CN101648989A - 长效型胶原蛋白及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种长效型胶原蛋白及其制造方法，是将一猪皮经过刮除多余组织、去除油脂、膨润、消化、离心分离、盐析、收集下层沉淀物、冷冻干燥后即可得一胶原蛋白，再将该胶原蛋白与γ－聚麸胺酸(γ－PGA)混合，同时加入一戊二醛溶液并搅拌均匀，进行第一交联，再重复加入该戊二醛溶液搅拌均匀，进行第二次交联后，即可得该长效型胶原蛋白，其可解决习用胶原蛋白的存留时间过短、必须常常补充施打，以及会残留高浓度的戊二醛，具有生物毒性会危害人体健康等缺点。
Description
技术领域
本发明是提供一种长效型胶原蛋白及其制造方法，其是透过制备一胶原蛋白(Collagen)，再添加一γ-聚麸胺酸(γ-PGA)，最后经过二次交联，即可得到该长效型胶原蛋白，其不但可增加该胶原蛋白在人体内的存留时间，同时具有较佳的生物适应性(biocompatibility)等优点，使得该长效型胶原蛋白在实际应用上极具产业应用价值。
背景技术
人随着年龄增长，肌肤会因老化而失去光泽、出现皱纹，甚至变得粗糙没有弹性，其主要原因是由于皮肤中的真皮层(Dermis)随着年龄增长，其代谢能力会慢慢衰退，而真皮层即是肌肤的弹性来源，一但真皮层的代谢能力退化，肌肤便会随的老化；于是坊间逐渐发展出许多回春(rejuvenate)的方法，而在回春方法中，效果最佳为填充颜面填充物，而颜面填充物的材料(facial fillers)中又可分为合成材料与天然材料两种，该合成材料包含有：硅胶(Silicone)、氢氧基磷灰石(Hydroxyapatite，HAP)、聚乳酸(Poly-lactic acid，PLA)、甲基丙烯酸树脂(Polymethyl methacrylate，PMMA)及聚甲基丙烯酸羟乙酯(Hydroxyethylmethacrylate，HEMA)等；而该天然材料则包含有：肉毒杆菌毒素(BT)、自体脂肪(Autologous fat)、胶原蛋白(Collagen)及玻尿酸(Hyaluronic acid，HA)等。
该合成颜面填充材料却具有下列缺点：
1、硅胶(Silicone)：注射至人体内可永久存在于体内，不过极容易引起长期发炎反应及产生肉芽肿(granulomas)，必须通过手术取出；另外，受到地心引力的影响，可能会有植入物移位(migration)的现象产生，因此美国药物食品检验局(Food and DrugAdministration，FDA)已明文禁止施打此材料于人体中。
2、氢氧基磷灰石(HAP)：目前以HAP为材料中，如：Radiesse，其是唯一通过美国药物食品检验局(FDA)所认可的颜面填充物，其虽可维持2～5年不等，不过有时会有结块(nodule)产生，尤其是在嘴唇部位，相当不美观。
3、聚乳酸(PLA)：目前主要是以左型聚乳酸(PLLA)作为施打材料，虽经过美国药物食品检验局(FDA)认可，不过仍会有肉芽肿(granulomas)产生，是目前所有颜面填充注射材料(facial fillers)的中，发生肉芽肿频率最高者。
4、甲基丙烯酸树脂(PMMA)：甲基丙烯酸树脂虽然具有良好的生物适应性(biocompatibility)，但在人体内却不会被降解掉，会造成生物累积，虽是永久性植入材料，也相当容易产生肉芽肿，亦需要开刀取出，故目前已有许多国家禁止甲基丙烯酸树脂使用于皮下注射。
5、聚甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)：其缺点与甲基丙烯酸树脂类似，不过由于其中含有一氢氧基(-OH)，所以在施打后其弹性较佳，不过随着时间会有硬化现象发生。
上述该合成颜面填充材料的缺点，主要是会引起严重发炎反应，同时在人体内会有较大副作用。
又，该天然颜面填充材料亦具有下列缺点：
1、肉毒杆菌毒素(BT)：其是透过阻止乙酰胆碱(acetylcholine)的释放，以阻断部分神经与肌肉的生理功能，以达到消除动态皱纹的效果，但肉毒杆菌毒素(BT)同时会阻断肌肉的部分生理功能，长期下来肌肉会有退化迹象，故当患者在微笑时，其脸部表情会不自然；另外，由于肌肉的活动力减少，故患者每天皆必须针对注射的部位进行按摩，另一方面，有研究文献指出，施打过量肉毒杆菌毒素(BT)有1％的致死机率。
2、自体脂肪：其材料来源为患者自体的脂肪，所以生物兼容性极高，但由于脂肪来源及患者的个体差异，使得自体脂肪在体内存留时间的变异相当大，期间可由数月至数年不等，另一方面，由于自体脂肪颗粒较粗大，无法填补小范围的皱痕或细纹，故在使用效果及范围均相当有限。
3、胶原蛋白：目前胶原蛋白有：人类活体(human collagen)、人类尸体(cadavericcollagen)、牛(bovine collagen)及猪(porcine collagen)等，其中牛的胶原蛋白(bovinecollagen)已使用二十几年，且都通过美国药物食品检验局(FDA)许可，不过由于爆发人畜共通的狂牛症(mad cow disease)疫情，有感染的疑虑；而来自人类活体的胶原蛋白，虽通过美国药物食品检验局许可，但由于其来源取得较为困难，其价格亦较其它材料昂贵许多；人类尸体的胶原蛋白虽然来源与人类活体的胶原蛋白相同，但由于受到培养环境因素的影响，制备出来的颗粒度(particle size)较大，约介于微米(μm)与厘米(mm)范围间，故亦需较粗大的针头，造成患者额外的疼痛感。
4、玻尿酸(HA)：由于玻尿酸(HA)是由两种单体(如：N-acetyglucosamine与D-glucuronic acid)聚合而成，是一种多醣类(polysaccharide)，其可被完全代谢，但其中的该单体(如：N-acetyglucosamine)的结构非常接近肝素(heparin)，所以当产生伤口时，该单体(如：N-acetyglucosamine)会进行填补，因而导致玻尿酸(HA)的数量减少，且由于玻尿酸(HA)只能强化真皮层中物质的结合，并不能使肌肤具有弹性，所以在植入后，必须尽量避免受外力挤压及伤口产生，另一方面，肌肉移动会加速玻尿酸(HA)的吸收，故患者必须避免过多脸部表情。
综合上述天然及合成颜面填充材料中，以胶原蛋白的发炎反应程度为最低，其可应用范围也最广，但胶原蛋白仍有下列缺点：
1、在体内存留时间较短：未交联过的胶原蛋白在人体内三个月便会被降解吸收，而经戊二醛(Glutaraldehyde)等交联剂交联过的胶原蛋白可存留至六个月，但存留时间仍然过短，必须常常补充施打，相当不便。
2、具有生物毒性：经过戊二醛交联过的胶原蛋白，会有高浓度的戊二醛残留，其具有高度生物毒性、会危害人体健康。
由此可见，上述习用的胶原蛋白仍有诸多缺失，实非一良善的设计，而亟待加以改良。
发明内容
有鉴于习用胶原蛋白，其具有存留时间短及具有生物毒性等缺点；因此，发明人依据多年来从事此方面的相关经验，乃经过长久努力研究与实验，并配合相关学理，终于开发设计出本发明的一种长效型胶原蛋白及其制造方法。
本发明的一目的，在提供一种长效型胶原蛋白，是在一胶原蛋白中加入一γ-聚麸胺酸(γ-polyglutarmic acid，γ-PGA)，再透过二次交联，即可得到一交联程度更均匀完全及存留时间增长为2～3倍的长效型胶原蛋白，以解决习用胶原蛋白的存留时间过短、必须常常补充施打的缺点。
本发明的另一目的，在提供一低生物毒性的胶原蛋白，是利用一极低浓度的戊二醛，透过二次交联使该胶原蛋白与该戊二醛交联均匀完全，即可得到一极低浓度的戊二醛残留、同时具有较佳的生物适应性(biocompatibility)的胶原蛋白，以解决习用胶原蛋白会有高浓度的戊二醛残留，及该戊二醛具有生物毒性会危害人体健康的缺点。
附图说明
图1为本发明的流程示意图；
图2为γ-聚麸胺酸的化学结构图；
图3为该胶原蛋白标准溶液曲线图；
图4为A组、B组、C组样本在相同浓度胶原蛋白降解酶下的降解速率测试结果示意图。
具体实施方式
为便于贵审查委员能对本发明的技术手段及运作过程有更进一步的认识与了解，现举一实施例配合图式，详细说明如下。
本发明是一种长效型胶原蛋白及其制造方法，其中先制备一胶原蛋白(Collagen)，并在该胶原蛋白中加入一γ-聚麸胺酸(γ-polyglutarmic acid，γ-PGA)同时经过下列一预定制程，即可得到一长效型胶原蛋白，其中该γ-聚麸胺酸(γ-PGA)的化学结构如图2所示，其结构中的酰胺键结(amide linkage.-CONH)，系由该γ-聚麸胺酸(γ-PGA)的胺基(-NH2)及侧基(residue group)的羰基(-COOH)键结而成，称为γ-键结，该键结较不易因为受到人体体内酵素的攻击而快速降解，利用该γ-聚麸胺酸(γ-PGA)对于人体体内酵素降解的高抵抗性，以大幅减缓胶原蛋白在人体内的降解速率。
请参阅图1所示，该长效型胶原蛋白的制造是依下列步骤进行处理：
步骤一、刮除多余组织：首先，将一猪皮刮除多余肌肉及脂肪等组织，再将剩余部分剪成小片段组织；
步骤二、去除油脂：将该小片段组织浸泡于丙酮(acetone)中，以去除油脂，再以二次水冲洗，直到完全去除油脂为止；
步骤三、膨润：将去除油脂的小片段组织，在一预定温度下(该预定温度为4℃)，浸泡于一盐水中(该盐水浓度为10％)一预定时间(该预定时间为24小时)后，再浸泡于一特定酸碱值(该特定酸碱值为pH值4.5)的柠檬酸(citric acid)溶液中，并持续该预定时间使该小片段组织膨润；
步骤四、消化：将经过膨润后的该小片段组织，在该预定温度下浸泡于一第一溶液中(该第一溶液为一浓度为0.5M的胃液素(pepsin)及一氢氯酸(hydrochloric acid)混合的溶液)持续该预定时间，使该小片段组织消化成为一第二溶液；
步骤五、离心分离：将该第二溶液在一第一预定条件下(该第一预定条件为5500g)进行离心，使其中被消化的该小片段组织与该第二溶液分离；
步骤六、盐析：将前述分离后的该第二溶液加入一食盐水溶液，制备为一第三溶液(该第三溶液的浓度为0.8M)，同时加以剧烈摇晃直到析出一云状物为止；
步骤七、收集下层沉淀物：将摇晃后的该第三溶液在一第二预定条件(该第二预定条件为22000g)下进行离心，同时收集一下层沉淀物，再将该下层沉淀物置入二次水中，同时加入一氢氧化钠(NaOH)(该氢氧化钠的浓度为0.1N)，调整酸碱值成为一第四溶液(该第四溶液的pH值为7)；
步骤八、冷冻干燥：将该第四溶液于一另一预定温度(该另一预定温度为-20℃)下冷冻该预定时间后，再进行干燥，即可得一胶原蛋白(该胶原蛋白为一第一型胶原蛋白(Type I collagen))；
步骤九、与该γ-聚麸胺酸(γ-PGA)混合：将该胶原蛋白配置为一胶原蛋白溶液(该胶原蛋白溶液的浓度为35mg/ml)，同时取一预定量(该预定量为4ml)的该胶原蛋白溶液，与同样预定量的γ-聚麸胺酸(γ-PGA)混合为一第五溶液；
步骤十、进行第一次交联：在该第五溶液中以-泵浦(该泵浦为一蠕动泵浦)滴入一另一预定量(该另一预定量为0.5ml)戊二醛溶液(该戊二醛溶液的浓度为0.05％)，同时以一预定转速(该预定转速为250rpm)搅拌一另一预定时间(该另一预定时间为30分钟)，使该第五溶液中的胶原蛋白与戊二醛进行第一次交联；
步骤十一、进行第二次交联：最后再重复步骤十，完成第二次交联后，即可得该长效型胶原蛋白。
以下则根据一Bicinchoninic acid(简称BCA)检测法步骤，加以证明本发明的该长效型胶原蛋白确有其抗降解的效果：
一、首先，将一A试剂及一B试剂以体积百分比50∶1的比例均匀混合，制备出一BCA试剂；
二、取一A组样本、一B组样本及一C组样本各25μl分别加入96孔滴定盘的各槽中；
三、于该各槽中分别加入200μl的该BCA试剂，于37℃下静置30分钟，使各组样本完全反应；
四、最后，利用一免疫酵素光谱分析仪分别测量各组样本的吸收值，其测定波长为650nm。
前述该A试剂的制备系利用将40mg的酒石酸钠(Na2C4H4O6.2H2O)溶在10ml浓度为0.5M的氢氧化钠(NaOH)溶液中，待其完全溶解后，再加入1g碳酸钠(Na2CO3)，持续搅拌，直到溶液呈透明澄清状态。
前述该B试剂的制备系利用秤取0.2g的酒石酸钠(Na2C4H4O6.2H2O)，溶于2ml浓度为0.5M的氢氧化钠(NaOH)溶液中，待其完全溶解后，再加入去离子水使溶液体积达到10ml，最后再加入0.3g硫酸铜(CuSO4)于该溶液内，此时该溶液呈蓝色澄清状态。
前述该A组样本为一4ml浓度为35mg/ml的胶原蛋白溶液。
前述该B组样本系取4ml浓度为35mg/ml的胶原蛋白溶液，再以该泵浦在一分钟内滴入0.5ml的该戊二醛溶液，同时以转速250rpm搅拌三十分钟均匀混合，进行第一次交联，并在第一次交联后，重复滴入0.5ml一戊二醛溶液，再以转速250rpm搅拌三十分钟均匀混合后，进行第二次交联；其中该戊二醛溶液的制备，系取400μL的戊二醛溶于7.6ml的该磷酸缓冲盐液(Phosphate-Buffered Saline，PBS)中，即制备完成浓度为0.5％的该戊二醛溶液。
前述该C组样本即为依据本发明的制造方法所获得的该长效型胶原蛋白，且为利用该BCA检测法的检测，故需将该γ-聚麸胺酸(γ-PGA)溶于一磷酸缓冲盐液(Phosphate-Buffered Saline，PBS)中，以顺利完成检测。
此外，透过该BCA检测法去检测一胶原蛋白标准溶液，可得到将该胶原蛋白标准溶液在波长为650nm处的一吸收值x，同时再将该吸收值x代入一曲线方程式：y＝0.002x+0.074，即可得到一y值，其中该曲线方程式中的y值系代表该胶原蛋白标准溶液中的胜肽链(peptide bond)浓度，藉此即可得到如图3所示的该胶原蛋白标准溶液曲线图，透过该图可得知该胶原蛋白标准溶液在波长为650nm处的吸收值对应其胜肽链浓度的关系。
前述该胶原蛋白标准溶液，系取2ml、浓度为35mg/ml的胶原蛋白，溶于5ml、浓度为0.025N的醋酸溶液中，然后利用该磷酸缓冲盐液(Phosphate-Buffered Saline，PBS)溶液稀释，即制备完成该胶原蛋白标准溶液。
请参阅图4所示，为该A组、B组、C组样本在相同浓度的胶原蛋白降解酶(collagenase)下，经该BCA检测法的检测结果，其结果中显示：在实验天数第11天时，该A组样本的溶液中胜肽链(peptide bond)浓度为2.052mg/ml，该B组样本的溶液中胜肽链浓度为1.77mg/ml，该C组样本中溶液的胜肽链浓度为0.87mg/ml，经由上述结果中可发现，在相同实验条件的下，该C组样本的降解速率较该A组、该B组样本的降解速率缓慢许多，即表示该C组样本较能抵抗人体体内酵素的降解作用；该C组样本的降解速度约比该B组样本的降解速度慢2倍，而以目前临床测试结果得知，该B组样本可在人体体内存留6～9个月，故可推算出该C组样本在人体体内中存留时间约为12～18个月。
另一方面，由于该C组样本中的该γ-聚麸胺酸(γ-PGA)系以γ方式键结，而人体体内的胺键(amine bond)系以α方式键结，所以人体内能降解γ方式键结的酵素在DNA序列上系为一不活化(inactivated)状态，而根据研究指出，活化此酵素需要6～7个月时间，故当一γ方式键结的多胜肽(polypeptide)进入人体中，至少需6～7个月才能开始被降解，代表一γ-聚麸胺酸(γ-PGA)与一胶原蛋白的共聚材料(如该C组样本)，在人体中至少需要比18～25个月才能被完全代谢降解。
下列系利用一细胞(该细胞为一3T3纤维母细胞)评估该A组、B组、C组样本的生物适应性(biocompatibility)：其系将该A组、B组、C组样本分别与该细胞一起培养3天，再分别透过下列项目数据，藉以得知细胞的活性、存活率、数量、衰老(senescence)情形及基因毒性等各项信息：
一、粒线体酵素活性(Mitochondrial activity assay，MTT)：透过检测分别与该A组、B组、C组样本一起培养的该等细胞中的粒线体酵素活性，以得知该等细胞的活性。
二、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)：透过检测分别与该A组、B组、C组样本一起培养的该等细胞中的乳酸脱氢酶(LDH)，以检测出该等细胞的存活率。
三、总DNA含量：透过检测分别与该A组、B组、C组样本一起培养的该等细胞中的总DNA含量，以分析该等细胞的数量。
四、半乳□甘酶(b-galactosidase)：透过检测分别与该A组、B组、C组样本一起培养的该等细胞中的半乳□甘酶(b-galactosidase)，以检测该等细胞的衰老情形。
五、染色体畸变(chromosome aberration)：利用吉姆沙染色法(Giemsa stain)检测分别与该A组、B组、C组样本一起培养的该等细胞的染色体畸变(chromosomeaberration)，以分别得知即该A组、B组、C组样本对于该等细胞的基因毒性。
其检测结果分别如下表所示，下表中的控制组即为前述的该胶原蛋白标准溶液：
| 控制组 | A组样本 | B组样本 | C组样本 | |
| 粒线体酵素活性 | 0.643 | 0.682 | 0.611 | 0.692±0. |
| (MTT) | ±0.154 | ±0.124 | ±0.173 | 189 |
| 乳酸脱氢酶(LDH) | 0.487±0.094 | 0.503±0.163 | 0.476±0.120 | 0.511±0.143 |
| 总DNA含量 | 0.833±0.144 | 0.789±0.159 | 0.810±0.201 | 0.805±0.176 |
| 半乳□甘酶(b-galactosidase) | 0.418±0.067 | 0.512±0.169 | 0.543±0.112 | 0.498±0.128 |
| 染色体畸变(chromosomeaberration) | 6.8％ | 5.88％ | 7.92％ | 6.73％ |
由上表的结果可观察到：A组、B组、C组样本与控制组在粒线体酵素活性(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总DNA含量、半乳□甘酶(b-galactosidase)及染色体畸变(chromosome aberration)等指标，均没有统计上的差异，藉此可证明A组、B组、C组样本没有细胞毒性及引发染色体(chromosome)的变异，具有良好的生物适应性。
由上述可证明，本发明的该长效型胶原蛋白有别习用的胶原蛋白关键在于：
一、本发明具有新颖性及进步性，由于本发明是在胶原蛋白中加入该γ-聚麸胺酸(γ-PGA)，并经过两次交联，即可得到该长效型胶原蛋白，其可解决习用胶原蛋白的存留时间过短、必须常常补充施打的缺点，故具有其新颖性及进步性。
二、本发明具有实用性，由于本发明系利用该低浓度的戊二醛，透过两次交联使该胶原蛋白与该戊二醛交联均匀完全，即可得到一极低浓度戊二醛残留、同时具有较佳的生物适应性的该长效型胶原蛋白，故具有其实用性。
按，上述详细说明为针对本发明的一种较佳的可行实施例说明而已，该实施例并非用以限定本发明的申请专利范圉，举凡其它未脱离本发明所揭示的技艺精神下所完成的均等变化与修饰变更，均应包含于本发明所涵盖的专利范围中。
Claims (9)
1、一种长效型胶原蛋白的制造方法，该方法包含下列步骤：
将一猪皮刮除多余肌肉及脂肪组织，再将剩余部分剪成小片段组织；
将该小片段组织浸泡于一有机溶剂中，再以二次水冲洗直到完全去除油脂为止；
将去除油脂的小片段组织，在一预定温度下，浸泡于一盐水中一预定时间后，再浸泡于一特定酸碱值的酸性溶液中持续该预定时间，使该小片段组织膨润；
将经过膨润后的该小片段组织，在该预定温度下浸泡于一第一溶液中持续该预定时间，使该小片段组织消化成为一第二溶液；
将该第二溶液在一第一预定条件下进行离心，使其中被消化的该小片段组织与该第二溶液分离；
将分离后的该第二溶液加入一食盐水溶液，制备为一第三溶液，同时加以剧烈摇晃，直到析出一云状物为止；
将摇晃后的该第三溶液在一第二预定条件下进行离心，同时收集一下层沉淀物，将该下层沉淀物置入二次水中，同时加入一氢氧化钠，调整酸碱值成为一第四溶液；
将该第四溶液于一另一预定温度下冷冻该预定温度，再进行干燥即可得一胶原蛋白；
将该胶原蛋白配置为一胶原蛋白溶液，同时取一预定量的该胶原蛋白溶液，与同样预定量的γ-聚麸胺酸混合为一第五溶液；
在该第五溶液中以一泵浦滴入一另一预定量戊二醛溶液，同时以一预定转速搅拌一另一预定时间，使该第五溶液中的该胶原蛋白与戊二醛溶液中的戊二醛进行第一次交联；
再次以该泵浦滴入该另一预定量戊二醛溶液，同时以一预定转速搅拌该另一预定时间，进行第二次交联，即可得该长效型胶原蛋白。
2、根据权利要求1所述的长效型胶原蛋白的制造方法，其中该有机溶剂为丙酮。
3、根据权利要求1所述的长效型胶原蛋白的制造方法，其中该预定温度为4℃。
4、根据权利要求1所述的长效型胶原蛋白的制造方法，其中该酸性溶液为一柠檬酸溶液。
5、根据权利要求1所述的长效型胶原蛋白的制造方法，其中该第一溶液为一浓度为0.5M的胃液素及一氢氯酸的混合溶液。
6、根据权利要求1所述的长效型胶原蛋白的制造方法，其中该另一预定温度为-20℃。
7、根据权利要求1所述的长效型胶原蛋白的制造方法，其中该胶原蛋白为一第一型胶原蛋白。
8、一种长效型胶原蛋白，其系在一胶原蛋白添加一γ-聚麸胺酸，并经过一预定制程以得到该长效型胶原蛋白。
9、根据权利要求8所述的长效型胶原蛋白，其中该预定制程分别包含加入一戊二醛溶液、进行第一次交联及进行第二次交联的步骤。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100217 |