KR20180085742A - 추적 및 검출을 위한 표적 변형 - Google Patents

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KR20180085742A
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트레보 제이. 모린
다니엘 에이. 헬러
윌리엄 비. 던바
타일러 슈롭셔
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투 포어 가이즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 나노포어 디바이스에서의 검출을 용이하게 하도록 변형된 표적 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 나노포어 디바이스를 사용한 이러한 변형된 표적 분자의 검출 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제학적, 화학적 또는 생물학적 제품을 추적하고 입증하기 위한, 그리고 변형된 표적 분자를 포함하는 시료의 다양한 조건을 측정하기 위한 이러한 변형된 표적 분자의 이용 방법을 개시한다.

Description

추적 및 검출을 위한 표적 변형
상호-참조
본 출원은 2015년 11월 23일자 출원된 미국 가출원 제62/259,012호의 이익을 주장하며, 상기 기초 출원은 그의 전문이 참고로 포함된다.
나노-스케일 및 마이크로-스케일 분자, 예를 들어, 생물학적 치료제, 소분자 약물, 화학적 또는 생물학적 제품의 성분, 또는 화학적 또는 생물학적 지시약의 검출은 큰 가치를 갖는다.
예를 들어, 이러한 검출은 그들의 판매처를 통해 그들의 생산 지점에서 소비자까지 약제학적, 화학적 또는 생물학적 제품의 추적 및 검증을 가능하게 한다. 이러한 추적 및 검증은 매우 어렵고 시간이 많이 소요된다. 이러한 제품의 추적을 돕고, 주어진 시간의 특정 제품의 구성성분을 결정하는 방법이 존재하지만, 표준 방법은 시료를 실험실에 보내는 것이며, 이는 실현 가능하더라도, 종종 시간이 많이 소요되는 과정이다.
나노-스케일 및 마이크로-스케일 분자의 검출은 또한, 시료의 다양한 물리적 또는 생리학적 조건의 측정을 가능하게 한다. 예를 들어, 다양한 조건, 예를 들어, pH, 독성 조성물, 화학적 조성물, 온도 등에 반응하여, 그들의 입체형태, 구조 또는 안정성을 변경시키는 것으로 알려져 있는 다수의 나노-스케일 및 마이크로-스케일 분자가 존재한다. 그러나, 이러한 분자의 물리적 상태를 검출하고, 관련 정보를 수득하는 것은 어렵고 시간이 소요된다.
나노포어 디바이스를 사용한 나노-스케일 및 마이크로-스케일 분자의 검출이 최근에 가능해졌다. 나노포어 검출은 나노-스케일 및 마이크로-스케일 분자를 검출하고 분석하는 신속하고, 휴대가 쉬우며, 저렴하고, 정확한 수단이다. 그러나, 나노포어 검출의 적용은 소수의 표적 분자에 제한되는데, 그 이유는 나노포어 검출이, 분자가 포획되고, 나노포어를 통과하고, 나노포어 센서에 의해 검출 가능하게 하는 특정 물리적 특성(예를 들어, 크기, 전하 등)을 표적 분자가 갖는 것을 필요로 하기 때문이다. 따라서, 본질적으로 상기 특성을 갖지 않는 다양한 표적 분자에 대한 나노포어 기법의 적용 방법이 필요하다.
본 명세서에 개시된 다양한 양태는 상기-언급된 요구 중 하나 이상을 충족시킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 각각 몇몇의 양태를 가지며, 몇몇의 양태 중 어떠한 단일의 양태도 단독으로 그의 바람직한 속성을 담당하지 않는다. 후속하는 청구범위에 의해 표현되는 바와 같은 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서, 더욱 중요한 특성이 이제 간략히 논의될 것이다. 이러한 논의를 고려한 이후, 그리고 특히 "발명을 실시하기 위한 구체적인 내용"으로 명명된 섹션을 판독한 이후, 본 명세서에 기재된 시료 특징이 개선된 시스템 및 방법을 어떻게 제공하는지를 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 나노포어 디바이스에서의 검출을 용이하게 하도록 변형된 표적 분자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 표적 분자는 제1 부착 부위를 포함하며, 상기 부착 부위는 드라이버(driver) 분자에 결합된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자는 제2 부착 부위를 더 포함하며, 상기 제2 부착 부위는 제1 페이로드(payload) 분자에 결합된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 제1 부착 부위를 포함하는 표적 분자; 및 제1 부착 부위를 포함하는 드라이버 분자를 포함하는 나노포어 검출을 위해 설계된 복합체를 제공하며, 드라이버 분자의 제1 부착 부위는 표적 분자의 제1 부착 부위에 대하여 공유 결합을 이룬다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 제1 부착 부위를 포함하는 표적 분자; 및 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위를 포함하는 링커 분자를 포함하는 나노포어 검출을 위해 설계된 복합체를 제공하며, 링커 분자의 제1 부착 부위는 표적 분자의 제1 부착 부위에 대하여 공유 결합을 이루며, 링커 분자의 제2 부착 부위는 드라이버 분자를 위한 결합 부위이다. 일부 실시형태에서, 복합체는 드라이버 분자를 더 포함하며, 드라이버 분자는 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹(pi-stacking) 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통하여 링커 분자의 제2 부착 부위에 결합된다.
일부 실시형태에서, 링커 분자는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA), 리보핵산(RNA), 나노입자, 펩타이드 핵산(PNA), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 덴드리머, 합성 폴리머 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 분자는 펩타이드, 발린-시트룰린 링커, 말레이미도카프로일(mc) 링커, [N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(MCC) 링커, 석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC) 링커, PEG-계 링커, 하이드라존 링커, N-석신이미딜-4-(2-피리딜다이티오) 부타노에이트(SPDB) 링커 또는 카보네이트 링커 또는 임의의 다른 동종이작용성 또는 이종이작용성 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 생물학적 치료제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 치료제는 단클론성 항체, 단백질, 프로테아제, 펩타이드, 당, 핵산 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 소분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 소분자 치료제 또는 소분자 진단 약물이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 효소 억제제 또는 활성화제, 수용체 길항제 또는 작용제, 및 세포 과정 또는 경로의 소분자 조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자 치료 약물이다. 일부 실시형태에서, 소분자 치료 약물은 리시노프릴(Lisinopril)이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 비료, 건설 또는 건축 재료 및 식이 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 또는 생물학적 제품의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성분은 나이트로게나제이다. 일부 실시형태에서, 성분은 보론산이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 pH 지시약, 독소 지시약, 화학적 지시약, 오염물질 지시약 또는 온도 지시약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지시약이다.
일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA) 또는 리보핵산(RNA)이다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 20개 초과의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 링커 분자에 결합한다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 제2 부착 부위를 더 포함하며, 상기 제2 부착 부위는 제1 페이로드 분자에 결합된다. 일부 실시형태에서, 제1 페이로드 분자는 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 표적 분자에 결합된다.
일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 제2 부착 부위를 더 포함하며, 상기 제2 부착 부위는 제2 페이로드 분자에 결합된다. 일부 실시형태에서, 제2 페이로드 분자는 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 드라이버 분자에 결합된다.
일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 페이로드 분자는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA), 리보핵산(RNA), 나노입자, 펩타이드 핵산, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 덴드리머 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 복수의 페이로드 분자에 결합된다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 복수의 페이로드 분자에 결합된다.
일부 실시형태에서, 표적 분자의 제1 부착 부위는 아미노산, 데옥시리보스 핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함한다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자의 제1 부착 부위는 아미노산, 데옥시리보스 핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함한다.
본 발명은 표적 분자의 검출 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 표적 분자를 포함하는 복합체를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 적어도 하나의 나노포어를 포함하는 나노포어 디바이스에 로딩하는 단계; (b) 적어도 하나의 나노포어에 걸쳐 전압을 인가하는 단계; 및 (c) 시료 중 복합체의 존재 또는 부재와 연관된 포어를 통과하는 전기 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 시료는 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시료는 환자로부터의 혈액, 소변, 타액 또는 조직 시료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시료는 물, 토양, 공기, 슬러지, 석유, 또는 화학적 또는 생물학적 제품을 포함한다.
일부 실시형태에서, 복합체는 하나 이상의 페이로드 분자에 결합되며, 전기 신호는 추가로 상기 하나 이상의 페이로드 분자의 결합과 연관된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 전기 신호에 기반하여 시료 중 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 전기 신호는 추가로 시료 중 표적 분자의 존재 또는 부재와 연관된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 전기 신호에 기반하여 시료 중 표적 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 시료 중 복합체 또는 표적 분자의 농도의 결정 단계를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 나노포어 검출을 위해 설계된 변형된 표적 분자에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 변형된 표적 분자는 드라이버 분자 또는 링커 분자를 위한 제1 부착 부위를 포함하며, 부착 부위는 표적 분자의 제1 변형에 의해 생성된다.
일부 실시형태에서, 제1 변형은 바이오티닐화, 아세틸화, 메틸화, 수몰레이션(summolation), 글리코실화, 인산화 또는 산화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 변형은 화학적 또는 생물학적 합성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 변형은 표적의 유전적 조작(genetic engineering)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 부착 부위는 아미노산, 데옥시리보스 핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부착 부위는 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통하여 드라이버 분자 또는 링커 분자에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 생물학적 치료제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 치료제는 단클론성 항체, 단백질, 프로테아제, 펩타이드, 당, 핵산 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 소분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 소분자 치료제 또는 소분자 진단 약물이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 효소 억제제 또는 활성화제, 수용체 길항제 또는 작용제, 및 세포 과정 또는 경로의 소분자 조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자 치료 약물이다. 일부 실시형태에서, 소분자 치료 약물은 리시노프릴이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 비료, 건설 또는 건축 재료 및 식이 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 또는 생물학적 제품의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성분은 나이트로게나제이다. 일부 실시형태에서, 성분은 보론산이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 pH 지시약, 독소 지시약, 화학적 지시약, 오염물질 지시약 또는 온도 지시약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지시약이다.
일부 실시형태에서, 변형된 표적 분자는 표적 분자의 적어도 하나의 기능을 유지한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 기능은 치료적, 진단적, 생물학적, 화학적 또는 영양적 활성이다.
일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA) 또는 리보핵산(RNA)이다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 20개 초과의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 표적 분자는 페이로드 분자로의 결합을 위한 제2 부착 부위를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 부착 부위는 표적 분자 또는, 변형된 표적 분자의 제2 변형에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 제2 변형은 바이오티닐화, 아세틸화, 메틸화, 수몰레이션, 글리코실화, 인산화 또는 산화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 변형은 화학적 또는 생물학적 합성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 변형은 표적의 유전자 조작을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 부착 부위는 아미노산, 데옥시리보스 핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 부착 부위는 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 페이로드 분자에 결합할 수 있다.
본 발명은 추가로 변형된 표적 분자의 검출 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 변형된 표적 분자를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 수득하는 단계; (b) 드라이버 분자를 시료에 첨가하여, 반응 산물을 생성하는 단계; (c) 반응 산물을 적어도 하나의 나노포어를 포함하는 나노포어 디바이스에 적용하는 단계; (d) 상기 적어도 하나의 나노포어에 걸쳐 전압을 인가하는 단계; 및 (e) 시료 중 변형된 표적 분자의 존재 또는 부재와 연관되는 포어를 통과하는 전기 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 시료는 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시료는 환자로부터의 혈액, 소변, 타액 또는 조직 시료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시료는 물, 토양, 공기, 슬러지, 석유, 또는 화학적 또는 생물학적 제품을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 표적 분자는 하나 이상의 페이로드 분자에 결합되며, 전기 신호는 상기 하나 이상의 페이로드 분자의 결합과 더 연관된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 전기 신호에 기반하여 시료 중 변형된 표적 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 시료 중 변형된 표적 분자의 농도의 결정 단계를 더 포함한다.
또한, 본 명세서에 기재된 변형된 표적 분자를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 포함하는 나노포어 디바이스로부터 전기 신호를 수득하는 단계; 및 전기 신호를 분석하여, 나노포어를 통한 표적 분자의 이동와 연관된 시그니처의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서, 시그니처의 존재가 상기 시료 중 표적 분자의 존재를 나타내며, 시그니처의 부재가 상기 시료로부터의 표적 분자의 부재를 나타내는 단계를 포함하는 표적 분자의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 데이터의 분석 방법이 본 명세서에 제공된다.
비 제한적이며, 단지 예시에 의해 특징을 예시하는 도면이 본 발명의 실시형태로서 제공된다.
도 1은 나노포어(106)를 통한 복합체의 이동을 용이하게 하기 위하여 링커 분자(104)를 통해 드라이버 분자(102)에 결합된 표적 분자(101)를 제시한다. 상기 도면은 백그라운드 분자(105)도 제시한다.
도 2는 드라이버 분자(102)에 부착되지 않은 표적 분자(101)를 예시한다. 나노포어 디바이스(106)는 드라이버 분자가 표적 분자에 결합되는지의 여부와 연관된 전기 신호를 감지한다.
도 3A 내지 도 3C는 나노포어를 통해 이동하는 시료에 독특한 전기 신호(x-축에 시간 및 y-축에 전류)를 예시한다. 시료는 링커 분자(104)를 통해 드라이버 분자(102)에 결합된 표적 분자(101)(도 3A); 단독의 드라이버 분자(102)(도 3B); 및 단독의 표적 분자(101)(도 3C)를 포함한다.
도 4는 변형된 리시노프릴의 화학 구조를 보여주며, 리시노프릴 분자는 SMCC 링커를 통해 드라이버 분자(즉, dsDNA)에 공유적으로 부착된다.
도 5는 SMCC 링커로 표지된 리시노프릴의 질량분석법으로부터의 데이터를 제공한다. 데이터에 의해, 리시노프릴이 링커 분자에 화학적으로 부착되는 것이 입증된다. 625.2의 질량 측정치는 625 내지 627의 질량 예측치와 일치한다.
도 6은 드라이버 분자(즉, 532 bp dsDNA)에 부착된 표적 분자(즉, 리시노프릴)로부터의 전기 신호를 플롯팅한 그래프를 제공한다.
도 7은 나노포어를 통과하는 DNA-파상풍 항체 복합체(점) 또는 항체 부재의 DNA-PNA 복합체(사각형)로부터 수집된 전기 신호를 플롯팅한 그래프이다.
도 8은 링커 분자(104a)를 통해 드라이버 분자(102)에 결합된 표적 분자(101)를 제시한다. 또한, 표적 분자는 또 다른 링커 분자(104b)를 통해 페이로드 분자(103)에 결합된다.
도 9A 및 도 9B는 나노포어를 통하여 이동하는 시료에 독특한 전기 신호를 제공한다. 시료는 링커 분자를 통해 드라이버 분자(102) 및 페이로드 분자(103)에 결합된 표적 분자(101)(도 9A) 및 링커 분자를 통해 드라이버 분자(102)에 결합된 표적 분자(101)(도 9B)를 포함한다.
도 10은 DNA-표적-페이로드 복합체(점) 또는 페이로드 부재의 DNA-표적 복합체(사각형)로부터 수집된 전기 신호를 플롯팅한 그래프를 제공한다. 표적은 펩타이드이며, 페이로드는 항체이다.
도 11은 페이로드 없이 드라이버 분자(dsDNA) 및 표적 분자(바이오틴)를 포함하는 복합체(사각형); 및 드라이버 분자(dsDNA), 표적(바이오틴) 및 페이로드(항-바이오틴 항체)를 포함하는 복합체(역삼각형)로부터 수집된 전기 신호를 플롯팅한 그래프를 제공한다.
도 12는 링커(104a 및 b)를 통해 드라이버 분자(102) 및 페이로드 분자(103a)에 결합된 표적 분자(101)를 보여준다. 드라이버 분자는 나노포어에서의 향상된 검출을 위하여 추가의 페이로드 분자(103b, 물결 모양 사각형)에 추가로 결합된다.
도 13은 나노포어를 통한 도 12의 복합체의 이동을 예시한다.
도 14A 내지 도 14C는 나노포어를 통해 이동하는 시료에 독특한 전기 신호를 예시한다. 시료는 페이로드 분자 및 드라이버 분자에 결합된 표적 분자로서, 드라이버 분자가 또 다른 페이로드 분자에 결합된 표적 분자(도 14A); 드라이버 분자 및 페이로드 분자에 결합된 표적 분자(도 14B); 및 단독의 드라이버 분자에 결합된 표적 분자(도 14C)를 포함한다.
도 15는 하나가 PNA-PEG를 위한 결합 부위이며, 다른 것이 PNA-펩타이드를 위한 결합 부위인 2개의 결합 부위를 포함하는 드라이버 분자(즉, 5631 bp DNA)를 보여준다.
도 16A 및 도 16B는 나노포어를 통과하는 상이한 복합체로부터의 전기 신호를 플롯팅한 그래프를 제공한다. 점은 단독의 드라이버 분자(DNA)로부터의 신호를 나타내며; 사각형 및 마름모는 DNA 및 PNA-PEG(PP) 복합체로부터의 신호를 나타내며; 역삼각형은 DNA 및 PNA-PEG(PP)와 V3 루프(PV3B) 복합체로부터의 신호를 나타내며; 별표는 DNA, PNA-PEG(PP)와 V3 루프(PV3B) 및 HIV 항체 복합체로부터의 신호를 나타낸다.
도면의 일부 또는 전부는 예시를 위한 개략도이며; 이에 따라, 그들이 반드시 도시된 요소의 실제의 상대적 크기 또는 위치를 도시하는 것은 아니다. 도면은 하기 청구범위의 범주 또는 의미를 제한하기 위해 사용되지 않을 것을 명백하게 이해하면서 하나 이상의 실시형태를 예시할 목적으로 제시된다.
a. 용어의 설명:
본 출원 전반에 걸쳐, 본 명세서는 본 발명의 디바이스, 조성물, 시스템 및 방법의 다양한 실시형태를 나타낸다. 기재된 다양한 실시형태는 다양한 예시적인 실시예를 제공하고자 하며, 대안의 종의 설명으로 간주되어서는 안 된다. 오히려, 제공된 다양한 실시형태의 설명은 범주가 중복되는 것일 수 있음을 주의해야 한다. 본 명세서에서 논의된 실시형태는 단지 예시일 뿐이며 본 발명의 범주를 제한하고자 하지 않는다.
또한, 본 발명 전반에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서는 확인 인용에 의해 참조된다. 이들 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서의 개시내용은 그들 전문이 본 발명에 참고로 포함된다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 단수형 "하나의" 및 "상기"는 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "하나의 전극"은 복수의 전극을 포함하며, 그의 복합물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 시스템, 디바이스 및 방법이 인용된 구성요소 또는 단계를 포함하지만, 다른 것들을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. "~로 본질적으로 이루어진"은 시스템, 디바이스 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우 조합에 대하여 임의의 본질적으로 유의미한 다른 구성요소 또는 단계를 배제하는 것을 의미할 것이다. "~로 이루어진"은 다른 구성요소 또는 단계를 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 연결 용어(transition term) 각각에 의해 정의되는 실시형태는 본 발명의 범주 내에 있다.
범위를 포함하는, 모든 수치 표시, 예를 들어, 거리, 크기, 온도, 시간, 전압 및 농도는, 0.1의 증분만큼 (+) 또는 (-)로 변하는 근사치이다. 항상 명확하게 언급되는 것은 아니지만, 모든 수치 표시가 용어 "약"이 선행되는 것을 이해해야 한다. 또한, 항상 명확하게 언급되는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된 구성요소는 단지 예시일 뿐이고 이의 등가물이 해당 분야에 알려져 있는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "표적 분자"는 나노포어에 의한 검출을 위해 변형될 수 있는 관심 분자를 지칭한다. 표적 분자는 드라이버 분자로의 결합 시에 나노포어를 통과할 수 있는 물리적 치수를 갖는다.
본 명세서에 사용되는 용어 "링커 분자"는 표적 분자와 드라이버 분자; 표적 분자와 페이로드 분자; 또는 드라이버 분자와 페이로드 분자 사이를 연결할 수 있는 분자를 지칭한다. 링커 분자는 표적 분자 및/또는 드라이버 분자로의 결합 시에 나노포어를 통과할 수 있는 물리적 치수를 갖는다.
본 명세서에 사용되는 용어 "드라이버 분자"는 그것이 인가되는 전압 하에 용액 중에서 나노포어 내에 포획될 수 있도록 충분히 하전된 분자를 지칭한다. 표적 분자로의 결합 시에, 드라이버 분자는 표적 분자를 나노포어 내로 유도할 수 있다. 드라이버 분자는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "페이로드 분자"는 나노포어 내에 포획되는 경우에 독특한 전기 신호의 생성을 용이하게 하는 물리적 치수를 갖는 분자를 지칭한다. 페이로드 분자는 표적 분자 또는 드라이버 분자를 위한 결합 부위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 나노포어를 통한 통과를 용이하게 하도록 하전될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "내부 공간을 분리하는 나노포어를 포함하는 디바이스"는 구조물 내에 개구를 포함하는 포어를 갖는 디바이스를 지칭할 것이며, 구조물은 내부 공간을 하나 초과의 용적 또는 챔버로 분리한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "전기 신호"는 전자 회로의 구성에 따라 시간이 지나면서 전류, 임피던스/저항 또는 전압에 대해 수집된 일련의 데이터를 포함한다. 관례적으로, 전류는 "전압 클램프" 구성에서 측정되며; 전압은 "전류 클램프" 구성에서 측정되며, 저항 측정은 옴의 법칙 V = IR을 사용하여 어느 하나의 구성에서 도출될 수 있다. 또한, 임피던스는 나노포어 디바이스로부터 수집된 전류 또는 전압 데이터로부터 측정됨으로써 생성될 수 있다. 본 명세서에 언급된 전기 신호의 유형은 전류 신호 시그니처 및 전류 임피던스 시그니처를 포함하지만, 다양한 다른 전기 시그니처를 사용하여 나노포어 내의 입자를 검출할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "나노포어"는 특정 크기의 분자의 통과를 가능하게 하기에 충분한 크기의 개구(홀 또는 채널)를 지칭한다. 전압을 인가하여 하전된 분자가 나노포어를 통과하도록 유도한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "센서"는 나노포어 디바이스로부터 신호를 수집하는 디바이스를 지칭한다. 많은 실시형태에서, 센서는 분자 또는 다른 엔티티, 특히 표적 분자가 포어를 통해 이동하는 경우, 포어에 걸친 이온 전류를 측정하도록 포어의 두 측에 배치된 한 쌍의 전극을 포함한다. 전극에 더하여, 추가의 센서, 예를 들어, 광학 센서를 사용하여 나노포어 디바이스에서 광학 신호를 검출할 수 있다. 기타 센서를 사용하여 전류 차단, 전자 터널링 전류(electron tunneling current), 전하-유도 전계 효과(charge-induced field effect), 나노포어 통과 시간, 광학 신호, 광 산란 및 플라즈몬 공명과 같은 특성을 검출할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "전류 측정치"는 인가된 전압에서 시간에 따라 나노포어를 통한 전류 흐름의 일련의 측정치를 지칭한다. 전류는 x,y 값으로 표현되며, x는 시점을 나타내며, y는 채널에서 방해되는 전류의 양을 나타낸다. 전류 측정치는 옴의 법칙을 통해 전류 임피던스/저항 및 전압(다른 전기 신호)과 관련된 전기 신호이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개방 채널"은 전류가 분석 소프트웨어에 의해 정의된 임계값으로부터 벗어나지 않는 노이즈 범위 내의, 나노포어 채널을 통과하는 전류의 기준선 수준을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "이벤트"는 전류 측정치의 y 값이 개방 채널 값으로부터 소정의 임계값만큼 벗어나는 경우 시작하고, y 값이 개방 채널 값의 임계값 내로 복귀하는 경우 종료하는 전류 임피던스 측정치의 세트를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "전류 임피던스 시그니처"는 전류 측정치의 집합을 의미하며, 이러한 제1 측정은 y의 값이 소프트웨어에 의해 정의되는 주어진 임계값을 초과하는 경우 시작하며, y의 값이 동일한 임계값을 지나 복귀하는 경우 종료한다. 이러한 임계값을 사용하여 이벤트 내의 다수의 시그니처를 확인할 수 있다(즉, 표적 분자는 그것에 부착된 하나 이상의 분자를 가질 수 있기 때문에, 이벤트는 하나 이상의 독특한 시그니처를 포함할 수 있다).
본 명세서에 사용되는 용어 "시그니처 곡선"은 단일의 시그니처에서 모든 x,y 점에 적용되는 수학식의 결과물을 의미한다. 이러한 식은 모든 점의 단순 평균(y에서 단일 선을 제공함) 또는 모든 N개의 점의 이동 평균(단순 곡선을 제공)만큼 간단하거나 또 다른 수학식일 수 있다. 단계 핏팅 알고리즘은 각 시그니처에 적용하기 위한 식의 또 다른 예이다. 단계의 수 또는 그들의 특성을 사용하여 시그니처 곡선 또는 곡선들에 관한 특성을 추론할 수 있다(예를 들어, 전문이 참조로 포함되는 문헌[C Raillon, P Granjon, M Graf, L J Steinbock, and A Radenovic. Fast and automatic processing of multi-level events in nanopore translocation experiments. Nanoscale, 4(16):4916, 2012] 참조). 나노포어가 본질적으로 비-결정적이기 때문에, 전기 신호는 동일한 유형의 분자가 통과하는 때마다 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 측정치를 분석하는 소프트웨어는 동일한 분자가 판독되는 때마다 일정한 시그니처 곡선을 보장하도록 충분한 유연성을 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "광학 센서"는 나노포어에 또는 나노포어에 인접하여 존재할 수 있는 고정된 시야 내의 광을 포획하는 장치를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "광학 이벤트"는 센서에 의해 단일의 표적 분자로부터 포획되는 광학 측정치의 세트를 지칭한다. 광학 측정치를 전류 임피던스 측정치와 연관시켜, 표적 분자가 나노포어에 진입하는 경우를 결정할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "광학 측정치"는 고정된 기간 내에 광학 센서에 의해 수득되는 값을 지칭한다. 이러한 측정치는 개별 값, 예를 들어, 색, 발광 및 세기 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 용어 "기호"는 단일의 관념을 포함하기 위한 이벤트 내의 하나 이상의 광학 시그니처의 어셈블리를 의미한다. 예를 들어, "적색, 녹색, 적색, 녹색"은 문자 "A"와 동일할 수 있다.
b. 표적 분자:
본 발명은 페이로드 분자 및/또는 드라이버 분자를 표적 분자, 예를 들어, 약제학적 화합물에 부가하기 위한 디바이스 및 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 표적 분자는 드라이버 분자가 부착될 수 있는 부착 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 표적 분자는 페이로드 분자가 부착될 수 있는 부착 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 부착 부위는 아미노산, 이중 가닥 데옥시리보스 핵산(dsDNA), 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함하나 이들에 한정되지 않는 표적 분자의 화학적 구성의 일부이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 단클론성 항체, 단백질, 프로테아제, 펩타이드, 당, 핵산 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 생물학적 치료제이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 소분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 효소 억제제 또는 활성화제, 수용체 길항제 또는 작용제 또는 세포 과정 또는 경로의 기타 소분자 조절제를 포함하나 이들에 한정되지 않는 소분자 치료제이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 리시노프릴이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 소분자 진단 약물이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 합성 분자이다. 일부 실시형태에서, 표적 분자는 비료, 건설 또는 건축 재료 및 식이 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 또는 생물학적 제품의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성분은 특정 기능을 갖는 화학적 또는 생물학적 제품의 필수 구성요소이다. 일부 실시형태에서, 성분은 효소이다. 일부 실시형태에서, 효소는 나이트로게나제이다. 일부 실시형태에서, 성분은 보론산이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 물리적 조건에 반응하여, 그의 입체형태, 구조 또는 안정성을 변경시키는 지시약이다. 일부 실시형태에서, 지시약은 pH 지시약, 독소 지시약, 화학적 지시약, 오염물질 지시약 또는 온도 지시약이다.
c. 링커 분자:
일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자는 링커 분자를 통하여 부착 부위를 통해 공유적으로 커플링된다.
일부 실시형태에서, 링커 분자는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA), 리보핵산(RNA), 나노입자, 펩타이드 핵산(PNA), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 덴드리머, 합성 폴리머 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커 분자는 펩타이드, 발린-시트룰린 링커, 말레이미도카프로일(mc) 링커, [N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(MCC) 링커, 석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC) 링커, PEG-계 링커, 하이드라존 링커, N-석신이미딜-4-(2-피리딜다이티오) 부타노에이트(SPDB) 링커 또는 카보네이트 링커 또는 임의의 다른 동종이작용성 또는 이종이작용성 분자이다.
일부 실시형태에서, 링커 분자는 나노포어 내의 표적 분자의 포획을 용이하게 할 수 있는 하전된 분자이다.
d. 페이로드 분자:
일부 실시형태에서, 표적 분자는 그것이 나노포어 내로 또는 그를 통해 이동함에 따라 독특한 전기 신호를 제공하여, 시료에 존재하는 다른 표적/페이로드 분자 또는 백그라운드 분자로부터의 판별을 가능하게 하는 하나 이상의 페이로드 분자에 의해 변형된다. 페이로드 분자는 나노포어 내의 표적 분자의 검출을 가능하게 하도록 구성된다. 이들 페이로드 분자는 나노포어를 통과하는 경우 그들의 전류 임피던스에 의해 서로 확인되고 구별될 수 있다. 이러한 전류 임피던스는 페이로드 분자의 너비, 길이, 크기 및/또는 전하에 의해 영향을 받는다. 페이로드 분자는 크기, 형상 또는 전하가 서로 상이할 수 있다. 따라서, 각 페이로드 분자는 나노포어의 통과 시에 독특한 전기 신호를 제공하여, 나노포어 내의 페이로드 분자에 결합된 표적 분자의 확인을 가능하게 할 수 있다.
페이로드 분자가 너비, 길이, 크기 및/또는 전하와 같은 파라미터에 의해 변형될 수 있기 때문에, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 더 큰 포어를 포함하는 다양한 크기의 포어로 수행될 수 있으며, 이는 더 작은 나노포어 디바이스보다 제작이 더 용이하고 저렴하다. 더 큰 크기의 검출 가능한 마커는 미표지 화합물에 비하여 포어를 통과하는 전류 흐름 또는 전류 임피던스의 더 큰 변화를 초래한다.
일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA), 리보핵산(RNA), 나노입자, 펩타이드 핵산(PNA), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 덴드리머 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 공유 결합, 중간 링커 또는 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 표적 분자에 연결된다.
일부 실시형태에서, 표적 분자, 드라이버 분자 또는 링커 분자는 페이로드 분자에 대한 결합 부위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 분자, 드라이버 분자 또는 링커 분자는 추가의 신호 차별화 페이로드 분자를 연결할 수 있는 추가의 부착 부위(들)를 함유하여, 시료 중 표적 분자의 추가의 판별 또는 확인의 향상을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 표적, 드라이버 및 페이로드 분자 중 하나 이상은 추가의 페이로드 분자로 추가로 변형된다. 일부 실시형태에서, 추가의 페이로드 분자는 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 결합, 파이-스태킹, 이온 결합 또는 기타 비-공유적 정전기 상호작용에 의해 부착 부위에 직접 연결된다.
e. 드라이버 분자:
드라이버 분자는 나노포어 내의 표적 분자의 포획을 용이하게 하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 전압에 의해 나노포어 내로 포획될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자는 공유 결합에 의해 부착 부위를 통해 함께 직접 연결된다. 일부 실시형태에서, 표적 및 드라이버 분자는 공유 결합에 의해 연결되지 않고, 대신에 정전기 상호작용, 수소 결합, 염 가교, 반 데르 발스 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 소수성 상호작용을 포함하는 비공유 결합에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA), 리보핵산(RNA), 펩타이드, 단백질, 탄수화물 또는 그들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 하나 이상의 합성 분자, 예를 들어, 덴드리머, 나노/마이크로 입자, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 펩타이드 핵산(PNA) 또는 기타 합성된 폴리머이다. 일부 실시형태에서, 표적 분자는 동일한 제형에 존재하지만, 드라이버 분자의 부착 부위와 회합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 그것이 나노포어 내로 또는 그를 통해 이동함에 따라 전류 임피던스를 제공하여, 표적 분자의 존재 또는 부재를 추론하게 한다.
드라이버 분자는 표적 분자로의 결합 시에 적절한 확산 계수 및 전기 이동도를 제공하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자의 전기 이동도는 해당 분야에 알려져 있는 기법에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 전기 이동도는 겔 전기영동에 의해 결정되며, 고유 전하는 특정 이온 세기 완충제, pH 및 추진력(예를 들어, TEA 완충제 pH 7.5 및 50 V 추진력)을 포함할 수 있는 특정 정적 조건 하에서 측정된다. 일부 실시형태에서, 전기 이동도는 등전점 전기영동(IEF)에 의해 결정되며, 이는 가변적인 "구역별" 완충계에서의 그의 전하에 기초하여 피분석물 이동도를 측정한다. 이러한 방법 하에서, 상이하게 하전된 변이체는 그들이 피분석물 등전점과 일치하는 pH의 영역에 진입하는 경우 이동을 중단한다. 상이하게 이동되는 "겔 상의 밴드"를 분석함으로써, 분자의 상이한 하전 상태를 추론할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이온 교환 크로마토그래피(IEX)는 피분석물 전하에 기반하여 고체 지지체로부터의 이동도를 측정한다. 본 명세서에서, 표적 분자(들)는 칼럼에 결합되며, pH 기울기를 이용하여 용출된다. pH가 분자의 등전점과 일치하는 경우, 피분석물은 더 이상 칼럼에 결합하지 않으며, 용출되고, 이후에 검출된다. 일부 실시형태에서, 전기 이동도는 질량 대 전하 비에 의해 결정되는 MALDI-TOF(비행 시간)에 기반하여 결정된다. 전하가 더 크고 질량이 더 작을수록, 그것은 더 신속하게 검출기로 이동한다. 역으로, 더 낮은 전하 및 더 큰 질량은 더 큰 "비행 시간"을 초래한다. 분자는 그들의 독특한 "비행 시간"을 사용하고, 표준물질과 비교하여 확인된다.
드라이버 분자는 나노포어를 통과하기에 충분히 작은 물리적 치수를 갖도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 적어도 20 bp를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자는 그것이 표적 분자, 페이로드 분자 또는 복수의 페이로드 분자에 결합하는 경우 나노포어를 통과하기에 충분히 작은 물리적 치수를 갖도록 구성된다.
f. 표적 분자 변형:
본 발명은 표적 분자 변형 및 검출을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 특정 실시형태에서, 시료 중 표적 분자의 존재 또는 부재를 검출하고/거나 정량화하기 위한 표적 분자의 변형 방법이 본 명세서에 제공된다. 특정 실시형태에서, 변형된 표적 분자는 나노포어 디바이스에서 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 표적 분자를 위한 부착 부위를 포함하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자는 페이로드 분자를 위한 부착 부위를 포함하도록 추가로 변형된다. 일부 실시형태에서, 부착 부위는 표적 분자의 생물학적 또는 화학적 변형에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 화학적 변형은 바이오티닐화, 아세틸화, 메틸화, 수몰레이션, 글리코실화, 인산화 또는 산화이다. 일부 실시형태에서, 부착 부위는 분자적, 생물학적 또는 생화학적 방법에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 부착 부위는 효소 반응에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 부착 부위는 유전자 조작에 의해 도입된다.
일부 실시형태에서, 부착 부위는 아미노산, 데옥시리보스 핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부착 부위는 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 결합, 파이-스태킹, 이온 결합 또는 기타 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 드라이버 분자 또는 페이로드 분자에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 부착 부위를 포함하는 표적 분자는 생물학적으로 또는 화학적으로 합성된다. 일부 실시형태에서, 합성은 바이오티닐화, 아세틸화, 메틸화, 수몰레이션, 글리코실화, 인산화, 산화 또는 기타 효소 반응을 수반한다. 일부 실시형태에서, 부착 부위는 아미노산, 데옥시리보스 핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부착 부위는 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 결합, 파이-스태킹, 이온 결합 또는 기타 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 드라이버 분자 또는 페이로드 분자에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 표적 분자는 표적 분자의 적어도 하나의 기능을 유지한다. 일부 실시형태에서, 표적 분자의 변형은 생물학적 치료제, 소분자 약물 및 화학적 또는 생물학적 제품의 성분으로서 표적 분자의 활성을 변경시키지 않는다.
g. 표적-드라이버 복합체:
일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자는 공유적으로 커플링된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자를 포함하는 복합체는 표적 분자와 드라이버 분자 간에 공유 결합을 이루는 화학 반응에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자를 포함하는 복합체는 화학적, 생물학적, 분자적 및 유전학적 반응에 의해 합성된다.
일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자를 포함하는 복합체는 치료 또는 진단 목적을 위하여 약제학적 조성물로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자를 포함하는 복합체는 지시약, 예를 들어, pH 지시약, 독소 지시약, 화학적 지시약, 오염물질 지시약 또는 온도 지시약으로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자를 포함하는 복합체는 화학적 또는 생물학적 제품, 예를 들어, 비료, 건설 또는 건축 재료 및 식이 조성물의 성분으로서 사용된다.
h. 표적-링커 복합체:
일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자는 링커 분자에 공유적으로 커플링된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 및 링커 분자를 포함하는 복합체는 표적 분자와 링커 분자 간에 공유 결합을 이루는 화학 반응에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 및 링커 분자를 포함하는 복합체는 화학적, 생물학적, 분자적 및 유전학적 반응에 의해 합성된다.
일부 실시형태에서, 링커는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA), 리보핵산(RNA), 나노입자, 펩타이드 핵산(PNA), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 덴드리머, 합성 폴리머 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 펩타이드, 발린-시트룰린 링커, 말레이미도카프로일(mc) 링커, [N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(MCC) 링커, 석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC) 링커, PEG-계 링커, 하이드라존 링커, N-석신이미딜-4-(2-피리딜다이티오) 부타노에이트(SPDB) 링커 또는 카보네이트 링커, 또는 임의의 다른 동종이작용성 또는 이종이작용성 분자 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 분자 및 링커 분자를 포함하는 복합체는 치료 또는 진단 목적을 위하여 약제학적 조성물로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자를 포함하는 복합체는 지시약, 예를 들어, pH 지시약, 독소 지시약, 화학적 지시약, 오염물질 지시약 또는 온도 지시약으로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 및 드라이버 분자를 포함하는 복합체는 화학적 또는 생물학적 제품, 예를 들어, 비료, 건설 및 건축 재료, 및 식이 조성물의 성분으로서 사용된다.
i. 검출 방법:
일부 실시형태에서, 본 기법은 시료 중 표적 분자의 확인 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 표적 분자를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 표적 분자(예를 들어, 검출 가능한 페이로드 분자에 결합된 약제학적 약물)가 포어를 통해 하나의 용적으로부터 다른 용적으로 이동되게 하는 조건 하에서 2개의 용적을 분리하고 연결시키는 포어를 갖는 디바이스 내로 로딩하는 단계, 및 (b) 나노포어를 통한 표적 분자의 통과와 연관된 전기 신호를 수집하는 단계를 수반한다. 전기 신호를 사용하여, 나노포어를 통과하여 이동하는 검출 가능한 분자와 연관된 이벤트를 수집하고 분석하여, 페이로드 분자에 부착된 표적 분자와 연관된 전기 신호를 확인할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 변형된 표적 분자를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 수득하는 단계, (b) 드라이버 분자를 시료에 첨가하여, 반응 산물을 생성하는 단계, (c) 반응 산물을 나노포어 디바이스에 적용하는 단계, (d) 각 포어에 걸쳐 전압을 인가하는 단계, 및 (e) 시료 중 변형된 표적 분자의 존재 또는 부재와 연관되는 포어를 통과하는 전기 신호를 측정하는 단계를 수반한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 전기 신호에 기반하여 시료 중 표적 분자 또는 표적 분자를 포함하는 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 전기 신호에 기반하여 시료 중 표적 분자 또는 표적 분자를 포함하는 복합체의 농도를 결정하는 단계를 수반한다.
"전기 신호"는 표적 분자에 부착된 하나 또는 대안적으로 둘 이상의 페이로드 분자의 포어를 통한 이동으로부터 전류 시그니처를 한번에 생성하는 전류 측정치를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 복수의 표적 분자는 복수의 독특한 페이로드 분자를 사용하여 검출될 수 있으며, 독특한 페이로드 분자에 결합된 각각의 표적 분자는 각각의 별개의 표적 분자의 확인을 위해 사용되는 독특한 전기 신호를 생성한다. 예를 들어, 페이로드 분자 A는 하나의 독특한 전기 신호를 제공할 수 있는 한편, 페이로드 분자 B는 상이한 독특한 전기 신호를 형성할 수 있다.
이들 상기 시나리오의 각각에서, 나노포어 디바이스는 그의 각각의 표적 분자에 결합된 각각의 독특한 페이로드 분자가 생성하는 각각의 독특한 전기 신호를 확인하도록 적합하게 구성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 시료는 약리학적 조성물이다. 일부 실시형태에서, 시료는 혼합 시료, 예를 들어, 환자로부터 수득되는 혈액 또는 소변 시료이다. 일부 실시형태에서, 시료는 환자로부터의 혈액, 소변, 타액 또는 조직 시료이다. 일부 실시형태에서, 시료는 표적이 투여된 대상체로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 시료는 인간 환자로부터 수득된다.
일부 실시형태에서, 시료는 물, 토양, 공기, 슬러지, 석유 또는 화학적 또는 생물학적 제품이다. 피분석물 검출을 위한 방법 및 조성물은 그의 전문이 참조로 포함되는 PCT 공개 제WO/2014/182634호에 개시되어 있다.
나노포어 실험에서, 전류 임피던스 이벤트의 집단이 생성된다. 수학적 모델링을 사용하여, 신뢰도 내에서 백그라운드로부터 본 발명의 표적 분자를 식별한다. 그러나, 혼합 시료, 예를 들어, 처리되지 않은 혈액은 표적의 전기 신호와 중첩되는 전기 신호를 생성하는 백그라운드 분자의 큰 집단을 갖는다. 높은 오차율이 이들 분자에 의해 도입되어, 표적 분자를 검출하기 위한 나노포어의 신뢰성에 영향을 미칠 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 신뢰성을 개선하기 위한 하나의 메커니즘은 표적 분자에 하나의 또는 페이로드 분자들을 부착하여, 나노포어를 통해 이동하는 페이로드 분자에 결합된 표적 분자의 존재 및/또는 아이덴티티를 확인하기 위해 사용될 수 있는 독특한 전기 신호를 제공하는 것이다. 따라서, 나노포어를 사용하여 벌크 시료 중 하나 이상의 페이로드 분자에 부착된 변형된 표적 분자를 검출하기 위한 개선된 방법 및 조성물이 제공된다.
표적 분자 및 하나 이상의 드라이버 분자 및/또는 페이로드 분자를 포함하는 형성된 복합체는 나노포어(또는 간단히 포어) 및 센서를 포함하는 디바이스를 사용하여 검출될 수 있다. 포어는 2개의 용적을 분리하는 구조물 내의 나노-스케일 또는 마이크로-스케일 개구이다. 센서는 포어를 통과하는 대상을 확인하도록 구성된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 센서는 측정 가능한 파라미터의 변화를 검출함으로써 포어를 통과하는 대상을 확인하며, 변화는 포어를 통과하는 대상을 나타낸다. 이러한 디바이스는 도처에 "나노포어 디바이스"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 나노포어 디바이스는 포어를 가로질러 하나의 용적에서 또 다른 용적으로 표적 분자를 이동시키기 위하여, 전력원에 연결된 전극을 포함한다. 표적 분자가 하전되거나 전하를 포함하는 드라이버 분자에 결합될 수 있기 때문이다. 포어에 걸쳐 전위 또는 전압을 생성함으로써, 표적 분자 또는 드라이버 분자에 결합된 표적 분자의 이동이 용이하게 되고 제어된다. 특정 실시형태에서, 센서는 한 쌍의 전극을 포함하며, 이는 둘 모두 전류를 판독함으로써 나노포어를 통한 대상의 통과를 검출하고, 포어에 걸쳐 전압을 제공하기 위한 센서로 구성된다. 특정 실시형태에서, 전압-클램프 또는 패치-클램프를 사용하여 동시에 포어에 걸쳐 전압을 공급하고, 포어를 통과하는 전류를 측정한다.
페이로드 분자에 결합된 표적 분자의 검출은 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 일 양태에서, 소정의 염(에를 들어, KCl) 농도를 포함하는 용액 중에서 인가된 전압 하에 포어를 통한 표적 분자의 이동은 독특한 검출 가능한 전기 신호를 생성할 것이다. 전기 신호는 전류 이동의 양(높이) 및/또는 전류 이동의 기간(너비)에 의해, 또는 전기 시그니처를 차별화시키는 신호의 임의의 다른 특징에 의해 서로 구별될 수 있다.
일부 실시형태에서, 센서는 전극을 포함하며, 이는 전력원에 연결되고, 전류를 검출할 수 있다. 따라서, 전극 중 어느 하나 또는 둘 모두는 "센서"로 작용한다. 이러한 실시형태에서, 전압-클램프 또는 패치-클램프를 사용하여, 동시에 포어에 걸쳐 전압을 공급하고, 포어를 통과하는 전류를 측정한다.
일부 양태에서, 프로브를 표적 분자에 첨가하여 검출을 돕는다. 이러한 프로브는 표적 분자에 부착된 페이로드 분자 또는 드라이버 분자에 결합할 수 있다. 일 양태에서, 프로브는 음성 또는 양성 중 어느 하나의 전하를 가져, 나노포어 내의 검출을 용이하게 한다. 또 다른 양태에서, 프로브는 크기를 부가하여, 나노포어 내의 검출을 용이하게 한다. 또 다른 양태에서, 프로브는 검출 가능한 표지, 예를 들어, 형광단을 포함한다.
j. 광학 검출:
페이로드 분자는 전류 임피던스의 사용에 대한 대안으로서 해당 분야에 알려져 있는 방법에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 예를 들어, 형광 염료(예를 들어, Cy5®, Cy3®, FITC, 로다민, 란타마이드 포스포르(lanthamide phosphor), 텍사스 레드(Texas red)), 32P, 35S, 3H, 14C, 125I, 131I, 전자-밀집 시약(예를 들어, 금), ELISA에 흔히 사용되는 효소(예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 비색 표지(예를 들어, 콜로이드 금), 자성 표지(예를 들어, 다이나비즈(Dynabeads)TM), 바이오틴, 디옥시게닌, 또는 항혈청 또는 단클론성 항체가 이용가능한 합텐 및 단백질을 포함할 수 있다. 기타 페이로드 분자는 각각 상응하는 수용체 또는 올리고뉴클레오타이드 보체와 복합체를 형성할 수 있는 표지 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 양태에서, 페이로드 분자는 형광단이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "형광단"은 특정 파장(여기 주파수)의 광을 흡수하고 이후에 더 긴 파장(방출 주파수)의 광을 방출하는 분자를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "공여 형광단"은 소광 모이어티에 매우 근접한 경우, 방출 에너지를 소광제에 공여하거나 전달하는 형광단을 의미한다. 소광 모이어티로의 에너지 공여의 결과로서, 공여 형광단은 그 자체가 가까이 배치된 소광 모이어티의 부재 하에 가질 특정 방출 주파수에서 광을 더 적게 방출할 것이다.
적합한 형광 모이어티는 해당 분야에 알려져 있는 하기의 형광단을 포함한다: 4-아세트아미도-4'-이소티오사이아나토스틸벤-2,2'다이설폰산 아크리딘 및 유도체: 아크리딘, 아크리딘 아이소티오사이아네이트, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 350, 알렉사 플루오르® 488, 알렉사 플루오르® 546, 알렉사 플루오르® 555, 알렉사 플루오르® 568, 알렉사 플루오르® 594, 알렉사 플루오르® 647(몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes)); 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 4-아미노-N-(3-바이닐설포닐) 페닐]나프탈리미드-3,5 다이설포네이트(루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow) VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸) 말레이미드, 안트라닐아마이드, 블랙 홀 켄처(Black Hole Quencher)TM(BHQTM) 염료(바이오서치 테크놀로지즈(biosearch Technologies)), 보디파이(BODIPY)® R-6G, 보디파이® 530/550, 보디파이® FL 브릴리언트 옐로우(Brilliant Yellow); 쿠마린 및 유도체: 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120); 7-아미노-4-트라이플루오로메틸쿠마린(쿠마린 151), Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®; 사이아노신 4',6-다이아미니디노-2-페닐인돌(DAPI) 5',5"-다이브로모파이로갈롤 설폰프탈레인(브로모파이로갈롤 레드(Bromopyrogallol Red)), 7-다이에틸아미노-3-(4'-아이소티오사이아나토페닐)-4-메틸쿠마린 다이에틸렌트라이아민 펜타아세테이트, 4,4'-다이아이소티오사이아나토다이하이드로-스틸벤-2,2'-다이설폰산, 4,4'-다이아이소티오사이아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산 5[다이메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드(DNS, 단실 클로라이드); 4-(4'-다이메틸아미노페닐라조)벤조산(DABCYL); 4-다이메틸아미노페닐아조페닐-4'-아이소티오사이아네이트(DABITC), 이클립스(Eclipse)TM(에포크 바이오사이언스즈 인코포레이티드(Epoch Biosciences Inc.)); 에오신 및 유도체: 에오신, 에오신 아이소티오사이아네이트; 에리트로신 및 유도체: 에리트로신 B, 에리트로신 아이소티오사이아네이트, 에티듐 플루오레세인 및 유도체: 5-카복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-다이클로로트라이아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2',7'-다이메톡시-4'5'-다이클로로-6-카복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC), 헥사클로로-6-카복시플루오레세인(HEX), QFITC(XRITC), 테트라클로로플루오레세인(TET), 플루오레사민, IR144, IR1446, 말라카이트 그린(Malachite Green) 아이소티오사이아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오쏘 크레솔프탈레인, 나이트로타이로신, 파라로자닐린, 페놀 레드(Phenol Red), B-피코에리트린, R-피코에리트린, o-프탈다이알데하이드, 오레곤 그린(Oregon Green)®, 프로피듐 아이오다이드; 피렌 및 유도체: 피렌, 피렌 부티레이트, 석신이미딜 1-피렌 부티레이트, QSY® 7, QSY® 9, QSY® 21, QSY® 35(몰레큘러 프로브즈), 리액티브 레드(Reactive Red) 4(시바크론(Cibacron)® 브릴리언트 레드(Brilliant Red) 3B-A); 로다민 및 유도체: 6-카복시-X-로다민(ROX), 6-카복시로다민(R6G), 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 그린, 로다민 X 아이소티오사이아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(텍사스 레드), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA), 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 아이소티오사이아네이트(TRITC), 리보플라빈, 로졸산, 터븀 킬레이트 유도체.
다른 형광 뉴클레오타이드 유사체가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Jameson et al., 278 Meth. Enzymol. 363-390 (1997)]; 문헌[Zhu et al., 22 Nucl. Acids Res. 3418-3422 (1994)]을 참조한다. 미국 특허 제5,652,099호 및 제6,268,132호에는 또한, 형광 올리고뉴클레오타이드를 생성하기 위한, 효소적 또는 화학적 합성 중 어느 하나를 통한 핵산, 예를 들어, DNA 및/또는 RNA 또는 올리고뉴클레오타이드로의 혼입을 위한 뉴클레오타이드 유사체가 기재되어 있다. 미국 특허 제5,135,717호에는 형광 표지로서 사용하기 위한 프탈로사이아닌 및 테트라벤즈트라이아자포르피린 시약이 기재되어 있다.
k. 나노포어 디바이스:
제공되는 바와 같은 나노포어 디바이스는 디바이스의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 구조물 내에 개구를 형성하는 적어도 하나의 포어, 및 (예를 들어, 대상을 나타내는 파라미터의 변화를 검출함으로써) 포어를 통과하는 대상을 확인하도록 구성된 적어도 하나의 센서를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법을 위해 사용되는 나노포어 디바이스는 또한, 전문이 참조로 포함되는 PCT 공개 WO/2013/012881호에 개시되어 있다.
나노포어 디바이스 내의 포어(들)는 나노 스케일 또는 마이크로 스케일의 것이다. 일 양태에서, 각각의 포어는 작은 또는 큰 분자 또는 미생물이 통과되게 하는 크기를 갖는다. 일 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 1㎚이다. 대안적으로, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 2㎚, 3㎚, 4㎚, 5㎚, 6㎚, 7㎚, 8㎚, 9㎚, 10㎚, 11㎚, 12㎚, 13㎚, 14㎚, 15㎚, 16㎚, 17㎚, 18㎚, 19㎚, 20㎚, 25㎚, 30㎚, 35㎚, 40㎚, 45㎚, 50㎚, 60㎚, 70㎚, 80㎚, 90㎚ 또는 100㎚이다.
일 양태에서, 포어는 직경이 약 100㎚ 이하이다. 대안적으로, 포어는 직경이 약 95㎚, 90㎚, 85㎚, 80㎚, 75㎚, 70㎚, 65㎚, 60㎚, 55㎚, 50㎚, 45㎚, 40㎚, 35㎚, 30㎚, 25㎚, 20㎚, 15㎚ 또는 10㎚ 이하이다.
일부 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 100㎚, 200㎚, 500㎚, 1000㎚, 2000㎚, 3000㎚, 5000㎚, 10000㎚, 20000㎚ 또는 30000㎚이다. 일 양태에서, 포어는 직경이 약 100000㎚ 이하이다. 대안적으로, 포어는 직경이 약 50000㎚, 40000㎚, 30000㎚, 20000㎚, 10000㎚, 9000㎚, 8000㎚, 7000㎚, 6000㎚, 5000㎚, 4000㎚, 3000㎚, 2000㎚ 또는 1000㎚ 이하이다.
일 양태에서, 포어는 약 1㎚ 내지 약 100㎚, 또는 대안적으로 약 2㎚ 내지 약 80㎚, 또는 약 3㎚ 내지 약 70㎚, 또는 약 4㎚ 내지 약 60㎚, 또는 약 5㎚ 내지 약 50㎚, 또는 약 10㎚ 내지 약 40㎚, 또는 약 15㎚ 내지 약 30㎚인 직경을 갖는다.
일부 양태에서, 나노포어 디바이스 내의 포어(들)는 큰 미생물 또는 세포를 검출하기 위한 더 큰 스케일의 것이다. 일 양태에서, 각각의 포어는 큰 세포 또는 미생물이 통과되게 하는 크기를 갖는다. 일 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 100㎚이다. 대안적으로, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 200㎚, 300㎚, 400㎚, 500㎚, 600㎚, 700㎚, 800㎚, 900㎚, 1000㎚, 1100㎚, 1200㎚, 1300㎚, 1400㎚, 1500㎚, 1600㎚, 1700㎚, 1800㎚, 1900㎚, 2000㎚, 2500㎚, 3000㎚, 3500㎚, 4000㎚, 4500㎚ 또는 5000㎚이다.
일 양태에서, 포어는 직경이 약 100,000㎚ 이하이다. 대안적으로, 포어는 직경이 약 90,000㎚, 80,000㎚, 70,000㎚, 60,000㎚, 50,000㎚, 40,000㎚, 30,000㎚, 20,000㎚, 10,000㎚, 9000㎚, 8000㎚, 7000㎚, 6000㎚, 5000㎚, 4000㎚, 3000㎚, 2000㎚ 또는 1000㎚ 이하이다.
일 양태에서, 포어는 약 100㎚ 내지 약 10000㎚, 또는 대안적으로 약 200㎚ 내지 약 9000㎚, 또는 약 300㎚ 내지 약 8000㎚, 또는 약 400㎚ 내지 약 7000㎚, 또는 약 500㎚ 내지 약 6000㎚, 또는 약 1000㎚ 내지 약 5000㎚, 또는 약 1500㎚ 내지 약 3000㎚인 직경을 갖는다.
일부 양태에서, 나노포어는 막의 도처에 연장된다. 예를 들어, 포어는 지질 이중층 막 내에 삽입된 단백질 채널이거나, 그것은 드릴링, 에칭 또는 고체-상태 기판, 예를 들어, 이산화규소, 질화규소, 그래핀 또는 이들 또는 다른 물질의 조합으로 형성된 층을 통하여 포어를 형성하는 다른 것들에 의해 조작될 수 있다. 일부 양태에서, 나노포어의 길이 또는 깊이는 2개의 다른 개별 용적을 연결하는 채널을 형성하기에 충분히 크다. 일부 이러한 양태에서, 각각의 포어의 깊이는 100㎚, 200㎚, 300㎚, 400㎚, 500㎚, 600㎚, 700㎚, 800㎚ 또는 900㎚ 초과이다. 일부 양태에서, 각각의 포어의 깊이는 2000㎚ 또는 1000㎚ 이하이다.
일 양태에서, 각각의 포어는 적어도 약 0.3㎚인 깊이(즉, 2개의 인접 용적 사이에 연장되는 포어의 길이)를 갖는다. 대안적으로, 각각의 포어는 적어도 약 0.6㎚, 1㎚, 2㎚, 3㎚, 4㎚, 5㎚, 6㎚, 7㎚, 8㎚, 9㎚, 10㎚, 11㎚, 12㎚, 13㎚, 14㎚, 15㎚, 16㎚, 17㎚, 18㎚, 19㎚, 20㎚, 25㎚, 30㎚, 35㎚, 40㎚, 45㎚, 50㎚, 60㎚, 70㎚, 80㎚ 또는 90㎚인 깊이를 갖는다.
일 양태에서, 각각의 포어는 약 100㎚ 이하인 깊이를 갖는다. 대안적으로, 깊이는 약 95㎚, 90㎚, 85㎚, 80㎚, 75㎚, 70㎚, 65㎚, 60㎚, 55㎚, 50㎚, 45㎚, 40㎚, 35㎚, 30㎚, 25㎚, 20㎚, 15㎚ 또는 10㎚ 이하이다.
일 양태에서, 포어는 약 1㎚ 내지 약 100㎚, 또는 대안적으로 약 2㎚ 내지 약 80㎚, 또는 약 3㎚ 내지 약 70㎚, 또는 약 4㎚ 내지 약 60㎚, 또는 약 5㎚ 내지 약 50㎚, 또는 약 10㎚ 내지 약 40㎚, 또는 약 15㎚ 내지 약 30㎚인 깊이를 갖는다.
일부 양태에서, 나노포어 디바이스는 포어를 가로질러 표적 분자를 이동시키는 수단 및/또는 포어를 통과하는 대상을 확인하기 위한 수단을 더 포함한다. 추가의 상세사항은 하기에, 2-포어 디바이스의 맥락에서 기재되어 제공되어 있다.
단일-포어 나노포어 디바이스에 비하여, 2-포어 디바이스는 포어를 가로지르는 표적 분자의 이동 방향 및 속도의 우수한 제어를 제공하도록 더욱 용이하게 구성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 나노포어 디바이스는 복수의 챔버를 포함하며, 각 챔버는 적어도 하나의 포어를 통해 인접 챔버와 소통한다. 이들 포어 중, 2개의 포어, 즉, 제1 포어 및 제2 포어는 표적 분자의 적어도 일부가 제1 포어에서 제2 포어 내로 이동하도록 배치된다. 추가로, 디바이스는 이동 동안 표적 분자를 확인할 수 있는 센서를 포함한다. 일 양태에서, 확인은 표적 분자의 개별 구성요소를 확인하는 것을 수반한다. 또 다른 양태에서, 확인은 표적 분자에 결합된 표적 피분석물 및/또는 융합 분자를 확인하는 것을 수반한다. 단일의 센서가 사용되는 경우, 단일의 센서는 포어에 걸친 이온 전류를 측정하기 위해 포어의 양 말단에 배치된 2개의 전극을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 단일의 센서는 전극 이외의 구성요소를 포함한다.
일 양태에서, 디바이스는 2개의 포어를 통해 연결된 3개의 챔버를 포함한다. 3개 초과의 챔버를 갖는 디바이스는 3-챔버 디바이스의 어느 하나의 측 상에 또는 3개의 챔버 중 임의의 2개 사이에 하나 이상의 추가의 챔버를 포함하도록 용이하게 설계될 수 있다. 마찬가지로, 2개 초과의 포어가 챔버를 연결하기 위해 디바이스에 포함될 수 있다.
일 양태에서, 다수의 표적 분자가 하나의 챔버로부터 다음 챔버로 동시에 이동하게 되도록 2개의 인접 챔버 사이에 2개 이상의 포어가 존재할 수 있다. 이러한 다중-포어 설계는 디바이스 내의 표적 분자 분석의 처리율을 향상시킬 수 있다.
예를 들어, 3-챔버 2-포어 디바이스("2-포어" 디바이스)에서, 각각의 챔버는 개별 전압이 챔버 사이의 포어의 각각에 걸쳐 인가될 수 있도록 전력원에 연결하기 위한 전극을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시형태에 따르면, 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하는 디바이스가 제공되며, 상부 챔버는 제1 포어를 통해 중간 챔버와 소통하며, 중간 챔버는 제2 포어를 통해 하부 챔버와 소통한다. 이러한 디바이스는 전문에 본 명세서에 참조로 포함되는 발명의 명칭이 Dual-Pore Device인 미국 특허 공개 제2013-0233709호에 이전에 개시된 치수 또는 다른 특징 중 임의의 것을 가질 수 있다.
일부 양태에서, 포어는 실질적으로 둥근 형상을 갖는다. 본 명세서에 사용되는 "실질적으로 둥근"은 적어도 약 80 또는 90%가 원통형인 형상을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 포어는 사각형, 직사각형, 삼각형, 타원형 또는 육각형 형상이다.
일 양태에서, 2개 이상의 포어를 포함하는 디바이스에서, 포어는 약 10㎚ 내지 약 1000㎚인 간격으로 이격된다. 일부 양태에서, 포어 사이의 간격은 1000㎚, 2000㎚, 3000㎚, 4000㎚, 5000㎚, 6000㎚, 7000㎚, 8000㎚ 또는 9000㎚ 초과이다. 일부 양태에서, 포어는 30000㎚, 20000㎚ 또는 10000㎚ 이하로 이격된다. 일 양태에서, 간격은 적어도 약 10㎚, 또는 대안적으로, 적어도 약 20㎚, 30㎚, 40㎚, 50㎚, 60㎚, 70㎚, 80㎚, 90㎚, 100㎚, 150㎚, 200㎚, 250㎚ 또는 300㎚이다. 또 다른 양태에서, 간격은 약 1000㎚, 900㎚, 800㎚, 700㎚, 600㎚, 500㎚, 400㎚, 300㎚, 250㎚, 200㎚, 150㎚ 또는 100㎚ 이하이다.
또 다른 양태에서, 포어 사이의 간격은 약 20㎚ 내지 약 800㎚, 약 30㎚ 내지 약 700㎚, 약 40㎚ 내지 약 500㎚, 또는 약 50㎚ 내지 약 300㎚이다.
2개의 포어는 그들이 챔버 간에 유체 소통을 가능하게 하고, 규정된 크기 및 그들 사이의 간격을 갖는 한 임의의 위치에 배치될 수 있다. 일 양태에서, 포어는 그들 사이에 직접적인 차단이 존재하지 않도록 배치된다. 또한, 일 양태에서, 포어는 실질적으로 동축이다.
일 양태에서, 나노포어 디바이스는 하나 이상의 전력원에 연결된다. 일부 양태에서, 전력원은 전압-클램프 또는 패치-클램프를 포함하며, 이는 각각의 포어에 걸쳐 전압을 인가하며, 개별적으로 각 포어를 통과하는 전류를 측정할 수 있다. 이러한 면에서, 전력원 및 전극 구성으로, 중간 챔버를 두 전력원 모두에 대한 공통의 접지로 설정할 수 있다.
일부 양태에서, 전력원 또는 전력원들은 제1 포어에 걸쳐 제1 전압 V1 및 제2 포어에 걸쳐 제2 전압을 인가하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 2개의 포어는 연속하여 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 포어는 상부 챔버와 중간 챔버 사이에 존재하며, 제2 포어는 중간 챔버와 하부 챔버 사이에 존재한다. 일부 양태에서, 제1 전압 V1 및 제2 전압 V2는 독립적으로 조정 가능하다. 일 양태에서, 중간 챔버는 2개의 전압에 대해 접지가 되도록 조정된다. 일 양태에서, 중간 챔버는 중간 챔버 내의 포어와 전극 각각 사이에 전도성을 제공하기 위한 매질을 포함한다. 일 양태에서, 중간 챔버는 중간 챔버 내의 포어와 전극의 각각 사이에 저항을 제공하기 위한 매질을 포함한다. 이러한 저항을 나노포어 저항에 비하여 충분히 작게 유지하면, 포어에 걸친 두 전압 및 전류를 분리하는데 유용하며, 이는 전압의 독립적인 조정에 도움이 된다.
전압의 조정은 챔버 내에서의 하전된 입자의 이동을 제어하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 두 전압이 동일한 극성으로 설정된 경우, 적절하게 하전된 입자는 상부 챔버로부터 중간 챔버로, 그리고 하부 챔버로, 또는 반대로, 순차적으로 이동될 수 있다. 일부 양태에서, 두 전압이 반대 극성으로 설정된 경우, 하전된 입자는 상부 또는 하부 챔버 중 어느 하나로부터 중간 챔버로 이동하여 거기에 유지될 수 있다.
나노포어 디바이스 및 검출을 위한 이용 메커니즘의 추가의 실시형태는 PCT 공개 WO2013/012881호 및 PCT 공개 WO2013/074546호에 기재되어 있으며, 각각은 전문이 참조로 포함된다.
l. 센서:
상기 논의된 바와 같이, 다양한 양태에서, 나노포어 디바이스는 결합 모티프의 결합 상태의 확인을 수행하기 위한 하나 이상의 센서를 더 포함한다.
디바이스에 사용되는 센서는 표적 분자를 확인하는데 적합한 임의의 센서일 수 있다. 예를 들어, 센서는 표적 분자 또는 결합된 페이로드 분자와 관련된 전류, 전압, pH 값, 광학적 특징 또는 체류 시간을 측정함으로써 표적 분자를 확인하도록 구성될 수 있다. 다른 양태에서, 센서는 표적 분자의 하나 이상의 개별 구성요소 또는 표적 분자에 결합된 하나 이상의 구성요소(즉, 페이로드 분자)를 확인하도록 구성될 수 있다. 센서는 측정 가능한 파라미터의 변화를 검출하도록 구성된 임의의 구성요소로 형성될 수 있으며, 변화는 표적 분자 또는 페이로드 분자를 나타낸다. 일 양태에서, 센서는 분자 또는 기타 엔티티, 특히 표적 분자가 포어를 통해 이동할 때 포어에 걸친 이온 전류를 측정하기 위해, 포어의 두 측에 배치된 한 쌍의 전극을 포함한다. 특정 양태에서, 포어에 걸친 이온 전류는 포어를 통과하는 표적 분자 세그먼트가 페이로드 분자에 결합되는 경우 측정 가능하게 변화한다. 이러한 전류의 변화는, 예를 들어 표적 분자에 결합된 존재하는 하나 이상의 페이로드 분자의 존재, 부재, 및/또는 크기와 상응하는 예측 가능하고 측정 가능한 방식으로 변할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 센서는, 전압을 인가하고 나노포어에 걸친 전류를 측정하는데 사용되는 전극을 포함한다. 나노포어를 통과하는 분자의 이동은 옴의 법칙 V = IZ에 따라 나노포어를 통과하는 전류에 영향을 주는 전기 임피던스(Z)를 제공하며, 여기서 V는 인가된 전압이며, I는 나노포어를 통과하는 전류이고, Z는 임피던스이다. 분자가 전기장 내에서(예를 들어, 전압 인가 하에서) 나노포어를 통해 이동하는 경우의 결과는 전기 신호이며, 이는 전류 신호의 추가의 분석 시에 나노포어를 통과하는 분자와 연관될 수 있다.
전기 신호로부터 체류 시간 측정치가 사용되는 경우, 구성요소의 크기는 감지 디바이스를 통과하는데 걸리는 시간의 길이에 기초하여 특정 구성요소와 연관될 수 있다.
일 실시형태에서, 표적 분자, 표적 분자의 구성요소(또는 단위), 또는 표적 분자에 결합된 구성요소(예를 들어, 페이로드 분자 또는 드라이버 분자)의 광학적 특성을 측정하는 센서가 나노포어 디바이스에 제공된다. 이러한 측정의 일례에는 특정 단위에 독특한 흡수 밴드를 적외선(또는 자외선) 분광법으로 확인하는 것이 포함된다.
일부 실시형태에서, 센서는 전기 센서이다. 일부 실시형태에서, 센서는 통과하는 표적 피분석물 또는 검출 가능한 표지가 독특한 형광 시그니처를 갖는 경우, 형광 검출 수단을 검출한다. 상기 시그니처를 검출하기 위하여 포어의 출구에 방사선원이 사용될 수 있다.
m. 나노포어 검출로부터의 데이터의 분석:
일부 실시형태에서, 표적 분자의 확인 방법은 하나 이상의 나노포어를 포함하는 디바이스에서 수행된다. 시료가 저장소 챔버 내로 진입하게 하는 미세유체 채널이 디바이스에 포함될 수 있다. 그 다음, 전압을 시료 혼합물에 인가하여, 하전된 분자, 예를 들어, 드라이버 분자에 결합된 표적 분자가 나노포어를 통과하게 한다. 분자가 포어를 통과함에 따라, 이벤트가 생성되며, 데이터를 소프트웨어에 의해 분석하여, 표적 분자의 존재와 연관된 알려져 있는 시그니처 곡선의 존재를 식별한다.
일부 실시형태에서, 전기 신호는 표적 분자를 포함하는 복합체가 나노포어를 통과할 때 생성된다. 일부 실시형태에서, 전기 신호는 시료 내의 표적 분자의 존재 또는 부재와 연관된다. 일부 실시형태에서, 전기 신호는 시료 내의 표적 분자의 농도와 연관된다.
또 다른 실시형태에서, 전류 임피던스 측정치 대신에 광학 신호를 사용하여, 표적 분자의 존재를 식별할 수 있다. 전압을 인가하여, 하전된 분자가 나노포어를 통과하게 유도한다. 광학 센서를 디바이스에서 사용하여, 나노포어에 또는 나노포어에 인접하여 존재할 수 있는 고정된 시야 내에서 광학 측정치를 수집한다. 광학 측정치는 고정된 기간 내에서 검출되는 광의 척도를 포함한다. 이러한 측정치는 개별 값, 예를 들어, 색, 발광 및 세기 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 상기 방법을 사용하여, 광학 센서가 검출할 광학 신호를 생성하여, 특정 광학 측정치를 제공하는 방식으로 변형된 표적 분자를 검출할 수 있다.
"광학 이벤트"는 하나 이상의 페이로드 분자를 함유할 수 있는 단일의 표적 분자 이동으로부터 센서에 의해 수집되는 광학적 측정치의 세트이다. 광학 시그니처는 광학 이벤트 내의 광학 측정치의 집합이며, 소프트웨어는 그것이 독특한 요약 값을 판독함을 결정하는 방식으로 그들을 분석한다.
실시형태 중 몇몇에서, 제공되는 전기적 또는 광학적 신호는 표적 분자와 전기적 또는 광학적 신호를 연관시키는 데이터베이스에 대하여 비교될 수 있다. 이러한 표적 분자는 나노포어를 통과하는 이동 시의 전류 임피던스, 또는 다른 검출 방법, 예를 들어, 광학적 측정을 통해 검출될 수 있는 바와 같은 본 명세서에 논의된 엔티티 중 임의의 것일 수 있다. 데이터베이스는 균일한 집단에 의해 제공되는 전기 신호를 판독함으로써 생성될 수 있다. 드라이버 분자에 추가로 결합될 수 있는 페이로드 분자에 결합된 표적 분자의 균일한 집단의 분석은 생성된 신호 패턴의 변이를 평가하고, 상기 코딩된 분자를 위한 기준 신호를 결정하는데 유용하다.
n. 응용:
일부 실시형태에서, 본 발명은 시료 중 표적 분자의 존재 또는 부재를 검출하기 위하여 적용된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 시료 중 표적 분자의 농도를 측정하기 위하여 적용된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 표적 분자를 포함하는 복합체의 존재 또는 부재를 검출하기 위하여 적용된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 시료 중 표적 분자를 포함하는 복합체의 농도를 측정하기 위하여 적용된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 표적 분자 또는 표적 분자를 포함하는 복합체의 물리적 특성을 검출하기 위하여 적용된다.
일부 실시형태에서, 시료는 약리학적 조성물이다. 일부 실시형태에서, 시료는 환자로부터의 혈액, 소변, 타액 또는 조직 시료이다. 일부 실시형태에서, 시료는 혼합 시료, 예를 들어, 환자로부터 수득되는 혈액 또는 소변 시료이다. 일부 실시형태에서, 시료는 표적이 투여된 대상체로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 시료는 인간 환자로부터 수득된다.
일부 실시형태에서, 시료는 물, 토양, 공기, 슬러지, 석유 또는 화학적 또는 생물학적 제품이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자 또는 표적 분자를 포함하는 복합체의 나노포어 검출은 시료의 조성에 관한 정보를 제공한다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 또는 표적 분자를 포함하는 복합체의 나노포어 검출은 시료의 물리적 조건, 예를 들어, pH, 조성 또는 온도에 관한 정보를 제공한다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 또는 표적 분자를 포함하는 복합체의 나노포어 검출은 표적 분자의 안정성에 관한 정보를 제공한다. 일부 실시형태에서, 표적 분자 또는 표적 분자를 포함하는 복합체의 나노포어 검출은 시료의 기원에 관한 정보를 제공한다.
6. 실시예
a. 실시예 1:
i. 표적-링커-드라이버 복합체:
도 1은 개시된 방법 및 시스템의 실시형태를 예시한 것이다. 더욱 구체적으로, 도면에는 링커 분자(104)를 통해 드라이버 분자(102)에 결합된 표적 분자(101)가 개시되어 있다. 드라이버 분자(102)를 하전시켜, 인가된 전압 하에서 나노포어(106)를 통한 표적 분자(101)의 이동을 용이하게 한다. 또한, 나노포어 내의 포획 시에 검출 가능한 신호를 생성하거나 생성하지 않을 수 있는 백그라운드 분자(105)가 도 1에 나타나 있다.
특정 조건 하에서, 드라이버 분자(102)는 도 2에 제공된 바와 같이 표적 분자(101)로부터 분리될 수 있다. 이것이 일어난다면, 드라이버 분자(102)는 표적 분자 없이 나노포어를 통과한다.
도 3에 예시된 바와 같이, 단독의 드라이버 분자(도 3B)의 이동 또는 단독의 표적 분자(도 3C)의 이동 시에 생성되는 전기 신호는 드라이버-표적 복합체(도 3A)의 이동 시에 생성되는 전기 신호와 상이하다. 이러한 경우에, 드라이버 분자에 결합된 표적 분자는 기간이 더 길고/거나 개방 채널 신호로부터 더 큰 변화를 갖는 전기 신호를 제공한다(도 3A 내지 도 3C).
ii. 표적(리시노프릴)-링커(SMCC)-드라이버(DNA) 복합체의 나노포어 검출:
본 발명은 그것이 전류 임피던스에 기반하여 나노포어에서 검출 가능하도록 드라이버 분자에 부착된 약물 화합물을 제공한다. 리시노프릴, 안지오텐신 전환 효소 억제제는 고혈압의 치료를 위하여 아스트라제네카(Astrazeneca)에 의해 시판되는 소분자 약물이다. 그의 작은 크기, 405 Da을 고려해 볼 때, 리시노프릴은 나노포어에서 검출되기에 너무 작다. 그러나, 드라이버 분자에 컨쥬게이트되는 경우, 리시노프릴은 나노포어를 통해 왕복하여, 검출을 가능하게 할 수 있다. 도 4는 dsDNA 드라이버 분자에 결합하는 SMCC 링커에 공유적으로 결합하도록 변형된 리시노프릴의 화학 구조를 보여준다.
구체적으로, 본 발명자들은 NHS-에스터 함유 분자로의 부착을 위한 유리 아민을 포함하도록 리시노프릴을 변형시켰다. 본 발명자들은 변형된 리시노프릴을 SMCC 링커를 통해 티올화 DNA에 연결시켰으며, SMCC 링커의 NHS-에스터 반응성 기는 리시노프릴의 유리 아민과 반응하는 한편, 링커 상의 말레이미드 기는 DNA 상의 5' 티올과 반응한다. 본 발명자들은 ESI-질량 분석법을 통해 리시노프릴의 SMCC 표지화를 확인하였으며, 625.2의 질량 측정치(도 5)는 625 내지 627의 질량 예측치와 일치하였다. 그 다음, 이러한 리시노프릴-SMCC 첨가물을 티올화 DNA와 반응시켜, 리시노프릴-DNA(또는 표적-드라이버) 복합체를 초래하였다.
DNA 드라이버 분자는 나노포어 디바이스에서의 리시노프릴의 번역 및 검출을 용이하게 하였다. DNA-리시노프릴 복합체는 도 6에 플롯팅된 바와 같이(점), 용이하게 검출 가능한 전기 신호를 생성하였다. 드라이버 없이 리시노프릴은 포어를 통과하는 경우 신호를 제공하지 않았다. 10nM 농도의 DNA-리시노프릴은 분당 144개의 이벤트를 제공하며, 이는 최대 전도도 이동이 1 내지 2 nS, 및 기간이 10-5 내지 10-4 s의 범위이다. 532 bp dsDNA 드라이버 분자로의 부착 없이, 리시노프릴은 나노포어로 검출 가능하지 않다.
iii. 표적(단클론성 항체)-링커(PNA-SMCC)-드라이버(DNA) 복합체의 나노포어 검출:
본 발명은 또한, 드라이버 분자에 결합하여 전기영동 전류 하에서 그것이 포어를 통과하게 하는 도메인에 표적을 공유적으로 커플링시킴에 의한 생물학적 표적 약물의 검출 방법을 제공한다. 구체적으로, 파상풍 박테리아(파상풍 독소) 내의 병원성 단백질에 결합하고 이를 중화시킬 수 있는 단클론성 항체 약물은 SMCC 링커를 통해 PNA에 공유적으로 컨쥬게이트되며, 이는 서열 특이적 위치에서 DNA 드라이버 분자에 결합한다. 복합체(드라이버-약물)는 포어에서 명백하게 검출 가능한 한편, 약물만 및 드라이버만은 검출 가능하지 않다. 따라서, 오직 드라이버-약물 복합체만이 포어에서 검출되어, 본 특허의 도 1의 개념을 실행할 수 있다.
도 7은 1 M LiCl 중에서, 27㎚의 추정 직경 및 29㎚의 포어 두께를 갖는 포어를 통과하는 드라이버 DNA 및 약물(항체)의 개별 분자의 최대 전도도 이동 대 기간의 이벤트 플롯을 보여준다. 최대 전도도 이동은 인가되는 전압(이 경우에 100 mV)으로 나눈 최대 전류 감쇄 이동으로 정의된다. 드라이버 및 약물이 서로 커플링되지 않은 경우, 어느 것도 나노포어를 통하여 인식 가능한 신호를 제공하지 않으며, 이에 따라, 최소로 검출된다(드라이버 DNA 신호 깊이는 10-5 내지 10-4 s의 기간과 함께 1 내지 2.5 nS였으며, 이벤트 비는 분당 8개 미만이었으며, 약물 항체는 전혀 검출되지 않았다). 그러나, 드라이버-약물의 완전한 복합체는 분당 170개의 이벤트, 및 1) 드라이버 DNA의 길이 및 2) 약물 항체의 "벌크"에 의해 제공되는 매우 두드러진 신호 깊이(2 내지 6 nS) 및 기간(10-4 내지 10-2 s)을 제공한다. 이는 개별적으로 단위(오직 드라이버 DNA-PNA만 흑색 사각형, 도 7)와 비교하여 용이하게 검출 가능한 집단을 생성하는 DNA/약물 복합체(점, 도 7)를 초래한다. 이는 나노포어 검출 및 정량화를 위한 약물과 드라이버 분자 간의 결합의 중요성을 보여준다.
b. 실시예 2
i. 표적-링커-드라이버-페이로드 복합체:
도 4는 본 발명의 또 다른 실시형태를 제공하며, 표적 분자(101)는 링커 분자(104a)를 통하여 드라이버 분자(102)에, 그리고 또 다른 링커(104b)를 통하여 페이로드 분자(103)에 결합된다. 도 9A 및 도 9B에 예시된 바와 같이, 페이로드 분자의 부가는 전기 신호를 향상시켜, 그의 기간 및/또는 개방 채널 신호와의 차이를 증가시켜, 나노포어 내의 표적 분자의 검출을 용이하게 한다.
ii. 표적(생물학적 펩타이드)-링커(PNA)-드라이버(DNA)-페이로드(항체) 복합체의 나노포어 검출:
도 10은 펩타이드 표적 분자에 특이적으로 결합하는 드라이버 분자 및 페이로드 분자에 부착된 생물학적 펩타이드 표적 분자로부터 수집된 데이터를 제공한다. 페이로드 분자는 벌크를 복합체(드라이버-표적-페이로드)에 부가하여, 그에 의해, 포어 내의 표적 분자의 검출을 용이하게 한다(도 9에 기재된 바와 같음). 구체적으로, 생물학적 펩타이드 표적 분자를 유리 티올을 갖는 화합물로의 이후의 부착을 위하여 말레이미드 부착 부위를 갖도록 조작하였다. 조작된 생물학적 펩타이드 표적 분자를 드라이버 분자에 결합하는 PNA 링커를 통해 108 bp dsDNA 드라이버 분자에 부착시켰다. 표적 분자를 페이로드로서 작용하는 항체에 추가로 결합시켰다.
도 10은 포어를 통과하는 경우 108 bp dsDNA 드라이버 분자-표적 분자 복합체에 의해 생성되는 최대 전도도 이동 대 전기 신호의 기간의 이벤트 플롯을 보여준다. 페이로드 분자 없이 표적-드라이버 복합체는 DNA의 음의 전하로 인하여 포어를 통하여 효율적으로 왕복하였다. 그러나, 그것은 그의 작은 크기 및 드라이버의 짧은 길이 때문에 용이하게 검출 가능하지 않았다(사각형). 이벤트 집단(사각형)은 오직 미미하게만 검출된다(1 nS의 깊이 및 10-4 s의 기간을 갖는 분당 오직 2개의 이벤트). DNA/표적이 페이로드 분자(항체)에 부착되어, DNA/펩타이드/항체 복합체(드라이버/표적/페이로드로 알려져 있음)가 제조되는 경우, 복합체는 포어에서 용이하게 검출 가능하다(점). 완전한 복합체 집단은 4 내지 6 nS 이벤트 깊이 및 0.1 내지 10 ms의 기간, 및 분당 56개의 이벤트의 포착을 생성하였으며, 페이로드가 없는 드라이버-표적 복합체에 비하여 유의미하게 증가한다.
iii. 표적(바이오틴)-드라이버(DNA)-페이로드(항체) 복합체의 나노포어 검출:
도 11은 표적 분자가 드라이버 및 페이로드에 직접 부착되는 경우 표적 분자의 검출로부터의 데이터를 제공한다. 여기에서, DNA 드라이버 분자의 5' 및 3' 말단을 작은(244 Da) 표적 분자, 바이오틴(바이타민 B7)에 공유적으로 부착시켰으며, 이를 이어서 항-바이오틴 항체 페이로드에 의해 결합시켜 표적 바이오틴 분자의 검출을 가능하게 하였다. 부착을 위하여, 바이오틴을 탄수화물 상의 5' 포스페이트로의 이후의 부착을 위하여 아마이드로 조작하였다. 드라이버 분자는 470 bp dsDNA였으며, 이는 나노포어에서 최소로 검출되었다(분당 대략 1개의 이벤트 검출, 도 11의 사각형). 표적 분자, 바이오틴은 극히 작으며(244 Da), 나노포어에서 홀로 검출되지 않는다. 드라이버 + 바이오틴의 나노포어 신호는 단독의 드라이버로부터의 신호와 매우 유사하였으며, 이에 따라, 바이오틴은 검출 불가능하게 되었다. 바이오틴-드라이버를 항체와 접촉시킴으로써, 드라이버-표적-페이로드 복합체가 형성되었으며, 복합체가 용이하게 검출되었다. 도 13의 산점도에서 역삼각형은 기간(10-4 s 내지 10-2 s), 크기(1 nS 내지 7 nS) 및 빈도(초당 1개의 이벤트)의 범위인 드라이버-표적-페이로드 복합체로부터의 이벤트를 보여준다. 페이로드 분자만으로는 신뢰성 있는 검출을 위한 충분한 신호가 제공되지 않는다. 또한, 항-바이오틴 항체는 드라이버 dsDNA 분자에 비특이적으로 결합하지 않는다. 따라서, 명백한 이벤트는 표적 분자의 존재의 절대적인 검출을 위하여, 완전한 드라이버-표적-페이로드 복합체에 독특한 것이다.
c. 실시예 3
i. 표적-링커-드라이버-2개의 페이로드 복합체:
도 12는 본 발명의 또 다른 실시형태를 제공하며, 추가의 페이로드 분자(103b)(물결 모양 사각형)는 드라이버 분자(102)에 연결된다. 예를 들어, PNA-PEG 페이로드 분자(103b)를 DNA 드라이버 분자에 부착시킬 수 있다. 이러한 페이로드 분자의 결합은 나노포어를 통한 이동 시에 전기 신호를 추가로 변형시켜, 나노포어에 의한 검출을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 드라이버 분자 및 복수의 페이로드 분자에 결합된 표적 분자는 하나의 챔버에서 다른 챔버로 나노포어를 통해 완전히 이동하도록 구성된다(도 13).
2개의 페이로드 분자를 포함하는 복합체(도 14A), 하나의 페이로드 분자를 포함하는 복합체(도 14B) 및 임의의 페이로드 분자가 없는 복합체(도 14C)는 상이한 전기 신호를 생성한다. 추가의 페이로드 분자에 결합된 표적 분자에 의해 생성되는 전기 신호는 향상된 기간 또는 개방 채널로부터의 전류의 변화를 가질 수 있다(도 14A). 추가의 페이로드 분자로부터의 전기 신호는 또한, 백그라운드 분자에 대한 또는 다른 표적 분자에 대한 판별을 용이하게 하기 위한 독특한 전류 시그니처를 제공할 수 있다.
ii. 표적(펩타이드)-링커(PNA)-드라이버(DNA)-2개의 페이로드(제1 페이로드로서 항체 및 제2 페이로드로서 PNA-PEG) 복합체의 나노포어 검출:
도 15는 이러한 실시형태에 사용되는 드라이버 분자를 보여준다. 드라이버 분자는 2개의 결합 부위를 포함하는데, 하나의 결합 부위는 제1 페이로드 분자에 결합된 표적 분자를 위한 것이고, 다른 결합 부위는 제2 페이로드 분자를 위한 것이다. 드라이버 분자에 부착된 제2 페이로드는 다중화를 가능하게 한다. 상이한 크기의 또는 상이하게 이격된 제2 페이로드를 사용함으로써, 시료 중 각 드라이버-표적 종에 대하여 독특한 임피던스 시그니처가 생성될 수 있다.
구체적으로, 도 15에서 5631 bp dsDNA 드라이버 분자의 2개의 결합 부위는 2개의 PNA 분자에 결합할 수 있다. 하나의 결합 부위는 독특한 확인을 위한 제2 페이로드 분자로서 사용되는 PNA-PEG를 위한 것이며, 다른 결합 부위는 표적-페이로드 복합체를 위한 것이며, 여기서, 각각 표적은 PNA-펩타이드이며, 페이로드는 항체이다. 이러한 모델에서, 이전의 실시예에서와 같이, 표적 펩타이드 그 자체는 나노포어 검출 및 정량화를 위하여 그를 드라이버(dsDNA)에 결합시킬 수 있는 수단으로서 그것에 컨쥬게이트된 PNA를 갖는 변형된 "약물"이다. 이러한 실시예에서 PEG(제2 페이로드) 및 펩타이드(표적)와 함께 사용되는 PNA는 동일하지만, 실제로는, 독특한 PNA 서열이 사용될 수 있고, 스캐폴드 당 오직 하나의 제2 페이로드 및 하나의 표적-페이로드를 가질 확률을 증가시키기 위해 바람직할 수 있다. PNA 서열이 동일하기 때문에, 초기 10X PNA-PEG를 사용하여, 대다수의 스캐폴드를 PNA 결합 부위 중 오직 1개를 사용하여 결합시킨 다음, 10X PNA-펩타이드를 사용하여 대다수의 스캐폴드 상의 남아 있는 PNA 결합 부위를 점유시켰다. 순차적으로 시약을 동일한 24.5-25.5㎚ 직경 포어에서 시험하였다.
도 16A 및 도 16B는 단독의 0.3nM 5631 bp DNA(단독의 드라이버, 원형); 10X PNA-10 kDa PEG(PP)가 있는 DNA(드라이버-페이로드: 사각형 및 마름모); 10X PP 및 10X PNA-V3 루프 펩타이드(PV3B)가 있는 DNA(드라이버-페이로드-표적 복합체; 녹색 삼각형); 및 10X PP 및 10X PV3B 및 결합 부위에 대한 2X HIV Ab가 있는 DNA(드라이버-표적-2개의 페이로드 복합체; 별표)로부터 수집된 이벤트 플롯(도 16A) 및 전기 신호의 히스토그램(도 16B)을 보여준다.
모든 시약 세트 간에, 오직 완충제 만의 이벤트-부재(즉, 10개 이하의 이벤트) 기간을 5 내지 10분 동안 기록하여, 시험된 각 시약이 최소의 교차-시료 오염으로 측정되었음을 보장하였다. 0.3nM의 단독의 5.6 kb DNA는 10분 내에 457개의 이벤트를 생성하였으며, 그 다음, 10X(6nM = 2 x 부위 당 3nM) PNA-PEG(10 kDa)가 있는 0.3nM DNA는 8분 내에 294개의 이벤트를 생성하고, 이후에 10X PNA-PEG(10 kDa)가 있는 0.3nM DNA의 반복은 7분 내에 316개의 이벤트를 생성하였다. 다음으로, 10X PP 및 10X V3B가 있는 DNA는 15분 내에 787개의 이벤트를 생성하였으며, 그 다음, 10X PP 및 10X V3B 및 2X Ab가 있는 DNA는 25분 내에 828개의 이벤트를 생성하였다. 최종 대조군으로서, 단독의 2X Ab(0.6nM)를 시행하여, 10분 내에 오직 7개의 이벤트만을 생성하였다.
DNA 단독의 집단은 다른 것들과 구별 가능하여, 표준 폴딩된, 부분적으로 폴딩된, 및 폴딩되지 않은 이벤트 프로파일을 생성한다. 10X PP 및 PV3B가 있는 DNA 집단은 이벤트 분포가 유사한 한편, Ab가 존재하는 완전한 복합체(페이로드 부재의 경우에서와 같음)는 더 깊고 더 길게 지속하는 집단을 생성한다(도 16A, 이벤트 주위의 네모, 좌측). 표준 이벤트 플롯을 사용한 이들 집계 경향은 제2 페이로드 결합 및 표적-페이로드 결합이 있는 복합체가 표적 검출 및 정량화를 위한 독특한 전기 시그니처를 생성하는 것을 보여준다.
드라이버 분자를 설계하는 대안적인 방식이 이러한 실시형태를 위해 이용 가능하다. 예를 들어, 전문이 참조로 포함되는 PCT 공개 WO/2015/176034호에는 다중화의 수단으로서, 독특한 식별자 및 표적을 위한 다수의 결합 부위를 포함하는 드라이버 분자(즉, 스캐폴드)가 개시되어 있다. 이러한 드라이버 분자를 표적 분자에 연결하여, 나노포어 디바이스를 사용하여 표적 분자의 검출을 가능하게 할 수 있다.
7. 참조에 의한 포함
본 출원에 열거된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌은 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참조로 포함되는 것으로 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그들 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
8. 등가물
다양한 특정 실시형태가 예시되고 기재되어 있지만, 상기 명세서는 제한하는 것이 아니다. 본 발명(들)의 목적과 범주로부터 벗어나지 않고, 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 알 것이다. 본 명세서의 검토 시에 많은 변이가 해당 분야의 숙련자에게 명백해질 것이다.

Claims (71)

  1. 나노포어 검출을 위해 설계된 복합체로서,
    제1 부착 부위를 포함하는 표적 분자; 및
    제1 부착 부위를 포함하는 드라이버 분자를 포함하되,
    상기 드라이버 분자의 제1 부착 부위가 상기 표적 분자의 제1 부착 부위에 대하여 공유 결합을 이루는, 복합체.
  2. 나노포어 검출을 위해 설계된 복합체로서,
    제1 부착 부위를 포함하는 표적 분자; 및
    제1 부착 부위 및 제2 부착 부위를 포함하는 링커 분자를 포함하되,
    상기 링커 분자의 제1 부착 부위가 상기 표적 분자의 제1 부착 부위에 대하여 공유 결합을 이루며,
    상기 링커 분자의 제2 부착 부위가 드라이버 분자를 위한 결합 부위인, 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 드라이버 분자를 더 포함하는 복합체로서, 상기 드라이버 분자가 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹(pi-stacking) 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 상기 링커 분자의 제2 부착 부위에 결합되는, 복합체.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 링커 분자가 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA), 리보핵산(RNA), 나노입자, 펩타이드 핵산(PNA), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 덴드리머, 합성 폴리머 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 복합체.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 분자가 펩타이드, 발린-시트룰린 링커, 말레이미도카프로일(mc) 링커, [N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(MCC) 링커, 석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC) 링커, PEG-계 링커, 하이드라존 링커, N-석신이미딜-4-(2-피리딜다이티오) 부타노에이트(SPDB) 링커 또는 카보네이트 링커 또는 임의의 다른 동종이작용성 또는 이종이작용성 분자를 포함하는, 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자가 생물학적 치료제를 포함하는, 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 치료제가 단클론성 항체, 단백질, 프로테아제, 펩타이드, 당, 핵산 또는 이들의 임의의 조합인, 복합체.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자가 소분자를 포함하는, 복합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 소분자가 소분자 치료제 또는 소분자 진단 약물인, 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 소분자가 효소 억제제 또는 활성화제, 수용체 길항제 또는 작용제, 및 세포 과정 또는 경로의 소분자 조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자 치료 약물인, 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 소분자 치료 약물이 리시노프릴(Lisinopril)인, 복합체.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자가 비료, 건설 또는 건축 재료 및 식이 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 또는 생물학적 제품의 성분을 포함하는, 복합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 성분이 나이트로게나제인, 복합체.
  14. 제12항에 있어서, 상기 성분이 보론산인, 복합체.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자가 pH 지시약, 독소 지시약, 화학적 지시약, 오염물질 지시약 또는 온도 지시약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지시약인, 복합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 드라이버 분자가 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA) 또는 리보핵산(RNA)인, 복합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 드라이버 분자가 20개 초과의 뉴클레오타이드를 포함하는, 복합체.
  18. 제16항에 있어서, 상기 드라이버 분자가 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 상기 링커 분자에 결합하는, 복합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자가 제2 부착 부위를 더 포함하며, 상기 제2 부착 부위가 제1 페이로드 분자에 결합되는, 복합체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제1 페이로드 분자가 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 상기 표적 분자에 결합되는, 복합체.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 드라이버 분자가 제2 부착 부위를 더 포함하며, 상기 제2 부착 부위가 제2 페이로드 분자에 결합되는, 복합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제2 페이로드 분자가 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 상기 드라이버 분자에 결합되는, 복합체.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 페이로드 분자가 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA), 리보핵산(RNA), 나노입자, 펩타이드 핵산, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 덴드리머 또는 이들의 임의의 조합인, 복합체.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자가 복수의 페이로드 분자에 결합되는, 복합체.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 드라이버 분자가 복수의 페이로드 분자에 결합되는, 복합체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자의 제1 부착 부위가 아미노산, 데옥시리보스 핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함하는, 복합체.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 드라이버 분자의 제1 부착 부위가 아미노산, 데옥시리보스 핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함하는, 복합체.
  28. 하기 단계들을 포함하는, 표적 분자의 검출 방법:
    a. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 적어도 하나의 나노포어를 포함하는 나노포어 디바이스에 로딩하는 단계;
    b. 상기 적어도 하나의 나노포어에 걸쳐 전압을 인가하는 단계; 및
    c. 상기 시료 중 복합체의 존재 또는 부재와 연관된 포어를 통과하는 전기 신호를 측정하는 단계.
  29. 제28항에 있어서, 상기 시료가 약제학적 조성물을 포함하는, 표적 분자의 검출 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 시료가 환자로부터의 혈액, 소변, 타액 또는 조직 시료를 포함하는, 표적 분자의 검출 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 시료가 물, 토양, 공기, 슬러지, 석유, 또는 화학적 또는 생물학적 제품을 포함하는, 표적 분자의 검출 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체가 하나 이상의 페이로드 분자에 결합되며, 상기 전기 신호가 상기 하나 이상의 페이로드 분자의 결합과 더 연관되는, 표적 분자의 검출 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기 신호에 기반하여 상기 시료 중 상기 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함하는, 표적 분자의 검출 방법.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기 신호가 상기 시료 중 상기 표적 분자의 존재 또는 부재와 더 연관되는, 표적 분자의 검출 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 전기 신호에 기반하여 상기 시료 중 상기 표적 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함하는, 표적 분자의 검출 방법.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료 중 상기 복합체 또는 상기 표적 분자의 농도를 결정하는 단계를 더 포함하는, 표적 분자의 검출 방법.
  37. 나노포어 검출을 위해 설계된 변형된 표적 분자로서,
    드라이버 분자 또는 링커 분자를 위한 제1 부착 부위를 포함하되, 상기 부착 부위가 표적 분자의 제1 변형에 의해 생성되는, 변형된 표적 분자.
  38. 제37항에 있어서, 상기 제1 변형이 바이오티닐화, 아세틸화, 메틸화, 수몰레이션(summolation), 글리코실화, 인산화 또는 산화를 포함하는, 변형된 표적 분자.
  39. 제37항에 있어서, 상기 제1 변형이 화학적 또는 생물학적 합성을 포함하는, 변형된 표적 분자.
  40. 제37항에 있어서, 상기 제1 변형이 상기 표적의 유전자 조작(genetic engineering)을 포함하는, 변형된 표적 분자.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 부착 부위가 아미노산, 데옥시리보스 핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함하는, 변형된 표적 분자.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 부착 부위가 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 상기 드라이버 분자에 결합할 수 있는, 변형된 표적 분자.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 부착 부위가 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 상기 링커 분자에 결합할 수 있는, 변형된 표적 분자.
  44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자가 생물학적 치료제를 포함하는, 변형된 표적 분자.
  45. 제44항에 있어서, 상기 생물학적 치료제가 단클론성 항체, 단백질, 프로테아제, 펩타이드, 당, 핵산 또는 이들의 임의의 조합인, 변형된 표적 분자.
  46. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자가 소분자를 포함하는, 변형된 표적 분자.
  47. 제46항에 있어서, 상기 소분자가 소분자 치료제 또는 소분자 진단 약물인, 변형된 표적 분자.
  48. 제47항에 있어서, 상기 소분자가 효소 억제제 또는 활성화제, 수용체 길항제 또는 작용제, 및 세포 과정 또는 경로의 소분자 조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자 치료제인, 변형된 표적 분자.
  49. 제48항에 있어서, 상기 소분자 치료 약물이 리시노프릴인, 변형된 표적 분자.
  50. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자가 비료, 건설 또는 건축 재료, 및 식이 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학적 또는 생물학적 제품의 성분인, 변형된 표적 분자.
  51. 제50항에 있어서, 상기 성분이 나이트로게나제인, 변형된 표적 분자.
  52. 제50항에 있어서, 상기 성분이 보론산인, 변형된 표적 분자.
  53. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자가 pH 지시약, 독소 지시약, 화학적 지시약, 오염물질 지시약 또는 온도 지시약으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 표적 분자.
  54. 제37항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 표적 분자가 상기 표적 분자의 적어도 하나의 기능을 유지하는, 변형된 표적 분자.
  55. 제54항에 있어서, 상기 적어도 하나의 기능이 치료적, 진단적, 생물학적, 화학적 또는 영양적 활성인, 변형된 표적 분자.
  56. 제37항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 드라이버 분자가 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA) 또는 리보핵산(RNA)인, 변형된 표적 분자.
  57. 제56항에 있어서, 상기 드라이버 분자가 20개 초과의 뉴클레오타이드를 포함하는, 복합체.
  58. 제36항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드 분자로의 결합을 위한 제2 부착 부위를 더 포함하는, 변형된 표적 분자.
  59. 제58항에 있어서, 상기 제2 부착 부위가 상기 표적 분자 또는 상기 변형된 표적 분자의 제2 변형에 의해 생성되는, 변형된 표적 분자.
  60. 제59항에 있어서, 상기 제2 변형이 바이오티닐화, 아세틸화, 메틸화, 수몰레이션, 글리코실화, 인산화 또는 산화를 포함하는, 변형된 표적 분자.
  61. 제59항에 있어서, 상기 제2 변형이 화학적 또는 생물학적 합성을 포함하는, 변형된 표적 분자.
  62. 제59항에 있어서, 상기 제2 변형이 상기 표적의 유전자 조작을 포함하는, 변형된 표적 분자.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 부착 부위가 아미노산, 데옥시리보스 핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 상의 반응성 기, 아민기, 티올, 알데하이드, 케톤, 아지드, 알카인, 황, 인 또는 기타 반응성 원자, 케톤, 카복실산, 에터, 아마이드, 알킬 할라이드, 에스터, 알카인, 하이드록실 또는 알코올을 포함하는, 변형된 표적 분자.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 부착 부위가 공유 결합, 중간 링커, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합, 소수성 상호작용, 파이-스태킹 상호작용, 이온 결합 또는 또 다른 비-공유적 정전기 상호작용을 통해 상기 페이로드 분자에 결합할 수 있는, 변형된 표적 분자.
  65. 하기 단계들을 포함하는, 변형된 표적 분자의 검출 방법:
    a. 제37항 내지 제64항 중 어느 한 항의 변형된 표적 분자를 포함하는 것으로 의심되는 시료를 수득하는 단계;
    b. 상기 드라이버 분자를 상기 시료에 첨가하여, 반응 산물을 생성하는 단계;
    c. 상기 반응 산물을 적어도 하나의 나노포어를 포함하는 나노포어 디바이스에 적용하는 단계;
    d. 상기 적어도 하나의 나노포어에 걸쳐 전압을 인가하는 단계; 및
    e. 상기 시료 중 변형된 표적 분자의 존재 또는 부재와 연관되는 포어를 통과하는 전기 신호를 측정하는 단계.
  66. 제65항에 있어서, 상기 시료가 약제학적 조성물을 포함하는, 변형된 표적 분자의 검출 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 시료가 환자로부터의 혈액, 소변, 타액 또는 조직 시료를 포함하는, 변형된 표적 분자의 검출 방법.
  68. 제65항에 있어서, 상기 시료가 물, 토양, 공기, 슬러지, 석유, 또는 화학적 또는 생물학적 제품을 포함하는, 변형된 표적 분자의 검출 방법.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 표적 분자가 하나 이상의 페이로드 분자에 결합되며, 상기 전기 신호가 상기 하나 이상의 페이로드 분자의 결합과 더 연관관되는, 변형된 표적 분자의 검출 방법.
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기 신호에 기반하여 상기 시료 중 상기 변형된 표적 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함하는, 변형된 표적 분자의 검출 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 시료 중 상기 변형된 표적 분자의 농도를 결정하는 단계를 더 포함하는, 변형된 표적 분자의 검출 방법.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202007911D0 (en) * 2020-05-27 2020-07-08 Imperial College Innovations Ltd Analyte detection method
CN115112729B (zh) * 2022-07-04 2024-05-24 南京师范大学 基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070054276A1 (en) * 2004-08-12 2007-03-08 Sampson Jeffrey R Polynucleotide analysis and methods of using nanopores
US20130071837A1 (en) * 2004-10-06 2013-03-21 Stephen N. Winters-Hilt Method and System for Characterizing or Identifying Molecules and Molecular Mixtures
WO2010082860A1 (en) * 2009-01-19 2010-07-22 Instituto De Biologia Experimental E Tecnologia (Ibet) Method and device for nanopore based single-molecule protein/ protein interaction detection
US20100243449A1 (en) * 2009-03-27 2010-09-30 Oliver John S Devices and methods for analyzing biomolecules and probes bound thereto
US20140335513A9 (en) * 2009-09-30 2014-11-13 Quantapore, Inc. Hybrid nanopore device with optical detection and methods of using same
US8557529B2 (en) * 2010-04-09 2013-10-15 International Business Machines Corporation Nanopore capture system
GB2500360B (en) * 2010-12-22 2019-10-23 Genia Tech Inc Nanopore-based single DNA molecule characterization, identification and isolation using speed bumps
WO2014071070A1 (en) * 2012-11-01 2014-05-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for selection of nucleic acids
ES2704902T3 (es) * 2013-05-06 2019-03-20 Two Pore Guys Inc Un método de detección de objetivos biológicos usando un nanoporo y un agente de unión a proteínas de fusión
EP3014264A4 (en) * 2013-06-25 2016-11-16 Two Pore Guys Inc QUANTIFICATION OF MULTIPLEXED BIOMARKERS BY NANOPORENT ANALYSIS OF BIOMARKER POLYMER COMPLEXES
WO2015176034A1 (en) * 2014-05-15 2015-11-19 Two Pore Guys, Inc. Scaffold data storage and target detection in a sample using a nanopore
MX2017009766A (es) * 2015-02-02 2017-12-11 Two Pore Guys Inc Detección de nanoporo de polinucleótidos blanco de fondo de muestra.
US20180023114A1 (en) * 2015-02-02 2018-01-25 Two Pore Guys, Inc. Labile Linkers for Biomarker Detection
MX2017011489A (es) * 2015-03-11 2018-01-23 Two Pore Guys Inc Detección de moléculas pequeñas mediante nanoporos a través de ensayos de competición.

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