JPWO2014010721A1 - 自己組織化ペプチド誘導体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]一般式(IX)
一般式(X)
[2]一般式(I)
で表されるペプチド誘導体Iと、
一般式(II)
で表されるペプチド誘導体IIとを、ビルディングブロックとして用い、これらを順次カップリングし、側鎖保護基を強酸で脱保護し、さらに末端の脱保護工程、修飾工程及び/又は塩交換工程を含んでもよい各工程よりなる、
一般式(VII)
又は、
一般式(VIII)
で表されるペプチド誘導体の製造方法。
[3]前記ペプチド誘導体IのN末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iaと、前記ペプチド誘導体IIのC末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体IIaとをカップリングさせ、生じたペプチド誘導体IIIaのC末端を脱保護した後に、さらに前記ペプチド誘導体IのC末端がアミド基であるペプチド誘導体Ibとカップリングさせ、得られたペプチド誘導体IVaの側鎖保護基を脱保護する工程を含む前記[2]に記載の製造方法。
[4]前記ペプチド誘導体IのN末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iaと、前記ペプチド誘導体IIのC末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体IIaとをカップリングさせ、生じたペプチド誘導体IIIaのC末端を脱保護した後に、さらに前記ペプチド誘導体IのC末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体Icとカップリングさせ、得られたペプチド誘導体IVbの側鎖保護基を脱保護した後にC末端エステル基をアミド基へと変換する工程を含む前記[2]に記載の製造方法。
[5]前記ペプチド誘導体IIaのC末端エステルがメチルエステルである前記[3]又は[4]に記載の製造方法。
[6]前記ペプチド誘導体IcのC末端エステルがメチルエステルである、前記[4]に記載の製造方法。
[7]一般式(V)
で表されるペプチド誘導体Vと、
一般式(VI)
で表されるペプチド誘導体VIとをカップリングさせ、そのカップリング体のN末端アルギニンのアミノ基及び/又はC末端アルギニンのカルボキシ基の脱保護を行う工程及び/又は修飾を行う工程を含んでいてもよい、前記ペプチド誘導体Iを得る工程を含む前記[3]〜[6]のいずれか1項に記載の製造方法。
[8]前記保護基A及び前記保護基Cが、Pbf(2,2,4,6,7−ペンタメチル−2,3−ジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル)基である前記[3]〜[7]のいずれか1項に記載の製造方法。
[9]前記保護基Bが、t−ブチルエステルである前記[3]〜[8]のいずれか1項に記載の製造方法。
[10]前記ペプチド誘導体IのN末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iaの調製において、ペプチド誘導体VのN末端がアセチル化されているペプチド誘導体Vaと、前記ペプチド誘導体VIのC末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体VIaをカップリングさせ、その後C末端エステルを脱保護してペプチド誘導体Iaを得る工程;及び/又は、前記ペプチド誘導体VのN末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vbと、前記ペプチド誘導体VIaとのカップリング後に、N末端をアセチル基に変換、並びにC末端エステルを脱保護してペプチド誘導体Iaを得る工程を含む前記[7]〜[9]のいずれか1項に記載の製造方法。
[11]前記ペプチドVIaのC末端エステル基がメチルエステルである、前記[10]に記載の製造方法。
[12]前記ペプチド誘導体IのC末端がアミド化されているペプチド誘導体Ibの調製において、前記ペプチド誘導体VのN末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vbと、前記ペプチド誘導体VIのC末端がアミド化されているペプチド誘導体VIbとをカップリングさせ、その後N末端を脱保護してペプチド誘導体Ibを得る工程を含む、前記[7]〜[9]のいずれか1項に記載の製造方法。
[13]前記ペプチド誘導体IのC末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体Icの調製において、前記ペプチド誘導体VのN末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vbと、前記ペプチド誘導体VIのC末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体VIaとをカップリングさせ、その後N末端を脱保護してペプチド誘導体Icを得る工程を含む、前記[7]〜[9]のいずれか1項に記載の製造方法。
[14]一般式(VII)
及び/又は、一般式(VIII)
で表されるペプチド誘導体を、有機溶媒存在下塩酸で処理して、塩交換する工程を含む一般式(XI)
[15]前記有機溶媒が、THF(テトラヒドロフラン)である前記[14]に記載の製造方法。
[16]一般式(VII)及び/又は一般式(VIII)で表されるペプチド誘導体のn(酸)が、2硫酸である前記[2]〜[15]のいずれか1項に記載の製造方法。
なお、本発明における「修飾」とは、特に限定されないが、例えば、後述する保護基によるN末端及び/又はC末端の保護、N末端のアセチル化、及び/又はC末端のアミド化等の通常のペプチド分野で常用される化学変換が挙げられる。
ここで、一般式(I)は、
一般式(II)は、
で表され、
一般式(VII)は、
で表され、及び、
一般式(VIII)は、
で表される。
また、一般式(IV)は、
本発明において、アミノ基の保護基は特に限定されず、例えばベンジルオキシカルボニル(Z)基、p−クロロベンジルオキシカルボニル基、p−ブロモベンジルオキシカルボニル基、p−ニトロベンジルオキシカルボニル基、p−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ベンズヒドリルオキシカルボニル基、2−(p−ビフェニリル)イソプロピルオキシカルボニル基、2−(3,5−ジメトキシフェニル)イソプロピルオキシカルボニル基、p−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル基、トリフェニルホスホノエチルオキシカルボニル基又は9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)等のアラルキルオキシカルボニルタイプの置換基又は非置換基;t−ブチルオキシカルボニル(Boc)基、t−アミルオキシカルボニル基、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、2−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル基又は2,2,2−トリクロロエチルオキシカルボニル基等のアルキルオキシカルボニルタイプの置換基又は非置換基;シクロペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基又はイソボルニルオキシカルボニル基等のシクロアルキルオキシカルボニルタイプの基、及びベンゼンスルホニル基、p−トルエンスルホニル基、メシチレンスルホニル基、メトキシトリメチルフェニルスルホニル基、2−ニトロベンゼンスルホニル基、2−ニトロベンゼンスルフェニル基、4−ニトロベンゼンスルホニル基又は4−ニトロベンゼンスルフェニル基等のヘテロ原子を含有する基を挙げることができる。
カルボキシ基の保護は、一般に、エステル化(エステル基による保護)又はシリル化(シリル基による保護)等により実施することができる。エステル化は特に限定されないが、例えばメチルエステル、エチルエステル、tert−ブチルエステル(t−Bu)等の低級アルキルエステル、又はベンジルエステル、p−メトキシベンジルエステル、p−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等が挙げられる。シリル化は、特に限定されないが、トリメチルシリル、トリエチルシリル、t−ブチルジメチルシリル、i−プロピル−ジメチルシリル等のトリアルキルシリル等が挙げられる。本発明においては、好ましくはエステル化により保護する。より好ましくは、ペプチド誘導体のC末端のカルボキシ基の保護には、メチルエステルを、アスパラギン酸の側鎖のカルボキシ基の保護には、t−Buエステルを、それぞれ用いる。
カルボキシ基の脱保護は、一般的に、加水分解、ケン化、水素化分解又は酵素的加水分解等によって行うことができる。
アルギニンの側鎖のグアニジノ基は求核性が強いため、電子求引基であるスルホニル基、ニトロ基、トシル基、カルボニル基等の適当な保護基により保護することができ、特にスルホニル基による保護が好ましい。スルホニル基としては、特に限定されないが、例えば、2,2,4,6,7−ペンタメチル−2,3−ジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル(Pbf)基、p−トルエンスルホニル(p−Ts)基、4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル(Mtr)基(M.Fujino et al., Chem.Pharm.Bull., 29,2825 (1981))、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル(Pmc)基(R.Ramage at al., Tetrahedron Lett., 28, 2287 (1987))、2−メトキシベンゼンスルホニル基等を用いることができる。本発明においては、Pbf基を用いることが好ましい。
300mLの反応容器に、Cl−・H2 +−Leu−Ala−Leu−OMe(ペプチド誘導体IIa(X=Ala)の塩酸塩)2.69g(7.3mmol)とHOBt 1.05g(7.8mmol)を仕込み、THF(38.2mL)に懸濁させた。この懸濁液に、EDC・HCl 1.96g(10.2mmol)を加え、氷浴にて冷却しながらNMM2.52g(24.9mmol)を滴下した。Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OH(ペプチド誘導体Ia)7.65g(6mmol)をDMF(15.3mL)とTHF(22.9mL)の混合溶媒に溶解し、この溶液を先の反応懸濁液に氷浴にて冷却しながら滴下した。氷浴にて冷却しながら終夜撹拌し、0.5N塩酸(38mL)、THF(74mL)、MTBE(46mL)を加え、室温で分散した後、吸引ろ過、真空乾燥を行い、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−OMe(ペプチド誘導体IIIa)8.39gを白色粉末として得た(Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OH(ペプチド誘導体Ia)からの収率88%)。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ ppm: 0.7-0.9(m, 24 H); 1.19(d, J = 7.1 Hz, 3 H); 1.33(s, 9 H); 1.3-1.8(m, 32 H); 1.84(s, 3 H); 2.00(s, 6 H); 2.42(s, 6 H); 2.48(s, 6 H); 2.4-2.6(m, 1 H); 2.6-2.8(m, 1 H); 2.96(s, 4 H); 3.02(br. s, 4 H); 3.60(s, 3 H); 4.1-4.4(m, 7 H); 4.56(q, J = 7.3 Hz, 1 H); 6.39, 6.65(br. s×2, 6 H); 7.68(d, J = 7.8 Hz, 1 H); 7.78(d, J = 8.4 Hz, 1 H); 7.9-8.1(m, 4 H); 8.11(d, J = 7.5 Hz, 1 H); 8.27(d, J = 8.0 Hz, 1 H).
500mLの反応容器に、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−OMe(ペプチド誘導体IIIa)7.93g(5mmol)、上水(71.4mL)、t−BuOH(238mL)を仕込んだ。室温にて1N 水酸化ナトリウム水溶液25mL(25mmol)を滴下した。室温で終夜撹拌した後、1N 塩酸(79.3mL)を滴下した。t−BuOHを減圧留去し、残渣にMTBE(123.1mL)、THF(79.3mL)、酢酸エチル(23.8mL)を加え、吸引ろ過を行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−OH 7.48gを白色粉末として得た(収率94%)。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ ppm: 0.7-0.9(m, 24 H); 1.19(d, J = 7.0 Hz, 3 H); 1.33(s, 9 H); 1.3-1.7(m, 32 H); 1.84(s, 3 H); 2.00(s, 6 H); 2.42(s, 6 H); 2.48(s, 6 H); 2.4-2.6(m, 1 H); 2.6-2.8(m, 1 H); 2.96(s, 4 H); 2.9-3.1(m, 4 H); 4.1-4.4(m, 7 H); 4.55(dd, J1 = 14.5 Hz, J2 = 7.9 Hz, 1 H); 6.42, 6.79(br. s×2, 6 H); 7.68(d, J = 8.1 Hz, 1 H); 7.80(d, J = 7.8 Hz, 1 H); 7.8-8.1(m, 5 H); 8.27(d, J = 7.9 Hz, 1 H).
100mLの反応容器に、Cl−・H2 +−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体Ibの塩酸塩)1.00g(0.791mmol)、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−OH 1.51g(0.956mmol)、DMF(10mL)、HOBt 0.13g(0.96mmol)、EDC・HCl 0.30g(1.6mmol)、THF(18mL)を加え、氷浴にて冷却した。氷浴にて冷却、撹拌しながらTEA 0.33mL(2.4mmol)を添加した。氷浴にて冷却下、1週間撹拌した。0.5N塩酸(5mL)、上水(15mL)、MTBE(10mL)を添加し、室温下撹拌後静置、分液した。有機層を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体IVa)1.28gを白色粉末として得た(Cl−・H2 +−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体Ibの塩酸塩)からの収率58%)。
1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)δ ppm: 0.7-0.9(m, 36 H); 1.23(d, J = 7.2 Hz, 3 H); 1.3-1.9(m, 76 H); 1.88(s, 3 H); 1.9-2.1(m, 12 H); 2.4-2.45(m, 12 H); 2.45-2.5(m, 12 H); 2.5-2.6(m, 2 H); 2.70(dd, J1 = 17.9 Hz, J2 = 6.9 Hz, 2 H); 2.9-3.0(m, 8 H); 3.02(br. s, 8 H); 4.0-4.3(m, 11 H); 4.4-4.6(m, 2 H); 6.43, 6.72(br. s×2, 12 H); 6.87(s, 1 H); 7.00(br. s, 1 H); 7.07(br. s, 1 H); 7.65(t, J = 7.4 Hz, 1 H); 7.7-7.9(m, 3 H); 7.82(d, J = 6.8 Hz, 2 H); 7.9-8.1(m, 3 H); 8.0-8.2(m, 2 H); 8.17(d, J = 7.2 Hz, 1 H)。MS(ESI)m/z: 1392.7([M+2H]2+).
一般式(IX)
500mLの反応容器に、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体IVa)7.19g(2.58mmol)を仕込み、TFA 52mL(0.67mol)、上水(2.7mL)を加えた。室温下 1.5時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣(61.75g)を撹拌しながら、MTBE(217mL)を加えて固体を析出させた。吸引ろ過、真空乾燥を行い、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・2H2SO4 4.71gを類白色粉末として得た(収率98%)。
1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)δ ppm: 0.8-0.9(m, 36 H); 1.19(d, J = 6.8 Hz, 3 H); 1.3-1.8(34 H); 1.87(s, 3 H); 2.4-2.6(m, 2 H); 2.6-2.8(m, 2 H); 3.09(d, J = 6.0 Hz, 8 H); 4.1-4.4(m, 11 H); 4.5-4.6(m, 2 H), 6.5-8.3(m, 31 H).
一般式(VII)で表されるペプチド誘導体の4メタンスルホン酸塩
30mLの反応容器に、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体IVa)0.54g(0.19mmol)を仕込み、TFA 4.0mL(52mmol)、MsOH 0.10mL(1.3mmol)、トリイソプロピルシラン 0.20mL(0.97mmol)の混合物を加えた。室温下2.1時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣(2.76g)を撹拌しながら、MTBE(14mL)を加えて固体を析出させた。吸引ろ過、乾燥を行い、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・4MsOH 0.46gを淡黄色粉末として得た(収率は定量的)。
1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)δ ppm: 0.8-0.9(m, 36 H); 1.21(d, J = 6.8 Hz, 3 H); 1.3-1.8(34 H); 1.88(s, 3 H); 2.38(s, 12 H); 2.4-2.6(m, 2 H); 2.7-2.8(m, 2 H); 3.09(d, J = 5.6 Hz, 8 H); 4.1-4.6(m, 13 H); 4.5-4.6(m, 2 H), 6.6-8.3(m, 31 H).
100mLの反応容器に、Cl−・H2+−Leu−Leu−Leu−OMe(ペプチド誘導体IIa(X=Leu)の塩酸塩)1.14g(2.79mmol)とHOBt 0.40g(3.0mmol)を仕込み、THF(5mL)に懸濁させた。この懸濁液に、EDC・HCl 0.75g(3.9mmol)を加え、氷浴にて冷却しながらNMM 1.04mL(9.46mmol)を滴下した。Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OH(ペプチド誘導体Ia)2.92g(2.29mmol)をDMF(8.2mL)とTHF(12.1mL)の混合溶媒に溶解し、この溶液を先の反応懸濁液に氷浴にて冷却しながら滴下した。室温に上げながら3日間撹拌した。0.5N 塩酸(19mL)、THF(19mL)を加えて、吸引ろ過、乾燥を行い、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Leu−Leu−OMe(ペプチド誘導体IIIa) 2.10gを淡黄色粉末として得た(収率46%)。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ ppm: 0.8-1.0(m, 30 H); 1.37(s, 9 H); 1.44(s, 12 H); 1.2-1.8(m, 23 H); 1.88(s, 3 H); 2.04(s, 6 H); 2.46(s, 6 H); 2.57(s, 6 H); 2.4-2.6(m, 1 H); 2.71(dd, J1 = 16.2 Hz, J2 = 6.2 Hz, 1 H); 3.00(s, 4 H); 3.0-3.1(m, 4 H); 3.63(s, 3 H); 4.1-4.4(m, 7 H); 4.59(dd, J1 = 14.4 Hz, J2 = 7.6 Hz, 1 H); 6.42, 6.66(br. s×2, 6 H); 7.74(d, J = 8.4 Hz, 1 H); 7.81(d, J = 8.0 Hz, 1 H); 7.87(d, J = 8.8 Hz, 1 H); 7.96(d, J = 7.6 Hz, 1 H); 7.9-8.1(m, 2 H); 8.15(d, J = 7.6 Hz, 1 H); 8.32(d, J = 8.0 Hz, 1 H).
50mLの反応容器に、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Leu−Leu−OMe(ペプチド誘導体IIIa) 1.20g(0.737mmol)のt−BuOH(10.3mL)溶液を仕込み、上水(8.5mL)を加えた。氷浴にて冷却しながら水酸化リチウム一水和物 45.76mg(1.090mmol)の上水(2.8mL)溶液を添加し、氷浴にて冷却しながら1週間撹拌した。上清をデカンテーションで除き、上水(14.3mL)、1N 塩酸(1.1mL)、t−BuOH(3mL)を加えて吸引ろ過、乾燥してAc−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Leu−Leu−OHの白色粉末を得た。これを50mL反応容器に仕込み、Cl−・H2 +−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体Ibの塩酸塩) 0.93g(0.73mmol)、DMF(8.3mL)、HOBt 97.82mg(0.7239mmol)、EDC・HCl 0.36g(1.9mmol)、THF(14.5mL)を加え氷浴にて冷却した。氷浴にて冷却、撹拌しながらTEA 0.37mL(2.7mmol)を添加した。氷浴にて冷却下、終夜撹拌した。0.5N 塩酸(3.6mL)、上水(10mL)、MTBE(7.2mL)を添加し、室温下撹拌後静置、分液した。有機層を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Leu−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体IVa)0.65 gを類白色非晶質固体として得た(Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Leu−Leu−OMe(ペプチド誘導体IIIa)から2工程での収率31%)。
1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)δ ppm: 0.7-0.9(m, 42 H); 1.3-1.8(m, 73 H); 1.88(s, 3 H); 1.9-2.1(m, 12 H); 2.4-2.5(m, 24 H); 2.6-2.8(m, 4 H); 2.9-3.0(m, 8 H); 2.9-3.1(br. s, 8 H); 4.0-4.8(m, 13 H); 6.40, 6.63(br. s×2, 12 H); 7.0-8.4(m, 15 H).
50mLの反応容器に、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Leu−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体IVa)0.78g(0.28mmol)を仕込み、TFA 5.7mL(74mmol)、上水(0.29mL)を加えた。室温下 1.9時間撹拌後、MTBE(15mL)を加えて固体を析出させた。室温下 1.5時間撹拌後、吸引ろ過を行い、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・2H2SO4 0.45gを類白色粉末として得た(収率86%)。
1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)δ ppm: 0.8-1.0(m, 42 H); 1.3-1.8(37 H); 1.90(s, 3 H); 2.4-2.6(m, 2 H); 2.7-2.9(m, 2 H); 3.1-3.2(br. s, 8 H); 4.1-4.4(m, 11 H); 4.5-4.6(m, 2 H), 6.6-8.4(m, 31 H).
200mLの反応容器に、Cl−・H2 +−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe(ペプチド誘導体Icの塩酸塩) 2.50g(1.9mmol)、HOBt 341mg(2.52mmol)を仕込み、THF(19.9mL)に懸濁させた。氷浴にて冷却し、EDC・HCl 1.42g(6.48mmol)を加え、NMM 1.39mL(12.6mmol)を滴下した。Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−OH 2.83g(1.8mmol)をDMF(19.8mL)とTHF(19.8mL)の混合溶媒に溶解し、この溶液を先の反応懸濁液に氷浴にて冷却しながら滴下した。氷浴にて冷却しながら3日間撹拌し、0.5N 塩酸(56.6mL)、酢酸エチル(28.3mL)を加え分液した。この有機層を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してAc−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe(ペプチド誘導体IVb)2.81gを白色固体として得た(Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−OHからの収率56%)。
1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)δ ppm: 0.81-0.94(m, 36 H), 1.20(d, J = 6.8 Hz, 3 H), 1.2-1.6(76 H); 1.85(s, 3 H); 2.00(s, 12 H); 2.42(s, 12 H); 2.47(s, 12 H); 2.5-2.7(m, 4 H); 2.95(s, 8 H), 3.01(br, 8 H), 3.58(s, 3 H); 4.1-4.4(m, 11 H); 4.52(m, 2 H).
50mLの反応容器に、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Ala−Leu−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe(ペプチド誘導体IVb)2.80g(1.0mmol)を仕込み、水冷にてTFA40mL(0.52mol)、上水(2mL)を加えた。室温下1時間撹拌し、エバポレーターで濃縮した。濃縮残渣にMTBE(91mL)を加え、室温で終夜撹拌した。吸引ろ過し、真空乾燥を行ってAc−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−OMe・2H2SO4 2.16gを白色固体として得た(収率は定量的)。
1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)δ ppm: 0.7-0.9(m, 36 H), 1.20(d, J = 5.0 Hz, 3 H); 1.3-1.7(m, 34 H); 1.88(s, 3 H); 2.4-2.7(m, 4 H); 3.10(d, J = 5.6 Hz, 8 H), 3.61(s, 3 H); 4.2-4.3(m, 11 H); 4.53(m, 2 H).
50mLの反応容器に、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−OMe・2H2SO4 2.13g(1.1mmol)を仕込み、水冷にて8N アンモニア/MeOH溶液42.6mL(341mmol)を加えた。室温にて1週間撹拌し、吸引ろ過し、ケーキをMeOH(8.5mL)で2回、MTBE(8.5mL)で1回洗浄し、真空乾燥を行い、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・2H2SO4 2.07gを白色固体として得た(収率は定量的)。
塩交換反応による、ペプチド誘導体4塩酸塩
500mLの反応容器に、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・2H2SO4 4.71g(2.54mmol)を仕込み、0.5N 塩酸180mL(90mmol)、THF(300mL)を加え室温下15時間撹拌した後、上清(370mL)を除去し、THF(360mL)を加え撹拌、静置後上清を除去した。THF(100mL)、MTBE(263mL)を加えて室温下0.4時間撹拌後、吸引ろ過し、真空乾燥して、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・4HCl 3.15gを白色粉末として得た(収率69%)。
IR(KBr)ν cm-1: 3273(s); 2957(m); 1626(s); 1541(s).
塩交換反応による、ペプチド誘導体4塩酸塩
50mLの反応容器に、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・2H2SO4 0.41g(0.22mmol)を仕込み、0.5N 塩酸15mL(7.5mmol)、THF(10mL)を加え室温下19時間撹拌した後、上清(32mL)を除去し、THF(45mL)を加え撹拌、静置後上清を除去した。MTBE(8mL)を加えて室温下0.5時間撹拌後、吸引ろ過し、真空乾燥して、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・4HCl 0.11gを白色粉末として得た(収率28%)。
1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)δ ppm: 0.8-1.0(m, 42 H); 1.3-1.8(37 H); 1.89(s, 3 H); 2.4-2.6(m, 2 H); 2.75(dd, J1 = 16.6 Hz、J2 = 5.8 Hz、2 H); 3.0-3.1(m, 8 H); 4.1-4.4(m, 11 H); 4.4-4.6(m, 2 H), 6.6-8.4(m, 31 H).
塩交換反応による、ペプチド誘導体4塩酸塩
10mLの反応容器に、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・4MsOH 0.17g(0.083mmol)を仕込み、0.5N塩酸6.9mL(3.5mmol)、THF(4.6mL)を加え室温下終夜撹拌した後、上清を除去し、THF(15mL)を加え撹拌、静置後上清を除去した。MTBE(5mL)を加えて室温下1.1時間撹拌後、吸引ろ過、真空乾燥を行って、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・4HCl 0.06gを白色固体として得た(収率40%)。
塩交換反応による、ペプチド誘導体4塩酸塩
50mLの反応容器に、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・4TFA 0.18g(0.085mmol)を仕込み、0.3N 塩酸 12.4mL(3.72mmol)、THF(12mL)を加え室温下振とうした。遠心沈降を行い、上清を除去した。THF(9mL)を加え振とう、静置後上清を除去した。MTBE(4mL)を加えて振とう後、吸引ろ過し、真空乾燥を行って、Ac−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−Leu−Ala−Leu−Arg−Leu−Asp−Leu−Arg−NH2・4HCl0.07gを白色固体として得た(収率46%)。
ペプチド誘導体Iaの合成。
200mLの反応容器にCl−・H2 +−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe(ペプチド誘導体VIaの塩酸塩)8.26g(10.9mmol)、HOBt 1.47g(10.9mmol)を加え、THF(84.6mL)に懸濁させた。氷浴にて冷却し、EDC・HCl 2.40g(12.5mmol)を加えた。氷浴にて冷却しながらFmoc−Arg(Pbf)−Leu−OH(ペプチド誘導体Vb(N末端保護基はFmoc基))8.52g(10.9mmol)のTHF(9.2mL)溶液を滴下した後、NMM 2.75g(27.2mmol)のTHF(33mL)溶液を滴下した。氷浴にて冷却しながら終夜撹拌した後、酢酸エチル(59.2mL)と上水(42.3mL)を加え、分液した。有機層を5%重曹水(50.8mL)、1N 塩酸(50.8mL)、上水(50.8mL)の順で洗浄した。エバポレーターにて減圧濃縮後、真空ポンプでポンプアップし、Fmoc−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe 20.54gを白色固体として得た(収率は定量的)。
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ ppm: 0.84(d, J = 6.2 Hz, 6 H); 0.88(d, J = 6.2 Hz, 6 H); 1.3-2.0(m, 35 H); 2.07(s, 6 H); 2.49(s, 3 H); 2.51(s, 3 H); 2.56(s, 3 H); 2.59(s, 3 H); 2.84(dd, J1 = 15.1 Hz, J2 = 4.2 Hz, 2 H); 2.91(s, 4 H); 3.1-3.3(br. s, 2 H); 3.32(br. s, 2 H); 3.71(s, 3 H); 4.0-4.2(m, 2 H); 4.2-4.4(m, 3 H); 4.4-4.6(m, 1 H); 4.5-4.7(m, 2 H); 6.14, 6.37(br. s×2, 6 H); 6.66(br. s, 1 H); 7.1-7.3(m, 1 H); 7.21(d, J = 7.8 Hz, 2 H); 7.36(t, J = 7.4 Hz, 2 H); 7.5-7.6(br. s, 2 H); 7.60(t, J = 6.7 Hz, 2 H); 7.6-7.8(br. s, 1 H); 7.73(d, J = 7.6 Hz, 2 H).
200mLの反応容器に、Fmoc−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe 14.68g(10mmol)、THF(95.4mL)を仕込み、室温にてピペリジン 1.53g(18mmol、1.8eq.)を滴下した。反応溶液を室温で7時間撹拌し、MTBE(58.7mL)、AcOEt(14.7mL)、0.5N 塩酸(88mL)を加えた。分液した有機層を1N 塩酸(88mL)、上水(88mL)で順次洗浄した後、有機層をエバポレーターで濃縮した。残渣にMeOH(58.7mL)、上水(29.4mL)、MTBE(58.7mL)、n−ヘプタン(58.7mL)を加え、溶解させた後、分液した。下層をMTBE/ヘプタン(1/1(v/v))の混合溶液(117.4mL)で2回洗浄した後、減圧でMeOHを留去した。残渣に上水(29.4mL)、酢酸エチル(58.7mL)、食塩(2.0g)を加え分液した後、有機層を減圧濃縮し、Cl−・H2 +−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe 12.66gを白色固体として得た(収率98%)。
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ ppm: 0.84(m, 12 H); 1.38(s, 9 H); 1.45(s, 12 H); 1.6-2.4(m, 14 H); 2.07(s, 6 H); 2.47(s, 6 H); 2.54(s, 6 H); 2.7-2.9(m, 2 H); 2.94(s, 4 H); 3.1-3.4(m, 4 H); 3.68(s, 3 H); 4.0-4.7(m, 5 H); 6.50(br. s, 6 H); 7.6-9.4(m, 8 H).
100mLの反応容器に、Cl−・H2 +−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe 8.97g(7mmol)、THF(63mL)を加え、氷浴にて冷却した。氷浴にて冷却しながら、無水酢酸1.07g(10.5mmol、1.5eq.)を加えた後、氷浴にて冷却しながらTEA1.77g(17.5mmol、2.5eq.)を滴下した。氷浴にて冷却しながら2時間撹拌し、酢酸エチル(36mL)、1N 塩酸(36mL)を加えた。分液した有機層を1N 塩酸(36mL)、5%重曹水(36mL)で順次洗浄した後、有機層を減圧濃縮し、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe8.46gを白色固体として得た(収率93%)。
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ ppm: 0.85(d, J = 6.6 Hz, 3 H); 0.88(d, J = 6.4 Hz, 6 H); 0.93(d, 5.4 Hz, 3 H); 1.42(s, 9 H); 1.46(s, 12 H); 1.3-2.0(m, 14 H); 2.05(s, 3 H); 2.09(s, 6 H); 2.48(s, 3 H); 2.50(s, 3 H); 2.55(s, 3 H); 2.57(s, 3 H); 2.7-2.8(m, 1 H); 2.9-3.1(m, 1 H); 2.95(s, 4 H); 3.1-3.3(m, 3 H); 3.3-3.4(m, 1 H); 3.72(s, 3 H); 3.9-4.1(m, 1 H); 4.4-4.6(m, 2 H); 4.5-4.7(m, 2 H); 6.0-6.5(m, 6 H); 7.14(d, J = 8.7 Hz, 1 H); 7.4-7.5(m, 1 H); 7.5-7.7(m, 3 H).
500mLの反応容器に、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe 8.11g(6.3mmol)、t−BuOH(243.5mL)、上水(73.1mL)を加え、溶解させた。水浴で冷却しながら、1N 水酸化ナトリウム水溶液 9.45mL(9.45mmol、1.5eq.)を滴下した。氷浴で冷却しながら終夜撹拌し、1N 塩酸 10.4mL(10.4mmol;1.65eq.)を滴下した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチル(105.5mL)、上水(40.6mL)を加え、分液した。有機層を0.5%KHCO3水溶液(81.2mL)、0.25%KHCO3水溶液(81.2mL)、0.2N 塩酸(81.2mL)で順次洗浄した後、有機層を減圧濃縮し、Ac−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OH(ペプチド誘導体Ia)7.68gを白色固体として得た(収率95.6%)。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ ppm: 0.82(d, J = 6.4 Hz, 6 H); 0.85(d, J = 6.6 Hz, 6 H); 1.33(s, 9 H); 1.41(s, 12 H); 1.3-1.5(m, 8 H); 1.5-1.7(m, 5 H); 1.6-1.9(m, 1 H); 1.84(s, 3 H); 2.00(s, 6 H); 2.42(s, 6 H); 2.48(s, 6 H); 2.4-2.6(m, 1 H); 2.68(dd, J1 = 15.8 Hz, J2 = 6.2 Hz, 1 H); 2.96(m, 4 H); 2.9-3.1(m, 4 H); 4.09(dd, J1 = 13.1 Hz, J2 = 7.6 Hz, 1 H); 4.1-4.4(m, 3 H); 4.55(dd, J1 = 14.6 Hz, J2 = 7.7 Hz, 1 H); 6.39, 6.5-6.9(br. s×2, 6 H); 7.63(d, J = 8.5 Hz, 1 H); 7.91(d, J = 8.0 Hz, 1 H); 7.98(d, J = 7.7 Hz, 1 H); 8.06(d, J = 7.4 Hz, 1 H); 8.26(m, 1 H).
ペプチド誘導体Ibの合成。
100mLの反応容器を用い、Cl−・H2 +−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体VIbの塩酸塩) 1.00g(1.41mmol)、DMF(2.1mL)、THF(1.5mL)、HOBt 0.20g(1.5mmol)、EDC・HCl 0.32g(1.7mmol)、TEA 0.24mL(1.7mmol)を仕込み氷浴で冷却した。氷浴にて冷却しながら、Fmoc−Arg(Pbf)−Leu−OH(ペプチド誘導体Vb(N末端保護基はFmoc基))1.04g(1.32mmol)のTHF(3mL)溶液を添加した。氷浴にて冷却しながら終夜撹拌した後、MTBE(15mL)、上水(15mL)を加えると固体が析出した。吸引ろ過を行い、乾燥して、Fmoc−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2 1.77gを類白色粉末として得た(Fmoc−Arg(Pbf)−Leu−OH(ペプチド誘導体Vb(N末端保護基はFmoc基))からの収率86%)。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ ppm: 0.7-0.9(m, 12 H); 1.32(s, 9 H); 1.3-1.8(m, 26 H); 2.00(s, 3 H); 2.00(s, 3 H); 2.42(s, 6 H); 2.5(s, 6 H); 2.5-2.6(m, 1 H); 2.6-2.7(m, 1 H); 2.94(s, 2 H); 2.95(s, 2 H); 3.0-3.1(m, 4 H); 4.00(m, 1 H); 4.13(dd, J1 = 13.6 Hz, J2 = 8.0 Hz, 1 H); 4.2-4.4(m, 5 H); 4.4-4.6(m, 1 H); 4.58(dd, J1 = 14.6 Hz, J2 = 7.8 Hz, 1 H) 6.42, 6.68(br. s×2, 6 H); 6.99(s, 1 H); 7.16(s, 3 H); 7.31(t, J = 7.5 Hz, 2 H); 7.41(t, J = 7.5 Hz, 2 H); 7.46(d, J = 8.4 Hz, 1 H); 7.7-7.8(m, 4 H); 7.8-7.9(m, 1 H); 7.88(d, J = 7.6 Hz, 2 H); 8.31(d, J = 7.6 Hz, 1 H).
30mLの反応容器を用い、Fmoc−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2 0.97g(0.67mmol)にDMF(2.5mL)を加えて溶解した。ピペリジン 0.10mL(1.0mmol)を加え、室温下2.1時間撹拌した。MTBE(3mL)、酢酸エチル(7mL)、0.24N 塩酸(8.5mL)を加えると固体が析出した。室温下終夜撹拌後、吸引ろ過し、乾燥してCl−・H2 +−Arg(Pbf)−Leu−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体Ibの塩酸塩)0.77gを淡黄色粉末として得た(収率91.2%)。
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ ppm: 0.82(d, J = 6.4 Hz, 3 H); 0.8-0.9(m, 9 H); 1.33(s, 9 H); 1.3-1.6(m, 10 H), 1.41(s, 12 H); 1.6-1.8(m, 4 H); 2.01(s, 3 H); 2.01(s, 3 H); 2.42(s, 3 H); 2.43(s, 3 H); 2.48(s, 6 H); 2.4-2.6(m, 1 H); 2.6-2.8(m, 1 H); 2.96(s, 4 H); 3.0-3.1(m, 4 H); 3.79(br. s, 1 H); 4.14(dd, J1 = 13.6 Hz, J2 = 8.0 Hz, 1 H); 4.26(dd, J1 = 14.8 Hz, J2 = 7.6 Hz, 1 H); 4.3-4.5(m, 1 H); 4.61(dd, J1 = 14.4 Hz, J2 = 8.0 Hz, 1 H); 6.51, 6.86(br. s×2, 6 H); 7.00(s, 1 H); 7.21(s, 1 H)7.3-8.2(m, 5 H); 8.47(d, J = 8.0 Hz, 1 H); 8.55(d, J = 8.0 Hz, 1 H).
200mLの反応容器を用い、Fmoc−Arg(Pbf)−OH・0.5IPE 5.60g(8.0mmol)、Cl−・H2 +−Leu−Ot−Bu 1.88g(8.4mmol)、HOBt 1.08g(8.0mmol)を加え、THF(39.2mL)に懸濁させた。氷浴にて冷却した後、EDC・HCl 1.69g(8.8mmol)を加えた。氷浴にて冷却しながら30分撹拌した後、NMM 1.78g(17.6mmol)のTHF(5.6mL)溶液を滴下した。氷浴にて冷却しながら4時間撹拌した後、酢酸エチル(14mL)と9%食塩水(28mL)を加え、分液した。有機層を飽和重曹水(28mL)、5%重曹水(28mL)、0.5N 塩酸(28mL)、0.1N 塩酸(28mL)、上水(28mL)の順で洗浄した。エバポレーターにて減圧濃縮後、真空ポンプでポンプアップし、Fmoc−Arg(Pbf)−Leu−Ot−Bu 6.66gを白色固体として得た(収率は定量的)。
1H NMR(400 MHz、CDCl3)δ ppm: 0.85(d, J = 6.8 Hz, 6 H); 1.42(m, 15 H); 1.54-1.97(m, 7 H); 2.07(s, 3 H); 2.51(s, 3 H); 2.59(s, 3 H) ; 2.91(s, 2 H); 3.31(br. s, 2 H); 4.14(m, 1 H); 4.31-4.38(m, 4 H); 5.95-6.30(br. s, 3 H); 7.23(m, 2 H); 7.33(t, J = 7.5 Hz, 2 H); 7.56(d, J = 7.4 Hz, 2 H); 7.72(d, J = 7.6 Hz, 2 H).
100mLの反応容器を用い、Fmoc−Arg(Pbf)−Leu−Ot−Bu 5.01g(6.0mmol)を仕込み、上水(3mL)、濃塩酸(3mL)を加え、80℃の油浴上で加熱、撹拌した。酢酸エチル(20mL)、上水(20mL)を加え分液した後、有機層を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してFmoc−Arg(Pbf)−Leu−OH(ペプチド誘導体Vb(N末端保護基はFmoc基))4.79gを白色固体として得た(収率は定量的)。
1H NMR (400 MHz、CDCl3) δ ppm: 0.87(d, J = 4.9 Hz, 6 H); 1.42(s, 6 H); 1.54-1.97(m, 7 H); 2.05(s, 3 H); 2.47(s, 3 H); 2.55(s, 3 H); 2.90(s, 2 H); 3.14-3.31(br. s, 2 H); 4.1-4.5(m, 5 H); 6.0 -6.6(br. s, 3 H); 7.22(m, 2 H); 7.34(t, J = 7.4 Hz, 2 H); 7.54(d, J = 7.4 Hz, 2 H); 7.71(d, J = 7.6 Hz, 2 H).
30mLの反応容器を用い、Boc−Arg(Pbf)−OH 2.11g(4.0mmol)に5.2% HCl/MeOH溶液 6.73g(9.6mmol)を添加した。反応溶液を室温で終夜撹拌した後、内温39〜42℃で5時間撹拌した。反応溶液をエバポレーターで濃縮、真空ポンプでポンプアップした。濃縮乾固物にMTBE(10mL)、上水(10mL)を加えて溶解し、分液した。水層をMTBE(10mL)で洗浄した後、炭酸ナトリウム 594mg(5.6mmol、1.4eq.)、酢酸エチル(40mL)を加え、分液した。有機層を10%炭酸カリウム水溶液(10mL)で3回洗浄した。有機層を濃縮し、析出した白色固体を綿栓ろ過にてろ別し、ろ液を濃縮した。H−Arg(Pbf)−OMe 1.53gを微黄色粘ちょう油状物として得た(収率71%)。
1H NMR(400 MHz、CDCl3)δ ppm: 1.46(s, 6 H); 1.62-1.85(m, 4 H); 2.09(s. 3 H); 2.53(s, 3 H); 2.58(s, 3 H); 2.95(s, 2 H); 3.19(m, 2 H); 3.50(m, 1 H); 3.83(s, 3 H); 6.0-6.15(m, 3 H).
100mLの反応容器を用い、THF(4mL)中、H−Arg(Pbf)−OMe 0.96g(2.17mmol)、HOBt 0.30g(2.2mmol、1.02eq.)、EDC・HCl 0.49g(2.6mmol、1.18eq.)、TEA 0.26g(2.6mmol、1.27eq.)を懸濁した。氷浴で冷却しながら、Boc−Leu−OH・H2O 0.53g(2.1mmol)のTHF(4mL)溶液を添加した。氷浴で冷却しながら終夜撹拌した後、酢酸エチル(5mL)を加え内温2℃で析出結晶をろ別した。ろ液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、Boc−Leu−Arg(Pbf)−OMe 1.43gを白色固体として得た(収率は定量的)。
1H NMR (400 MHz、CDCl3) δ ppm: 0.93(d, J = 6.4 Hz, 3 H); 0.95(d, J = 6.4 Hz, 3 H); 1.42(s, 9 H); 1.46(s, 6 H); 1.4-1.8(m, 6 H); 1.8-2.0(m, 1 H); 2.09(s, 3 H); 2.53(s, 3 H); 2.59(s, 3 H); 2.95(s, 2 H); 3.1-3.3(br. s, 2 H); 3.74(s, 3 H); 4.0-4.2(m, 1 H); 4.55(dt, J1 = 8.3 Hz, J2 = 4.5 Hz, 1 H); 5.13(d, J = 6.8 Hz, 1 H); 6.06, 6.15(br. s×2, 3 H); 7.03(d. J = 8.0 Hz, 1 H).
30mLの反応容器を用い、Boc−Leu−Arg(Pbf)−OMe 1.20g(1.76mmol)に5.88% HCl/MeOH 2.19g(3.53mmol)を加え、内温41〜43℃で終夜撹拌後、室温下2日間撹拌した。減圧濃縮し、残渣にTHF(1mL)を加えて置換濃縮した後、THF(3mL)を加えて100mLの反応容器へ移送した。Fmoc−Asp(Ot−Bu)−OH 0.74g(1.8mmol、1.03eq.)、HOBt 0.24g(1.8mmol、1.02eq.)、EDC・HCl 0.39g(2.0mmol、1.16eq.)を順に加え、懸濁した。氷浴にて冷却しながらNMM 0.41mL(3.7mmol、2.13eq.)を添加した。氷浴にて冷却しながら終夜撹拌した後、酢酸エチル(6mL)を加え析出結晶をろ別した。ろ液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。Fmoc−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe 1.28gを、白色固体として得た(Boc−Leu−Arg(Pbf)−OMeから2工程での収率99.9%)。
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ ppm: 0.88(d, J = 5.6 Hz, 3 H); 0.93(d, J = 6.0 Hz, 3 H); 1.44(s, 9 H); 1.44(s, 6 H); 1.4-1.9(m, 7 H); 2.08(s, 3 H); 2.52(s, 3 H); 2.58(s, 3 H); 2.66(dd, J1 = 17.1 Hz, J2 = 4.9 Hz, 1 H); 2.88(dd, J1 = 17.1 Hz, J2 = 3.6 Hz, 1 H); 2.93(s, 2 H); 3.19(br. s, 2 H); 3.70(s, 3 H); 4.21(t, J = 6.6 Hz, 1 H); 4.43(d, J = 6.4 Hz, 1 H);4.4-4.5(br. s, 1 H); 4.57(dt, J1 = 8.5 Hz, J2 = 4.1 Hz, 1 H); 5.8, 6.10(br. s×2, 3 H); 6.0-6.2(br. s, 1 H); 6.8-6.9(m, 1 H); 7.31(t, J = 7.6 Hz, 1 H); 7.41(t, J = 7.6 Hz, 1 H); 7.57(d, J = 7.6 Hz, 1 H); 7.77(d, J = 7.6 Hz, 1 H).
50mLの反応容器を用い、Fmoc−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe 0.74g(1.09mmol)にTHF(1.6mL)を加え溶解した。ピペリジン 0.21mL(2.1mmol、1.94eq.)を加え、室温下終夜撹拌した。酢酸エチル(2mL)と上水(4mL)を加えると白色固体が析出した。析出結晶をろ別し、ろ液に酢酸エチル(3.5mL)を加え、撹拌後静置、分液した。淡黄色濁った有機層を0.5N 塩酸(1mL)、1N 塩酸(1mL)、1N 塩酸(2mL×2)の順で洗浄した。減圧濃縮し、Cl−・H2 +−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−OMe(ペプチド誘導体VIaの塩酸塩)0.71gを淡黄色水アメ状残さとして得た(収率86%)。
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ ppm: 0.90(d, J = 5.6 Hz, 3 H); 0.94(d, J = 6.0 Hz, 3 H); 1.45(s, 9 H); 1.47(s, 6 H); 1.6-1.9(m, 7 H); 2.10(s, 3 H); 2.49(s, 3 H); 2.55(s, 3 H); 2.97(s, 2 H); 3.06(dd, J1 = 19.0 Hz, J2 = 6.8 Hz, 1 H); 3.12(dd, J1 = 19.0 Hz, J2 = 6.4 Hz, 1 H); 3.27(br. s, 2 H); 3.70(s, 3 H); 4.3-4.5(m, 2 H);4.5-4.6(m, 1 H); 6.68(br. s, 3 H); 8.5-8.9(br. s, 1 H); 8.17(br. s, 1 H); 8.58(br. s, 3 H).
100mLの反応容器を用い、Boc−Leu−Arg(Pbf)−OMe 6.54g(10mmol)に8N NH3/MeOH溶液 30mL(240mmol)を添加した。反応溶液を室温下2日間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣にCPME(14.5mL)を加えて置換濃縮を行い、無色液状のBoc−Leu−Arg(Pbf)−NH2のCPME溶液を得た。100mLの反応容器を用い、4M HCl/CPME溶液 10.4mL(41.6mmol)を仕込み、氷浴にて冷却しながら前記で合成したBoc−Leu−Arg(Pbf)−NH2のCPME溶液を滴下した。室温下終夜撹拌し、吸引ろ過を行い、CPME(12.1mL×2)で洗い込んだ。40℃で温風乾燥し、Cl−・H2 +−Leu−Arg(Pbf)−NH2 5.68gを白色粉末として得た(Boc−Leu−Arg(Pbf)−OMeから2工程での収率は定量的)。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ ppm: 0.8-1.0(m, 6 H); 1.41(s, 6 H); 1.3-1.6(m, 5 H); 1.6-1.8(m, 2 H); 2.01(s, 3 H); 2.43(s, 3 H); 2.49(s, 3 H); 3.0-3.1(br. s, 2 H); 3.8-3.9(br. s, 1 H); 4.2-4.3(m, 1 H); 6.08, 6.54(br. s×2, 3 H); 7.06(s, 1 H); 7.52(s, 1 H); 8.2-8.4(m, 3 H); 8.6-8.7(m, 1 H).
100mLの反応容器を用い、上記で合成したCl−・H2 +−Leu−Arg(Pbf)−NH2 1.02g(1.77mmol)、HOBt 0.25g(1.9mmol)、EDC・HC l0.40g(2.1mmol)、Fmoc−Asp(Ot−Bu)−OH 0.63g(1.5mmol)を仕込んだ。撹拌しながらTHF(8mL)を加え、氷浴にて冷却しながらNMM 0.45mL(4.1mmol)を添加した。氷浴にて冷却しながら5.8時間撹拌した後、酢酸エチル(8mL)、上水(8mL)を加え室温下撹拌後静置、分液した。有機層を飽和重層水(4mL)、上水(4mL)、1N 塩酸(4mL×2回)、上水(4mL×2)の順で洗浄した。得られたFmoc−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2の酢酸エチル溶液にピペリジン 0.36mL(3.6mmol、2.05eq.)を加え、室温下終夜撹拌した。上水(4mL)を加え撹拌、静置、分液を行い、有機層を上水洗浄(4mL×2回)した。減圧濃縮し、残渣にDMF(2.5mL)を加え再度減圧濃縮を行った。析出した固体をろ別し、ろ液をポンプアップしてH−Asp(Ot−Bu)−Leu−Arg(Pbf)−NH2(ペプチド誘導体VIb)0.98gを得た(Cl−・H2 +−Leu−Arg(Pbf)−NH2から2工程での収率78%)。
1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ ppm: 0.91(d, J = 6.0 Hz, 3 H); 0.96(d, J = 6.0 Hz, 3 H); 1.43(s, 9 H); 1.46(s, 6 H); 1.5-1.9(m, 6 H); 1.9-2.0(m, 1 H); 2.09(s, 3 H); 2.51(s, 3 H); 2.58(s, 3 H); 2.5-2.7(m, 1 H); 2.7-2.8(m, 1 H); 2.9-3.0(s, 2 H); 3.2-3.3(m, 2 H); 3.68(dd, J1 = 7.2 Hz, J2 = 4.8 Hz, 2H); 3.7-3.8(m, 1 H); 4.2-4.4(m, 1 H); 4.48(dt, J1 = 8.6 Hz, J2 = 4.7 Hz, 1 H); 5.66(s, 1 H); 6.18, 6.28(br. s×2, 3 H); 6.94(s, 1 H); 7.45(d, J = 8.0 Hz, 1 H); 7.90(d, J = 6.8 Hz, 1 H).
10Lの反応容器にCl−・H2 +−Leu−OMe 300g(1.65mol)、Boc−Ala−OH 327g(1.73mol)、HOBt 268g(1.98mol)、THF(3600mL)を仕込んだ後、内温−5〜0℃でTEA 550mL(3.96mol)を滴下した。この溶液にEDC・HCl 380g(1.98mol)を加えた後、氷浴で冷却しながら終夜撹拌した。反応液に9%食塩水(1500mL)、酢酸エチル(3000mL)を加えて分液した後、7%重層水(1500mL×2回)、上水(1500mL)、1N 塩酸(1500mL)、上水(1500mL×3回)の順で有機層を洗浄した。減圧濃縮した後、濃縮残渣にCPME(1500mL)を加えて置換濃縮し、Boc−Ala−Leu−OMeのCPME溶液を得た。これに2M HCl/CPME溶液3300mL(6.60mol)を加え、室温で終夜撹拌した。減圧濃縮し、Cl−・H2 +−Ala−Leu−OMeを得た。これに、THF(1800mL)を加えた。外温40℃に加熱し、Boc−Leu−OH 364g(1.46mol)、HOBt 230g(1.70mol)を加えた。内温−5〜0℃でEDC・HCl 326g(1.70mol)を加え、TEA 470mL(3.41mol)を滴下した。この反応液を氷浴で冷却しながら終夜撹拌した。反応液に9%食塩水(1800mL)、酢酸イソプロピル(3600mL)を加えて分液した後、7%重層水(1800mL×2回)、上水(1800mL)、1N 塩酸(1800mL)、上水(1800mL×3回)の順で有機層を洗浄した。有機層をろ過し、ろ液を濃縮した。濃縮残渣をIPA(1000mL)から再結晶し、ろ取した結晶をMTBE/IPA(9/1)混合溶液(4800mL)に溶解し、不溶物をろ別した。ろ液を減圧濃縮後、IPA(912mL)から再結晶を行い、ろ取した結晶を真空乾燥し294gのBoc−Leu−Ala−Leu−OMeを得た(Cl−・H2 +−Leu−OMeから3工程での収率40%)。
1H NMR (400 MHz、CDCl3)δ ppm: 0.9-1.0(m, 12 H); 1.38(d, J = 7.2 Hz, 3 H); 1.44(s, 9 H); 1.5-1.7(m, 6 H); 3.73(s, 3 H); 4.09(br. s, 1 H); 4.4-4.6(m, 2 H); 4.86(br. s, 1 H); 6.5-6.7(m, 2 H).
5Lの反応容器にBoc−Leu−Ala−Leu−OMe 250g(0.56mol)、2M HCl/CPME溶液1160mL(2.32mol)を仕込み、室温で終夜撹拌した。IPE(1250mL)を加えて10分撹拌した後、デカンテーションにより上澄みを除去した。IPE(3000mL)を加えて10分撹拌した後、デカンテーションにより上澄みを除去した。減圧濃縮し、199gのCl−・H2 +−Leu−Ala−Leu−OMe(ペプチド誘導体IIa(X=Ala)の塩酸塩)を得た(収率96.3%)。
1H NMR(400 MHz、CDCl3)δ ppm: 0.90-0.97(m, 12 H); 1.42(d, J = 6.8 Hz, 3 H); 1.63-1.82(m, 6 H); 3.71(s, 3 H); 4.38(br. s, 1 H); 4.47-4.50(m, 1 H); 4.71(br. s, 1 H); 7.59(br. s, 1 H); 8.28(br. s, 3 H); 8.51(br. s, 1 H).
ペプチド誘導体IIa(X=Leu)の塩酸塩
30mLの反応容器にH−Leu−Leu−Leu−OH 1.00g(2.80mmol)を仕込み、2M HCl/MeOH溶液5mL(10mmol)を加えて室温下終夜撹拌した。減圧濃縮を行い、Cl−・H2 +−Leu−Leu−Leu−OMe(ペプチド誘導体IIa(X=Leu)の塩酸塩)1.17gを得た(収率は定量的)。
1H NMR (400 MHz、D2O) δ ppm: 0.82 (d, J = 6.6 Hz, 3 H); 0.83-0.90 (m, 12 H); 0.92 (d, J = 6.6 Hz, 3 H); 1.3-1.8 (m, 9 H); 3.5-3.7 (s, 3 H); 3.6-3.9 (m, 1 H); 4.2-4.4 (m, 1 H); 4.4-4.5 (m, 1 H); 8.14 (br. s, 3 H); 8.46 (d, J = 7.8 Hz, 1 H); 8.61 (d, J = 8.4 Hz, 1 H).
Claims (16)
- 一般式(I)
で表されるペプチド誘導体Iと、
一般式(II)
で表されるペプチド誘導体IIとを、ビルディングブロックとして用い、これらを順次カップリングし、側鎖保護基を強酸で脱保護し、さらに末端脱保護工程、修飾工程及び/又は塩交換工程を含んでもよい各工程よりなる、
一般式(VII)
又は、
一般式(VIII)
で表されるペプチド誘導体の製造方法。 - 前記ペプチド誘導体IのN末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iaと、前記ペプチド誘導体IIのC末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体IIaとをカップリングさせ、生じたペプチド誘導体IIIaのC末端を脱保護した後に、さらに前記ペプチド誘導体IのC末端がアミド基であるペプチド誘導体Ibとカップリングさせ、得られたペプチド誘導体IVaの側鎖保護基を脱保護する工程を含む請求項2に記載の製造方法。
- 前記ペプチド誘導体IのN末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iaと、前記ペプチド誘導体IIのC末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体IIaとをカップリングさせ、生じたペプチド誘導体IIIaのC末端を脱保護した後に、さらに前記ペプチド誘導体IのC末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体Icとカップリングさせ、得られたペプチド誘導体IVbの側鎖保護基を脱保護した後にC末端エステル基をアミド基へと変換する工程を含む請求項2に記載の製造方法。
- 前記ペプチド誘導体IIaのC末端エステルがメチルエステルである、請求項3又は4に記載の製造方法。
- 前記ペプチド誘導体IcのC末端エステルがメチルエステルである、請求項4に記載の製造方法。
- 前記保護基A及び前記保護基Cが、2,2,4,6,7−ペンタメチル−2,3−ジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル基である請求項3〜7のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記保護基Bが、t−ブチルエステルである請求項3〜8のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記ペプチド誘導体IのN末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iaの調製において、ペプチド誘導体VのN末端がアセチル化されているペプチド誘導体Vaと、前記ペプチド誘導体VIのC末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体VIaをカップリングさせ、その後C末端エステルを脱保護してペプチド誘導体Iaを得る工程;及び/又は、前記ペプチド誘導体VのN末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vbと、前記ペプチド誘導体VIaとのカップリング後に、N末端をアセチル基に変換、並びにC末端エステルを脱保護してペプチド誘導体Iaを得る工程を含む請求項7〜9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記ペプチドVIaのC末端エステル基がメチルエステルである、請求項10に記載の製造方法。
- 前記ペプチド誘導体IのC末端がアミド化されているペプチド誘導体Ibの調製において、前記ペプチド誘導体VのN末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vbと、前記ペプチド誘導体VIのC末端がアミド化されているペプチド誘導体VIbとをカップリングさせ、その後N末端を脱保護してペプチド誘導体Ibを得る工程を含む、請求項7〜9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記ペプチド誘導体IのC末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体Icの調製において、前記ペプチド誘導体VのN末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vbと、前記ペプチド誘導体VIのC末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体VIaとをカップリングさせ、その後N末端を脱保護してペプチド誘導体Icを得る工程を含む、請求項7〜9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記有機溶媒がTHFである、請求項14に記載の製造方法。
- 一般式(VII)及び/又は一般式(VIII)で表されるペプチド誘導体のn(酸)が2硫酸である、請求項2〜15のいずれか1項に記載の製造方法。
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