JP6592427B2 - タンパク質および核酸を検出するためのナノ細孔バイオセンサー - Google Patents
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Description
本開示の一態様は、修飾細孔タンパク質から調製されたナノ細孔バイオセンサーに関する。例示的な細孔タンパク質としては、限定するものではないが、細胞溶解素、溶血素、ポリン、DNAパッケージングタンパク質、およびモータータンパク質が挙げられる。細孔タンパク質としては、細菌タンパク質またはウイルスタンパク質であってもよい。
本開示のさらなる態様は、修飾ClyA細孔タンパク質が、選択的結合特性を有するリガンドと組み合わされているナノ細孔バイオセンサーに関する。いくつかの実施形態において、これらの修飾細孔およびリガンドは、例えば、複合生体試料中、例えば、組織および/または体液中のタンパク質分析物の同定に使用される。標的タンパク質分析物は、試料の他の成分よりも低濃度で存在していてもよい。いくつかの実施形態において、リガンドはまた、分析物の構造または機能特性に基づいた巨大分子分析物の一部分を標的とするために使用することができる。リガンドの存在によって、標的タンパク質分析物と修飾細孔との会合が高まり得る。例えば、リガンドは、細孔の入口で選択性フィルタとして作用し、試料中の他の非標的タンパク質を拒絶しながら、標的タンパク質の捕捉を増加させることができる。
1.タンパク質分析物
いくつかの実施形態において、修飾ClyA細孔タンパク質は、タンパク質分析物が細孔内腔内に結合できるように操作される。この結合は安定的で再現可能な電流遮断を媒介し、非結合の細孔において測定された非遮断イオン電流と容易に区別される。タンパク質分析物は、15〜70kDaの分子量の範囲であってよく、例えば、例示的なタンパク質分析物は、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65または70kDaの分子量を有していてよい。分析物は、小タンパク質の二量体または他の多量体であってもよい。
本開示の別の態様は、試料中の特定のタンパク質の検出に関する。いくつかの実施形態において、試料中の少なくとも1つのタンパク質分析物の存在を検出する方法は、(a)試料を本明細書で開示した修飾ClyA細孔と接触させるステップと、(b)修飾ClyA細孔を横切って1以上の電位を加えるステップと、(c)1以上のそれぞれの電位で修飾ClyA細孔を通る電流を測定すること;(d)測定された電流を基準電流と比較するステップとを含み、ここで、基準電流に対する電流の変化は、試料中にタンパク質分析物が存在することを示す。いくつかの実施形態において、電流の変化は電流の低下である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は15〜50kDaの範囲の分子量、例えば、15、20、25、30、35、40、45または50kDaの分子量を有する。基準電流は、リガンドの非存在下で修飾ClyA細孔によって測定された電流であってもよいし、かつ/または、基準リガンドの存在下で修飾ClyA細孔によって測定された電流であってもよい。いくつかの実施形態において、基準リガンドおよびタンパク質分析物は同一である。ある特定の実施形態において、基準リガンドとタンパク質分析物は、少なくとも75%、80%、85%、90%または95%同一である。したがって、いくつかの実施形態において、試料中のタンパク質分析物を同定する方法は、(a)試料を本明細書に記載した修飾ClyA細孔と接触させるステップと、(b)修飾ClyA細孔を横切って1以上の電位を加えるステップと、(c)それぞれの1以上の電位で修飾ClyA細孔を通過する電流を測定するステップと、(d)測定した電流を既知のリガンドから得た1以上の基準電流と比較するステップとを含み、測定された電流と基準電流の間の合致は、タンパク質分析物および既知のリガンドが同一であることを示す。同様に、測定された電流と基準電流の間の不一致は、タンパク質分析物および既知のリガンドが同一でないことを示し得る。
本開示の一態様は、核酸の結合、検出、同定、移動、および/または輸送調節が可能な修飾ClyA細孔である。修飾ClyA細孔を通り移動する核酸としては、例えば、限定するものではないが、翻訳後修飾、例えばメチル化を生じ得る、または生じないDNA;RNA、例えば、トランスファーRNA(tRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、リボソームRNA(rRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、ミクロRNA(miRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、細胞外RNA(exRNA)、Piwi干渉RNA(piRNA)、およびノンコーディングRNA(ncRNA)などが挙げられる。核酸類似体は、例えば、2’−O−メチル置換RNA、ロックト核酸(LNA)、モルホリノ、およびペプチド核酸(PNA)、ジデオキシヌクレオチドなどがある。
実施例
所望の特性を有する酵素を調整するための目的の開発方法を使用してClyA−SSの活性を改善した。C87S置換およびC285S置換の悪影響を解消する変異は脂質二重層中のナノ細孔の安定性も増加させると推論される。ランダムライブラリーは、エラープローンPCRによってClyA−SSのバックグラウンドで生成し(1ラウンド当たり一遺伝子につき約1〜4つの変異)、溶血活性についてスクリーニングした(図6)。次いで、最も活性の高い変異体をNi−NTAアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、BN−PAGEによってオリゴマー形成に関して試験した(図7)。選択されたナノ細孔変異体は、選択の最終的および重要な基準として機能する所望の挙動(低電気的ノイズおよび高印加電位での開口維持能力)に関して平面脂質二重層において最終的にスクリーニングされた。4回目のスクリーニングの直後に、低電気的なノイズを示し(図8)、+90から−150で平面脂質二重層において開口が維持されたClyA−CS変異体が単離された(表1)。驚いたことに、87位のセリンが、野生型遺伝子のもとの残基であるシステインに逆変換された。部位特異的化学修飾に適しているシステインが少ないClyA変異体を得るためには、ClyA−CSを87位での飽和突然変異誘発に供し、得られたライブラリーにスクリーニングを行い、所望の電気的特性(SI)を有するシステインを含まないClyA−ASを選択した。ClyA−SSとは反対に、開発されたClyAナノ細孔は可溶性画分中の大腸菌(E.coli)細胞において発現され(図6)、このモノマーはアフィニティークロマトグラフィーによる一工程で精製することができ、これにより生成収率を10倍増加させることができた(10ml培養物当たり約0.6mg)。
ClyAモノマーを0.5%w/vのβ−ドデシルマルトシド(DDM)とインキュベーションすることによって形成したClyAオリゴマーは、BN−PAGEにおいて複数のバンドを示した(図2a)。このことは、ClyAがいくつかのオリゴマー状態に集合し得ることを示唆している。大腸菌(E.coli)ClyAオリゴマー化の厳密な化学量論は議論の的になっているので、これは特に興味深い。ClyA結晶構造(PDB_ID:2WCD)からは、cis側に5.5nmの開口部とtrans入口に3.3nmの開口を有する(アミノ酸側鎖のファン−デル−ワールス半径を含む)十二量体であることが示されたが、以前の低温電子顕微鏡構造からは、811または1312のサブユニットを有するナノ細孔であることが示されている。
同一のアミノ酸組成物であるがサイズは異なるナノ細孔を使用できることは、ナノ細孔のサイズが特定の分子を捕捉し試験するその機能が明らかであるので、生物学的ナノ細孔分野における新しい特徴であり、かつ重要である10b、14。−35mVで、HT(ヒトトロンビン、37kDa)が数分間継続してI型ClyA−SSナノ細孔へ明確な電流遮断を引き起こすことは以前に示されている7a。遮断シグナルは、2つの電流レベル、レベル1[開口ナノ細孔電流のパーセンテージ(IRES%)=56±1%]とレベル2(IRES%=23±1%、表1および図4a)との間で速やかに切り替えられ、ClyAナノ細孔内腔内のHTに関する2つの所在部位を反映している。レベル2は、おそらく深い部位のHT所在に関連していると考えられ、一方、レベル1は、ナノ細孔のcis入口付近のHTの所在に関連している7a。トロンビンがこうした明確な電流遮断のパターンを引き起こしたので、ここでは、HTを分子キャリパーとして使用して様々なClyAナノ細孔の幾何構造を比較した。
トロンビンは、直径4.2nm(SI)の球体にほぼ近い分子量を有する球状タンパク質である。したがって、I型、II型およびIII型のClyAは様々なオリゴマー状態を有するナノ細孔に対応することが仮定される場合(上記参照)、HTは、容易にはI型およびII型のClyAナノ細孔を通って移動しないはずである。(それぞれ、3.3nmおよび3.7nmの原子のファン−デル−ワールス半径を含むtrans直径、表1)。反対に、HTはIII型ClyAと同じ直径を有しており(表1)、このことから、タンパク質はこのナノ細孔を通って移動することができることが示唆される。分子がナノ細孔を通り抜けるかどうかを評価する有力な方法は、タンパク質の電流遮断の期間の電圧依存を調査することである。電位の増加とともに電流遮断期間が低減するということは、分子がナノ細孔を通って移動している有力な証拠である。逆に、電圧とともに電流遮断期間が増加することは、タンパク質がナノ細孔内に送り込まれるが、それを通って移動しないことを示唆する10f、15。−5mVから−25mVまで、I型ClyA−SSナノ細孔へのHT遮断の停止時間は印加電位に伴い増加しており(図9a)、HTがこの電圧間隔でナノ細孔を通って移動しないことが示唆された。I型およびII型の開発したClyAナノ細孔は−150mV以下の印加電位で開口したままであるという事実を活用し、HT遮断が−60から−150mVのI型およびII型ClyA−CSナノ細孔について特性決定された。I型ClyA−CSナノ細孔については−100mVを超える印加電位で、またII型ClyA−CSナノ細孔については−60mVで、HT電流遮断の停止時間が電位の増加に伴い顕著に減少した(図5a)。このことは、この電位範囲において、HT分子がナノ細孔を通って移動することを示唆している。同様に、Dendra2_M159A(FP、GFP様タンパク質、30kDaタンパク質)は、最初に増加を示し(−25mVから−40mVまで)、続いて、電流遮断期間の減少を示した(−50mVから−70mVまで)。このことは、FPが−50mVを超える電位でI型ClyA−SSナノ細孔を通って移動することを示唆している(図9b)。II型ClyA−CSを通るHTの移動が明らかとなった同じ電位で、HT遮断期間をI型およびII型ClyA−CSナノ細孔と比較すると、I型ClyA−CSよりも約2オーダー速かった(図5b、表1)。これは、I型およびII型ClyAが様々なサイズを有するナノ細孔と書かれている解釈に沿っている。
分子がナノ細孔の内腔内に留まる場合、イオン電流遮断は、分子によって中に入れなくなった電解質の原子体積に比例する10d、10f、16。したがって、分子が折り畳み構造を有するナノ細孔を通って移動する場合、IRES%は様々な印加電圧で一定のままのはずである。逆に、タンパク質が移動の際、非折り畳みである場合、IRES%は変化することが予想される。このことは、非折り畳みポリペプチド鎖の体積および形状が球状タンパク質の体積および形状とは異なることによって生じる。I型およびII型ナノ細孔を通るHTの移動の際のIRES%値は、−35mVおよび−150mVで同一であった(レベル2、表1)。これは、この電位範囲において、HTが、ナノ細孔中にある間、非折り畳みであることを示唆している。興味深いことに、I型ClyA−CSナノ細孔単独では、−90mV未満の電位でのHTの電流遮断は、多くの場合、高いIRES%の電流遮断(ショルダー)、続いて開口ナノ細孔電流に関する電流の増加(スパイク)を伴って終わった(図5cおよび図10)。IRES%値のショルダーはHTが移動の際に非折り畳みであることを示し得るが、タンパク質移動後の電流スパイクは、そうではなく、折り畳みHTがI型ナノ細孔を通り移動できるようにClyAナノ細孔に変形させる必要があり得ることを示唆している。
この研究では、野性型ClyAと比較した場合に平面脂質二重層でのその活性、溶解性および好ましい挙動が増加したClyA−CSが選択された。ClyA十二量体の内径(その狭い入口17で3.8nm、図11a)は、dsDNAの直径(B型構造において2.2nm)よりも大きい。これは、dsDNAが細孔を通り容易に電気泳動的に移動するはずであることを示唆している。しかし、おそらくは、生理学的な塩濃度でClyAの内腔を負荷電残基が覆っているために(pI=5.1)、ssDNAはナノ細孔に入らない7a。高アルカリpHでのα溶血素(αHL)ナノ細孔に関する以前の研究を考慮し7b、7c、DNAがClyA−CSナノ細孔を通り移動する能力は、細孔の内部電荷がスクリーニングされる、高イオン強度で試験した。+100mVの印加電位下で、2.5M NaCl、15mM Tris.HCl、pH7.5において、cisコンパートメントに0.12μMのビオチン化dsDNA1(290bp、表2)を添加すると、DNAが細孔の内腔に入り、それによって2.0±0.6msの停止時間で、0.63±0.01の残留電流(IRES=IB/IO)を示す(レベル1* +100=1.10±0.03nA、n=3実験)、開口細孔電流(IO)に対する一過性の電流遮断(IB)が生じる(図11b)。続いて、ビオチンと強固な複合体を形成する、0.3μMのニュートラアビジンをcisコンパートメントに添加すると、高い残留電流値で(IRES=0.68±0.01)、一時的遮断が長く継続する電流遮断に変わった(レベル1+100=1.19±0.01nA、n=4)。開口細孔電流は、印加電位を−100mVまで逆転させることによって戻すことができる(図11b)。これらの結果からは、ニュートラアビジンは、cisタンパク質:DNA複合体(この場合、DNAは細孔の完全な長さを占める)を形成することによって、ClyAナノ細孔を通るDNAの完全移動を妨げることがわかる(図11c)。trans複合体もまた、dsDNA:ニュートラアビジン複合体がtrans側を通って通過する場合、−100mVで(レベル1−100=1.02±0.03nA、IRES=0.62±0.01、n=4)形成され得る(図11d)。
ロタキサンは超分子の連結系であって、そこで、線状ユニット(スレッド)はマイクロ環を通って移動し、2つの嵩高い置換基(ストッパ)によって捕捉される。このように力学的に結合されている分子は、例えば、分子エレクトロニクスにおけるスイッチまたは分子機構における成分としての用途を有する。ロタキサンは、dsDNA22を含む様々な分子から作製されるか、またはαHLナノ細孔を通って通過したビオチン化ssDNA分子を一方の側でストレプトアビジンにより、また反対側でDNAヘアピンにより固定化することによって作製した(dsDNAはαHLを通って移動することができない)23。ここで、ClyAナノ細孔を通るdsDNAの移動を証明するために、ClyAナノ細孔のtrans側に付加されたdsDNA分子が、ナノ細孔の内腔を通って通り抜けた後に、cis側の第2のDNA鎖とハイブリダイズする、ロタキサン系を構築した。ジスルフィド結合を介して細孔のcis入口に(図11aの103位に)導入されているシステイン残基に、5’末端で共有結合されている12個のssDNA分子2(51塩基、表2、図12a)を含有する、ClyAナノ細孔ClyA−2を使用した。2は、ロタキサンストッパとして機能するように設計されている。スレッド3は、オリゴ6とのハイブリダイゼーションによってcis側でストッパとハイブリダイズするように設計されている、5’末端のさらなる31個の核酸塩基長を有するssDNAと;trans側でニュートラアビジンとの複合体形成に使用される3’ビオチン化リンカーとを含むdsDNA分子(59bp、表2)である。cis側でのスレッドとストッパの間の結合は、2の最初の16個の核酸塩基と、3の最後の25個の核酸塩基に相補的であるssDNA分子4を架橋することによって媒介される(表2、図12a)。3および4がtransコンパートメントに加えられる場合、−100mVで、DNAスレッドは細孔によって捕捉されるが、電位が+100mV(レベル2+100、IRES=0.77±0.04、n=4)に転換された際、細孔から放出されず、よってDNAロタキサンが形成されていることが示唆される(図12b)。興味深いことに、+100mVで、ロタキサンの残留電流は、cisまたはtrans擬スレッドのIRES値よりも高い(それぞれ、0.68±0.01および0.62±0.01)。このことは2のハイブリダイズしていないssDNA長がこの電位で細孔に及んでいる可能性があることを示唆している(図12b)。ロタキサンは、cisチャンバーに20mMのDTTを添加すると分解される可能性があり、その結果、2とClyAの間のジスルフィド結合は低下し、+100mVでの開口細孔電流が戻る(図12c〜12e)。
データは、ClyA−2が細孔の細孔内腔から非特異的DNAを排除することを示し、細孔に結合されているメッシュssDNA分子が連結されていないDNA移動のための立体的かつ/または静電気的障害を生じる可能性があることを示唆している。さらに、細孔に結合されているDNAは細孔内腔を塞ぐことが多く(図15c)、したがって、他のDNA分子の侵入を妨げる。特異的DNA分子がClyA−2にハイブリダイズされる場合、速やかなDNAの捕捉が正の印加電位で観察される。細孔に結合されているssDNAの濃度は、以前に約20mMであると推定されている21。したがって、細孔入口付近のdsDNAの濃度の増加によって、特異的DNA鎖の捕捉を促進することができる。この場合、ハイブリダイズしていない鎖2はさらに細孔に連結される可能性があり、その場合には、dsDNA構築物は細孔内腔に入るためにssDNA2と競合せざるを得ない。
正の高い印加電位で、ClyA−2ナノ細孔のイオン電流は開口細孔レベルと数種類の閉塞細孔レベルの間で変動した(図12c、図15および図16a)。このことは、細孔の頂部に連結されているssDNA分子はClyAの内腔に入るが、細孔のtrans側に永久的に通り抜けられないことを示唆している1c。さらにこの解釈が示唆されている;+100mVで、ClyA−CSのcis側にニュートラアビジンとの複合体の90量体ssDNA 5a(表2)を加え、引き続き等モル濃度の相補的ssDNA 5bを加えた場合(表2、図13)、長く継続するDNA移動事象に変換される一過性の電流遮断が生じた(図13)。ナノ細孔を通るDNAの移動は、細孔内腔の電荷分布をモジュレートすることによって26、27、または溶液のイオン強度を変化させることによって7c、28調整され得る閾値電位よりも上で観察されることが多い24−27。したがって、おそらく、その低い電荷密度および/または高い可撓性を理由に、これらの知見は、ssDNAがdsDNAよりもDNA移動に関して高い閾値を有することを示している(図13)。
ロタキサン構造において、ssDNA分子は、正の印加電位で細孔の全長に及び得る。これは、+100mVでは、ロタキサンのIRES値(0.77)が、細孔内に固定化されているdsDNAを有するcisおよびtrans擬ロタキサンのIRES値よりも高い(それぞれ0.68および0.62、図11cおよび図11d)という理由から想定される。さらに、I−V曲線の傾斜から計算されるロタキサンのユニタリコンダクタンス値は、正バイアス(13.0nS、図16)よりも正の印加電位(10.8nS)で低かった。ssDNAはdsDNA(B型構造ではd=2.2)よりも直径が小さいので(d=1nm)、これらの結果は、さらに、ssDNAは正バイアスで細孔を塞ぐことを示唆している。ssDNAが細孔に広がる能力をさらに調査するため、59核酸塩基対の3’ビオチン化dsDNAセクション、続いて5’末端の31核酸塩基のssDNA長によって形成されるDNAハイブリッド3の能力を、ClyA−CS細孔を通る移動能力について試験した。+100mVで、ClyA−CS細孔のcis側にニュートラアビジンとの複合体の3を加えると、IRES=0.67の長く継続する電流遮断が引き起こされ(図19)、それはcis−擬ロタキサンと同じIRESであった(0.68)。このことは、この電位で、DNAハイブリッドがClyAを通って移動し、dsDNAが細孔内腔に広がることを示唆している。3の移動はssDNA末端からしか開始されないことから、これらの結果は、+100mVで、ssDNA先導配列がClyAの内腔を移動することができることを示唆している。興味深いことに、+50mVおよび+70mVでは、電流遮断は単なる一過性であり(図19)、この電圧ではssDNAはClyA細孔を通過することができないことを示唆される。3の最後の12核酸塩基に相補的である鎖6を加えると、長く継続する電流遮断が+70mVで生じた(図19)。これは、DNA移動の閾値が低くなることを示唆する。
ClyAナノ細孔のスクリーニング
ClyAは、pT7プラスミドを使用することによって、E. cloni(登録商標)EXPRESS BL21(DE3)細胞(Lucigen)で発現させた。形質転換体は、5%ウマ血液(BBL(商標)、Becton, Dickinson and Company)を含んだブルセラ菌寒天培地で予備スクリーニングし、それぞれを増殖させ、96穴ウェルプレートで過剰発現させた。細胞溶解産物からのモノマーは、まず、ウマ赤血球(bioMerieux)上で溶血活性についてスクリーニングし、次いで、Ni−NTAアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。精製モノマーは、0.5%β−ドデシルマルトシド(GLYCON Biochemicals GmbH)12の存在下でオリゴマー化し、未変性ゲル電気泳動ゲルに装填してオリゴマー化をチェックした。次いで、ClyAオリゴマーの電気的特性を平面脂質二重層においてスクリーニングした。
ClyAは、pT7プラスミドを使用することにより、E. cloni(登録商標)EXPRESS BL21(DE3)細胞で発現させた。モノマーはNi−NTAアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、0.2%β−ドデシルマルトシド(GLYCON Biochemicals GmbH)の存在下でオリゴマー化した。
イオン電流は、ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(Avanti Polar Lipids、Alabaster、AL)から形成された平面二重層から記録することにより測定した。電流は、パッチクランプ増幅器(Axopatch 200B、Axon Instruments、Foster City、CA)18を使用し、Ag/AgCl電極により測定した。
ライブラリーは、T7プロモーターおよびT7ターミネータープライマーを使用して、プラスミドDNA由来のClyA遺伝子を増幅することにより構築した(表3)。第1の突然変異誘発ラウンドにおいて、本発明者らは、テンプレートとして腸チフス菌(Salmonella typhi)由来のClyA−SSをコードしている合成遺伝子含有のプラスミドを使用した。第2の突然変異誘発ラウンドから、本発明者らは、先の選択ラウンドに由来するDNAプラスミドを使用した。ClyA−SSにおいて、WT配列は、2個のCys残基(87位および285位)をSerで置換することにより、また、Gly−Ser−SerリンカーをコードしているDNAを結合させ、続いてC末端ヘキサヒスチジンタグ7aを結合させることにより修飾した。
システイン非含有ClyA変異体を含有するライブラリーを所持するため、4ClyA4をコードしている遺伝子(表2)を87NNSプライマー(完全なセットのアミノ酸をコードしている87位に縮重コドンを含有、表3)およびT7ターミネータープライマーを使用して増幅させた。PCR条件:約400ngのテンプレートプラスミドを含有する、最終容量0.3mLのPCRミックス(ReadyMix(商標))について、30回のサイクルを実施した(95℃で3分のプレインキュベーション、次いでサイクルの実施:95℃で15秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、72℃で3分の伸長)。得られたPCR産物は、4ClyA4サーキュラーテンプレートを使用して、MEGAWHOP手順によってpT7発現プラスミドへクローニングした(上記参照)。
ClyA−SS遺伝子は、87Cプライマーおよび285Cプライマーを使用して増幅させた(表3)。PCR条件:最終容量0.3mLのPCRミックス(150μlのREDTaq ReadyMix、6μMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、約400ngのテンプレートプラスミド)について、27回のサイクルを実施した(95℃で3分のプレインキュベーション、次いでサイクルの実施:95℃で15秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、72℃で3分の伸長)。得られたPCR産物は、ClyA−SSのサーキュラーテンプレートを使用して、上記のMEGAWHOP手順によってpT7発現プラスミドへクローニングした。
ClyA−SSは「検出ボーダー」溶血活性を示すので、変異誘発の最初の2ラウンドの間、ライブラリーは、5%ウマ血液を含むブルセラ寒天培地に対する活性のみをスクリーニングした。第3の選択ラウンドからは、過剰発現後の粗製溶解産物から得たブルセラ寒天培地上で溶血活性を示すコロニーに対し、ウマ赤血球上での溶血活性についてさらにスクリーニングした。この研究の目的は、β−ドデシルマルトシド(DDM)中で十分にオリゴマー化され、脂質二重層において電気的ノイズが低く、ユニタリコンダクタンスが均一であるナノ細孔を形成するClyA変異体を得ることであった。したがって、溶血活性単独のスクリーニングは、こうした変異体を選択する唯一の基準として有用ではなかった(例えば、WT−ClyAは非常に溶血作用的に活性であるが、非均一的な単位電流分布を示す)。このため、第4のラウンドから、粗製溶解産物からのタンパク質はNi−NTAアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ClyAのオリゴマー化はDDMでのインキュベーション後にBN−PAGEで試験した。次いで、十分にオリゴマー化したClyAナノ細孔を(高い印加電位において、形成されたチャネルの均一性、低電気ノイズおよび安定性に対して特定の応力を有する)平面脂質二重層において試験した。
プラスミドDNAをE.cloni(登録商標)EXPRESS BL21(DE3)細胞(Lucigen)にエレクトロポレートした後、100μg/mlアンピシリンを補充した5%ウマ血液(BBL(商標)、Becton、Dickinson and Company)を含むブルセラ寒天培地上で形質転換体を予備スクリーニングした。37℃で終夜増殖させた後、コロニー周囲の細胞溶解兆候によって確認された溶血活性を示すクローンは、37℃で終夜振盪することにより、96穴ウェルプレート(100μg/mLアンピシリンを含有する0.5mL 2×YT培地)でそれぞれ増殖させた。得られた培養物は、次のラウンド(ラウンド1および2)でテンプレートとして機能するプラスミドDNA(QIAprep、Qiagen)を調製するためにプールするか、タンパク質過剰発現(ラウンド3〜5)のスターターとして使用した。
ラウンド3〜5:400〜600個のクローンから得たスターター培養物50μl(上記参照)を新しい96穴ウェルプレート中の新鮮な培地450μlに接種し、OD600〜0.8まで37℃で培養物を増殖させた。次いで、IPTG(0.5mM)を加えて過剰発現を誘導し、その温度は終夜のインキュベーションの間に25℃まで下げた。翌日、細菌を4℃で3000×gにて15分間遠心分離を行って回収し、上清を廃棄し、ペレットを数時間−70℃でインキュベートし細胞破壊を促進した。次いで、ペレットを溶解バッファー(15mM Tris.HCl、pH7.5、150mM NaCl、1mM MgCl2、10μg/mlリゾチームおよび0.2単位/mL DNAse I)0.3mLに再懸濁し、37℃で30分間、1300RPMで振盪することにより溶解させた。次いで、5〜30μLの溶解産物を約1%のウマ赤血球懸濁液100uLに添加した。後者を、4℃で6000×gにて5分間、ウマ血液(bioMerieux)を遠心分離にかけることにより調製し、ペレットを15mM Tris.HCl pH7.5、150mM NaClに再懸濁した(上清が赤色を呈した場合、再度、溶液を遠心分離にかけ、ペレットを同一バッファー中に再懸濁した)。溶血活性は、経時的に650nmでのODの低下をモニターした(約3〜10分間隔、Multiskan GO Microplate Spectrophotometer、Thermo Scientificを使用して測定)。クローンの溶血活性は、基準と同じプレートで増殖させた、前のラウンドから得た2〜4個の親クローンの活性と比較した。
ラウンド4:最も溶血作用的に活性のある変異体の6〜12種は同じ溶解産物から部分的に精製し、Ni−NTAアフィニティークロマトグラフィーを使用することによりこれを溶血活性のスクリーニングに使用した:モノマーClyAを含有する粗製溶解産物0.2mLは、15mM Tris.HCl pH7.5、(ClyAオリゴマー化誘発用)1%DDMおよび10mMイミダゾールを補充した150mM NaClで1mLにし、周囲温度で20分間インキュベートし、4℃で10分間、20,000×gの遠心分離にかけた。清澄化溶解産物を20μL(ビーズ容量)のNi−NTAアガロースビーズ(Qiagen)に、1時間、4℃で穏やかに混合することによって結合させた。未結合画分は、4℃で10分間、20,000×gの遠心分離を行い除去した(上清の廃棄)。最後に、オリゴマー化したClyAタンパク質は、600mMイミダゾールを含む15mM Tris.HCl pH7.5、150mM NaCl 0.2%DDMの50μLで溶出した。典型的には、40μgのClyAに、約10%グリセロールおよび1×NativePAGE(商標)泳動バッファーおよび1×陰極バッファー添加剤(Invitrogen(商標))を補充し、次いで、BN−PAGEに装填した(図7)。次いで、BN−PAGEでオリゴマーを形成した変異体を、(形成されたチャネルの均一性に対して特定の応力を有する)平面脂質二重層において試験した。
E. cloni(登録商標)EXPRESS BL21 (DE3)細胞をClyA遺伝子含有pT7プラスミドで形質転換した。形質転換体は、100mg/Lアンピシリンを補充したLB寒天平板で終夜37℃にて増殖させた。得られたコロニーをまとめてプールし、100mg/Lのアンピシリンを含有するLB培地50mLに接種した。培養物は、OD600が0.6〜0.8に達するまで、200rpmで振盪しながら37℃で増殖させた。次いで、ClyAの発現は0.5mMのIPTGを添加することによって誘導し、増殖を20℃で継続した。翌日、細菌を10分間、6000×gの遠心分離により回収し、ペレットを−70℃で保存した。
13量体および14量体のClyAナノ細孔は、以下のように、12量体の結晶構造(PDBコード:2WCD)からモデル化した。中心軸は12量体の長さによって構築し(ax12)、細孔のおおよその半径(r12)を呈するモノマーAの残基114のC−アルファ原子(114Ca−A)とax12の間の距離を測定した。114Ca−AとモノマーB中の同等の原子(114Ca−B)間の距離(d)を使用して、12量体(c12=dx12)、13量体(c13=dx13)および14量体(c14=dx14)のおおよその円周を計算した。次いで、3つのオリゴマーの半径(r12、r13およびr14)を、簡易な三角法を使用して円周から計算した。次いで、12量体、13量体および14量体をそれぞれ距離r12、r13およびr14にモノマーを置くことにより中心軸から構築し、また、それぞれ、360°/12、360°/13および360°/14の角度に対して回転させた。この方法を使用して構築された12量体は、高次の細孔を構築する高度の対称性および実現可能性を示す、12量体のX線の結晶構造を完全に再現した(RMS=0.29Å)20。
印加電位はtrans電極の電位を意味する。ClyAナノ細孔は、グラウンドに接続されたcisコンパートメントから脂質二重層に挿入された。2つのコンパートメントは、直径約100μmの開口部を含む25μm厚のポリテトラフルオロエチレンフィルム(Goodfellow Cambridge Limited)によって分離させた。開口部は10%のヘキサデカンを含むペンタン約5μLで前処理し、二重層は、両電気生理学的チャンバーに1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DPhPC)を含むペンタン(10mg/mL)約10μLを添加することによって形成した。典型的には、単一チャネルを得るには、cisコンパートメント(0.5mL)に0.01〜0.1ngのオリゴマーClyAを添加することで十分であった。電気的記録は、150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH7.5において実施した。記録するチャンバーの温度は、チャンバーの底部および側面と直接接触している金属製ケースを通って循環する水によって28℃に維持した。
平面二重層記録からの電気的シグナルはAxopatch 200Bパッチクランプ増幅器(Axon Instruments)を使用することにより増幅し、Digidata 1440 A/Dコンバーター(Axon Instruments)でデジタル化した。データはClampex 10.2ソフトウェア(Molecular Devices)を使用することにより記録し、その後の分析はClampfitソフトウェア(Molecular Devices)を用いて行った。開口細孔電流およびHT遮断は、特段の記載がない限り、10kHzのローパスベッセルフィルタを適用し、50kHzでサンプリングすることにより記録した。ユニタリチャネルコンダクタンス分布データを収集するため、トレースは、カットオフが200Hzのガウスローパスフィルタを用いてさらにデジタル的に選別した。開口細孔電流は、細孔が正確な方向で挿入されることを確実にするため(cis側から再構築された場合、ClyAのユニタリコンダクタンスは正の印加電位でより高い)+35および−35mVでのすべての挿入チャネルについて決定し、−35mVに対応する値を使用して分布を構築した。ClyAに関する開口細孔電流値(IO)とHTに関する閉塞細孔電流値(IB)は、全点のヒストグラムに適合するガウスから計算した(0.3pA binサイズ)3。HTおよびBT遮断に関するヒストグラムは、少なくとも10の電流遮断から、少なくとも0.5秒の長さで作成した。残留電流値(IRES)は次のように計算した:IRES%=IB/IO%。HTが同じ遮断で2つの電流レベルを生じた場合、それらの相対的寄与率(図4b、表1)は全点のヒストグラムに適合するガウスから得られるピークの面積から推定した3。HT遮断持続時間は、単一指数関数に少なくとも50の事象での遮断滞留時間の累積分布をあてはめることによって計算した3。−5から−20mVまで、HT遮断持続時間は、3ステップからなる周期的掃引電圧プロトコルを適用することにより測定した。第1の「捕捉」ステップにおいて、印加電位は、2秒間、−60mVに設定した。第2の「放出」ステップにおいて、印加電位は、2〜10秒で、HTが細孔から放出される目的の電圧まで(−5〜−20mV)低下した。最後に「再生」ステップにおいて、電位は、0.2秒の間+35mVまですぐに逆転し、新しい非閉塞の開口細孔状態が再生成された。少なくとも50の曲線を平均し、放出ステップに対応するトレースの部分を単一指数関数にあてはめた。時折レベル1電流およびレベル2電流の両方を示したFP遮断期間(滞留時間)は、二桁にわたって分布しており、指数関数と十分に一致していなかった。したがって、平均滞留時間はFPに関して示す。トレースは、5kHzで設定した内部ローパスベッセルフィルタにより20kHzのサンプリングレートで記録した。測定は、150mM NaCl、15mM Tris.HCl、pH7.5で実施した。グラフはOrigin(OriginLab Corporation)で作成し、温度は28℃に設定した。この研究で示した値はすべて、別段の定めがない限り、少なくとも3つの個別の記録の平均に基づいている。
DNAの調製
ssDNA分子は、Integrated DNA Technologies(IDT)から購入した。1は、2つのプライマーの1つが5’ビオチン化されているPCRによって調製した。3は、1つが3’末端でビオチン部分を含有している、2つの相補的ssDNA分子をインキュベートすることにより形成した。次いで、DNAハイブリッドは、アフィニティークロマトグラフィーによって過剰ssDNAから精製した。5および6は、IDTによって精製されたHPLCであった。
ClyAは、pT7プラスミドを使用することにより大腸菌(E. coli)(DE3)pLysS細胞で発現させた。C末端オリゴ−ヒスチジンタグを含有するモノマーは、大腸菌(E. coli)細胞で発現させ、可溶性画分はNi−NTAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ClyA十二量体は0.2%β−ドデシルマルトシド(DDM)を添加することによって形成し、ブルー未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってモノマーから分離させた。オリゴマーClyA−CSの最も低いバンドを抽出し、4℃で保存した。
1は、REDTaq(登録商標)ReadyMix(商標)PCR反応ミックス(Sigma)製のTaq DNAポリメラーゼを用い、5’ビオチン化フォワードプライマー(bio−5’TAATACGACTCACTATAGGG−3’)と非ビオチン化リバースプライマー(5’−CATCAGCAGCACTTTGATATCGCCCACC−3’)を使用し、pT7−ClyA−WT DNAテンプレートのPCR増幅によって作製した。最大35サイクルの後に、24本の反応チューブ(各々のチューブ、50μL)のPCR産物を、PCRクイック精製キット(QIAGEN)を使用して精製し、構築物のサイズは2%アガロースゲル(TAEバッファー)を使用してチェックした。典型的な試料濃度は約200ng/Lであった。
他に規定のない限り、シグナルは、10kHzのベッセルフィルタを使用して、50kHzのサンプリングレートで収集した。脂質二重層は、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DphPC)を含むペンタン(w/v)の10%溶液1〜2μLの添加によって形成させた。電位は、寒天ブリッジ(2.5MのNaClバッファー中3%w/vの低溶解アガロース)中に沈めたAg/AgCl電極の使用により加えた。印加電位は、チャンバーのtransコンパートメントに接続された作用電極の電位を意味する。ClyAナノ細孔溶液(0.01〜0.1ng)は、外側電極に接続されたcisコンパートメントに加えた。単一チャネルを挿入した後、過剰タンパク質は数サイクルの潅流により除去した。電気的記録は、2.5M NaCl、15mM Tris.HCl pH8.0中、22℃で実施した。誤差は、文字nで示している、少なくとも3つの独立した反復の平均からの標準偏差を示す。
本明細書に記載の全ての刊行物および特許は、それぞれの刊行物または特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれることを示したかのように、本明細書にその全体を参考して援用する。矛盾する場合、本明細書中のあらゆる定義を含む本出願が規制する。
本発明の特定の実施形態を論じてきたが、上記明細書は例示であって、限定するものではない。本発明の多くの変更は、当業者によって、本明細書および以下の特許請求の範囲が検討された際に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲とそれらの完全な均等物の範囲、および明細書を、そのような変更を含めて参照することによって決定しなければならない。
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Claims (15)
- 複数のサブユニットを含む修飾ClyA細孔であって、
それぞれのサブユニットが配列番号1と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列によ
って表されるポリペプチドを含み、
(i) 配列番号1の厳密に1個のCys残基がAlaで置換されており、
(ii) 配列番号1の厳密に1個のCys残基がAlaで置換されており、配列番号1の厳密に1個のCys残基がSerで置換されており、または
(iii) 配列番号1の厳密に1個のCys残基がSerで置換されており、かつ、配列番号1のL99、E103、F166およびK294の1個またはそれ以上が他のアミノ酸残基に置換されており、
配列番号1の厳密に1個のCys残基が、C87またはC285であり、
前記ポリペプチドは、配列番号1のC87およびC285の両方がSerで置換されているポリペプチドではない、
修飾ClyA細孔。 - Alaで置換された前記Cys残基がC87であり、および/またはSerで置換され
た前記Cys残基がC285である、請求項1に記載の修飾ClyA細孔。 - それぞれのサブユニットが、
(i) L99Q、E103G、F166YおよびK294Rから選択される少なくとも1個の追加アミノ酸置換、
(ii) 配列番号1のI203における追加のアミノ酸置換I203V、ならびに/または
(iii) 配列番号3のアミノ酸配列によって表されるポリペプチド
を含む、請求項1または2に記載の修飾ClyA細孔。 - 修飾ClyA細孔が、
(i)少なくとも12個のサブユニットを含み、(ii)12個のサブユニットを含み、(iii)
13個のサブユニットを含み、(iv)少なくとも3.5nmのcis直径を有し、(v)少な
くとも6nmのtrans直径を有し、または(vi)前記修飾ClyA細孔を通る電圧が+
90から−150mVの範囲である場合、開口したままである、請求項1から3のいずれ
か一項に記載の修飾ClyA細孔。 - 核酸を移動させるための、請求項1から4のいずれか一項に記載の修飾ClyA細孔の
使用。 - (i)複数のサブユニットを含む修飾ClyA細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号1と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、配列番号1の厳密に1個のCys残基がSerで置換されており、および/または配列番号1の厳密に1個のCys残基がAlaで置換されている、修飾ClyA細孔、ならびに
(ii)選択的結合特性を有するリガンド
を含み、
配列番号1の厳密に1個のCys残基が、C87またはC285であり、
前記ポリペプチドは、配列番号1のC87およびC285の両方がSerで置換されているポリペプチドではない、
ナノ細孔バイオセンサー。 - 前記修飾ClyA細孔が、請求項2から4のいずれか一項において定義されるものであ
る請求項6に記載のナノ細孔バイオセンサー。 - リガンドが、(i)アプタマー、抗体、レセプター、もしくは標的タンパク質に結合する
ペプチド、または(ii)標的タンパク質の前記修飾ClyA細孔への結合を阻害する、標的
タンパク質の阻害剤である、請求項6又は7に記載のナノ細孔バイオセンサー。 - タンパク質を検出するための、請求項1から4のいずれか一項に記載の修飾ClyA細
孔、または請求項6から8のいずれか一項に記載のナノ細孔バイオセンサーの使用。 - 前記タンパク質が、(i)前記修飾ClyA細孔の内腔内に結合する、(ii) 前記修飾Cl
yA細孔の内腔内の複数の部位に結合する、および/または(iii)15〜70kDaの範
囲の分子量を有する、請求項9に記載の使用。 - 試料中の少なくとも1つのタンパク質分析物の存在を検出する方法であって、
(a)複数のサブユニットを含む修飾ClyA細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号1と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、配列番号1の厳密に1個のCys残基がSerで置換されており、および/または配列番号1の厳密に1個のCys残基がAlaで置換されている、修飾ClyA細孔、または修飾ClyA細孔を含む請求項6から8のいずれか1項に記載のナノ細孔バイオセンサーと、試料とを接触させるステップであって、
配列番号1の厳密に1個のCys残基が、C87またはC285であり、
前記ポリペプチドは、配列番号1のC87およびC285の両方がSerで置換されているポリペプチドではない、ステップと、
(b)修飾ClyA細孔を横切って電位を加えるステップと、
(c)修飾ClyA細孔を介して通る電流を測定するステップと、
(d)測定された電流を基準電流と比較するステップとを含み、基準電流に対する電流の変化は、試料中にタンパク質分析物が存在することを示す、
前記方法。 - 前記修飾ClyA細孔が、請求項2から4のいずれか一項において定義されるものであ
る請求項11に記載の方法。 - 修飾ClyA細孔を通ってDNAを移動させる方法であって、
(a)複数のサブユニットを含む修飾ClyA細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号1と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、配列番号1の厳密に1個のCys残基がSerで置換されており、および/または配列番号1の厳密に1個のCys残基がAlaで置換されている、修飾ClyA細孔を提供するステップであって、
配列番号1の厳密に1個のCys残基が、C87またはC285であり、
前記ポリペプチドは、配列番号1のC87およびC285の両方がSerで置換されているポリペプチドではない、ステップと、
(b)修飾ClyA細孔を横切る少なくとも+50mVの電圧を加えるステップと、
(c)修飾ClyA細孔のcis開口部にDNA含有試料を加えるステップと、
(d)細孔を通る流動電流を測定するステップと
を含む、前記方法。 - (i)DNAが二本鎖DNAであり、(ii)電流遮断はDNAの移動を示し、(iii)修飾Cl
yA細孔は、高イオン強度の条件下で使用され、または(iv)前記修飾ClyA細孔が、請
求項2から4のいずれか一項において定義されるものである、請求項13に記載の方法。 - DNAを移動させるためのデバイスであって、
第1のチャンバーへの膜によって分離されている液体を充填したコンパートメントと、
膜を横切って電位を加えることができる電極と、
膜に挿入された、複数のサブユニットを含む1以上の修飾ClyA細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号1と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、配列番号1の厳密に1個のCys残基がSerで置換されており、および/または配列番号1の厳密に1個のCys残基がAlaで置換されている、修飾ClyA細孔と、
1つのチャンバー内の高イオン強度の溶液
とを含み、
配列番号1の厳密に1個のCys残基が、C87またはC285であり、
前記ポリペプチドは、配列番号1のC87およびC285の両方がSerで置換されているポリペプチドではなく、
DNAは1以上の修飾ClyA細孔を通って第1のチャンバーから第2のチャンバーへ移動する、
前記デバイス。
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