WO2017033941A1 - 生分解性インジェクタブルゲル - Google Patents

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gel
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chitosan
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大塚　英典
大輔 松隈
範昭 松田
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株式会社スリー・ディー・マトリックス
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Definitions

  • the present invention relates to a biodegradable injectable gel composed of a triblock copolymer PEG-PLA-PEG, a self-assembling peptide and chitosan.
  • an interpenetrating polymer network (IPN) type injectable consisting of a self-assembled peptide gel (RADA16) as a pseudo-extracellular matrix and a covalently bonded gel (chitosan / PEG) as a mechanical support.
  • the gel (chitosan / PEG / RADA16) was found to be a useful cartilage tissue regeneration scaffold. It has been confirmed that the fibrous network of peptides contained in the gel contributes to the enhancement of cell functions, and as a result, promotes excellent cartilage tissue regeneration in vivo.
  • the scaffold is decomposed and disappeared and replaced with normal tissue.
  • the covalently bonded chitosan / PEG gel has poor degradability, and it was difficult to control the degradation of the scaffold after regeneration of living tissue.
  • the present invention provides a biodegradable injectable gel.
  • a biodegradable injectable gel (chitosan / PEG-PLA-PEG / PEG) using a triblock copolymer PEG-PLA-PEG (FIGURE 1) into which Poly (D, L-lactide) (PLA) is introduced. RADA16) is provided.
  • polymer or “polymer” can be used interchangeably and refer to molecules having a structure composed of repeating monomer units, which can be obtained from a monomer having a low molecular weight.
  • polymer refers to a macromolecule formed by covalently bonding a large number of atoms, such as a protein, a nucleic acid and the like, in addition to a polymer.
  • the term “average degree of polymerization” refers to the average number of monomer units contained in one polymer molecule. That is, in the polymer composition, polymer molecules having different lengths are dispersed within a certain range.
  • the “number average molecular weight” means the average molecular weight per molecule in the polymer composition
  • the “weight average molecular weight” means the molecular weight calculated by weighting the weight.
  • the ratio between the number average molecular weight and the weight average molecular weight is referred to as the degree of dispersion, which is a measure of the molecular weight distribution of the polymer composition. The closer the degree of dispersion is to 1, the closer the average degree of polymerization in the polymer composition and the more polymer chains of the same length.
  • biodegradable means a substance that can be chemically decomposed by an action such as hydrolysis, enzymatic decomposition, or microbial decomposition.
  • the injectable gel of the present invention includes, for example, a radical scavenger, a peroxide decomposer, an antioxidant, an ultraviolet absorber, a heat stabilizer, a plasticizer within the range not departing from the spirit of the present invention.
  • An additive such as an agent, a flame retardant, and an antistatic agent can be added and used. Moreover, it can be used by mixing with polymers other than the polymer of this invention.
  • Such a composition comprising the biodegradable injectable gel of the present invention is also an object of the present invention.
  • the biodegradable injectable gel of the present invention can be used alone by being dissolved in an appropriate organic solvent, or mixed with other polymer compounds depending on the purpose of use. Can be used as a thing.
  • the medical device of this invention should just have the biodegradable injectable gel of this invention in at least one part of the surface used in contact with a biological tissue or blood. That is, the composition containing the biodegradable injectable gel of the present invention can be used as a surface treatment agent on the surface of a base material constituting a medical device.
  • One aspect of the present invention is a biodegradable injector according to the present invention for suppressing a foreign body reaction to blood or tissue until it is decomposed when used in contact with tissue or blood in a living body. Burger.
  • the biodegradable injectable gel of the present invention can be preferably used for medical purposes.
  • the biodegradable injectable gel of the present invention can be used in an appropriate mixing ratio depending on the intended use.
  • a composition having the characteristics of the present invention can be obtained.
  • the ratio of the biodegradable injectable gel of the present invention to 50 to 70% by weight, it is possible to obtain a composition having various characteristics while utilizing the features of the present invention. .
  • the “medical device” includes an in-vivo implantable device such as a prosthesis and a device such as a catheter that may temporarily come into contact with a living tissue, and is not limited to those handled in vivo.
  • the medical device of the present invention is a device used for medical applications having the polymer composition of the present invention on at least a part of its surface.
  • the surface of the medical device referred to in the present invention refers to, for example, the surface of the material constituting the medical device that contacts blood when the medical device is used, the surface portion of the hole in the material, and the like.
  • the material and shape of the base material constituting the medical device are not particularly limited, and may be any of, for example, a porous body, fiber, nonwoven fabric, particle, film, sheet, tube, hollow fiber, and powder.
  • the materials include natural polymers such as Kinishiki and hemp, nylon, polyester, polyacrylonitrile, polyolefin, halogenated polyolefin, polyurethane, polyamide, polycarbonate, polysulfone, polyethersulfone, poly (meth) acrylate, and ethylene-vinyl alcohol. Examples thereof include synthetic polymers such as polymers, butadiene-acrylonitrile copolymers, and mixtures thereof.
  • metals, ceramics, composite materials thereof, and the like can be exemplified, and they may be composed of a plurality of base materials.
  • the present invention is applied to at least a part of the surface in contact with blood, preferably almost the entire surface in contact with blood. Desirably, a biodegradable injectable gel is provided.
  • the biodegradable injectable gel of the present invention can be used as a material constituting a whole medical device used in contact with tissue or blood in a living body or a material constituting a surface portion thereof, and is an implantable prosthesis. And therapeutic instruments, extracorporeal circulation type artificial organs, surgical sutures, and catheters (circulatory catheters such as angiographic catheters, guide wires, PTCA catheters, gastrointestinal catheters, gastrointestinal catheters, esophageal tubes, etc.)
  • the biodegradable injector according to the present invention has at least a part of the surface in contact with blood of a medical device such as a catheter, tube, urinary catheter, urinary catheter, etc. Desirably, it is composed of bulgel. Further, the biodegradability of the biodegradable injectable gel according to the present invention can be used particularly preferably for a medical device placed in the body during treatment.
  • the biodegradable injectable gel of the present invention comprises a hemostatic agent, an adhesive material for biological tissue, a repair material for tissue regeneration, a carrier for a sustained drug release system, a hybrid artificial organ such as an artificial pancreas and an artificial liver, an artificial blood vessel, and an embolization material It may also be used as a matrix material for a scaffold for cell engineering.
  • These medical devices may be further provided with surface lubricity because they can be easily inserted into blood vessels and tissues and do not damage the tissues.
  • surface lubricity a method of insolubilizing a water-soluble polymer to form a water-absorbing gel layer on the material surface is excellent. According to this method, a material surface having both biocompatibility and surface lubricity can be provided.
  • the biodegradable injectable gel of the present invention is a material that is excellent in biocompatibility by itself, but can also carry various physiologically active substances, so that not only a blood filter, but also a blood storage container, a blood circuit It can be used for various medical devices such as indwelling needles, catheters, guide wires, stents, oxygenators, dialysis machines, and endoscopes.
  • the biodegradable injectable gel of the present invention may be coated on at least a part of the substrate surface constituting the blood filter.
  • the polymer compound of the present invention may be coated on at least a part of the blood bag and the surface of the tube communicating with the blood bag in contact with the blood.
  • blood in an extracorporeal circulation blood circuit composed of an instrument side blood circuit unit composed of a tube, an arterial filter, a centrifugal pump, a hemoconcentrator, a cardio pregear, etc., and an operative field side blood circuit unit composed of a tube, catheter, soccer, etc At least a part of the surface in contact with the surface may be coated with the biodegradable injectable gel of the present invention.
  • an inner needle having a sharp needle tip at a distal end, an inner needle hub installed on the proximal end side of the inner needle, a hollow outer needle into which the inner needle can be inserted, and a proximal end side of the outer needle
  • An indwelling needle assembly comprising: an outer needle hub installed on the inner needle; a protector mounted on the inner needle and movable in the axial direction of the inner needle; and a connecting means for connecting the outer needle hub and the protector.
  • At least a portion of the three-dimensional, blood-contacting surface may be coated with the biodegradable injectable gel of the present invention.
  • at least a part of the surface of the long tube that contacts the blood of the catheter constituted by the adapter connected to the proximal end (hand side) thereof may be coated with the biodegradable injectable gel of the present invention.
  • the surface of the guide wire that comes into contact with blood may be coated with the biodegradable injectable gel of the present invention.
  • stents of various shapes such as hollow tubular bodies made of metal materials or polymer materials with pores on the side, metal material wires or polymer material fibers knitted into a cylindrical shape, etc. At least a portion of the surface in contact with blood may be coated with the biodegradable injectable gel of the present invention.
  • a large number of porous hollow fiber membranes for gas exchange are housed in a housing, blood flows on the outer surface side of the hollow fiber membrane, and oxygen-containing gas flows inside the hollow fiber membrane.
  • the lung may be an artificial lung in which the outer surface or outer layer of the hollow fiber membrane is coated with the biodegradable injectable gel of the present invention.
  • a dialysate circuit including at least one dialysate container filled with dialysate and at least one drainage container for collecting dialysate, and starting from the dialysate container, or
  • the end point may be a dialyzer having a liquid feeding means for feeding dialysate, and at least a part of the surface in contact with the blood may be coated with the biodegradable injectable gel of the present invention.
  • the present invention is an excellent scaffold for cartilage tissue regeneration and has the effect of having excellent biodegradability.
  • 1 is a 1 H-NMR spectrum of the product. 1 is a 1 H-NMR spectrum of the product. It is a GPC measurement result of a product. 1 is a 1 H-NMR spectrum of the product. 1 is a 1 H-NMR spectrum of the product. It is a gelation phase diagram when PEG 5k and PEG-PLA-PEG are used (left: chitosan / PEG 5k, right: chitosan / PEG-PLA-PEG). The frequency-dependent measurement results when PEG5k and PEG-PLA-PEG are used are shown (left: chitosan / PEG 5k, right: chitosan / PEG-PLA-PEG).
  • the gelation behavior when PEG5k and PEG-PLA-PEG are used is shown (left: chitosan / PEG 5k, right: chitosan / PEG-PLA-PEG).
  • the gelation behavior of the RADA mixed system is shown (upper: RADA, left: chitosan / PEG 5k / RADA, right: chitosan / PEG-PLA-PEG / RADA).
  • GAG production (left: GAG production per day, right: integrated GAG production). This is the amount of GAG produced in the gel. GAG total production (in medium + in gel). 1 is a 1 H-NMR spectrum of the product. 1 is a 1 H-NMR spectrum of the product.
  • Example 1 EXAMPLES
  • medical agent used in the following examples used the commercial item as it was.
  • the molecular weight distribution of the polymer obtained in each example was measured as follows.
  • protons were assigned.
  • the standard for the integrated value was 214.00 based on the peak a derived from the EO chain of PEG. From the value of PLA-derived peak b, the number of PLA chains was set to 5.
  • protons were assigned.
  • the standard for the integrated value was 428.00 based on the peak a derived from the EO chain of PEG, assuming that THP-PEG-PLA-OH was completely bonded to both ends of adipoyl chloride. From the value of the peak b derived from PLA, the PLA chain number was set to 10 chains.
  • the GPC measurement results are shown in FIG.
  • protons were assigned.
  • the standard of the integrated value was set to 428.00 based on the peak a derived from the EO chain of PEG. Since the THP-derived peak disappeared, THP deprotection was confirmed.
  • protons were assigned.
  • the standard of the integrated value was set to 428.00 based on the peak a derived from the EO chain of PEG. From the NHS-derived peak, it was found that 99.3% NHS was formed.
  • PEG-PLA-PEG is known to form a physical cross-linked gel by temperature phase transition (Sol-Gel transition) for the first time in a high concentration region such as 30 wt% at room temperature (20 ° C.) ( T, Mukose et al., Macromol. Biosci. 2014, 4, 361-367). The gelation of this system occurred in a very low concentration region, suggesting gelation based on the formation of chemical crosslinks between molecular chains.
  • G ′ increased rapidly after a predetermined time, and a clear gel point (G ′> G ′′) was observed. Also, when PEG-PLA-PEG was used, the gelation rate decreased. This was confirmed by the inclusion of PLA, resulting in a decrease in solvation and consequently a decrease in reaction rate.
  • FIG. 9 the measurement result of gelation behavior in the RADA mixed system is shown (FIG. 9).
  • G ′ at the start of measurement was higher than G ′′, and it was suggested that gelation occurs immediately upon mixing with PBS.
  • G ′ changed in multiple stages over time, and the inflection point was highly correlated with the gelation time of chitosan / PEG 5k and chitosan / PEG-PLA-PEG.
  • the chitosan / PEG-PLA-PEG gel had a higher degree of swelling than the chitosan / PEG5k gel. This is considered to be due to the introduction of PLA, the reactivity decreased and the degree of swelling increased. In both cases, the degree of swelling was significantly reduced as a result of inclusion of the peptide. This suggests an increase in network density based on the formation of the IPN structure.
  • Degradation behavior evaluation Decomposition tests are as follows: -Acid accelerated decomposition test (acetic acid, room temperature conditions) ⁇ Experimental operation was performed. Each 300 ⁇ L volume gel was made and swelled in 1 mL PBS (150 mM, pH 7.4) for 48 hours (4 ° C.). After swelling the gel, PBS was removed, 1 mL of CH 3 COOH was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature. After a predetermined time, the sample was washed three times with PBS, and the swelling weight of the gel was measured. Each sample was lyophilized for 24 hours and then the dry weight of the gel was measured. The degree of swelling Q and weight loss were calculated using the following equations. The solution was changed every day ( Figure 12).
  • Circular Dichroism (CD) Spectrum Measurement Each sample having a volume of 90 ⁇ L was prepared and applied to a quartz cell having an optical path length of 0.1 mm. The measurement conditions are as follows. Measurement wavelength: 300-205nm Data interval: 0.5 nm Scanning speed: 200 nm / min Integration count: 3 times Response: 2.0 s Band width: 1.0 nm Measurement temperature: 20 ° C
  • RADA is known to exhibit a negative cotton effect based on the ⁇ sheet structure in the vicinity of 220 nm of the CD spectrum. Similarly, since a negative cotton effect was obtained in the gel containing the peptide, it was found that the fiber structure of the peptide was stably held inside the gel.
  • a cell suspension was prepared using a 4 wt% chitosan solution.
  • 25 ⁇ L of cell suspension was added to a 1.5 mL sampling tube.
  • a 4 wt% PEG solution (in 300 mM PBS) was separately prepared using NHS-PEG-PLA-PEG-NHS that had been subjected to UV treatment for 20 minutes.
  • 12.5 ⁇ L of the 4 wt% PEG solution of (6) was added to (5) above, and immediately after pipetting, 12.5 ⁇ L of 1.0 wt% RADA16 solution was added and mixed.
  • the mitochondrial activity according to the MTT assay was reduced in all hydrogels at the beginning of the culture. Thereafter, the RADA non-mixed gel maintained a low state, but the RADA mixed gel showed a remarkable increase in activity. This is considered that the cell activity was improved as a result of the peptide fiber structure mimicking the biological environment. In addition, when PEG-PLA-PEG was used, the cell activity was significantly improved. This is considered to be the effect of imparting degradability. In addition, a decrease in activity was confirmed when PEG-PLA-PEG was used in the later stage of culture. This suggests that the gel has degraded and cells have been released.
  • the produced chitosan / PEG-PLA-PEG / RADA16 gel showed the same amount of GAG production in the medium and GAG production in the gel at the initial stage of culture. However, in the late stage of culture, the amount of GAG produced is higher in the chitosan / PEG-PLA-PEG / RADA16 gel.
  • the chitosan / PEG-PLA-PEG / RADA16 gel has been confirmed to show a mild degradation behavior under the culture conditions, and it is considered that the GAG production amount is improved as a result of imparting degradability to the gel.
  • succinimide-PEG-PLA-PEG-succinimide is capable of cross-linking at a very low concentration, unlike a physical cross-linking gel using PEG-PLA-PEG or PLA-PEG-PLA. Therefore, since it can be handled as a cell mixture with low viscosity, it can be used as an injectable gel for in vivo administration and has high suitability for clinical treatment.
  • the cell viability after the gelation reaction is an extremely low toxicity reaction that maintains 100% of that before crosslinking.
  • the triblock copolymer of the present invention is useful for the production of biodegradable interpenetrating polymer networks (IPN).
  • IPN biodegradable interpenetrating polymer networks

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Abstract

本発明は、ポリエチレングリコール－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ポリエチレングリコール骨格を有する、トリブロック共重合体に関する。

Description

生分解性インジェクタブルゲル
　本発明は、トリブロック共重合体ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ、自己組織化ペプチド及びキトサンから構成される生分解性インジェクタブルゲルに関する。
　再生医療において、物理物性を高度に制御可能なハイドロゲルは、効果的な細胞の増殖、分化の場を提供する足場として注目されている。我々はこれまでに、疑似細胞外マトリックスとしての自己組織化ペプチドゲル（ＲＡＤＡ１６）と、力学的支持体としての共有結合ゲル（キトサン／ＰＥＧ）からなる相互侵入高分子網目（ＩＰＮ）型のインジェクタブルゲル（キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６）が、有用な軟骨組織再生足場となることを見出した。ゲル中に含まれるペプチドの繊維状網目が細胞の高機能化に寄与し、結果としてｉｎ　ｖｉｖｏでの優れた軟骨組織再生を促すことを確認している。
　一方、生体組織の再生誘導後、足場は分解・消失し、正常組織と置換されることが望ましい。共有結合性のキトサン／ＰＥＧゲルは分解性に乏しく、生体組織再生後の足場分解を制御することが困難であった。
　本発明は、生分解性インジェクタブルゲルを提供する。
　本発明では、Ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＬＡ）を導入したトリブロック共重合体ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ（Ｆｉｇｕｒｅ　１）を用いる、生分解性インジェクタブルゲル（キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６）を提供する。
　すなわち、本発明は、以下に関する。
　［１］ポリエチレングリコール－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ポリエチレングリコール骨格を有する、トリブロック共重合体、
　［２］式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（式中、
　ｎは、重合度を表し、好ましくは、１０～１０００の範囲であり、
　ｍは、重合度を表し、好ましくは、１～１００の範囲である）
で示される繰り返し単位を含む、請求項１に記載のトリブロック共重合体、
　［３］上記［１］又は［２］に記載のトリブロック共重合体、キトサン、自己組織化ペプチドを含む、生分解性インジェクタブルゲル、
　［４］自己組織化ペプチドが、（ＲＡＤＡ）４である、［３］に記載の生分解性インジェクタブルゲル、
　［５］下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（式中、
　ｎは、重合度を表し１０～１０００の範囲である）
をＤ，Ｌ－ラクチドと反応させ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式中、
　ｍは、重合度を表し１～１００の範囲である）
を得る工程、
得られた
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
を
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
と反応させ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
を得る工程、
得られた
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
を脱保護し、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
を得る工程、
得られた
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
を炭酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）と反応させ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
を得る工程
を含む、ポリエチレングリコール－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ポリエチレングリコール骨格を有する、トリブロック共重合体の製造方法、
　［６］上記［１］のトリブロック共重合体を含む、架橋剤。
　用語「ポリマー」又は「重合体」は、互換的に使用することができ、分子量の小さいモノマーから得ることができる、モノマー単位の繰り返しで構成された構造を有する分子をいう。用語「高分子」は、ポリマーのほか、例えばタンパク質、核酸等のような多数の原子が共有結合してなる巨大分子をいう。
　ポリマーにおいて用語「平均重合度」は、１個のポリマー分子中に含まれるモノマー単位の平均数をいう。すなわち、ポリマー組成物中には、異なる長さのポリマー分子がある程度の範囲で分散して存在している。
　ポリマーの重合度に関して「数平均分子量」とは、ポリマー組成物中の分子１個あたりの分子量の平均をいい、「重量平均分子量」とは、重量に重みをつけて計算した分子量をいう。また、数平均分子量と重量平均分子量の比を分散度といい、ポリマー組成物の分子量分布の尺度となる。分散度が１に近いほど、ポリマー組成物中の平均重合度が近くなり、同じ程度の長さのポリマー鎖を多く含むことになる。
　本発明において、「生分解性」とは、加水分解、酵素分解、微生物分解等の作用により化学的に分解することが可能なものをいう。
　本発明のインジェクタブルゲルには、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、必要に応じて、例えば、ラジカル捕捉剤、過酸化物分解剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、熱安定剤、可塑剤、難燃剤、帯電防止剤等の添加剤を添加して使用することができる。また、本発明のポリマー以外のポリマーと混合させて使用することができる。このような、本発明の生分解性インジェクタブルゲルを含む組成物もまた、本発明の目的である。
　本発明の生分解性インジェクタブルゲルは、適宜の有機溶媒に溶解させて単独で使用することもできるし、使用の目的に応じて他の高分子化合物と混合して使用する等、各種の組成物として使用することができる。また、本発明の医療用機器は、生体内組織や血液と接して使用される表面の少なくとも一部分に本発明の生分解性インジェクタブルゲルを有していればよい。つまり、医療用機器を成す基材の表面に対して、本発明の生分解性インジェクタブルゲルを含む組成物を表面処理剤として用いることができる。また、医療用機器の少なくとも一部の部材を本発明の生分解性インジェクタブルゲル、又は、その組成物で構成しても良い。
　本発明の一つの態様は、生体内組織や血液に接して使用されたときに、分解されるまでの間、血液や組織に対して異物反応を抑制するための、本発明の生分解性インジェクタブルゲルである。
　本発明の生分解性インジェクタブルゲルは、医療用途に好ましく使用されることができる。本発明の生分解性インジェクタブルゲルを他の高分子化合物等と混合して組成物として使用する場合には、その使用の用途に応じて適宜の混合割合で使用することができる。特に、本発明の生分解性インジェクタブルゲルの割合を９０重量％以上とすることで、本発明の特徴を強く有する組成物とすることができる。その他、使用の用途によっては、本発明の生分解性インジェクタブルゲルの割合を５０～７０重量％とすることで、本発明の特徴を活かしつつ、各種の特性を併せ持つ組成物とすることができる。
　本発明の一つの態様は、本発明の生分解性インジェクタブルゲルを含む、医療用機器である。ここで、「医療用機器」とは、人工器官等の体内埋め込み型デバイス及びカテーテル等の一時的に生体組織と接触することがあるデバイスを含み、生体内で取り扱われるものに限定されない。また、本発明の医療用機器は、本発明のポリマー組成物を少なくとも表面の一部に有する医療用途に使用される機器である。本発明でいう医療用機器の表面とは、例えば、医療用機器が使用される際に血液等が接触する医療用機器を構成する材料の表面並びに材料内の孔の表面部分等をいう。
　本発明において、医療用機器を構成する基材の材質や形状は特に制限されることなく、例えば、多孔質体、繊維、不織布、粒子、フィルム、シート、チューブ、中空糸や粉末等いずれでも良い。その材質としては木錦、麻等の天然高分子、ナイロン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリオレフィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、エチレン－ビニルアルコール共重合体、ブタジエン－アクリロニトリル共重合体等の合成高分子あるいはこれらの混合物が挙げられる。また、金属、セラミクス及びそれらの複合材料等が例示でき、複数の基材より構成されていても構わず、その血液と接する表面の少なくとも一部、好ましくは血液と接する表面のほぼ全部に本発明に係る生分解性インジェクタブルゲルが設けられることが望ましい。
　本発明の生分解性インジェクタブルゲルは、生体内組織や血液と接して使用される医療用機器の全体をなす材料、又はその表面部をなす材料として用いることができ、体内埋め込み型の人工器官や治療器具、体外循環型の人工臓器類、手術縫合糸、さらにカテーテル類（血管造影用カテーテル、ガイドワイヤー、ＰＴＣＡ用カテーテル等の循環器用カテーテル、胃管カテーテル、胃腸カテーテル、食道チューブ等の消化器用カテーテル、チューブ、尿道カテーテル、尿菅カテーテル等の泌尿器科用カテーテル）等の医療用機器の血液と接する表面の少なくとも一部、好ましくは血液と接する表面のほぼ全部が本発明に係る生分解性インジェクタブルゲルで構成されることが望ましい。また、本発明に係る生分解性インジェクタブルゲルが有する生分解性を利用して、治療の際に体内に留置される医療用機器に特に好ましく用いることができる。
　本発明の生分解性インジェクタブルゲルは、止血剤、生体組織の粘着材、組織再生用の補修材、薬物徐放システムの担体、人工すい臓や人工肝臓等のハイブリッド人工臓器、人工血管、塞栓材、細胞工学用の足場のためのマトリックス材料等に用いても良い。
　これらの医療用機器においては、血管や組織への挿入を容易にして組織を損傷しないため、さらに表面潤滑性を付与してもよい。表面潤滑性を付与する方法としては水溶性高分子を不溶化して材料表面に吸水性のゲル層を形成させる方法が優れている。この方法によれば、生体親和性と表面潤滑性を併せ持つ材料表面を提供できる。
　本発明の生分解性インジェクタブルゲルはそれ自体が生体親和性に優れた材料であるが、様々な生理活性物質をさらに担持させることもできるため、血液フィルターのみならず、血液保存容器、血液回路、留置針、カテーテル、ガイドワイヤー、ステント、人工肺装置、透析装置、内視鏡等の様々な医療用機器に用いることができる。
　具体的には、本発明の生分解性インジェクタブルゲルを、血液フィルターを構成する基材表面の少なくとも一部にコーティングしてもよい。また、血液バッグと前記血液バッグに連通するチューブの血液と接する表面の少なくとも一部に本発明の高分子化合物をコーティングしてもよい。また、チューブ、動脈フィルター、遠心ポンプ、ヘモコンセントレーター、カーディオプレギア等からなる器械側血液回路部、チューブ、カテーテル、サッカー等からなる術野側血液回路部から構成される体外循環血液回路の血液と接する表面の少なくとも一部を本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングしてもよい。
　また、先端に鋭利な針先を有する内針と、前記内針の基端側に設置された内針ハブと、前記内針が挿入可能な中空の外針と、前記外針の基端側に設置された外針ハブと、前記内針に装着され、かつ前記内針の軸方向に移動可能なプロテクタと、前記外針ハブと前記プロテクタとを連結する連結手段とを備えた留置針組立体の、血液と接する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングされてもよい。また、長尺チューブとその基端（手元側）に接続させたアダプターから構成されるカテーテルの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングされてもよい。
　また、ガイドワイヤーの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングされてもよい。また、金属材料や高分子材料よりなる中空管状体の側面に細孔を設けたものや金属材料のワイヤや高分子材料の繊維を編み上げて円筒形に成形したもの等、様々な形状のステントの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングされてもよい。
　また、多数のガス交換用多孔質中空糸膜をハウジングに収納し、中空糸膜の外面側に血液が流れ、中空糸膜の内部に酸素含有ガスが流れるタイプの中空糸膜外部血液灌流型人工肺の、中空糸膜の外面もしくは外面層に、本発明の生分解性インジェクタブルゲルが被覆されている人工肺としてもよい。
　また、透析液が充填された少なくとも一つの透析液容器と、透析液を回収する少なくとも一つの排液容器とを含む透析液回路と、前記透析液容器を起点とし、又は、前記排液容器を終点として、透析液を送液する送液手段とを有する透析装置であって、その血液と接する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングされてもよい。
　本発明は、優れた軟骨組織再生の足場であり、かつ、優れた生分解性を有するという効果を奏する。
生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 生成物のＧＰＣ測定結果である。 生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 ＰＥＧ　５ｋおよび、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合のゲル化相図である（左：キトサン／ＰＥＧ　５ｋ、右：キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ）。 ＰＥＧ５ｋおよび、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合の周波数依存測定結果を示す（左：キトサン／ＰＥＧ　５ｋ、右：キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ）。 ＰＥＧ５ｋおよび、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合のゲル化挙動を示す（左：キトサン／ＰＥＧ　５ｋ、右：キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ）。 ＲＡＤＡ混合系のゲル化挙動を示す（上：ＲＡＤＡ、左：キトサン／ＰＥＧ　５ｋ／ＲＡＤＡ、右：キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ／ＲＡＤＡ）。 ＰＥＧ５ｋおよび、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合のヤング率（点）、及びＲＡＤＡ混合系におけるヤング率（斜線）である。 ＰＥＧ５ｋおよび、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合の膨潤度（点）、及びＲＡＤＡ混合系における膨潤度（斜線）である。 ＲＡＤＡ混在化、非混在化における、ＰＥＧ５ｋ、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合の酸性条件下における分解挙動である。 ＲＡＤＡ混在化、非混在化における、ＰＥＧ５ｋ、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合の生理条件下における分解挙動である。 各ハイドロゲルにおけるＣＤ　スペクトル測定結果である。 細胞存在下におけるキトサン／ＰＥＧ５ｋゲル、キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧゲルの分解挙動である。 各種ハイドロゲルのＭＴＴアッセイによるミトコンドリア活性である。 ＧＡＧ産生量（左：ｄａｙ当たりＧＡＧ産生量、右：積算ＧＡＧ産生量）である。 ゲル内ＧＡＧ産生量である。 ＧＡＧ総生産量（培地中＋ゲル内）である。 生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。
［実施例１］
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、以下の例で用いた薬品は、とくに断りの無い場合は市販品をそのまま用いた。以下の例において、各実施例で得られた重合体の分子量分布の測定は以下のようにして行った。
　数平均分子量（［Ｍｎ］、単位：ｇ/mol）
　ピーク分子量が既知の標準ポリスチレンを用い、該標準ポリスチレンで校正したゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー社製「ＴＯＳＯ　ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣ」、カラム構成：ＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ　ＳｕｐｅｒＭＰ（ＨＺ）－Ｍ，　ＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＺ－Ｍ　４本直列）を使用して、重合体の数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。（溶媒：ＴＨＦ、温度：４０℃、流量：０．３５ｍＬ／min）。
　分子量分布（［Ｍｗ／Ｍｎ］）
　上記の方法で求めた重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）の値を用い、その比（Ｍｗ／Ｍｎ）として求めた。
　ＮＭＲ測定
　ポリマーの構造解析については、ＮＭＲ測定装置（Ｂｒｕｋｅｒ製、４００ＭＨｚ）を用い、１Ｈ－ＮＭＲ測定及び１３Ｃ－ＮＭＲ測定を行った。なお、ケミカルシフトはＣＤＣｌ３（１Ｈ：７．２６ppm、１３Ｃ：７７．１ppm）を基準とした。
　両末端反応性ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ　の合成
　全体の合成スキームを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＯＨ（Ｍｘ＝２，３５５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　Ａｒ雰囲気下で、エチレングリコール（１）１５．０ｇ（２２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（無水）２００ｍｌに溶解し、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ　４２４ｍｇ（２．２３ｍｍｏｌ，　１ｍｏｌ％／ｖｓ．（１））を加え、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン　９．３３ｇ（１１１ｍｍｏｌ，０．５ｅｑｕｉｖ．／ｖｓ．　（１））をゆっくり滴下し、常温で攪拌３０分後、微量のＴＥＡを添加した。反応溶液を濃縮し、カラム（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘａｎｅ＝１／１）にかけて片末端ＴＨＰ保護体（２）を得た（７．３６ｇ（２２％））。さらに減圧蒸留により精製を行った。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ　４．５８－４．５４（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），３．９５－３．５１（ｍ，６Ｈ），２．９２－２．８８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），１．９１－１．７５（ｍ，６Ｈ）（図２０）。
（３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　（２）１４６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）をＡｒ置換｛（真空１５分＋Ａｒ）×３｝し、Ａｒフロー下でＴＨＦ（無水）１５ｍｌを添加し、ＴＨＦ中のカリウムナフタレン１ｍｍｏｌ分を滴下し、メタル化した。メタル化後、Ａｒフロー下でエチレンオキシド　２．５ｍｌ（５０ｍｍｏｌ）を滴下し、常温で２日間攪拌した。反応溶液をジエチルエーテル４００ｍｌで再沈澱精製して、フリーズドライによりＴＨＰ－ＰＥＧ－ＯＨ（３）を得た（２．２ｇ（回収率１００％））。ＧＰＣ：数平均分子量（Ｍｎ）＝２３５５，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０７．１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ４．６３－４．６（ｔ，１Ｈ），３．９０－３．３７（ｍ，２０８Ｈ），１．８９－１．４７（ｍ，６Ｈ）（図２１）。
　ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　Ｎ２雰囲気下、トルエン９７．９２ｍＬ（ｄｌ－ラクチド：１０ｍｇ／ｍＬ）にＴＨＰ－ＰＥＧ－ＯＨ（Ｍｎ＝２，３５５、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０９４）２０００ｍｇ（０．８４９３ｍｍｏｌ）、ｄｌ－ラクチド（再結晶済み）９７９．２ｍｇ（６．７９４ｍｍｏｌ、８ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＯＨ）、Ｓｎ（Ｏｃｔ）２３４．４０ｍｇ（０．０８４９ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＯＨ）を溶解させ、１２０℃で４８時間撹拌した。反応後、濃縮し、ジエチルエーテルで再沈殿させた。ベンゼンによる凍結乾燥後、化合物の構造は１Ｈ－ＮＭＲにより解析した。（収量：２５３１ｍｇ、収率８５．０％、図１）
　図１より、プロトンの帰属を行った。積算値の基準は、ＰＥＧのＥＯ鎖由来ピークａを基準として２１４．００とした。ＰＬＡ由来のピークｂの値から、ＰＬＡ連鎖数を５連鎖とした。
　ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＴＨＰ　の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　Ｎ２雰囲気下、ＣＨ２Ｃｌ２３０ｍＬにＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＯＨ２０００ｍｇ（０．７３６６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ５３９．９ｍｇ（４．４１９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＯＨ）を溶解させ、ＴＥＡ４１１μＬ（２．９４６ｍｍｏｌ，２ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＯＨ）を添加し、氷冷下（０℃）１０分間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２２０ｍＬに溶解させた塩化アジポイル６７．４１ｍｇ（０．３６８３ｍｍｏｌ、０．５ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＯＨ）を混ぜ合わせた後、室温で４８時間撹拌した。反応後、１Ｎ　ＨＣｌ、ＭｉｌｌｉＱで洗浄し、この操作を２回繰り返した。さらに、ＭｇＳＯ４を加え、濃縮後、ベンゼンによる凍結乾燥を行った。化合物の構造は１Ｈ－ＮＭＲ、ＧＰＣにより解析した（収量１６１９ｍｇ、収率７９．３％、図２）。
　図２より、プロトンの帰属を行った。積算値の基準は、塩化アジポイルの両末端にＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＯＨが完全に結合していると仮定し、ＰＥＧのＥＯ鎖由来のピークａを基準として４２８．００とした。ＰＬＡ由来のピークｂの値から、ＰＬＡ連鎖数を１０連鎖とした。また、ＧＰＣ測定結果を図３に示す。
　ＧＰＣ測定の結果、単峰性の溶出ピークはＴＨＰ－ＰＥＧ－ＯＨ，ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＯＨ，ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＴＨＰの順に高分子量側へとシフトした。これらの結果より、ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＴＨＰの合成を確認した。
　ＯＨ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　Ｎ２雰囲気下、ＭｅＯＨ　２０ｍＬにＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＴＨＰ　１５００ｍｇ（０．２７０７ｍｍｏｌ）、ピリジニウムパラトルエンスルホナート（ＰＰＴＳ）　６８．０３ｍｇ（０．２７０７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＴＨＰ）を溶解させ、室温で７時間撹拌した。反応後、濃縮し、ジエチルエーテルで再沈殿させた。ベンゼンによる凍結乾燥後、化合物の構造を１Ｈ－ＮＭＲにより解析した（収量１３８５ｍｇ、収率９５．２％、図４）。
　図４より、プロトンの帰属を行った。積算値の基準は、ＰＥＧのＥＯ鎖由来のピークａを基準として４２８．００とした。ＴＨＰ由来ピークが消失していることから、ＴＨＰの脱保護を確認した。
　ＮＨＳ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＮＨＳの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　Ｎ２雰囲気下、ＣＨ２Ｃｌ２　５０ｍＬにＯＨ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＯＨ　１２００ｍｇ（０．２２３２ｍｍｏｌ）を溶解させた。別途、ＣＨ３ＣＮ　２０ｍＬに炭酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）（ＤＳＣ）　２８５．９ｍｇ（１．１１６ｍｍｏｌ）を５０℃で３０分間溶解させた。２０ｍＬのＤＳＣ溶液と５０ｍＬのＰＥＧ溶液を混ぜ合わせた後、ピリジン２００μＬを添加し、室温で４８時間攪拌した。反応後、ろ過・濃縮の後、ジエチルエーテルで再沈殿した。ベンゼンによる凍結乾燥後、化合物の構造を１Ｈ－ＮＭＲにより解析した（収量１１４２ｍｇ、収率９０．１％、図５）。
　図５より、プロトンの帰属を行った。積算値の基準は、ＰＥＧのＥＯ鎖由来のピークａを基準として４２８．００とした。ＮＨＳ由来のピークから、９９．３％ＮＨＳ化されていることがわかった。
　キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルの作製と物性評価
　キトサン／ＰＥＧ　２．０／１．０ｗｔ％　３００μＬゲルの作製
　ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）を用いて調製した６．０ｗｔ％キトサン１００μＬにＰＢＳ　１５０μＬを添加した。そこにＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）を用いて調製した６．０ｗｔ％両末端ＮＨＳ－ＰＥＧ　５０μＬを添加した。
　キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６　２．０／１．０／０．２５ｗｔ％３００μＬゲルの作製
　ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）を用いて調製した６．０ｗｔ％キトサン１００μＬにＰＢＳ（３００ｍＭ，ｐＨ７．４）７５μＬを添加した。そこにＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）を用いて調製した６．０ｗｔ％両末端ＮＨＳ－ＰＥＧ５０μＬを添加した後、１．０ｗｔ％ＲＡＤＡ１６水溶液７５μＬを素早く添加した。
［ゲル化相図の作製］
・実験操作
　溶液のゲル化を、２０分間静置させた後、ｔｉｌｔｉｎｇ　ｔｅｓｔ　により評価した。各々のゲル化挙動を観察した後、ゲル化相図を作成した。目的とする濃度のキトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧゲルは、キトサン，ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ，ＰＢＳの混合比を適宜変化させることで作製した。すべてのゲルにおいて、イオン濃度の異なるＰＢＳを適宜用いることで、最終ＰＢＳ濃度が１５０ｍＭとなるように調整した。ゲル化相図を図５に示す。
　キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧは、ＰＥＧ　５ｋと比較して、より高濃度領域においてゲル化することを確認した。これは、ＰＬＡを含有することで溶媒和性が減少し、結果として反応性が減少したためであると考えられる。また、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧは、室温（２０℃）において、３０ｗｔ％のような高濃度領域において初めて、温度相転移（Ｓｏｌ－Ｇｅｌ転移）による物理架橋ゲルを形成することが知られている（T, Mukose et al., Macromol. Biosci. 2014, 4, 361-367）。本系のゲル化は極めて低濃度領域で生じていることから、分子鎖間の化学架橋形成に基づくゲル化が示唆された。
　周波数依存測定
　体積３００μＬのゲルを、直径１５ｍｍのディスク型に成形した。ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で２４時間膨潤させた（４℃）後、装置台座にセットした。パラレルプレートを、０．５Ｎの荷重が掛かるようにゲルに接近させた。周波数測定において、せん断応力ひずみは１％（＝γ）とし、発振周波数を０．１－１００Ｈｚの範囲で測定した（図７）。双方において、貯蔵弾性率（Ｇ’）は損失弾性率（Ｇ”）よりも高く、典型的なゲル物性を確認した。
　ゲル化挙動観察
　ゲル化挙動を、ゲルの典型的作製法と同様の手法でレオメーター台座上に体積２１０μＬのゲル前駆体溶液を調製した後、即座に粘弾性測定を開始することで評価した。測定周波数は１Ｈｚとし、測定荷重は１Ｐａで行った。なお、ＲＡＤＡのゲル化は、ＰＢＳ（２００ｍＭ，ｐＨ７．４）１５７．５μＬに対して１．０ｗｔ％ＲＡＤＡ１６水溶液５２．５μＬを添加することで観察した（図８）。
　双方において、所定時間経過後にＧ’は急激に増加し、明確なゲル化点（Ｇ’＞Ｇ”）が観測された。また、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合、ゲル化速度の減少を確認した。これは、ＰＬＡを含有することで、溶媒和性が減少し、結果として反応速度が減少したためである。
　次に、ＲＡＤＡ混合系におけるゲル化挙動測定結果を示す（図９）。ＲＡＤＡ１６ペプチドゲルの場合、測定開始時のＧ’はＧ”より高く、ＰＢＳとの混和により即座にゲル化することが示唆された。また、ＲＡＤＡを混合することにより、Ｇ’の値は、それぞれ単独の場合と比べて顕著に増大した。さらに、Ｇ’は時間経過とともに多段階に変化し、その変曲点はキトサン／ＰＥＧ　５ｋ、キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧのゲル化時間と高く相関していた。これらの結果から、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６、キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルは、ＲＡＤＡ１６のネットワークが形成された後に、その間をキトサン／ＰＥＧ、キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧが架橋する相互侵入高分子網目（Ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＩＰＮ）構造を形成していることが示唆された。
　力学強度測定
　体積３００μＬのゲルを、直径１５ｍｍのディスク型に成形した。ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で２４時間膨潤させた（４℃）後、装置台座にセットした。
　測定周波数を１Ｈｚに固定した後、各ゲルサンプルに１Ｐａから３０００Ｐａまでの圧力を印加することで力学強度を測定した。損失弾性率Ｇ”が貯蔵弾性率Ｇ’を上回る点をゲルの破断点と定義し、応力－ひずみ曲線を作成した。得られた応力－ひずみ曲線の初期の傾きを直線近似することで、ヤング率を算出した（図１０）。
　キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧゲルは、キトサン／ＰＥＧ５ｋゲルよりも力学強度が低くなった。これは、ＰＬＡを導入したことによって反応性が低下し、力学強度が低くなったためと考えられる。また、双方において、ペプチドを内包した結果、力学強度が向上した。これは、ゲルの網目が複合したためであり、ＩＰＮ構造の形成を示唆している。
　膨潤度測定
　体積３００μＬのゲルを作製し、ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で４８時間膨潤させた（４℃）後、膨潤後のゲルの重量を測定した。各サンプルを２４時間凍結乾燥させた後、ゲルの重量を再度測定した。以下の式を用いて、膨潤度Ｑ０を算出した（図１１）。
Ｑ０＝（Ｗｓ－Ｗｄ）／Ｗｄ
Ｗｓ：膨潤ゲルの重量、Ｗｄ：乾燥ゲルの重量
　キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧゲルは、キトサン／ＰＥＧ５ｋゲルよりも膨潤度が高くなった。これは、ＰＬＡを導入したことによって反応性が低下し、膨潤度が高くなったと考えられる。また、双方において、ペプチドを内包した結果、膨潤度が有意に低下した。これは、ＩＰＮ構造の形成に基づく網目密度の増加を示唆している。
　分解挙動評価
　分解試験を、以下：
・酸加速分解試験（酢酸、室温条件下）
・実験操作
について行った。
　体積３００μＬのゲルをそれぞれ作製し、１ｍＬのＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で４８時間膨潤させた（４℃）。ゲルを膨潤させた後、ＰＢＳを取り除き、ＣＨ３ＣＯＯＨを１ｍＬ加え、室温条件下で静置した。所定時間経過後、サンプルを、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、ゲルの膨潤重量を測定した。各サンプルを２４時間凍結乾燥させた後、ゲルの乾燥重量を測定した。以下の式を用いて、膨潤度Ｑ、重量損失を算出した。溶液は１日毎に取り換えた（図１２）。
Ｑ＝（Ｗｓ－Ｗｄ）／Ｗｄ
ＷＳ：膨潤ゲルの重量、Ｗｄ：乾燥ゲルの重量
 
重量損失（％）＝（Ｗｄ０－Ｗｄ）／Ｗｄ０×１００
Ｗｄ０：初期乾燥重量（ｄａｙ０）
　ＰＥＧ５ｋを用いたゲルでは、分解挙動を示さなかった。一方、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いたゲルにおいては、ＲＡＤＡの有無に依らず、顕著な分解挙動が確認された。ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合、ＰＬＡの加水分解に基づく分解挙動を示すことが確認された。
　生理条件下分解試験（ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）、３７℃）
　体積３００μＬのゲルをそれぞれ作製し、１ｍＬのＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で４８時間膨潤させた（４℃）。ゲルを膨潤させた後、ＰＢＳを取り除き、新たなＰＢＳを１ｍＬ加え、３７℃条件下で静置した。所定時間経過後、サンプルをＰＢＳを用いて３回洗浄し、ゲルの膨潤重量を測定した。各サンプルを２４時間凍結乾燥させた後、ゲルの乾燥重量を測定した。以下の式を用いて、膨潤度Ｑ、重量損失を算出した。溶液は３日毎に取り換えた（図１３）。
Ｑ＝（Ｗｓ－Ｗｄ）／Ｗｄ
ＷＳ：膨潤ゲルの重量、Ｗｄ：乾燥ゲルの重量
 
重量損失（％）＝（Ｗｄ０－Ｗｄ）／Ｗｄ０×１００
Ｗｄ０：初期乾燥重量（ｄａｙ０）
　ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ及びＲＡＤＡにおいて、初期の段階では未架橋鎖の流出に伴う重量損失上昇が確認された。ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合、ＲＡＤＡの有無によらず、緩やかな分解挙動が確認された。分解速度は、ＰＥＧ　５ｋを用いた場合と比較して加速しており、生理条件下においても同様に、ＰＬＡの加水分解に伴う分解挙動が確認された。
　円二色性（ＣＤ）スペクトル測定
　体積９０μＬの各サンプルをそれぞれ作製し、光路長０．１ｍｍの石英セルに塗布した。測定条件は以下のとおりである。
測定波長：３００－２０５ｎｍ
データ間隔：０．５ｎｍ
走査速度：２００ｎｍ／ｍｉｎ
積算回数：３回
レスポンス：２．０ｓ
バンド幅：１．０ｎｍ
測定温度：２０℃
　ＲＡＤＡは、ＣＤスペクトルの２２０ｎｍ付近にβシート構造に基づく負のコットン効果を示すことが知られている。ペプチドを内包したゲルにおいても同様に、負のコットン効果が得られたことから、ペプチドの繊維構造はゲル内部で安定に保持されていることがわかった。
　キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルの細胞培養
（１）２０分間のＵＶ滅菌処理を施したキトサン（カルボキシメチルキトサン、甲陽ケミカル）を用い、４ｗｔ％キトサン溶液（１５０ｍＭ　ＰＢＳ）を調製した。
（２）予めインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養したサブコンフルのウシ由来軟骨細胞（Ｐ１）をトリプシン処理により基板から剥がし、遠心後（１，５００ｒｐｍ，５分間）、上澄みを除去した。
（３）ＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ加え、細胞数を測定した。
（４）遠心（１，５００ｒｐｍ，５分間）し、上澄み除去後、４ｗｔ％キトサン溶液を用いて、細胞懸濁液を作製した。
（５）１．５ｍＬサンプリングチューブに細胞懸濁液を２５μＬ加えた。
（６）２０分間のＵＶ処理を施したＮＨＳ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＮＨＳを用いて、４ｗｔ％ＰＥＧ溶液（３００ｍＭＰＢＳ中）を別途調製した。
（７）上記の（５）に（６）の４ｗｔ％ＰＥＧ溶液を１２．５μＬ加え、ピペッティングを行った後すぐに、１．０ｗｔ％ＲＡＤＡ１６溶液を１２．５μＬ加え混ぜ合わせた。なお、キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ＝２．０／１．０ｗｔ％を足場とする場合には、ＲＡＤＡ１６溶液の代わりに同体積の１５０ｍＭ　ＰＢＳを添加した。
（８）１０分間ゲル化させた後、ゲル上部にＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，２％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ）を５００μＬ加え、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ２）内で培養した。２－３日毎に培地サンプルを回収し、フレッシュなＤＭＥＭを５００μＬ添加した。回収した培地サンプルは－８０℃で保存した。
　ゲル組成：
１．キトサン／ＰＥＧ５ｋ＝２．０／１．０ｗｔ％
２．キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ＝２．０／１．０ｗｔ％
３．キトサン／ＰＥＧ５ｋ／ＲＡＤＡ１６＝２．０／１．０／０．２５ｗｔ％
４．キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６＝２．０／１．０／０．２５ｗｔ％
　培養条件：
細胞数：５．０×１０５細胞
細胞密度：１．０×１０７細胞／ｍｌ
ゲル体積：５０μＬ
培地量：５００μＬ
　キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ／ＲＡＤＡ　ゲルの軟骨細胞機能評価
　分解挙動評価（細胞存在下）
　上記と同様の方法で、体積３００μＬのキトサン／ＰＥＧ　５ｋ　ゲル及びキトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧゲルをそれぞれ作製し、ＤＭＥＭを１ｍＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で静置した。所定時間経過後、サンプルをＰＢＳを用いて３回洗浄し、各サンプルを２４時間凍結乾燥させ、ゲルの乾燥重量を測定した。以下の式を用いて、重量損失を算出した。培地は２，３日毎に取り換えた。
重量損失（％）＝（Ｗｄ０－Ｗｄ）／Ｗｄ０×１００
Ｗｄ０：初期乾燥重量（ｄａｙ０）
　培養条件：
細胞数：３．０×１０６細胞
細胞密度：１．０×１０７細胞／ｍｌ
ゲル体積：３００μＬ
培地量：１０００μＬ
　細胞存在下において、キトサン／ＰＥＧ５ｋゲルはｄａｙ４０まで顕著な分解挙動は示さず、キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧゲルは経過時間に伴う緩やかな分解挙動を示した。従って、細胞存在下においても同様に、ＰＬＡに由来する分解挙動を示していることが示唆された。また、キトサン／ＰＥＧ５ｋゲルにおいて、ｄａｙ４０以降、細胞の伸展に伴い架橋鎖が切断され、顕著な分解挙動を示していると考えられる。
　ＭＴＴアッセイ
（１）サンプルの培地を交換する際に、ＤＭＥＭを４５０μＬ加え、５ｍｇ／ｍＬ　ＭＴＴ試薬を５０μＬ加えた。
（２）２４時間、インキュベーション（３７℃，５％ＣＯ２）した。
（３）上澄みを除去し、ゲルを崩し、ＭＴＴ抽出用試薬（２－プロパノール：１Ｍ　ＨＣｌ＝２４：１ｖｏｌ％）を５００μＬ加え、３７℃で２４時間振とうした。
（４）遠心（１，５００ｒｐｍ，５分間）後、９６ウェルプレートに上澄みを１００μＬ／ウェル加え、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した（図１６）。
　ＭＴＴアッセイによるミトコンドリア活性は、培養初期において全てのハイドロゲルにおいて低下した。その後、ＲＡＤＡ非混合ゲルでは低い状態を維持していたが、ＲＡＤＡ混合ゲルでは顕著な活性の上昇が見られた。これは、ペプチドの繊維構造が生体環境を模倣した結果、細胞活性が向上したと考えられる。また、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合、細胞活性は有意に向上した。これは、分解性を付与した影響であると考えられる。また、培養後期において、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧを用いた場合、活性の低下を確認した。これは、ゲルが分解し細胞が放出されていることを示唆している。
　ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）アッセイ
（１）ＤＭＭＢ　４ｍｇをエタノール１．２５ｍＬに溶解させ、ギ酸０．７５ｍＬ，１．０Ｍ　ＮａＯＨ溶液６．４ｍＬを添加し、計２５０ｍＬになるまでＭｉｌｌｉ　Ｑ水でメスアップすることにより、ＤＭＭＢ溶液を調製した。
（２）９６ウェルプレートにＤＭＭＢ溶液を１２５μＬ／ウェル加えた。
（３）検量線用コンドロイチン硫酸溶液（ＰＢＳ中），サンプル（２倍希釈培地、ゲル融解液）を２０μＬ／ウェル加え、よくピペッティングした。
（４）５７０ｎｍにおける吸光度を測定した（図１７～１９）。
　作製したキトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルは、キトサン／ＰＥＧ５ｋ／ＲＡＤＡ１６ゲルと比較すると、培地中のＧＡＧ産生、及びゲル中のＧＡＧ産生量は、培養初期の段階では同程度のＧＡＧ産生量を示しているが、培養後期の段階では、キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルの方がＧＡＧ産生量が高くなっている。キトサン／ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルは、培養条件下において緩やかな分解挙動を示すことを確認しており、ゲルに分解性を付与した結果ＧＡＧ産生量が向上していると考えられる。
　重合官能基－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－重合官能基、または重合官能基－ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＰＬＡ－重合官能基をゲル化の架橋材料として用いる場合は、重合開始剤、重合性の刺激（紫外線、ガンマ線、など）が必要となる。
　この場合、（１）光毒性、重合開始剤分解物等の毒性シグナルによって、ゲル化反応後の細胞生存率が大きく低下する、（２）光（主に紫外線）照射による細胞に対する遺伝子異常、癌化等のリスクが高まり、臨床ステージの安全性確保が困難である、などのデメリットが大きい（Wiliams et al, Biomaterials 2005, 26, 1211-1218; Liu et al, Adv. Mater. 2014, 26, 3912-3917; Cui et al, Biomacromolecules 2013, 14, 1904-1912）。
　一方、スクシンイミド－ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ－スクシンイミドは、ＰＥＧ－ＰＬＡ－ＰＥＧ、またはＰＬＡ－ＰＥＧ－ＰＬＡを用いる物理架橋ゲルと違い、極めて低濃度での架橋が可能である。したがって粘性の低い細胞混和物として扱うことが可能なため、生体内投与型のインジェクタブルゲルとしての利用が可能であり、臨床治療への適合性が高い。
　また、ゲル化反応の駆動力として、分解生成物（副生成物）の安全なスクシンイミドとタンパク分子アミノ酸残基との反応を用いており、しかも混合するだけでゲル化が進むため、他の第３刺激因子を必要としない。
　その結果、ゲル化反応後の細胞生存率は、架橋前に対して１００％を維持する極めて毒性の低い反応である。
　本発明のトリブロック共重合体は、生分解性相互侵入高分子網目（ＩＰＮ）の製造のために有用である。

Claims (6)

  1. 　ポリエチレングリコール－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ポリエチレングリコール骨格を有する、トリブロック共重合体。
  2. 　式Ｉ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （式中、
    　ｎは、１０～１０００であり、
    　ｍは、１～１００である）
    で示される繰り返し単位を含む、請求項１に記載のトリブロック共重合体。
  3. 　請求項１又は２に記載のトリブロック共重合体、キトサン、自己組織化ペプチドを含む、生分解性インジェクタブルゲル。
  4. 　自己組織化ペプチドが、（ＲＡＤＡ）４である、請求項３に記載の生分解性インジェクタブルゲル。
  5. 　下記：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    （式中、
    　ｎは、１０～１０００である）
    をＤ，Ｌ－ラクチドと反応させ、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    （式中、
    　ｍは、１～１００である）
    を得る工程、
    得られた
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    を
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    と反応させ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    を得る工程、
    得られた
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    を脱保護し、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    を得る工程、
    得られた
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    を炭酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）と反応させ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    を得る工程
    を含む、ポリエチレングリコール－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ポリエチレングリコール骨格を有する、トリブロック共重合体の製造方法。
  6. 　請求項１のトリブロック共重合体を含む、架橋剤。
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