KR102309424B1 - 나노포어를 이용한 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents
나노포어를 이용한 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 나노포어 및 RNA 표적을 이용한 약물 스크리닝 기술에 관한 것이다. 본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 피코몰 수준의 극미량의 시료로도 리보스위치를 표적으로 하는 물질 또는 약물을 효율적으로 스크리닝할 수 있다. 리보스위치를 표적으로 하여 발굴된 물질은 리보스위치에 의해 조절되는 질병의 치료에 사용될 수 있으며, 특히 항균제 또는 항생제 발굴에 유용하다.
Description
본 발명은 나노포어를 이용한 약물 스크리닝에 관한 것이다.
항생제 내성은 심각한 공중 보건의 문제로서, 다제내성 슈퍼박테리아로 인한 사망률 및 이환율의 증가는 인체 건강에 대한 주요 위협이다. 항생제 내성을 극복하기 위해서는 새로운 작용 기전 및/또는 새로운 항생제를 개발하는 것이 필수적이다.
리보스위치(riboswitch)는 아미노산과 그 유도체(라이신, 글리신, SAM. SAH), 코엔자임(FMN, TPP, coenzyme B12), 핵 염기와 그 유도체(아데닌, 구아닌, c-di-GMP, c-di-AMP, preQ1) 및 이온(Mg2+)과 같은 저분자 대사 산물 및 이온에 대한 반응으로 박테리아의 유전자 발현을 조절한다. 리보스위치는 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인으로 구성된다. 리보스위치 앱타머 도메인의 동족 대사산물에 대한 결합은 발현 플랫폼 도메인에서 순차적인 형태적 변화를 포함하여 3차원 구조 접힘 (folding)을 유도한다. 이러한 구조 재배열을 통해 리보스위치는 박테리아 대사와 관련된 유전자의 전사 또는 번역을 조절한다. 리보스위치는 선택성이 높은 저분자를 인식하도록 진화했으며, 진핵 생물이 아닌 박테리아에 존재하므로 교차 반응 없이 박테리아만을 특정하여 표적화 할 수 있다. 따라서, 세균성 리보스위치를 표적으로 하는 것은 특히 슈퍼 박테리아에서 항생제 내성을 극복하기 위한 유망한 전략이 될 수 있다. 치료적 표적으로서 질병 관련 RNA의 중요성에도 불구하고, 이들에 대한 저분자 약물의 효율적인 약물 스크리닝은 다량의 RNA의 필요성, 표면 플라즈마 공명의 낮은 감도, RNA에 대한 저분자 결합 검출, 형광 기반 분석에서 RNA의 화학적 표지의 필요성 등과 같은 방법에 의해 제한적이다. 이에 고효율의 새로운 약물 스크리닝 기술의 개발은 다양한 RNA 매개 질병에 대한 약물 발굴을 촉진할 것이다.
나노포어 센싱은 생체 분자들의 단일 분자 분석을 위한 새로운 기술이다. 인가된 전압에서 단일 나노포어 채널을 통한 하전된 분석물의 이동은 이온 전류의 일시적인 차단을 유도하며, 이는 전류 세기(current amplitude) 및 통과 또는 체류 시간(dwell time)으로 측정된다. 단백질 나노포어를 이용한 호모유리딘 RNA 단편(PolyU)를 나노포어를 기반으로 검출한 이후, 다양한 나노포어 기반 접근법이 핵산을 감지하는데 사용되었다(비특허문헌 1). 단백질 나노포어 중에서는 황색 포도상구균이 분비하는 독소인 알파-헤몰라이신(α-hemolysin, αHL)이 주로 핵산 분석에 사용된다. 293개 아미노산으로 구성된 단백질 모노머 (monomer)가 지질 이중층에서 자가 조립하여 ~ 10 nm 길이의 채널을 포함하여 안정한 헵타머 (heptamer) 기공을 형성한다. αHL 나노포어는 정교한 기하학적 구조와 1.4nm 직경의 좁은 협착부(constriction)로 인해 단일 분자의 검출, 특히 핵산의 검출에 적합한 플랫폼이다. 그러나, 핵산에 대한 저분자 약물 스크리닝에 단백질 나노포어를 적용하는 기술은 제한적으로 보고되어 있다(비특허문헌 2).
이에 본 발명자들은 나노포어를 이용한 저분자 약물 스크리닝 기술을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 리간드에 의한 리보스위치의 3차원적 구조변화를 나노포어를 통해 검출할 수 있음을 확인하였으며, 이로부터 리보스위치-표적 물질 스크리닝 시스템을 구축함으로써 본 발명을 완성하였다.
B. M. Venkatesan and R. Bashir, Nat. Nanotechnol., 2011, 6, 615-624.
M. Wanunu, S. Bhattacharya, Y. Xie, Y. Tor, A. Aksimentiev and M. Drndic, ACS Nano, 2011, 5, 9345-9353.
본 발명의 일 목적은 나노포어를 이용하여 리보스위치-표적 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 나노포어를 이용하여 항균제 또는 항생제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 목적은 나노포어를 포함하는 리보스위치-표적 물질 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 나노포어를 이용한 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법은 (a) 리보스위치가 나노포어를 통과하면서 발생하는 전기적 신호 또는 체류 시간을 측정하는 단계; (b) 상기 리보스위치에 결합할 것으로 기대되는 후보물질을 리보스위치에 처리하고, 상기 리보스위치가 나노포어를 통과하면서 발생하는 전기적 신호 또는 체류 시간을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 측정된 전기적 신호 또는 체류 시간을 비교하여 (b)단계에서 전기적 신호의 종류가 2개 이상으로 되거나, 체류 시간이 증가하는 경우 상기 후보물질을 리보스위치-표적 물질로 선별하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법은 리보스위치에 표적 물질이 결합되어 나타나는 리보스위치의 3차원적 구조 변화를 전기적 신호로 측정 및 비교하여 리보스위치-표적 물질을 발굴할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 리보스위치 단독상태와 비교할 때 리보스위치-리간드 복합체의 경우 나노포어 체류 시간(dwell time)이 더 길게 측정되는 것을 확인하였고, 리보스위치 단독상태의 경우 타입-I의 단일레벨 전기신호만이 확인되는 반면, 리보스위치-리간드 복합체의 경우 타입-I과 타입-II의 이중레벨 전기 신호가 섞여서 관측되는 것을 확인하였다. 이로부터, 전기신호의 발현 양상과 나노포어 체류 시간의 차이를 이용하여 리간드의 결합 및 삼차원적 접힘 유도에 의한 리보스위치의 구조 변화를 나노포어로 검출할 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 용어, "리보스위치(riboswitch)”는 세포 내에서 특정 대사산물 등의 저분자 물질이 특이적으로 결합할 수 있는 mRNA의 조절부위를 의미하며, 리보스위치는 상기 특정 대사산물의 농도를 감지하여 하류에 위치한 mRNA에 의해 코딩된 유전자의 발현량을 조절하는 생체 센서로 작용한다. 즉, 상기 리보스위치에 특정 물질(예컨대 대사산물)의 결합 여부에 따라 이 mRNA로부터 단백질이 합성되는 정도가 조절된다. 리보스위치는 개념적으로 크게 앱타머 도메인(aptamer domain)과 발현 플랫폼 도메인(expression platform domain)으로 구분되는데, 상기 앱타머 도메인은 특정 물질에 직접 결합하는 부위이고, 상기 발현 플랫폼 도메인은 앱타머 도메인의 변화에 반응하여 구조적 변화가 발생하는 부위이다.
상기 리보스위치는 예를 들어, 아데닌 리보스위치와 구아닌 리보스위치를 포함하는 퓨린 리보스위치, 라이신 리보스위치, 사이클릭 디-GMP 리보스위치, glmS 리보스위치, TPP 리보스위치, 및 FMN 리보스위치 등 일 수 있다. 구체적으로, 상기 리보스위치는 리간드가 결합할 수 있는 앱타머 도메인을 갖는 것이라면 제한없이 포함될 수 있고, 예를 들어 상기 리보스위치가 아데닌 리보스위치인 경우 아데닌이 결합할 수 있는 최소한의 길이를 갖는 것이면 제한없이 포함될 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "리보스위치-표적 물질"은 리보스위치의 앱타머 영역에 결합할 수 있는 저분자 화합물을 의미한다. 상기 저분자 화합물은 표적 리보스위치에 결합함으로써 전사와 번역의 기능을 조절할 수 있고, 예를 들어 박테리아에서 발견되는 리보스위치를 표적으로 하는 리간드일 수 있다. 상기 리간드가 항생제의 내성 균주에 존재하는 리보스위치와 결합하는 리간드일 경우 항생제의 내성을 극복할 수 있는 새로운 항생제 후보물질이 될 수 있다. 이에, 본 발명의 리보스위치-표적 물질은 항균제 또는 항생제 일 수 있다.
본 발명의 용어, "후보물질"은 리보스위치의 앱타머 도메인에 결합할 수 있을 것으로 예상되는 모든 물질을 의미하며, 예를 들어 저분자 화합물, 단백질, 올리고펩티드, 다당류, 폴리뉴클레오티드 등의 임의의 분자일 수 있다. 이러한 후보물질은 천연 물질뿐만 아니라 합성 물질을 모두 포함한다.
본 발명의 "리보스위치-리간드 복합체" 또는 "리보스위치-표적 물질 복합체"는 리보스위치 및 이의 리간드 또는 이의 표적물질이 서로 결합하여 형성된 복합체를 의미하고, 본 명세서에서는 동등한 의미로 상호교환적으로 사용되며, 복합체 형성시 결합의 방법이나 위치, 복합체의 크기 등의 제한없이 전하를 가지는 것이라면 제한없이 포함된다.
구체적으로, 상기 리보스위치-표적 물질 복합체는 복합체 형성 전에 비하여, 상기 나노포어를 통과하는 전기적 신호의 세기를 변화시키는 것일 수 있다. 상기 결합체의 형성은 결합 전후의 단백질 전하 특성을 변화시킴으로써, 나노포어를 통과하는 전류를 변화시키므로, 상기 변화된 전기적 신호의 종류 및 결합체가 나노포어를 통과하는 시간으로부터 리보스위치와 표적 물질의 결합 형성을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 리보스위치에 리간드가 결합된 리보스위치-리간드 복합체는 나노포어를 통과하기 위해 두 단계의 과정을 거치며 이 과정에서 이중레벨의 전기 신호와 리보스위치 단독상태보다 2배 이상 큰 체류 시간을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 용어, "나노포어"는 리보스위치 또는 리보스위치-표적 물질 복합체를 제1 구획에서 제2 구획으로 통과시킬 수 있는 구조물을 의미한다. 상기 통과되는 리보스위치 또는 리보스위치-표적 물질 복합체는 전하 특성에 따라, 서로 다른 전기적 신호를 발생시킬 수 있다.
본 발명에서 나노포어는 리보스위치 또는 리보스위치-표적 물질 복합체를 통과시킬 수 있는 직경을 가진 것이라면 제한없이 포함될 수 있으며, 구체적으로 좁은 협착부 (또는 전위의 효율을 억제 또는 저하시키는 영역)을 가지는 단백질 나노포어 일 수 있고, 예를 들어, α-헤모라이신, ClyA, 에어로라이신, 라이세닌, CsgG, FhaU, FracC, MspA 또는 OmpG 등 일 수 있다.
본 발명의 용어, “전기적 신호”는 리보스위치 또는 리보스위치-표적 물질 복합체가 나노포어를 통과하면서 발생되는 신호를 의미한다. 구체적으로, 상기 리보스위치 또는 리보스위치-표적 물질 복합체가 전압이 걸린 나노포어를 전기영동의 힘에 의해 통과하면서 전기적 신호를 발생시킬 수 있고, 상기 전기적 신호의 일 예는 전류가 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 리보스위치-표적 물질 스크리닝 방법에서는 상기 후보물질이 리보스위치의 앱타머 영역에 결합할 경우 리보스위치-표적 물질로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 리보스위치-리간드 복합체 형성 전 나노포어를 통과하면서 발생된 단일레벨의 전기신호가 복합체 형성으로 인해 이중레벨의 전기신호로 달라지고, 리보스위치-리간드 결합체가 나노포어를 통과하는 시간이 리보스위치가 단독으로 나노포어를 통과하는 시간보다 증가하는 것을 확인하여, 본 발명의 스크리닝 방법이 유효함을 확인하였다.
본 발명의 용어, "스크리닝"은 샘플들 또는 후보물질들 중에서 바람직한 감수성 또는 활성을 갖는 화합물을 가능한 최소의 단계를 거쳐 추출, 분리 및 확인하는 프로세스를 의미한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 리보스위치에 결합하는 물질을 스크리닝하여 발굴하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 리보스위치-표적 후보물질 처리 전후 전기적 신호를 관측, 측정 및 비교하여 리보스위치에 후보물질이 결합되는지 확인함으로써, 리보스위치-표적 물질을 발굴할 수 있다.
본 발명의 리보스위치-표적 물질 스크리닝 방법에서, 상기 리보스위치 표적-물질은 항균제 또는 항생제일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 나노포어를 이용한 항균제 또는 항생제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항균제 또는 항생제의 스크리닝 방법은 (a) 리보스위치가 나노포어를 통과하면서 발생하는 전기적 신호 또는 체류 시간을 측정하는 단계; (b) 상기 리보스위치에 결합할 것으로 기대되는 후보물질을 리보스위치에 처리하고, 상기 리보스위치가 나노포어를 통과하면서 발생하는 전기적 신호 또는 체류 시간을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 측정된 전기적 신호 또는 체류 시간을 비교하여 (b)단계에서 전기적 신호의 종류가 2개 이상으로 되거나, 체류 시간이 증가하는 경우 상기 후보물질을 리보스위치-표적 물질로 선별하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 용어, "리보스위치", "리보스위치-표적 물질", "후보물질", "나노포어", "전기적 신호" 및 "스크리닝"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에서는 In silico 스크리닝을 통해 766개의 천연물 라이브러리로부터 40개의 리보스위치-표적 후보물질을 1차적으로 선별하고, 이들에 대해 나노포어 기반의 약물 스크리닝을 수행한 결과 10% 이상의 타입-II 이동 이벤트가 관찰된 3개의 그룹을 선별하였다. 그 후 개별적인 나노포어 스크리닝을 통해 3개의 새로운 리보스위치-표적 약물을 발굴하였으며, 발굴된 3,4-디카페오일퀴닉산(3,4-dicaffeoylquinic acid), 4,5-디카페오일퀴닉산(4,5-dicaffeoylquinic acid) 및 루테올린-7-글루쿠로니드(luteolin-7-glucuronide)은 모두 타입 II의 이동 이벤트 및 이중레벨 신호를 나타내고, 리보스위치 단독 상태보다 2배 이상 큰 나노포어 체류 시간을 나타내는 것을 확인하였다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 나노포어, (ii) 리보스위치 RNA 및 (iii) 이온 전류와 체류 시간을 측정할 수 있는 구성을 포함하는 리보스위치-표적 물질 스크리닝용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 용어, "리보스위치", "리보스위치-표적 물질", "후보물질", "나노포어", "전기적 신호" 및 "스크리닝"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 리보스위치-표적 물질 스크리닝용 키트는 리보스위치, 리포스위치-후보물질 복합체 또는 리보스위치-표적 물질 복합체가 나노포어를 통과하는 경우 이온 전류, 전기적 신호 또는 체류 시간을 측정할 수 있는 구성이 구비될 수 있다.
본 발명의 리보스위치-표적 물질 스크리닝용 키트에서 상기 체류 시간은 리보스위치-표적 후보물질의 처리에 의해 증가된다.
본 발명의 리보스위치-표적 물질 스크리닝용 키트에서, 상기 리보스위치-표적 물질은 항균제 또는 항생제 일 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 극미량의 시료로도 리보스위치를 표적으로 하는 물질 또는 약물을 효율적으로 스크리닝할 수 있다. 리보스위치를 표적으로 하여 발굴된 물질은 리보스위치에 의해 조절되는 질병의 치료에 사용될 수 있으며, 특히 항균제 또는 항생제 발굴에 유용하다.
본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 아데닌에 의해 유도된 ARS의 3차원적 접힘을 NMR을 기반으로 분석한 결과를 나타낸 것이다: 도 1의 a는 아데닌에 의해 유도된 ARS의 3차원적 접힘 과정에서 ARS의 3가지 분자 상태; 도 1의 b는 50nM KCl 또는 1M KCl 존재 하에서 유리된 ARS 및 ARS-아데닌 복합체의 1D 1H NMR 스펙트럼.
도 2는 리간드를 사용하여 ARS 및 ARS-Mut의 나노포어 이벤트에 대한 통계 분석 결과를 나타낸 것이다: 도 2의 a는 ARS 단독상태에 대한 전류 강하 (I/I0) 및 체류 시간 (td) 히스토그램; 도 2의 b는 ARS-아데닌 복합체에 대한 전류 강하 (I/I0) 및 체류 시간 (td) 히스토그램; 도 2의 c는 아데닌의 구조 및 ARS 단독상태 (검은 색 사각형)와 아데닌이 결합된 ARS (빨간색 원)의 산점도(scatter plot); 도 2의 d는 ARS 단독상태-Mut에 대한 전류 강하 (I/I0) 및 체류 시간 (td) 히스토그램; 도 2의 e는 아데닌이 결합된 ARS-Mut에 대한 전류 강하 (I/I0) 및 체류 시간 (td) 히스토그램; 도 2의 f는 4개의 염기 돌연변이 (U28G, G42C, U47C 및 U51C)가 있는 ARS-Mut의 구조 및 ARS 단독상태-Mut (주황색 사각형) 및 아데닌이 결합된 ARS-Mut(녹색 삼각형)의 나노포어 이벤트 산점도.
도 3은 ARS-아데닌 복합체의 나노포어 이벤트에 대한 통계 분석 결과를 나타낸 것이다: 도 3의 a는 ARS-아데닌 복합체에 대한 두 가지 타입의 전류 트레이스(current trace); 도 3의 b는 타입 I 이벤트의 I/I0 및 체류 시간 히스토그램; 도 3의 c는 타입 II 이벤트의 I/I0 및 체류 시간 히스토그램; 도 3의 d는 복합체 및 ARS 단독상태 (검은 색 사각형)에 대한 타입 I (파란색 원) 및 타입 II (빨간색 원) 이벤트의 산점도; 도 3의 e는 ARS 단독상태, 중간체 및 복합체의 범핑(Bumping) 또는 통과(Translocation)에 대해 제안된 분자 모델.
도 4는 다수의 비-결합 화합물이 존재할 때 ARS와 아데닌의 특이적 상호작용에 대한 나노포어 측정 결과를 나타낸 것이다: 도 4의 a는 비-결합성 화합물의 혼합물이 아데닌 없이 있는 경우 ARS의 타입 I 이벤트에 대한 tI 가 있는 I/I0 히스토그램; 도 4의 b는 비-결합성 화합물의 혼합물이 아데닌과 함께있는 경우, ARS의 타입 I 이벤트에 대한 tI 가 있는 I/I0 히스토그램; 도 4의 c는 아데닌 및 MIX-3의 존재 하에 ARS의 유형 II 이벤트에 대한 tII가 있는 I/I0 히스토그램; 도 4의 d는 MIX-3만 포함하는 ARS (진한 회색) MIX-3 및 아데닌을 포함하는 ARS의 타입 I 이벤트 (파란색) 및 타입 II 이벤트 (빨간색)의 I/I0 히스토그램 비교; 도 4의 e는 ARS와 아데닌의 특이적 상호작용의 나노포어 이동에 대한 개략적 모델.
도 5는 ARS RNA에 대한 나노포어 기반 약물 스크리닝 접근 방식을 나타낸 것이다: 도 5의 a는 히트 화합물 (NC1, NC2 및 NC4)이 존재할 경우 ARS에 대한 나노포어 이벤트의 전류 트레이스로 히트 화합물과 함께 ARS에서 감지된 대표적인 타입 II 이벤트(별표 표시됨)가 오른쪽 열에 표시됨; 도 5의 b 내지 d는 각각의 히트 화합물(NC1 (b), NC2 (c) 및 NC4 (d))의 결합에서 생성된 ARS의 타입 II 이벤트에 대한 I/I0 및 체류 시간 (tII) 히스토그램; 도 5의 e는 ARS 존재 하에서 히트 화합물 및 ARS 비-결합 화합물 (NC11 및 NC12)의 1D CPMG NMR 분석 결과로서 파란색 실선 및 빨간색 점선은 각각 ARS의 부재 및 존재시 천연물의 1D CPMG 스펙트럼을 나타냄.
도 6은 인가 전압의 증가에 따른 이벤트 체류 시간의 변화를 나타낸 것이다: 도 6의 a는 ARS 단독상태(파란색 사각형)의 타입 I 이벤트의 인가 전압((+100 mV, +120 mV, +140 mV 및 +160 mV)에 따른 체류 시간; 도 6의 b는 ARS-아데닌 복합체의 인가 전압 (+80 mV, +100 mV 및 +120 mV)에 따른 체류 시간으로 타입 I 및 타입 II 이벤트는 각각 파란색 삼각형과 빨간색 사각형으로 표시되고, 오차 막대는 표준 오차를 나타냄.
도 7은 MIX-3에서 천연 화합물의 비-결합 능력을 1D-CPMG로 분석한 것이다: 파란색 실선 및 빨간색 점선은 각각 ARS 부재 및 존재시 화합물의 1D CPMG 스펙트럼을 나타냄.
도 8은 실험예 6을 통해 발굴한 ARS 표적 화합물의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 리간드를 사용하여 ARS 및 ARS-Mut의 나노포어 이벤트에 대한 통계 분석 결과를 나타낸 것이다: 도 2의 a는 ARS 단독상태에 대한 전류 강하 (I/I0) 및 체류 시간 (td) 히스토그램; 도 2의 b는 ARS-아데닌 복합체에 대한 전류 강하 (I/I0) 및 체류 시간 (td) 히스토그램; 도 2의 c는 아데닌의 구조 및 ARS 단독상태 (검은 색 사각형)와 아데닌이 결합된 ARS (빨간색 원)의 산점도(scatter plot); 도 2의 d는 ARS 단독상태-Mut에 대한 전류 강하 (I/I0) 및 체류 시간 (td) 히스토그램; 도 2의 e는 아데닌이 결합된 ARS-Mut에 대한 전류 강하 (I/I0) 및 체류 시간 (td) 히스토그램; 도 2의 f는 4개의 염기 돌연변이 (U28G, G42C, U47C 및 U51C)가 있는 ARS-Mut의 구조 및 ARS 단독상태-Mut (주황색 사각형) 및 아데닌이 결합된 ARS-Mut(녹색 삼각형)의 나노포어 이벤트 산점도.
도 3은 ARS-아데닌 복합체의 나노포어 이벤트에 대한 통계 분석 결과를 나타낸 것이다: 도 3의 a는 ARS-아데닌 복합체에 대한 두 가지 타입의 전류 트레이스(current trace); 도 3의 b는 타입 I 이벤트의 I/I0 및 체류 시간 히스토그램; 도 3의 c는 타입 II 이벤트의 I/I0 및 체류 시간 히스토그램; 도 3의 d는 복합체 및 ARS 단독상태 (검은 색 사각형)에 대한 타입 I (파란색 원) 및 타입 II (빨간색 원) 이벤트의 산점도; 도 3의 e는 ARS 단독상태, 중간체 및 복합체의 범핑(Bumping) 또는 통과(Translocation)에 대해 제안된 분자 모델.
도 4는 다수의 비-결합 화합물이 존재할 때 ARS와 아데닌의 특이적 상호작용에 대한 나노포어 측정 결과를 나타낸 것이다: 도 4의 a는 비-결합성 화합물의 혼합물이 아데닌 없이 있는 경우 ARS의 타입 I 이벤트에 대한 tI 가 있는 I/I0 히스토그램; 도 4의 b는 비-결합성 화합물의 혼합물이 아데닌과 함께있는 경우, ARS의 타입 I 이벤트에 대한 tI 가 있는 I/I0 히스토그램; 도 4의 c는 아데닌 및 MIX-3의 존재 하에 ARS의 유형 II 이벤트에 대한 tII가 있는 I/I0 히스토그램; 도 4의 d는 MIX-3만 포함하는 ARS (진한 회색) MIX-3 및 아데닌을 포함하는 ARS의 타입 I 이벤트 (파란색) 및 타입 II 이벤트 (빨간색)의 I/I0 히스토그램 비교; 도 4의 e는 ARS와 아데닌의 특이적 상호작용의 나노포어 이동에 대한 개략적 모델.
도 5는 ARS RNA에 대한 나노포어 기반 약물 스크리닝 접근 방식을 나타낸 것이다: 도 5의 a는 히트 화합물 (NC1, NC2 및 NC4)이 존재할 경우 ARS에 대한 나노포어 이벤트의 전류 트레이스로 히트 화합물과 함께 ARS에서 감지된 대표적인 타입 II 이벤트(별표 표시됨)가 오른쪽 열에 표시됨; 도 5의 b 내지 d는 각각의 히트 화합물(NC1 (b), NC2 (c) 및 NC4 (d))의 결합에서 생성된 ARS의 타입 II 이벤트에 대한 I/I0 및 체류 시간 (tII) 히스토그램; 도 5의 e는 ARS 존재 하에서 히트 화합물 및 ARS 비-결합 화합물 (NC11 및 NC12)의 1D CPMG NMR 분석 결과로서 파란색 실선 및 빨간색 점선은 각각 ARS의 부재 및 존재시 천연물의 1D CPMG 스펙트럼을 나타냄.
도 6은 인가 전압의 증가에 따른 이벤트 체류 시간의 변화를 나타낸 것이다: 도 6의 a는 ARS 단독상태(파란색 사각형)의 타입 I 이벤트의 인가 전압((+100 mV, +120 mV, +140 mV 및 +160 mV)에 따른 체류 시간; 도 6의 b는 ARS-아데닌 복합체의 인가 전압 (+80 mV, +100 mV 및 +120 mV)에 따른 체류 시간으로 타입 I 및 타입 II 이벤트는 각각 파란색 삼각형과 빨간색 사각형으로 표시되고, 오차 막대는 표준 오차를 나타냄.
도 7은 MIX-3에서 천연 화합물의 비-결합 능력을 1D-CPMG로 분석한 것이다: 파란색 실선 및 빨간색 점선은 각각 ARS 부재 및 존재시 화합물의 1D CPMG 스펙트럼을 나타냄.
도 8은 실험예 6을 통해 발굴한 ARS 표적 화합물의 화학 구조를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[준비예 1]
리보스위치 RNA 및 단백질 나노포어의 준비
RNA 는 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA, USA)에서 합성되었다. 염기서열 정보는 아래 [표 1]에 표기하였다. 모든 RNA 10mM 인산칼륨(pH 6.2) 버퍼에 대하여 12시간 이상 투석시켰다. RNA 95℃에서 가열한 후, 5분 동안 얼음에서 빠르게 어닐링(annealing)하였다. 나노포어 실험은 10 ~ 500 nM RNA 농도에서 수행하였다. α-헤몰리신(α-hemolysin, αHL) 단백질은 List Biological Laboratories Inc.(Campbell, CA, USA)에서 구입하였다. DPhPC(1,2-diphytanoylsn-glycero-3-phosphocholine)는 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)에서 구입하였다.
| 이름 | 염기서열 (5'->3') | 길이 | 서열번호 |
| ARS | GGC UUC AUA UAA UCC UAA UGA UAU GGU UUG GGA GUU UCU ACC AAG AGC CUU AAA CUC UUG AUU AUG AAG UC | 71 nt | 1 |
| ARS-Mut | GGC UUC AUA UAA UCC GAA UGA UAU GGU UUC GGA GCU UCC ACC AAG AGC CUU AAA CUC UUG AUU AUG AAG UC | 71 nt | 2 |
[실험예 1]
리간드에 의해 유도된 리보스위치의 구조 변화 확인
먼저, NMR 분석을 통해 리간드가 리보스위치에 결합함에 따라 리보스위치의 구조가 3차원적으로 변화하는 것을 아데닌-센싱 리보스위치(Adenine-sensing riboswitch, ARS)와 아데닌을 이용하여 확인하였다.
ARS는 박테리아 퓨린 대사에 필수적인 아데노신 탈아미노화효소(adenosine deaminase, ADD)의 번역을 조절한다. 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)의 ARS의 앱타머 도메인은 3개의 나선형 줄기 (P1-P3), 2개의 헤어핀 루프 (L2 및 L3) 및 3개의 결합 부위 (J1-2, J3-1 및 J2-3)로 구성된다 (도 1의 a). ARS는 단독상태(free state)에서는 유연하지만 아데닌에 결합하면 튜닝포크(tuning-fork)와 같은 3차 구조로 접힌다. 중간상태(intermediate state)를 통해 복합체의 3차 구조는 아데닌 결합 부위의 새로운 염기 삼중체 형성과 루프 L2와 L3 사이의 수소 결합을 통해 안정화 된다(도 1의 a). ARS는 박테리아 퓨린 대사의 번역을 제어한다.
구체적으로, 아데닌 결합에 의해 유도되는 ARS의 3차원적 접힘(tertiary folding)을 모니터링하기 위해 아데닌이 부재 또는 존재하는 상태에서 ARS로 1D NMR 실험을 수행했다. ARS-아데닌 복합체(ARS-adenine complex)는 ARS가 3차원적으로 접히는 동안 새로운 수소 결합 형성에 의해 생성된 U31, U39, U47 및 U49의 4가지 특징적인 이미노 양성자 피크를 나타냈다. 아데닌 결합시 U31-U39의 비정규 염기쌍이 형성되었으며, 이는 L2와 L3 루프 사이의 장거리 3차 상호 작용에 중요하다(도 1). 또한 새로운 수소가 추가되었다. 아데닌 결합 부위의 결합 네트워크는 U47 및 U49 이미노 양성자 피크를 생성했다. NMR 분석은 ARS에 대한 아데닌의 결합이 극적인 구조적 재배열을 유도하고 복합체의 3차 구조를 실질적으로 안정화시키는 것으로 나타났다. 나노포어 측정에 앞서 ARS는 복합체의 4가지 특징적인 이미노 양성자 피크를 검출하여 높은 염 농도 (1M KCl)에서도 아데닌에 결합함을 확인했다(도 1의 b).
[실험예 2]
나노포어를 이용한 리보스위치 구조 변화 검출가능성 확인
α-헤모라이신(α-hemolysin, α-HL) 나노포어를 사용하여 리보스위치와 리간드의 상호작용을 단일분자 수준에서 검출할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 10mM 인산칼륨(pH 6.2), 2mM MgCl2 및 1M KCl을 포함하는 버퍼 상에서 ARS 단독상태(free ARS) 또는 ARS-아데닌 복합체(ARS-adenine complex)를 단일의 αHL 나노포어가 있는 지질 이중층의 cis면에 추가했다. 나노포어에 (+) 100mV의 전압을 걸어주면 ARS 단독상태 또는 ARS-아데닌 복합체가 전기 영동으로 구동되어 이온 전류가 차단된다. ARS 단독상태와 ARS-아데닌 복합체의 나노포어 이벤트를 통계적으로 분석했다 (도 2의 a 내지 c). ARS 단독상태의 나노포어 이벤트는 평균 체류 시간 (dwell time, td)이 0. 38ms인 0.69 및 0.86의 두 가지 평균 전류 차단 (I/I0 )을 나타냈다(도 2의 a). 특히, ARS-아데닌 복합체는 I/I0값 (0.69 및 0.87)과 ARS 단독상태보다 유의적으로 증가한 평균 td d (0.63 ms)를 가진 전류 차단을 생성했다(도 2의 b).
다음으로, 4개의 염기 돌연변이 (U28G, G42C, U47C 및 U51C)가 있는 ARS 돌연변이 (ARS-Mut)를 사용하여 나노포어 이벤트를 측정하여 ARS-아데닌 결합을 방해했다 (도 2의 d 내지 f). ARS-Mut의 I/I0 (0.68 및 0.82) 및 td (0.50ms) 값은 ARS 단독상태-Mut의 값과 크게 다르지 않았다 (도 2의 d 내지 e). 또한, 아데닌이 있는 ARS-Mut의 산점도는 ARS 단독상태-Mut의 분포와 매우 유사한 분포를 보여주었다(도 2의 f).
이로부터, ARS-아데닌 복합체에서 관찰된 체류 시간의 유의적인 증가는 ARS와 아데닌의 특이적인 상호작용에 의한 것이며, 이를 나노포어를 이용하여 검출할 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 3]
부분적으로 접힌 리보스위치 중간체의 특징적인 나노포어 이벤트 확인
ARS-아데닌 복합체로부터 두 가지 타입의 특징적인 전류 차단 이벤트를 관찰하였다.
구체적으로, ARS 단독상태는 단일레벨의 이온 전류 차단이 있는 타입 I 이벤트만 보였지만 ARS-아데닌 복합체는 타입 I 및 타입 II의 이벤트가 섞여서 이중레벨의 전기신호가 관측되었다(도 3의 a). 타입 II 이벤트는 구별되는 지속시간 (tII1 및 tII2)과 함께 두 가지 전류 레벨 (III1 및 III2로 지칭 됨)의 특징적인 패턴을 보였으며, 이는 이들이 아데닌이 결합된 ARS RNA에서 발생했음을 나타낸다. 타입 II 이벤트의 레벨 1 (III1)의 평균 I/I0 값은 0.45로 레벨 2 (III2)의 약 50 %에 해당한다. 이후 복합체의 타입 I 및 II 나노포어 이벤트를 분리한 후 각 타입의 이벤트를 통계적으로 분석했다. ARS-아데닌 복합체의 타입 I 및 II 이벤트는 I/I0 의 평균 값과 체류 시간에서 차이가 있었다 (도 3의 b 내지 c). 특히, 체류 시간은 타입 II 이벤트(tII, 2.14ms)가 타입 I 이벤트 (tI, 0.28ms) 보다 더 길게 측정되었으며, 현저한 차이를 나타내었다. 또한, 타입 I 및 II 이벤트의 산점도는 명확하게 구별되는 분포를 나타냈다 (도 3의 d).
이로부터, ARS-아데닌 복합체에서 관찰된 특징적인 전류차단 이벤트를 이용하여 리보스위치와 리간드의 상호작용을 나노포어를 이용하여 검출할 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 4]
나노포어를 이용한 리보스위치 구조 변화 검출 모델의 구축
실험예 2 및 3에서 분석한 나노포어 데이터를 기반으로 리보스위치 단독 및 리간드-결합 리보스위치의 나노포어 이벤트에 대한 분자모델을 구축하였다 (도 3의 e).
아데닌에 의해 유도된 ARS RNA의 3차원적 접힘이 진행되는 동안 3가지 분자 상태 (ARS 단독, 중간체 및 ARS-아데닌 복합체)가 생성될 수 있다. 평활말단(Blunt end) A형 RNA 듀플렉스(Duplex)는 A형 듀플렉스의 직경이 크기 때문에 α-HL 나노포어를 통과하지 못한다는 것이 알려져 있다. 따라서 ARS 단독상태는 짧은 평균 체류 시간 (0.38ms)과 단일레벨 전류 차단으로 빈번한 범핑(Bumping) 신호를 발생시킨다(도 2의 a). 마찬가지로, 접힘 공정의 최종 생성물인 안정된 평활말단의 P1 스템(Stem)을 가진 ARS-아데닌 복합체는 포어에 들어갈 수 없으므로 평균 tI가 0.28ms 인 타입 I 범핑 이벤트가 발생한다 (도 3의 b).
ARS 단독 또는 복합체와는 달리, 유연한 말단 스템과 준안정(Matastable) 상태의 2차 구조를 가지는, 부분적으로 접힌 ARS 중간체는 두 단계 공정을 통해 나노포어를 통과 할 수 있다. 1단계는 아데닌-결합 ARS의 2차 구조를 포착하고 단일 가닥으로 언지핑(unzipping)하는 것이다 (도 3의 e). 서브-체류 시간 tII1 동안, 아데닌-결합 ARS의 나선형 듀플렉스가 α-HL 나노포어의 통로(vestibule) 외부에서 염기쌍이 풀리는 언지핑(unzipping)이 일어난다. ARS의 언지핑 과정이 완료되면 2단계에서 나노포어를 통과하는 과정을 거치게 된다. 서브-체류 시간 tII2 동안 나노포어에서 즉시 방출된다 (도 3의 e, 중간 컬럼). 전압-의존적인 나노포어 검출을 통해 타입 II 이벤트가 포어 통과(translocation)의 결과임을 확인하였다. 복합체에서 발생하는 타입 II 이벤트는 인가 전압이 증가함에 따라(+80mV에서 +120mV으로) 체류 시간이 크게 감소한 것으로 나타났다(도 6). 이는 분석물이 나노포어를 통과함을 나타낸다.
타입 II 나노포어 통과 이벤트(translocation event)와 달리 ARS 단독 및 복합체의 타입 I 이벤트는 인가 전압이 증가해도 유사한 체류 시간을 나타내었다.
종합하면, 아데닌-결합 ARS는 2단계 이온 전류 차단과 타입 I 이벤트 보다 ~ 7.64배 더 긴 체류 시간 (2.14ms)으로 타입 II 이동 신호를 생성한다. 이러한 상당한 시간의 지연은 유연한 말단 스템을 사용하여 아데닌-결합 중간체의 듀플렉스의 단일가닥으로 분리 즉, 언지핑 (Unzipping) 한 결과로 발생할 수 있다.
이로부터, 단일 분자 기반 나노포어 센서가 리간드 결합-커플링된 RNA 접힘 경로에서 생성된 일시적이고 부분적으로 접힌 중간체를 감지하는데 유용한 플랫폼임을 알 수 있다.
[실험예 5]
나노포어 기반의 약물 스크리닝 가능성 확인
리보스위치와 리간드의 상호작용을 나노포어로 검출함으로써 약물을 스크리닝 할 수 있는지 확인하고자 하였다. 또한, 여러 성분의 천연물이 포함된 상태에서도 리보스위치와 리간드의 특이적 결합을 검출할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 아데닌의 부재 또는 존재 하에서 ARS에 결합하지 않는 비-결합 화합물 (MIX-3: ATP, (-)-에피카테킨 및 트라미프로세이트)의 혼합물을 이용하여 나노포어 측정을 수행하였다 (도 4). MIX-3은 타입 I 이벤트만 생성했으며 평균 I/I0 이 0.69 및 0.87이고 상대적으로 짧은 td (0.31ms)를 나타내었다. 이는 MIX-3이 ARS에 결합하여 삼차원적 구조변화를 유도하지 않음을 의미한다(도 4의 a). MIX-3에서 각 화합물의 비-결합 능력은 리간드 관찰 NMR 스크리닝 기법인 1D CPMG에 의해 추가적으로 확인하였다 (도 7)
그러나 MIX-3에 아데닌을 첨가하면 타입 I 및 타입 II 이벤트가 혼합되어 나타났으며, 후자는 ARS 단독상태 보다 나노포어 체류 시간 (tII, 2.52ms)이 ~ 6.6 배 더 증가하였다 (도 4의 c).
이로부터, 타입 II 통과 이벤트의 특징적인 깊은 전류 차단은 ARS에 대한 약물 결합을 식별하고 체류 시간을 늘리는 데 사용할 수 있음을 알 수 있다. 또한, ARS에 대한 아데닌의 특이적 결합은 여러 물질을 포함하는 복잡한 샘플에서도 나노포어에 의해 검출될 수 있음을 알 수 있다(도 4의 e).
[실험예 6]
리보스위치 구조 변화 검출 모델을 이용한 약물 스크리닝
실험예 4의 구조 변화 검출 모델을 이용하여 나노포어 기반의 약물 스크리닝을 수행하였다.
구체적으로, Discovery Studio 소프트웨어 내의 LibDock 및 CDOCKER 프로그램을 사용하여 ARS에 대한 항생제 약물의 인 실리코(in silico) 스크리닝을 수행하였다. 766 개의 천연물로 구성된 라이브러리에서 LibDock 및 CDOCKER 계산상의 도킹 점수(docking score)가 가장 높거나 상호작용 에너지가 가장 낮은 40개의 천연물을 1차적으로 선별했다 (표 2).
| 화합물 | LibDock 점수 (kcal/mol) |
화합물 | CDOCKE 상호작용에너지 (kcal/mol) |
| NC1 | 172.57 | NC21 | -54.58 |
| NC2 | 172.57 | NC22 | -38.16 |
| NC3 | 161.69 | NC23 | -36.87 |
| NC4 | 158.44 | NC24 | -35.56 |
| NC5 | 158.18 | NC25 | -29.35 |
| NC6 | 155.07 | NC26 | -28.95 |
| NC7 | 152.2 | NC27 | -28.18 |
| NC8 | 151.41 | NC28 | -25.3 |
| NC9 | 148.99 | NC29 | -25.01 |
| NC10 | 144.52 | NC30 | -23.55 |
| NC11 | 143.68 | NC31 | -23.51 |
| NC12 | 143.68 | NC32 | -22.77 |
| NC13 | 143.11 | NC33 | -22.76 |
| NC14 | 139.99 | NC34 | -22.02 |
| NC15 | 139.43 | NC35 | -21.23 |
| NC16 | 136.68 | NC36 | -21.04 |
| NC17 | 136.68 | NC37 | -20.41 |
| NC18 | 134.68 | NC38 | -20.41 |
| NC19 | 134.37 | NC39 | -20.18 |
| NC20 | 134.37 | NC40 | -19.66 |
40개의 천연물들을 각각 4 개의 천연물로 구성된 10 개 그룹으로 나누어 나노포어 기반 약물 스크리닝을 수행하였다. 나노포어 스크리닝 결과에서 10 % 이상의 type II 특이적 이동 이벤트(translocation event)를 가진 3 개의 그룹을 선별하였다. 이후 선별된 그룹의 각 개별 화합물에 대한 후속 나노포어 기반 스크리닝을 통해 최종적으로 3개의 새로운 ARS 표적-천연물 히트를 발굴하였다(도 8). NC1 (3,4-디카페오일퀸산), NC2 (4,5-디카페오일퀸산) 및 NC4 (루테올린-7-글루쿠로나이드)의 히트 화합물들은 모두 타입 II의 이동 이벤트와 ARS 단독상태보다 4.1~7.3배 이상 큰 체류 시간을 나타내었다 (도 5의 a 내지 d). 히트 천연물들이 ARS에 결합하는지 확인하기 위하여 NMR 분광법을 사용하여 ARS의 부재 또는 존재 하에 3개의 히트 화합물로 1D CPMG 실험을 수행했다. ARS와 결합하지 않는 천연물(NC11 및 NC12)과 달리 NC1, NC2 및 NC4는 ARS를 추가한 후 1D CPMG 스펙트럼에서 극적인 피크라인 확장(peak line-broadening) 및/또는 상당한 화학적 이동(chemical shift) 변화를 보여 ARS가 히트 천연물들과 확실히 결합함을 확인하였다 (도 5의 e). 특히 NC1과 NC2는 새로운 항생제 약물에 대한 공통 스캐폴드를 공유함을 확인하였고, 3가지 히트 화합물은 모두 항균 활성 또는 항염증 활성을 갖는 약초에서 유래한다는 것을 확인하였다: Lonicera japonica (NC1 및 NC2) 및 Marchantia berteroana (NC4).
이로부터, 본 발명의 나노포어 기반의 약물 스크리닝 기술은 질환과 관련된 다양한 RNA 표적들로 확대하여 적용할 수 있고, 단일 성분으로 사전 분류 할 필요없이 다 성분 천연물을 고효율로 단시간 내에 스크리닝 할 수 있음을 알 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Biosience and Biotechnology
<120> SCREENING METHOD FOR THE RIBOSWITCH-TARGETED SUBSTANCES USING
NANOPORES
<130> 2020-DPA-3714
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 71
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARS
<400> 1
ggcuucauau aauccuaaug auaugguuug ggaguuucua ccaagagccu uaaacucuug 60
auuaugaagu c 71
<210> 2
<211> 71
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARS-Mut
<400> 2
ggcuucauau aauccgaaug auaugguuuc ggagcuucca ccaagagccu uaaacucuug 60
auuaugaagu c 71
Claims (12)
- (a) 리보스위치가 나노포어를 통과하면서 발생하는 전기적 신호 또는 체류 시간을 측정하는 단계;
(b) 상기 리보스위치에 결합할 것으로 기대되는 후보물질을 리보스위치에 처리하고, 상기 리보스위치가 나노포어를 통과하면서 발생하는 전기적 신호 또는 체류 시간을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 측정된 전기적 신호 또는 체류 시간을 비교하여 (b)단계에서 측정된 체류 시간이 더 길게 측정되는 경우 또는 (b) 단계에서 이중레벨로 전기적 신호의 변화가 측정되는 경우, 상기 후보물질을 리보스위치-표적 물질로 선별하는 단계;를 포함하는 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 단계 (b)에서 리보스위치에 후보물질이 결합되어 나타나는 리보스위치의 3차원적 구조 변화를 전기적 신호로 측정하는 것인, 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법.
- 청구항 2에 있어서,
상기 리보스위치의 3차원적 구조의 변화가 나노포어를 통과하는 시간을 지연시키는 것인, 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 리보스위치는 퓨린 리보스위치, 라이신 리보스위치, 사이클릭 디-GMP 리보스위치, glmS 리보스위치, TPP 리보스위치, 및 FMN 리보스위치로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인, 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 나노포어를 생성하는 단백질은 α-헤모라이신, ClyA, 에어로라이신, 라이세닌, CsgG, FhaU, FracC, MspA 및 OmpG로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 리보스위치-표적 물질은 항균제 또는 항생제인, 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법.
- (a) 리보스위치가 나노포어를 통과하면서 발생하는 전기적 신호 또는 체류 시간을 측정하는 단계;
(b) 상기 리보스위치에 결합할 것으로 기대되는 후보물질을 리보스위치에 처리하고, 상기 리보스위치가 나노포어를 통과하면서 발생하는 전기적 신호 또는 체류 시간을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 측정된 전기적 신호 또는 체류 시간을 비교하여 (b)단계에서 측정된 체류 시간이 더 길게 측정되는 경우 또는 (b) 단계에서 이중레벨로 전기적 신호의 변화가 측정되는 경우, 상기 후보물질을 항균제 또는 항생제로 선별하는 단계;를 포함하는 항균제 또는 항생제의 스크리닝 방법.
- 청구항 7에 있어서,
상기 리보스위치는 앱타머 도메인 및 발현 도메인을 포함하고, 상기 후보물질이 앱타머 도메인에 결합하여 리보스위치의 3차원적인 구조를 변화시킴으로써 유전자의 번역을 억제하는 것인, 항균제 또는 항생제의 스크리닝 방법.
- 청구항 7에 있어서,
상기 항균제 또는 항생제는 3,4-디카페오일퀴닉산(3,4-dicaffeoylquinic acid), 4,5-디카페오일퀴닉산(4,5-dicaffeoylquinic acid) 및 루테올린-7-글루쿠로니드(luteolin-7-glucuronide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 항균제 또는 항생제의 스크리닝 방법.
- (i) 나노포어, (ii) 리보스위치 RNA 및 (iii) 이온 전류와 체류 시간을 측정할 수 있는 구성을 포함하는 리보스위치-표적 물질 스크리닝용 키트.
- 청구항 10에 있어서,
상기 체류 시간은 리보스위치-표적 후보물질의 처리에 의해 증가되는 것인, 스크리닝용 키트.
- 청구항 10에 있어서,
상기 리보스위치-표적 물질은 항균제 또는 항생제인, 스크리닝용 키트.
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| KR1020200126367A KR102309424B1 (ko) | 2020-09-28 | 2020-09-28 | 나노포어를 이용한 리보스위치-표적 물질의 스크리닝 방법 |
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Patent Citations (2)
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