WO2007013624A1 - ゲル及び該ゲルからなる医療用材料 - Google Patents

ゲル及び該ゲルからなる医療用材料 Download PDF

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WO2007013624A1
WO2007013624A1 PCT/JP2006/315050 JP2006315050W WO2007013624A1 WO 2007013624 A1 WO2007013624 A1 WO 2007013624A1 JP 2006315050 W JP2006315050 W JP 2006315050W WO 2007013624 A1 WO2007013624 A1 WO 2007013624A1
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gel
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collagen
cross
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Akio Kishida
Tsuyoshi Kimura
Kwangwoo Nam
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National University Corporation Tokyo Medical And Dental University
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
    • C08H1/06—Macromolecular products derived from proteins derived from horn, hoofs, hair, skin or leather

Definitions

  • the present invention relates to a gel, a medical material comprising the gel, and a medical device using the medical material.
  • Collagen is a biodegradable bio-derived material that is abundantly contained in animal dermis, tendon, bone, fascia, etc., and collagen gel (collagen hydrate mouth gel) is useful as a medical material.
  • collagen gel collagen hydrate mouth gel
  • the ability to crosslink between collagen molecules when preparing a collagen gel Crosslinking between collagen molecules using a chemical cross-linking agent such as glutaraldehyde is a biocompatibility that is an important property of collagen. (Biocompatibility) is significantly impaired.
  • Patent Document 1 discloses that a carboxyl group possessed by polyion and an amino group or a hydroxyl group possessed by a collagen molecule are combined with an amide bond using calpositimide.
  • a method for preparing a collagen gel by cross-linking collagen molecules by ester bonding is disclosed, and the collagen gel thus prepared exhibits high adhesion to living tissue. It is disclosed that it is useful for non-molded medical materials such as materials, closure materials, dead space fillers, and molded medical products such as blood substitutes.
  • Patent Document 1 as polyanions, hyaluronic acid, alginic acid, gum arabic, polyglutamic acid, polyacrylic acid, polyaspartic acid, polymalic acid, carboxymethylcellulose, carboxylated starch and the like are less toxic to living organisms. ! Polyon-on is disclosed!
  • Patent Documents 2 to 4 disclose copolymers of 2-methacryloyloxysethyl phosphorylcholine and methacrylic acid ester as biocompatible medical materials.
  • Patent Document 1 International Publication W098Z54224 Pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 2890316
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-6704
  • Patent Document 4 International Publication WO00Z01424 Pamphlet Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a gel useful as a medical material, a medical material such as the gel cartridge, and a medical instrument using the medical material.
  • the present invention provides the following gel, medical material and medical instrument.
  • R1 and R2 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group
  • R3 represents a carboxyl group, a carboxyl group-derived group having reactivity with an amino group or a hydroxyl group, or the following formula ( II):
  • R4, R5, and R6 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group, a diazo-um group, or an aryl group, and x: y is 0.1: 0.9-9-0 9: 0. 1, m and n represent an integer of 1 or more. ]
  • a gel having a cross-linked collagen comprising a plurality of collagen molecules cross-linked by a cross-linking group having a repeating unit represented by
  • a medical instrument having a part or member made of the medical material according to (4).
  • cross-linking group (I) By adjusting the degree of cross-linking of collagen molecules by a cross-linking group having a repeating unit represented by the formula (I) (hereinafter referred to as “cross-linking group (I)”) or a cross-linking group (I )
  • the gel of the present invention has one or more desired functions (for example, mechanical strength (tensile strength), Swelling degree (flexibility), morphology, biodegradability (degradation resistance to collagenase), shrinkage temperature (moisture retention and dimensional stability), cell adhesion or non-adhesion, blood coagulation activity or blood anticoagulation activity, etc. ) Is given. Therefore, the gel of the present invention is useful as a medical material.
  • R1 and R2 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group
  • examples of the alkyl group represented by R1 or R2 include a methyl group, an ethyl group, an npropyl group, an isopropyl group
  • Examples include linear or branched alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms such as n- butyl, isobutyl, s-butyl, t- butyl, n -pentyl, isopentyl, t-pentyl, and neopentyl.
  • alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms such as a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an isopropyl group are preferable.
  • R3 represents a reactivity with a carboxyl group, an amino group or a hydroxyl group. It represents a derivative group of a carboxyl group or a group represented by the formula (II).
  • a part or all of R3 is a group represented by the formula (II), a carboxyl group, a carboxyl group-derived group having reactivity with an amino group or a hydroxyl group, and a group of the formula (II)
  • the mole fraction with the group represented by) is usually 0: 100 to 99: 1, preferably 10:90 to 90:10, more preferably 60:40 to 40:60.
  • carboxyl group-derived group having reactivity with an amino group or a hydroxyl group examples include, for example, the following formula (III):
  • R7 represents a hydrogen atom, an alkyl group or an acyl group.
  • the alkyl group represented by R7 is, for example, a linear or branched chain having 1 to 3 carbon atoms such as a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an isopropyl group.
  • the isyl group represented by R7 include, for example, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, a propiol group, a ptylyl group, an isoptylyl group, a bivaloyl group, and the like.
  • the acyl group represented by R7 may have a substituent such as a carboxyl group or a hydroxyl group.
  • * represents a binding site with a collagen molecule.
  • the group represented by the formula (II) is generated by the bond between a carboxyl group or a derivative group thereof and the amino group or hydroxyl group of the collagen molecule, and the bonding site between the group represented by the formula (II) and the collagen molecule is It has a structure of —CO—NH— or —CO—O—.
  • R 4, R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group, diazo -Represents um group or aryl group.
  • the alkyl group represented by R4, R5 or R6 include a methyl group, an ethyl group, an n propyl group, an isopropyl group, an n butyl group, an isobutyl group, an s butyl group, a t butyl group, an n pentyl group, Forces including linear or branched alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms such as isopentyl group, t pentyl group and neopentyl group Among these, alkyl having 1 to 2 carbon atoms such as methyl group and ethyl group Groups are preferred.
  • aryl groups represented by R4, R5, or R6 include a phenyl group, a p-methoxyphenyl group, a 3,5-dimethoxyphenyl group, a p-chlorophenol group, and a p-fluorophenol.
  • Substituted, unsubstituted aromatic hydrocarbon groups such as thiol group, 3,5 dimethylphenyl group, 2,4,6 trimethylphenyl group, naphthyl group; furyl group, phenyl group, pyridyl group, pyrrolyl group, oxazolyl group
  • substituted or unsubstituted aromatic heterocyclic groups such as an isoxazolyl group, thiazolyl group, isothiazolyl group, imidazolyl group, pyrazolyl group, pyrimidinyl group, pyridazinyl group, bilaridyl group, quinolyl group, and isoquinolyl group.
  • X and y are mole fractions of the respective polymerized units, and is usually 0.1.
  • 0.9-9.9 0.1, preferably 0.3: 0.7-7.0.9: 0.1.
  • m and n are forces representing an integer of 1 or more m is usually 2 to 10, preferably 2 to 6, more preferably 2 to 4, and n is usually 2 to 10 , Preferably an integer of 2-6, more preferably an integer of 2-4. This is because the yield decreases as m and n increase.
  • a cross-linked collagen obtained by cross-linking a plurality of collagen molecules with a cross-linking group having a repeating unit represented by the formula (I) (hereinafter referred to as “cross-linking group (I)”!), Collagen
  • the type of molecule is not particularly limited as long as it can form a gel support structure.
  • the types of collagen molecules include, for example, type I collagen, type II collagen, atelocollagen, acylated collagen, esterified collagen, type IV collagen, thiolated collagen, fish collagen, synthetic collagen, etc.
  • Type I collagen, type II collagen and the like are preferable.
  • Most of the soft tissue consists of type collagen, and most of the cartilage consists of type II collagen, which is used for disease treatment.
  • the gel of the present invention can be suitably used as a medical material.
  • Cross-linked collagen may have only one type of collagen molecular force, or may have two or more types of collagen molecular force, but may consist of only one type of collagen molecule. And prefer to be. Since the number of amine groups and carboxyl groups required for the reaction can be calculated, it is a force that facilitates reaction control and physical property control of the product.
  • the solvent retained in the gel of the present invention is usually water.
  • the gel of the present invention hide mouth gel
  • the water retained in the gel may contain salts, minerals, amino acids, vitamins, proteins, organic solvents (for example, alcohols, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide) and the like.
  • the gel of the present invention is, for example, a 2 morpholinoethanesulfonic acid aqueous solution, a phosphate buffered saline, an aqueous solution such as Tris buffer, or distilled water, and the following formula (IV):
  • polymer (IV) A polymer having a repeating unit represented by the following formula (hereinafter referred to as “polymer (IV)”) is converted to a carboximide (for example, 1-ethyl 3- (3 dimethylaminopropyl) 1-ethyl carbo Diimide hydrochloride (EDC), 1-4-butanediol-diglycidyl ether (BDGE) After the reaction, it can be obtained by reacting with a plurality of collagen molecules.
  • a carboximide for example, 1-ethyl 3- (3 dimethylaminopropyl) 1-ethyl carbo Diimide hydrochloride (EDC), 1-4-butanediol-diglycidyl ether (BDGE)
  • the carboxyl group or derivative group of the polymer (IV) reacts with the succinimides after reacting with the carpositimides, then reacts with the succinimides, and then the amino group (within the same molecule) of the collagen molecule.
  • the polymer (IV) and the collagen molecule bind to each other via —CO—NH—.
  • the polymer (IV) binds to a plurality of collagen molecules to form a crosslinked collagen composed of a plurality of collagen molecules crosslinked by the crosslinking group (I), thereby forming a hyde mouth having the crosslinked collagen as a support structure.
  • a gel is formed.
  • the pH of the aqueous solution that is a reaction solvent is usually 7.0 to 11.0 (alkaline conditions) or 2.0 to 5.0.
  • pH condition preferably 8.5 to 9.5 (alkali condition) or 4.5 to 5.0 (acid condition).
  • acid condition preferably 8.5 to 9.5 (alkali condition) or 4.5 to 5.0 (acid condition).
  • pH of the reaction solvent aqueous solution By adjusting the pH of the reaction solvent aqueous solution, the mechanical strength (tensile strength), swelling degree (flexibility), morphology, co-biodegradability (degradation resistance to collagenase), shrinkage temperature of the gel formed (Moisture retention and dimensional stability) can be adjusted.
  • the reaction temperature is usually 4 to 37 ° C, preferably 4 to 8 ° C
  • the reaction time is usually 30 to 960. Minutes, preferably 60 to 240 minutes
  • the loading amount of the carbodiimides is usually 0.5 to 10 molar equivalents, preferably 4 to 7 molar equivalents relative to the polymer (IV).
  • the amount of soot is usually 1.5 to 10 molar equivalents, preferably 2 to 7 molar equivalents relative to the polymer (IV).
  • the reaction temperature is usually 4 to 37 ° C, preferably 4 to 8 ° C
  • the reaction time is Usually, it is 30 to 960 minutes, preferably 60 to 240 minutes
  • the collagen concentration in the aqueous solution is usually 0.3 to 5% by mass, preferably 0.5 to 1% by mass.
  • the polymer (IV) has the following formula (V):
  • reaction solvent for example, methanol, ethanol, propanol, t-butanol, benzene, toluene, dimethylformamide, tetrahydrofuran, chloroform, etc.
  • polymerization initiator for example, 2,2'-azobisisobutyl nitrile (AIBN), azobis maleeno-tolyl and other aliphatic azo compounds; benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, ammonium persulfate, potassium persulfate and other organic peroxides Can be used.
  • x: y is usually 0.1: 0.9 to 0.9: 0.1, preferably 0.2: 0.8 to 0.9: 0.1, more preferably 0.3: 0.7 to 0.7: 0.3. , Amount of added calories Control reaction temperature, reaction time, etc.
  • the molecular weight of the polymer (IV) is usually 10,000 to 700,000, preferably ⁇ 10,000 to 500,000, more preferably ⁇ 100,000 to 300,000. When the molecular weight of the polymer (IV) is in the above range, the polymer (IV) has a molecular weight equivalent to that of collagen and sufficient reactive groups, and can crosslink between the collagen molecules.
  • the monomer (V) include 2-methacryloyloxychetylphosphorylcholine (a compound in which Rl, R4, R5 and R6 are methyl groups, and m and n are 2 in the formula (V)). This monomer is commercially available.
  • the plurality of collagen molecules Before reacting the calpositimides or the polymer (IV) reacted with the calpositimides and succinimide with the plurality of collagen molecules, the plurality of collagen molecules may be cross-linked in advance.
  • the mechanical strength tensile strength
  • swelling degree flexibility
  • morphology morphology
  • biodegradability degradation resistance against collagenase
  • Shrinkage temperature moisture retention and dimensional stability
  • Crosslinking of a plurality of collagen molecules can be carried out using a known crosslinking agent such as formalin and dartalaldehyde.
  • a known crosslinking agent such as formalin and dartalaldehyde.
  • the carboxyl group of the collagen molecule carboxyl group in the same molecule or carboxyl group of a different molecule
  • an amino group amino group in the same molecule or amino group of different molecules
  • a plurality of collagen molecules are cross-linked via CO—NH or CO—O by reacting with (hydroxyl groups in the same molecule or hydroxyl groups of different molecules).
  • Such cross-linking is carried out by, for example, carpoimides (for example, 1-ethyl 3- (3 dimethylaminopropyl) 1 Of tilcarbodiimide hydrochloride (EDC), 1-4-butanediol diglycidyl ether (BDGE)), or carpositimides and succinimides (eg, N-hydroxysuccinimide (NHS), N-hydroxysunolephone succinimide (NHSS)) It can be obtained by reacting a plurality of collagen molecules in the presence.
  • carpoimides for example, 1-ethyl 3- (3 dimethylaminopropyl) 1 Of tilcarbodiimide hydrochloride (EDC), 1-4-butanediol diglycidyl ether (BDGE)
  • carpositimides and succinimides eg, N-hydroxysuccinimide (NHS), N-hydroxysunolephone succinimide (NHSS)
  • the pH of the aqueous solution as the reaction solvent is usually 7.0 to 10.0 (alkaline conditions) or 2.0 to 5.0.
  • a gel by reacting a carpositimide or a polymer (IV) reacted with a carpositimide and a succinimide with a plurality of collagen molecules, and then crosslink the carboxyl groups of the gel.
  • the gel thus obtained has a high-density network and is highly stable in water.
  • the carboxyl groups to be crosslinked may be the carboxyl groups of the collagen molecule, or the carboxyl group of the collagen molecule and the carboxyl group of the crosslinking group (I).
  • Cross-linking of carboxyl groups can be performed, for example, using a cross-linking agent having a plurality of functional groups having reactivity with carboxyl groups.
  • the functional group having reactivity with a carboxyl group include an amine group and an epoxide group.
  • the cross-linking agent having a plurality of functional groups having reactivity with a carboxyl group include 1-ethyl-3- (3 dimethylaminopropyl) -1-ethylcarbodiimide hydrochloride, polyamine, and 1,4 butanediol diene.
  • a glycidyl ether etc. are mentioned.
  • polyamines include collagen, glutamine, lysine, and dartal aldehyde.
  • the reaction temperature is usually 0 to 60 ° C, preferably 0 to 37 ° C
  • the reaction time is usually 1 to 168 hours. It is preferably 1 to 48 hours
  • pH is usually 1 to 14, preferably 3 to 10
  • examples of the reaction solvent include distilled water, MES buffer, phosphorus buffer, Tris buffer, Disodum tetraborate decahydrate buffer or the like can be used!
  • the reaction temperature is usually 0 to 60 ° C, preferably 0 to 40 ° C, and the reaction time is usually 1 to 168 hours, preferably 1 to 48 hours, pH is usually 1 to 14, preferably 3 to 10.
  • Reaction solvents include, for example, distilled water, MES buffer, phosphorus buffer, Tris buffer, disodium tetraborate Japanese (disodum tetraborate decahydrate) buffer can be used.
  • a gel imparted with a desired functionality can be produced by adjusting the degree of crosslinking of collagen molecules by the crosslinking group (I).
  • the cross-linking group (I) by adjusting the degree of cross-linking of the collagen molecule by the cross-linking group (I), the balance between collagen cell adhesion and cell non-adhesion of the cross-linking group (I) can be adjusted.
  • the cross-linking group (I) it is possible to produce a gel imparted with cell adhesion or non-cell adhesion.
  • the cross-linking group (I) by adjusting the degree of cross-linking of the collagen molecule by the cross-linking group (I), the balance between the blood coagulation property of collagen and the blood anticoagulant activity of the cross-linking group (I) can be adjusted.
  • a gel to which a desired blood coagulation activity or blood anticoagulant activity is imparted can be produced. It is known that 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine has blood anticoagulant activity (Y. Iwasaki. Et al., J. Biomed. Mater. Res. Vol. 36, pp.508-5 15 ( 1997)).
  • cross-linking group (I) By adjusting the degree of cross-linking of the collagen molecule by the cross-linking group (I), desired mechanical strength (tensile strength), degree of swelling (flexibility), morphology, surface characteristics (hydrophilicity, hydrophobicity) , Gels with biodegradability (degradation resistance to collagenase), shrinkage temperature (moisture retention and dimensional stability) (for example, gels with high mechanical strength and sufficient flexibility) Can be manufactured.
  • the gel of the present invention can be suitably used as a medical material.
  • the medical material can be used as a medical instrument material, for example.
  • the entire medical device may be composed of the gel of the present invention, or the part or member thereof may be composed of the gel of the present invention.
  • medical devices include artificial blood vessels, anti-adhesion membranes, wound dressings, vascular catheters, force-eura, monitoring tubes, artificial kidneys, cardiopulmonary, extracorporeal circulation blood circuits, artificial kidney AV shunts, artificial Blood vessel, artificial heart, artificial heart valve, temporary blood bypass tube, blood circuit for artificial dialysis, stent, blood bag, disposable circuit for blood component separation device, dialysis membrane, artificial liver, nanoparticle coating material, Examples include a nano sensor coating material.
  • the entire artificial blood vessel may be formed by the gel of the present invention!
  • the gage of the present invention It may be covered with ⁇ .
  • Collagen Type I collagen (manufactured by Koken)
  • a 0.5 mass% aqueous solution (pH 3) was heated in an incubator to prepare a collagen film.
  • a collagen gel (EZN-ac gel) was prepared in the same manner as described above using an MES aqueous solution (pH was adjusted by dropwise addition of hydrochloric acid) having an acidic condition (pH 4.5).
  • Each collagen gel is rinsed in Na HPO aqueous solution for 2 hours and washed with distilled water for 3 days
  • PMA12 a 5 mg, MES aqueous solution (pH 4. 5 or 10) in 8 mL, it was allowed to react for 10 minutes at EDC (6 X 10- 5 mol ZmL ) / NHS (6 X 10 "5 mol / mL) and 4 ° C Then, prepare EZN-ac gel (50 mg) or EZN-al gel (50 mg), react at 4 ° C for 4 hours, and use MiC-acac gel (EZN-ac gel as PMA-immobilized collagen gel).
  • MiC acal gel (EZN-ac gel cross-linked at pHIO), MiC-alac gel (EZN-al gel cross-linked at pH 4.5), MiC-alal gel (hereinafter simply "MiC gel") (Also) (EZN-al gel was cross-linked with pHIO).
  • Each collagen gel is rinsed in Na HPO aqueous solution for 2 hours and washed with distilled water for 3 days
  • MiC gel Re-immobilize the same PMA on MiC-alal gel (MiC gel) as above, A highly prevalent MdC gel was obtained.
  • the amount of PMA and cross-linking agent reacted with EZN-al gel was doubled to prepare MiCII gel.
  • the same PMA immobilization as described above was performed on the MiCII gel to prepare an MdCII gel.
  • Table 1 summarizes the various collagen gels prepared as described above.
  • the surface was analyzed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) with a photoelectron emission angle of 90 °. Then, using a scanning electron microscope (SEM, SM-200, Topeon, Tokyo, Japan), the surfaces and fracture surfaces of various collagen gels were observed. The results are shown in Figure 1. Although not shown, the MiC-acac gel and MiC-alal gel were transparent.
  • the shrinkage temperature of various collagen gels was measured with a differential scanning calorimeter (DSC6000, Seiko Electronics, Japan). The temperature was increased from 20 ° C to 150 ° C at a rate of 5 ° CZ, and the shrinkage temperatures (Ts (° C)) of various collagen gels were measured. The results are shown in Table 2.
  • the shrinkage temperatures of MiC-acac gel, MiC-alcal gel, MiC-alal gel, MiC-alac gel, M dC gel and MdC II gel are Uc-gel, E / N- Higher than ac gel and E / N-toggle.
  • the contraction temperatures of MiC-alal gel, MiC-alac gel, MdC gel and MdC II gel were significantly higher than those of Uc-gel, E / N-ac gel and E / N-al gel. From this, it became clear that the gel shrinkage temperature can be increased by immobilizing PMA on the collagen gel, that is, the moisture retention and dimensional stability of the gel can be improved.
  • the bow I tension strength of various collagen gels was measured with an I tension strength tester (STA-1150, manufactured by Orientec Corp.). That is, various collagen gel fragments (4 cm ⁇ 1 cm) were prepared and pulled at a speed of 0.5 mmZ seconds, and a stress / strain curve and tensile strength were calculated. The stress'strain curve is shown in Figure 2, and the tensile strength is shown in Table 3.
  • the degree of swelling of various collagen gels was measured as follows.
  • the lyophilized sample was cut into 10 mg, placed in 3 mL of phosphate buffer (pH 7.4), and allowed to stand at 37 ° C for 24 hours. Thereafter, the weight of the swollen sample was measured, and the degree of swelling (Swelling ratio (%)) was calculated.
  • the degree of swelling was calculated by the following formula.
  • W represents the weight of the swollen sample
  • w represents the weight of the freeze-dried sample.
  • the swelling degree of MiC-acac gel, MiC-acal gel, MiC-alal gel, MiC-alac gel, MiC II gel, MdC gel and MdC II gel all exceeded 100%. It was revealed that it has a sufficient degree of swelling (flexibility). In other words, it was clarified that the tensile strength (mechanical strength) of the gel can be increased by maintaining the sufficient degree of swelling (flexibility) of the gel by immobilizing PMA on the collagen gel.
  • Lyophilized collagen gel was placed in 2 mL of 0.1 M Tris—HC1 buffer (pH 7.4) containing 5 X 10 " 3 M calcium chloride and 8 X 10" 4 M sodium azide and stabilized for 1 hour. . Then, the weight of the gel was measured and returned to the Tris-HC1 buffer. After that, collagenase (collagenase activity: 300 unitsZ mg) (EC3. 4. 24. 3) was dissolved in Tris—HC1 buffer containing gel at a concentration of 1.32 mgZmL, 0. 1M Tris—HCl buffer (pH 7). 4) 2 mL was added to adjust the total concentration of collagenase to 100 units / mL. Collagenase was activated at 37 ° C, the change in the weight of the collagen gel from 1 to 72 hours was measured, and the degradation rate of the collagen gel by collagenase was calculated. The results are shown in Fig. 4.
  • EDC 1-Ethyl 3- (3 dimethylaminopropyl) 1-carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide acid
  • the collagen film has a pH of 9.0
  • a non-crosslinked collagen gel (Uc gel) was prepared by soaking in MES buffer for 1 day and used as a control gel together with an E / N gel.
  • PMA having a 2-methacryloyloxychetyl phosphorylcholine (MPC) unit was used to crosslink with collagen.
  • the activated PMA was reacted with collagen film or EZN gel at 4 ° C for 48 hours to prepare PMA-activated collagen gel (MPC immobilized collagen gel; MiC gel). This gel is Na HPO
  • Figure 5 shows the transparency of Uc gel and MiC gel.
  • Fig. 5 (a) shows a state where blue light is applied
  • Fig. 5 (b) shows a state observed in a bright place
  • A shows a Uc gel
  • B shows a MiC gel.
  • MiC gel cross-linked collagen gel
  • Uc gel uncrosslinked gel
  • white white
  • MiC gel crosslinked gel
  • the static contact angle was measured using a goometer. Water droplets were formed on the surface of the sample with a BiHnont syringe, and the contact angle was measured.
  • the photoelectron emission angle was set to 90 °, and the surface molecular states of various collagen gels were examined.
  • Figure 6 shows the measurement results of the contact angle.
  • A represents a Uc gel
  • B represents an EN gel
  • C represents a MiC gel
  • D represents a glutaraldehyde crosslinked gel.
  • Protein adsorption experiments were performed using fibrinogen plasma. Samples were placed in fibrinogen plasma (lmg ZmL) and incubated at 37 ° C for 3 hours. After washing with PBS, all proteins were peeled off using 1% sodium dodecyl sulfate (SDS). The peeled protein was collected, and the adsorbed protein concentration was measured with a Micro BCA kit (wavelength 750 nm).
  • Fibrinogen plasma is a protein in the blood that is activated on the surface of the material when it comes into contact with the surface of the material to help adhere platelets and cells.
  • the phospholipid polymer is immobilized, the adsorption of fibrinogen plasma can be prevented and the adhesion of platelets and cells can be suppressed.
  • L-929 cells (mouse fibroblasts) were used to examine the adhesion properties between the collagen gel and the cells.
  • L-929 cells were cultured in Eagle's Minimum Essential Medium (E-MEM). After treatment with 0.25% trypsin, the cell density is 5X10 3 cells / dis adjusted to h and seeded on the surface of the collagen gel. After 24 or 48 hours, lactate dehydrogenase analysis (LDH; wavelength 560 nm) was used to count the number of cells attached to the surface of the gel. The morphology of the attached cells was observed using a scanning electron microscope (SEM). Cells attached to the sample were washed with PBS and fixed with 2.5% dartalaldehyde. The sample was dehydrated and dried in vacuum. All dried samples were sterilized and observed with a scanning electron microscope. The result is shown in FIG.
  • E-MEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • the Uc gel that adsorbed about 16,000 cells in 48 hours compared to about 4,500 E ZN gels and about 2,000 cells MiC and MdC gels. Adsorbed. Inhibition of cell adsorption is due to the phospholipid group of PMA. That is, the phospholipid group arranged outside the gel surface has a function of preventing interaction with the protein. By fixing PMA, the surface of the collagen gel is hydrophilized, which makes it difficult to adsorb cells. In the case of Uc gel and EN gel, the adherent cells had a strong interaction with the surface of the gel, so the morphology of the adhered cells was flat (Fig. 11). On the other hand, in the case of MiC, MdC and MtC gels, the morphology of the contacted cells was round. This indicates that the interaction between the PMA surface and the cells is weak, and it is considered that the cells cannot proliferate.
  • Toxicity experiments were carried out using a 3- (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) kit.
  • L929 cells (5, OOOcells / well) were seeded on the sample and cultured for 48 hours. Thereafter, the sample was washed thoroughly with PBS, 200 ⁇ L of MTT solution (0.5 mg / mL in medium, filter-sterilized) was added to the sample, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 4 hours. Then, MTT was discarded, and blue formazan was dissolved in 100 ⁇ L of dimethyl sulfoxide and added to the sample. Toxicity was examined using a Micro BCA kit (wavelength 570 nm). The number of cells adhered to TCPS (Tissue culture polystyrene) was set to 100% for comparison.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • BDDGE reacts with carboxyl groups under acidic conditions and reacts with amine groups under alkaline conditions. Therefore, we cross-linked BDDG E to non-internally crosslinked phospholipid polymer / collagen noble gel under acidic conditions, and performed phospholipid polymer, collagen fiber cross-linking and collagen fiber cross-linking, the strongest, high and stable. A new type of high-density network gel gel was prepared. Using this gel, the difference between microfiber crosslinks and collagen fiber crosslinks was examined.
  • PMA having a 2-methacryloyloxychetyl phosphorylcholine (MPC) unit was used to crosslink with collagen.
  • EDC EDCZNHS
  • the activated PMA was reacted with collagen film and EZN gel at 4 ° C for 48 hours to prepare PMA-activated collagen gel (MPC immobilized collagen gel (without intrahelical cross-links); MiC-0 gnole). This. Wash this gel with Na HPO aqueous solution for 2 hours and immediately with distilled water to remove unreacted substances.
  • MiC-0 gel In order to produce a collagen gel with a more dense network by cross-linking the carboxyl groups of MiC-0 gel, it was added to MES buffer (pH 4.5) containing BDDGE. MiC-0 gel was put and reacted at 25 ° C for 5 days. Thereafter, the gel was washed with water 4 times for 30 minutes V, and a MiC-OZdiol gel (high-density network gel) having cross-linking between carboxyl groups was prepared.
  • the structural formula of the high-density network gel is shown in FIG.
  • the dried sample (high-density network gel) was placed in distilled water, the change in weight was measured, and the degree of swelling was calculated. Each sample was placed in 25 ° C or 37 ° C distilled water and left for 24 hours. Thereafter, the swollen gel was weighed by lightly wiping water, and the water content was calculated. The moisture content (%) was calculated based on the following formula.
  • Moisture content (%) (W -W) / W X 100
  • W is the weight of the dried sample and W is the weight of the swollen sample.
  • FIG. Fig. 14 (a) shows the results for water content
  • Fig. 14 (b) shows the results for erosion rate.
  • the moisture content of the collagen gel decreased with crosslinking.
  • MiC-O Zdiol gel had the lowest water content compared to MiC-0 gel. Converting the water content into the degree of expansion, it was as strong as about 70%. Compared with EZN gel, the water content was very low. This indicates that the cross-linking between carboxyl groups is powerful and forms a dense structure. In the end, this gel has a high stability in water. As a result of comparing the moisture content at 25 ° C and 37 ° C, there was no change other than the Uc gel. This is thought to be a force that maintains the stable network structure by suppressing the swelling of the collagen gel and a preventing the denaturation of the one-helix structure with water.
  • the erosion rate of the high-density network gel was about 2% or less compared to the Uc gel in which an erosion rate of about 30% was observed. Compared with other gels, the erosion rate was very low. This indicates that this gel forms a dense network with very high stability. That is, it is considered that the collagen fiber bridge can form a more stable collagen gel than the microfiber crosslink.
  • FIG. 1 is a diagram showing the observation results of the surfaces and fracture surfaces of various collagen gels.
  • FIG. 2 is a diagram showing stress / strain curves of various collagen gels.
  • FIG. 3 is a diagram showing measurement results of the degree of swelling of various collagen gels.
  • FIG. 4 is a graph showing the degradation rate of various collagen gels by collagenase.
  • FIG. 5 is a diagram showing the transparency of Uc gel (A) and MiC gel (B), (a) shows a state where blue light is applied, and (b) shows a state observed in a bright place.
  • FIG. 6 is a diagram showing a measurement result of a contact angle.
  • FIG. 7 is a diagram showing a measurement result of X-ray photoelectron spectroscopy (XPS).
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of a shrinkage experiment, where A is a Uc gel, B is an EN gel, C is a MiC gel, and D is a dartalaldehyde crosslinked gel.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of a protein adsorption experiment.
  • FIG. 10 shows the results of cell adhesion experiments.
  • FIG. 11 is a view showing the morphology of cells adhered to the surface of a gel.
  • FIG. 12 shows the results of toxicity experiments.
  • FIG. 13 is a view showing the structure of a MiC—OZdiol gel (high-density network gel) having a crosslink between carboxyl groups.
  • FIG. 14 (a) shows the measurement results of moisture content, and (b) shows the measurement results of erosion rate.

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Description

明 細 書
ゲル及び該ゲルカ なる医療用材料
技術分野
[0001] 本発明は、ゲル、該ゲルからなる医療用材料及び該医療用材料を利用した医療用 器具に関する。
背景技術
[0002] コラーゲンは動物の真皮、腱、骨、筋膜等に豊富に含まれる生分解性の生体由来 材料であり、コラーゲンゲル (コラーゲンハイド口ゲル）は医療用材料として有用である 。コラーゲンゲルを調製する際、コラーゲン分子間の架橋化が必要となる力 グルタ ルアルデヒド等の化学架橋剤を用いてコラーゲン分子間の架橋化を行うと、コラーゲ ンの重要な性質である生体適合性 (生体親和性)が著しく損なわれる。
[0003] このような問題を解決することができる技術として、特許文献 1には、ポリア-オンが 有するカルボキシル基と、コラーゲン分子が有するアミノ基又は水酸基とを、カルポジ イミドを用いてアミド結合又はエステル結合させることによりコラーゲン分子間の架橋 化を行い、コラーゲンゲルを調製する方法が開示されており、こうして調製されたコラ 一ゲンゲルは、生体組織と高い接着性を示すので、生体接着剤、止血材、閉鎖材、 死腔充填材等の非成形医療用材料や、代用血管等の成形医療用として有用である ことが開示されている。特許文献 1には、ポリア二オンとして、ヒアルロン酸、アルギン 酸、アラビアゴム、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリリンゴ酸 、カルボキシメチルセルロース、カルボキシル化デンプン等の生体に対して毒性の少 な!ヽポリア-オンが開示されて!ヽる。
[0004] 一方、特許文献 2〜4には、生体適合性の医療用材料として、 2—メタクリロイルォキ シェチルホスホリルコリンとメタクリル酸エステル等との共重合体が開示されている。 特許文献 1：国際公開 W098Z54224号パンフレット
特許文献 2：特許第 2890316号公報
特許文献 3：特開 2005— 6704号公報
特許文献 4:国際公開 WO00Z01424号パンフレット 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、医療用材料として有用なゲル、該ゲルカゝらなる医療用材料、及び該医 療用材料を利用した医療用器具を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 上記目的を達成するために、本発明は、以下のゲル、医療用材料及び医療用器具 を提供する。
(1)次式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000005_0001
[式（I)中、 R1及び R2は互いに独立して水素原子又はアルキル基を表し、 R3はカル ボキシル基、又はアミノ基若しくは水酸基との反応性を有するカルボキシル基の誘導 基、又は次式 (II) :
[化 2]
C = 0 (I I)
* [式 (II)中、 *はコラーゲン分子との結合部位を表す。]
で表される基を表し、 R4、 R5及び R6は互いに独立して水素原子、アルキル基、ジァ ゾ-ゥム基又はァリール基を表し、 x :yは 0. 1 : 0. 9〜0. 9 : 0. 1であり、 m及び nは 1 以上の整数を表す。 ]
で表される繰り返し単位を有する架橋基によって架橋された複数のコラーゲン分子か らなる架橋コラーゲンを支持構造として有するゲル。
(2)前記（1)記載のゲルが有するカルボキシル基同士を架橋して得られるゲル。
(3)前記カルボキシル基同士を 1, 4-ブタンジオールジグリシジルエーテルで架橋し て得られる前記（2)記載のゲル
(4)前記（1)又は（2)記載のゲル力もなる医療用材料。
(5)前記 (4)記載の医療用材料からなる部分又は部材を有する医療用器具。
発明の効果
[0007] 式 (I)で表される繰り返し単位を有する架橋基 (以下「架橋基 (I)」と 、う。 )によるコラ 一ゲン分子の架橋度を調節することにより、又は架橋基 (I)によってコラーゲン分子を 架橋する際の反応溶媒 (水溶液)の pHを調節することにより、本発明のゲルには、 1 種又は 2種以上の所望の機能 (例えば、機械的強度 (引張強度)、膨潤度 (柔軟性)、 形態、生分解性 (コラゲナーゼに対する分解耐性)、収縮温度 (水分保持性及び寸 法安定性)、細胞接着性又は細胞非接着性、血液凝固活性又は血液抗凝固活性等 )が付与される。したがって、本発明のゲルは医療用材料として有用である。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 以下、本発明について詳細に説明する。
式（I)において、 R1及び R2は互いに独立して水素原子又はアルキル基を表し、 R 1又は R2で表されるアルキル基としては、例えば、メチル基、ェチル基、 n プロピル 基、イソプロピル基、 n ブチル基、イソブチル基、 s ブチル基、 t ブチル基、 n— ペンチル基、イソペンチル基、 t ペンチル基、ネオペンチル基等の炭素数 1〜5の 直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられる力 これらのうち、メチル基、ェチル 基、 n—プロピル基、イソプロピル基等の炭素数 1〜3のアルキル基が好ましい。
[0009] 式 (I)にお 、て、 R3はカルボキシル基、又はアミノ基若しくは水酸基との反応性を 有するカルボキシル基の誘導基、又は式 (II)で表される基を表す。式 (I)において、 R3の一部又は全部が式 (II)で表される基であり、カルボキシル基又はアミノ基若しく は水酸基との反応性を有するカルボキシル基の誘導基と、式 (II)で表される基とのモ ル分率は通常 0 : 100〜99： 1、好ましくは 10 : 90〜90： 10、さらに好ましくは 60 :40 〜40： 60である。
[0010] アミノ基又は水酸基との反応性を有するカルボキシル基の誘導基としては、例えば 、次式 (III) :
[化 3]
C = 0 (I I I) O—— R7
[式 (m)中、 R7は水素原子、アルキル基又はァシル基を表す。 ]
で表される基が挙げられる。
[0011] 式（III)において、 R7で表されるアルキル基としては、例えば、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基等の炭素数 1〜3の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル 基が挙げられ、 R7で表されるァシル基としては、例えば、ァセチル基、トリフルォロア セチル基、プロピオ-ル基、プチリル基、イソプチリル基、ビバロイル基等の炭素数 1
〜5の脂肪族ァシル基；ベンゾィル基、 3, 5—ジメチルベンゾィル基、 2, 4, 6—トリメ チルベンゾィル基、 2, 6—ジメトキシベンゾィル基、 2, 4, 6—トリメトキシベンゾィル 基、 2, 6—ジイソプロポキシベンゾィル基、ナフチルカルボ-ル基、アントリルカルボ -ル基等の芳香族ァシル基が挙げられる。 R7で表されるァシル基は、カルボキシル 基、水酸基等の置換基を有していてもよい。
[0012] 式 (II)にお 、て、 *はコラーゲン分子との結合部位を表す。式 (II)で表される基は、 カルボキシル基又はその誘導基と、コラーゲン分子のアミノ基又は水酸基との結合に より生じ、式 (II)で表される基とコラーゲン分子との結合部位は— CO— NH—又は— CO— O—という構造をとつている。
[0013] 式（I)において、 R4、 R5及び R6は互いに独立して水素原子、アルキル基、ジァゾ -ゥム基又はァリール基を表す。 R4、 R5又は R6で表されるアルキル基としては、例 えば、メチル基、ェチル基、 n プロピル基、イソプロピル基、 n ブチル基、イソブチ ル基、 s ブチル基、 t ブチル基、 n ペンチル基、イソペンチル基、 t ペンチル基 、ネオペンチル基等の炭素数 1〜5の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられ る力 これらのうち、メチル基、ェチル基等の炭素数 1〜2のアルキル基が好ましい。 炭素数の大きいアルキル基である場合、疎水性が高まることにより、疎水性相互作用 が増加し、ゲルの吸水性又は保水性が減じて、ゲルの生体適合性又は機械的強度 が低下するおそれがあるからである。 R4、 R5又は R6で表されるァリール基としては、 例えば、フエ-ル基、 p—メトキシフエ-ル基、 3, 5—ジメトキシフエ-ル基、 p クロ口 フエ-ル基、 p—フルオロフェ-ル基、 3, 5 ジメチルフエ-ル基、 2, 4, 6 トリメチ ルフヱニル基、ナフチル基等の置換又は非置換の芳香族炭化水素基;フリル基、チ ェニル基、ピリジル基、ピロリル基、ォキサゾリル基、イソォキサゾリル基、チアゾリル 基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、 ビラリジ-ル基、キノリル基、イソキノリル基等の置換又は非置換の芳香族複素環基 が挙げられる。
[0014] 式（I)において、 X及び yはそれぞれの重合単位のモル分率であり、 は通常0. 1
: 0. 9〜0. 9 : 0. 1、好ましくは 0. 3 : 0. 7〜0. 9 : 0. 1である。
[0015] 式（I)において、 m及び nは 1以上の整数を表す力 mは通常 2〜10、好ましくは 2 〜6、さらに好ましくは 2〜4の整数を表し、 nは通常 2〜10、好ましくは 2〜6、さらに 好ましくは 2〜4の整数を表す。 m及び nが大きくなると収率が低下するからである。
[0016] 式 (I)で表される繰り返し単位を有する架橋基 (以下「架橋基 (I)」と!、う。 )によって 複数のコラーゲン分子が架橋されてなる架橋コラーゲンにお 、て、コラーゲン分子の 種類は、ゲルの支持構造を形成し得る限り特に限定されるものではない。コラーゲン 分子の種類としては、例えば、 I型コラーゲン、 II型コラーゲン、ァテロコラーゲン、ァ シル化コラーゲン、エステル化コラーゲン、 IV型コラーゲン、チオール化コラーゲン、 魚コラーゲン、合成コラーゲン等が挙げられる力 これらのうち、 I型コラーゲン、 II型 コラーゲン等が好ましい。軟組織の大部分力 型コラーゲンから、軟骨の大部分が II 型コラーゲンからなり、それぞれ疾病治療に用いられているので、 I型コラーゲン又は II型コラーゲンを使用する場合、本発明のゲルを医療用材料として好適に使用する ことができる。
[0017] また、架橋コラーゲンは、 1種類のみのコラーゲン分子力もなつて 、てもよ 、し、 2種 類以上のコラーゲン分子力 なって 、てもよ 、が、 1種類のみのコラーゲン分子から なって 、ることが好ま 、。反応に必要なアミン基及びカルボキシル基の数が計算で きるため、反応コントロール及び生成物の物性コントロールが容易となる力 である。
[0018] 本発明のゲルに保持される溶媒は通常、水である。ゲルに保持される溶媒が水で ある場合、本発明のゲル (ハイド口ゲル)を医療用材料として好適に使用することがで きる。ゲルに保持される水には、塩、ミネラル、アミノ酸、ビタミン、タンパク質、有機溶 媒（例えば、アルコール類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド）等が含まれ ていてもよい。
[0019] 本発明のゲルは、例えば、 2 モルホリノエタンスルホン酸水溶液、リン酸緩衝生理 食塩水、トリス緩衝液等の水溶液又は蒸留水中で、次式 (IV)：
[化 4]
R1 R2
( IV)
Figure imgf000009_0001
O"
[式（IV)中、 Rl、 R2、 R4、 R5、 R6、 R7、 x、 y、 m及び nは前記と同義である。 ] で表される繰り返し単位を有するポリマー（以下「ポリマー（IV)」と 、う。）を、カルポジ イミド類（例えば、 1 ェチル 3— (3 ジメチルァミノプロピル) 1 ェチルカルボ ジイミド塩酸塩 (EDC)、 1—4—ブタンジオール—ジグリシジルエーテル（BDGE) )、 又はカルポジイミド類及びスクシンイミド類 (例えば、 N—ヒドロキシスクシンイミド (NH S)、 N—ヒドロキシスルホンスクシンイミド (NHSS) )と反応させた後、複数のコラーゲ ン分子と反応させることにより得ることができる。ポリマー（IV)が有するカルボキシル 基又はその誘導基は、カルポジイミド類と反応した後、スクシンイミド類が存在する場 合には、スクシンイミド類と反応し、次いで、コラーゲン分子が有するアミノ基（同一分 子内のアミノ基又は異なる分子のアミノ基）と反応し、ポリマー（IV)とコラーゲン分子と がー CO— NH—を介して結合する。ポリマー（IV)が複数のコラーゲン分子と結合す ることにより、架橋基 (I)によって架橋された複数のコラーゲン分子からなる架橋コラ 一ゲンが形成され、これにより架橋コラーゲンを支持構造として有するハイド口ゲルが 形成される。
[0020] 反応溶媒である水溶液の pHは、通常 7. 0-11. 0 (アルカリ条件）又は 2. 0〜5. 0
(酸性条件）、好ましくは 8. 5〜9. 5 (アルカリ条件)又は 4. 5〜5. 0 (酸性条件)であ る。反応溶媒である水溶液の pHを調節することにより、形成されるゲルの機械的強 度 (引張強度)、膨潤度 (柔軟性)、形態、コ生分解性 (コラゲナーゼに対する分解耐 性)、収縮温度 (水分保持性及び寸法安定性)等を調節することができる。
[0021] ポリマー（IV)と、カルポジイミド類又はカルポジイミド類及びスクシンイミド類との反 応において、反応温度は通常 4〜37°C、好ましくは 4〜8°Cであり、反応時間は通常 30〜960分、好ましくは 60〜240分であり、カルボジイミド類の添力卩量はポリマー（IV )に対して通常 0. 5〜 10モル当量、好ましくは 4〜7モル当量であり、スクシンイミド類 の添力卩量はポリマー（IV)に対して通常 1. 5〜10モル当量、好ましくは 2〜7モル当 量である。
[0022] カルポジイミド類又はカルポジイミド類及びスクシンイミド類と反応したポリマー（IV) と、コラーゲン分子との反応において、反応温度は通常 4〜37°C、好ましくは 4〜8°C であり、反応時間は通常 30〜960分、好ましくは 60〜240分であり、水溶液中のコラ 一ゲン濃度は、通常 0. 3〜5質量％、好ましくは 0. 5〜1質量％である。
[0023] ポリマー（IV)は、次式 (V)：
[化 5] R
b
Figure imgf000011_0001
[式 (V)中、 Rl、 R4、 R5、 R6、 m及び nは前記と同義である。 ]
で表されるモノマーと、次式 (VI)：
[化 6]
Figure imgf000011_0002
c=o
O—— R7
[式 (VI)中、 R2及び R7は前記と同義である。 ]
で表されるモノマーとを常法に従って共重合させることにより得ることができる。この反 応において、反応溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、 t- ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロ口ホル ム等を使用することができ、重合開始剤としては、例えば、 2,2'—ァゾビスイソプチ口 二トリル (AIBN)、ァゾビスマレノ-トリル等の脂肪族ァゾ化合物；過酸化べンゾィル、 過酸化ラウロイル、過硫酸アンモニゥム、過硫酸カリウム等の有機過酸ィ匕物等を使用 することができる。
ポリマー（IV)を製造するにあたり、 x:yが通常 0.1:0.9〜0.9:0.1、好ましくは 0 .2:0.8〜0.9:0. 1、さらに好ましくは 0.3:0.7〜0.7:0.3となるように、添カロ量 、反応温度、反応時間等を制御する。ポリマー（IV)の分子量は、通常 10, 000〜70 0, 000、好まし <は 10, 000〜500, 000、さらに好まし <は 100, 000〜300, 000 である。ポリマー（IV)の分子量が上記範囲にある場合、ポリマー（IV)がコラーゲンと 同等の分子量及び十分な反応基を有し、コラーゲン分子間を架橋することができる。
[0025] モノマー（V)の具体例としては、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン（式（ V)において、 Rl、 R4、 R5及び R6がメチル基であり、 m及び nが 2である化合物）が 挙げられ、このモノマーは市販されている。
[0026] カルポジイミド類又はカルポジイミド類及びスクシンイミド類と反応したポリマー（IV) と、複数のコラーゲン分子とを反応させる前に、予め、複数のコラーゲン分子を架橋し ておいてもよい。複数のコラーゲン分子を予め架橋しておくことにより、最終的に形成 されるゲルの機械的強度 (引張強度)、膨潤度 (柔軟性)、形態、生分解性 (コラゲナ ーゼに対する分解耐性)、収縮温度 (水分保持性及び寸法安定性)等を調節すること ができる。
[0027] 複数のコラーゲン分子の架橋化は例えばホルマリン、ダルタルアルデヒド等の公知 の架橋剤を使用して行うことができるが、本発明のゲルを医療用材料として使用する 場合、生体適合性、透明性、機械的特性等の点から、コラーゲン分子のカルボキシ ル基（同一分子内のカルボキシル基又は異なる分子のカルボキシル基）とァミノ基 ( 同一分子内のアミノ基又は異なる分子のアミノ基)又は水酸基（同一分子内の水酸基 又は異なる分子の水酸基）とを反応させ、複数のコラーゲン分子を CO— NH 又 は CO— O を介して架橋化することが好ましい。このような架橋化は、例えば、 2 モルホリノエタンスルホン酸水溶液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液等の水 溶液又は蒸留水中、カルポジイミド類 (例えば、 1ーェチルー 3— (3 ジメチルァミノ プロピル) 1 ェチルカルボジイミド塩酸塩（EDC) , 1 -4-ブタンジオール ジグ リシジルエーテル (BDGE) )、又はカルポジイミド類及びスクシンイミド類 (例えば、 N ーヒドロキシスクシンイミド（NHS)、 N ヒドロキシスノレホンスクシンイミド（NHSS) )の 存在下、複数のコラーゲン分子を反応させることにより得ることができる。
[0028] 反応溶媒である水溶液の pHは、通常 7. 0-10. 0 (アルカリ条件）又は 2. 0〜5. 0
(酸性条件）、好ましくは 8. 5〜9. 5 (アルカリ条件)又は 4. 5〜5. 0 (酸性条件)であ る。反応溶媒である水溶液の pHを調節することにより、最終的に形成されるゲルの機 械的強度 (引張強度)、膨潤度 (柔軟性)、形態、生分解性 (コラゲナーゼに対する分 解耐性)、収縮温度 (水分保持性及び寸法安定性)等を調節することができる。
[0029] カルポジイミド類又はカルポジイミド類及びスクシンイミド類と反応したポリマー（IV) と、複数のコラーゲン分子とを反応させてゲルを調製した後、当該ゲルが有するカル ボキシル基同士を架橋することが好ましい。こうして得られるゲルは、高密度ネットヮ ークを有しており、水中における安定性が高い。
架橋させるカルボキシル基同士は、コラーゲン分子が有するカルボキシル基同士 であってもよいし、コラーゲン分子が有するカルボキシル基と架橋基 (I)が有するカル ボキシル基であってもよ 、。
[0030] カルボキシル基同士の架橋は、例えば、カルボキシル基との反応性を有する官能 基を複数個有する架橋剤を用いて行うことができる。カルボキシル基との反応性を有 する官能基としては、例えば、アミン基、エポキシド基等が挙げられる。カルボキシル 基との反応性を有する官能基を複数個有する架橋剤としては、例えば、 1 ェチル - 3 - (3 ジメチルァミノプロピル）— 1—ェチルカルボジイミド塩酸塩、ポリアミン、 1 , 4 ブタンジオールジグリシジルエーテル等が挙げられる。ポリアミンとしては、例え ば、コラーゲン、グルタミン、リシン、ダルタルアルデヒド等が挙げられる。
[0031] 1, 4 ブタンジオールジグリシジルエーテルを用いてカルボキシル基同士を架橋 する場合、反応温度は通常 0〜60°C、好ましくは 0〜37°Cであり、反応時間は通常 1 〜168時間であり、好ましくは 1〜48時間であり、 pHは通常 1〜14、好ましくは 3〜1 0であり、反応溶媒としては、例えば、蒸留水、 MES緩衝液、リン緩衝液、 Tris緩衝 液、テトラホウ酸ジナトリウム十水和物（disodum tetraborate decahydrate)緩衝液等を 用!/、ることができる。
[0032] また、ポリアミンを用いてカルボキシル基同士を架橋する場合、、反応温度は通常 0 〜60°C、好ましくは 0〜40°Cであり、反応時間は通常 1〜168時間であり、好ましくは 1〜48時間であい、 pHは通常 1〜14、好ましくは 3〜10であり、反応溶媒としては、 例えば、蒸留水、 MES緩衝液、リン緩衝液、 Tris緩衝液、テトラホウ酸ジナトリウム十 水和物 (disodum tetraborate decahydrate)緩衝 を用いることができる。 [0033] 本発明のゲルを製造する際、架橋基 (I)によるコラーゲン分子の架橋度を調節する ことにより、所望の機能性が付与されたゲルを製造することができる。
例えば、架橋基 (I)によるコラーゲン分子の架橋度を調節することにより、コラーゲン の細胞接着性と、架橋基 (I)の細胞非接着性とのバランスを調節することができ、これ により、所望の細胞接着性又は細胞非接着性が付与されたゲルを製造することがで きる。
[0034] また、架橋基 (I)によるコラーゲン分子の架橋度を調節することにより、コラーゲンの 血液凝固性と、架橋基 (I)の血液抗凝固活性とのバランスを調節することができ、これ により、所望の血液凝固活性又は血液抗凝固活性が付与されたゲルを製造すること ができる。なお、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンが血液抗凝固活性を 有することは公知である（Y. Iwasaki.et al.， J. Biomed. Mater. Res. Vol. 36, pp.508- 5 15 (1997))。
[0035] また、架橋基 (I)によるコラーゲン分子の架橋度を調節することにより、所望の機械 的強度 (引張強度)、膨潤度 (柔軟性)、形態、表面特性 (親水性、疎水性)、生分解 性 (コラゲナーゼに対する分解耐性)、収縮温度 (水分保持性及び寸法安定性)等が 付与されたゲル (例えば、機械的強度が大きぐしかも十分な柔軟性を有しているゲ ル)を製造することができる。
[0036] 従って、本発明のゲルは、医療用材料として好適に使用することができる。医療用 材料は、例えば、医療用器具材料として使用することができる。医療用器具の全体が 本発明のゲルで構成されて 、てもよ 、し、その部分又は部材が本発明のゲルで構成 されていてもよい。医療器具としては、例えば、人工血管、癒着防止膜、創傷被覆材 、血管カテーテル、力-ユーラ、モニタリングチューブ、人工腎臓、人工心肺、体外循 環用血液回路、人工腎臓用 A— Vシャント、人工血管、人工心臓、人工心臓弁、血 液の一時的バイパスチューブ、人工透析用血液回路、ステント、血液バッグ、血液成 分分離装置のデイスポーザブル回路、透析膜、人工肝臓、ナノ粒子被覆材、ノィォ センサー被覆材等が挙げられる。
[0037] 例えば、本発明のゲルを人工血管用材料として使用する場合、本発明のゲルによ り人工血管の全体を形成してもよ!/、し、生体内の血管の内側又は外側を本発明のゲ ルで被覆してもよ ヽ。生体内の血管の内側又は外側を本発明のゲルで被覆すること により、血管への細胞浸潤を抑制することができ、これにより組織過増殖の抑制又は 組織再生促進を図ることができる。
実施例
〔実施例 1〕各種コラーゲンゲルの調製
1.ポリ（MPC— co—メタクリル酸）（PMA)の合成
2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン（MPC) 0. Olmol及びメタクリル酸 0 . 024molをエタノール 15mLに溶かし、重合開始剤として a , α '―ァゾビスイソブチ 口-トリル (AIBN) l . 2mmolを加えた後、 60°Cで 16時間反応させることにより重合 を行った。反応混合溶液をジェチルエーテルに投じて重合物を沈殿させ、これを濾 別し、ァセトニトリルで洗浄した後、減圧乾燥し、次式 (VII)で表されるポリ（MPC— co ーメタクリル酸）（PMA)を得た (収率 80%)。
[化 7]
(VII)
Figure imgf000015_0001
得られた PMAの分子量をゲル濾過クロマトグラフィー（GPC) (標準物貧:ポリェチ レンオキサイド）により測定した結果、数平均分子量は約 300, 000であった。また、 得られた PMAにおける MPC残基及びメタクリル酸残基のモル分率をプロトン核磁気 共鳴装置（1H— NMR)により測定した結果、 x= 3、 y= 7であった。 [0040] 2.コラーゲンゲルの調製
(l) EDCZNHS架橋ゲル（EZN— acゲル， EZN— alゲル）の調製
コラーゲン (タイプ Iコラーゲン (高研製) ) 0. 5質量％水溶液 (pH3)をインキュベー ター中で加温することにより、コラーゲンフィルムを調製した。コラーゲンフィルム 0. 0 5gを 1 ェチル 3— (3 ジメチルァミノプロピル) 1 ェチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC) 6 X 10— 5mol/mL及び N ヒドロキシスクシンイミド（NHS) 6 X 10— 5mol/m Lを含有する 2—モルホリノエタンスルホン酸（MES)水溶液 (pHIO) (pHは水酸化 ナトリウム滴下により調整） 8mL中に浸漬し、 4°Cで 4時間反応させることにより（COO H： EDC： NHS = 1 : 5 : 5)、コラーゲン分子が有するカルボキシル基とアミノ基とを結 合させ、複数のコラーゲン分子が CO— NH を介して架橋されて 、るコラーゲン ゲル（EZN— alゲル）を得た。
[0041] また、 pHが酸性条件 (pH4. 5)である MES水溶液 (pHは塩酸滴下により調整）を 用いて、上記と同様にコラーゲンゲル (EZN— acゲル)を調製した。
各コラーゲンゲルは、 Na HPO水溶液中で 2時間リンスし、蒸留水にて 3日間洗浄
2 4
した。
[0042] (2) PMA固定化ゲル（MiC— acacゲル， MiC— acalゲル， MiC— alacゲル， MiC alalゲル）の調製
PMA12. 5mgを、 MES水溶液（pH4. 5又は 10) 8mL中で、 EDC (6 X 10— 5mol ZmL) /NHS (6 X 10"5mol/mL)と 4°Cで 10分間反応させた。その後、 EZN— a cゲル（50mg)又は EZN— alゲル（50mg)をカ卩え、 4°Cで 4時間反応させ、 PMA固 定化コラーゲンゲルとして、 MiC— acacゲル（EZN— acゲルをpH4. 5で架橋）、 M iC acalゲル（EZN— acゲルを pHIOで架橋）、 MiC— alacゲル（EZN— alゲル を pH4. 5で架橋）、 MiC— alalゲル（以下単に「MiCゲル」ともいう）（EZN— alゲル を pHIOで架橋)を調製した。
各コラーゲンゲルは、 Na HPO水溶液中で 2時間リンスし、蒸留水にて 3日間洗浄
2 4
した。
[0043] (3) PMA多重固定化ゲル（MiCIIゲル， MdCゲル， MdCIIゲル）の調製
MiC— alalゲル（MiCゲル）に上記と同様の PMA固定化を再度行い、 PMAの含 有率の高い MdCゲルを得た。また、 PMAの架橋量を増加させるために、 EZN— al ゲルと反応させる PMA及び架橋剤の量を 2倍に増加させ、 MiCIIゲルを調製した。 MiCIIゲルに上記と同様の PMA固定化を行 、、 MdCIIゲルを調製した。
以上のように調製された各種コラーゲンゲルを表 1に要約する。
[0044] [表 1]
Figure imgf000017_0001
[0045] 〔実施例 2〕コラーゲンゲルの物性評価
1.コラーゲンゲルの表面分析
サンプルを凍結乾燥した後、表面を X線光電子分光解析法 (XPS)により光電子の 放出角度を 90° にして分析した。そして、走査電子顕微鏡（SEM, SM- 200, To peon, Tokyo, Japan)を使用して各種コラーゲンゲルの表面と破断表面を観察した 。結果を図 1に示す。なお、図示はしないが、 MiC-acacゲル及び MiC-alalゲルは透 明であった。
[0046] 2.コラーゲンゲルのネットワーク解析
(1)収縮温度
各種コラーゲンゲルの収縮温度を示差走査熱量計 (DSC6000,セイコー電子、 Ja pan)で測定した。 20°Cから 150°Cまで 5°CZ分の速度で温度を上げ、各種コラーゲ ンゲルの収縮温度 (Ts (°C) )を測定した。結果を表 2に示す。
[0047] [表 2] サンプル Ts (V)
Uc -ゲル 56.4±8.1
E/N- acゲル 67.5±0.9
E/N- alゲル 73.5±2.9
MiC - acacゲル 74.1±3.9
MiC- acalゲル 75.1±2.0
MiC- alalゲル 84.1±3.9
MiC- a lacゲル 84.8±2.0
MiC IIゲル 85.4±2.8
MdCゲル 84.9±1.8
MdC 11ゲル 83.9±4.0
(n=3)
[0048] 表 2に示すように、 MiC - acacゲル、 MiC- acalゲル、 MiC- alalゲル、 MiC- alacゲル、 M dCゲル及び MdC IIゲルの収縮温度は、 Uc-ゲル、 E/N- acゲル及び E/N-トグルよりも 高かった。特に、 MiC- alalゲル、 MiC- alacゲル、 MdCゲル及び MdC IIゲルの収縮温 度は、 Uc-ゲル、 E/N-acゲル及び E/N-alゲルよりも顕著に高かった。このことから、コ ラーゲンゲルへの PMA固定化により、ゲルの収縮温度を高められること、すなわち、 ゲルの水分保持性及び寸法安定性を高められることが明ら力となった。また、コラー ゲンゲルへの PMA固定ィ匕の際の pH条件（アルカリ条件又は酸性条件）を調節する ことにより、又は PMAによる架橋度を調節することにより、又は EDCZNHS架橋ゲ ルの調製時の pH条件 (アルカリ条件又は酸性条件）を調節することにより、ゲルの水 分保持性及び寸法安定性を調節できることが明らかとなった。
[0049] (2)引張強度
各種コラーゲンゲルの弓 I張強度を I張強度試験機 (STA- 1150,オリエンテック 社製)で測定した。すなわち、各種コラーゲンゲル断片（4cm X 1cm)を作製し、 0.5 mmZ秒の速度で引っ張り、応力 ·歪み曲線及び引張強度を算出した。応力'歪み 曲線を図 2に示し、引張強度を表 3に示す。
[0050] [表 3] サンプル Low strain modulus (MPa) High strain modulus (MPa)
Uc -ゲル 0.4±0.1 0.6±0.1
E/N- alゲル 2.1±0.1 2.9±0.2
MiC - alalゲル 5.1±0.6 8.0±1.0
MdCゲル 7.6±1.1 16.7±3.6
(n=3-5)
[0051] 表 3に示すように、 MiC-alalゲル及び MdCゲルの引張強度は、 Uc-ゲル及び E/N - al ゲルよりも高かった。このこと力ら、コラーゲンゲルへの PMA固定化により、ゲルの引 張強度 (機械的強度)を高められることが明らかとなった。また、 PMAによる架橋度を 調節することにより、ゲルの引張強度 (機械的強度)を調節できることが明らかとなつ た。
[0052] (3)膨潤度
各種コラーゲンゲルの膨潤度の測定は、次のようにして行った。凍結乾燥したサン プルを lOmgに切断し、 3mLのリン酸緩衝液（pH7.4)の中に入れ、 37°Cで 24時間 で放置した。その後、膨潤したサンプルの重量を測定し、膨潤度（Swelling ratio (%) )を算出した。膨潤度は次式にて算出した。
[0053] 膨潤度（％) = (W -W)/W X 100
h d h
なお、 wは膨潤したサンプル重量、 wは凍結乾燥したサンプル重量を表す。 ま h d
た、上記と同様にして、酸性水溶液 (pH2.1)中での膨潤度を測定した。
[0054] 結果を図 3に示す。
図 3に示すように、 MiC- acacゲル、 MiC- acalゲル、 MiC- alalゲル、 MiC- alacゲル、 M iC IIゲル、 MdCゲル及び MdC IIゲルの膨潤度はいずれも 100%を越えており、十分 な膨潤度 (柔軟性)を有していることが明らかとなった。すなわち、コラーゲンゲルへ の PMA固定化により、ゲルの十分な膨潤度 (柔軟性)を保持したまま、ゲルの引張強 度 (機械的強度）を高めることができることが明らかとなった。また、コラーゲンゲルへ の PMA固定ィ匕の際の pH条件 (アルカリ条件又は酸性条件）を調節することにより、 又は PMAによる架橋度を調節することにより、又は EDC/NHS架橋ゲルの調製時 の PH条件（アルカリ条件又は酸性条件）を調節することにより、ゲルの膨潤度（柔軟 性)を調節できることが明らかとなった。また、ゲルの膨潤度は pHに応答して変化す ることが明ら力となった。
[0055] (4)コラーゲンゲルの生分解性評価
凍結乾燥したコラーゲンゲルを 5 X 10"3M塩化カルシウム及び 8 X 10"4Mアジ化 ナトリウムを含有する 0. 1M Tris—HC1緩衝液 (pH7. 4)2mLに入れ、 1時間安定 化させた。そして、そのゲルの重さを測定し、 Tris— HC1緩衝液に戻した。その後、ゲ ルを含有する Tris— HC1緩衝液に、コラゲナーゼ（コラゲナーゼ活性： 300unitsZ mg) (EC3. 4. 24. 3)を 1. 32mgZmLの濃度で溶かした 0. lM Tris—HCl緩衝 液 (pH7. 4) 2mLを添加し、コラゲナーゼの全体濃度を 100units/mLに調節した 。 37°Cでコラゲナーゼを活性ィ匕し、 1時間から 72時間までのコラーゲンゲルの重量 の変化を測定し、コラゲナーゼによるコラーゲンゲルの分解率を計算した。結果を図 4に示す。
[0056] 図 4に示すように、コラーゲンゲルへの PMA固定化により、ゲルのコラゲナーゼ分 解耐性を高められることが明ら力となった。コラーゲンゲルへの PMA固定ィ匕の際の p H条件 (アルカリ条件又は酸性条件)を調節することにより、又は PMAによる架橋度 を調節することにより、又は EDCZNHS架橋ゲルの調製時の pH条件 (アルカリ条件 又は酸性条件)を調節することにより、ゲルのコラゲナーゼ分解耐性 (生分解性)を調 節できることが明ら力となった。
[0057] 〔実施例 3〕コラーゲンゲルの物性評価
(1)各種コラーゲンゲルの調製
実施例 1に準じて各種コラーゲンゲルを調製した。
架橋剤として 1 ェチル 3— (3 ジメチルァミノプロピル) 1 カルボジイミド塩 酸 (EDC)と N ヒドロキシスシ-ルイミド酸 (NHS)を使用した。まず、 EDC及び NH Sでコラーゲンフィルムを架橋し、 EDCZNHSコラーゲンゲル（EZNゲル）を作製し た。 MES緩衝液（C H NO S -H O ;0. O5mol, pH9. 0) 20mLに EDC及び NH
6 13 4 2
Sを溶かした後、コラーゲンフィルムを入れ、 4°Cで 4時間反応させた (EDC :NHS : C OOH = 5 : 5 : l) oその後、 EZNゲルを Na HPO水溶液で 2時間洗浄し、すぐ蒸留
2 4
水で洗浄して、未反応物質及び塩を除去した。また、コラーゲンフィルムを pH9. 0の MES緩衝液に 1日漬け、架橋されていないコラーゲンゲル (Ucゲル)を作製し、 E/ Nゲルとともに対照ゲルとして使用した。
[0058] 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン（MPC)ユニットを有する PMAを使 用し、コラーゲンとの架橋を行った。 PMAをコラーゲンゲルに固定ィ匕するため、まず PMAを MES緩衝液（pH9. 0)中で EDC及び NHSと 10分間反応させ（EDC :NH S： COOH = 5 : 5 : 1)、 PMAのカルボキシル基を活性化した。その活性化 PMAをコ ラーゲンフィルム又は EZNゲルと 4°Cで 48時間反応させ、 PMA—活性化コラーゲ ンゲル（MPC immobilized collagen gel； MiCゲル）を作製した。このゲルを Na HPO
2 4 水溶液で 2時間洗浄し、すぐ蒸留水で洗浄して未反応物質と塩を除去した。最後に、 コラーゲンゲルに含まれている MPCの分率の上昇させるため、 EDC及び NHSで活 性化させた PMAを MiCゲルと反応させ、 PMA—二重活性化コラーゲンゲル（MPC double immobilized collagen gel； MdCゲル）を作製した。このゲルも Na HPO水溶
2 4 液で 2時間洗浄し、すぐ蒸留水で洗浄して未反応物質と塩を除去した。すべてのコラ 一ゲンゲルは凍結乾燥して保存した。また、もっとも MPCの分率が高いリン質'コラ 一ゲンノヽイブリツドゲルを作製するため、 MdCゲルに、活性ィ匕した PMAを反応させ、 PMA—三重活性化コラーゲンゲル（MPC triple immobilized collagen gel;MtCゲル )を作製した。
[0059] (2)各種コラーゲンゲルの生物学的特性
(a)透明性
Ucゲル及び MiCゲルの透明性を図 5に示す。なお、図 5 (a)はブルーライトを当て た状態を示し、図 5 (b)は明るい場所で観察した状態を示し、 Aは Ucゲル、 Bは MiC ゲルを示す。
図 5に示すように、 MiCゲル (架橋されたコラーゲンゲル）は高い透明性を有する。 また、ブルーライトを当てた Ucゲル (架橋されていないゲル）は青色を反射し、白く見 える（若干青色）が、ブルーライトを当てた MiCゲル (架橋されたゲル）は、透明だった
[0060] (b)表面分析
接触角及び X線光電子分光法（X- ray photoelectron spectroscopy ;XPS)により、 各種コラーゲンゲルの表面分析を行った。各種コラーゲンゲルの接触角については
、ゴ-ォメーターを用いて静的接触角を測定した。 BiHnont注射器で試料の表面に 水滴を形成させ、その接触角を測定した。また、 XPSについては、光電子の放出角 を 90° にし、各種コラーゲンゲルの表面分子状態を調べた。
接触角の測定結果を図 6に示す。
図 6に示すように、リン脂質ポリマー（PMA)の固定が進むとともに接触角が低下す ることが確認された。コラーゲンゲル表面の親水化はタンパク質の吸着と細胞の接着 を抑制する因子の一つである。リン脂質ポリマーの固定ィ匕は、コラーゲンゲル表面を 親水化した。また、再架橋による接触角の低下が観察された。これは、リン脂質ポリマ 一で再架橋すると緻密なポリマー層が形成され、表面がより親水化されるからである と考えられる。そして、表面の親水化によって、タンパク質の吸着と細胞の接着が抑 制されることが期待される。
[0061] XPSの結果を図 7に示す。
図 7に示すように、 PMAで架橋したコラーゲンのみリンピークが検出された。これに より、コラーゲンゲル層の外部に PMA層が生成されていることが確認された。即ち、 PMAがコラーゲン層の中に入り込まずに、コラーゲン層の表面全体に固定ィ匕される ことにより、細胞及び生物的活性を抑制するリン脂質基がゲルの表面に存在し、これ によりゲルの表面特性が変化したことが示された。
[0062] (c)収縮実験
各種コラーゲンゲルを 80°Cで 3時間最小必須培地 (MEM)中で放置した後、各種 コラーゲンゲルの体積を測定し、放置前の体積と比較して、収縮した体積を算出した 結果を図 8に示す。なお、図 8中、 Aは Ucゲル、 Bは ENゲル、 Cは MiCゲル、 Dは グルタルアルデヒド架橋ゲルを示す。
図 8に示すように、 80°Cで 3時間各コラーゲンゲルを放置した結果、架橋されてい ないコラーゲンゲルの場合、温度上昇とともに収縮し、最終的に解けることが確認さ れた。架橋されたゲルの場合、収縮が抑えられることが確認された。架橋されていな い場合、収縮率は約 67%であり、 PMAで架橋されたゲルの場合、収縮率は約 7〜8 %であった (表 4)。このことは、リン脂質ポリマー Zコラーゲンノヽイブリツドゲルの場合 、リン脂質ポリマー (PMA)とコラーゲン繊維間架橋により、コラーゲンの収縮を防ぐこ とが可能であることを意味する。
[表 4]
Gel type Shrinkage temperature (°C) Shrink volume (¾)
Uc gel 56±8 67
EN gel 76±3 41
MiC-1 gel 84±4 7.3
MdC-1 gel 85±2 7.8
Glutaraldehyde
77 48
cross - 1 inked gel
[0064] (d)タンパク質吸着実験
タンパク質吸着実験はフイブリノゲン血漿を使って行った。フイブリノゲン血漿（lmg ZmL)に試料を入れ、 37°Cで 3時間培養した。その後、 PBSで洗浄し、 1 ％ドデ シル硫酸ナトリウム（SDS)を使ってタンパク質を全部剥がした。剥がしたタンパク質を 回収し、 Micro BCAキット (波長 750nm)で吸着タンパク質濃度を測定した。
結果を図 9に示す。
図 9に示すように、架橋されたコラーゲンゲルは、架橋されていないコラーゲン及び 内部架橋ゲル (ENゲル）に比べ、タンパク質吸着量が減ることが確認された。フイブリ ノゲン血漿は血液に含まれているタンパク質で、血液が材料表面と接触した時、表面 で活性化されて血小板及び細胞の接着を助ける。しカゝしながら、リン脂質ポリマーを 固定した場合、フイブリノゲン血漿の吸着を防ぐことができ、血小板及び細胞の接着 を抑制することが可能である。
[0065] (e)細胞接着実験
L— 929細胞 (マウス繊維雅細胞）を使用して、コラーゲンゲルと細胞との間の接着 特性を調べた。 L— 929細胞を Eagle's Minimum Essential Medium (最小必須培地； E— MEM)で培養した。 0.25%トリプシンで処理後、細胞の密度を 5X103cells/dis hに調整し、コラーゲンゲルの表面に播いた。 24時間又は 48時間後、乳酸脱水素酵 素分析 (LDH ;波長 560nm)を使い、ゲルの表面に接着した細胞の数を数えた。接 着した細胞の形態は走査電子顕微鏡 (SEM)を使用して観察した。試料に接着した 細胞を PBSで洗浄し、 2. 5%ダルタルアルデヒドで固定した。そして、試料を脱水化 し、真空で乾燥した。乾燥した試料はすべて滅菌し、走査電子顕微鏡で観察した。 結果を図 10に示す。
図 10に示すように、 48時間で約 16, 000個の細胞が吸着された Ucゲルに対し、 E ZNゲルは約 4, 500個、 MiCゲル及び MdCゲルは約 2, 000個の細胞が吸着され た。細胞の吸着抑制は、 PMAのリン脂質基による。すなわち、ゲル表面の外側に並 んであるリン脂質基がタンパク質との相互作用を防ぐ機能がある。そして、 PMAを固 定ィ匕することによってコラーゲンゲルの表面は親水化され、細胞の吸着が難しくなる と考えられる。 Ucゲルと ENゲルの場合、接着した細胞はゲルの表面と強い相互作 用を起こすため、接着した細胞の形態は扁平ィ匕した（図 11)。一方、 MiC、 MdC及 び MtCゲルの場合、接触した細胞の形態は丸だった。これは PMA表面と細胞との 間の相互作用が弱いことを示しており、細胞は増殖できないと考えられる。
(f)毒性実験
毒性実験は 3- (4,5- dimethylthiazolyl)- 2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT)キ ットを使って行った。 L929細胞（5, OOOcells/well)を試料に播き、 48時間培養した。 その後、 PBSで試料をよく洗い、 MTT溶液 200 μ L· (0.5 mg/mL in medium, filter- st erilized)を試料に加え 37°Cで 4時間放置した。そして、 MTTを捨て、ブルーフオルマ ザンを 100 μ Lのジメチルスルホキシドに溶かし、試料に添カ卩した。 Micro BCA kit ( 波長 570nm)を使い、毒性を調べた。 TCPS (Tissue culture polystyrene)に接着し た細胞の数を 100%に設定し、比較した。
結果を図 12に示す。
図 12に示すように、各種コラーゲンゲルに接着して 、る細胞は殆ど生きて 、ること が分かった。組織 SHAPE ¥* MERGEFORMAT培養用ポリスチレン（TCPS)を基 準として生きている細胞の割合を調べた結果、 TCPSとあまり変わらないことが分かつ た。このことは、接着細胞の数の減少は毒性ではなぐコラーゲンゲル表面と細胞と の間の弱い相互作用による細胞接着抑制特性に起因することを示している。
[0067] 〔実施例 4〕コラーゲン繊維間架橋とコラーゲン繊維 Zポリマー架橋による高密度ネッ トワークゲルの作製
EDC及び NHSを利用したコラーゲンとポリマーの架橋は、反応後、架橋剤が残ら ない長点があることから汎用されている。しかしながら、 EDC及び NHSとポリマーとの 反応率は低いため、我々はポリマー再固定化 (再架橋）を行い、ポリマーの架橋率を 高めることに成功した。このシステムの場合、コラーゲンの内部架橋は微小繊維間架 橋によるものの、コラーゲン繊維間架橋は存在しない。微小繊維間架橋とコラーゲン 繊維間架橋の役割はあまり知られて 、な ヽので、内部架橋の明確な役割に関して調 ベる必要がある。そこで、我々は、 1,4—ブタンジオールジグリシジルエーテル（BDD GE)を使い、その問題点の解決に望んだ。 BDDGEは酸性の条件ではカルボキシ ル基と反応し、アルカリ性の条件ではァミン基と反応する特徴を持っている。そこで、 我々は内部架橋されていないリン脂質ポリマー/コラーゲンノヽイブリツドゲルに BDDG Eを酸性条件で架橋し、リン脂質ポリマーとコラーゲン繊維架橋、コラーゲン繊維間架 橋を行 、、もっとも強くて高 、安定性を持つ新し 、タイプの高密度ネットワークゲルド ゲルを作製した。このゲルを使用し、微小繊維間架橋とコラーゲン繊維間架橋の差 異を調べた。
[0068] (1)コラーゲンゲルの作製
2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン（MPC)ユニットを有する PMAを使 用し、コラーゲンとの架橋を行った。 PMAをコラーゲンゲルに固定ィ匕するため、まず PMAを EDCZNHSと 10分間 MES緩衝液で反応させ（EDC： NHS： COOH = 5： 5 : 1)、 PMAのカルボキシル基を活性化した。その活性化 PMAをコラーゲンフィル ム及び EZNゲルと 4°Cで 48時間反応させ、 PMA—活性化コラーゲンゲル [MPC im mobilized collagen gel (without intrahelical cross-links)； MiC— 0グノレ]を作製し 7こ。 このゲルを Na HPO水溶液で 2時間洗浄し、すぐ蒸留水で洗浄して未反応物質と
2 4
塩を除去した。
MiC— 0ゲルが有するカルボキシル基同士を架橋し、もっと緻密なネットワークを有 するコラーゲンゲルを作製するため、 BDDGEを含有する MES緩衝液 (pH4. 5)に MiC— 0ゲルを入れ、 25°Cで 5日間反応させた。その後、ゲルを水で 30分間 4回洗 V、、カルボキシル基間架橋を有する MiC— OZdiolゲル（高密度ネットワークゲル）を 作製した。高密度ネットワークゲルの構造式を図 13に示す。
[0069] (2)含水率
乾燥した試料 (高密度ネットワークゲル)を蒸留水の中に入れて重さの変化を測定 し、膨潤度を計算した。各試料を 25°C又は 37°Cの蒸留水中に入れ、 24時間放置し た。その後、水を軽く拭いて膨潤したゲルの重さを量り、含水率を計算した。含水率（ %)は以下の式に基づき算出した。
含水率（％) = (W -W ) /W X 100
h d h
なお、 Wは乾燥した試料の重さ、 Wは膨潤した試料の重さである。
d h
また、含水率実験の前の試料の重さと実験後の乾燥した試料の重さの変化を測定 し、コラーゲンゲルの浸食率も計算した。
[0070] 結果を図 14に示す。なお、図 14 (a)は含水率に関する結果であり、図 14 (b)は浸 食率に関する結果である。
図 14 (a)に示すように、コラーゲンゲルの含水率は架橋とともに低下した。 MiC— O Zdiolゲルは、 MiC— 0ゲルと比較して含水率が最も低下した。含水率を膨張度に 換算すると、約 70%にも及ばな力つた。また、 EZNゲルと比較しても、非常に含水 率が低力つた。これは、カルボキシル基間架橋が力なり緻密な構造を形成させること を示している。結局、このゲルは水の中に高い安定性を持つことを表している。 25°C 及び 37°Cにおける含水率を比べた結果、 Ucゲル以外に変化は見られな力つた。こ れは、コラーゲンゲルの膨潤を抑え、 a 一へリックス構造の水による変性を防ぐことに より、安定したネットワーク構造が維持される力 であると考えられる。
また、図 14 (b)に示すように、約 30%の浸食率が観察された Ucゲルに対し、高密 度ネットワークゲルの浸食率は約 2%以下だった。他のゲルと比べても、非常に低い 浸食率であった。このことは、このゲルが非常に安定性が高ぐ緻密なネットワークを 形成していることを示している。すなわち、微小繊維間架橋よりもコラーゲン繊維間架 橋の方が安定したコラーゲンゲルを形成できると考えられる。
図面の簡単な説明 [図 1]各種コラーゲンゲルの表面と破断表面の観察結果を示す図である。
[図 2]各種コラーゲンゲルの応力 ·歪み曲線を示す図である。
[図 3]各種コラーゲンゲルの膨潤度の測定結果を示す図である。
[図 4]コラゲナーゼによる各種コラーゲンゲルの分解率を示す図である。
[図 5]Ucゲル (A)及び MiCゲル (B)の透明性を示す図であり、 (a)はブルーライトを 当てた状態を示し、 (b)は明るい場所で観察した状態を示す。
[図 6]接触角の測定結果を示す図である。
[図 7]X線光電子分光法 (XPS)の測定結果を示す図である。
[図 8]収縮実験の結果を示す図であり、 Aは Ucゲル、 Bは ENゲル、 Cは MiCゲル、 D はダルタルアルデヒド架橋ゲルを示す。
[図 9]タンパク質吸着実験の結果を示す図である。
[図 10]細胞接着実験の結果を示す図である。
[図 11]ゲルの表面に接着した細胞の形態を示す図である。
[図 12]毒性実験の結果を示す図である。
[図 13]カルボキシル基間架橋を有する MiC— OZdiolゲル（高密度ネットワークゲル) の構造を示す図である。
[図 14] (a)は含水率の測定結果であり、 (b)は浸食率の測定結果である。

Claims

請求の範囲
次式 (I):
Figure imgf000028_0001
[式（I)中、 Rl及び R2は互いに独立して水素原子又はアルキル基を表し、 R3はカル ボキシル基、又はアミノ基若しくは水酸基との反応性を有するカルボキシル基の誘導 基、又は次式 (II):
[化 2]
C=0 (II)
*
[式 (II)中、 *はコラーゲン分子との結合部位を表す。]
で表される基を表し、 R4、 R5及び R6は互いに独立して水素原子、アルキル基、ジァ ゾ-ゥム基又はァリール基を表し、 x:yは 0. 1:0. 9〜0. 9:0. 1であり、 m及び nは 1 以上の整数を表す。 ]
で表される繰り返し単位を有する架橋基によって架橋された複数のコラーゲン分子か らなる架橋コラーゲンを支持構造として有するゲル。
請求項 1記載のゲルが有するカルボキシル基同士を架橋して得られるゲル。
[3] 前記カルボキシル基同士を 1, 4-ブタンジオールジグリシジルエーテルで架橋して 得られる請求項 2記載のゲル
[4] 請求項 1又は 2記載のゲル力 なる医療用材料。
[5] 請求項 4記載の医療用材料力 なる部分又は部材を有する医療用器具。
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