EP1208207A2 - Verfahren zur herstellung eines kanalbildenden proteins - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines kanalbildenden proteins

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EP1208207A2
EP1208207A2 EP00969208A EP00969208A EP1208207A2 EP 1208207 A2 EP1208207 A2 EP 1208207A2 EP 00969208 A EP00969208 A EP 00969208A EP 00969208 A EP00969208 A EP 00969208A EP 1208207 A2 EP1208207 A2 EP 1208207A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
channel
mspa
protein
forming protein
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00969208A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Niederweis
Stefan Bossmann
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1208207A2 publication Critical patent/EP1208207A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)

Definitions

  • the invention relates to a method for producing a channel-forming protein, a channel-forming protein, a gene coding for such a protein and a mutated mspA, mspC or mspD gene, a plasmid vector and an overexpression system.
  • the invention relates generally to the technical field of manufacturing nanostructures.
  • the best characterized nanostructures so far include carbon nanochannels (Yakobson, BI and Smalley, RE Fullerene nanotubes: c l, 000, 000 and beyond. Am Sei 85, 324, 1997). With coal ⁇ fabric nanochannels could be shown that the electronic properties are controlled by their structural details. Carbon nanochannels are synthesized using various variants of CVD (chemical vapor deposition) (Fan, S., Chapline, MG, Franklin, NR, Tombier, TW, Cassell, AM and Dai, H. Self-oriented regular arrays of carbon nanotubes and their field emission properties. Science 283, 512-4, 1999) and is therefore very complex.
  • CVD chemical vapor deposition
  • Mycobacteria belong to a subgroup of Gram-positive bacteria which have mycolic acids and which include the genera Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Gordona, Tsukamurella, Dietzia. Trias, J. and Benz, R. Permeability of the cell wall of Mycobacterium smegmatis. Mol Microbiol 14, 283-290 (1994) describe channel-forming proteins, namely porins, in the mycolic acid layer of mycobacteria. No biochemical or molecular genetic data on these porins have been published to date.
  • J Bacteriol 180, 3541-3547 (1998) the expression of a gene for a porin-like protein from Mycobacteri - um tuberculosis H37Rv in E. coli is known. Expression of the gene causes bacterial growth to stop because the expressed protein is apparently toxic to E. coli. Only small amounts of the protein from E. coli can be isolated shortly before the cells die.
  • the object of the invention is to provide an improved method for producing a channel-forming protein.
  • a method for producing a channel-forming protein occurring in Gram-positive bacteria is provided, the channel-forming protein being obtained by
  • the channel-forming proteins are proteins that can form a water-filled channel or a water-filled channel-like structure. Such proteins occur naturally, especially in the cell wall of bacteria. You can use channel-like structures or channels with a diameter of up to 3 n and even more. The length can be up to 10 nm and more.
  • the channel-like structures or channels can be formed from several, in particular four or eight, subunits.
  • the method according to the invention is much more efficient than the previously described methods, offers the possibility of extensive automation of the chromatographic purification and enables a drastically increased yield.
  • the Gram-positive bacterium can be a bacterium containing at least one mycolic acid.
  • the bacterium is a mycobacterium, preferably Mycobacterium smegmatis.
  • the channel-forming protein can be a porin.
  • a porin is preferred which is essentially chemically stable with respect to organic solvents and / or is thermally stable up to a temperature of 80 ° C., preferably 100 ° C. Stable means that the channel-like structure of the protein is preserved and essentially no denaturation of the protein takes place.
  • the porin is preferably MspA, MspC, MspD, a fragment of these porins, a protein homologous to these porins or their fragments, or a protein derived from a sequence of these porins.
  • MspA has the sequence of amino acids 28-211 of sequence 3 (see below)
  • MspC has sequence 7
  • MspD has sequence 9.
  • the protein homologous to said porins or their fragments has a structure similar to these porins or fragments. At least 20% of the amino acids are identical or homologous to the amino acids of these porins or fragments.
  • An amino acid in one protein is homologous to another amino acid if it can be replaced by the other amino acid without the function or structure of the protein being significantly affected thereby.
  • one or more amino acids may be missing or replaced by other amino acids or amino acid analogs compared to these sequences.
  • the proteins mentioned are particularly suitable for the production of nanostructures.
  • a good yield is achieved if the heterologous overexpression is carried out in E. coli or mycobacteria.
  • a gene coding for a channel-forming protein, preferably a porin, is expediently used for overexpression. It is also advantageous that an mspA gene according to sequence 1 (see below), an mspC gene according to sequence 6 or an mspD gene according to sequence 8 is used for overexpression.
  • a mutated gene derived from sequences 1, 6 or 8 can also be used for overexpression, the mutation being designed such that the chemical and thermal stability and the channel-like structure of the expressed protein essentially match those of MspA, MspC or MspD. speaks.
  • the mutation can also consist essentially in an adaptation of the codons of the mspA gene, the mspC gene or the mspD gene to the codons of the genes highly expressed in E. coli.
  • Such codons are from Nakamura, T. et al. , Two types of linkage between codon usage and gene-expression levels. FEBS Lett. 289, 123-125 (1991).
  • a mutated mspA, mspC or mspD gene can also be used for overexpression, the mutation essentially is that the GC content is reduced to less than 66%. Adjusting codon usage significantly improves overexpression of MspA, MspC and MspD in E. coli.
  • the yield can be increased again by a factor of 10 to 20 compared to the process for preparing the native protein described above.
  • synmspA gene according to sequence 4 it has proven to be advantageous to use the synmspA gene according to sequence 4 for overexpression.
  • a vector suitable for overexpression in E. coli in which the synmspA gene according to sequence 4 is inserted can be used for this purpose.
  • suitable vectors are e.g. by Hannig, G. and Makrides, S.C. in Trends in Biotechnology, 1998, Vol. 16, pp54. The disclosure content of this document is hereby incorporated.
  • the detergents can be selected from the following group: isotridecyl poly (ethylene glycol ether) s , alkyl glucosides, especially octyl glucoside, alkyl maltosides, especially dodecyl maltoside, alkyl thioglucosides, especially octyl thioglucoside, octyl polyethylene oxide and lauryl oxide dimethyl.
  • CMC critical micellar concentration
  • a phosphate buffer 100 mM Na 2 HP0 4 / NaH 2 PO 4 , pH 6.5, 150 mM NaCl.
  • the zwitterionic and non-ionic detergents release the channel-forming protein MspA very selectively and with good yield from the cell wall of M. smegmatis.
  • the temperature during the extraction is between 80 and 110 ° C., preferably between 90 and 100 ° C., and / or the extraction time is 5 to 120 minutes, preferably 25-35 minutes. It is also advantageous to use a buffer with an ionic strength of more than 50 mM NaCl or Na phosphate.
  • MspA for purification in dimethyl sulfoxide at a temperature in the range from 50 to 110 ° C .; the solution can then be separated from the residue and MspA can be precipitated by cooling.
  • the channel-forming protein is advantageously precipitated for purification, in particular using acetone. This can lead to an accumulation of the channel-forming protein compared to non-precipitating proteins. Furthermore, it is advantageous to subject the protein to purification by ion exchange chromatography, in particular anion exchange chromatography. For further purification The channel-forming protein can then be subjected to size exclusion chromatography.
  • the channel-forming protein obtained by heterologous overexpression can be renatured by increasing the local concentration of the channel-forming protein.
  • the local concentration can be increased by electrophoretic enrichment, in particular by applying a DC voltage, by precipitation or by adsorption on a surface, in particular a membrane. It is expedient to apply a DC voltage in the range of 50 V for a time of approximately 30 minutes.
  • the invention further relates to a channel-forming protein from a Gram-positive bacterium produced by the method according to the invention.
  • the Gram-positive bacterium can be a bacterium containing mycolic acid, the bacterium expediently being a mycobacterium, preferably Mycobacterium smegmatis.
  • the channel-forming protein is a porin that is essentially chemically stable to organic solvents.
  • the porin is preferably substantially thermally stable up to a temperature of 80 ° C, preferably 100 ° C. It can be the porin MspA, MspC, MspD, a fragment of these porins, a protein homologous to these porins or their fragments, or a protein derived from the sequence of these porins.
  • the chemical and thermal stability and the channel-like structure of the derived protein can essentially correspond to that of the MspA, MspC or MspD proteins. But it is also conceivable that other porins not mentioned here have these properties and are thus included in the subject matter of the present invention.
  • aaa Insofar as the channel-forming proteins are contained in the cell wall of M. smegmatis, they can be dissolved in organic solvents (eg CHCl 3 / MeOH) without denaturing. The ability to form channels remains in organic solvents.
  • organic solvents eg CHCl 3 / MeOH
  • a gene coding for a channel-forming protein according to the invention is also claimed.
  • This can be the mspA gene according to sequence 1, the mspC gene according to sequence 6 or the mspD gene according to sequence 8.
  • a mutated mspA gene, mspC gene or mspD gene also comes into consideration, the mutation essentially being an adaptation of the codons of the mspA gene, of the spC gene or of the mspD gene to the codons of the genes highly expressed in E. coli.
  • the mutation can consist essentially in that the GC content is less than 66% is reduced.
  • the mutated gene can also be derived from one of the sequences 1, 6 or 8 and be designed such that the chemical and thermal stability and the channel-like structure of the expressed protein essentially correspond to that of MspA, MspC or MspD.
  • Other mutations not mentioned here are also conceivable for the person skilled in the art.
  • Genes which lead to the formation of the channel-like proteins according to the invention are included in the scope of protection claimed.
  • a mutated mspA gene, the mutated gene being the synmspA gene according to sequence 4 (see below).
  • Another object of the invention is the plasmid vector pMN501 and an overexpression system in which E. coli contains this plasmid vector.
  • 5 shows a schematic view of a device for renaturation
  • 6 shows a renatured MspA in gel electrophoretic representation
  • sample buffer 40 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane, pH 7.0, 3% SDS, 8% glycerol, 0.1% Serva Blau G
  • gel-electro- phoretically separated according to their size 40 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane, pH 7.0, 3% SDS, 8% glycerol, 0.1% Serva Blau G
  • Figures la-c show proteins extracted from M. smegmatis at different temperatures.
  • Fig. La shows a 10% SDS polyacrylamide gel stained with Coomassie blue.
  • Lane M mass standard with 200, 116.3, 97.4, 66.3, 55.4, 36.5, 31, 21.5 and 14.4 kDa.
  • Lanes 1 to 8 12 ⁇ l each of extracts obtained at 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100 ° C.
  • Fig. Lb shows an Unoblot of an 8% SDS polyacrylamide gel on a PVDF membrane.
  • the proteins were visualized using a rabbit antiserum directed against MspA and a chemiluminescence reaction (ECL detection system, Amersham-Pharmacia, Vienna, Austria).
  • Lane M mass standard with 97.4, 68, 46, 31, 20.1 and 14.4 kDa.
  • Lanes 1 to 3 2 ⁇ l each of an extract obtained at 30, 40 or 50 ° C.
  • Lanes 4 to 8 1 ⁇ l each of an extract obtained at 60, 70, 80, 90 or 100 ° C.
  • Lane 9 1 ng MspA.
  • Fig. Lc shows an 8% SDS-polyacrylamide gel stained with silver.
  • Lane M mass standard with 200, 116.3, 97.4, 66.3, 55.4, 36.5, 31, 21.5 and 14.4 kDa.
  • Lane 1 and 2 15 ⁇ l each of an extract obtained at 30 or 40 ° C.
  • Lane 3 10 ⁇ l of an extract obtained at 50 ° C.
  • Lanes 4 to 8 4 ⁇ l each of an extract obtained at 60, 70, 80, 90 or 100 ° C.
  • Lane 9 shows 270 ng of purified MspA.
  • Lane 2 shows a 10% SDS polyacrylamide gel stained with Coomassie Blue.
  • Lane M mass standard: 200, 116.3, 97.4, 66.3, 55.4, 36.5, 31, 21.5 and 14.4 kDa.
  • Lane 1 40 ⁇ g of protein from M. smegmatis with POP05 buffer (100 mM Na 2 HP0 4 / NaH 2 P0 4 , pH 6.5, 0.1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5% octyl polyethylene oxide (OPOE)) extract obtained.
  • Lane 2 40 ⁇ g protein from the extract after precipitation with acetone.
  • Lane 3 4 ⁇ g protein from combined MspA-containing fractions of an anion exchange chromatography.
  • Lane 4 4 ⁇ g protein of the MspA-containing fractions after precipitation with acetone.
  • Lane 5 4 ⁇ g protein from combined MspA-containing fractions after size exclusion chromatography.
  • the sequences of the mspA gene, the mspA gene + promoter and the MspA protein with suspected signal sequence are shown in the sequence listing as sequences 1 - 3.
  • FIG. 5 schematically shows a device for renaturing monomeric MspA.
  • a pencil lead (type: Eberhard Faber, 3H) was shortened to a length of 5 cm.
  • a polypropylene tube without a lid was filled with 60 ⁇ l of a solution with 5 ⁇ g denatured MspA and the pipette tip and the pencil lead were placed in the solution. Then the pipette tip was connected as a cathode and the pencil lead as an anode.
  • Figure 6 shows the renaturation of denatured MspA.
  • the proteins were separated with a 10% SDS-polyacrylamide gel according to Shugger (Schägger, H. and von Jagow, G. Tricinosodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the Separation of proteins in the ranks from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 166: 368-79 (1987)).
  • the gel was stained with silver.
  • Lane M mass standard: 116, 97, 66, 55, 36.5, 31, 21.5, 14.4 kDa
  • Lane 1 800 ng denatured MspA.
  • Lane 2 800 ng MspA after the renaturation reaction.
  • the samples were incubated at 37 ° C for 30 minutes before being applied to the gel.
  • 7a to 7c show electron micrographs of modifications of the channel protein MspA from M. smegmatis.
  • c (MspA) 17.2 x 10-9 mol / L, 100 mM Na 2 HP0 4 / NaH 2 P0 4 , pH 6.5,
  • Isolated channel proteins are present in FIG. 7a.
  • a band structure can be seen in FIG. 7b, which has large pores with a diameter of 12 nm.
  • Fig. 7c it can be seen that the ribbon structure has two types of channels, namely first channels with a small diameter of approximately 2.4 nm and second channels with a larger diameter of approximately 9.0 to 10.0 nm.
  • Example 1 Extraction of MspA from M. smegmatis at different temperatures
  • the volume of the supernatant was reduced by evaporation from 120 to 10 ul.
  • the proteins were separated by size by gel electrophoresis, as shown in Figures la-c.
  • the proportion of MspA in the total protein extracted increases significantly at temperatures above 50 ° C. Other proteins are hardly extracted at these temperatures.
  • the precipitated protein was dissolved in 10 ml of 25 mM AOP05 (N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (Hepes), pH 7.5, 10 mM ⁇ aCl, 0.5% OPOE) and on an anion exchanger Column POR ⁇ S 20HQ with a volume of 1.7 ml (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA). After washing the column with 14 ml of AOP05, bound proteins were eluted with a gradient of 100% AOP05 to 100% BOP05 (25 mM Hepes, pH 7.5, 2 M NaCl, 0.5% OPOE) over 34 ml.
  • AOP05 N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid
  • BOP05 25 mM Hepes, pH 7.5, 2 M NaCl, 0.5% OPOE
  • MspA eluted between 0.48 and 0.74 M NaCl with a peak at 0.57 M NaCl.
  • the 4 fractions with the highest amount of MspA were pooled and precipitated with acetone.
  • the resulting pellet was taken up in 600 ul AOP05, incubated on ice and centrifuged at 4 ° C for 5 minutes to remove insoluble material.
  • the resulting protein solution was applied to a Superdex 200 gel filtration column with a volume of 24 ml (Pharmacia, Freiburg, Germany). Proteins were eluted with 48 ml AOP05 at a flow rate of 0.2 ml / minute.
  • Example 3 Process for the preparation of the channel protein MspA from E. coli To further increase the yield of MspA, an overexpression of the corresponding gene is proposed. First the mspA gene is cloned, which codes for the channel protein MspA from Mycobacterium smegmatis mc 155. The T7 expression system for the overexpression of the mspA gene is chosen.
  • the mspA gene is amplified from the plasmid pPOR6 via PCR.
  • all codons are changed that rarely occur in highly expressed genes from Escher ichia coli.
  • sequence listing see below, all introduced mutations are listed in sequence 4.
  • This DNA, called synmspA is made according to the method of Stemmer (Stemmer, WP, Crameri, A., Ha, KD, Brennan, TM and Heyneker, HL Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides.
  • Example 5 Electrochemical assembly of the channel protein MspA
  • the renaturation can take place in an apparatus developed for this purpose (FIG. 5).
  • the renaturation reaction is carried out with 5 ⁇ g MspA in monomeric form in this reaction apparatus by applying a voltage of 50 V for
  • the protein is examined in a protein gel after the renaturation reaction described above (FIG. 6). It turns out that a large part of the protein is assembled into oligomeric units. Reconstitution experiments can show that the MspA again has high channel activity in this form. This proves that the renaturation of MspA is possible with low DC voltages.
  • This renaturation reaction is very easy to carry out and is therefore an important part of the preparation of functional channel protein MspA from overproducing E. coli.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines in Gram-positiven Bakterien vorkommenden kanalbildenden Proteins, wobei das kanalbildende Protein gewonnen wird durch a) heterologe Überexpression oder b) Aufreinigung aus Mycobakterien, wobei die Extraktionstemperatur mehr als 50°C beträgt.

Description

Verfahren zur Herstellung eines kanalbildenden Proteins
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines kanalbildenden Proteins, ein kanalbildendes Protein, ein Gen codierend für ein solches Protein und ein mutiertes mspA- , mspC- oder mspD- Gen, einen Plasmidvektor und ein Überexpressionssystem.
Die Erfindung betrifft allgemein das technische Gebiet der Herstellung von Nanostrukturen. Zu den bisher am besten charakterisierten Nanostrukturen gehören Kohlenstoff-Nanokanäle (Yakobson, B. I. und Smalley, R. E. Fullerene nanotubes : cl, 000, 000 and beyond. Am Sei 85, 324, 1997). Mit Kohlen¬ stoff-Nanokanälen konnte gezeigt werden, daß die elek- tronischen Eigenschaften durch ihre strukturellen Details kontrolliert werden. Die Synthese von Kohlenstoff-Nanokanälen erfolgt durch verschiedene Varianten von CVD (chemical vapor deposition) (Fan, S., Chapline, M. G., Franklin, N. R. , Tombier, T. W. , Cassell, A. M. und Dai , H. Self-oriented regulär arrays of carbon nanotubes and their field emission proper- ties. Science 283, 512-4,1999) und ist damit sehr aufwendig.
Aus Johnson, S. A. , Ollivier, P. J. und Mallouk, T. E. Orde- red mesoporous poly ers of tunable pore size from colloidal silica templates . Science 283, 963-965 (1999) ist ein Verfahren zur Herstellung von organischen Nanokanälen auf der Grundlage eines Templates bekannt. Damit können Nanokanäle mit einem Durchmesser von 5 bis 35 n hergestellt werden.
Mycobakterien gehören zu einer Untergruppe von Gram-positiven Bakterien, die Mycolsäuren besitzen und die die Gattungen Co- rynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Gordona, Tsukamurella, Dietzia einschließen. Trias, J. und Benz, R. Permeability of the cell wall of My- cobacterium smegmatis . Mol Microbiol 14, 283-290 (1994) beschreiben kanalbildende Proteine, nämlich Porine, in der My- colsäure-Schicht von Mycobakterien. Biochemische oder molekulargenetische Daten über diese Porine wurden bisher nicht veröffentlicht .
Aus Lichtinger, T., Burkovski , A. , Niederweis, M. , Kramer, R. und Benz, R. Biochemical and biophysical characterization of the cell wall porin of Corynebacterium glutamicum : the Channel is formed by a low molecular mass polypeptide. Biochemi - stry 37, 15024-32 (1998) ist ein Verfahren zur Präparation von Porinen aus Corynebakterien bekannt. Dieses Verfahren ist relativ ineffizient.
Mukhopadhyay, S., Basu, D. und Chakrabarti, P. Characterization of a porin from Mycobacterium smegmatis . J Bacteriol 179, 6205-6207 (1997) beschreiben die Extraktion von Porinen aus M. smegmatis mit einem Puffer mit 1 % Zwittergent durch Inkubation bei Raumtemperatur für eine Stunde. Die Ausbeuten waren schlecht und die Verunreinigung mit anderen Proteinen groß.
Aus Harth, G. et al . , High-level heterologous expression and secretion in rapidly growing nonpathogenic mycobacteria of four major Mycobacterium tuberculosis extracellular proteins considered to be leading vaccine candidates and drug targets . Infection and Immuni ty 65, 2321-2328 (1997) ist es bekannt, daß eine starke Expression von gering konservierten, Mycobac- terium-spezifischen Proteinen in E. coli nicht möglich zu sein scheint. Aus Senaratne, R.H. et al . , Expression of a Gene for a Porin- Like Protein of the OmpA Family from Mycobacterium tuJerculo- sis H37Rv. J Bacteriol 180, 3541-3547 (1998) ist die Expression eines Gens für ein porinartiges Protein aus Mycobacteri - um tuberculosis H37Rv in E. coli bekannt. Die Expression des Gens verursacht einen Abbruch des Bakterienwachstums, weil das exprimierte Protein offensichtlich toxisch für E. coli ist. Es können lediglich geringe Mengen des Proteins aus E. coli kurz vor dem Absterben der Zellen isoliert werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines kanalbildenden Proteins anzugeben.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 26, 27, 28, 30, 32, 36, 37, 38, 40 und 41 gelöst. Zweckmäßige Weiterbildungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 25, 29, 31, 33, 34, 35, 39 sowie ggf. 37 und 38.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines in Gram-positiven Bakterien vorkommenden kanalbildenden Proteins vorgesehen, wobei das kanalbildende Protein gewonnen wird durch
a) heterologe Überexpression oder
b) Aufreinigung aus Mycobakterien, wobei die Extraktions- temperatur mehr als 50°C beträgt.
Unter den kanalbildenden Proteinen werden Proteine verstan- den, welche einen wassergefüllten Kanal oder eine wassergefüllte kanalartige Struktur bilden können. Solche Proteine kommen natürlicherweise, insbesondere in der Zellwand von Bakterien, vor. Sie können kanalartige Strukturen oder Kanäle mit einem Durchmesser bis zu 3 n und sogar darüber bilden. Die Länge kann bis zu 10 nm und mehr betragen. Die kanalartigen Strukturen oder Kanäle können aus mehreren, insbesondere vier oder acht, Untereinheiten gebildet sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist wesentlich effizienter als die bisher beschriebenen Verfahren, bietet die Möglichkeit einer weitgehenden Automatisierung der chromatographischen Aufreinigung und ermöglicht eine drastisch erhöhte Ausbeute.
Das Gram-positive Bakterium kann ein mindestens eine Mycol- säure enthaltendes Bakterium sein. Nach einer Ausgestaltung ist das Bakterium ein Mykobakterium, vorzugsweise Mycobacterium smegmatis .
Das kanalbildende Protein kann ein Porin sein. Bevorzugt wird ein Porin, das im wesentlichen gegenüber organischen Lösungsmitteln chemisch stabil und/oder bis zu einer Temperatur von 80°C, vorzugsweise 100°C, thermisch stabil ist. Stabil bedeu- tet, daß die kanalartige Struktur des Proteins erhalten bleibt und im wesentlichen keine Denaturierung des Proteins stattfindet .
Das Porin ist vorzugsweise MspA, MspC, MspD, ein Fragment dieser Porine, ein zu diesen Porinen oder deren Fragmenten homologes Protein oder ein von einer Sequenz dieser Porine abgeleitetes Protein ist. MspA weist die Sequenz der Aminosäuren 28 - 211 der Sequenz 3 (siehe unten) , MspC die Sequenz 7 und MspD die Sequenz 9 auf. Das zu den genannten Po- rinen oder deren Fragmenten homologe Protein weist eine ähnliche Struktur wie diese Porine oder Fragmente auf . Mindestens 20 % der Aminosäuren sind identisch oder homolog zu den Aminosäuren dieser Porine oder Fragmente. Eine Aminosäure in einem Protein ist zu einer anderen Aminosäure homolog, wenn sie durch die andere Aminosäure ersetzt werden kann, ohne daß dadurch die Funktion oder Struktur des Proteins wesentlichen beeinflußt wird. Bei dem von einer der Sequenzen der Porine abgeleiteten Protein können gegenüber diesen Sequenzen einzelne oder mehrere Aminosäuren fehlen oder durch andere Aminosäuren oder Aminosäureanaloga ersetzt sein.
Die genannten Proteine eignen sich wegen ihrer überraschend hohen chemischen und thermischen Stabilität besonders gut zur Herstellung von Nanostrukturen.
Eine gute Ausbeute wird erzielt, wenn die heterologe Überexpression in E. coli oder Mycobakterien durchgeführt wird. Zweckmäßigerweise wird zur Überexpression ein für ein kanalbildendes Protein, vorzugsweise ein Porin, codierendes Gen benutzt. Vorteilhaft ist es weiter, daß zur Überexpression ein mspA-Gen gemäß Sequenz 1 (siehe unten) , ein mspC-Gen gemäß Sequenz 6 oder ein mspD-Gen gemäß Sequenz 8 benutzt wird. Zur Überexpression kann auch ein von den Sequenzen 1, 6 oder 8 abgeleitetes mutiertes Gen benutzt werden, wobei die Mutation so ausgebildet ist, daß die chemische und thermische Stabilität sowie die kanalartige Struktur des exprimierten Proteins im wesentlichen denen von MspA, MspC oder MspD ent- spricht. Die Mutation kann auch im wesentlichen in einer An- gleichung der Codons des mspA-Gens, des mspC-Gens oder des mspD-Gens an die Codons der in E. coli hoch exprimierten Gene bestehen. Solche Codons sind aus Nakamura, T. et al . , Two types of linkage between codon usage and gene-expression levels. FEBS Lett . 289, 123-125 (1991) bekannt.
Zur Überexpression kann auch ein mutiertes mspA- , mspC- oder mspD-Gen benutzt werden, wobei die Mutation im wesentlichen darin besteht, daß der GC-Gehalt auf weniger als 66% vermindert ist.- Die Anpassung der Codon-Benutzung verbessert die Uberexpression von MspA, MspC und MspD in E. coli erheblich.
Durch Herstellung des kanalbildenden Proteins MspA aus E. coli kann die Ausbeute gegenüber dem oben beschriebenen Verfahren zur Präparation des nativen Proteins noch einmal um den Faktor 10 bis 20 gesteigert werden.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, zur Überexpression das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 zu benutzen. Dazu kann ein zur Überexpression in E. coli geeigneter Vektor verwendet werden, in den das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 eingesetzt ist. Solche geeigneten Vektoren sind z.B. von Hannig, G. und Makrides, S.C. in Trends in Biotechnology, 1998, Vol. 16, pp54 beschrieben. Der Offenbarungehalt dieses Dokuments wird hiermit einbezogen.
Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, die kanalbilden- den Proteine mittels nicht-ionischer oder zwitterionischer Detergentien aus der Zellwand von Gram-positiven Bakterien zu gewinnen. Die Detergentien können aus der folgenden Gruppe ausgewählt sein: Isotridecylpoly (ethyleneglycolether)n, Al- kylglucoside, besonders Octylglucosid, Alkylmaltoside, beson- ders Dodecylmaltosid, Alkylthioglucoside, besonders Oc- tylthioglucosid, Octyl-Polyethylenoxide und Lauryldimethyla- minoxid. Es ist zweckmäßigerweise eine zweifache oder höhere kritische micellare Konzentration (CMC) in einem Phosphatpuffer (100 mM Na2HP04/NaH2P04, pH 6,5, 150 mM NaCl) eingestellt worden. - Die zwitterionischen und nicht-ionischen Detergentien lösen insbesondere das kanalbildende Protein MspA sehr selektiv und mit guter Ausbeute aus der Zellwand von M. smegmatis . Es hat sich weiter als zweckmäßig erwiesen, daß die Temperatur bei der Extraktion zwischen 80 und 110 °C, vorzugsweise zwischen 90 und 100 °C, und/oder die Extraktionszeit 5 bis 120 Minuten, vorzugsweise 25 - 35 Minuten, beträgt. Vorteilhaft ist weiter die Benutzung eines Puffers mit einer Ionenstärke von mehr als 50 mM NaCl oder Na-Phosphat.
Insbesondere eine Durchführung der Extraktion bei 100 °C, die Verwendung eines Puffers mit hoher Ionenstärke sowie zwitterionischer und nicht-ionischer Detergentien verbessern das Extraktionsverfahren für Porine aus Mycobacterium smegmatis . Es bietet gegenüber den bisherigen Verfahren zur Aufreinigung solcher Proteine mit Hilfe organischer Lösungsmittel oder der Extraktion bei Raumtemperatur folgende Vorteile:
aa) Verzicht auf organische Lösungsmittel bb) geringe Verunreinigungen mit anderen Proteinen cc) effiziente Extraktion
Es ist auch möglich, MspA zur Aufreinigung in Dimethylsulfo- xid bei einer Temperatur im Bereich von 50 - 110 °C zu lösen; danach kann die Lösung vom Rückstand getrennt und MspA durch Abkühlen ausgefällt werden.
Vorteilhafterweise wird das kanalbildende Protein zur Aufreinigung, insbesondere mittels Aceton, ausgefällt. Dabei kann es zu einer Anreicherung des kanalbildenden Proteins gegenüber nicht ausfallenden Proteinen kommen. Weiterhin ist es vorteilhaft, das Protein zur Aufreinigung einer Ionenaustauscher-Chromatographie, insbesondere einer Anionenaustau- scher-Chromatographie, zu unterwerfen. Zur weiteren Aufreini- gung kann das kanalbildende Protein einer Größenausschluß- Chromatographie unterworfen werden.
Das durch heterologe Überexpression gewonnene kanalbildende Protein kann durch Erhöhen der lokalen Konzentration des kanalbildenden Proteins renaturiert werden. Das Erhöhen der lokalen Konzentration kann durch elektrophoretische Anreicherung, insbesondere durch Anlegen einer Gleichspannung, durch Ausfällen oder durch Adsorption an einer Oberfläche, insbe- sondere einer Membran, erfolgen. Zweckmäßig ist das Anlegen einer Gleichspannung im Bereich von 50 V für eine Zeit von etwa 30 Minuten.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein kanalbildendes Protein aus einem Gram-positiven Bakterium hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Das Gram-positive Bakterium kann ein Mycolsäure enthaltendes Bakterium sein, wobei zweckmäßigerweise das Bakterium ein My- kobakterium, vorzugsweise Mycobacterium smegmatis, ist.
Von besonderem Vorteil ist es, daß das kanalbildende Protein ein Porin ist, das im wesentlichen gegenüber organischen Lösungsmitteln chemisch stabil ist. Das Porin ist vorzugsweise im wesentlichen bis zu einer Temperatur von 80°C, vorzugsweise 100°C, thermisch stabil. Es kann sich dabei um das Porin MspA, MspC, MspD, ein Fragment dieser Porine, ein zu diesen Porinen oder deren Fragmenten homologes Protein oder ein von der Sequenz dieser Porine abgeleitetes Protein handeln. Die chemische und thermische Stabilität sowie die kanalartige Struktur des abgeleiteten Proteins kann im wesentlichen derjenigen der Proteine MspA, MspC oder MspD entsprechen. Es ist aber auch denkbar, daß weitere hier nicht genannte Porine diese Eigenschaften aufweisen und damit vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfaßt sind.
Die erfindungsgemäßen kanalbildenden Proteine haben die fol- genden Vorteile:
aaa) Soweit die kanalbildenden Proteine in der Zellwand von M. smegmatis enthalten sind, lassen sie sich daraus in organischen Lösungsmitteln (z. B. CHCl3/MeOH) lösen, ohne zu de- naturieren. Die Fähigkeit zur Kanalbildung bleibt in organischen Lösungsmitteln erhalten.
bbb) Sie lassen sich mit Aceton fällen, ohne zu denaturieren.
ccc) Sie überstehen selbst Kochen in Detergentien (z. B. 10 Minuten in 3% SDS) , ohne zu denaturieren.
Diese extreme Stabilität der erfindungsgemäßen Proteine gegenüber chemischer und thermischer Denaturierung ermöglicht deren Verwendung zur Herstellung von technisch verwertbaren Nanostrukturen .
Nach Maßgabe der Erfindung wird weiterhin ein für ein erfin- dungsgemäßes kanalbildendes Protein codierendes Gen bean- sprucht . Das kann das mspA-Gen gemäß Sequenz 1, das mspC-Gen gemäß Sequenz 6 oder das mspD-Gen gemäß Sequenz 8 sein.
Als weiterer Gegenstand kommt auch ein mutiertes mspA-Gen, mspC-Gen oder mspD-Gen in Betracht, wobei die Mutation im we- sentliehen in einer Angleichung der Codons des mspA-Gens, des spC-Gens oder des mspD-Gens an die Codons der in E. coli hoch exprimierten Gene besteht. Die Mutation kann im wesentlichen darin bestehen, daß der GC-Gehalt auf weniger als 66% vermindert ist. Das mutierte Gen kann aber auch von einer der Sequenzen 1, 6 oder 8 abgeleitet und so ausgebildet sein, daß die chemische und thermische Stabilität sowie die kanalartige Struktur des exprimierten Proteins im wesentlichen der von MspA, MspC oder MspD entspricht. Weitere hier nicht genannte Mutationen sind für den Fachmann ebenfalls denkbar. Gene, die zur Ausbildung der erfindungsgemäßen kanalartigen Proteine führen, sind vom beanspruchten Schutzumfang umfaßt. Z.B. ein mutiertes mspA-Gen, wobei das mutierte Gen das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 (siehe unten) ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist der Plasmidvektor pMN501 und ein Überexpressionssystem, bei dem E. coli diesen Plasmidvektor enthält.
Nachfolgend werden anhand der Figuren Beispiele der Erfindung erläutert. Es zeigen:
Fig. la-c die Temperaturabhängigkeit der Extraktion von MspA aus M. smegmatis in gelelekrophoretischer Darstellung,
Fig. 2 die Reinigung von MspA aus M. smegmatis in gele- lektrophoretischer Darstellung,
Fig. 3 die Reinigung von MspA aus E. coli in gelelektro- phoretischer Darstellung,
Fig. 4 die Konstuktion des Plasmidvektors pMN501,
Fig. 5 eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zur Renaturierung, Fig. 6 ein renaturiertes MspA in gelelektrophoretischer Darstellung und
Fig. 7a-c Modifikationen des Kanalproteins MspA in elektro- nenmikroskopischer Darstellung.
Bei allen gelelektrophoretischen Darstellungen von Proteinen sind die Proteine 30 Minuten bei Raumtemperatur in Probenpuffer (40 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan, pH 7,0, 3% SDS, 8% Glycerin, 0,1% Serva Blau G) inkubiert und dann gelelektro- phoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt worden.
Die Figuren la-c zeigen bei verschiedenen Temperaturen aus M. smegmatis extrahierte Proteine. Fig. la zeigt ein mit Coo- massie Blau gefärbtes 10%-iges SDS-Polyacrylamidgel. Spur M: Massenstandard mit 200, 116,3, 97,4, 66,3, 55,4, 36,5, 31, 21,5 und 14,4 kDa. Spuren 1 bis 8: je 12 μl von bei 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder 100°C erhaltenen Extrakten.
Fig. lb zeigt einen Im unoblot eines 8%-igen SDS- Polyacrylamidgels auf einer PVDF-Membran. Die Proteine wurden unter Verwendung eines gegen MspA gerichteten Antiserums aus Kaninchen und einer Chemilumineszenz-Reaktion (ECL- Detektionssyste , Amersham-Pharmacia, Wien, Österreich) sichtbar gemacht. Spur M: Massenstandard mit 97,4, 68, 46, 31, 20,1 und 14,4 kDa. Spuren 1 bis 3: Je 2 μl eines bei 30, 40 oder 50°C erhaltenen Extrakts. Spuren 4 bis 8: Je 1 μl eines bei 60, 70, 80, 90 oder 100°C erhaltenen Extrakts. Spur 9 : 1 ng MspA.
Fig. lc zeigt ein mit Silber gefärbtes 8%-iges SDS- Polyacrylamidgel. Spur M: Massenstandard mit 200, 116,3, 97,4, 66,3, 55,4, 36,5, 31, 21,5 und 14,4 kDa. Spur 1 und 2: Je 15 μl eines bei 30 oder 40°C gewonnenen Extrakts. Spur 3: 10 μl eines bei 50°C gewonnenen Extrakts. Spuren 4 bis 8: Je 4 μl eines bei 60, 70, 80, 90 oder 100°C erhaltenen Extrakts. Spur 9 zeigt 270 ng aufgereinigtes MspA.
Fig. 2 zeigt ein mit Coomassie Blau gefärbtes 10 %iges SDS- Polyacrylamidgel. Spur M: Massenstandard: 200, 116,3, 97,4, 66,3, 55,4, 36,5, 31, 21,5 und 14,4 kDa. Spur 1: 40 μg Protein eines aus M. smegmatis mit POP05-Puffer (100 mM Na2HP04/NaH2P04, pH 6,5, 0 , 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 % Oc- tylpolyethylenoxid (OPOE) ) gewonnenen Extrakts. Spur 2: 40 μg Protein aus dem Extrakt nach Fällung mit Aceton. Spur 3 : 4 μg Protein aus vereinigten MspA enthaltenden Fraktionen einer Anionenaustauscher-Chromatographie . Spur 4: 4 μg Protein der MspA enthaltenden Fraktionen nach Fällung mit Aceton. Spur 5: 4 μg Protein aus vereinigten MspA enthaltenden Fraktionen nach Größenausschluß-Chromatographie. Die Sequenzen des mspA- Gens, des mspA-Gens + Promotor sowie des MspA-Proteins mit vermuteter Signalsequenz sind im Sequenzprotokoll als Sequen- zen 1 - 3 wiedergeben.
Fig. 3 zeigt die Reinigung des Kanalproteins MspA aus E. coli . Die Proteine wurden mit einem 10 %igen SDS-Polyacrylamidgel nach Größe getrennt. Das Gel wurde mit Coomassie Blau gefärbt. Spur 1: Lysat von E. coli BL21 (DE3 ) /pMN501 vor der Induktion durch IPTG. Spur 2: Lysat von E. coli BL21 (DE3) /pMN501 nach der Induktion durch IPTG. Spur 3: Massenstandard: 200, 116, 97, 66, 55, 36,5, 31, 21,5, 14,4 und 6 kDa. Die Proben wurden 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurden. In Fig. 4 ist schematisch die Konstruktion des Plasmids pMN501 zur Uberexpression von MspA in E. coli BL21(DE3) dargestellt. Die verwendeten Abkürzungen bedeuten:
lad : Gen codierend für den Laktose-Repressor nptl : Gen codierend für die Neomycinphosphotransferase; sie vermittelt Kanamycinresistenz Ori : Replikationsursprung RBS : Ribosomenbindestelle
Fig. 5 zeigt schematischen eine Vorrichtung zur Renaturierung von monomerem MspA. Eine Pipettenspitze aus Polyethylen von 5 cm Länge, deren unteres Ende nach ca. 2 mm abgeschnitten wurde, wurde mit einer 1.7 %igen Agarose-Lösung (in TAE-Puffer) gefüllt. Eine Bleistiftmine (Typ: Eberhard Faber, 3H) wurde auf eine Länge von 5 cm gekürzt. Ein Polypropylengefäß ohne Deckel wurde mit 60 μl einer Lösung mit 5 μg denaturiertem MspA gefüllt und die Pipettenspitze und die Bleistiftmine in die Lösung gestellt. Dann wurde die Pipettenspitze als Katho- de und die Bleistiftmine als Anode angeschlossen.
Fig. 6 zeigt die Renaturierung von denaturiertem MspA. Die Proteine wurden mit einem 10 %igen SDS-Polyacrylamidgel nach Schägger getrennt (Schägger, H. and von Jagow, G. Tricine- sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the Separation of proteins in the ränge from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 166, 368-79 (1987)). Das Gel wurde mit Silber gefärbt. Spur M: Massenstandard: 116, 97, 66, 55, 36.5, 31, 21.5, 14.4 kDa; Spur 1: 800 ng denaturiertes MspA. Spur 2: 800 ng MspA nach der Renaturierungsreaktion. Die Proben wurden 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurden. Die Fig. 7a bis 7c zeigen elektronenmikroskopische Aufnahmen von Modifikationen des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis . Die Herstellung der Proben erfolgt nach folgendem Protokoll: Ein Milliliter einer Lösung des Kanalproteins MspA (c(MspA)= 17,2 x 10-9 mol/L, 100 mM Na2HP04/NaH2P04, pH 6,5, 150 mM NaCl, 0,10 g/L SDS) werden bei 24,5°C in einem Ultraschallbad dispergiert. Zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und einer HOPG (Kohlenstoff) - Oberfläche (1,0 mm2) wird ein konstanter Abstand von 5,0 cm eingestellt. Die HOPG-Oberflache wird für 20 Sekunden den dispergierten Flüssigkeitströpfchen ausgesetzt .
In Fig. 7a liegen isolierte Kanalproteine vor. In Fig. 7b ist eine Bänderstruktur erkennbar, die große Poren mit einem Durchmesser von 12 nm aufweist. Aus Fig. 7c ist ersichtlich, daß die Bänderstruktur zwei Typen von Kanälen beitzt, nämlich erste Kanäle mit einem kleinen Durchmesser von etwa 2.4 nm und zweite Kanäle mit größeren Durchmesser von etwa 9.0 bis 10,0 nm.
Beispiel 1: Extraktion von MspA aus M. smegmatis bei verschiedenen Temperaturen
10 mg M. smegmatis mc2155-Zellen (Naßgewicht) wurden mit PBS (100 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) gewaschen und in 150 μl PG05-Puffer (0,5 % Isotridecylpoly- ethylenglycolether, 100 mM Na2HP0 /NaH2P04, 0 , 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 6,5) resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden für 30 Minuten bei 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder 100°C inkubiert. Die Proben wurden für 10 Minuten auf Eis gekühlt und für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Volumen des Überstands wurde durch Verdampfen von 120 auf 10 μl reduziert. Die Proteine wurden gelelektrophoretisch nach ihrer Größe getrennt, wie es in den Figuren la-c gezeigt ist. Der Anteil von MspA an dem insgesamt extrahierten Protein nimmt bei Temperaturen über 50°C deutlich zu. Andere Proteine werden bei diesen Temperaturen kaum noch extrahiert.
Beispiel 2 : Aufreinigung von MspA aus M. smegmatis
10 g M. smegmatis (Naßgewicht) wurden mit PBS gewaschen, in 35 ml POP05-Puffer resuspendiert und unter Rühren für 30 Minuten in einem Wasserbad gekocht. Die Zellsuspension wurde für 10 Minuten auf Eis gekühlt und bei 4°C für 15 Miunten bei 27000 g zentrifugiert. 42 ml des Überstands wurden vorsichtig mit einem gleichen Volumen eisgekühlten Acetons gemischt. Die Mischung wurde eine Stunde auf Eis gekühlt und bei 4°C für 15 Minuten bei 8000 g zentrifugiert. Das ausgefällte Protein wurde in 10 ml 25 mM AOP05 (N- (2-Hydroxyethyl) piperazin-N'-2- ethansulfonsäure (Hepes), pH 7,5, 10 mM ΝaCl, 0,5 % OPOE) gelöst und auf eine Anionenaustauscher-Säule PORÖS 20HQ mit einem Volumen von 1,7 ml (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA) geladen. Nach Waschen der Säule mit 14 ml AOP05 wurden gebundene Proteine mit einem Gradienten von 100% AOP05 bis 100 % BOP05 (25 mM Hepes, pH 7 , 5 , 2 M NaCl, 0,5 % OPOE) über 34 ml eluiert. Es wurden 90 1 ml-Fraktionen gesammelt und ge- lelektrophoretisch analysiert. MspA eluierte zwischen 0,48 und 0,74 M NaCl mit einem Peak bei 0,57 M NaCl. Die 4 Fraktionen mit der höchsten MspA-Menge wurden vereinigt und mit Aceton gefällt. Das resultierende Pellet wurde in 600 μl AOP05 aufgenommen, auf Eis inkubiert und bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert um unlösliches Material zu entfernen. Die resultierende Proteinlösung wurde auf eine Superdex 200 Gelfiltrations-Säule mit einem Volumen von 24 ml (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) aufgetragen. Proteine wurden mit 48 ml AOP05 bei einer Flußrate von 0,2 ml/Minute eluiert. 50 1 ml- Fraktionen wurden gesammelt und gelelektrophoretisch analysiert. Fraktionen mit nahezu reinem MspA wurden vereinigt. Die einzelnen Reinigungsstufen sind aus Fig. 2 ersichtlich. Die Ausbeute beträgt 700 μg. 1 μg dieser Probe zeigte in einem silbergefärbten SDS-Polyacrylamidgel keinerlei Kontaminationen mit anderen Proteinen (nicht gezeigt) . MspA ist bis oder nahezu bis zur Homogenität aufgereinigt worden.
Beispiel 3 : Verfahren zur Präparation des Kanalproteins MspA aus E. coli Zur weiteren Erhöhung der Ausbeute an MspA wird eine Überexpression des entsprechenden Gens vorgeschlagen. Zunächst wird das mspA-Gen kloniert, das für das Kanalprotein MspA aus Mycobacterium smegmatis mc 155 kodiert. Es wird das T7- Expressionssystem für die Überexpression des mspA-Gens ge- wählt.
Das mspA-Gen wird aus dem Plasmid pPOR6 über PCR amplifi- ziert. In der nativen mspA-Sequenz werden alle Codons verändert, die in stark exprimierten Genen aus Escher ichia coli selten vorkommen. Im Sequenzprotokoll (siehe unten), sind in Sequenz 4 alle eingeführten Mutationen aufgelistet. Diese synmspA genannte DNA wird nach der Methode von Stemmer (Stemmer, W. P., Crameri, A. , Ha, K. D., Brennan, T. M. and Heyne- ker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides . Gene 164, 49-53 (1995) ) durch Assemblierung von Oligonucleotiden synthetisiert und anstelle des mspA-Gens in den Vektor pMN500 eingesetzt. Das resultierende Plasmid pMN501 (Fig. 4) vermittelt in Zellen von E. coli BL21(DE3) eine starke Expression von denaturiertem MspA-Monomer (20 kDa) nach Induktion mit IPTG. Das so exprimierte rMspA genannte Protein weist die Sequenz 5 (siehe unten) auf. Beispiel 4: Aufreinigung von MspA aus E. coli
Ein Liter LB-Medium mit 30 μg/mL Kanamycin wird mit E. coli BL21 (DE3) /pMN500 beimpft und bei 37°C bis zu einer OD60o von 0.6 geschüttelt. Dann wird mit 1 mM IPTG induziert und die Zellen noch sechs Stunden bei 37°C bis zu einer ODεoo von 2.2 geschüttelt. Die Zellen werden in 40 mL A-Puffer (25 mM Hepes, pH 7,5, 10 mM NaCl) resuspendiert und durch zehnminütiges Kochen in Wasser aufgeschlossen. Nach einer zehnminütigen Inkubation auf Eis werden die Zelltrümmer und die ausgefallenen Proteine durch Zentrifugation bei 10000 g für 10 Minuten abgetrennt. Der Überstand wird an einem Anionenaustauscher (PORÖS HQ20) mit einem linearen NaCl-Gradienten von 10 mM bis
2 M NaCl getrennt. Monomeres MspA eluiert bei 350 mM NaCl. Um höhermolekulare Proteine abzutrennen, werden die Fraktionen mit MspA vereinigt und es wird eine Gelfiltration durchgeführt. Die Ausbeute beträgt 10 mg MspA mit einer Reinheit von über 95 % (Daten nicht gezeigt) .
Beispiel 5 : Elektrochemische Assemblierung des Kanalproteins MspA
Durch die Überexpression von MspA in E. coli ist es zwar leicht möglich, das Kanalprotein mit einer guten Ausbeute zu isolieren. Das gewonnene Protein liegt zum großen Teil in in- aktiver Form vor. Die Überführung in die aktive Form bzw. Renaturierung von monomerem MspA kann nach folgendem Protokoll erfolgen:
Die Renaturierung kann in einer für diesen Zweck entwickelten Apparatur stattfinden (Fig. 5). Die Renaturierungsreaktion wird mit 5 μg MspA in monomerer Form in dieser Reak- tionsapparatur durch Anlegen einer Spannung von 50 V für
30 Minuten durchgeführt. Zum Schluß wird die Spannung für fünf Sekunden umgepolt, um an der Bleistiftmine adsorbiertes Porin wieder zu lösen.
Das Protein wird nach der oben beschriebenen Renaturierungs- reaktion in einem Proteingel untersucht (Fig. 6) . Dabei stellt sich heraus, daß ein großer Teil des Proteins zu oli- gomeren Einheiten assembliert ist. Durch Rekonstitutionsexpe- rimente kann gezeigt werden, daß das MspA in dieser Form wieder hohe Kanalaktivität besitzt. Das beweist, daß die Renatu- rierung von MspA durch geringe Gleichspannungen möglich ist.
Diese Renaturierungsreaktion ist sehr einfach durchzuführen und ist damit ein wichtiger Bestandteil der Präparation von funktionalem Kanalprotein MspA aus überproduzierenden E. coli .
Liste der Sequenzen:
1. mspA-Gen, translatiert 2. mspA-Gen + Promotor, translatiert
3. MspA-Proteins mit vermuteter Signalsequenz
4. synmspA-Gen, translatiert
5. rMspA-Protein
6. mspC-Gen 7 . MspC-Protein
8 . mspD-Gen
9 . mspD-Protein

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines in Gram-positiven Bakterien vorkommenden kanalbildenden Proteins, wobei das kanalbil- dende Protein gewonnen wird durch
a) heterologe Überexpression oder
b) Aufreinigung aus Mycobakterien, wobei die Extraktions- temperatur mehr als 50°C beträgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gram-positive Bakterium ein mindestens eine Mycolsäure enthaltendes Bakterium ist.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Bakterium ein Mykobakterium, vorzugsweise Mycobacterium smegmatis , ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kanalbildende Protein ein Porin ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Porin im wesentlichen gegenüber organischen Lösungsmit- teln chemisch stabil ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Porin im wesentlichen bis zu einer Temperatur von 80°C, vorzugsweise 100°C, thermisch stabil ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Porin MspA, MspC, MspD, ein Fragment dieser Porine, ein zu diesen Porinen oder deren Fragmenten homologes Protein oder ein von einer Sequenz dieser Porine abgeleitetes Protein ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die heterologe Überexpression in E. coli oder Mycobakterien durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Überexpression ein für ein kanalbildendes Protein, vor- zugsweise ein Porin, codierendes Gen benutzt wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Uberexpression ein mspA-Gen gemäß Sequenz 1, ein mspC-Gen gemäß Sequenz 6 oder ein mspD-Gen gemäß Sequenz 8 benutzt wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Überexpression ein von den Sequenzen 1, 6 oder 8 abgeleitetes mutiertes Gen benutzt wird, wobei die Mutation so aus- gebildet ist, daß die chemische und thermische Stabilität sowie die kanalartige Struktur des expimierten Proteins im wesentlichen denen von MspA, MspC oder MspD entspricht.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mutation im wesentlichen in einer Angleichung der Codons des mspA-Gens, des mspC-Gens oder des mspD-Gens an die Codons der in E. coli hoch exprimierten Gene besteht.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Überexpression ein mutiertes mspA- , mspC- oder mspD-Gen benutzt wird, wobei die Mutation im wesentlichen darin besteht, daß der GC-Gehalt auf weniger als 66% vermindert ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Uberexpression das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 benutzt wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein zur Uberexpression in E. coli geeigneter Vektor verwendet wird, in den das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 eingesetzt ist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die kanalbildenden Proteine mittels nicht-ionischer oder zwitterionischer Detergentien aus der Zellwand von Gram- positiven Bakterien gewonnen werden.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detergentien aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
Isotridecylpoly (ethyleneglycolether)n, Alkylglucoside, besonders Octylglucosid, Alkylmaltoside, besonders Dodecylmalto- sid, Alkylthioglucoside, besonders Octylthioglucosid, Octyl- Polyethylenoxide und Lauryldimethylaminoxid.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Temperatur bei der Extraktion zwischen 80 und 110°C, vorzugsweise zwischen 90 und 100°C beträgt.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Extraktionszeit 5 bis 120 Minuten, vorzugsweise 25 - 35 Minuten, beträgt.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Puffer mit einer Ionenstärke von mehr als 50 mM NaCl oder Na-Phosphat benutzt wird.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kanalbildende Protein zur Aufreinigung, insbesondere mittels Aceton, ausgefällt wird.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kanalbildende Protein zur Aufreinigung einer Ionenaustauscher-Chromatographie, insbesondere einer Anionenaustau- scher-Chromatographie, unterworfen wird.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kanalbildende Protein zur Aufreinigung einer Größenaus- schluß-Chromatographie unterworfen wird.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das durch heterologe Überexpression gewonnene kanalbildende
Protein durch Erhöhen der lokalen Konzentration des kanalbildenden Proteins renaturiert wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Erhöhen der loka- len Konzentration durch elektrophoretische Anreicherung, insbesondere durch Anlegen einer Gleichspannung, durch Ausfällen oder durch Adsorption an einer Oberfläche, insbesondere einer Membran, erfolgt.
26. Kanalbildendes Protein aus einem Gram-positiven Bakterium hergestellt nach dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche .
27. Kanalbildendes Protein aus einem Gram-positiven Bakteri- um, wobei das kanalbildende Protein ein Porin ist, das im wesentlichen gegenüber organischen Lösungsmitteln chemisch stabil ist.
28. Kanalbildendes Protein aus einem Gram-positiven Bakterium, wobei das kanalbildende Protein ein Porin ist, das im wesentlichen bis zu einer Temperatur von 80°C thermisch stabil ist .
29. Kanalbildendes Protein nach Anspruch 28, wobei das kanalbildende Protein ein Porin ist, das im wesentlichen bis zu einer Temperatur von 100°C thermisch stabil ist.
30. Kanalbildendes Protein aus einem Gram-positiven Bakterium, wobei das kanalbildende Protein das Porin MspA, MspC, MspD, ein Fragment dieser Porine, ein zu diesen Porinen oder deren Fragmenten homologes Protein oder ein von der Sequenz dieser Porine abgeleitetes Protein ist.
31. Kanalbildendes Protein nach Anspruch 30, wobei die chemische und thermische' Stabilität sowie die kanalartige Struktur des abgeleiteten Proteins im wesentlichen derjenigen der Proteine MspA, MspC oder MspD entspricht.
32. Gen codierend für ein kanalbildendes Protein nach einem der Ansprüche 26 - 31.
33. Gen nach Anspruch 32, wobei das Gen das mspA-Gen gemäß Sequenz 1 ist.
34. Gen nach Anspruch 32, wobei das Gen das mspC-Gen gemäß Sequenz 6 ist.
35. Gen nach Anspruch 32, wobei das Gen das mspD-Gen gemäß Sequenz 8 ist.
36. Mutiertes mspA-Gen, mspC-Gen oder mspD-Gen, wobei die Mutation im wesentlichen in einer Angleichung der Codons des mspA-Gens, des mspC-Gens oder des mspD-Gens an die Codons der in E. coli hoch exprimierten Gene besteht.
37. Mutiertes mspA-Gen, mspC-Gen oder mspD-Gen, insbesondere nach Anspruch 36, wobei die Mutation im wesentlichen darin besteht, daß der GC-Gehalt auf weniger als 66% vermindert ist .
38. Mutiertes mspA-Gen, mspC-Gen oder mspD-Gen, insbesondere nach Anspruch 36 oder 37, abgeleitet von einer der Sequenzen 1, 6 oder 8, wobei die Mutation so ausgebildet ist, daß die chemische und thermische Stabilität sowie die kanalartige Struktur des exprimierten Proteins im wesentlichen der von MspA, MspC oder MspD entspricht.
39. Mutiertes mspA-Gen nach einem der Ansprüche 36 bis 38, wobei das mutierte Gen das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 ist.
40. Plasmidvektor pMN501.
41. Überexpresεionssystem, bei dem E. coli den Plasmidvektor PMN501 enthält.
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