WO2016075977A1 - 自己組織化ペプチド修飾キトサンナノ会合体の合成とプロテインデリバリーへの応用 - Google Patents

自己組織化ペプチド修飾キトサンナノ会合体の合成とプロテインデリバリーへの応用 Download PDF

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大塚　英典
大輔 松隈
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    • A61L2400/12—Nanosized materials, e.g. nanofibres, nanoparticles, nanowires, nanotubes; Nanostructured surfaces

Definitions

  • the present invention relates to a nanogel containing a self-assembling peptide, chitosan and polyethylene glycol.
  • the present invention provides a novel DDS carrier capable of maintaining protein structural stability.
  • the present invention is as follows. [1] A nanogel comprising a self-assembling peptide, chitosan and polyethylene glycol, [2] The nanogel according to claim 1, wherein the self-assembling peptide is RADARADARADARADA or RADADARADARADAADAGGGC.
  • the nanogel of the present invention can be supported without impairing the function of the protein and has an excellent sustained release property.
  • the self-assembling peptide used in the present invention can be represented by, for example, the following four general formulas.
  • ((XY) l- (ZY) m) n (I) ((YX) l- (YZ) m) n (II) ((ZY) l- (XY) m) n (III) ((YZ) l- (YX) m) n (IV) In the formulas (I) to (IV), X represents an acidic amino acid, Y represents a hydrophobic amino acid, Z represents a basic amino acid, and l, m and n are all integers (n ⁇ (l + m) ⁇ 200)).
  • the N terminal may be acetylated and the C terminal may be amidated.
  • the hydrophilic amino acid an acidic amino acid selected from aspartic acid and glutamic acid and a basic amino acid selected from arginine, lysine, histidine and ornithine can be used.
  • alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, serine, threonine or glycine can be used.
  • self-assembling peptides having repetitive sequences of arginine, alanine, aspartic acid and alanine (RADA) can be preferably used. More specifically, it is RADARADARADARADA (PuraMatrix (registered trademark)) or its terminal modified type RADADARADARADAADAGGGC (RADAGGGC).
  • Chitosan is a deacetylated product of chitin ( ⁇ -1,4-poly-N-acetylglucosamine) and is a polysaccharide mainly having a ⁇ -1,4-polyglucosamine structure.
  • the chitosan of the present invention includes a conventionally known derivative such as carboxymethyl chitosan.
  • Chitosan can be prepared by any method known in the art. For example, chitosan is made by decalcifying chitin obtained from crustacean crusts such as crabs, shrimp and krill, and insect crusts such as beetles and grasshoppers, and deproteinizing chitin. It can be obtained by deacetylation by treatment (for example, caustic soda treatment).
  • chitosan having various molecular weights is known.
  • the molecular weight of chitosan is not particularly limited, but the weight average molecular weight is preferably in the range of 1,000 to 1,000,000, and more preferably in the range of 10,000 to 300,000.
  • the weight average molecular weight may be rephrased as “weight average absolute molecular weight”.
  • the weight average molecular weight of chitosan can be measured by any method known in the art.
  • the weight average molecular weight can be measured by a method such as gel permeation chromatography-multi-angle laser light scattering analysis (GPC-MALS method), vapor pressure absolute molecular weight measurement, membrane absolute molecular weight measurement.
  • GPC-MALS method gel permeation chromatography-multi-angle laser light scattering analysis
  • vapor pressure absolute molecular weight measurement membrane absolute molecular weight measurement.
  • the weight average molecular weight of chitosan should just be contained in the said numerical range at least in any measuring method and measurement conditions, and does not need to be contained in the said numerical range under all the measuring methods and measuring conditions.
  • the degree of deacetylation from chitin is preferably about 50%.
  • the polyethylene glycol of the present invention includes a conventionally known derivative such as a multi-arm polyethylene glycol and a derivative having an amino group-reactive structure such as an aldehyde, hydroxysuccinimide ester or nitrobenzenesulfonate ester structure at the terminal.
  • the molecular weight of polyethylene glycol is preferably 1000 to 20000, more preferably 1000 to 5000.
  • polymer or “polymer” can be used interchangeably and refer to molecules having a structure composed of repeating monomer units, which can be obtained from a monomer having a low molecular weight.
  • polymer refers to a macromolecule formed by covalently bonding a large number of atoms, such as a protein, a nucleic acid and the like, in addition to a polymer.
  • the term “average degree of polymerization” refers to the average number of monomer units contained in one polymer molecule. That is, in the polymer composition, polymer molecules having different lengths are dispersed within a certain range.
  • the “number average molecular weight” means the average molecular weight per molecule in the polymer composition
  • the “weight average molecular weight” means the molecular weight calculated by weighting the weight.
  • the ratio between the number average molecular weight and the weight average molecular weight is referred to as the degree of dispersion, which is a measure of the molecular weight distribution of the polymer composition. The closer the degree of dispersion is to 1, the closer the average degree of polymerization in the polymer composition and the more polymer chains of the same length.
  • a radical scavenger for example, a radical scavenger, a peroxide decomposer, an antioxidant, an ultraviolet absorber, a heat stabilizer, a plasticizer, Additives such as flame retardants and antistatic agents can be added and used. Moreover, it can be used by mixing with polymers other than the polymer of this invention.
  • a composition comprising the biodegradable nanogel of the present invention is also an object of the present invention.
  • the biodegradable nanogel of the present invention can be used alone by being dissolved in an appropriate organic solvent, or as various compositions such as being used by mixing with other polymer compounds depending on the purpose of use. Can be used.
  • the medical device of this invention should just have the biodegradable nanogel of this invention in at least one part of the surface used in contact with a biological tissue or blood. That is, the composition containing the biodegradable nanogel of the present invention can be used as a surface treatment agent on the surface of a base material constituting a medical device.
  • One aspect of the present invention is the biodegradable nanogel of the present invention for suppressing foreign body reaction to blood or tissue until it is decomposed when used in contact with tissue or blood in vivo. It is.
  • the biodegradable nanogel of the present invention can be preferably used for medical applications.
  • the biodegradable nanogel of the present invention can be used in an appropriate mixing ratio depending on the intended use.
  • a composition having the characteristics of the present invention can be obtained.
  • the ratio of the biodegradable nanogel of the present invention to 50 to 70% by weight, it is possible to obtain a composition having various characteristics while utilizing the features of the present invention.
  • One embodiment of the present invention is a medical device including the biodegradable nanogel of the present invention.
  • the “medical device” includes an in-vivo implantable device such as a prosthesis and a device such as a catheter that may temporarily come into contact with a living tissue, and is not limited to those handled in vivo.
  • the medical device of the present invention is a device used for medical applications having the polymer composition of the present invention on at least a part of its surface.
  • the surface of the medical device referred to in the present invention refers to, for example, the surface of the material constituting the medical device that contacts blood when the medical device is used, the surface portion of the hole in the material, and the like.
  • the material and shape of the base material constituting the medical device are not particularly limited, and may be any of, for example, a porous body, fiber, nonwoven fabric, particle, film, sheet, tube, hollow fiber, and powder.
  • the materials include natural polymers such as Kinishiki and hemp, nylon, polyester, polyacrylonitrile, polyolefin, halogenated polyolefin, polyurethane, polyamide, polycarbonate, polysulfone, polyethersulfone, poly (meth) acrylate, and ethylene-vinyl alcohol. Examples thereof include synthetic polymers such as polymers, butadiene-acrylonitrile copolymers, and mixtures thereof.
  • metals, ceramics, composite materials thereof, and the like can be exemplified, and they may be composed of a plurality of base materials.
  • the present invention is applied to at least a part of the surface in contact with blood, preferably almost the entire surface in contact with blood. Desirably, a biodegradable nanogel is provided.
  • the biodegradable nanogel of the present invention can be used as a material constituting a whole medical device used in contact with tissue or blood in a living body or a material constituting a surface portion thereof, and can be used as an implantable prosthesis or treatment.
  • Instruments, extracorporeal circulation type artificial organs, surgical sutures, and catheters angiographic catheters, guide wires, PTCA catheters and other cardiovascular catheters, gastrointestinal catheters, gastrointestinal catheters, esophageal tubes and other digestive organ catheters, Tube, urinary catheter, urinary catheter such as urinary catheter), etc.
  • at least part of the surface in contact with blood, preferably almost all of the surface in contact with blood is composed of the biodegradable nanogel according to the present invention It is desirable that
  • the biodegradability of the biodegradable nanogel according to the present invention can be used particularly preferably for a medical device placed in the body during treatment.
  • the biodegradable nanogel of the present invention includes hemostatic agents, biological tissue adhesives, tissue regeneration repair materials, drug sustained release carriers, hybrid artificial organs such as artificial pancreas and artificial liver, artificial blood vessels, embolization materials, cells You may use for the matrix material for engineering scaffolds, etc.
  • These medical devices may be further provided with surface lubricity because they can be easily inserted into blood vessels and tissues and do not damage the tissues.
  • surface lubricity a method in which a water-soluble polymer is insolubilized to form a water-absorbing gel layer on the material surface is excellent. According to this method, a material surface having both biocompatibility and surface lubricity can be provided.
  • the biodegradable nanogel of the present invention itself is a material excellent in biocompatibility, but it can further carry various physiologically active substances, so that not only blood filters but also blood storage containers, blood circuits, indwelling It can be used for various medical devices such as a needle, a catheter, a guide wire, a stent, an artificial lung device, a dialysis device, and an endoscope.
  • the biodegradable nanogel of the present invention may be coated on at least a part of the substrate surface constituting the blood filter.
  • the polymer compound of the present invention may be coated on at least a part of the blood bag and the surface of the tube communicating with the blood bag in contact with the blood.
  • blood in an extracorporeal circulation blood circuit composed of an instrument side blood circuit unit composed of a tube, an arterial filter, a centrifugal pump, a hemoconcentrator, a cardio pregear, etc., and an operative field side blood circuit unit composed of a tube, catheter, soccer, etc. At least a part of the surface in contact with the biodegradable nanogel of the present invention may be coated.
  • an inner needle having a sharp needle tip at a distal end, an inner needle hub installed on the proximal end side of the inner needle, a hollow outer needle into which the inner needle can be inserted, and a proximal end side of the outer needle
  • An indwelling needle assembly comprising: an outer needle hub installed on the inner needle; a protector mounted on the inner needle and movable in the axial direction of the inner needle; and a connecting means for connecting the outer needle hub and the protector.
  • At least a portion of the three-dimensional, blood-contacting surface may be coated with the biodegradable nanogel of the present invention.
  • at least a part of the surface of the catheter that is composed of the long tube and the adapter connected to the proximal end (hand side) of the long tube may be coated with the biodegradable nanogel of the present invention.
  • the surface of the guide wire that comes into contact with blood may be coated with the biodegradable nanogel of the present invention.
  • stents of various shapes such as hollow tubular bodies made of metal materials or polymer materials with pores on the side, metal material wires or polymer material fibers knitted into a cylindrical shape, etc. At least a portion of the surface in contact with blood may be coated with the biodegradable nanogel of the present invention.
  • the lung may be an artificial lung in which the outer surface or outer layer of the hollow fiber membrane is coated with the biodegradable nanogel of the present invention.
  • a dialysate circuit including at least one dialysate container filled with dialysate and at least one drainage container for collecting dialysate, and starting from the dialysate container, or
  • the end point may be a dialyzer having a liquid feeding means for feeding dialysate, and at least a part of the surface in contact with the blood may be coated with the biodegradable nanogel of the present invention.
  • the sample solution is made up to 100 mL (final solvent concentration: 15 mM PBS), RADAGGGC aqueous solution (100 mL of 0.24 mg / mL added: 24 mg, maleimide group in 1.2 eq. Vs. CS) is added, and 16 at room temperature. Stir for hours (pH 6.75 during stirring). After stirring, dialysis purification was carried out for 2 days in Milli-Q using a dialysis membrane (fraction molecular weight: 12,000 to 14000). After dialysis, a white solid was obtained by freeze-drying (PEG / RADA-g-CS). As the dry sample of PEG / RADA-g-CS, only the amount necessary for IR analysis was collected. The modification rate of RADA was estimated from the quantification of the amount of peptide per sample unit weight using a micro BCA assay. In subsequent experiments, an aqueous PEG / RADA-g-CS solution concentrated to the target concentration was used.
  • CD spectrum measurement confirmed the negative cotton effect derived from the ⁇ -sheet structure of RADA in PEG / RADA-g-CS (Table 3).
  • the formation of a RADA ⁇ sheet structure in PEG / RADA-g-CS was also confirmed from fluorescence measurements (Table 3).
  • RADA pre-coated FITC-BSA was prepared by the above operation. Using RADA16, a sample physically coated with FITC-BSA is used to target disulfide bonds (chemical modification to FITC-BSA) with thiols in Cys residues present in FITC-BSA using RADAGGGC Two types of samples were prepared. FITC-BSA has 35 Cys residues in the molecule, and one of them is a free Cys that is not involved in the intramolecular disulfide bond. Therefore, RADAGGGC was added to form a disulfide bond with Cys. .
  • the molecular recognition function by RADA modification was evaluated using an ELISA assay. It is the ELISA quantification result using untreated albumin as a control. In both RADA16 and RADAGGGC albumin treatments, the ELISA quantification results were comparable to the control, so a RADA precoat without protein structural variation was achieved, and even in nanogel encapsulation by this method, there was no protein structural variation Encapsulation can be achieved (FIGS. 5 and 6).
  • FITC aqueous solution (1.41 ⁇ 10 ⁇ 6 mol, 0.55 mg, molar equivalent of 0.4 eq. Vs. lysozyme) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Then, after dialysis in PBS for 2 days, solvent exchange was not performed overnight (3 days total dialysis), and it was confirmed by UV spectrum measurement that FITC-derived absorption was not observed in the dialysis membrane liquid. After completion of dialysis, filtration was performed using a syringe filter having a pore diameter of 1.0 ⁇ m in order to remove insolubilized substances in the dialysis membrane fluid. After filtration, the concentrations of FITC and lysozyme were quantified (see below for details), and the recovered solution was diluted with PBS to the working concentration of 0.5 mg / mL.
  • a UV spectrum of FITC in PBS [0/5/10/25/50 ( ⁇ 10 ⁇ 6 M)] was measured, and a calibration curve was prepared from the absorbance at 495 nm.
  • the UV spectrum of the sample diluted 10 times with PBS was measured so that the absorbance of the sample solution was within the measurable range. 3.
  • step B The calibration curve prepared in step B and the BCA assay of the sample solution were performed according to the kit procedure.
  • C Determination of concentrations of FITC and lysozyme
  • the FITC concentration in the sample solution was calculated from the absorbance at 495 nm of the sample solution obtained by the experiment of (A) using a calibration curve. 2.
  • FITC responds to the BCA assay. Therefore, in the calibration curve of FITC in (B), the absorbance corresponding to the FITC concentration calculated in (A) was subtracted as the background. The concentration was determined from the calibration curve of lysozyme.
  • CD spectrum measurement was performed on the FITC-unmodified lysozyme solution having the same concentration as the sample solution whose lysozyme concentration was calculated by the above procedure (in this measurement, the lysozyme concentration was adjusted to 0.05 mg / mL).
  • RADAGGGC 0.5 mL of Milli-Q aqueous solution, 1, 5, 10 eq. Vs. FITC-lysozyme
  • FITC-lysozyme 0.5 mg / mL, 2.0 mL in 2 ⁇ PBS
  • FITC-lysozyme 0.5 mg / mL, 2.0 mL in 2 ⁇ PBS
  • RADAGGGC pre-coated FITC-lysozyme sample without performing a purification operation except for unreacted RADAGGGC.
  • RADA16 without terminal modification was also mixed and stirred with FITC-lysozyme using the same weight ratio and operation.
  • Addition equivalent means the molar amount of RADA added to 1 mol of lysozyme.
  • RADA pre-coated FITC-lysozyme was prepared by the above operation. Samples physically coated with FITC-lysozyme using RADA16 and disulfide bonds with thiols in the Cys residues present in FITC-lysozyme (chemical modification to FITC-lysozyme) are targeted using RADAGGGC Two types of samples were prepared. FITC-lysozyme has 8 Cys residues in the molecule, all of which are involved in the intramolecular disulfide bond, so there is no free Cys, but in the Cys residue forming the disulfide bond Pre-coating was performed with the aim of binding RADAGGGC to lysozyme through an exchange reaction.
  • Lysozyme lytic activity evaluation (Davies, R. C. et al. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 1968, 178, 294-503) 1. To a black cell having an optical path length of 1 cm, 666 ⁇ L of Micrococcus solution (150 ⁇ g / mL) and 234 ⁇ L of 1 ⁇ PBS were added. 2. A 100 ⁇ L lysozyme sample solution prepared separately was added thereto. The peptide pre-coated lysozyme sample was prepared by mixing lysozyme and peptide solution and then reacting in the dark for 16 hours, and then used for subsequent lytic activity evaluation. 3.
  • FIG. 12 shows the lytic activity of peptide-coated lysozyme when the lytic activity of lysozyme is 1. It was confirmed that inactivation of lysozyme by precoat was stably maintained for both RADA16 and RADAGGGC. As a result, it was suggested that the peptide coat for the protein can be supported in the nanogel stably and with high efficiency while maintaining the activity of the protein.
  • the nanogel of the present invention is useful for protein delivery.

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Abstract

　自己組織化ペプチド、キトサン及びポリエチレングリコールを含む、ナノゲル。

Description

自己組織化ペプチド修飾キトサンナノ会合体の合成とプロテインデリバリーへの応用
　本発明は、自己組織化ペプチド、キトサン及びポリエチレングリコールを含む、ナノゲルに関する。
　近年、生理活性タンパク質を医薬品として用いたＤＤＳ治療が注目され、有効な薬理活性を発現するための機能性キャリアが広く研究されている。しかし、キャリアへのタンパク質の担持操作における変性や担持効率の低さは依然として大きな課題であり、タンパク質の立体構造を損なうことなく、担持効率を高めるキャリアの設計が求められている。一方、特定のアミノ酸配列を有する自己組織化ペプチドは、β－シート構造形成に基づく自己組織ネットワークを構築する。生体適合性に優れたペプチドの自己組織ネットワークを担持マトリックスとしたナノキャリアを創製することができれば、タンパク質の構造安定性を維持可能な新規ＤＤＳキャリアとなることが期待できる。
　本発明は、タンパク質の構造安定性を維持可能な新規ＤＤＳキャリアを提供する。
　本発明は、以下のとおりである。
［１］自己組織化ペプチド、キトサン及びポリエチレングリコールを含む、ナノゲル、
［２］自己組織化ペプチドが、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ又はＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＧＧＧＣである、請求項１に記載のナノゲル。
　本発明のナノゲルは、タンパク質の機能を損なうことなく担持することができ、優れた徐放性を有する。
ＲＡＤＡプレコート当量を変化させた際の会合体への担持量測定結果である。 添加ＦＩＴＣ－ＢＳＡに対する会合体への担持量測定結果である。 ＦＩＴＣ－ＢＳＡ放出挙動評価である。上段が放出割合表記であり、下段が放出量標記である。 担持・放出物質収支である。 ＲＡＤＡ修飾アルブミンの構造安定性評価の結果である。 ＲＡＤＡ修飾アルブミンの構造安定性評価の結果である。 ＦＩＴＣ－ライソザイムのＣＤスペクトルの測定結果である。 ＲＡＤＡプレコート当量を変化させた際のＦＩＴＣ－ライソザイムへの担持量測定結果である。 添加ＦＩＴＣ－ライソザイムに対する会合体への担持効率測定結果である。 ＦＩＴＣ－ライソザイムの放出挙動評価である。 ＦＩＴＣ－ライソザイムの担持・放出物質収支である。 ＲＡＤＡプレコートライソザイムの溶菌活性である。
　本発明において用いられる自己組織化ペプチドは、たとえば、以下の４つの一般式で表すことができる。
　（（ＸＹ）l－（ＺＹ）m）n　　　（Ｉ）
　（（ＹＸ）l－（ＹＺ）m）n　　　（II）
　（（ＺＹ）l－（ＸＹ）m）n　　　（III）
　（（ＹＺ）l－（ＹＸ）m）n　　　（IV）
（式（Ｉ）～（IV）中、Ｘは酸性アミノ酸、Ｙは疎水性アミノ酸、Ｚは塩基性アミノ酸を表し、ｌ、ｍおよびｎは共に整数（ｎ×（ｌ＋ｍ）＜２００）である。）
また、そのＮ末端はアセチル化されていてもよく、Ｃ末端はアミド化されていてもよい。
　ここで、親水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される酸性アミノ酸およびアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチンから選択される塩基性アミノ酸を使用することができる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニンまたはグリシンを使用することができる。
　これらの自己組織化ペプチドの中でも、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニン（ＲＡＤＡ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドを好ましく使用することができる。より具体的には、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標））又はその末端改変型であるＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＧＧＧＣ（ＲＡＤＡＧＧＧＣ）である。
　キトサンとは、キチン（β－１，４－ポリ－Ｎ－アセチルグルコサミン）の脱アセチル化物であり、β－１，４－ポリグルコサミン構造を主とする多糖類である。本発明のキトサンには、従来公知の誘導体、たとえば、カルボキシメチルキトサンを含む。
　キトサンは、当該分野で公知の任意の方法により調製され得る。たとえば、キトサンは、カニ、エビ、オキアミなどの甲殻類の甲皮や、カブトムシ、バッタなどの昆虫類の甲皮などの原材料を脱カルシウム処理し、除タンパク処理をして得られるキチンを、アルカリ処理（例えば、苛性ソーダ処理）で脱アセチル化することなどによって得ることができる。また、キトサンの原材料としては、上述の甲皮等に代えて、キノコ類、微生物、イカの中骨等を用いてもよい。
　キトサンとしては、種々の分子量のものが知られている。本発明の水性組成物において、キトサンの分子量は特に限定されるものではないが、重量平均分子量が１０００～１００００００の範囲にあることが好ましく、１００００～３０００００の範囲にあることがより好ましい。重量平均分子量は、「重量平均絶対分子量」と言い換えてもよい。
　キトサンの重量平均分子量は、当該分野で公知の任意の方法で測定することができる。例えば、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー－多角度レーザー光散乱分析法（ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法）、蒸気圧式絶対分子量測定、メンブレン式絶対分子量測定などの方法によって測定可能である。キトサンの重量平均分子量は、少なくとも、いずれかの測定方法及び測定条件において前記数値範囲内に含まれればよく、全ての測定方法及び測定条件下で前記数値範囲内に含まれる必要はない。
　本発明の水性組成物に含まれるキトサンにおいて、キチンからの脱アセチル化の程度は、好ましくは５０％程度である。
　本発明のポリエチレングリコールは、従来公知の誘導体、たとえばマルチアームポリエチレングリコール、末端にアルデヒド，ヒドロキシスクシンイミドエステル又はニトロベンゼンスルホネートエステル構造のような、アミノ基反応性の構造を有する誘導体を含む。ポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは、１０００～２００００、より好ましくは、１０００～５０００である。
　用語「ポリマー」又は「重合体」は、互換的に使用することができ、分子量の小さいモノマーから得ることができる、モノマー単位の繰り返しで構成された構造を有する分子をいう。用語「高分子」は、ポリマーのほか、例えばタンパク質、核酸等のような多数の原子が共有結合してなる巨大分子をいう。
　ポリマーにおいて用語「平均重合度」は、１個のポリマー分子中に含まれるモノマー単位の平均数をいう。すなわち、ポリマー組成物中には、異なる長さのポリマー分子がある程度の範囲で分散して存在している。
　ポリマーの重合度に関して「数平均分子量」とは、ポリマー組成物中の分子１個あたりの分子量の平均をいい、「重量平均分子量」とは、重量に重みをつけて計算した分子量をいう。また、数平均分子量と重量平均分子量の比を分散度といい、ポリマー組成物の分子量分布の尺度となる。分散度が１に近いほど、ポリマー組成物中の平均重合度が近くなり、同じ程度の長さのポリマー鎖を多く含むことになる。
　本発明のナノゲルには、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、必要に応じて、例えば、ラジカル捕捉剤、過酸化物分解剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、熱安定剤、可塑剤、難燃剤、帯電防止剤等の添加剤を添加して使用することができる。また、本発明のポリマー以外のポリマーと混合させて使用することができる。このような、本発明の生分解性ナノゲルを含む組成物もまた、本発明の目的である。
　本発明の生分解性ナノゲルは、適宜の有機溶媒に溶解させて単独で使用することもできるし、使用の目的に応じて他の高分子化合物と混合して使用する等、各種の組成物として使用することができる。また、本発明の医療用機器は、生体内組織や血液と接して使用される表面の少なくとも一部分に本発明の生分解性ナノゲルを有していればよい。つまり、医療用機器を成す基材の表面に対して、本発明の生分解性ナノゲルを含む組成物を表面処理剤として用いることができる。また、医療用機器の少なくとも一部の部材を本発明の生分解性ナノゲル、又は、その組成物で構成しても良い。
　本発明の一つの態様は、生体内組織や血液に接して使用されたときに、分解されるまでの間、血液や組織に対して異物反応を抑制するための、本発明の生分解性ナノゲルである。
　本発明の生分解性ナノゲルは、医療用途に好ましく使用されることができる。本発明の生分解性ナノゲルを他の高分子化合物等と混合して組成物として使用する場合には、その使用の用途に応じて適宜の混合割合で使用することができる。特に、本発明の生分解性ナノゲルの割合を９０重量％以上とすることで、本発明の特徴を強く有する組成物とすることができる。その他、使用の用途によっては、本発明の生分解性ナノゲルの割合を５０～７０重量％とすることで、本発明の特徴を活かしつつ、各種の特性を併せ持つ組成物とすることができる。
　本発明の一つの態様は、本発明の生分解性ナノゲルを含む、医療用機器である。ここで、「医療用機器」とは、人工器官等の体内埋め込み型デバイス及びカテーテル等の一時的に生体組織と接触することがあるデバイスを含み、生体内で取り扱われるものに限定されない。また、本発明の医療用機器は、本発明のポリマー組成物を少なくとも表面の一部に有する医療用途に使用される機器である。本発明でいう医療用機器の表面とは、例えば、医療用機器が使用される際に血液等が接触する医療用機器を構成する材料の表面並びに材料内の孔の表面部分等をいう。
　本発明において、医療用機器を構成する基材の材質や形状は特に制限されることなく、例えば、多孔質体、繊維、不織布、粒子、フィルム、シート、チューブ、中空糸や粉末等いずれでも良い。その材質としては木錦、麻等の天然高分子、ナイロン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリオレフィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、エチレン－ビニルアルコール共重合体、ブタジエン－アクリロニトリル共重合体等の合成高分子あるいはこれらの混合物が挙げられる。また、金属、セラミクス及びそれらの複合材料等が例示でき、複数の基材より構成されていても構わず、その血液と接する表面の少なくとも一部、好ましくは血液と接する表面のほぼ全部に本発明に係る生分解性ナノゲルが設けられることが望ましい。
　本発明の生分解性ナノゲルは、生体内組織や血液と接して使用される医療用機器の全体をなす材料、又はその表面部をなす材料として用いることができ、体内埋め込み型の人工器官や治療器具、体外循環型の人工臓器類、手術縫合糸、さらにカテーテル類（血管造影用カテーテル、ガイドワイヤー、ＰＴＣＡ用カテーテル等の循環器用カテーテル、胃管カテーテル、胃腸カテーテル、食道チューブ等の消化器用カテーテル、チューブ、尿道カテーテル、尿菅カテーテル等の泌尿器科用カテーテル）等の医療用機器の血液と接する表面の少なくとも一部、好ましくは血液と接する表面のほぼ全部が本発明に係る生分解性ナノゲルで構成されることが望ましい。また、本発明に係る生分解性ナノゲルが有する生分解性を利用して、治療の際に体内に留置される医療用機器に特に好ましく用いることができる。
　本発明の生分解性ナノゲルは、止血剤、生体組織の粘着材、組織再生用の補修材、薬物徐放システムの担体、人工すい臓や人工肝臓等のハイブリッド人工臓器、人工血管、塞栓材、細胞工学用の足場のためのマトリックス材料等に用いても良い。
　これらの医療用機器においては、血管や組織への挿入を容易にして組織を損傷しないため、さらに表面潤滑性を付与してもよい。表面潤滑性を付与する方法としては水溶性高分子を不溶化して材料表面に吸水性のゲル層を形成させる方法が優れている。この方法によれば、生体親和性と表面潤滑性を併せ持つ材料表面を提供できる。
　本発明の生分解性ナノゲルはそれ自体が生体親和性に優れた材料であるが、様々な生理活性物質をさらに担持させることもできるため、血液フィルターのみならず、血液保存容器、血液回路、留置針、カテーテル、ガイドワイヤー、ステント、人工肺装置、透析装置、内視鏡等の様々な医療用機器に用いることができる。
　具体的には、本発明の生分解性ナノゲルを、血液フィルターを構成する基材表面の少なくとも一部にコーティングしてもよい。また、血液バッグと前記血液バッグに連通するチューブの血液と接する表面の少なくとも一部に本発明の高分子化合物をコーティングしてもよい。また、チューブ、動脈フィルター、遠心ポンプ、ヘモコンセントレーター、カーディオプレギア等からなる器械側血液回路部、チューブ、カテーテル、サッカー等からなる術野側血液回路部から構成される体外循環血液回路の血液と接する表面の少なくとも一部を本発明の生分解性ナノゲルでコーティングしてもよい。
　また、先端に鋭利な針先を有する内針と、前記内針の基端側に設置された内針ハブと、前記内針が挿入可能な中空の外針と、前記外針の基端側に設置された外針ハブと、前記内針に装着され、かつ前記内針の軸方向に移動可能なプロテクタと、前記外針ハブと前記プロテクタとを連結する連結手段とを備えた留置針組立体の、血液と接する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性ナノゲルでコーティングされてもよい。また、長尺チューブとその基端（手元側）に接続させたアダプターから構成されるカテーテルの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性ナノゲルでコーティングされてもよい。
　また、ガイドワイヤーの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性ナノゲルでコーティングされてもよい。また、金属材料や高分子材料よりなる中空管状体の側面に細孔を設けたものや金属材料のワイヤや高分子材料の繊維を編み上げて円筒形に成形したもの等、様々な形状のステントの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性ナノゲルでコーティングされてもよい。
　また、多数のガス交換用多孔質中空糸膜をハウジングに収納し、中空糸膜の外面側に血液が流れ、中空糸膜の内部に酸素含有ガスが流れるタイプの中空糸膜外部血液灌流型人工肺の、中空糸膜の外面もしくは外面層に、本発明の生分解性ナノゲルが被覆されている人工肺としてもよい。
　また、透析液が充填された少なくとも一つの透析液容器と、透析液を回収する少なくとも一つの排液容器とを含む透析液回路と、前記透析液容器を起点とし、又は、前記排液容器を終点として、透析液を送液する送液手段とを有する透析装置であって、その血液と接する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性ナノゲルでコーティングされてもよい。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、以下の例で用いた薬品は、とくに断りの無い場合は市販品をそのまま用いた。以下の例において、各実施例で得られた重合体の分子量分布の測定は以下のようにして行った。
　数平均分子量（［Ｍｎ］、単位：ｇ/mol）
　ピーク分子量が既知の標準ポリスチレンを用い、該標準ポリスチレンで校正したゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー社製「TOSO HLC-8320GPC」、カラム構成：TSKguardcolumn SuperMP(HZ)-M, TSKgel SuperMultiporeHZ-M ４本直列）を使用して、重合体の数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。（溶媒：THF、温度：４０℃、流量：0.35 mL/min）。
　分子量分布（［Ｍｗ／Ｍｎ］）
　上記の方法で求めた重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）の値を用い、その比（Ｍｗ／Ｍｎ）として求めた。
　ＮＭＲ測定
　ポリマーの構造解析については、ＮＭＲ測定装置（Ｂｒｕｋｅｒ製、４００ＭＨｚ）を用い、１Ｈ－ＮＭＲ測定及び１３Ｃ－ＮＭＲ測定を行った。なお、ケミカルシフトはＣＤＣｌ３（１Ｈ：７．２６ppm、１３Ｃ：７７．１ppm）を基準とした。
　片末端アルデヒドポリ（エチレングリコール）（ＣＨＯ－ＰＥＧ－ＯＨ）の合成
　α－アセタール－ω－ヒドロキシロイル－ＰＥＧ（Ｍｎ＝５，３００，５４５ｍｇ）をＴＨＦ　２．５ｍＬに溶解させ、１Ｎ　ＨＣｌ　２．５ｍＬを添加し、室温で１時間撹拌した。その後、水洗しておいたクロロホルムで抽出し、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで脱水後、ジエチルエーテルで再沈した。ベンゼンを用いたフリーズドライにより白色の固体（ＣＨＯ－ＰＥＧ－ＯＨ）を得た（収量：４２２ｍｇ（回収率：７７％）１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ，基準ピーク：下線部）δ：９．７８－９．８３（２），３．５４－３．８０（１））。
　ＰＥＧグラフトキトサン（ＰＥＧ－ｇ－ＣＳ）の合成
　キトサン（ＣＳ、（甲陽ケミカル、ＤＡＣ５０、Ｌｏｔ：９８１０２８、Ｍｗ＝２３４，０００、Ｍｎ＝９３，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５、脱アセチル化度＝５４％），８０ｍｇ，アミノ基２．３８×１０－４ｍｏｌ［脱アセチル化度より質量当たりのアミノ基量を算出］）をＭｉｌｌｉ－Ｑ水８ｍＬに溶解させ、０．１Ｎ　ＮａＯＨ（約３５０μＬ）を添加してｐＨを６．５に調整した。そこへ粉末のＣＨＯ－ＰＥＧ－ＯＨ（４１０ｍｇ，アルデヒド基４．７６×１０－５ｍｏｌ［アルデヒド化率６０％より算出］，０．２ｅｑ．ｖｓ．ＣＳ中のアミノ基）を加え、常温で１時間撹拌した。その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２９ｍｇ，１０ｅｑ．ｖｓ．アルデヒド基）を添加し２４時間常温で撹拌した。得られた溶液を水に対して１日間透析（分画分子量：１２０００～１４０００）し、凍結乾燥により白色の固体（ＰＥＧ－ｇ－ＣＳ）を得た。（収量：４３５ｍｇ（回収率：８９％）１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＥＵＴＥＲＩＵＭ　ＯＸＩＤＥ，基準ピーク：下線部）δ：２．８３－３．００（１），２．６７－２．８２（２））。
　なお、キトサン（甲陽ケミカル、ＤＡＣ５０ＨＣｌ、Ｌｏｔ：１０７３１１、Ｍｗ＝１，０４６，０００、Ｍｎ＝１５７，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝６．７、脱アセチル化度＝４７％）を用いたときは、ナノゲルの形成は困難であった。
　ＰＥＧ及びＲＡＤＡグラフトキトサン（ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳ）の合成
　ＰＥＧ－ｇ－ＣＳ　５０ｍｇ（残存するアミノ基１．８７×１０－５ｍｏｌ）を１０ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解させた。そこへ０．１Ｎ　ＮａＯＨ（約３５μＬ）を加え、溶液のｐＨを７．４３に調整した。別途用意した６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－スクシンイミジル（ＨＬ；Ｈｅｔｅｒｏ　Ｌｉｎｋｅｒ）のｄｒｙ　ＤＭＳＯ溶液（１２．０ｍｇ，３．７４×１０－５ｍｏｌ，２．０ｅｑ．ｖｓ．ＣＳ中のアミノ基）を添加し、室温で３時間撹拌した（ＰＥＧ／ＨＬ－ｇ－ＣＳ）。撹拌後、透析膜（分画分子量１２０００～１４０００）を用いてＭｉｌｌｉ－Ｑ中で４時間透析精製を行った。構造解析のため、サンプルの一部を凍結乾燥により粉体回収した。１Ｈ－ＮＭＲよりマレイミド修飾率を測定した（１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＥＵＴＥＲＩＵＭ　ＯＸＩＤＥ，基準ピーク：下線部）δ：６．９４－７．０４（３），２．８６－３．０２（１），２．７５－２．８６（２））。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳの構造である。「Grafted degree」は、キトサンのアミノ基に対してＰＥＧ及びＲＡＤＡがどの程度修飾されたかの割合を示す。このとき、キトサン中のアミノ基の量は、脱アセチル化度を元に定義している。すなわち、脱アセチル化を考慮したアミノ基が全て修飾されると、５４％になる。
　ＰＥＧは、１Ｈ－ＮＭＲ解析から算出した。ＨＬ（Ｈｅｔｅｒｏ　Ｌｉｎｋｅｒ）は、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－スクシンイミジルの略称であり、キトサン骨格にマレイミド基を修飾するための低分子である。マレイミド基の修飾率も、１Ｈ－ＮＭＲ解析から算出した。次に、ＲＡＤＡＧＧＧＣのシステインをターゲットに、マレイミド基と反応させることで、キトサンをＲＡＤＡＧＧＧＣで修飾した。ＲＡＤＡ修飾後の定量解析には、マイクロＢＣＡアッセイを用いた。
　サンプル溶液を１００ｍＬにメスアップ（最終溶媒濃度：１５ｍＭ　ＰＢＳ）し、ＲＡＤＡＧＧＧＣ水溶液（０．２４ｍｇ／ｍＬを１００ｍＬ添加：２４ｍｇ，１．２ｅｑ．ｖｓ．ＣＳ中のマレイミド基）を添加し、室温で１６時間撹拌した（撹拌時のｐＨ６．７５）。撹拌後、透析膜（分画分子量１２０００～１４０００）を用いてＭｉｌｌｉ－Ｑ中で２日間透析精製を行った。透析後、凍結乾燥により白色の固体を得た（ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳ）。なお、ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳの乾燥サンプルは、ＩＲ解析に必要な量のみを採取した。ＲＡＤＡの修飾率は、マイクロＢＣＡアッセイを用いたサンプル単位重量あたりのペプチド量の定量から見積もった。以後の実験は、目的濃度まで濃縮したＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳ水溶液を用いた。
　ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳの会合挙動評価を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＣＤスペクトル測定によって、ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳにおけるＲＡＤＡのβシート構造由来の負のコットン効果が確認された（表３）。また、蛍光測定からも、ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳにおけるＲＡＤＡのβシート構造の形成が確認された（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳ会合体によるＦＩＴＣ－ＢＳＡの担持・徐放評価
　ＦＩＴＣ－ＢＳＡは、６６ｋＤａであり、その構造内に３５のＣｙｓ残基を有し、その中の３４のＣｙｓ残基は、－Ｓ＝Ｓ－を形成している。
　ＦＩＴＣ－ＢＳＡ（２×ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ，２．０ｍＬ）に対してＲＡＤＡＧＧＧＣ　Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水溶液（０．５ｍＬ、１、５、１０ｅｑ．ｖｓ．ＦＩＴＣ－ＢＳＡ）を添加し、暗所室温で１６時間撹拌した。この時、溶液中でＦＩＴＣ－ＢＳＡの濃度は０．４ｍｇ／ｍＬとなっているため、未反応のＲＡＤＡＧＧＧＣを除く精製操作は行わずにＲＡＤＡＧＧＧＣプレコートＦＩＴＣ－ＢＳＡサンプルとして使用した。また、比較として、末端改変されていないＲＡＤＡ１６も同様の重量比率及び操作を用いてＦＩＴＣ－ＢＳＡと混合・撹拌した（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記操作によってＲＡＤＡプレコートＦＩＴＣ－ＢＳＡを調製した。ＲＡＤＡ１６を用いることでＦＩＴＣ－ＢＳＡを物理的に被覆したサンプルを、ＲＡＤＡＧＧＧＣを用いることでＦＩＴＣ－ＢＳＡに存在するＣｙｓ残基中のチオールとのジスルフィド結合（ＦＩＴＣ－ＢＳＡに対して化学修飾）を狙ったサンプルの２種類を調製した。ＦＩＴＣ－ＢＳＡは分子内に３５個のＣｙｓ残基を有し、そのうちの１つは分子内ジスルフィド結合に関与しないフリーのＣｙｓであるため、そのＣｙｓとのジスルフィド結合形成を狙ってＲＡＤＡＧＧＧＣを添加した。このＲＡＤＡプレコート手法によって、ＦＩＴＣ－ＢＳＡに対して実際にＲＡＤＡＧＧＧＣが化学修飾出来ているかについて確認は行えていないが、以降の担持・徐放検討及び、構造安定性試験によって、ＲＡＤＡプレコートの効果を評価した（表５、表６、図１～４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＲＡＤＡ修飾による分子認識機能を評価した。コントロールとして未処理のアルブミンを用いたＥＬＩＳＡ定量結果である。ＲＡＤＡ１６、ＲＡＤＡＧＧＧＣいずれのアルブミン処理においても、ＥＬＩＳＡ定量結果はコントロールと同程度であったことからタンパク質の構造変異を伴わないＲＡＤＡプレコートを達成し、本手法によるナノゲル内包においても、タンパク質の構造変異のない内包が達成できる（図５、６）。
ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳ会合体によるＦＩＴＣ－ライソザイムの担持・徐放評価
ＦＩＴＣ－ライソザイムの合成（Robeson, J, L. et al. Langmuir. 1996, 12, 6104-6113、Takano, M. et al. Eur. J. Pharmacol. 2004, 502, 149-155）
　ライソザイム５０ｍｇ（３．５７×１０－６ｍｏｌ）をｐＨ９．２の１００ｍＭホウ酸緩衝液（ホウ酸溶液に１Ｍ　ＮａＯＨを添加することでｐＨを調整した（ホウ酸終濃度１００ｍＭ））３０ｍＬに溶解させ、そこへ１．０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ水溶液を５５０μＬ（１．４１×１０－６ｍｏｌ，０．５５ｍｇ，モル等量で０．４ｅｑ．ｖｓ．ライソザイム）添加し、室温で１時間撹拌した。その後、ＰＢＳ中で２日間透析を行った後、溶媒交換を一晩行わず（透析通算３日間）透析膜外液にＦＩＴＣ由来の吸収が見られないことをＵＶスペクトル測定により確認した。透析終了後、透析膜内液の不溶化物を取り除くために孔径１．０μｍのシリンジフィルターを用いてろ過を行った。ろ過後、ＦＩＴＣ、ライソザイムそれぞれの濃度を定量し（詳細は下記参照）、回収溶液を使用濃度である０．５　ｍｇ／ｍＬまでＰＢＳを用いて希釈した。
ＦＩＴＣ－ライソザイム中における各化合物の濃度決定
　ＦＩＴＣの定量については、時間経過や溶媒種によって蛍光強度は変動が大きく定量性を欠くため、吸光度測定を利用した。
（Ａ）ＦＩＴＣ－ライソザイム中のＦＩＴＣ定量～ＵＶスペクトル測定～
１．ＦＩＴＣの定量を行うため、ＦＩＴＣのＰＢＳ溶液［０／５／１０／２５／５０（×１０－６Ｍ）］のＵＶスペクトル測定を行い、４９５ｎｍにおける吸光度から検量線を作成した。
２．サンプル溶液の吸光度が測定可能領域に入るよう、ＰＢＳで１０倍希釈したサンプルのＵＶスペクトルを測定した。
３．サンプル溶液の４９５ｎｍにおける吸光度から、１．で作成した検量線を使用して、サンプル溶液中のＦＩＴＣ濃度を算出した。
（Ｂ）ＦＩＴＣ－ライソザイム中のライソザイム定量～ＢＣＡアッセイ～
１．検量線としてライソザイムのＰＢＳ溶液を調製した　［０／０．２５／０．５０／０．７５／１．０／１．５／２．０（ｍｇ／ｍＬ）］。
２．ＦＩＴＣがＢＣＡアッセイの妨害物質にならないかを確認するため、ＦＩＴＣのＰＢＳ溶液を調製した［０／１０／２５／５０／１００（μｇ／ｍＬ）］。
３．上記の１．．２．で調製した検量線及び、サンプル溶液のＢＣＡアッセイをキットの手順に則り行った。
（Ｃ）ＦＩＴＣ，ライソザイムそれぞれの濃度決定
１．ＦＩＴＣについては（Ａ）の実験により得られたサンプル溶液の４９５ｎｍにおける吸光度から、検量線を使用してｓａｍｐｌｅ溶液中のＦＩＴＣ濃度を算出した。
２．ライソザイムについては、（Ｂ）よりＦＩＴＣがＢＣＡアッセイに反応することが分かったため、（Ｂ）のＦＩＴＣの検量線において、（Ａ）で算出されたＦＩＴＣ濃度に相当する吸光度をバックグラウンドとして差し引いたうえでライソザイムの検量線から濃度を決定した。
ＦＩＴＣ－ライソザイムの構造安定性評価
　上記の操作によってライソザイム濃度を算出されたサンプル溶液と同濃度のＦＩＴＣ未修飾ライソザイム溶液についてＣＤスペクトル測定を行った（本測定ではライソザイム濃度を０．０５ｍｇ／ｍＬに調整）。
 
ＣＤスペクトル測定条件
開始波長：３００　ｎｍ
終了波長：２０５　ｎｍ
積算回数：３回
データ間隔：０．５　ｎｍ
レスポンス：１　ｓｅｃ
バンド幅：１．０　ｎｍ
光路長：１　ｃｍ
感度：５０　ｍｄｅｇ
操作感度：２００　ｎｍ／ｍｉｎ
　サンプル溶液中の各化合物定量結果を表７及び図６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　合成したＦＩＴＣ－ライソザイムとｎａｔｉｖｅライソザイムのライソザイム濃度を合わせてＣＤスペクトル測定を行ったところ、スペクトルの波形・強度の一致が確認された。したがって、今回合成したＦＩＴＣ－ライソザイムはＦＩＴＣ修飾による変性はないものと考えられる．
　ＦＩＴＣの吸光度から検量線を使い、合成したＦＩＴＣ－ライソザイムを会合体への担持・徐放評価を行った。
ＦＩＴＣ－ライソザイムへのＲＡＤＡプレコート
　ＦＩＴＣ－ライソザイムは、１４ｋＤａであり、その構造内に８つのＣｙｓ残基を有し、その全てが－Ｓ＝Ｓ－を形成している。
　ＦＩＴＣ－ライソザイム（２×ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ，２．０ｍＬ）に対してＲＡＤＡＧＧＧＣ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水溶液０．５ｍＬ、１、５、１０ｅｑ．ｖｓ．ＦＩＴＣ－ライソザイム）を添加し、暗所室温で１６時間撹拌した。この時、溶液中でＦＩＴＣ－ライソザイムの濃度は０．４ｍｇ／ｍＬとなっているため、未反応のＲＡＤＡＧＧＧＣを除く精製操作は行わずにＲＡＤＡＧＧＧＣプレコートＦＩＴＣ－ライソザイムサンプルとして使用した。また、比較として、末端改変されていないＲＡＤＡ１６も同様の重量比率及び操作を用いてＦＩＴＣ－ライソザイムと混合・撹拌した。
　プレコートに用いるＲＡＤＡ水溶液濃度・条件を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　＊添加当量は、１ｍｏｌのライソザイムに対するＲＡＤＡの添加モル量を意味する。
　上記操作によってＲＡＤＡプレコートＦＩＴＣ－ライソザイムを調製した。ＲＡＤＡ１６を用いることでＦＩＴＣ－ライソザイムを物理的に被覆したサンプルを、ＲＡＤＡＧＧＧＣを用いることでＦＩＴＣ－ライソザイムに存在するＣｙｓ残基中のチオールとのジスルフィド結合（ＦＩＴＣ－ライソザイムに対して化学修飾）を狙ったサンプルの２種類を調製した。ＦＩＴＣ－ライソザイムは分子内に８個のＣｙｓ残基を有し、その全てが分子内ジスルフィド結合に関与しているため、ｆｒｅｅのＣｙｓは存在しないが、ジスルフィド結合を形成しているＣｙｓ残基中のチオールを介し、ＲＡＤＡＧＧＧＣが交換反応によってライソザイムと結合することを狙いプレコートを行った。ＦＩＴＣ－ＢＳＡと同様に、このＲＡＤＡプレコート手法によって、ライソザイムに対して実際にＲＡＤＡＧＧＧＣが化学修飾出来ているか確認は行えていないが、以降の担持・徐放検討及び、溶菌活性試験を行うことで、ＲＡＤＡプレコートの意義とそのライソザイムについて評価を行った。
１．ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳのＭｉｌｌｉ－Ｑ水溶液の濃度を２．０ｍｇ／ｍＬに調整した。
２．予めＲＡＤＡ１６、ＲＡＤＡＧＧＧＣでプレコートを行ったＦＩＴＣ－ＢＳＡ（ＲＡＤＡのプレコート添加当量：１，５，１０ｅｑ．ｖｓ．ＦＩＴＣ－ライソザイム）及びプレコートを行っていないＦＩＴＣ－ライソザイムを、ＦＩＴＣ－ライソザイム濃度が０．４ｍｇ／ｍＬになるよう調整した（溶媒終濃度：１．６×ＰＢＳ）。
３．上記１，２それぞれの溶液をマイクロチューブ中に７５０μＬずつ等量添加・混合し、３０分間バスソニケーターを用いて超音波を当てた。（内包時濃度…ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳ：１．０ｍｇ／ｍＬ，ＦＩＴＣ－ライソザイム：２００μｇ／ｍＬ）
４．超音波終了後、うち１ｍＬを１００，０００ｒｐｍ，３０分間遠心し、上澄みの溶液を取れる限り全量分取した。
５．上澄みのサンプルをそれぞれ９６ウェルプレートに１００μＬ添加し、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定した。［観測波長：４９４ｎｍ］
６．ＲＡＤＡ未プレコートＦＩＴＣ－ライソザイム、及び、ＲＡＤＡ１６、ＲＡＤＡＧＧＧＣを１０等量プレコートしたＦＩＴＣ－ライソザイムの３サンプルについては、徐放挙動を測定するため、それぞれの遠心管に新たなＰＢＳ、または会合体の崩壊を加速させることが既知である１Ｍ　ＮａＯＨを３００μＬ添加した。
７．一定時間ごとに、溶媒に放出されるＦＩＴＣ－ライソザイムの吸光度を測定した（９６ウェルプレートに１００μＬ添加、４９４ｎｍにおける吸光度を測定し、測定後使用した１００μＬのサンプルは遠心管に全量戻した。）。
　結果を図８～１１に示した。
　まず担持量について考察する。ＲＡＤＡをプレコートしていないフリーＦＩＴＣ－ライソザイムと比較した際、ＲＡＤＡをプレコートしたサンプルにおいて担持量の向上が観測された。また、この担持量向上のライソザイムは、ＲＡＤＡの添加当量を上げることでさらに向上可能であるということが分かった。さらに２種のＲＡＤＡにおいて比較すると、ＦＩＴＣ－ライソザイムへの物理的被覆であるＲＡＤＡ１６より、ＦＩＴＣ－ライソザイムへのジスルフィド結合という化学修飾が示唆されるＲＡＤＡＧＧＧＣにおいてより担持量が向上するという結果が得られた。この結果は、ＦＩＴＣ－ライソザイムをＲＡＤＡでプレコートするという手法によって、ＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳ会合体のＲＡＤＡコアへと分子間βシート構造形成を介し、効率的に担持されたためであると考えられる。以上の結果は、先に行ったＦＩＴＣ－ＢＳＡと同様の傾向を示すものであり、これによりＲＡＤＡプレコート手法が種々のタンパク質の担持量向上において適用可能であることが示唆された。
　次に放出挙動について考察する。本実験では、会合体からのＦＩＴＣ－ライソザイムの徐放挙動を測定するにあたり、溶媒としてＰＢＳと会合体の崩壊を加速させることが既知である１Ｍ　ＮａＯＨとの２種類を使用した。上段には、内包量に対する放出量の割合を、放出率として示したグラフを、下段には放出されたＦＩＴＣ－ライソザイムの重量を縦軸にしたグラフを示した。２種の溶媒について比較すると、会合体の崩壊が観測されないＰＢＳ中では、ＦＩＴＣ－ライソザイムの放出はほぼ観測されず、会合体の崩壊が示唆される塩基性条件では、会合体の崩壊に伴い、担持量の６０％程度の放出が観測された。また、１Ｍ　ＮａＯＨ中での各サンプルのリリースを比較すると、ＲＡＤＡ未修飾のＢＳＡと比較した際、ＲＡＤＡをプレコートしたＦＩＴＣ－ＢＳＡにおいてスローリリースが達成され、またこのライソザイムはＲＡＤＡ１６よりＲＡＤＡＧＧＧＣにおいて顕著であるという結果が得られた。これは、ＲＡＤＡの自己組織化特性により、ＢＳＡがβシート構造形成を介して会合体コアへと効率的に担持されているとする内包量の結果と相関のとれた結果であると考えられる。
　また、担持量と放出量の物質収支について考察すると、１Ｍ　ＮａＯＨを使用した系において、６時間までの間に担持量の８０％程度を放出したという結果が得られた。ＦＩＴＣ－ＢＳＡを用いた系では６時間までの間に担持量のほぼ全量を放出するという結果が得られたため、これについてはＰＥＧ／ＲＡＤＡ－ｇ－ＣＳとライソザイムとの何か特異的な結合が関与していると考えられる。一般にＲＡＤＡを用いたバルクゲルでは、タンパク質の放出挙動は、タンパク質の分子量に大きく依存し、電荷についてはあまり影響を受けないということが知られている（Koutsopoulos, S. et al. PNAS. 2009, 106, 4623-4628、Hosseinkhani, H. et al. Chem. rev. 2013, 113, 4837-4861）。そのため、ＦＩＴＣ－ＢＳＡと比較して分子量の小さいＦＩＴＣ－ライソザイムではＦＩＴＣ－ＢＳＡよりも早い放出挙動が得られると考えていたが、今回得られた結果では、ＲＡＤＡをプレコートしていないＦＩＴＣ－ライソザイムにおいてもＰＢＳ中での放出が大きく抑制されており、ＲＡＤＡのマクロゲルが示す特性とは異なる結果が得られた。本会合体はＲＡＤＡのほか、構成成分としてＰＥＧとＣＳを含むため、このいずれかとライソザイムの特異的な結合により、このような結果が得られたと考えているが詳細については考察・検討中である。
ＲＡＤＡプレコートＦＩＴＣ－ライソザイムの機能評価
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ溶液の調製
１×ＰＢＳ＊を用いてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ　ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４６９８）１５０μｇ／ｍＬ溶液を調製した。終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈し、光路長１ｃｍのセルを用いて溶液のＵＶスペクトルを測定し、４５０ｎｍにおける吸光度が０．６－０．７になっていることを確認した。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓを用いたライソザイムの溶菌活性では、終濃度が１００μｇ／ｍＬを採用することとした。
　＊１×ＰＢＳ…１３７ｍＭ　ＮａＣｌ，２．７ｍＭ　ＫＣｌ，８．０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，１．５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４
Ｌｙｓｏｚｙｍｅの溶菌活性評価（Davies, R. C. et al. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 1968, 178, 294-503）
１．光路長１ｃｍのブラックセルに６６６μＬのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ溶液（１５０μｇ／ｍＬ）と１ｘＰＢＳ　２３４μＬを添加した。
２．そこへ別途調製した１００μＬのライソザイムサンプル溶液を添加した。なお、ペプチドプレコートライソザイムサンプルは、ライソザイムとペプチド溶液を混合後、暗所で１６時間反応させることで調製した後、引き続く溶菌活性評価に用いた。
３．ライソザイムサンプルを添加後、素早く１０回ピペッティングした後、直ちに測定を開始し、４５０ｎｍにおける吸光度をモニターした。
４．開始直後から６０秒後までの４５０ｎｍの吸光度の減少速度を直線近似の傾きから算出し、ライソザイムの溶菌活性とした。
５．ペプチドを添加しないライソザイムの活性を１とした場合のペプチドプレコートサンプル（プレコート条件は，ライソザイム：ＲＡＤＡ又はＧＧＧＣ－ＲＡＤＡ＝１：１，１：１０，１：１００の３種）の溶菌活性を比較することで、ペプチドコートによるライソザイムの溶菌活性残存率を算出した。ここで、サンプルの総体積は１０００μＬとし、終濃度はそれぞれＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ；１００μｇ／ｍＬ，ライソザイム；６μｇ／ｍＬに統一した。
　図１２には、ライソザイムの溶菌活性を１とした際のペプチドコートライソザイムの溶菌活性を示す。ＲＡＤＡ１６，ＲＡＤＡＧＧＧＣともにプレコートによるライソザイムの失活は安定に保持されていることが確認された。この結果、タンパク質に対するペプチドコートは、タンパクの活性を保持したまま、安定かつ高効率にナノゲル中に担持させることが可能であることが示唆された。
　本発明のナノゲルは、プロテインデリバリーのために有用である。

Claims (2)

  1. 　自己組織化ペプチド、キトサン及びポリエチレングリコールを含む、ナノゲル。
  2. 　自己組織化ペプチドが、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ又はＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＧＧＧＣである、請求項１に記載のナノゲル。
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