JP5119442B2 - ゲル及び該ゲルからなる医療用材料 - Google Patents
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Description
(1)次式(I):
[式(I)中、R1及びR2は互いに独立して水素原子又はアルキル基を表し、R3はカルボキシル基、又はアミノ基若しくは水酸基との反応性を有するカルボキシル基の誘導基、又は次式(II):
[式(II)中、*はコラーゲン分子との結合部位を表す。]
で表される基を表し、R4、R5及びR6は互いに独立して水素原子、アルキル基、ジアゾニウム基又はアリール基を表し、x:yは0.1:0.9〜0.9:0.1であり、m及びnは1以上の整数を表す。]
で表される繰り返し単位を有する架橋基によって架橋された複数のコラーゲン分子からなる架橋コラーゲンを支持構造として有するゲル。
(2)前記(1)記載のゲルが有するカルボキシル基同士を架橋して得られるゲル。
(3)前記カルボキシル基同士を1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルで架橋して得られる前記(2)記載のゲル
(4)前記(1)又は(2)記載のゲルからなる医療用材料。
(5)前記(4)記載の医療用材料からなる部分又は部材を有する医療用器具。
式(I)において、R1及びR2は互いに独立して水素原子又はアルキル基を表し、R1又はR2で表されるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、s−ブチル基、t−ブチル基、n−ペンチル基、イソペンチル基、t−ペンチル基、ネオペンチル基等の炭素数1〜5の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられるが、これらのうち、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基等の炭素数1〜3のアルキル基が好ましい。
[式(III)中、R7は水素原子、アルキル基又はアシル基を表す。]
で表される基が挙げられる。
[式(IV)中、R1、R2、R4、R5、R6、R7、x、y、m及びnは前記と同義である。]
で表される繰り返し単位を有するポリマー(以下「ポリマー(IV)」という。)を、カルボジイミド類(例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−1−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)、1−4―ブタンジオール−ジグリシジルエーテル(BDGE))、又はカルボジイミド類及びスクシンイミド類(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、N−ヒドロキシスルホンスクシンイミド(NHSS))と反応させた後、複数のコラーゲン分子と反応させることにより得ることができる。ポリマー(IV)が有するカルボキシル基又はその誘導基は、カルボジイミド類と反応した後、スクシンイミド類が存在する場合には、スクシンイミド類と反応し、次いで、コラーゲン分子が有するアミノ基(同一分子内のアミノ基又は異なる分子のアミノ基)と反応し、ポリマー(IV)とコラーゲン分子とが−CO−NH−を介して結合する。ポリマー(IV)が複数のコラーゲン分子と結合することにより、架橋基(I)によって架橋された複数のコラーゲン分子からなる架橋コラーゲンが形成され、これにより架橋コラーゲンを支持構造として有するハイドロゲルが形成される。
[式(V)中、R1、R4、R5、R6、m及びnは前記と同義である。]
で表されるモノマーと、次式(VI):
[式(VI)中、R2及びR7は前記と同義である。]
で表されるモノマーとを常法に従って共重合させることにより得ることができる。この反応において、反応溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、t−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム等を使用することができ、重合開始剤としては、例えば、2,2'−アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、アゾビスマレノニトリル等の脂肪族アゾ化合物;過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等の有機過酸化物等を使用することができる。
架橋させるカルボキシル基同士は、コラーゲン分子が有するカルボキシル基同士であってもよいし、コラーゲン分子が有するカルボキシル基と架橋基(I)が有するカルボキシル基であってもよい。
例えば、架橋基(I)によるコラーゲン分子の架橋度を調節することにより、コラーゲンの細胞接着性と、架橋基(I)の細胞非接着性とのバランスを調節することができ、これにより、所望の細胞接着性又は細胞非接着性が付与されたゲルを製造することができる。
1.ポリ(MPC−co−メタクリル酸)(PMA)の合成
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)0.01mol及びメタクリル酸0.024molをエタノール15mLに溶かし、重合開始剤としてα,α'−アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)1.2mmolを加えた後、60℃で16時間反応させることにより重合を行った。反応混合溶液をジエチルエーテルに投じて重合物を沈殿させ、これを濾別し、アセトニトリルで洗浄した後、減圧乾燥し、次式(VII)で表されるポリ(MPC−co−メタクリル酸)(PMA)を得た(収率80%)。
(1)EDC/NHS架橋ゲル(E/N−acゲル,E/N−alゲル)の調製
コラーゲン(タイプIコラーゲン(高研製))0.5質量%水溶液(pH3)をインキュベーター中で加温することにより、コラーゲンフィルムを調製した。コラーゲンフィルム0.05gを1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−1−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)6×10-5mol/mL及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)6×10-5mol/mLを含有する2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)水溶液(pH10)(pHは水酸化ナトリウム滴下により調整)8mL中に浸漬し、4℃で4時間反応させることにより(COOH:EDC:NHS=1:5:5)、コラーゲン分子が有するカルボキシル基とアミノ基とを結合させ、複数のコラーゲン分子が−CO−NH−を介して架橋されているコラーゲンゲル(E/N−alゲル)を得た。
各コラーゲンゲルは、Na2HPO4水溶液中で2時間リンスし、蒸留水にて3日間洗浄した。
PMA12.5mgを、MES水溶液(pH4.5又は10)8mL中で、EDC(6×10-5mol/mL)/NHS(6×10-5mol/mL)と4℃で10分間反応させた。その後、E/N−acゲル(50mg)又はE/N−alゲル(50mg)を加え、4℃で4時間反応させ、PMA固定化コラーゲンゲルとして、MiC−acacゲル(E/N−acゲルをpH4.5で架橋)、MiC−acalゲル(E/N−acゲルをpH10で架橋)、MiC−alacゲル(E/N−alゲルをpH4.5で架橋)、MiC−alalゲル(以下単に「MiCゲル」ともいう)(E/N−alゲルをpH10で架橋)を調製した。
各コラーゲンゲルは、Na2HPO4水溶液中で2時間リンスし、蒸留水にて3日間洗浄した。
MiC−alalゲル(MiCゲル)に上記と同様のPMA固定化を再度行い、PMAの含有率の高いMdCゲルを得た。また、PMAの架橋量を増加させるために、E/N−alゲルと反応させるPMA及び架橋剤の量を2倍に増加させ、MiCIIゲルを調製した。MiCIIゲルに上記と同様のPMA固定化を行い、MdCIIゲルを調製した。
以上のように調製された各種コラーゲンゲルを表1に要約する。
1.コラーゲンゲルの表面分析
サンプルを凍結乾燥した後、表面をX線光電子分光解析法(XPS)により光電子の放出角度を90°にして分析した。そして、走査電子顕微鏡(SEM,SM−200,Topcon,Tokyo,Japan)を使用して各種コラーゲンゲルの表面と破断表面を観察した。結果を図1に示す。なお、図示はしないが、MiC-acacゲル及びMiC-alalゲルは透明であった。
(1)収縮温度
各種コラーゲンゲルの収縮温度を示差走査熱量計(DSC6000,セイコー電子、Japan)で測定した。20℃から150℃まで5℃/分の速度で温度を上げ、各種コラーゲンゲルの収縮温度(Ts(℃))を測定した。結果を表2に示す。
各種コラーゲンゲルの引張強度を引張強度試験機(STA−1150,オリエンテック社製)で測定した。すなわち、各種コラーゲンゲル断片(4cm×1cm)を作製し、0.5mm/秒の速度で引っ張り、応力・歪み曲線及び引張強度を算出した。応力・歪み曲線を図2に示し、引張強度を表3に示す。
各種コラーゲンゲルの膨潤度の測定は、次のようにして行った。凍結乾燥したサンプルを10mgに切断し、3mLのリン酸緩衝液(pH7.4)の中に入れ、37℃で24時間で放置した。その後、膨潤したサンプルの重量を測定し、膨潤度(Swelling ratio(%))を算出した。膨潤度は次式にて算出した。
なお、Whは膨潤したサンプル重量、Wdは凍結乾燥したサンプル重量を表す。 また、上記と同様にして、酸性水溶液(pH2.1)中での膨潤度を測定した。
図3に示すように、MiC-acacゲル、MiC-acalゲル、MiC-alalゲル、MiC-alacゲル、MiC IIゲル、MdCゲル及びMdC IIゲルの膨潤度はいずれも100%を越えており、十分な膨潤度(柔軟性)を有していることが明らかとなった。すなわち、コラーゲンゲルへのPMA固定化により、ゲルの十分な膨潤度(柔軟性)を保持したまま、ゲルの引張強度(機械的強度)を高めることができることが明らかとなった。また、コラーゲンゲルへのPMA固定化の際のpH条件(アルカリ条件又は酸性条件)を調節することにより、又はPMAによる架橋度を調節することにより、又はEDC/NHS架橋ゲルの調製時のpH条件(アルカリ条件又は酸性条件)を調節することにより、ゲルの膨潤度(柔軟性)を調節できることが明らかとなった。また、ゲルの膨潤度はpHに応答して変化することが明らかとなった。
凍結乾燥したコラーゲンゲルを5×10-3M 塩化カルシウム及び8×10-4M アジ化ナトリウムを含有する0.1M Tris−HCl緩衝液(pH7.4)2mLに入れ、1時間安定化させた。そして、そのゲルの重さを測定し、Tris−HCl緩衝液に戻した。その後、ゲルを含有するTris−HCl緩衝液に、コラゲナーゼ(コラゲナーゼ活性:300units/mg)(EC3.4.24.3)を1.32mg/mLの濃度で溶かした0.1M Tris−HCl緩衝液(pH7.4)2mLを添加し、コラゲナーゼの全体濃度を100units/mLに調節した。37℃でコラゲナーゼを活性化し、1時間から72時間までのコラーゲンゲルの重量の変化を測定し、コラゲナーゼによるコラーゲンゲルの分解率を計算した。結果を図4に示す。
(1)各種コラーゲンゲルの調製
実施例1に準じて各種コラーゲンゲルを調製した。
架橋剤として1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−1−カルボジイミド塩酸(EDC)とN−ヒドロキシスシニルイミド酸(NHS)を使用した。まず、EDC及びNHSでコラーゲンフィルムを架橋し、EDC/NHSコラーゲンゲル(E/Nゲル)を作製した。MES緩衝液(C6H13NO4S・H2O;0.05mol,pH9.0)20mLにEDC及びNHSを溶かした後、コラーゲンフィルムを入れ、4℃で4時間反応させた(EDC:NHS:COOH=5:5:1)。その後、E/NゲルをNa2HPO4水溶液で2時間洗浄し、すぐ蒸留水で洗浄して、未反応物質及び塩を除去した。また、コラーゲンフィルムをpH9.0のMES緩衝液に1日漬け、架橋されていないコラーゲンゲル(Ucゲル)を作製し、E/Nゲルとともに対照ゲルとして使用した。
(a)透明性
Ucゲル及びMiCゲルの透明性を図5に示す。なお、図5(a)はブルーライトを当てた状態を示し、図5(b)は明るい場所で観察した状態を示し、AはUcゲル、BはMiCゲルを示す。
図5に示すように、MiCゲル(架橋されたコラーゲンゲル)は高い透明性を有する。また、ブルーライトを当てたUcゲル(架橋されていないゲル)は青色を反射し、白く見える(若干青色)が、ブルーライトを当てたMiCゲル(架橋されたゲル)は、透明だった。
接触角及びX線光電子分光法(X-ray photoelectron spectroscopy;XPS)により、各種コラーゲンゲルの表面分析を行った。各種コラーゲンゲルの接触角については、ゴニオメーターを用いて静的接触角を測定した。Bil-mont注射器で試料の表面に水滴を形成させ、その接触角を測定した。また、XPSについては、光電子の放出角を90°にし、各種コラーゲンゲルの表面分子状態を調べた。
接触角の測定結果を図6に示す。
図6に示すように、リン脂質ポリマー(PMA)の固定が進むとともに接触角が低下することが確認された。コラーゲンゲル表面の親水化はタンパク質の吸着と細胞の接着を抑制する因子の一つである。リン脂質ポリマーの固定化は、コラーゲンゲル表面を親水化した。また、再架橋による接触角の低下が観察された。これは、リン脂質ポリマーで再架橋すると緻密なポリマー層が形成され、表面がより親水化されるからであると考えられる。そして、表面の親水化によって、タンパク質の吸着と細胞の接着が抑制されることが期待される。
図7に示すように、PMAで架橋したコラーゲンのみリンピークが検出された。これにより、コラーゲンゲル層の外部にPMA層が生成されていることが確認された。即ち、PMAがコラーゲン層の中に入り込まずに、コラーゲン層の表面全体に固定化されることにより、細胞及び生物的活性を抑制するリン脂質基がゲルの表面に存在し、これによりゲルの表面特性が変化したことが示された。
各種コラーゲンゲルを80℃で3時間最小必須培地(MEM)中で放置した後、各種コラーゲンゲルの体積を測定し、放置前の体積と比較して、収縮した体積を算出した。
結果を図8に示す。なお、図8中、AはUcゲル、BはENゲル、CはMiCゲル、Dはグルタルアルデヒド架橋ゲルを示す。
図8に示すように、80℃で3時間各コラーゲンゲルを放置した結果、架橋されていないコラーゲンゲルの場合、温度上昇とともに収縮し、最終的に解けることが確認された。架橋されたゲルの場合、収縮が抑えられることが確認された。架橋されていない場合、収縮率は約67%であり、PMAで架橋されたゲルの場合、収縮率は約7〜8%であった(表4)。このことは、リン脂質ポリマー/コラーゲンハイブリッドゲルの場合、リン脂質ポリマー(PMA)とコラーゲン繊維間架橋により、コラーゲンの収縮を防ぐことが可能であることを意味する。
タンパク質吸着実験はフィブリノゲン血漿を使って行った。フィブリノゲン血漿(1mg/mL)に試料を入れ、37℃で3時間培養した。その後、PBSで洗浄し、1wt%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を使ってタンパク質を全部剥がした。剥がしたタンパク質を回収し、Micro BCA キット(波長750nm)で吸着タンパク質濃度を測定した。
結果を図9に示す。
図9に示すように、架橋されたコラーゲンゲルは、架橋されていないコラーゲン及び内部架橋ゲル(ENゲル)に比べ、タンパク質吸着量が減ることが確認された。フィブリノゲン血漿は血液に含まれているタンパク質で、血液が材料表面と接触した時、表面で活性化されて血小板及び細胞の接着を助ける。しかしながら、リン脂質ポリマーを固定した場合、フィブリノゲン血漿の吸着を防ぐことができ、血小板及び細胞の接着を抑制することが可能である。
L−929細胞(マウス繊維雅細胞)を使用して、コラーゲンゲルと細胞との間の接着特性を調べた。L−929細胞をEagle’s Minimum Essential Medium(最小必須培地;E−MEM)で培養した。0.25%トリプシンで処理後、細胞の密度を5×103cells/dishに調整し、コラーゲンゲルの表面に播いた。24時間又は48時間後、乳酸脱水素酵素分析(LDH;波長560nm)を使い、ゲルの表面に接着した細胞の数を数えた。接着した細胞の形態は走査電子顕微鏡(SEM)を使用して観察した。試料に接着した細胞をPBSで洗浄し、2.5%グルタルアルデヒドで固定した。そして、試料を脱水化し、真空で乾燥した。乾燥した試料はすべて滅菌し、走査電子顕微鏡で観察した。
結果を図10に示す。
図10に示すように、48時間で約16,000個の細胞が吸着されたUcゲルに対し、E/Nゲルは約4,500個、MiCゲル及びMdCゲルは約2,000個の細胞が吸着された。細胞の吸着抑制は、PMAのリン脂質基による。すなわち、ゲル表面の外側に並んであるリン脂質基がタンパク質との相互作用を防ぐ機能がある。そして、PMAを固定化することによってコラーゲンゲルの表面は親水化され、細胞の吸着が難しくなると考えられる。UcゲルとENゲルの場合、接着した細胞はゲルの表面と強い相互作用を起こすため、接着した細胞の形態は扁平化した(図11)。一方、MiC、MdC及びMtCゲルの場合、接触した細胞の形態は丸だった。これはPMA表面と細胞との間の相互作用が弱いことを示しており、細胞は増殖できないと考えられる。
毒性実験は3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)キットを使って行った。L929細胞(5,000cells/well)を試料に播き、48時間培養した。その後、PBSで試料をよく洗い、MTT溶液200μL(0.5 mg/mL in medium, filter-sterilized)を試料に加え37℃で4時間放置した。そして、MTTを捨て、ブルーフォルマザンを100μLのジメチルスルホキシドに溶かし、試料に添加した。Micro BCA kit(波長570nm)を使い、毒性を調べた。TCPS(Tissue culture polystyrene)に接着した細胞の数を100%に設定し、比較した。
結果を図12に示す。
図12に示すように、各種コラーゲンゲルに接着している細胞は殆ど生きていることが分かった。組織 SHAPE \* MERGEFORMAT 培養用ポリスチレン(TCPS)を基準として生きている細胞の割合を調べた結果、TCPSとあまり変わらないことが分かった。このことは、接着細胞の数の減少は毒性ではなく、コラーゲンゲル表面と細胞との間の弱い相互作用による細胞接着抑制特性に起因することを示している。
EDC及びNHSを利用したコラーゲンとポリマーの架橋は、反応後、架橋剤が残らない長点があることから汎用されている。しかしながら、EDC及びNHSとポリマーとの反応率は低いため、我々はポリマー再固定化(再架橋)を行い、ポリマーの架橋率を高めることに成功した。このシステムの場合、コラーゲンの内部架橋は微小繊維間架橋によるものの、コラーゲン繊維間架橋は存在しない。微小繊維間架橋とコラーゲン繊維間架橋の役割はあまり知られていないので、内部架橋の明確な役割に関して調べる必要がある。そこで、我々は、1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDGE)を使い、その問題点の解決に望んだ。BDDGEは酸性の条件ではカルボキシル基と反応し、アルカリ性の条件ではアミン基と反応する特徴を持っている。そこで、我々は内部架橋されていないリン脂質ポリマー/コラーゲンハイブリッドゲルにBDDGEを酸性条件で架橋し、リン脂質ポリマーとコラーゲン繊維架橋、コラーゲン繊維間架橋を行い、もっとも強くて高い安定性を持つ新しいタイプの高密度ネットワークゲルドゲルを作製した。このゲルを使用し、微小繊維間架橋とコラーゲン繊維間架橋の差異を調べた。
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)ユニットを有するPMAを使用し、コラーゲンとの架橋を行った。PMAをコラーゲンゲルに固定化するため、まずPMAをEDC/NHSと10分間MES緩衝液で反応させ(EDC:NHS:COOH=5:5:1)、PMAのカルボキシル基を活性化した。その活性化PMAをコラーゲンフィルム及びE/Nゲルと4℃で48時間反応させ、PMA−活性化コラーゲンゲル[MPC immobilized collagen gel (without intrahelical cross-links);MiC−0ゲル]を作製した。このゲルをNa2HPO4水溶液で2時間洗浄し、すぐ蒸留水で洗浄して未反応物質と塩を除去した。
MiC−0ゲルが有するカルボキシル基同士を架橋し、もっと緻密なネットワークを有するコラーゲンゲルを作製するため、BDDGEを含有するMES緩衝液(pH4.5)にMiC−0ゲルを入れ、25℃で5日間反応させた。その後、ゲルを水で30分間4回洗い、カルボキシル基間架橋を有するMiC−0/diolゲル(高密度ネットワークゲル)を作製した。高密度ネットワークゲルの構造式を図13に示す。
乾燥した試料(高密度ネットワークゲル)を蒸留水の中に入れて重さの変化を測定し、膨潤度を計算した。各試料を25℃又は37℃の蒸留水中に入れ、24時間放置した。その後、水を軽く拭いて膨潤したゲルの重さを量り、含水率を計算した。含水率(%)は以下の式に基づき算出した。
含水率(%)=(Wh−Wd)/Wh×100
なお、Wdは乾燥した試料の重さ、Whは膨潤した試料の重さである。
また、含水率実験の前の試料の重さと実験後の乾燥した試料の重さの変化を測定し、コラーゲンゲルの浸食率も計算した。
図14(a)に示すように、コラーゲンゲルの含水率は架橋とともに低下した。MiC−0/diolゲルは、MiC−0ゲルと比較して含水率が最も低下した。含水率を膨張度に換算すると、約70%にも及ばなかった。また、E/Nゲルと比較しても、非常に含水率が低かった。これは、カルボキシル基間架橋がかなり緻密な構造を形成させることを示している。結局、このゲルは水の中に高い安定性を持つことを表している。25℃及び37℃における含水率を比べた結果、Ucゲル以外に変化は見られなかった。これは、コラーゲンゲルの膨潤を抑え、α−へリックス構造の水による変性を防ぐことにより、安定したネットワーク構造が維持されるからであると考えられる。
また、図14(b)に示すように、約30%の浸食率が観察されたUcゲルに対し、高密度ネットワークゲルの浸食率は約2%以下だった。他のゲルと比べても、非常に低い浸食率であった。このことは、このゲルが非常に安定性が高く、緻密なネットワークを形成していることを示している。すなわち、微小繊維間架橋よりもコラーゲン繊維間架橋の方が安定したコラーゲンゲルを形成できると考えられる。
Claims (5)
- 次式(I):
で表される基を表し、R4、R5及びR6は互いに独立して水素原子、アルキル基、ジアゾニウム基又はアリール基を表し、x:yは0.1:0.9〜0.9:0.1であり、m及びnは1以上の整数を表す。]
で表される繰り返し単位を有する架橋基によって架橋された複数のコラーゲン分子からなる架橋コラーゲンを支持構造として有するゲル。 - 請求項1記載のゲルが有するカルボキシル基同士を架橋して得られるゲル。
- 前記カルボキシル基同士を1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルで架橋して得られる請求項2記載のゲル
- 請求項1又は2記載のゲルからなる医療用材料。
- 請求項4記載の医療用材料からなる部分又は部材を有する医療用器具。
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