CN108474760A - 用于追踪和检测的靶修饰 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经修饰以促进在纳米孔装置中检测的靶分子。本发明进一步涉及使用纳米孔装置检测这种经修饰的靶分子的方法。它还公开了使用这种经修饰的靶分子用于追踪和验证药物、化学或生物产品并测量包含所述经修饰的靶分子的样品的各种条件的方法。

Description

用于追踪和检测的靶修饰
1.相关申请案
本申请要求于2015年11月23日提交的美国临时申请No.62/259,012的权益，该申请通过引用整体并入。
2.发明背景
纳米级和微米级分子(如生物治疗剂、小分子药物、化学或生物产品的成分，或化学或生物指示剂)的检测具有重要价值。
例如，这样的检测允许从其生产点通过其分销商到消费者追踪和验证药物、化学或生物产品。这种追踪和验证非常困难并且耗时。虽然确实有方法可以帮助追踪这些产品并在给定时间确定特定产品的成分，但标准方法是将样品送到实验室，如果可行的话，这通常是一个耗时的过程。
纳米级和微米级分子的检测还可以测量样品的各种物理或生理条件。例如，已知许多纳米级和微米级分子会响应各种条件(如pH、毒性组分、化学组分、温度等)改变其构象、结构或稳定性。然而，检测这些分子的物理状态并获得相关信息是困难并且耗时的。
近年来，使用纳米孔装置检测纳米级和微米级分子成为可能。纳米孔检测是一种快速、便携、廉价并且精确的检测和分析纳米级和微米级分子的手段。然而，由于纳米孔检测需要靶分子具有特定的物理性质(例如，尺寸、电荷等)以使得分子被捕获并穿过纳米孔并且可被纳米孔传感器检测到，所以纳米孔检测的应用限于少量靶分子。因此，需要将纳米孔技术应用于各种靶分子而非固有地具有所述性质的靶分子的方式。
3.发明概要
本文公开的各个方面可以实现一个或多个上述需求。这里描述的系统和方法每个都有几个方面，其中没有一个单独负责其期望的属性。在不限制由随附的权利要求表达的本公开的范围的情况下，现在将简要讨论更突出的特征。在考虑了这个讨论之后，并且特别是在阅读题为“详细描述”的部分之后，将会理解这里描述的样品特征如何提供改进的系统和方法。
在一些实施方案中，本公开内容提供经修饰以促进在纳米孔装置中检测的靶分子。在一些实施方案中，靶分子包含第一附着位点，其中所述附着位点与驱动分子结合。在一些实施方案中，靶分子还包含第二附着位点，其中所述第二附着位点与第一有效负载分子结合。
在一些实施方案中，本发明提供了设计用于纳米孔检测的复合物，其包含：包含第一附着位点的靶分子；和包含第一附着位点的驱动分子，其中驱动分子的第一附着位点与靶分子的第一附着位点形成共价键。
在一些实施方案中，本发明提供了设计用于纳米孔检测的复合物，其包含：包含第一附着位点的靶分子；和包含第一附着位点和第二附着位点的接头分子，其中接头分子的第一附着位点与靶分子的第一附着位点形成共价键，并且接头分子的第二附着位点是驱动分子的结合位点。在一些实施方案中，复合物还包含驱动分子，其中驱动分子经由共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与接头分子的第二附着位点结合。
在一些实施方案中，接头分子包括肽、蛋白质、碳水化合物、单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、核糖核酸(RNA)、纳米颗粒、肽核酸(PNA)、聚乙二醇(PEG)、树状聚合物、合成聚合物或其任何组合。在一些实施方案中，接头分子包括肽、缬氨酸-瓜氨酸接头、马来酰亚胺己酰基(mc)接头、[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-甲酸酯(MCC)接头、4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)接头、基于PEG的接头、腙接头、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)接头或碳酸酯接头，或任何其他同双功能或异双功能分子。
在一些实施方案中，靶分子包含生物治疗剂。在一些实施方案中，生物治疗剂是单克隆抗体、蛋白质、蛋白酶、肽、糖、核酸或其任何组合。
在一些实施方案中，靶分子包含小分子。在一些实施方案中，小分子是小分子治疗剂或小分子诊断药物。在一些实施方案中，小分子是选自由酶抑制剂或活化剂、受体拮抗剂或激动剂和细胞过程或途径的小分子调节剂组成的组的小分子治疗药物。在一些实施方案中，小分子治疗药物是赖诺普利(Lisinopril)。
在一些实施方案中，靶分子包含选自由肥料、建筑或建造材料和膳食组合物组成的组的化学或生物产品的成分。在一些实施方案中，成分是固氮酶。在一些实施方案中，成分是硼酸。
在一些实施方案中，靶分子是选自由pH指示剂、毒素指示剂、化学指示剂、污染物指示剂或温度指示剂组成的组的指示剂。
在一些实施方案中，驱动分子是单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)或核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，驱动分子包含超过20个核苷酸。
在一些实施方案中，驱动分子经由共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与接头分子结合。
在一些实施方案中，靶分子还包含第二附着位点，其中所述第二附着位点与第一有效负载分子结合。在一些实施方案中，第一有效负载分子经由共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与靶分子结合。
在一些实施方案中，驱动分子还包含第二附着位点，其中所述第二附着位点与第二有效负载分子结合。在一些实施方案中，第二有效负载分子经由共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与驱动分子结合。
在一些实施方案中，第一或第二有效负载分子是肽、蛋白质、碳水化合物、单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、核糖核酸(RNA)、纳米颗粒、肽核酸、聚乙二醇(PEG)、树状聚合物或其任何组合。
在一些实施方案中，靶分子与多个有效负载分子结合。在一些实施方案中，驱动分子与多个有效负载分子结合。
在一些实施方案中，靶分子的第一附着位点在氨基酸、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)上包含以下反应性基团：胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。在一些实施方案中，驱动分子的第一附着位点在氨基酸、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)上包含以下反应性基团：胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。
本发明还提供了检测靶分子的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)将怀疑包含有包含靶分子的复合物的样品装载在包含至少一个纳米孔的纳米孔装置中；(b)在所述至少一个纳米孔的两端施加电压；以及(c)测量通过所述孔的电信号，其与样品中复合物的存在或不存在相关。
在一些实施方案中，样品包含药物组合物。在一些实施方案中，样品包括来自患者的血液、尿液、唾液或组织样品。在一些实施方案中，样品包括水、土壤、空气、污泥、石油或化学或生物产品。
在一些实施方案中，复合物与一个或多个有效负载分子结合，并且其中电信号进一步与所述一个或多个有效负载分子的结合相关。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于电信号确定样品中复合物的存在或不存在的步骤。在一些实施方案中，电信号进一步与样品中靶分子的存在或不存在相关。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于电信号确定样品中靶分子的存在或不存在的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括确定样品中复合物或靶分子浓度的步骤。
本发明还涉及设计用于纳米孔检测的经修饰的靶分子。在一些实施方案中，经修饰的靶分子包含驱动分子或接头分子的第一附着位点，其中附着位点通过靶分子的第一修饰产生。
在一些实施方案中，第一修饰包括生物素化、乙酰化、甲基化、类泛素化、糖基化、磷酸化或氧化。在一些实施方案中，第一修饰包括化学或生物合成。在一些实施方案中，第一修饰包括靶的基因工程。
在一些实施方案中，第一附着位点在氨基酸、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)上包含以下反应性基团：胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。在一些实施方案中，第一附着位点可以经由共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与驱动分子或接头分子结合。
在一些实施方案中，靶分子包含生物治疗剂。在一些实施方案中，生物治疗剂是单克隆抗体、蛋白质、蛋白酶、肽、糖、核酸或其任何组合。
在一些实施方案中，靶分子包含小分子。在一些实施方案中，小分子是小分子治疗剂或小分子诊断药物。在一些实施方案中，小分子是选自由酶抑制剂或活化剂、受体拮抗剂或激动剂和细胞过程或途径的小分子调节剂组成的组的小分子治疗药物。在一些实施方案中，小分子治疗药物是赖诺普利。
在一些实施方案中，靶分子包含选自由肥料、建筑或建造材料和膳食组合物组成的组的化学或生物产品的成分。在一些实施方案中，成分是固氮酶。在一些实施方案中，成分是硼酸。
在一些实施方案中，靶分子是选自由pH指示剂、毒素指示剂、化学指示剂、污染物指示剂或温度指示剂组成的组的指示剂。
在一些实施方案中，经修饰的靶分子维持靶分子的至少一个功能。在一些实施方案中，所述至少一个功能是治疗性、诊断性、生物学、化学或营养学活性。
在一些实施方案中，驱动分子是单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)或核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，驱动分子包含超过20个核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的靶分子还包含用于结合有效负载分子的第二附着位点。在一些实施方案中，第二附着位点通过靶分子或经修饰的靶分子的第二修饰产生。在一些实施方案中，第二修饰包括生物素化、乙酰化、甲基化、类泛素化、糖基化、磷酸化或氧化。在一些实施方案中，第二修饰包括化学或生物合成。在一些实施方案中，第二修饰包括靶的基因工程。
在一些实施方案中，第二附着位点在氨基酸、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)上包含以下反应性基团：胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。在一些实施方案中，第二附着位点可以经由共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与有效负载分子结合。
本发明进一步涉及检测经修饰的靶分子的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)获得怀疑包含经修饰的靶分子的样品；(b)将驱动分子加入样品以产生反应产物；(c)将反应产物施加到包含至少一个纳米孔的纳米孔装置；(d)在所述至少一个纳米孔两端施加电压；和(e)测量通过所述孔的电信号，其与样品中经修饰的靶分子的存在或不存在相关。
在一些实施方案中，样品包含药物组合物。在一些实施方案中，样品包括来自患者的血液、尿液、唾液或组织样品。在一些实施方案中，样品包括水、土壤、空气、污泥、石油或化学或生物产品。
在一些实施方案中，经修饰的靶分子与一个或多个有效负载分子结合，并且其中电信号进一步与所述一个或多个有效负载分子的结合相关。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于电信号确定样品中经修饰的靶分子的存在或不存在的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括确定样品中经修饰的靶分子的浓度的步骤。
本文还提供分析数据以检测a中存在或不存在靶分子的方法，其包括从纳米孔装置获得电信号，所述纳米孔装置包含怀疑含有本文所述经修饰的靶分子的样品；以及分析电信号以检测存在或不存在与通过纳米孔的靶分子的移位相关的标记，其中存在标记指示所述样品中存在靶分子，并且其中不存在标记指示所述样品中不存在靶分子。
4.图式简单说明
作为本公开的实施方案提供的是仅通过例示而不是限制来说明特征的附图。
图1呈现了经由接头分子(104)与驱动分子(102)结合的靶分子(101)以促进复合物移位穿过纳米孔(106)。该图还呈现了后面的组分子(105)。
图2示出了未附着于驱动分子(102)的靶分子(101)。纳米孔装置(106)感测与驱动分子是否与靶分子结合相关的电信号。
图3A-C示出了移位穿过纳米孔的样品所特有的电信号(x轴为时间而y轴为电流)。样品包括通过接头分子(104)与驱动分子(102)结合的靶分子(101)(图3A)；仅驱动分子(102)(图3B)；和仅靶分子(101)(图3C)。
图4示出了经修饰的赖诺普利的化学结构，其中赖诺普利分子经由SMCC接头与驱动分子(即dsDNA)共价连接。
图5提供了用SMCC接头标记的赖诺普利的质谱数据。数据证实赖诺普利与接头分子化学连接。测得的质量625.2与预测质量625-627相符。
图6提供了绘制来自与驱动分子(即532bp dsDNA)连接的靶分子(即赖诺普利)的电信号的图。
图7是绘制从穿过纳米孔的DNA-破伤风抗体复合物(点)或没有抗体的DNA-PNA复合物(正方形)收集的电信号的图。
图8呈现了通过接头分子(104a)与驱动分子(102)结合的靶分子(101)。靶分子还通过另一接头分子(104b)与有效负载分子(103)结合。
图9A-B提供了移位穿过纳米孔的样品所特有的电信号。样品包括经由接头分子与驱动分子(102)和有效负载分子(103)结合的靶分子(101)(图9A)和经由接头分子与驱动分子(102)结合的靶分子(101)(图9B)。
图10提供了绘制从DNA-靶-有效负载复合物(点)或没有有效负载的DNA-靶复合物(正方形)收集的电信号的图。靶是肽，有效负载是抗体。
图11提供了绘制从包含驱动分子(dsDNA)和靶分子(生物素)而没有有效负载的复合物(正方形)和包含驱动分子(dsDNA)、靶(生物素)和有效负载(抗生物素抗体)(倒三角形)的复合物收集的电信号的图。
图12示出了经由接头(104a和b)与驱动分子(102)和有效负载分子(103a)结合的靶分子(101)。驱动分子进一步与另外的有效负载分子(103b，波浪盒)结合以增强纳米孔中的检测。
图13示出了图12的复合物移位穿过纳米孔。
图14A-C示出了移位穿过纳米孔的样品所特有的电信号。样品包括与有效负载分子和驱动分子结合的靶分子，其中驱动分子与另一有效负载分子结合(图14A)；与驱动分子和有效负载分子结合的靶分子(图14B)；和仅与驱动分子结合的靶分子(图14C)。
图15示出了包含两个结合位点的驱动分子(即5631bp DNA)，一个针对PNA-PEG，另一个针对PNA-肽。
图16A-B提供了绘制来自穿过纳米孔的不同复合物的电信号的图。点代表来自单独驱动分子(DNA)的信号；正方形和菱形代表来自DNA和PNA-PEG(PP)复合物的信号；倒三角形代表来自DNA和PNA-PEG(PP)与V3环(PV3B)的复合物的信号；并且星形代表来自DNA、PNA-PEG(PP)与V3环(PV3B)和HIV抗体的复合物的信号。
附图中的一些或全部是示例性的示意图；因此，它们不一定描绘所示元件的实际相对尺寸或位置。附图是出于说明一个或多个实施方案的目的而呈现，明确理解它们将不被用于限制随附权利要求书的范围或含义。
5.详细描述
a.术语解释：
在本申请通篇，本文涉及本发明装置、组合物、系统和方法的各种实施方案。所描述的各种实施方案旨在提供各种说明性实例，并且不应被解释为替代物种的描述。相反，应该注意的是，提供的各种实施例的描述可以具有重叠的范围。这里讨论的实施方案仅仅是说明性的，并不意味着限制本发明的范围。
而且，在本公开通篇，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过标识引用来引用。这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用整体并入本公开中。
如说明书和权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数提及物。例如，术语“电极”包括多个电极，包括其混合物。
如本文所用，术语“包括”旨在表示系统、装置和方法包括所列举的组件或步骤，但不排除其它。当用于定义系统、装置和方法时，“基本上由……组成”应意味着排除对组合具有任何重要意义的其它组件或步骤。“由……组成”将意味着排除其它组件或步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
所有数值标记，例如距离、尺寸、温度、时间、电压和浓度(包括范围)都是以0.1为增量变化(+)或(-)的近似值。应该理解的是，尽管并非总是明确指出，但所有的数字标记之前都有术语“约”。还应该理解，虽然并非总是明确指出，但本文描述的组件仅仅是示例性的，并且这些的等价物在本领域中是已知的。
如本文所用，术语“靶分子”是指可以被修饰以用于由纳米孔检测的所关注分子。靶分子在与驱动分子结合后可以穿过纳米孔的物理尺寸。
如本文所用，术语“接头分子”是指可以连接在靶分子与驱动分子之间；靶分子与有效负载分子之间；或者在驱动分子与有效负载分子之间的分子。接头分子在与靶分子和/或驱动分子结合后可以穿过纳米孔的物理尺寸。
如本文所用，术语“驱动分子”是指充分带电的分子，使得其可以在施加的电压下在溶液中的纳米孔中被捕获。一旦与靶分子结合，驱动分子可以驱动靶分子进入纳米孔。驱动分子可以包括单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)或核糖核酸(RNA)。
如本文所用，术语“有效负载分子”是指具有有助于在纳米孔中捕获时产生独特电信号的物理尺寸的分子。有效负载分子具有靶分子或驱动分子的结合位点。在一些实施方案中，有效负载分子可以带电以有助于通过纳米孔。
如本文所用，“包含分隔内部空间的纳米孔的装置”应指结构内具有包含开口的孔的装置，所述结构将内部空间分隔成多于一个体积或腔室。
如本文所用，术语“电信号”涵盖取决于电子电路的配置随时间收集的关于电流、阻抗/电阻或电压的一系列数据。常规地，电流以“电压钳”配置测量；电压采用“电流钳”配置测量，电阻测量可以使用欧姆定律V＝IR在任一配置中导出。阻抗也可以通过从纳米孔装置收集的电流或电压数据测量而产生。本文引用的电信号的类型包括电流特征和电流阻抗特征，但各种其它电子特征也可以用于检测纳米孔中的粒子。
如本文所用，术语“纳米孔”是指具有足够尺寸以允许特定尺寸的分子通过的开口(孔或通道)。施加电压以驱动带电分子通过纳米孔。
如本文所用，术语“传感器”是指收集来自纳米孔装置的信号的装置。在许多实施例中，传感器包括放置在孔的两侧的一对电极，以在分子或其它实体，特别是靶分子穿过孔移动时测量通过孔的离子电流。除了电极之外，另外的传感器(例如光学传感器)可以用于检测纳米孔装置中的光信号。其它传感器可以用于检测如电流阻断、电子隧道电流、电荷诱导场效应、纳米孔传播时间、光信号、光散射和等离子体共振等性质。
如本文所用，术语“电流测量”是指在施加的电压下随着时间的推移通过纳米孔的电流流动的一系列测量。电流表示为x,y值，其中x表示时间点，y表示通道中阻塞的电流量。电流测量是通过欧姆定律与电流阻抗/电阻和电压(其它电信号)相关的电信号。
如本文所用，术语“开放通道”是指在电流不偏离由分析软件定义的值的阈值的噪声范围内的通过纳米孔通道的电流的基线水平。
如本文所用，术语“事件”是指当电流测量值的y值从开放通道值偏离规定的阈值时开始并在y值返回到开放通道值的阈值范围内时结束的一组电流阻抗测量。
如本文所用，术语“电流阻抗特征”是指当y的值超过由软件定义的给定阈值时开始第一次这样的测量并且当y的值返回超过该相同阈值时结束的电流测量的集合。此阈值可以用于识别事件内的多个特征(即，由于靶分子可能具有一个或多个分子附着于其上，所以事件可能含有一个或多个独特的特征)。
如本文所用，术语“特征曲线”是指适用于单个特征中的所有x,y点的数学公式的结果。这个公式可以像所有点的简单平均值(在y上产生一条线)一样简单，或者作为每N个点的移动平均值(产生简单的曲线)或另一个数学公式。步长拟合算法是适用于每个特征的公式的另一个实例。可以使用步长或其性质来推断关于特征曲线或曲线的性质。(参见例如C Raillon,P Granjon,M Graf,L J Steinbock和A Radenovic.Fast and automaticprocessing of multi-level events in nanopore translocationexperiments.Nanoscale,4(16):4916,2012，其全部内容通过引用并入)。由于纳米孔本质上是非确定性的，所以每次相同类型的分子通过时，电信号可以显著变化。因此，分析测量结果的软件可以采用足够的灵活性，以确保每次读取相同分子时都能获得一致的特征曲线。
如本文所用，术语“光学传感器”是指捕获可位于纳米孔处或附近的固定视场内的光的仪器。
如本文所用，术语“光学事件”是指由传感器从单个靶分子捕获的一组光学测量。光学测量结果可以与电流阻抗测量结果相关以确定靶分子何时进入纳米孔。
如本文所用，术语“光学测量”是指由光学传感器在固定时间段内获得的值。该测量可以包括但不限于一个或多个单独的值，例如颜色、发光和强度。
如本文所用，术语“符号”是指事件内的一个或多个光学特征的组装，以便包括单个抽象。例如，“红色，绿色，红色，绿色”可以等同于字母“A”。
b.靶分子：
本发明提供了用于将有效负载分子和/或驱动分子添加至靶分子(如药物化合物)的装置和方法。在某些实施方案中，靶分子包含驱动分子可以附着的附着位点。在某些实施方案中，靶分子包含有效负载分子可以附着的附着位点。在一些实施方案中，附着位点是靶分子的化学组成的一部分，包括但不限于氨基酸、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、核糖核酸(RNA)上的反应性基团、胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。
在一些实施方案中，靶分子是生物治疗剂，包括单克隆抗体、蛋白质、蛋白酶、肽、糖、核酸或其任何组合。
在一些实施方案中，靶分子包括小分子。在一些实施方案中，小分子是小分子治疗剂，包括但不限于酶抑制剂或活化剂，受体拮抗剂或激动剂或细胞过程或途径的其它小分子调节剂。在一些实施方案中，小分子是赖诺普利。在一些实施方案中，小分子是小分子诊断药物。
在一些实施方案中，靶分子是合成分子。在一些实施方案中，靶分子包括选自由肥料、建筑或建造材料和膳食组合物组成的组的化学或生物产品的成分。在一些实施方案中，所述成分是具有特定功能的化学或生物产品的必需成分。在一些实施方案中，所述成分是酶。在一些实施方案中，所述酶是固氮酶。在一些实施方案中，所述成分是硼酸。
在一些实施方案中，靶分子是响应于身体状况而改变其构象、结构或稳定性的指示剂。在一些实施方案中，所述指示剂是pH指示剂、毒素指示剂、化学指示剂、污染物指示剂或温度指示剂。
c.接头分子：
在一些实施方案中，靶分子和驱动分子通过附着位点经由连接分子共价偶联。
在一些实施方案中，接头分子包括肽、蛋白质、碳水化合物、单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、核糖核酸(RNA)、纳米颗粒、肽核酸(PNA)、聚乙二醇(PEG)、树状聚合物、合成聚合物或其任何组合。
在一些实施方案中，接头分子是肽、缬氨酸-瓜氨酸接头、马来酰亚胺己酰基(mc)接头、[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-甲酸酯(MCC)接头、4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)接头、基于PEG的接头、腙接头、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)接头或碳酸酯接头，或任何其他同双功能或异双功能分子。
在一些实施方案中，接头分子是可促进纳米孔中的靶分子捕获的带电分子。
d.有效负载分子：
在一些实施方案中，靶分子被一个或多个有效负载分子修饰，所述有效负载分子在其移位进入或穿过纳米孔时提供独特的电信号，从而能够区分存在于样品中的其它靶/有效负载分子或背景分子。有效负载分子被配置为允许检测纳米孔中的靶分子。这些有效负载分子可以在通过纳米孔时通过它们的电流阻抗来识别和彼此区分。该电流阻抗受到有效负载分子的宽度、长度、尺寸和/或电荷的影响。有效负载分子可以根据尺寸、形状或电荷而彼此不同。因此，每个有效负载分子可以在通过纳米孔时提供独特的电信号，从而允许鉴定与纳米孔中的有效负载分子结合的靶分子。
由于有效负载分子可以通过如宽度、长度、尺寸和/或电荷的参数进行修饰，因此本文所述的组合物和方法可以用不同尺寸的孔进行，包括较大的孔，这些孔比较小的纳米孔装置制造更容易且更便宜。与未标记化合物相比，更大尺寸的可检测标记导致流过孔的电流或电流阻抗变化更大。
在一些实施方案中，有效负载分子是肽、蛋白质、碳水化合物、单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、核糖核酸(RNA)、纳米颗粒、肽核酸、聚乙二醇(PEG)、树状聚合物或其任何组合。在一些实施方案中，有效负载分子经由共价键、中间接头或非共价静电相互作用连接至靶分子。
在一些实施方案中，靶分子、驱动分子或接头分子具有与有效负载分子的结合位点。在一些实施方案中，靶分子、驱动分子或接头分子含有能够连接另外的信号区分性有效负载分子的另外的附着位点，从而允许进一步区分或增强样品中靶分子的鉴定。在一些实施方案中，靶分子、驱动分子和有效负载分子中的一个或多个进一步用另外的有效负载分子修饰。在一些实施方案中，另外的有效负载分子通过共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水键、π堆叠、离子键或其它非共价静电相互作用直接连接至附着位点。
e.驱动分子：
驱动分子被配置为促进捕获纳米孔中的靶分子。在一些实施方案中，可以通过电压将驱动分子捕获到纳米孔中。在一些实施方案中，靶分子和驱动分子通过附着位点由共价键直接连接在一起。在一些实施方案中，靶分子和驱动分子不通过共价键连接，而是通过非共价键连接，包括静电相互作用、氢键、盐桥、范德华相互作用、阳离子-π相互作用或疏水性相互作用。在一些实施方案中，驱动分子包括单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、核糖核酸(RNA)、肽、蛋白质、碳水化合物或其组合。在一些实施方案中，驱动分子是一种或多种合成分子，例如树状聚合物、纳米/微米颗粒、聚乙二醇(PEG)、肽核酸(PNA)或其它合成聚合物。在一些实施方案中，靶分子处于相同的制剂中但与驱动分子的附着位点不相关。在一些实施方案中，当驱动分子移位进入或通过纳米孔时，驱动分子提供电流阻抗，由此允许推断靶分子的存在或不存在。
驱动分子被配置为在与目标分子结合时提供适当的扩散系数和电迁移率。在一些实施方案中，通过本领域已知的技术来测量驱动分子的电迁移率。在一些实施方案中，通过凝胶电泳测定电迁移率，其中天然电荷在特定的静态条件下测量，该静态条件可以包括特定的离子强度缓冲液、pH和驱动力(例如TEA缓冲液pH 7.5和50V驱动力)。在一些实施方案中，通过等电聚焦(IEF)测定电迁移率，等电聚焦基于其在可变“分区”缓冲系统中的电荷来测量分析物迁移率。在这种方法下，不同的带电变异体在进入与分析物等电点相匹配的pH区域时停止迁移。通过分析不同迁移的“凝胶上的条带”，可以推断分子的不同带电状态。在一些实施方案中，离子交换色谱(IEX)基于分析物电荷来测量离开固体支持物的迁移率。在这里，靶分子与柱结合并使用pH梯度洗脱。当pH与分子的等电点匹配时，分析物不再与柱结合，并被洗脱出来且随后检测。在一些实施方案中，基于由质荷比决定的MALDI-TOF(飞行时间)来确定电迁移率。电荷越多，质量越小，它就越快地前进到检测器。相反，更少的电荷和更大的质量导致更大的“飞行时间”。分子是使用其独特的“飞行时间”并与标准进行比较来鉴定的。
驱动分子被配置为具有足够小的物理尺寸以穿过纳米孔。在一些实施方案中，驱动分子包含具有至少20bp的聚核苷酸。在一些实施方案中，驱动分子被配置成当其结合到靶分子、有效负载分子或多个有效负载分子时具有足够小的物理尺寸以通过纳米孔。
f.靶分子修饰：
本公开提供了用于靶分子修饰和检测的方法和系统。在某些实施方案中，本文提供了用于修饰靶分子以检测和/或定量样品中靶分子存在或不存在的方法。在某些实施方案中，可以在纳米孔装置中检测经修饰的靶分子。
在一些实施方案中，靶分子经修饰以包含用于靶分子的附着位点。在一些实施方案中，靶分子经进一步修饰以包含用于有效负载分子的附着位点。在一些实施方案中，附着位点通过靶分子的生物学或化学修饰而产生。在一些实施方案中，化学修饰是生物素化、乙酰化、甲基化、类泛素化、糖基化、磷酸化或氧化。在一些实施方案中，通过分子、生物或生物化学方法引入附着位点。在一些实施方案中，通过酶促反应引入附着位点。在一些实施方案中，通过基因工程引入附着位点。
在一些实施方案中，附着位点在氨基酸、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)上包含以下反应性基团：胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。在一些实施方案中，附着位点可以通过共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水键、π堆叠、离子键或其它非共价静电相互作用与驱动分子或有效负载分子结合。
在一些实施方案中，包含附着位点的靶分子是生物学或化学合成的。在一些实施方案中，合成涉及生物素化、乙酰化、甲基化、类泛素化、糖基化、磷酸化、氧化或其它酶促反应。在一些实施方案中，附着位点在氨基酸、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)上包含以下反应性基团：胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。在一些实施方案中，附着位点可以通过共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水键、π堆叠、离子键或其它非共价静电相互作用与驱动分子或有效负载分子结合。
在一些实施方案中，经修饰的靶分子维持靶分子的至少一种功能。在一些实施方案中，靶分子的修饰不会改变靶分子作为生物治疗剂、小分子药物和化学或生物产品的成分的活性。
g.靶标-驱动子复合物：
在一些实施方案中，靶分子和驱动分子共价偶联。在一些实施方案中，通过在靶分子与驱动分子之间形成共价键的化学反应产生包含靶分子和驱动分子的复合物。在一些实施方案中，通过化学、生物学、分子和遗传反应合成包含靶分子和驱动分子的复合物。
在一些实施方案中，包含靶分子和驱动分子的复合物用作用于治疗或诊断目的的药物组合物。在一些实施方案中，包含靶分子和驱动分子的复合物用作指示剂，如pH指示剂、毒素指示剂、化学指示剂、污染物指示剂或温度指示剂。在一些实施方案中，包含靶分子和驱动分子的复合物用作如肥料、建筑或建造材料和膳食组合物的化学或生物产品的成分。
h.靶标-接头复合物：
在一些实施方案中，靶分子和驱动分子共价偶联至接头分子。在一些实施方案中，通过在靶分子与接头分子之间形成共价键的化学反应产生包含靶分子和接头分子的复合物。在一些实施方案中，通过化学、生物学、分子和遗传反应合成包含靶分子和接头分子的复合物。
在一些实施方案中，接头包括肽、蛋白质、碳水化合物、单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、核糖核酸(RNA)、纳米颗粒、肽核酸(PNA)、聚乙二醇(PEG)、树状聚合物、合成聚合物或其任何组合。在一些实施方案中，接头包括肽、缬氨酸-瓜氨酸接头、马来酰亚胺己酰基(mc)接头、[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-甲酸酯(MCC)接头、4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)接头、基于PEG的接头、腙接头、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)接头或碳酸酯接头，或任何其它同双功能或异双功能分子中的至少一种。
在一些实施方案中，包含靶分子和接头分子的复合物用作用于治疗或诊断目的的药物组合物。在一些实施方案中，包含靶分子和驱动分子的复合物用作指示剂，如pH指示剂、毒素指示剂、化学指示剂、污染物指示剂或温度指示剂。在一些实施方案中，包含靶分子和驱动分子的复合物用作如肥料、建筑或建造材料和膳食组合物的化学或生物产品的成分。
i.检测方法：
在一些实施方案中，本技术提供了用于鉴定样品中的靶分子的方法。该方法需要(a)在允许靶分子(例如，与可检测的有效负载分子结合的药物)通过孔从一个体积移位到另一个体积的条件下，将怀疑包含靶分子的样品加载到具有分离并连接两个体积的孔的装置中，以及(b)收集与靶分子通过纳米孔的通道相关的电信号。使用电信号，可以收集和分析与通过纳米孔移位的可检测分子相关的事件，从而鉴定与附着于有效负载分子的靶分子相关的电信号。
在一些实施方案中，该方法需要(a)获得怀疑包含经修饰的靶分子的样品，(b)将驱动分子添加至样品以产生反应产物，(c)将反应产物施加至纳米孔装置，(d)跨越每个孔施加电压，和(e)测量通过孔的电信号，其与样品中经修饰的靶分子的存在或不存在相关。
在一些实施方案中，该方法还需要基于电信号确定样品中靶分子或包含靶分子的复合物的存在或不存在。在一些实施方案中，该方法还需要基于电信号确定样品中靶分子或包含靶分子的复合物的浓度。
“电信号”可以包括一次从移位穿过一个或者两个或更多个附着于靶分子的有效负载分子的孔产生电流特征的电流测量结果。
在一些实施方案中，可以使用多个独特的有效负载分子来检测多个靶分子，其中与独特的有效负载分子结合的每个靶分子产生用于鉴定每个不同靶分子的独特电信号。例如，有效负载分子A可以提供一个独特电信号，而有效负载分子B可以形成不同的独特电信号。
在上述这些情况中的每一个中，纳米孔装置可以被适当地配置以鉴定与其各自的靶分子结合的每个独特的有效负载分子产生的每个独特的电信号。
在一些实施方案中，样品是药理学组合物。在一些实施方案中，样品是混合样品，例如从患者获得的血液或尿液样品。在一些实施方案中，样品是来自患者的血液、尿液、唾液或组织样品。在一些实施方案中，样品从已经施用靶标的受试者获得。在一些实施方案中，样品获自人类患者。
在一些实施方案中，样品是水、土壤、空气、污泥、石油或化学或生物产品。用于分析物检测的方法和组合物在PCT公开WO/2014/182634中公开，其通过引用整体并入。
在纳米孔实验中，会产生一组电流阻抗事件。数学建模用于在一定置信度内从背景中挑选出我们的靶分子。然而，混合样本，例如未经处理的血液，具有大量的背景分子，其产生与靶标重叠的电信号。这些分子可能引入高误差率，影响纳米孔检测靶分子的可靠性。如本文所公开，用于提高可靠性的一种机制是将一个或有效负载分子连接至靶分子以提供独特的电信号，所述电信号可用于鉴定已经移位通过纳米孔的与有效负载分子结合的靶分子的存在和/或身份。因此，提供了改进的方法和组合物，其用于使用纳米孔检测散装样品中与一个或多个有效负载分子连接的经修饰的靶分子。
可以使用包括纳米孔(或简称为孔)和传感器的装置来检测形成的包含靶分子和一个或多个驱动分子和/或有效负载分子的复合物。孔是分隔两个体积的结构中的纳米级或微米级开口。传感器配置为鉴定穿过孔的物体。例如，在一些实施方案中，传感器通过检测可测量参数的变化来鉴定穿过孔的物体，其中所述变化表示物体穿过孔。该装置在通篇被称为“纳米孔装置”。在一些实施方案中，纳米孔装置包括连接到电源的电极，用于穿过孔将靶分子从一个体积移动到另一个体积。由于靶分子可以带电或结合到包含电荷的驱动分子。通过跨越孔产生电势或电压，促进和控制靶分子或结合到驱动分子的靶分子的运动。在某些实施方案中，传感器包括一对电极，其被配置为传感器以通过读取电流来检测物体通过纳米孔，并且提供跨越孔的电压。在某些实施方案中，使用电压钳或膜片钳来同时跨越孔提供电压并测量通过孔的电流。
与有效负载分子结合的靶分子的检测可以通过各种方法进行。在一个方面，在包含预定盐(例如，KCl)浓度的溶液中，在施加的电压下，靶分子移位通过孔将产生独特的可检测电信号。电信号可以通过电流移位的量(高度)和/或电流移位的持续时间(宽度)或信号中区分电特征的任何其它特征来彼此区分。
在一些实施方案中，传感器包括电极，其连接到电源并且可以检测电流。因此，一个或两个电极可用作“传感器”。在该实施方案中，使用电压钳或膜片钳来同时跨越孔提供电压并测量通过孔的电流。
在一些方面，将探针添加到靶分子以辅助检测。该探针能够结合附着于靶分子的有效负载分子或驱动分子。在一个方面，探针具有负电荷或正电荷以促进纳米孔中的检测。在另一个方面，探针增加尺寸以促进纳米孔中的检测。在另一个方面，探针包括可检测标记，例如荧光团。
j.光学检测：
有效负载分子可以通过本领域已知的方法检测，作为使用电流阻抗的替代方案。在一些实施方案中，有效负载分子可以包括例如荧光染料(例如，FITC、罗丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体、德克萨斯红(Texas red))、32P、35S、3H、14C、125I、131I、电子密度试剂(例如金)、通常用于ELISA的酶(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记(例如胶体金)、磁性标记(例如DynabeadsTM)、生物素、洋地黄毒苷(dioxigenin)或可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。其它有效负载分子包括分别能够与相应的受体或寡核苷酸补体形成复合物的标记或寡核苷酸。
在一些方面，有效负载分子是荧光团。如本文所用的术语“荧光团”是指吸收特定波长(激发频率)的光并随后发射更长波长(发射频率)的光的分子。如本文所用的术语“供体荧光团”是指当紧邻淬灭剂部分时将荧光能量提供或转移至淬灭剂的荧光团。由于向淬灭剂部分提供能量，供体荧光团自身将以其在不存在紧密定位的淬灭剂部分时具有的特定发射频率下发射较少的光。
合适的荧光部分包括本领域已知的以下荧光团：4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸根合二苯乙烯-2,2'-二磺酸吖啶和衍生物：吖啶、异硫氰酸吖啶、Alexa 350、Alexa488、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 647(Molecular Probes)；5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-(3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5-二磺酸盐(萤光黄VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、Black Hole QuencherTM(BHQTM)染料(biosearchTechnologies)、 R-6G、530/550、 FL亮黄；香豆素和衍生物：香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)；7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)、花青素4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)5',5"-二溴连苯三酚磺酞(溴邻苯三酚红)、7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素二亚乙基三胺五乙酸酯、4,4'-二异硫氰酸根合二氢-二苯乙烯-2,2'-二磺酸、4,4'-二异硫氰酸根合二苯乙烯-2,2'-二磺酸5[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯偶氮基苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)、EclipseTM(Epoch Biosciences Inc.)；伊红和衍生物：伊红、异硫氰酸伊红；赤藓红和衍生物：赤藓红B、异硫氰酸赤藓红、荧光乙锭和衍生物：5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、QFITC(XRITC)、四氯荧光素(TET)、荧光胺、IR144、IR1446、异硫氰酸孔雀石绿、4-甲基伞形酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、副蔷薇苯胺、酚红、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、邻苯二甲醛、Oregon 碘化丙啶；芘和衍生物：芘、丁酸芘、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯、7、9、21、35(Molecular Probes)、活性红4(亮红3B-A)；罗丹明和衍生物：6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、若丹明(Rhod)、若丹明B、若丹明123、若丹明绿、异硫氰酸若丹明X、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(得克萨斯红)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、核黄素、玫瑰酸、铽螯合物衍生物。
可以使用其它荧光核苷酸类似物，参见例如Jameson等,278Meth.Enzymol.363-390(1997)；Zhu等,22Nucl.Acids Res.3418-3422(1994)。美国专利No.5,652,099和6,268,132也描述了核苷类似物，通过酶促或化学合成掺入核酸(例如DNA和/或RNA或寡核苷酸)中以产生荧光寡核苷酸。美国专利No.5,135,717描述了用作荧光标记的酞菁和四苯并三氮杂卟啉试剂。
k.纳米孔装置：
如所提供的，纳米孔装置包括至少一个孔，所述孔在将装置的内部空间分成两个体积的结构中形成开口；和至少一个传感器，其被配置为鉴定通过所述孔的物体(例如，通过检测指示物体的参数的变化)。用于本文所述方法的纳米孔装置也公开在PCT公开WO/2013/012881中，其通过引用整体并入。
纳米孔装置中的孔是纳米级或微米级的。在一个方面，每个孔具有允许小分子或大分子或微生物通过的尺寸。在一个方面，每个孔的直径至少约1nm。或者，每个孔的直径至少约2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm。
在一个方面，孔直径不超过约100nm。或者，孔的直径不超过约95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm、50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm或10nm。
在一些方面，每个孔的直径为至少约100nm、200nm、500nm、1000nm、2000nm、3000nm、5000nm、10000nm、20000nm或30000nm。在一个方面，孔的直径不超过约100000nm。或者，孔的直径不超过约50000nm、40000nm、30000nm、20000nm、10000nm、9000nm、8000nm、7000nm、6000nm、5000nm、4000nm、3000nm、2000nm或1000nm。
在一个方面，孔的直径在约1nm与约100nm之间、或者在约2nm与约80nm之间、或在约3nm与约70nm之间、或在约4nm与约60nm之间、或在约5nm与约50nm之间、或在约10nm与约40nm之间、或在约15nm与约30nm之间。
在一些方面，纳米孔装置中的孔具有较大的级别以便检测大的微生物或细胞。在一个方面，每个孔具有允许大的细胞或微生物通过的尺寸。在一个方面，每个孔的直径为至少约100nm。或者，每个孔的直径为至少约200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm、1500nm、1600nm、1700nm、1800nm、1900nm、2000nm、2500nm、3000nm、3500nm、4000nm、4500nm或5000nm。
在一个方面，孔的直径不超过约100,000nm。或者，孔的直径不超过约90,000nm、80,000nm、70,000nm、60,000nm、50,000nm、40,000nm、30,000nm、20,000nm、10,000nm、9000nm、8000nm、7000nm、6000nm、5000nm、4000nm、3000nm、2000nm或1000nm。
在一个方面，孔的直径在约100nm与约10000nm之间、或者在约200nm与约9000nm之间、或在约300nm与约8000nm之间、或在约400nm与约7000nm之间、或在约500nm与约6000nm之间、或在约1000nm与约5000nm之间、或在约1500nm与约3000nm之间。
在一些方面，纳米孔延伸穿过膜。例如，孔可以是插入脂质双层膜中的蛋白质通道，或者可以通过钻孔、蚀刻或以其它方式形成穿过如二氧化硅、氮化硅、石墨烯或由这些或其它材料的组合形成的层的固态基底的孔来工程化。在一些方面，纳米孔的长度或深度足够大以便形成连接两个以其它方式分开的体积的通道。在一些这样的方面中，每个孔的深度大于100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm或900nm。在一些方面，每个孔的深度不超过2000nm或1000nm。
在一个方面，每个孔的深度(即，在两个相邻体积之间延伸的孔的长度)为至少约0.3nm。或者，每个孔的深度为至少约0.6nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm或90nm。
在一个方面，每个孔的深度不超过约100nm。或者，深度不超过约95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm、50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm或10nm。
在一个方面，孔的深度在约1nm与约100nm之间、或者在约2nm与约80nm之间、或在约3nm与约70nm之间、或在约4nm与约60nm之间、或在约5nm与约50nm之间、或在约10nm与约40nm之间、或在约15nm与约30nm之间。
在一些方面，纳米孔装置还包括使靶分子穿过孔移动的器件和/或鉴定通过孔的物体的器件。下面提供其它细节，在双孔装置的背景下描述。
与单孔纳米孔装置相比，双孔装置可以更容易地配置以提供对靶分子穿过孔的运动的速度和方向的良好控制。
在某些实施方案中，纳米孔装置包括多个腔室，每个腔室通过至少一个孔与相邻腔室连通。在这些孔中，放置两个孔，即第一孔和第二孔，以允许至少一部分靶分子移出第一孔并进入第二孔。此外，该装置包括能够在移动期间鉴定靶分子的传感器。在一个方面，鉴定需要鉴定靶分子的各个组分。在另一个方面，鉴定需要鉴定与靶分子结合的融合分子和/或靶分析物。当使用单个传感器时，单个传感器可以包括放置在孔两端的两个电极以测量穿过孔的离子电流。在另一个实施方案中，单个传感器包括不同于电极的组件。
在一个方面，该装置包括通过两个孔连接的三个腔室。具有三个以上腔室的装置可以容易地设计为在三腔室装置的任一侧或三个腔室中的任意两个腔室之间包括一个或多个附加腔室。同样，装置中可以包括两个以上的孔来连接腔室。
在一个方面，两个相邻腔室之间可以有两个或更多个孔，以允许多个靶分子同时从一个腔室移动到下一个腔室。这种多孔设计可以提高装置中靶分子分析的通量。
例如，在三腔室双孔装置(“双孔”装置)中，每个腔室可以包含用于连接到电源的电极，使得可以在腔室之间的每个孔上施加单独的电压。
根据本公开的实施方案，提供了一种装置，该装置包括上腔室、中腔室和下腔室，其中上腔室通过第一孔与中腔室连通，并且中间腔室通过第二孔与下腔室连通。这样的装置可以具有先前在标题为双孔装置(Dual-Pore Device)的美国公布No.2013-0233709中公开的任何尺寸或其它特征，其全部内容通过引用并入本文。
在一些方面，孔具有基本上圆形的形状。这里所用的“基本上圆形”是指至少约80或90％呈圆柱体形式的形状。在一些实施方案中，孔的形状为正方形、矩形、三角形、椭圆形或六角形。
在一个方面，在包含两个或更多个孔的装置中，孔以约10nm至约1000nm的距离间隔开。在一些方面，孔之间的距离大于1000nm、2000nm、3000nm、4000nm、5000nm、6000nm、7000nm、8000nm或9000nm。在一些方面，孔间隔不大于30000nm、20000nm或10000nm。在一个方面，该距离为至少约10nm，或者，至少约20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm或300nm。在另一个方面，该距离不大于约1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、250nm、200nm、150nm或100nm。
在另一个方面，孔之间的距离介于约20nm与约800nm之间、介于约30nm与约700nm之间、介于约40nm与约500nm之间或介于约50nm与约300nm之间。
这两个孔可以布置在任何位置，只要它们允许腔室之间的流体连通并且在它们之间具有规定的尺寸和距离。在一个方面，孔被放置成使得它们之间不存在直接阻塞。仍然在一个方面，孔基本上是同轴的。
在一个方面，纳米孔装置连接到一个或多个电源。在一些方面，电源包括电压钳或膜片钳，其可以提供跨越每个孔的电压并且独立地测量通过每个孔的电流。在这方面，电源和电极配置可以将中间室设置为两个电源的共同接地。
在一些方面，电源被配置为在第一孔上施加第一电压V1，并在第二孔上施加第二电压。在一些实施方案中，两个孔串联。在一些实施方案中，第一孔位于上腔室与中腔室之间，并且第二孔位于中腔室与下腔室之间。在一些方面，第一电压V1和第二电压V2是独立可调的。在一个方面，中腔室被调整为相对于两个电压的接地。在一个方面，中腔室包括用于在每个孔与中腔室中的电极之间提供电导的介质。在一个方面，中腔室包括用于在中腔室中的每个孔与电极之间提供电阻的介质。相对于纳米孔电阻保持这种足够小的电阻对于将穿过孔的两个电压和电流去耦是有用的，这有助于独立调整电压。
可以使用电压的调节来控制腔室中带电粒子的移动。例如，当两个电压设置为相同的极性时，可以将适当带电的粒子顺序地从上腔室移动到中腔室和下腔室，或者以其它方式移动。在一些方面，当两个电压被设定为相反极性时，带电粒子可以从上腔室或下腔室移动到中腔室并保持在那里。
在PCT公开WO2013/012881和PCT公开WO2013/074546中描述了纳米孔装置的其它实施方案和用于检测的使用机制，其每一个都通过引用整体并入。
l.传感器：
如上所述，在各个方面，纳米孔装置还包括一个或多个传感器以执行对结合基序的结合状态的鉴定。
装置中使用的传感器可以是任何适用于鉴定靶分子的传感器。例如，可以配置传感器以通过测量与靶分子或结合的有效负载分子相关联的电流、电压、pH值、光学特征或停留时间来鉴定靶分子。在其它方面，传感器可以被配置为鉴定靶分子的一个或多个单独组分或与靶分子结合的一个或多个组分(即，有效负载分子)。传感器可以由被配置为检测可测量参数的变化的任何组件形成，其中该变化指示靶分子或有效负载分子。在一个方面，传感器包括放置在孔的两侧的一对电极，以在分子或其它实体，特别是靶分子移动穿过孔时，测量穿过孔的离子电流。在某些方面，当通过孔的靶分子片段结合到有效负载分子时，穿过孔的离子电流可测量地变化。这种电流变化可以可预测的、可测量的方式变化，例如，与存在并且结合靶分子的一种或多种有效负载分子的存在、不存在和/或大小相对应。
在一个优选实施方案中，传感器包括施加电压并用于测量穿过纳米孔的电流的电极。穿过纳米孔的分子移位提供了电阻抗(Z)，其根据欧姆定律V＝IZ影响穿过纳米孔的电流，其中V是施加的电压，I是穿过纳米孔的电流，并且Z是阻抗。当分子在电场中(例如，在施加的电压下)移位穿过纳米孔时的结果是电信号，其可以在进一步分析电流信号时与通过纳米孔的分子相关。
当使用来自电信号的停留时间测量值时，可以基于通过传感装置所花费的时间长度将组分的尺寸与特定组分相关联。
在一个实施方案中，在纳米孔装置中提供传感器，其测量靶分子、靶分子的组分(或单元)或与靶分子结合的组分(例如有效负荷分子或驱动分子)的光学特征。这种测量的一个实例包括通过红外(或紫外)光谱鉴定特定单元所特有的吸收带。
在一些实施方案中，传感器是电传感器。在一些实施方案中，当通过的靶分析物或可检测标记具有独特的荧光特征时，传感器检测荧光检测器件。可以使用孔出口处的辐射源来检测该特征。
m.纳米孔检测数据分析：
在一些实施方案中，鉴定靶分子的方法在含有一个或多个纳米孔的装置上进行。装置中可以包括微流体通道，其允许样品进入储液室。然后对样品混合物施加电压，使带电分子(例如与驱动分子结合的靶分子)通过纳米孔。当分子通过孔时，产生事件，并且通过软件分析数据以辨别与靶分子存在相关的已知特征曲线的存在。
在一些实施方案中，电信号在包含靶分子的复合物通过纳米孔时产生。在一些实施方案中，电信号与样品内靶分子的存在或不存在相关。在一些实施方案中，电信号与样品内靶分子的浓度相关。
在另一个实施方案中，可以使用光信号代替电流阻抗测量来辨别靶分子的存在。施加电压以驱动带电分子通过纳米孔。在装置中使用光学传感器来捕获可驻留在纳米孔或其附近的固定视场内的光学测量。光学测量包括在固定时间段内检测到的光的测量。该测量可以包括但不限于一个或多个单独的值，例如颜色、发光和强度。该方法可以用于检测已经以这样的方式修饰的靶分子，以产生光学传感器将检测的光信号，从而提供特定的光学测量。
“光学事件”是由传感器从可以包含一个或多个有效负载分子的单个靶分子移位捕获的一组光学测量。光学特征是光学事件中的光学测量的集合，其中软件以确定其已经读取唯一抽象值的方式分析它们。
在几个实施方案中，可以相对于将靶分子与电信号或光信号相关联的数据库比较所提供的电信号或光信号。该靶分子可以是本文讨论为能够通过在移位穿过纳米孔时的电流阻抗或其它检测方法(如光学测量)来检测的实体中的任一个。数据库可以通过读取由同质群体提供的电信号来生成。分析与有效负载分子结合的靶分子的同质群体对于评估所产生的信号模式的变化并确定该编码分子的参考信号是有用的，所述靶分子可以进一步与驱动分子结合。
n.应用：
在一些实施方案中，本发明用于检测样品中靶分子的存在或不存在。在一些实施方案中，本发明用于测量样品中靶分子的浓度。在一些实施方案中，本发明用于检测包含靶分子的复合物的存在或不存在。在一些实施方案中，本发明用于测量样品中包含靶分子的复合物的浓度。在一些实施方案中，本发明用于检测靶分子或包含靶分子的复合物的物理性质。
在一些实施方案中，样品是药理学组合物。在一些实施方案中，样品是来自患者的血液、尿液、唾液或组织样品。在一些实施方案中，样品是混合样品，例如从患者获得的血液或尿液样品。在一些实施方案中，样品从已经施用靶标的受试者获得。在一些实施方案中，样品获自人类患者。
在一些实施方案中，样品是水、土壤、空气、污泥、石油或化学或生物产品。
在一些实施方案中，靶分子或包含靶分子的复合物的纳米孔检测提供关于样品组成的信息。在一些实施方案中，靶分子或包含靶分子的复合物的纳米孔检测提供关于样品的物理条件(如pH、组成或温度)的信息。在一些实施方案中，靶分子或包含靶分子的复合物的纳米孔检测提供关于靶分子稳定性的信息。在一些实施方案中，靶分子或包含靶分子的复合物的纳米孔检测提供关于样品来源的信息。
6.实施例
a.实施例1：
i.靶标-接头-驱动子复合物：
图1示出了所公开的方法和系统的实施方案。更具体而言，该图公开了经由接头分子104结合至驱动分子102的靶分子101。使驱动分子102带电以促进靶分子101在施加的电压下穿过纳米孔106的移位。在图1中还示出了背景分子105，其可以在纳米孔中捕获时产生或不产生可检测信号。
在某些条件下，驱动分子102可以与靶分子101分离，如图2所示。如果发生这种情况，那么驱动分子102在没有靶分子的情况下通过纳米孔。
如图3所示，单独驱动分子移位(图3B)或单独靶分子移位(图3C)时产生的电信号不同于驱动子-靶标复合物移位(图3A)时产生的电信号。在这种情况下，与驱动分子结合的靶分子提供持续时间更长和/或与开放通道信号相比具有更大变化的电信号(图3A-C)。
ii.靶标(赖诺普利)-接头(SMCC)-驱动子(DNA)复合物的纳米孔检测：
本发明提供了连接到驱动分子上的药物化合物，使得它可以基于电流阻抗在纳米孔中被检测到。赖诺普利，一种血管紧张素转化酶抑制剂，是由Astrazeneca出售的用于治疗高血压的小分子药物。鉴于其体积小，405Da，赖诺普利太小而无法在纳米孔中检测到。然而，当与驱动分子缀合时，赖诺普利可穿过允许检测的纳米孔。图4显示经修饰以共价结合于SMCC接头的赖诺普利的化学结构，其与dsDNA驱动分子结合。
具体而言，我们对赖诺普利进行修饰以包含用于连接含有NHS-酯的分子的游离胺。我们通过SMCC接头将经修饰的赖诺普利与硫醇化DNA连接，SMCC接头的NHS-酯反应性基团与赖诺普利中的游离胺反应，而接头上的马来酰亚胺基团与DNA上的5'硫醇反应。我们通过ESI-质谱确认了赖诺普利的SMCC标记，测得的质量625.2(图5)与预测的质量625-627相匹配。然后将该赖诺普利-SMCC加合物与硫醇化DNA反应，产生赖诺普利-DNA(或靶标-驱动子)复合物。
DNA驱动分子促进了纳米孔装置中赖诺普利的翻译和检测。DNA-赖诺普利复合物产生易于检测的电信号，如图6(点)所示。没有驱动子的赖诺普利通过孔时没有发出任何信号。10nM浓度的DNA-赖诺普利每分钟提供144个事件，最大电导变化范围介于1-2nS，持续时间为10-5至10-4s。在没有连接到532bp dsDNA驱动分子的情况下，赖诺普利无法用纳米孔检测。
iii.靶标(单克隆抗体)-接头(PNA-SMCC)-驱动子(DNA)复合物的纳米孔检测：
本发明还提供了一种检测靶标药物生物制剂的方法，其通过将靶标共价偶联至结合驱动分子的结构域以在电泳电流下通过孔将其引入。具体而言，能够结合并中和破伤风杆菌中的致病蛋白(破伤风毒素)的单克隆抗体药物通过SMCC接头与PNA共价缀合，所述SMCC接头在序列特定位置结合DNA驱动分子。复合物(驱动子-药物)在孔中可以清晰地被检测到，而药物本身和驱动子本身是不可被检测的。因此，只有驱动子-药物复合物可以在减小以实践本专利的图1中的概念的孔中被检测到。
图7显示了在1M LiCl中，最大电导变化与驱动子DNA和药物(抗体)的单个分子持续时间的事件图，所述分子穿过具有27nm的估计直径和29nm的孔隙厚度的孔。最大电导变化定义为最大电流衰减变化除以施加的电压(在此情况下为100mV)。当驱动子和药物不相互偶联时，都不能通过纳米孔给出明显的信号，因此最小程度地被检测到(驱动子DNA信号深度为1至2.5nS，持续时间为10-5至10-4s，事件速率小于每分钟8次，根本检测不到药物抗体)。然而，驱动子-药物的完整复合物每分钟可提供170个事件，并且通过1)驱动子DNA的长度和2)药物抗体的“体积”来提供非常明显的信号深度(2-6nS)和持续时间(10-4-10-2s)。与单独单位(仅驱动子DNA-PNA，黑色方块，图7)相比，这导致DNA/药物复合物产生容易检测的群体(点，图7)。这显示了药物和驱动分子之间结合以用于纳米孔检测和定量的重要性。
b.实施例2
i.靶标-接头-驱动子-有效负载复合物：
图4提供了本发明的另一个实施方案，其中靶分子101通过接头分子104a与驱动分子102结合，并且通过另一接头104b与有效负载分子103结合。如图9A-B所示，有效负载分子的添加增强电信号以增加其持续时间和/或与开放通道信号的差异，以促进纳米孔中靶分子的检测。
ii.靶标(肽生物剂)-接头(PNA)-驱动子(DNA)-有效负载(抗体)复合物的纳米孔检测：
图10提供了从连接到驱动分子的肽生物靶分子和特异性结合肽靶分子的有效负载分子收集的数据。有效负载分子增加了复合物(驱动子-靶标-有效负载)的体积，从而促进了孔中靶分子的检测(如图9所述)。具体而言，将肽生物靶分子工程化以具有马来酰亚胺附着位点，用于随后与具有游离硫醇的化合物连接。工程化的肽生物靶分子通过与驱动分子结合的PNA接头连接到108bp dsDNA驱动分子。靶分子进一步与作为有效负载的抗体结合。
图10显示了108bp dsDNA驱动分子-靶分子复合物在通过孔时产生的电信号的最大电导变化与电信号持续时间的事件图。由于DNA的负电荷，没有有效负载分子的靶标-驱动子复合物有效地穿过孔。但是，由于它的体积小以及驱动子的长度短(正方形)，所以其不容易检测到。事件群体(正方形)只能略微检测到(每分钟只有2个事件，深度为1nS，持续时间为10-4s)。当DNA/靶标连接到有效负载分子(抗体)上时，使得DNA/肽/抗体复合物(也称为驱动子/靶标/有效负载)复合物容易在孔中检测到(点)。完整的复合物群体产生了4-6nS的事件深度和0.1至10ms的持续时间，并且每分钟捕获56个事件，与没有有效负载的驱动子-靶标复合物相比显著增加。
iii.靶标(生物素)-驱动子(DNA)-有效负载(抗体)复合物的纳米孔检测：
图11提供了直接连接到驱动子和有效负载时检测靶分子的数据。在这里，DNA驱动分子的5'和3'末端共价连接到小(244Da)的靶分子，即生物素(维生素B7)上，然后将其与抗生物素抗体有效负载结合，以便能够检测靶生物素分子。为了连接，生物素用酰胺工程化，以便随后连接到碳水化合物上的5'磷酸盐。驱动分子是470bp dsDNA，其在纳米孔中检测到得最少(每分钟检测到约1个事件，图11中的正方形)。靶分子(生物素)非常小(244Da)，并且本身在纳米孔中检测不到。驱动子加上生物素的纳米孔信号非常类似于仅来自驱动子的信号，因此使生物素无法检测。通过将生物素-驱动子与抗体接触，形成了驱动子-靶标-有效负载复合物，并且容易检测到复合物。图13的散点图中的倒三角形显示来自驱动子-靶标-有效负载复合物的事件,其在持续时间(10-4s至10-2s)、振幅(1nS至7nS)和频率(每秒1个事件)的范围。有效负载分子本身不能提供足够的信号用于可靠的检测。另外，抗生物素抗体不能非特异性结合驱动dsDNA分子。因此，明显的事件是完整的驱动子-靶标-有效负载复合物所特有的，以隐式检测靶分子的存在。
c.实施例3
i.靶标-接头-驱动子-两个有效负载复合物：
图12提供了本发明的另一个实施方案，其中附加的有效负载分子103b(波浪盒)连接到驱动分子102。例如，PNA-PEG有效负载分子103b可以连接到DNA驱动分子。有效负载分子的这种结合在通过纳米孔移位时进一步修饰电信号以增强纳米孔的检测。在一些实施方案中，与驱动分子和多个有效负载分子结合的靶分子被配置为通过纳米孔从一个腔室完全移位至另一个腔室(图13)。
包含两个有效负载分子的复合物(图14A)，包含一个有效负载分子的复合物(图14B)和没有任何有效负载分子的复合物(图14C)产生不同的电信号。由结合到附加有效负载分子的靶分子产生的电信号可以具有增强的持续时间或来自开放通道的电流变化(图14A)。来自附加有效负载分子的电信号还可以提供独特的电流特征，以便于区分背景分子或其它靶分子。
ii.靶标(肽)-接头(PNA)-驱动子(DNA)-两个有效负载(抗体作为第一有效负载，PNA-PEG作为第二有效负载)复合物的纳米孔检测：
图15显示了本实施方案中使用的驱动分子。驱动分子包含两个结合位点，一个结合位点用于与第一有效负载分子结合的靶分子，另一个结合位点用于第二有效负载分子。连接到驱动分子的二级有效负载允许复用。通过使用不同尺寸或间隔的二级有效负载，可以为样品中的每个驱动子-靶标物种生成独特的阻抗特征。
具体而言，图15中的5631bp dsDNA驱动分子的两个结合位点可以结合两个PNA分子。分别而言，一个结合位点是针对用作独特鉴定的二级有效负载分子的PNA-PEG，而另一个结合位点是针对靶标-有效负载复合物，其中靶标是PNA-肽并且有效负载是抗体。在该模型中，如在先前的实施例中，靶肽本身是经修饰的“药物”，其具有与其缀合的PNA作为能够将其结合至驱动子(dsDNA)的手段以用于纳米孔检测和定量。与PEG(二级有效负载)和肽(靶标)一起使用的PNA在该实施例中是相同的，但是实际上可以使用独特的PNA序列，并且可能是优选的，以便增加每个支架只有一个二级有效负载和一个靶标-有效负载的可能性。因为PNA序列相同，所以最初的10X PNA-PEG用于结合大多数只有1个PNA结合位点的支架，然后是10X PNA-肽，意图占据大多数支架上剩余的PNA结合位点。试剂在相同的24.5-25.5nm直径的孔中依次测试。
图16A-B显示从单独的0.3nM 5631bp DNA(仅驱动子，圆形)；具有10X PNA-10kDaPEG(PP)的DNA(驱动子-有效负载：正方形和菱形)；具有10X PP和10X PNA-V3环肽(PV3B)的DNA(驱动子-有效负载-靶标复合物：绿色三角形)；和具有10X PP、10X PV3B和2X HIV Ab结合位点的DNA(驱动子-靶标-两个有效负载复合物：星形)收集的电信号的事件图(图16A)和直方图(图16B)。
在所有试剂组之间，记录仅缓冲的无事件(即10个或更少的事件)周期5-10分钟，以确保每种测试试剂都以最小的交叉样品污染进行测量。0.3nM单独的5.6kb DNA在10分钟内产生457个事件，接着是0.3nM具有10X(每个位点6nM＝2x 3nM)PNA-PEG(10kDa)的DNA在8分钟内产生294个事件，随后重复的0.3nM具有10X PNA-PEG(10kDa)的DNA在7分钟内产生316个事件。接下来，具有10X PP和10X V3B的DNA在15分钟内产生787个事件，随后是具有10X PP和10X V3B和2X Ab的DNA，其在25分钟内产生828个事件。作为最终对照，仅运行2XAb(0.6nM)，在10分钟内仅产生7个事件。
单独的DNA群体与其它群体区别开来，产生标准的折叠，部分折叠和展开的事件轮廓。具有10X PP和PV3B的DNA群体在事件分布中具有可比性，而存在Ab的完整复合物(如在没有有效负载的情况下)产生更深和持续更长的群体(图16A，围绕事件的框，左边)。使用标准事件图的这些总体趋势显示，具有二级有效负载结合以及靶标效负载结合的复合物产生用于靶检测和定量的独特电子特征。
设计驱动分子的替代方法可用于该实施方案。例如，通过引用整体并入的PCT公开WO/2015/176034公开了作为多路复用手段的包含用于独特标识符和靶标的多个结合位点的驱动分子(即，支架)。这样的驱动分子可以连接到靶分子以使得能够使用纳米孔装置检测靶分子。
7.引用并入
出于所有目的，本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文件通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其它文件都单独表明通过引用并入用于所有目的。
8.等效物
尽管已经说明和描述了各种具体实施方案，但上述说明不是限制性的。应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以做出各种改变。在阅读本说明书后，许多变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

Claims (71)

1.一种设计用于纳米孔检测的复合物，其包含：
包含第一附着位点的靶分子；和
包含第一附着位点的驱动分子，
其中所述驱动分子的第一附着位点与所述靶分子的第一附着位点形成共价键。
2.一种设计用于纳米孔检测的复合物，其包含：
包含第一附着位点的靶分子；和
包含第一附着位点和第二附着位点的接头分子，
其中所述接头分子的第一附着位点与所述靶分子的第一附着位点形成共价键，以及
所述接头分子的第二附着位点是驱动分子的结合位点。
3.如权利要求2所述的复合物，其还包含所述驱动分子，其中所述驱动分子通过共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与所述接头分子的第二附着位点结合。
4.如权利要求2至3中任一项所述的复合物，其中所述接头分子包括肽、蛋白质、碳水化合物、单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、核糖核酸(RNA)、纳米颗粒、肽核酸(PNA)、聚乙二醇(PEG)、树状聚合物、合成聚合物或其任何组合。
5.如权利要求2至4中任一项所述的复合物，其中所述接头分子包括肽、缬氨酸-瓜氨酸接头、马来酰亚胺己酰基(mc)接头、[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-甲酸酯(MCC)接头、4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)接头、基于PEG的接头、腙接头、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)接头或碳酸酯接头，或任何其它同双功能或异双功能分子。
6.如权利要求1至5中任一项所述的复合物，其中所述靶分子包含生物治疗剂。
7.如权利要求6所述的复合物，其中所述生物治疗剂是单克隆抗体、蛋白质、蛋白酶、肽、糖、核酸或其任何组合。
8.如权利要求1至5中任一项所述的复合物，其中所述靶分子包含小分子。
9.如权利要求8所述的复合物，其中所述小分子是小分子治疗药物或小分子诊断药物。
10.如权利要求9所述的复合物，其中所述小分子是选自由酶抑制剂或活化剂、受体拮抗剂或激动剂和细胞过程或途径的小分子调节剂组成的组的小分子治疗药物。
11.如权利要求10所述的复合物，其中所述小分子治疗药物是赖诺普利。
12.如权利要求1至5中任一项所述的复合物，其中所述靶分子包含选自由肥料、建筑或建造材料和膳食组合物组成的组的化学或生物产品的成分。
13.如权利要求12所述的复合物，其中所述成分是固氮酶。
14.如权利要求12所述的复合物，其中所述成分是硼酸。
15.如权利要求1至5中任一项所述的复合物，其中所述靶分子是选自由pH指示剂、毒素指示剂、化学指示剂、污染物指示剂或温度指示剂组成的组的指示剂。
16.如权利要求1至15中任一项所述的复合物，其中所述驱动分子是单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)或核糖核酸(RNA)。
17.如权利要求16所述的复合物，其中所述驱动分子包含超过20个核苷酸。
18.如权利要求16所述的复合物，其中所述驱动分子通过共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与所述接头分子结合。
19.如权利要求1至18中任一项所述的复合物，其中所述靶分子还包含第二附着位点，其中所述第二附着位点与第一有效负载分子结合。
20.如权利要求19所述的复合物，其中所述第一有效负载分子通过共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与所述靶分子结合。
21.如权利要求1至19中任一项所述的复合物，其中所述驱动分子还包含第二附着位点，其中所述第二附着位点与第二有效负载分子结合。
22.如权利要求21所述的复合物，其中所述第二有效负载分子通过共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与所述驱动分子结合。
23.如权利要求19至22中任一项所述的复合物，其中所述第一或所述第二有效负载分子是肽、蛋白质、碳水化合物、单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、核糖核酸(RNA)、纳米颗粒、肽核酸、聚乙二醇(PEG)、树状聚合物或其任何组合。
24.如权利要求19至23中任一项所述的复合物，其中所述靶分子与多个有效负载分子结合。
25.如权利要求19至24中任一项所述的复合物，其中所述驱动分子与多个有效负载分子结合。
26.如权利要求1至25中任一项所述的复合物，其中所述靶分子的第一附着位点在氨基酸、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)上包含以下反应性基团：胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。
27.如权利要求1至25中任一项所述的复合物，其中所述驱动分子的第一附着位点在氨基酸、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)上包含以下反应性基团：胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。
28.一种检测靶分子的方法，其包括以下步骤：
a.将怀疑包含如权利要求1至27中任一项所述的复合物的样品装入包含至少一个纳米孔的纳米孔装置中；
b.跨越所述至少一个纳米孔施加电压；以及
c.测量通过所述孔的电信号，其与所述样品中所述复合物的存在或不存在相关。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述样品包含药物组合物。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述样品包括来自患者的血液、尿液、唾液或组织样品。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述样品包括水、土壤、空气、污泥、石油或化学或生物产品。
32.如权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述复合物与一个或多个有效负载分子结合，并且其中所述电信号进一步与所述一个或多个有效负载分子的结合相关。
33.如权利要求28至32中任一项所述的方法，其还包括基于所述电信号确定所述样品中所述复合物的存在或不存在的步骤。
34.如权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述电信号进一步与所述样品中所述靶分子的存在或不存在相关。
35.如权利要求34所述的方法，其还包括基于所述电信号确定所述样品中所述靶分子的存在或不存在的步骤。
36.如权利要求28至35中任一项所述的方法，其还包括确定所述样品中所述复合物或所述靶分子的浓度的步骤。
37.一种设计用于纳米孔检测的经修饰的靶分子，其包含
驱动分子或接头分子的第一附着位点，其中所述附着位点是通过靶分子的第一修饰产生的。
38.如权利要求37所述的经修饰的靶分子，其中所述第一修饰包括生物素化、乙酰化、甲基化、类泛素化、糖基化、磷酸化或氧化。
39.如权利要求37所述的经修饰的靶分子，其中所述第一修饰包括化学或生物合成。
40.如权利要求37所述的经修饰的靶分子，其中所述第一修饰包括所述靶的基因工程。
41.如权利要求37至40中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述第一附着位点在氨基酸、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)上包含以下反应性基团：胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。
42.如权利要求37至41中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述第一附着位点可以通过共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与所述驱动分子结合。
43.如权利要求37至42中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述第一附着位点可以通过共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与所述接头分子结合。
44.如权利要求37至43中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述靶分子包含生物治疗剂。
45.如权利要求44所述的经修饰的靶分子，其中所述生物治疗剂是单克隆抗体、蛋白质、蛋白酶、肽、糖、核酸或其任何组合。
46.如权利要求37至43中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述靶分子包含小分子。
47.如权利要求46所述的经修饰的靶分子，其中所述小分子是小分子治疗剂或小分子诊断药物。
48.如权利要求47所述的经修饰的靶分子，其中所述小分子是选自由酶抑制剂或活化剂、受体拮抗剂或激动剂和细胞过程或途径的小分子调节剂组成的组的小分子治疗剂。
49.如权利要求48所述的经修饰的靶分子，其中所述小分子治疗药物是赖诺普利。
50.如权利要求37至43中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述靶分子是选自由肥料、建筑或建造材料和膳食组合物组成的组的化学或生物产品的成分。
51.如权利要求50所述的经修饰的靶分子，其中所述成分是固氮酶。
52.如权利要求50所述的经修饰的靶分子，其中所述成分是硼酸。
53.如权利要求37至43中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述靶分子是选自由pH指示剂、毒素指示剂、化学指示剂、污染物指示剂或温度指示剂组成的组。
54.如权利要求37至53中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述经修饰的靶分子维持所述靶分子的至少一个功能。
55.如权利要求54所述的经修饰的靶分子，其中所述至少一个功能是治疗性、诊断性、生物学、化学或营养学活性。
56.如权利要求37至55中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述驱动分子是单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、双链脱氧核糖核酸(dsDNA)或核糖核酸(RNA)。
57.如权利要求56所述的复合物，其中所述驱动分子包含超过20个核苷酸。
58.如权利要求36至57中任一项所述的经修饰的靶分子，其还包含用于结合有效负载分子的第二附着位点。
59.如权利要求58所述的经修饰的靶分子，其中所述第二附着位点是通过所述靶分子或所述经修饰的靶分子的第二修饰产生的。
60.如权利要求59所述的经修饰的靶分子，其中所述第二修饰包括生物素化、乙酰化、甲基化、类泛素化、糖基化、磷酸化或氧化。
61.如权利要求59所述的经修饰的靶分子，其中所述第二修饰包括化学或生物合成。
62.如权利要求59所述的经修饰的靶分子，其中所述第二修饰包括所述靶的基因工程。
63.如权利要求58至62中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述第二附着位点在氨基酸、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)上包含以下反应性基团：胺基、硫醇基、醛基、酮基、叠氮化物基、炔基、硫、磷或其它反应原子、酮基、羧酸基、醚基、酰胺基、卤代烷基、酯基、炔基、羟基或醇基。
64.如权利要求58至63中任一项所述的经修饰的靶分子，其中所述第二附着位点可以通过共价键、中间接头、范德华键、静电键、疏水性相互作用、π堆积相互作用、离子键或另一种非共价静电相互作用与所述有效负载分子结合。
65.一种检测经修饰的靶分子的方法，其包括以下步骤：
a.获得怀疑包含如权利要求37至64中任一项所述的经修饰的靶分子的样品；
b.将所述驱动分子加入所述样品以产生反应产物；
c.将所述反应产物施加到包含至少一个纳米孔的纳米孔装置；
d.跨越所述至少一个纳米孔施加电压；以及
e.测量通过所述孔的电信号，其与所述样品中所述经修饰的靶分子的存在或不存在相关。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述样品包含药物组合物。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述样品包括来自患者的血液、尿液、唾液或组织样品。
68.如权利要求65所述的方法，其中所述样品包括水、土壤、空气、污泥、石油或化学或生物产品。
69.如权利要求65至68中任一项所述的方法，其中所述经修饰的靶分子与一个或多个有效负载分子结合，并且其中所述电信号进一步与所述一个或多个有效负载分子的结合相关。
70.如权利要求65至69中任一项所述的方法，其还包括基于所述电信号确定所述样品中所述经修饰的靶分子的存在或不存在的步骤。
71.如权利要求70所述的方法，其还包括确定所述样品中所述经修饰的靶分子的浓度的步骤。
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