２つの端部を備えた先細形の分離容器を有する。該容器は、緩衝液を含み、一定電流を発生させる電源を用いて内容物内に温度勾配を作ることが可能であるという物性を有する。該電源は、該容器の一端と接続した端子および該容器の他端と接続したもう一つの端子を有する。該電源は、かかる電気泳動の経過を監視するための検出システムを備えた該容器内で、緩衝液に沿って温度勾配を作るために接続される。緩衝液中の両性電解質についての等電点電気泳動では、２つの端部を備えた先細形の分離容器を使う。該容器は、電源からの一定電流を用いて容器の内容物内に温度勾配を作ることが可能であるという物性を有する。該電源および画像検出系は、かかる電気泳動の経過を監視するために配置される。その方法は、容器を両性電解質を含む緩衝液で満たし、該容器内の該緩衝液に沿って温度勾配を形成させるため電源を接続し、さらに該検出システムを用いて該電気泳動の経過を監視する段階が含まれる。緩衝液に含まれる生化学的原料の両性電解質成分を分画する方法では、２つの端部を備えた先細形の分離容器が用いられる。該容器は、容器の一端と接続された一つの端子と、他端と接続されたもう一つの端子を有する電源によって発生させた一定電流を用いて、容器の内容物内に温度勾配を作ることができるという物性を有する。該容器の各端部には端子用のリザーバーがある。１つのリザーバーは陰極リザーバーであり、他のリザーバーは陽極リザーバーである。種々の分離陽極リザーバーがある。その方法は、十分に小さいｐＩを有する緩衝液成分の全てが容器を通過して第１陽極リザーバーに入るまでその流れを活性化する段階と、第１陽極リザーバーを第２陽極リザーバーに交換し、第１リザーバーで使用されたよりも僅かに低い電流で系を活性化し、それにより、容器の一端に等電点電気泳動させ十分に小さいｐＩを有する両性電解質の一部を負に帯電させ、第２陽極コンテナ内に移動させる段階と、第２陽極コンテナを第３陽極コンテナに交換し、同じく小さな電流でその工程を繰り返して、容器の一端に等電点電気泳動させ、十分に小さなｐＩを有するもう一つの両性電解質を第３陽極コンテナに移動させる段階と、両性電解質成分の十分な分画が得られるまで、継続して陽極コンテナを用い継続して電流を低下させて該工程を繰り返す段階からなる。図面の簡単な説明図１は、等電点電気泳動システムの部分概略透視図であり、図２は、等電点電気泳動システムの概略側面図であり、図３ａは、試料領域に分けられた両性電解質を備えた円錐形毛管の概略側面図であり、図３ｂは、図３ａの毛管に沿った温度勾配を示すグラフであり、図３ｃは、該毛管の長さに沿ったｐＨ勾配を示すグラフであり、図４は、各端部においてリザーバーを有する円錐形毛管の側面図であり、図５は、一定の内径を有し、厚みの異なる導電体を有する毛管の側面断面図であり、図６は、Ｖ型の横断面を有する連続流動分離容器の概略透視図であり、図７は、内壁が被覆された毛管の長さに沿った連続的な吸収シグナルの強度を示すグラフであり、図８は、内壁が被覆されていない毛管の長さに沿った連続的な吸収シグナルの強度を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態図１において、先細形の分離容器２には、各端部においてリザーバー４、６を備える２つの端部がある。該容器とリザーバーは、緩衝液８を含む。緩衝液は、弱酸と共役塩基または弱塩基と共役酸（通常は水中で）との混合物のいずれかである。一定の電流を発生する電源（図示せず）は、容器２の一端部において接続された一つの端子１０および容器２の他端において接続されたもう一つの端子１２を備える。電源は、容器２内の緩衝液８に沿って温度勾配を生ずるように接続される。同様に、電源によって生ずる電流は、両性電解質成分の等電点電気泳動に要求される電場勾配を生じさせる。膜１４は超瀘過膜であり、電極を囲んで緩衝液中のタンパク質またはその他の物質が電極表面と接触することを妨げるので、吸収、酸化、還元、または減成が起きないであろう。容器２は、電源が容器に一定電流を通すように接続されたときに、緩衝液８内に温度勾配が生ずるような物性を有する。容器２は、狭い端部１６と広い端部１８を有する円錐型毛管である。陽極端子は狭い端部１６においてリザーバー６に接続され、陰極端子１２は広い端部１８においてリザーバー４に接続されている。毛管は先細の形状は、緩衝液内部に毛管の一端部から他端部にわたって温度勾配を生じさせる。温度勾配は、次いで、ｐＨ勾配を生じさせる。電流が緩衝液を通過するとき、毛管の狭い端部は広い端部１８よりも熱くなり、緩衝液に沿って温度勾配が生じる。電流の存在によって生じた電場勾配は、両性電解質を、同じ等電点を有し毛管の同じ領域に移動する両性電解質とともに等電点電気泳動または分画する。検出システムは、等電点電気泳動の経過を監視する。検出システムは、光線２０を発生させる光源（図１に図示せず）から成る。光線２０は、円柱レンズ２２、透明な毛管およびレンズ２４を介してセンサー２６に至る。センサー２６は、光線が毛管を通過するときの光線の吸収シグナルの相違を決定する。図２において、毛管または分離容器２および検出システムのより詳細な概略図は、図１に示されるものと同じであり、同じ符号によって特定される。図２において、光源２８は一方の側に反射板３０を有し、フィルター３２を介して導かれる光線２０を生ずる。光線２０は、フィルター３２の後方で、仕切３８においてピンホール３６上に光線を集める焦点レンズ３４を通過する。ピンホールを通過した後、光線２０は、収集レンズ４０を通過し、その後毛管２上に光線を集める円柱レンズ２２を通過する。毛管２と毛管内に含まれる緩衝液８を通過した後、光線はレンズ２４を通過し、連続的に吸収シグナルの強度が測定されるセンサー２６に導かれる。好ましくは、電気は、およそ１ＫＶの高圧のＤＣ電源から供給する。好ましくは、電圧は、分離容器の長さ１ｃｍ当りＩ００Ｖから１ｋＶがよい。図３ａ、３ｂ、３ｃより、毛管は広い端部よりも狭い端部においてより熱くなり、さらにｐＨは広い端部よりも狭い端部においてより小さいことが明らかである。電解質緩衝液で満たされた分離容器の単位長さ当たり生成した熱量は、変数ｘで示せばｄＱ（ｘ）／ｄｘであり、電気泳動電流Ｉと変数ｘで示される分離容器に沿った電界の強さＥ（ｘ）に比例する。すなわち、と表される。電気泳動電流Ｉの値は、毛管の中心軸線に沿って一定であり（図３ａ参照）、式Ｉ＝ｋＡ（ｘ）Ｅ（ｘ）により算出される。ここで、Ａ（ｘ）は変数ｘで与えられる分離チャンネルの断面積、ｋは電解質の電導率であり、ゆえにとなる。毛管形状が円錐形の分離容器については、上記関係はと表される。ここで、Ｒ（ｘ）は変数ｘで与えられる毛管の半径である。上記式は、毛管の中心軸線に沿って毛管の直径が小さくなることによって、系内で生成する熱量が急速に増加することを明確に示しており、結果として、図３ｂで示すように毛管内で温度勾配を生ずることとなる。円錐形毛管内でもたらされる正確な温度曲線は、系内における熱移動を示し、かつ適切な電解質の流れを考慮した微分方程式を解くことによって算出される。緩衝液のｐＨを決定する弱酸または弱塩基の解離定数は、熱力学的特性なので、円錐形の毛管の内部で生成した熱勾配は、図３ｃで示すような対応するｐＨ勾配をもたらす。図４は、少量の生化学的原料を分析の前に迅速に濃縮精製するのに用いられる装置を示している。まず第一段階として、上部リザーバー４は緩衝液８に含まれる両性電解質で満たされている。容器２の下端に設けられたリザーバー６には、電源（図示せず）から正端子が接続されている。リザーバー４は、負端子または接地端子が接続されている。分離電圧をかけた後、緩衝液８中で目的のタンパク質は、被覆されていない円錐形の毛管の内部で濃縮され等電点電気泳動される。それから、試料の正に荷電した両性電解質（緩衝液のｐＨより高いｐＩをもつもの）および非荷電化学種を含む部分は、リザーバー４から取り除かれる。それから、毛管の内容物は採取のため空けられる。リザーバーの下方から上方へ流れる電気浸透による流れは、非荷電化学種が毛管に入ることを妨げる。しかしそれはまた等電点電気泳動工程の速度を低下させる。上部リザーバー４を加圧するか下部リザーバー６を減圧することにより、毛管内の液体力学的流れを増加させることができる。図４に示した装置は、陽極コンテナ（その一つのみが図４に示されている）を使用したとき、生化学的物質の両性電解質成分を分画するのに用いることもできる。すべての試料成分は、毛管の通過を可能にするのに十分に低いｐＩなので、はじめに、第一のリザーバー６において採取され、第一画分を構成する。それから、第一の陽極コンテナ６は第二の陽極コンテナ（図示せず）に交換され、毛管２の先端部４２は、第二のコンテナ内に据えられ、系内の電流はわずかに低下し、それによって、先端部４２内の温度は低下する。電流は電位の低下に従って低下する。このことは、結果として先端部における緩衝液のｐＨを大きくする。十分に低いｐＩをもち、毛管内の非常に先端部に存在するタンパク質は負に荷電され、第二の陽極コンテナに移動する。円錐形の毛管内部で等電点電気泳動され濃縮された生化学的原料をさらに分画し、所望の更なる画分を得るため、この過程は、引き続いて電流を低下させることによって数回繰り返される。この工程は、連続的に自動化された方法で行うことができ、また、濃縮、分画または分離に用いられる。図５においては、分離容器４４は、一定の内径を有し、厚さの異なる導電性の外壁４６を有する。正電極が狭い端部４８側、負電極が広い端部５０側になるよう電極を外壁４６に接続し、一定電流を外壁４６に流したとき、電極が容器内の緩衝液中に接続されている代わりに導電性の外壁４６に接続されている点を除いて図１で示した分離容器２に対する温度勾配と同じように温度勾配が形成される。外壁４６内に温度勾配が形成され、外壁４６からの熱は容器４４内の緩衝液に伝導されて、緩衝液内に同様の温度勾配を形成する。正電極（図示せず）は外壁４６の狭い方の端部、負電極（図示せず）は外壁４６の広い方の端部に接続されている。単一の電源が好適に用いられるが、外壁４６に一つと等電点電気泳動に一つの電源を別々に使用してもよい。図６において、二つの互いに平行でない壁５４と５６を有する連続流動分離容器５２が示されている。両壁は容器がＶ字状の横断面となるよう互いに狭まり、該横断面に垂直となる方向に、緩衝液を該容器に連続的に流入および流出させられるよう流入口５８と流出口６０が設けられている。流出口６０に設けられた収集装置６２は、収集装置が配設された容器の長さ方向に沿って興味のある位置における等電点電気泳動された両性電解質を含む緩衝液の部分を収集する。電極は図６には示されていないが、正電極は狭い端部６４の緩衝液中に、負電極は広い端部６６の緩衝液中に接続されている。端部壁はそれ自身を膜で保護された電極とすることもできる。図７は、０、２７、３２および３７分の等電点電気泳動の毛管の長さ方向に沿った電場の吸収シグナルの大きさを示している。これらの結果は、電気浸透による流れを除去するため、毛管壁の内側を架橋していないポリアクリルアミドでコートしたものを用いて得られた。加えて、電位の流体力学的流れを減じるために毛管の両端には、アガロースゲルプラグを用いた。まずはじめに、円錐形の毛管と二つのリザーバー（図１に示したもの）に、ｐＨ＝７．３のトリス緩衝液で満たした。次に、均一の温度とそれに対応するｐＨ勾配を形成するため、毛管に１ｋＶの電位を１０分間かけた。次に、二つの型のヘモグロビン（メトヘモグロビン、ｐＩ＝７．２０、オキシヘモグロビン、ｐＩ＝７．００）の０．１ｍｇ／ｍｌ試料溶液を接地電極（陰極）の接続された毛管の広い端部側のリザーバー４に数滴注入した。試料成分は、選択された緩衝液のｐＨと比較して、わずかに低いｐＩ（ｐＨ単位の画分で）を有しているので、これらは最初は負に荷電しており、毛管を通って正電極１０に向かって泳動し始め、それらの等電点に到達して泳動を終始する。検体は毛管の内部で捕捉され、これらは、メトヘモグロビン６８とオキシヘモグロビン７０それぞれの二つの狭い領域を形成する。それは毛管での検体の蓄積が確認される間は、吸収シグナルの強度が連続的に増加することが認められる。言い換えれば、ピーク面積がその間増加することとなる。等電点電気泳動帯の幅は、試料中に存在する二つの型のヘモグロビン（０．２ｐＨ単位と約０．０４ｐＨ単位）の間の距離から算出される。図３においては、円錐形の毛管の二つの端部間の推定のｐＨ差は、およそ１ｐＨ単位である。これは、両端部間の温度差が約４０℃あること対応している。ｐＨ幅を広げるために、より大きいｐＨの温度係数をもつ緩衝液が使用される。また、毛管の小さい方の端部を狭めることにより、または電位差を大きくして電気泳動電流を増加することにより、温度差を増大させることができる。この場合、毛管内部が高温になることによりタンパク質が変性するのを防止するため、緩衝液リザーバーを冷却することが要求される。３２分と３７分の間でも、試料帯はまだ毛管に沿って位置を変えているので、図３において、３０分後でも温度条件は定常状態にあるとはいえない。しかしながら、３２分と３７分の間で起こる移動は２７分と３２分の間で起こる移動よりは小さいので、系は定常状態の温度条件に近づきつつあるといえる。図８は、毛管の長さ方向に対する時間ごとの吸収シグナルの大きさを示している。図８で使用した円錐形毛管は、内壁が被覆されていないものを用いた。緩衝液中の検体の濃度は、図７における場合の約１０倍であった。したがって、図８の系では図７の系よりも試料は迅速に凝集された。図８における検体の帯は、適切な等電点の位置ではなく、タンパク質の電気泳動の速度が電気浸透によって発生した流れに等しくなる、いくぶん高いｐＨのところに現れている。毛管内の電解質の流れは系を冷却し、結果として、ｐＨ値は毛管の狭い端部の方にシフトする。また、流れが存在することにより、より迅速に温度平衡に達する。このことは、毛管内における検体の帯の位置が非常に安定していることからも示唆される。例えば、ピーク７２は、３分後、４分後および７分後のいずれにおいても、毛管に沿っておよそ１９．５ｍｍの位置に出現していることがわかる。図８における分解能は、図７におけるものと比較して約５０％減退する。これはおそらくは系内の流れによって引き起こされるものである。図８の最下部に示した結果は、分離電圧を約１ｋＶから約１．５ｋＶに増大させて得られたものである。毛管内で生成した熱量が増加し、ｐＨ値はより冷たい端部側にシフトするので、検体の帯７２と７４毛管の広い端部の方へ移動している。新しい位置では帯幅と毛管の直径が増大するので、帯の強度は減少している。図７より、本発明の等電点電気泳動の技術は、分析や調整のための分離だけでなく、分析前の生化学的試料の前段階的濃縮や精製にも使用できることがわかる。また、図８より、等電点電気泳動システムは、電位をかけることによって、検出点または収集点に向かって検体が泳動する性質をもつ標的の両性電解質（例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸その他の等電点を有する物質）の毛管内での捕集や濃縮に使用できることがわかる。実施例＃１長さ４ｃｍの円錐形の毛管を分離濃縮チャンネルとして用いて、内径５ｍｍのガラス管を引っ張ることによって作製した。毛管の一端の直径が０．２ｍｍであり、他端は１ｍｍであった。この毛管をカートリッジ上にのせ、その２端を図１に示されるように緩衝液のリザーバーに繋いだ。実験によっては、報告された方法によって電気浸透を排除するために、毛管の内壁を非架橋ポリ（アクリルアミド）で被覆した。架橋ポリ（アクリルアミド）を使用してもよい。分離を高圧直流電源（スペルマン（Spel1men）製、プレインビュー（Plainview）、ニューヨーク）によって行ない、分離電圧は約１ｋＶであった。陽極を毛管の径の小さい方の端部の緩衝液のリザーバー中に挿入し、毛管の他端を接地した。本実験に使用したタンパク質のサンプルは、メトヘモグロビン（７５％）及びオキシヘモグロビン（２５％）の２つの主要なイソ型を含むヒトヘモグロビン（シグマ（Sigma）製、セントルイス（St，Louis）、ミズーリ州）であった。化学薬品はすべて試薬用であり、溶液は脱イオン水を用いて調製した。緩衝液としてはｐＨ７．３の０．０５Ｍトリス緩衝液を用いた。この緩衝液は、大きいｐＨの温度係数を有する（ｄｐＨ／ｄＴが２５℃で−０．０２８Ｋ−１である）（１０）。タンパク質溶液はトリス緩衝液中で調製された。この溶液を０．２μｍの細孔を有するディスク形状の酢酸セルロースフィルター（サルトリウス（Sart orius）製、ゴッティンゲン（Gottingen）、ドイツ国）を用いて濾過した。紫外線−可視光線吸収結像検出器を、毛管内で等電点電気泳動されたタンパク質領域を検出するのに用いた。図２に示されるように、検出器の光源としてハロゲンランプを用いた。センサーとしては、１０２４ピクセルＣＣＤ（タイプＳ３９０３−１０２４Ｑ、浜松、浜松市、日本国）を用いた。帯域着色フィルター（４００ｎｍ〜６００ｎｍ）を用いてランプのＩＲ及び紫外線付近をカットした。光線をまず図２に示すように平行にした後、３つの円筒形のレンズによって毛管に焦点を合わせられた。図２に示すように、毛管の像をＣＣＤセンサーに投影した。２つのサンブル導入方法を本実験に用いた。第一の方法では、被覆された毛管に緩衝液を充填し、１％のアガロースゲル（緩衝液中で調製）の栓を両方のリザーバーに詰め、システムにおける流体力学的な流れを防止した後、電圧をかけた。１０分後、０．１ｍｇ／ｍｌのサンプル溶液を数滴毛管の陰極側のリザーバーの頂上に添加した。第二の方法では、リザーバー及び被覆していない毛管にタンパク質溶液を満たし、電圧をかけた。すべての実験において、印加電圧を約１ｋＶに調節することによって、毛管を流れる電流を約０．８ｍＡに維持した。すべての実験を３連で行い、再現性を担保した。本発明の等電点電気泳動システムを用いると、毛管の径の小さい側（陽極端）のリザーバー６を所定の温度に維持し、リザーバー内に存在する標的タンパク質（即ち、陽極側のリザーバーに添加されサンプル）を正に荷電するのに十分低いｐＨの緩衝液を得る。次に、これらのタンパク質を陰極側に毛管を通じて移動させ、そのタンパク質自身の等電点で毛管内に静止させるまたは毛管の径の大きい端部に連結されたリザーバー４で収集する。このシステムは、等電点に関して生物学的原料を分画することによってこの材料を精製するのに使用することができる。陰極側のリザーバー４は、室温に保たれたリザーバー４中の緩衝液よりも低いｐＩを有するタンパク質を含む。陽極側のリザーバーはそのリザーバー中の緩衝液のｐＨよりも高いｐＩでタンパク質を含む一方、毛管は中間のｐＩを有するタンパク質を含む。陽極側のリザーバー６は処理中加熱され、この加熱によってサンプルが陰極及び陽極側のリザーバーに導入される際の濃縮及び等電点電気泳動処理が加速される。添付された請求の範囲の概念内に含まれる、数多くの変化が可能であることは、当業者には容易に明らかである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１月２４日【補正内容】請求の範囲１．緩衝液中に含まれる両性電解質の等電点電気泳動に使用される装置であって、該装置は二つの端部を有する先細形の分離容器を有し、該容器は緩衝液と一定電流を発生する電源を有し、該電源はその一つの端子が該容器の一端に連結されもう一つの端子が該容器の他端に連結されており、該容器は該電源が等電点電気泳動の経過を検出する検出システムを伴って該容器内で該緩衝液に沿って温度勾配を生じるように連結され得るような物性を有することを特徴とする、装置。２．該分離容器は円錐形の毛管である請求の範囲第１項に記載の装置。３．該電源はＤＣ電源であり、該電源の陽極は該毛管の径の小さい端部の緩衝液中に連結され、該ＤＣ電源の陰極は該毛管の径の大きい端部の緩衝液中に連結されている請求の範囲第２項に記載の装置。４．毛管の各端部にリザーバーがあり、該リザーバーは緩衝液を含み、電極は該リザーバーに連結されている請求の範囲第３項に記載の装置。５．該分離容器は一定の内径を有する先細形のチャンネルを含み外壁には導電性表面を有し、該導電性表面はチャンネルの一端から他端に向かって厚さが変化し、陽極は径の小さい端部の外壁に連結され、陰極は径の大きい端部の壁に連結されている請求の範囲第１項に記載の装置。６．電源はＤＣ電源であり、径の小さい端部は径の大きい端部より高い温度を有する請求の範囲第５項に記載の装置。７．導電性表面は、先細形のチャンネルの外壁を完全に覆うものである請求の範囲第５項に記載の装置。８．検出システムは等電点電気泳動の経過を連続的に検出する吸収結像検出システムであり、分離容器が透明である請求の範囲第１、２または５項に記載の装置。９．容器の内壁が電気浸透による流れを排除する物質で被覆されている請求の範囲第１、２または５項に記載の装置。１０．該装置はタンパク質を等電点電気泳動させるために用いられ、内壁がポリ（アクリルアミド）で被覆されている請求の範囲第７項に記載の装置。１１．該容器は緩衝液が容器の縦軸方向に沿って容器内を連続して流れ得るような流入口及び流出口を有し、収集装置が等電点電気泳動された部分の緩衝液を収集できるように流出口に配置されている請求の範囲第１、２または５項に記載の装置。１２．該容器は、容器がＶ形状の横断面を有するように相互に狭まっている二つの側壁を有し、流入口及び流出口は、緩衝液が該横断面方向に連続して容器中に及び容器から流れることができるように配置されている請求の範囲第１項に記載の装置。１３．等電点電気泳動された緩衝液部分を収集する少なくとも１つの収集装置を流出口に有する請求の範囲第１２項に記載の装置。１４．容器にかかる電圧が実質的に１ｋＶである請求の範囲第１、２または５項に記載の装置。１５．容器にかかる電圧が１ｃｍの長さ当たり１００ボルトから１ｃｍの長さ当たり１ｋＶの範囲である請求の範囲第１、２または５項に記載の装置。１６．二つの端部を有する先細形の分離容器を用いた緩衝液中に含まれる両性電解質の等電点電気泳動方法であって、該容器は電源からの一定電流を用いて容器の内容物中に温度勾配を生じさせ得るような物性を有し、電源及び結像検出システムが等電点電気泳動の経過を検出できるように配置されており、かつ該容器は両性電解質を含む緩衝液で満たされており、該方法は、該容器内の該緩衝液に沿って温度勾配を生じさせ該両性電解質を等電点電気泳動させるために電源を連結し、検出システムを用いて等電点電気泳動の経過を検出することを特徴とする、方法。１７．二つの端部を有する先細形の分離容器を用いた緩衝液中に含まれる生物学的原料の両性電解質成分の分画方法であって、該容器は一つの端子が該容器の一端に連結されもう一つの端子が該容器の他端に連結された電源により発生させた一定電流を用いて容器の内容物中に温度勾配を生じさせ得るような物性を有し、容器の各端部には端子用のリザーバーがあり、一方のリザーバーが陽極リザーバーであり他方のリザーバーが陰極リザーバーであり、陽極リザーバーは複数個あり、該方法は十分に低いｐＩを有する緩衝液の全成分が容器を通過して第一の陽極リザーバー中に通るまで電流を活性化する段階と、第一の陽極リザーバーを第二の陽極リザーバーと交換し、第一のリザーバーで用いた電流より若干低い電流でシステムを活性化する段階と、これにより等電点電気泳動により容器の一端に配置された十分に低いｐＩをもつ両性電解質の一部を負に荷電し第二の陽極コンテナ中に移動させる段階と、第二の陽極コンテナを第三の陽極コンテナと交換し、等電点電気泳動により容器の一端に配置された十分に低いｐＩをもつ両性電解質の他の一部を第三の陽極コンテナ中に移動させるためにさらにより低い電流で前記工程を繰り返す段階と、両性電解質成分の十分な分画が得られるまで継続して陽極コンテナを用い継続して電流を減少させて前記工程を繰り返す段階からなる、方法。１８．該容器は一端に先端部を有する円錐形の毛管であり、毛管の先端部が継続して陽極コンテナ中に浸漬されている請求の範囲第１７項に記載の方法。

Claims

【特許請求の範囲】１．緩衝液中に含まれる両性電解質の等電点電気泳動に使用される装置であって、該装置は二つの端部を有する先細形の分離容器からなり、該容器は緩衝液を含み、かつ一定電流を発生する電源を用いて容器の内容物中に温度勾配が生じるような物性を有し、該電源はその一つの端子が該容器の一端に連結されもう一つの端子が該容器の他端に連結されており、かつ等電点電気泳動の経過を検出する検出システムを伴って該容器内で該緩衝液に沿って温度勾配を生じるように連結されたことを特徴とする、装置。２．該分離容器は円錐形の毛管である請求の範囲第１項に記載の装置。３．該電源はＤＣ電源であり、該電源の陽極は該毛管の径の小さい端部の緩衝液中に連結され、該ＤＣ電源の陰極は該毛管の径の大きい端部の緩衝液中に連結されている請求の範囲第２項に記載の装置。４．毛管の各端部にリザーバーがあり、該リザーバーは緩衝液を含み、電極は該リザーバーに連結されている請求の範囲第３項に記載の装置。５．該分離容器は一定の内径を有する先細形のチャンネルを含み外壁には導電性表面を有し、該導電性表面はチャンネルの一端から他端に向かって厚さが変化し、陽極は径の小さい端部の外壁に連結され、陰極は径の大きい端部の壁に連結されている請求の範囲第１項に記載の装置。６．電源はＤＣ電源であり、径の小さい端部は径の大きい端部より高い温度を有する請求の範囲第５項に記載の装置。７．導電性表面は、先細形のチャンネルの外壁を完全に覆うものである請求の範囲第５項に記載の装置。８．検出システムは等電点電気泳動の経過を連続的に検出する吸収結像検出システムであり、分離容器が透明である請求の範囲第１、２または５項に記載の装置。９．容器の内壁が電気浸透による流れを排除する物質で被覆されている請求の範囲第１、２または５項に記載の装置。１０．該装置はタンパク質を等電点電気泳動させるために用いられ、内壁がポリ（アクリルアミド）で被覆されている請求の範囲第７項に記載の装置。１１．該容器は緩衝液が容器の縦軸方向に沿って容器内を連続して流れ得るような流入口及び流出口を有し、収集装置が等電点電気泳動された部分の緩衝液を収集できるように流出口に配置されている請求の範囲第１、２または５項に記載の装置。１２．該容器は、容器がＶ形状の横断面を有するように相互に狭まっている二つの側壁を有し、流入口及び流出口は、緩衝液が該横断面方向に連続して容器中に及び容器から流れることができるように配置されている請求の範囲第１項に記載の装置。１３．等電点電気泳動された緩衝液部分を収集する少なくとも１つの収集装置を流出口に有する請求の範囲第１２項に記載の装置。１４．容器にかかる電圧が実質的に１ｋＶである請求の範囲第１、２または５項に記載の装置。１５．容器にかかる電圧が１ｃｍの長さ当たり１００ボルトから１ｃｍの長さ当たり１ｋＶの範囲である請求の範囲第１、２または５項に記載の装置。１６．二つの端部を有する先細形の分離容器を用いた緩衝液中に含まれる両性電解質の等電点電気泳動方法であって、該容器は電源からの一定電流を用いて容器の内容物中に温度勾配を生じさせ得るような物性を有し、かつ電源及び結像検出システムが等電点電気泳動の経過を検出できるように配置されており、該方法は両性電解質を含む緩衝液で容器を満たす段階と、該容器内の該緩衝液に沿って温度勾配を生じさせるために電源を連結する段階と、検出システムを用いて等電点電気泳動の経過を検出する段階からなる、方法。１７．二つの端部を有する先細形の分離容器を用いた緩衝液中に含まれる生物学的原料の両性電解質成分の分画方法であって、該容器は一つの端子が該容器の一端に連結されもう一つの端子が該容器の他端に連結された電源により発生させた一定電流を用いて容器の内容物中に温度勾配を生じさせ得るような物性を有し、容器の各端部には端子用のリザーバーがあり、一方のリザーバーが陽極リザーバーであり他方のリザーバーが陰極リザーバーであり、陽極リザーバーは複数個あり、該方法は十分に低いｐＩを有する緩衝液の全成分が容器を通過して第一の陽極リザーバー中に通るまで電流を活性化する段階と、第一の陽極リザーバーを第二の陽極リザーバーと交換し、第一のリザーバーで用いた電流より若干低い電流でシステムを活性化する段階と、これにより等電点電気泳動により容器の一端に配置された十分に低いｐＩをもつ両性電解質の一部を負に荷電し第二の陽極コンテナ中に移動させる段階と、第二の陽極コンテナを第三の陽極コンテナと交換し、等電点電気泳動により容器の一端に配置された十分に低いｐＩをもつ両性電解質の他の一部を第三の陽極コンテナ中に移動させるためにさらにより低い電流で前記工程を繰り返す段階と、両性電解質成分の十分な分画が得られるまで継続して陽極コンテナを用い継続して電流を減少させて前記工程を繰り返す段階からなる、方法。１８．該容器は一端に先端部を有する円錐形の毛管であり、毛管の先端部が継続して陽極コンテナ中に浸漬されている請求の範囲第１７項に記載の方法。