JP2010068867A - 長時間作用型コラーゲンおよびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】年齢の増長に連れて老化した皮膚を若返らせる方法として、滞留時間が長く生物毒性のない自然顔面充填材料である長時間作用型コラーゲンおよびその製造方法を提供。
【解決手段】豚皮の余分な組織の擦り落とし,油脂の除去,膨潤,消化,遠心分離,塩析,下層沈殿物の収集,冷凍乾燥を経った後に、コラーゲンを取得し、更に該コラーゲンがγ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)と混合し、同時にグルタルアルデヒド溶液を添加し且つ均一に攪拌し、第1の架橋を行い、更に該グルタルアルデヒド溶液を繰り返して添加し且つ均一に攪拌し、第2の架橋を行って得る、長時間作用型コラーゲン。
【選択図】図1
【解決手段】豚皮の余分な組織の擦り落とし,油脂の除去,膨潤,消化,遠心分離,塩析,下層沈殿物の収集,冷凍乾燥を経った後に、コラーゲンを取得し、更に該コラーゲンがγ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)と混合し、同時にグルタルアルデヒド溶液を添加し且つ均一に攪拌し、第1の架橋を行い、更に該グルタルアルデヒド溶液を繰り返して添加し且つ均一に攪拌し、第2の架橋を行って得る、長時間作用型コラーゲン。
【選択図】図1
Description
本発明は、長時間作用型コラーゲンおよびその製造方法を提供するもので、コラーゲン(Collagen)の製備を介し、更にγ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)を添加し、最後に2回の架橋を経つことにより、つまり該長時間作用型コラーゲンを取得できるものであるが、これは、該コラーゲンが人体内に滞留する時間を、増長できるだけではなく、同時により好ましい生体適合性(biocompatibility)などの利点を具することにより、該長時間作用型コラーゲンが実際の応用上では、産業応用の価値を極めて具する。
故に、人々は、年齢の増長に連れて皮膚が老化により光沢を失い、しわが現れ、ひいては粗末となって弾力性が無すが、その主要な原因は、皮膚中における真皮層(Dermis)が年齢の増長に連れてその代謝機能を次第に衰退し、そして真皮層がつまり皮膚の弾力性のソースとなり、一旦真皮層の代謝機能が退化すれば、共に皮膚が老化するためであるが、従って世の中に数多くの若返リ(rejuvenate)の方法を次第に発展し、そして若返リの方法中でも、効果の最も優れるのは、顔面を充填する充填剤で、そして顔面の充填剤の材料(facial fillers)の中に合成材料と自然材料の両種類に分別できるが、該合成材料がシリコーン(Silicone),ハイドロキシアパタイト(Hydroxyapatite,HAP),ポリ乳酸(Poly-lactic acid,PLA),ポリメタクリル酸メチル樹脂(Polymethyl methacrylate,PMMA)及びヒドロキシエチルメタクリレート(Hydroxyethylmethacrylate,HEMA)などを含んでなり、そして該自然材料がボツリヌス菌毒素(BT),自家脂肪(Autologous fat),コラーゲン(Collagen)及びヒアルロン酸(Hyaluronic acid,HA)などを含んでなる。
但し、該合成顔面充填剤材料は、下記の欠点を具する。
1、シリコーン(Silicone):人体内に注射して体内に永遠に存在できるが、でも長時間炎症反応を引き起こして更に肉芽腫(granulomas)を生成するのは、極めて容易となり、手術により取り出す必要があり、その他に地球引力の影響を受けることにより、インプラントのマイグレーション(migration)の現象を生成する恐れがあり、従って米国食品医薬品局(Food and Drug Administration,FDA)は、既に明文には、この材料を人体中に注射することを禁じる。
2、ハイドロキシアパタイト(HAP):目前にHAPを材料とする中では、例えばRadiesse(ラディエッセ)は、米国食品医薬品局(FDA)を通すことにより認可された唯一の顔面充填剤で、2〜3年間等に維持できるが、但し偶にノジュール(nodule)を生成し、特に唇部位には相当に不美観となる。
3、ポリ乳酸(PLA):目前に主としてポリ-L-乳酸(PLLA)を注射材料とし、米国食品医薬品局(FDA)を通すことにより認可されるが、但し依然として肉芽腫(granulomas)を生成し、目前に全ての顔面充填注射材料(facial fillers)の中でも、肉芽腫を生成する周波数が最も高くなる。
4、ポリメタクリル酸メチル樹脂(PMMA):ポリメタクリル酸メチル樹脂は、良好な生体適合性(biocompatibility)を具するが、但し人体内に分解できず、生物の累積をもたらし、然し永遠に材料をインプラントしても、肉芽腫を相当容易に生成し、手術により取り出す必要もあり、従って目前に数多くの国が既にポリメタクリル酸メチル樹脂を皮下注射に使用することを禁じる。
5、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA):その欠点がポリメタクリル酸メチル樹脂と類似するが、然しながら、その中でも水酸基(-OH)を一つ含み、従って注射された後にその弾力性がより好ましくなり、でも時間に連れて硬化現象が起こる。
前述の該合成顔面充填材料の欠点は、主として厳しい炎症反応を引き起こし、同時に人体内には、より大きな副作用がある。
また、該自然顔面充填材料も、下記の欠点を具する。
1、ボツリヌス菌毒素(BT):アセチルコリン(acetylcholine)の釈放を阻止することを介することにより、一部の神経と筋肉の生理機能を遮断するが、これにより、ダイナミックな皺の除去効果を達成し、但し同時にボツリヌス菌毒素(BT)が筋肉の一部の生理機能を遮断し、長時間の下で筋肉に退化の兆しが起こり、従って患者が微笑む時に、その顔部の表情が不自然となり、その他に筋肉の活動力が減少するため、毎日患者が何れも注射の部位に対してマッサージを行う必要があり、一方では研究文献から、ボツリヌス菌毒素(BT)を過量に注射すれば、1%の死亡率があることを見い出す。
2、自家脂肪:その材料のソースが患者の自家脂肪であるため、生物の互換性が極めて高くなり、但し脂肪のソース及び患者の個人の差異により、自家脂肪を体内に滞留する時間の差異が相当に大きくなり、期間が数ヶ月乃至数年間などまでになり、一方では自家脂肪の粒子がより粗大となり、小範囲の皺跡または細い紋様を埋め込むことができず、従って使用の効果および範疇には、何れも相当に限りがある。
3、コラーゲン:目前にコラーゲンには、ヒトコラーゲン(human collagen),死体コラーゲン(cadaveric collagen),ウシコラーゲン(bovine collagen)及びブタコラーゲン(porcine collagen)などがあり、その中でも、ウシコラーゲン(bovine collagen)が既に二十数年間に使用され、且つ何れも米国食品医薬品局(FDA)を通すことにより認可されるが、但し人獣共通の狂牛病(mad cow disease)の疫病情況が爆発的に起こるため、感染する疑いがあり、そして人類の生体からのコラーゲンが、米国食品医薬品局を通すことにより許可されるが、但しそのソースから取得するのが比較的に困難となるため、その値段も他の材料よりも遥かに高価となり、人類の死体のコラーゲンは、そのソースが人類の生体のコラーゲンと同じであるが、但し培養の環境因子の影響を受けるため、製備できた粒度(particle size)が比較的に大きくなり、約ミクロン(μm)とセンチメートル(mm)の間に介在し、従ってより粗大な針の頭も必要とすることにより、患者の余分な痛み感を引き起こす。
4、ヒアルロン酸(HA):ヒアルロン酸(HA)が2種類の単量体(例えばN-アセチグルコサミン(N-acetyglucosamine)とD-グルクロン酸(D-glucuronic acid))により重合されてなり、多糖類(polysaccharide)の一種となり、完全に代謝できるが、然しながらその中の該単量体(例えばN-アセチグルコサミン(N-acetyglucosamine))の構造が非常にヘパリン(heparin)に類似するため、傷口が生成した時に、該単量体(例えばN-アセチグルコサミン(N-acetyglucosamine))が埋め込まれるが、従ってヒアルロン酸(HA)の数量の減少をもたらし、且つヒアルロン酸(HA)が真皮層の中における物質の結合のみを強化でき、ひいては皮膚が弾力性を具することを不可能とするため、インプラントした後に、外力による押し付け及び傷口の生成をできるだけ避ける必要があり、一方では筋肉の移動がヒアルロン酸(HA)の吸収を加速するが、従って患者は、多すぎる顔部の表情を避ける必要がある。
前述の天然および合成の顔面の充填材を総合する中では、コラーゲンによる炎症の反応程度が最低となり、その応用可能な範疇も最も広くなり、但しコラーゲンは、依然として下記の欠点がある。
1.体内に滞留する時間が比較的に短くなること:架橋しなかったコラーゲンが人体内に三ヶ月間に分解して吸収され、そしてグルタルアルデヒド(Glutaraldehyde)などの架橋剤を経って架橋されたコラーゲンが六ヶ月間までに滞留できるが、但し滞留時間が依然として短すぎ、常に補充して注射する必要があり、相当に不便となる。
2.生物毒性を具すること:グルタルアルデヒドを経って架橋されたコラーゲンが、高濃度のグルタルアルデヒドを残留し、その具する高度な生物毒性が人体の健康を危害する。
これにより、前述の従来のコラーゲンが依然として数多くの欠点を具し、実に優れる設計ではなく、そして改善をより期待することを了解できる。
従来のコラーゲンの具する滞留時間が短くなること及び生物毒性を具するなどの欠点に鑑み、従って本発明者は、多年の該方面に関連する経験を従事することに基づき、つまり長時間の努力,研究と実験を経って更に関連する学理に対応するため、ついに本発明の「長時間作用型コラーゲンおよびその製造方法」を開発して設計する。
本発明の目的は、長時間作用型コラーゲンを提供するもので、コラーゲン中にγ−ポリグルタミン酸(γ−polyglutarmic acid,γ−PGA)を入れ、更に2回の架橋を介し、つまり架橋の度合いがより均一かつ完全となると共に滞留時間が2〜3倍に増長する長時間作用型コラーゲンを取得でき、これにより、慣用のコラーゲンの滞留時間が短すぎて常に補充して注射する必要がある欠点を、解決するものである。
本発明の他の目的は、生物毒性の低いコラーゲンを提供するもので、濃度の極めて低いグルタルアルデヒドを利用し、2回の架橋を介して該コラーゲンと該グルタルアルデヒドを均一かつ完全に架橋し、つまり濃度の極めて低いグルタルアルデヒドを残留すると同時により好ましい生体適合性(biocompatibility)を具するコラーゲンを取得でき、これにより、慣用のコラーゲンに高濃度のグルタルアルデヒドが残留して更に該グルタルアルデヒドが生物毒性を具して人体の健康を危害する欠点を、解決するものである。
貴審査官は、本発明の技術手段および動作過程をより認識かつ了解できることに寄与するために、実施例を挙げて図面に対応し、下記のように詳細に説明する。
本発明は、「長時間作用型コラーゲンおよびその製造方法」に関するもので、予めコラーゲン(Collagen)を製備し、且つ該コラーゲン中にγ−ポリグルタミン酸(γ−polyglutarmic acid,γ−PGA)を入れ、同時に下記の予定のプロセスを経つことにより、つまり長時間作用型コラーゲンを取得できるが、その中でも該γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)の化学構造は、図2に示すように、その構造中におけるアミド結合(amide
linkage.−CONH)が該γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)のアミノ基(−NH2)と残基(residue
group)のカルボニル基(−COOH)結合からなり、γ−結合と言い、該結合が比較的に人体の体内における酵素の攻撃により急速に分解しにくく、該γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)が人体の体内における酵素の分解に対する高抵抗性を利用し、これにより、人体内におけるコラーゲンの分解速度を大幅に緩める。
linkage.−CONH)が該γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)のアミノ基(−NH2)と残基(residue
group)のカルボニル基(−COOH)結合からなり、γ−結合と言い、該結合が比較的に人体の体内における酵素の攻撃により急速に分解しにくく、該γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)が人体の体内における酵素の分解に対する高抵抗性を利用し、これにより、人体内におけるコラーゲンの分解速度を大幅に緩める。
図1に示すように参照し、該長時間作用型コラーゲンの製造は、下記のステップに基づいて処理を行う。
ステップ1、余分な組織の擦り落とし:先ず豚皮から余分な筋肉と脂肪などの組織を擦り落として更に余剰の部分を小切れの組織に剪断すること、
ステップ2、油脂の除去:該小切れの組織をアセトン(acetone)の中に浸漬することにより油脂を除去して更に油脂を完全に除去するまでに2次水にて洗い流すこと、
ステップ3、膨潤:油脂が除去された小切れの組織を、予定の温度(該予定の温度が4℃)の下で予定の時間(該予定の時間が24時間)に塩水(該塩水の濃度が10%)の中に浸漬した後に、更に特定なpH値(該特定なpH値が4.5)のクエン酸(citric acid)溶液中に浸漬して更に該予定の時間を継続することにより、該小切れの組織が膨潤すること、
ステップ4、消化:膨潤を経った後の該小切れの組織が該予定の温度下で第1の溶液(該第1の溶液が濃度0.5Mのペプシン(pepsin)と塩化水素酸(hydrochloric acid)を混合する溶液)の中に浸漬して該予定の時間を継続することにより、該小切れの組織が第2の溶液に消化されること、
ステップ5、遠心の分離:該第2の溶液が第1の予定条件(該第1の予定条件が5500g)の下で遠心を行うことにより、その中でも消化された該小切れの組織が該第2の溶液と分離すること、
ステップ6、塩析:前述の分離した後の該第2の溶液を塩水溶液に添加して第3の溶液(該第3の溶液の濃度が0.8M)を製備し、同時に雲形の物を析出するまでに、より激しく揺動すること、
ステップ7、下層の沈殿物の収集:揺動した後の該第3の溶液が第2の予定条件(該第2の予定条件が22000g)の下で遠心を行い、同時に下層の沈殿物を収集し、更に該下層の沈殿物を2次水の中に入れ、同時に水酸化ナトリウム(NaOH)(該水酸化ナトリウムの濃度が0.1N)を添加し、pH値を調整して第4の溶液(該第4の溶液のpH値が7)となること、
ステップ8、冷凍乾燥:他の予定温度(該他の予定温度が−20℃)の下では該予定の時間に該第4の溶液を冷凍し後に、更に乾燥を行い、つまりコラーゲン(該コラーゲンが第1型のコラーゲン(Type 1
collagen))を取得できること、
ステップ9、該γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)との混合:該コラーゲンを配してコラーゲン溶液(該コラーゲン溶液の濃度が35mg/ml)となり、同時に予定量(該予定量が4ml)の該コラーゲン溶液を取り出し、同様な予定量のγ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)と混合して第5の溶液となること、
ステップ10、1回目の架橋の行い:該第5の溶液中にポンプ(該ポンプが蠕動ポンプ)により他の予定量(該他の予定量が0.5ml)のグルタルアルデヒド溶液(該グルタルアルデヒド溶液の濃度が0.05%)を滴入し、同時に予定の回転数(該予定の回転数が250rpm)にて他の予定時間(該他の予定時間が30分間)に攪拌することにより、該第5の溶液中における該コラーゲンがグルタルアルデヒドとの1回目の架橋を行うこと、
ステップ11、2回目の架橋の行い:最後に再びステップ10を繰り返して2回目の架橋を完成した後に、つまり該長時間作用型コラーゲンを取得できること。
ステップ2、油脂の除去:該小切れの組織をアセトン(acetone)の中に浸漬することにより油脂を除去して更に油脂を完全に除去するまでに2次水にて洗い流すこと、
ステップ3、膨潤:油脂が除去された小切れの組織を、予定の温度(該予定の温度が4℃)の下で予定の時間(該予定の時間が24時間)に塩水(該塩水の濃度が10%)の中に浸漬した後に、更に特定なpH値(該特定なpH値が4.5)のクエン酸(citric acid)溶液中に浸漬して更に該予定の時間を継続することにより、該小切れの組織が膨潤すること、
ステップ4、消化:膨潤を経った後の該小切れの組織が該予定の温度下で第1の溶液(該第1の溶液が濃度0.5Mのペプシン(pepsin)と塩化水素酸(hydrochloric acid)を混合する溶液)の中に浸漬して該予定の時間を継続することにより、該小切れの組織が第2の溶液に消化されること、
ステップ5、遠心の分離:該第2の溶液が第1の予定条件(該第1の予定条件が5500g)の下で遠心を行うことにより、その中でも消化された該小切れの組織が該第2の溶液と分離すること、
ステップ6、塩析:前述の分離した後の該第2の溶液を塩水溶液に添加して第3の溶液(該第3の溶液の濃度が0.8M)を製備し、同時に雲形の物を析出するまでに、より激しく揺動すること、
ステップ7、下層の沈殿物の収集:揺動した後の該第3の溶液が第2の予定条件(該第2の予定条件が22000g)の下で遠心を行い、同時に下層の沈殿物を収集し、更に該下層の沈殿物を2次水の中に入れ、同時に水酸化ナトリウム(NaOH)(該水酸化ナトリウムの濃度が0.1N)を添加し、pH値を調整して第4の溶液(該第4の溶液のpH値が7)となること、
ステップ8、冷凍乾燥:他の予定温度(該他の予定温度が−20℃)の下では該予定の時間に該第4の溶液を冷凍し後に、更に乾燥を行い、つまりコラーゲン(該コラーゲンが第1型のコラーゲン(Type 1
collagen))を取得できること、
ステップ9、該γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)との混合:該コラーゲンを配してコラーゲン溶液(該コラーゲン溶液の濃度が35mg/ml)となり、同時に予定量(該予定量が4ml)の該コラーゲン溶液を取り出し、同様な予定量のγ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)と混合して第5の溶液となること、
ステップ10、1回目の架橋の行い:該第5の溶液中にポンプ(該ポンプが蠕動ポンプ)により他の予定量(該他の予定量が0.5ml)のグルタルアルデヒド溶液(該グルタルアルデヒド溶液の濃度が0.05%)を滴入し、同時に予定の回転数(該予定の回転数が250rpm)にて他の予定時間(該他の予定時間が30分間)に攪拌することにより、該第5の溶液中における該コラーゲンがグルタルアルデヒドとの1回目の架橋を行うこと、
ステップ11、2回目の架橋の行い:最後に再びステップ10を繰り返して2回目の架橋を完成した後に、つまり該長時間作用型コラーゲンを取得できること。
以下にBicinchoninic
acid(ビシンコニン酸;BCAと略称)測定法のステップに基づき、本発明の該長時間作用型コラーゲンが確かに分解抵抗な効果を具することを、より証明する。
acid(ビシンコニン酸;BCAと略称)測定法のステップに基づき、本発明の該長時間作用型コラーゲンが確かに分解抵抗な効果を具することを、より証明する。
一、先ず体積パーセンテージ50:1の割合にてA試薬とB試薬を均一に混合し、BCA試薬を製備する。
二、A組のサンプル,B組のサンプルとC組のサンプルを25μL個別に取り出して夫々96穴の滴定盤の各槽中に入れる。
三、該各槽中に200μLの該BCA試薬を夫々入れ、37℃の下で30分間に静置することにより、各組のサンプルが完全に反応する。
四、最後に免疫酵素スペクトル・アナライザーを利用して各組のサンプルの吸収値を夫々測定し、その測定した波長が650nmである。
前述の該A試薬の製備は、40mgの酒石酸ナトリウム(Na2C4H4O6・2H2O)を利用して10mlの濃度0.5Mの水酸化ナトリウム(NaOH)溶液の中に溶解し、完全に溶解した後になるまでに、更に炭酸ナトリウム(Na2CO3)を1g入れ、溶液が透明な清澄状態を呈するまでに、持続的に攪拌するものである。
前述の該B試薬の製備は、0.2gの酒石酸ナトリウム(Na2C4H4O6・2H2O)を利用して秤量し、2mlの濃度0.5Mの水酸化ナトリウム(NaOH)溶液の中に溶解し、完全に溶解した後になるまでに、更に脱イオン水を入れることにより、溶液の体積が10mlに達し、最後に更に該溶液内に0.3gの硫酸銅(CuSO4)を入れ、この時に該溶液が青色の清澄状態を呈するものである。
前述の該A組のサンプルが、4mlの濃度35mg/mlのコラーゲン溶液である。
前述の該B組のサンプルは、4mlの濃度35mg/mlのコラーゲン溶液を取り、更に該ポンプにより、1分間以内に0.5mlの該グルタルアルデヒド溶液を滴入し、同時に回転数250rpmで30分間に均一に攪拌し、1回目の架橋を行い、且つ1回目の架橋を行った後に、0.5mlのグルタルアルデヒド溶液の滴入を繰り返し、更に回転数250rpmで30分間に攪拌して均一に混合した後に、2回目の架橋を行うが、その中でも、該グルタルアルデヒド溶液の製備は、400μLのグルタルアルデヒドを取って7.6mlの該リン酸緩衝塩液(Phosphate-Buffered Saline, PBS)の中に溶解し、つまり濃度が0.5%である該グルタルアルデヒド溶液を製備して完成する。
前述の該C組のサンプルは、即ち本発明の製造方法に準じて取得された該長時間作用型コラーゲンで且つ該BCA測定法を利用してなる検査・測定であるが、従って該γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)をリン酸緩衝塩液(Phosphate-Buffered
Saline, PBS)の中に溶解することにより検査・測定を順調に完成する必要がある。
Saline, PBS)の中に溶解することにより検査・測定を順調に完成する必要がある。
その他に、該BCA測定法を介してコラーゲンスタンダード溶液を測定し、該コラーゲンスタンダード溶液の波長が650nmである箇所の吸収値xを取得でき、同時に再び該吸収値xを曲線方程式:y=0.002x+0.074に代入し、つまりy値を取得できるが、その中でも、該曲線方程式中のy値が該コラーゲンスタンダード溶液中におけるペプチド結合(peptide
bond)の濃度を代表し、これにより、例えば図3に示す該コラーゲンスタンダード溶液の曲線図を取得でき、該図を介し、該コラーゲンスタンダード溶液の波長が650nmである箇所の吸収値は、そのペプチド結合の濃度に対応する関係を、了解できる。
bond)の濃度を代表し、これにより、例えば図3に示す該コラーゲンスタンダード溶液の曲線図を取得でき、該図を介し、該コラーゲンスタンダード溶液の波長が650nmである箇所の吸収値は、そのペプチド結合の濃度に対応する関係を、了解できる。
2mlの前述の該コラーゲンスタンダード溶液が取り出され、濃度が35mg/mlであるコラーゲンは、5mlの濃度0.025Nの酢酸溶液中に溶解され、この後に該リン酸緩衝塩液(Phosphate-Buffered Saline, PBS)の溶液を利用して希釈し、つまり該コラーゲンスタンダード溶液を製備して完成する。
図4に示すように参照し、これは、同じ濃度のコラゲナーゼ(collagenase)の下で該A組,B組とC組のサンプルが該BCA測定法により検査・測定された結果であるが、その結果の中から、実験日数の第11日目の時に、該A組のサンプルの溶液中におけるペプチド結合(peptide
bond)の濃度が2.052mg/mlで、該B組のサンプルの溶液中におけるペプチド結合の濃度が1.77mg/mlで、該C組のサンプルの溶液中におけるペプチド結合の濃度が0.87mg/mlであることを表示し、前述の結果を通し、同じ実験条件の下で、該C組のサンプルの分解速度が該A組,該B組のサンプルの分解速度よりも遥かに遅くなることを発見でき、即ち該C組のサンプルが人体の体内における酵素の分解作用を比較的に抵抗できることを表示するが、該C組のサンプルの分解速度が、該B組のサンプルの分解速度よりも約2倍に遅くなり、そして目前の臨床テスト結果から、該B組のサンプルが人体の体内に6〜9ヶ月間に滞留でき、従って該C組のサンプルが人体の体内に滞留する時間は、約12〜18ヶ月間であると推測することが分かる。
bond)の濃度が2.052mg/mlで、該B組のサンプルの溶液中におけるペプチド結合の濃度が1.77mg/mlで、該C組のサンプルの溶液中におけるペプチド結合の濃度が0.87mg/mlであることを表示し、前述の結果を通し、同じ実験条件の下で、該C組のサンプルの分解速度が該A組,該B組のサンプルの分解速度よりも遥かに遅くなることを発見でき、即ち該C組のサンプルが人体の体内における酵素の分解作用を比較的に抵抗できることを表示するが、該C組のサンプルの分解速度が、該B組のサンプルの分解速度よりも約2倍に遅くなり、そして目前の臨床テスト結果から、該B組のサンプルが人体の体内に6〜9ヶ月間に滞留でき、従って該C組のサンプルが人体の体内に滞留する時間は、約12〜18ヶ月間であると推測することが分かる。
一方では、該C組のサンプルの中における該γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)がγ方式により結合され、そして人体の体内のアミン結合(amine bond)がα方式により結合され、従って人体内にγ方式結合を分解できる酵素がDNA配列の上で不活性化(inactivated)状態となるが、そして研究に基づき、この酵素を活性化するために6〜7ヶ月間を必要とし、従ってγ方式結合のポリペプチド(polypeptide)が人体の中に入り込む時に、少なくとも6〜7ヶ月間を必要としてやっと分解し始めることが出来、γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)とコラーゲンを代表するコポリマー材料(例えば該C組のサンプル)が人体の中に少なくとも18〜25ヶ月間を必要として完全に代謝・分解できることを見い出す。
下記のように、細胞(該細胞が3T3繊維母細胞)を一つ利用して該A組,B組とC組のサンプルの生体適合性(biocompatibility)を評価するが、これは、該A組,B組とC組のサンプルが夫々該細胞と一緒に三日間に培養し、更に個別に下記の項目,数字を介することにより、細胞の活性,生存率,数量,老化(senescence)状態と遺伝子の毒性などの各情報を了解するものである。
一、ミトコンドリア酵素活性(Mitochondrial activity assay, MTT):夫々該A組,B組,C組のサンプルと一緒に培養する該等の細胞中におけるミトコンドリア酵素活性の検査・測定を介することにより、該等の細胞の活性を了解する。
二、乳酸脱水素酵素(Lactate Dehydrogenase, LDH):夫々該A組,B組,C組のサンプルと一緒に培養する該等の細胞中における乳酸脱水素酵素(LDH)の検査・測定を介することにより、該等の細胞の生存率を検査・測定する。
三、DNA総含有量:夫々該A組,B組,C組のサンプルと一緒に培養する該等の細胞中におけるDNA総含有量の検査・測定を介することにより、該等の細胞の数量を分析する。
四、b-ガラクトシダーゼ(b-galactosidase):夫々該A組,B組,C組のサンプルと一緒に培養する該等の細胞中におけるb-ガラクトシダーゼ(b-galactosidase)の検査・測定を介することにより、該等の細胞の老化状態を検査・測定する。
五、染色体異常(chromosome aberration):ギムザ染色法(Giemsa stain)を利用し、夫々該A組,B組,C組のサンプルと一緒に培養する該等の細胞における染色体異常(chromosome
aberration)を検査・測定することにより、つまり該A組,B組,C組のサンプルが該等の細胞に対する遺伝子の毒性を夫々了解する。
aberration)を検査・測定することにより、つまり該A組,B組,C組のサンプルが該等の細胞に対する遺伝子の毒性を夫々了解する。
その検査・測定の結果は、夫々下記の表のように示し、下記の表の中における控え組が、即ち前述の該コラーゲンスタンダード溶液である。
前記の表の結果から、A組,B組,C組のサンプルと控え組は、ミトコンドリア酵素活性(MTT),乳酸脱水素酵素(LDH),DNA総含有量,b-ガラクトシダーゼ(b-galactosidase)及び染色体異常(chromosome
aberration)などの指標において、何れも統計上の差異が無すことが観察でき、これにより、A組,B組とC組のサンプルが細胞毒性および染色体(chromosome)の誘発による変異を具さず、良好な生体適合性(biocompatibility)を具することを、証明できる。
aberration)などの指標において、何れも統計上の差異が無すことが観察でき、これにより、A組,B組とC組のサンプルが細胞毒性および染色体(chromosome)の誘発による変異を具さず、良好な生体適合性(biocompatibility)を具することを、証明できる。
前記の叙述から、本発明の該長時間作用型コラーゲンが従来のコラーゲンと異なるヒンジは、下記の通りであることを、証明できる。
一、本発明は、新規性と進歩性を具するものでるが、本発明は、コラーゲン中に該γ−ポリグルタミン酸(γ−PGA)を入れ、且つ2回の架橋を経つことにより、つまり該長時間作用型コラーゲンを取得でき、慣用のコラーゲンの滞留時間が短すぎること及び常に補充して注射する必要がある欠点を解決でき、従って新規性と進歩性を具する。
二、本発明は、実用性を具するものでるが、本発明は、該濃度の低いグルタルアルデヒドを利用し、2回の架橋を介することにより、該コラーゲンと該グルタルアルデヒドを均一かつ完全に架橋し、つまり濃度の極めて低いグルタルアルデヒドを残留すると同時により好ましい生体適合性(biocompatibility)を具する該長時間作用型コラーゲンを取得でき、従って実用性を具する。
故に、前述の詳細な説明は、ただ本発明に対してより好ましい実行可能な実施例の説明のみで、但し該実施例が本発明の特許請求の範囲を限定するように用いられるわけではなく、例えば本発明の掲示する技術精神をまだ脱逸しない下では完成された他の等価な変形および潤色・変更は、何れも本発明により跨られた特許請求の範囲内に含まれるべきである。
Claims (9)
- 長時間作用型コラーゲンの製造方法においては、該方法は、下記のステップを含むが、
豚皮から余分な筋肉と脂肪などの組織を擦り落として更に余剰の部分を小切れの組織に剪断すること、
該小切れの組織を有機溶剤中に浸漬して更に油脂を完全に除去するまでに2次水にて洗い流すこと、
油脂が除去された小切れの組織を、予定の温度下で予定の時間に塩水中に浸漬した後に、更に特定なpH値の酸性溶液中に浸漬して該予定の時間を継続することにより、該小切れの組織が膨潤すること、
膨潤を経った後の該小切れの組織が該予定の温度下で第1の溶液中に浸漬して該予定の時間を継続することにより、該小切れの組織が第2の溶液に消化されること、
該第2の溶液が第1の予定条件下で遠心を行うことにより、その中でも消化された該小切れの組織が第2の溶液と分離すること、
分離した後の該第2の溶液を塩水溶液に添加して第3の溶液を製備し、同時に雲形の物を析出するまでに、より激しく揺動すること、
揺動した後の該第3の溶液が第2の予定条件下で遠心を行い、同時に下層の沈殿物を収集し、該下層の沈殿物を2次水の中に入れ、同時に水酸化ナトリウムを添加し、pH値を調整して第4の溶液となること、
他の予定温度下では該予定温度該にて該第4の溶液を冷凍して更に乾燥を行い、つまりコラーゲンを取得できること、
該コラーゲンを配してコラーゲン溶液となり、同時に予定量の該コラーゲン溶液を取り出し、同様な予定量のγ−ポリグルタミン酸と混合して第5の溶液となること、
該第5の溶液中にポンプにより他の予定量のグルタルアルデヒド溶液を滴入し、同時に予定の回転数にて他の予定時間に攪拌することにより、該第5の溶液中における該コラーゲンがグルタルアルデヒド溶液中におけるグルタルアルデヒドとの1回目の架橋を行うこと、
再び該ポンプにより該他の予定量のグルタルアルデヒド溶液を滴入し、同時に予定の回転数にて該他の予定時間に攪拌して2回目の架橋を行い、つまり該長時間作用型コラーゲンを取得できることであることを特徴とする長時間作用型コラーゲンの製造方法。 - 該有機溶剤がアセトンであることを特徴とする請求項1に記載の長時間作用型コラーゲンの製造方法。
- 該予定温度が4℃であることを特徴とする請求項1に記載の長時間作用型コラーゲンの製造方法。
- 該酸性溶液がクエン酸溶液であることを特徴とする請求項1に記載の長時間作用型コラーゲンの製造方法。
- 該第1の溶液は、濃度が0.5Mであるペプシンと塩化水素酸との混合溶液であることを特徴とする請求項1に記載の長時間作用型コラーゲンの製造方法。
- 該他の予定温度が−20℃であることを特徴とする請求項1に記載の長時間作用型コラーゲンの製造方法。
- 該コラーゲンが第1型のコラーゲンであることを特徴とする請求項1に記載の長時間作用型コラーゲンの製造方法。
- 長時間作用型コラーゲンは、コラーゲンにγ−ポリグルタミン酸を添加し、且つ予定のプロセスを経つことにより、該長時間作用型コラーゲンを取得するものであることを特徴とする長時間作用型コラーゲン。
- 該予定のプロセスは、それぞれグルタルアルデヒド溶液を入れるステップ、第1の架橋を行うステップ及び第2の架橋を行うステップを、含むことを特徴とする請求項8に記載の長時間作用型コラーゲン。
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