JP2016516735A5 - - Google Patents

Claims (15)

1. 複数のサブユニットを含む修飾ＣｌｙＡ細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、ここで(i)厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されており、(ii)厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されており、厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、または(iii)厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、かつ、Ｌ９９、Ｅ１０３、Ｆ１６６およびＫ２９４の１個またはそれ以上が他のアミノ酸残基に置換されている、修飾ＣｌｙＡ細孔。
2. Ａｌａで置換された前記Ｃｙｓ残基がＣ８７であり、および／またはＳｅｒで置換された前記Ｃｙｓ残基がＣ２８５である、請求項１に記載の修飾ＣｌｙＡ細孔。
3. それぞれのサブユニットが、(i)Ｌ９９Ｑ、Ｅ１０３Ｇ、Ｆ１６６ＹおよびＫ２９４Ｒから選択される少なくとも１個の追加アミノ酸置換、(ii)Ｌ２０３Ｖ、およびサブユニットが追加のＣ末端配列ＧＳＳＨＨＨＨＨＨを含む場合はＨ３０７Ｙから選ばれる少なくとも１個の追加アミノ酸置換、ならびに／または(iii) 配列番号３のアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含む、請求項１または２に記載の修飾ＣｌｙＡ細孔。
4. 修飾ＣｌｙＡ細孔が、
   (i)少なくとも１２個のサブユニットを含み、(ii)１２個のサブユニットを含み、(iii)１３個のサブユニットを含み、(iv)少なくとも３．５ｎｍのｃｉｓ直径を有し、(v)少なくとも６ｎｍのｔｒａｎｓ直径を有し、または(vi)前記修飾ＣｌｙＡ細孔を通る電圧が＋９０から−１５０ｍＶの範囲である場合、開口したままである、請求項１から３のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡ細孔。
5. 核酸を移動させるための、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡ細孔の使用。
6. (i)複数のサブユニットを含む修飾ＣｌｙＡ細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含む修飾ＣｌｙＡ細孔（ここで、厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、および／または厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されている）、ならびに(ii)選択的結合特性を有するリガンドを含む、ナノ細孔バイオセンサー。
7. 前記修飾ＣｌｙＡ細孔が、請求項２から４のいずれか一項において定義されるものである請求項６に記載のナノ細孔バイオセンサー。
8. リガンドが、(i)アプタマー、抗体、レセプター、もしくは標的タンパク質に結合するペプチド、または(ii)標的タンパク質の前記修飾ＣｌｙＡ細孔への結合を阻害する、標的タンパク質の阻害剤である、請求項６又は７に記載のナノ細孔バイオセンサー。
9. タンパク質を検出するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡ細孔、または請求項６から８のいずれか一項に記載のナノ細孔バイオセンサーの使用。
10. 前記タンパク質が、(i)前記修飾ＣｌｙＡ細孔の内腔内に結合する、(ii) 前記修飾ＣｌｙＡ細孔の内腔内の複数の部位に結合する、および／または(iii)１５〜７０ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項９に記載の使用。
11. 試料中の少なくとも１つのタンパク質分析物の存在を検出する方法であって、
    （ａ）試料を、複数のサブユニットを含む修飾ＣｌｙＡ細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含む修飾ＣｌｙＡ細孔（ここで、厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、および／または厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されている）または修飾ＣｌｙＡ細孔を含む請求項６から８のいずれか１項に記載のナノ細孔バイオセンサーと接触させるステップと、
    （ｂ）修飾ＣｌｙＡ細孔を横切って電位を加えるステップと、
    （ｃ）修飾ＣｌｙＡ細孔を介して通る電流を測定するステップと、
    （ｄ）測定された電流を基準電流と比較するステップとを含み、ここで、基準電流に対する電流の変化は、試料中にタンパク質分析物が存在することを示す、
    前記方法。
12. 前記修飾ＣｌｙＡ細孔が、請求項２から４のいずれか一項において定義されるものである請求項１１に記載の方法。
13. 修飾ＣｌｙＡ細孔を通ってＤＮＡを移動させる方法であって、
    （ａ）複数のサブユニットを含む修飾ＣｌｙＡ細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含む修飾ＣｌｙＡ細孔（ここで、厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、および／または厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されている）を提供するステップと、
    （ｂ）修飾ＣｌｙＡ細孔を横切る少なくとも＋５０ｍＶの電圧を加えるステップと、
    （ｃ）修飾ＣｌｙＡ細孔のｃｉｓ開口部にＤＮＡ含有試料を加えるステップと、
    （ｄ）細孔を通る流動電流を測定するステップと
    を含む、前記方法。
14. (i)ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡであり、(ii)電流遮断はＤＮＡの移動を示し、(iii)修飾ＣｌｙＡ細孔は、高イオン強度の条件下で使用され、または(iv)前記修飾ＣｌｙＡ細孔が、請求項２から４のいずれか一項において定義されるものである、請求項１３に記載の方法。
15. ＤＮＡを移動させるためのデバイスであって、第１のチャンバーへの膜によって分離されている液体を充填したコンパートメントと、膜を横切って電位を加えることができる電極と、膜に挿入された、複数のサブユニットを含む１以上の修飾ＣｌｙＡ細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含む修飾ＣｌｙＡ細孔（ここで、厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、および／または厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されている）と、１つのチャンバー内の高イオン強度の溶液とを含み、ここで、ＤＮＡは１以上の修飾ＣｌｙＡ細孔を通って第１のチャンバーから第２のチャンバーへ移動する、
    前記デバイス。