CN117730847A - 一种用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液 - Google Patents
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液。该玻璃化冷冻保护液，包含成分：乙二醇(v/v)15‑20％；Ficoll 70(w/v)10‑15％；人血白蛋白(v/v)15‑20％；人血小板裂解液(v/v)20‑25％；蔗糖0.3M；ROCK抑制剂Y‑27632 5μM。本发明无DMSO的可快速冷冻间充质干细胞的新型冻存保护剂，同时由于加了小分子化合物Y‑27632且控制冻存液的超低内毒素，能大大减小冻存对细胞的损伤及毒性，提高细胞的复苏活率以及细胞的回收率，可用于间充质干细胞的玻璃化冷冻，生产方法简洁、高效。
Description
技术领域
本发明涉及一种冷冻保护液，特别是涉及一种用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液。
背景技术
细胞治疗是指经生物工程改造或者体外扩大培养的“种子细胞”输入患者体内治疗疾病的新型医疗技术。细胞治疗主要包括免疫细胞治疗和干细胞治疗。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)属于成体干细胞，是干细胞治疗中主要使用的细胞种类之一。MSCs细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的细胞，具有来源丰富、低免疫原性、增殖能力强、多向分化能力、调节免疫等特性。以间充质干细胞为基础的细胞疗法在美容，保健，药物筛选以及组织损伤、免疫缺陷，以及糖尿病、退行性神经系统疾病、骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应(GVHD)、脊髓损伤等疑难杂症的研究治愈方面展现出了巨大的潜能。
调查表明，截止到2019年，全球范围内已经有16款干细胞相关的药物上市，2024年全球干细胞治疗的市场份额将增长至1945.6亿美元。
细胞治疗一般需要大量的优质细胞，这决定了细胞治疗的效果。临床研究表明MSCs细胞数量达到1×109个时才能有效的治疗组织损伤。而人体组织当中含有的MSCs细胞数量较少，要想获得大量的MSCs细胞则需要在体外进行连续扩增，但是这种方法不仅会增加细胞污染的可能性，更重要的是会导致细胞老化，功能退变。为了避免连续培养对MSCs细胞产生的不利影响，为细胞治疗提供数量充足、功能完好、来源一致的细胞资源，临床和基础实验研究都需要借助细胞深低温冷冻保存细胞技术。这种深低温冷冻保存细胞技术可以将细胞进行远距离的运输，确保细胞存活，避免细胞污染。细胞冻存还可以满足临床研究的一些不可预知的需求，有利于全球干细胞市场的发展。
所谓深低温冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-170℃的超低温条件)，并在此温度下长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。利用此技术可以使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停滞，而一旦恢复正常生理温度又能继续生长发育。
水在低于零度的条件下会结冰，如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先冻结，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。为了避免细胞内冰晶的损伤及溶质损伤，玻璃化冷冻技术应运而生。
玻璃化冷冻法的基本原理是将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下冻结，形成玻璃化状态，保存了液态时正常分子和离子分布，因而玻璃化对细胞具有保护作用。细胞在冷冻保护剂中脱水到一定程度后，则引起内源性胞质大分子如蛋白质及渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，从而使细胞在剧烈的快速降温中得到保护。玻璃化冷冻保护剂是冷冻及解冻过程中对细胞起保护作用的试剂，可有效减少细胞内外渗透压和细胞内外冰晶对细胞的损伤。冷冻保护剂根据是否能够穿透细胞膜，可分为渗透型和非渗透型两类。渗透型冷冻保护剂可渗透细胞膜、进入细胞内，并与细胞内水分相互置换，这类渗透性保护剂通常为一些富含羟基的小分子物质，如甘油(Gly)、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、1,2－丙二醇(PROH)等。非渗透型保护剂是一类富含羟基的大分子物质，因其不能够进入细胞而称之为非渗透性保护剂。非渗透性保护剂主耍通过改变细胞外渗透压，引起细胞脱水，从而减少细胞内冰晶的形成，发挥非特异性保护作用。常用的非渗透型冷冻保护剂包括单糖(如葡萄糖)、双糖(如海藻糖)、三糖(如棉花糖)、聚庶糖(Ficoll)、聚乙稀吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、白蛋白(Albumin)等。
目前常用的深低温冷冻保存MSCs细胞的冷冻保护剂都含有DMSO，DMSO可以渗透进入MSCs细胞，发挥冻存保护作用。但是DMSO本身具有细胞毒性，即便细胞复温后快速清除DMSO，但残留的微量DMSO依然可能导致神经毒性、心血管衰竭等多种副反应。严重影响复苏后的间充质干细胞的存活率甚至(子代)安全性以及功能表达。
目前应用于间充质干细胞深低温冷冻保存的冷冻保护剂大多含有动物源的血清，动物源血清具有成分不明确，不适用于临床大规模应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液，其为无DMSO的可快速冷冻间充质干细胞的新型冻存保护剂，同时由于加了小分子化合物Y-27632且控制冻存液的超低内毒素，能大大减小冻存对细胞的损伤及毒性，提高细胞的复苏活率及细胞的回收率，可用于间充质干细胞的玻璃化冷冻，生产方法简洁、高效。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液，包含以下成分：
乙二醇(v/v)15-20％；
Ficoll 70(w/v)10-15％；
人血白蛋白(v/v)15-20％；
人血小板裂解液(v/v)20-25％；
蔗糖0.3M；
ROCK抑制剂Y-27632 5μM。
进一步地，所述ROCK抑制剂Y-27632，抑制细胞凋亡，用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用。
进一步地，所述冷冻保护液使用高糖DMEM基础培养基补充剩余体积；所述Ficoll70及所述蔗糖均使用高糖DMEM基础培养基作为溶剂配制。
另外，本发明还公开了一种用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：高糖DMEM基础培养基中加入10-15％(w/v)Ficoll 70静置过夜溶解；
步骤二：ROCK抑制剂Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用；
步骤三：将15-20％(v/v)乙二醇、15-20％(v/v)人血白蛋白、20-25％(v/v)人血小板裂解液、0.3M蔗糖以及5μM的Y-27632按照比例混入溶解后的10％ Ficoll 70溶液中混匀用高糖DMEM基础培养基补充剩余体积。
进一步地，所述0.3M蔗糖使用高糖DMEM基础培养基作为溶剂配制。
进一步地，所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，还包括将配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用的步骤。
进一步地，所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：高糖DMEM基础培养基中加入10％(w/v)Ficoll 70静置过夜溶解；
步骤二：ROCK抑制剂Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用；
步骤三：将15％(v/v)乙二醇、15％(v/v)人血白蛋白、20％(v/v)人血小板裂解液、0.3M蔗糖以及5μM的Y-27632按照比例混入溶解后的10％(w/v)Ficoll 70溶液中混匀用高糖DMEM基础培养基补充剩余体积；
步骤四：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。
更进一步地，所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：40mL高糖DMEM基础培养基中加入10g Ficoll 70静置过夜溶解；
步骤二：ROCK抑制剂Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用；
步骤三：将15mL乙二醇、15mL人血白蛋白、20mL人血小板裂解液、10.269g蔗糖以及50μL的Y-27632混入溶解后的40mL Ficoll 70溶液中混匀用高糖DMEM基础培养基补充至100mL；
步骤四：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。
借由上述技术方案，本发明用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液具有下列优点：
本发明无DMSO的可快速冷冻间充质干细胞的新型冻存保护剂，同时由于加了小分子化合物Y-27632(Y-27632是ROCK抑制剂，可以有效抑制细胞凋亡)且控制冻存液的超低内毒素，能大大减小冻存对细胞的损伤及毒性，提高细胞的复苏活率以及细胞的回收率，可用于间充质干细胞的玻璃化冷冻，生产方法简洁、高效。
附图说明
图1显示的是组织块贴壁法分离培养原代人脐带间充质干细胞(X40)；
图2显示的是P3代人脐带间充质干细胞成骨及成脂分化(X100)；
图3显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人脐带间充质干细胞复苏后形态(X40)；
图4显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人脐带间充质干细胞复苏后成骨及成脂分化(X100)；
图5显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人脐带间充质干细胞复苏后增殖能力；
图6显示的是组织块贴壁法分离培养原代人胎盘间充质干细胞(左侧培养第8天，右侧培养第12天)(X40)；
图7显示的是P3代人胎盘间充质干细胞成骨及成脂分化(X100)；
图8显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人胎盘间充质干细胞复苏后形态(X40)；
图9显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人胎盘间充质干细胞复苏后成骨及成脂分化(X100)；
图10显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人胎盘间充质干细胞复苏后增殖能力；
图11显示的是组织块贴壁法分离培养原代人脂肪间充质干细胞(左侧培养第8天，右侧培养第10天)(X40)；
图12显示的是P3代人脂肪间充质干细胞成骨及成脂分化(X100)；
图13显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人脂肪间充质干细胞复苏后形态(X40)；
图14显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人脂肪间充质干细胞复苏后成骨及成脂分化(X100)；
图15显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人脂肪间充质干细胞复苏后增殖能力；
图16显示的是组织块贴壁法分离培养原代人子宫内膜间充质干细胞(左侧培养第5天，右侧培养第12天)(X40)；
图17显示的是P3代人子宫内膜间充质干细胞成骨及成脂分化(X100)；
图18显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人子宫内膜间充质干细胞复苏后形态(X40)；
图19显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人子宫内膜间充质干细胞复苏后成骨及成脂分化(X100)；
图20显示的是冷冻1、3、6个月的P3代人子宫内膜间充质干细胞复苏后增殖能力。
具体实施方式
本发明涉及一种无血清、无DMSO、成分明确的适用于临床大规模深低温冷冻保存脐带、胎盘、子宫内膜及脂肪来源的间充质干细胞的冷冻保护液。具体配制步骤如下：
步骤一：高糖DMEM基础培养基中加入Ficoll 70静置过夜溶解；
步骤二：Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用；
步骤三：将乙二醇、人血白蛋白、人血小板裂解液、蔗糖以及Y-27632(5mM储液)混入溶解后的Ficoll 70溶液中混匀用高糖DMEM基础培养基补充至100mL；
步骤四：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。
实施例、对比例1-3：冷冻保护液的配制成分
本发明中用于深低温冷冻保存脐带、胎盘、脂肪及经血来源的间充质干细胞的冷冻保护液(Cryoprotectant，Cry)的成分见表1：
表1冷冻保护液成分(v是体积，w是重量)
| 组别 | Cry-1 | Cry-2 | Cry-3 | Cry-4 |
| 乙二醇(v/v) | 15％ | 15％ | — | 20％ |
| Ficoll 70(w/v) | 10％ | 10％ | — | 15％ |
| 人血白蛋白(v/v) | 15％ | 15％ | 20％ | — |
| 人血小板裂解液(v/v) | 20％ | 20％ | 25％ | — |
| 蔗糖 | 0.3M | — | 0.3M | 0.3M |
| Y-27632 | 5μM | 5μM | 5μM | 5μM |
Cry-1具体配制步骤如下：
步骤一：40mL高糖DMEM基础培养基中加入10g Ficoll 70静置过夜溶解
步骤二：Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用
步骤三：将15mL乙二醇、15mL人血白蛋白、20mL人血小板裂解液、10.269g蔗糖以及50μL的Y-27632(5mM储液)混入溶解后的40mL Ficoll 70溶液中混匀后用高糖DMEM基础培养基补充至100mL。
步骤四：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。
Cry-2具体配制步骤如下：
步骤一：40mL高糖DMEM基础培养基中加入10g Ficoll 70静置过夜溶解
步骤二：Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用
步骤三：将15mL乙二醇、15mL人血白蛋白、20mL人血小板裂解液、以及50μL的Y-27632(5mM储液)混入溶解后的40mL Ficoll 70溶液中混匀后用高糖DMEM基础培养基补充至100mL。
步骤四：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。
Cry-3具体配制步骤如下：
步骤一：Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用
步骤二：将20mL人血白蛋白、25mL人血小板裂解液、10.269g蔗糖以及50μL的Y-27632(5mM储液)混入40mL高糖DMEM基础培养基中混匀后用高糖DMEM基础培养基补充至100mL。
步骤三：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。
Cry-4具体配制步骤如下：
步骤一：40mL高糖DMEM基础培养基中加入15g Ficoll 70静置过夜溶解
步骤二：Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用
步骤三：将20mL乙二醇、10.269g蔗糖以及50μL的Y-27632(5mM储液)混入溶解后的40mL Ficoll 70溶液中混匀后用高糖DMEM基础培养基补充至100mL。
步骤四：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。
以下通过具体功效试验例结合附图对本发明的实施例产品作进一步详细说明。
功效试验例1：人脐带间充质干细胞的深低温冷冻保存及复苏后生物学鉴定
①人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定
取新生儿脐带置于无菌生理盐水，生理盐水充分洗涤至无血迹，分离华通氏胶并剪碎至3-5mm后转入培养瓶中，加入人脐带间充质干细胞完全培养基后置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
待贴壁细胞(记为P0代次)达80％汇合度后传代。取培养至P3代次的人脐带间充质干细胞一部分用生理盐水制备成单细胞悬液后用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD90、CD105，一部分按照赛业生物科技公司的成骨与成脂分化试剂盒说明书操作检测人脐带间充质干细胞的分化潜能。
结果表明，本发明中分离培养的人脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，待汇合度达90％时出现涡旋状(图1)，通过流式细胞术检测细胞表面抗原发现人脐带间充质干细胞低表达CD34、CD45(分别为0.23±0.11、0.10±0.04)，高表达CD90、CD105(分别为96.80±1.71、97.80±1.74)，且能进行成骨及成脂细胞方向分化(图2)，说明本发明中分离培养的人脐带间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特性。
②人脐带间充质干细胞的深低温冷冻复苏后检测其生物学特性
取4×108个P3代次的人脐带间充质干细胞分为40份(1×107个细胞/份)制备成单细胞悬液并离心弃掉上清后随机分为4组，分别为Cry-1组、Cry-2组、Cry-3组和Cry-4组(每组10份细胞)，每份细胞缓慢加入1mL预冷的冷冻保护液(Cry-1、Cry-2、Cry-3和Cry-4)混匀后迅速转移至预冷的程序降温盒并置于-80℃过夜后转移到液氮中。在1、3、6个月时将Cry-1组、Cry-2组、Cry-3组和Cry-4组分别取出3只储存在液氮中的细胞置于37℃水浴锅中进行快速复苏，每只复苏的细胞加入复苏液(10％人血白蛋白+5μMY-27632+生理盐水)混匀后离心弃上清，用人脐带间充质干细胞完全培养基重悬细胞后取20μL用7-AAD标记后检测细胞活性(见式1)，其余细胞接种到细胞培养瓶后置于二氧化碳培养箱中培养，每2天换液，待细胞汇合度达85％时常规传代后通过CCK-8法检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞的表面抗原特性、成骨成脂分化试剂盒检测细胞分化能力。
复苏细胞活率＝(7-AAD阴性细胞数/获取的总细胞数)×100％(1)
结果表明，7-AAD标记检测Cry-2、Cry-3、Cry-4这三个配方冻存1个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(84.3％、53.2％、31.8％)，冻存3个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(76.3％、47.9％、30.8％)，冻存6个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(75.9％、31.1％、26.4％)，而Cry-1冻存复苏后的细胞活率为95.7％(冻存1个月)、95.2％(冻存3个月)以及95.6％(冻存6个月)，由于Cry-2、Cry-3、Cry-4三个配方冷冻复苏后的细胞活率均低于90.0％，所以后续细胞生长特性的检测实验均使用Cry-1冷冻复苏后的细胞。
Cry-1冷冻复苏后的人脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，待汇合度达90％时出现涡旋状(图3)，通过流式细胞术检测细胞表面抗原发现人脐带间充质干细胞低表达CD34、CD45(分别为0.33±0.21、0.18±0.14)，高表达CD90、CD105(分别为97.80±1.11、96.80±1.74)，且能进行成骨及成脂细胞方向分化(图4)，说明本发明中Cry-1冷冻复苏后的人脐带间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特性。
Cry-1冷冻复苏后的细胞的24h细胞贴壁率分别为82.8％(冻存1个月)、81.4％(冻存3个月)以及82.0％(冻存6个月)；复苏后的细胞在体外继续培养3代，CCK-8检测细胞增殖情况发现，3组细胞的增殖情况与冷冻保存前无显著性差异，且3组细胞之间也无明显差异(图5)。说明本发明的Cry-1冷冻保护液能很好保护人脐带间充质干细胞的深低温冷冻保存。
功效试验例2：人胎盘间充质干细胞的深低温冷冻保存及复苏后生物学鉴定
①人胎盘间充质干细胞的分离、培养及鉴定
取胎盘置无菌生理盐水，PBS充分洗涤至无血迹，剪取胎儿侧的绒毛膜层组织10cm，眼科手术剪将组织剪碎至3-5mm后转入培养瓶中，加入人胎盘间充质干细胞完全培养基后置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待贴壁细胞(记为P0代次)达80％汇合度后传代。
取培养至P3代次的人胎盘间充质干细胞一部分用生理盐水制备成单细胞悬液后用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD90、CD105，一部分按照赛业生物科技公司的成骨与成脂分化试剂盒说明书操作检测人胎盘间充质干细胞的分化潜能。
结果表明，本发明中分离培养的人胎盘间充质干细胞呈长梭形贴壁生长(图6)，待汇合度达90％时出现涡旋状，通过流式细胞术检测细胞表面抗原发现人胎盘间充质干细胞低表达CD34、CD45(分别为0.29±0.11、0.41±0.04)，高表达CD90、CD105(分别为96.20±1.41、98.80±1.36)，且能进行成骨及成脂细胞方向分化(图7)，说明本发明中分离培养的人胎盘间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特性。
②人胎盘间充质干细胞的深低温冷冻复苏后检测其生物学特性
取4×108个P3代次的人胎盘间充质干细胞分为40份(1×107个细胞/份)制备成单细胞悬液并离心弃掉上清后随机分为4组，分别为Cry-1组、Cry-2组、Cry-3组和Cry-4组(每组10份细胞)，每份细胞缓慢加入1mL预冷的冷冻保护液(Cry-1、Cry-2、Cry-3和Cry-4)混匀后迅速转移至预冷的程序降温盒并置于-80℃过夜后转移到液氮中。在1、3、6个月时将Cry-1组、Cry-2组、Cry-3组和Cry-4组分别取出3只储存在液氮中的细胞置于37℃水浴锅中进行快速复苏，每只复苏的细胞加入复苏液(10％人血白蛋白+5μMY-27632+生理盐水)混匀后离心弃上清，用人胎盘间充质干细胞完全培养基重悬细胞后取20μL用7-AAD标记后检测细胞活性(见式1)，其余细胞接种到细胞培养瓶后置于二氧化碳培养箱中培养，每2天换液，待细胞汇合度达85％时常规传代后通过CCK-8法检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞的表面抗原特性、成骨成脂分化试剂盒检测细胞分化能力。
复苏细胞活率＝(7-AAD阴性细胞数/获取的总细胞数)×100％(1)
结果表明，7-AAD标记检测Cry-2、Cry-3、Cry-4这三个配方冻存1个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(84.3％、53.2％、31.8％)，冻存3个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(76.3％、47.9％、30.8％)，冻存6个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(75.9％、31.1％、26.4％)，而Cry-1冻存复苏后的细胞活率为95.7％(冻存1个月)、95.2％(冻存3个月)以及95.6％(冻存6个月)，由于Cry-2、Cry-3、Cry-4三个配方冷冻复苏后的细胞活率均低于90.0％，所以后续细胞生长特性的检测实验均使用Cry-1冷冻复苏后的细胞。
Cry-1冷冻复苏后的人胎盘间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，待汇合度达90％时出现涡旋状(图8)，通过流式细胞术检测细胞表面抗原发现人胎盘间充质干细胞低表达CD34、CD45(分别为0.22±0.11、0.28±0.19)，高表达CD90、CD105(分别为98.80±1.01、97.80±1.94)，且能进行成骨及成脂细胞方向分化(图9)，说明本发明中冷冻复苏后的人胎盘间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特性。
Cry-1冷冻复苏后的细胞的24h细胞贴壁率分别为81.8％(冻存1个月)、83.4％(冻存3个月)以及82.1％(冻存6个月)；复苏后的细胞在体外继续培养3代，CCK-8检测细胞增殖情况发现，3组细胞的增殖情况与冷冻保存前无显著性差异，且3组细胞之间也无明显差异(图10)。说明本发明的冷冻保护液能很好保护人胎盘间充质干细胞的深低温冷冻保存。
功效试验例3：人脂肪间充质干细胞的深低温冷冻保存及复苏后生物学鉴定
①人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定
无菌条件下，将获得脂肪用无菌生理盐水反复冲洗去除麻醉药品及血细胞，获得纯度较高的脂肪颗粒。用0.3％的Ⅰ型胶原酶37℃恒温摇床震荡消化1h。过滤去除未消化组织，800r/min离心10min后弃上清，加入人脂肪间充质干细胞完全培养基重悬后接种到培养瓶中置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待贴壁细胞(记为P0代次)达80％汇合度后传代。
取培养至P3代次的人脂肪间充质干细胞一部分用生理盐水制备成单细胞悬液后用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD90、CD105，一部分按照赛业生物科技公司的成骨与成脂分化试剂盒说明书操作检测人脂肪间充质干细胞的分化潜能。
结果表明，本发明中分离培养的人脂肪间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，待汇合度达90％时出现涡旋状(图11)，通过流式细胞术检测细胞表面抗原发现人脂肪间充质干细胞低表达CD34、CD45(分别为0.32±0.41、0.73±0.54)，高表达CD90、CD105(分别为98.11±1.65、98.23±1.45)，且能进行成骨及成脂细胞方向分化(图12)，说明本发明中分离培养的人脂肪间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特性。
②人脂肪间充质干细胞的深低温冷冻复苏后检测其生物学特性
取4×108个P3代次的人脂肪间充质干细胞分为40份(1×107个细胞/份)制备成单细胞悬液并离心弃掉上清后随机分为4组，分别为Cry-1组、Cry-2组、Cry-3组和Cry-4组(每组10份细胞)，每份细胞缓慢加入1mL预冷的冷冻保护液(Cry-1、Cry-2、Cry-3和Cry-4)混匀后迅速转移至预冷的程序降温盒并置于-80℃过夜后转移到液氮中。在1、3、6个月时将Cry-1组、Cry-2组、Cry-3组和Cry-4组分别取出3只储存在液氮中的细胞置于37℃水浴锅中进行快速复苏，每只复苏的细胞加入复苏液(10％人血白蛋白+5μMY-27632+生理盐水)混匀后离心弃上清，用人脂肪间充质干细胞完全培养基重悬细胞后取20μL用7-AAD标记后检测细胞活性(见式1)，其余细胞接种到细胞培养瓶后置于二氧化碳培养箱中培养，每2天换液，待细胞汇合度达85％时常规传代后通过CCK-8法检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞的表面抗原特性、成骨成脂分化试剂盒检测细胞分化能力。
复苏细胞活率＝(7-AAD阴性细胞数/获取的总细胞数)×100％(1)
结果表明，7-AAD标记检测Cry-2、Cry-3、Cry-4这三个配方冻存1个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(84.3％、53.2％、31.8％)，冻存3个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(76.3％、47.9％、30.8％)，冻存6个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(75.9％、31.1％、26.4％)，而Cry-1冻存复苏后的细胞活率为95.7％(冻存1个月)、95.2％(冻存3个月)以及95.6％(冻存6个月)，由于Cry-2、Cry-3、Cry-4三个配方冷冻复苏后的细胞活率均低于90.0％，所以后续细胞生长特性的检测实验均使用Cry-1冷冻复苏后的细胞。
Cry-1冷冻复苏后的人脂肪间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，待汇合度达90％时出现涡旋状(图13)，通过流式细胞术检测细胞表面抗原发现人脂肪间充质干细胞低表达CD34、CD45(分别为0.29±0.11、0.28±0.11)，高表达CD90、CD105(分别为95.80±1.51、95.80±1.24)，且能进行成骨及成脂细胞方向分化(图14)，说明本发明中冷冻复苏后的人脂肪间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特性。
Cry-1冷冻复苏后的细胞的24h细胞贴壁率分别为80.8％(冻存1个月)、81.1％(冻存3个月)以及81.0％(冻存6个月)；复苏后的细胞在体外继续培养3代，CCK-8检测细胞增殖情况发现，3组细胞的增殖情况与冷冻保存前无显著性差异，且3组细胞之间也无明显差异(图15)。说明本发明的冷冻保护液能很好保护人脂肪间充质干细胞的深低温冷冻保存。
功效试验例4：人子宫内膜间充质干细胞的深低温冷冻保存及复苏后生物学鉴定
①人子宫内膜间充质干细胞的分离、培养及鉴定
将15mL经血中加入等体积无菌生理盐水混匀后缓慢加入等体积的Ficoll分离液上(2只50mL离心管，每只离心管含有15mL Ficoll分离液与15mL经血-生理盐水混合液)，2000r/min离心30min后吸取中间白膜层的单个核细胞，加入2倍体积的生理盐水混匀后1200r/min离心10min，洗涤2次白膜层的单个核细胞后弃掉上清，加入人子宫内膜间充质干细胞完全培养基混匀后接种至培养瓶中置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待贴壁细胞(记为P0代次)达80％汇合度后传代。
取培养至P3代次的人子宫内膜间充质干细胞一部分用生理盐水制备成单细胞悬液后用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD90、CD105，一部分按照赛业生物科技公司的成骨与成脂分化试剂盒说明书操作检测人子宫内膜间充质干细胞的分化潜能。
结果表明，本发明中分离培养的人子宫内膜间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，待汇合度达90％时出现涡旋状(图16)，通过流式细胞术检测细胞表面抗原发现人子宫内膜间充质干细胞低表达CD34、CD45(分别为0.56±0.53、0.23±0.76)，高表达CD90、CD105(分别为98.23±1.34、97.61±1.76)，且能进行成骨及成脂细胞方向分化(图17)，说明本发明中分离培养的人子宫内膜间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特性。
②人子宫内膜间充质干细胞的深低温冷冻复苏后检测其生物学特性
取4×108个P3代次的人子宫内膜间充质干细胞分为40份(1×107个细胞/份)制备成单细胞悬液并离心弃掉上清后随机分为4组，分别为Cry-1组、Cry-2组、Cry-3组和Cry-4组(每组10份细胞)，每份细胞缓慢加入1mL预冷的冷冻保护液(Cry-1、Cry-2、Cry-3和Cry-4)混匀后迅速转移至预冷的程序降温盒并置于-80℃过夜后转移到液氮中。在1、3、6个月时将Cry-1组、Cry-2组、Cry-3组和Cry-4组分别取出3只储存在液氮中的细胞置于37℃水浴锅中进行快速复苏，每只复苏的细胞加入复苏液(10％人血白蛋白+5μMY-27632+生理盐水)混匀后离心弃上清，用人子宫内膜间充质干细胞完全培养基重悬细胞后取20μL用7-AAD标记后检测细胞活性(见式1)，其余细胞接种到细胞培养瓶后置于二氧化碳培养箱中培养，每2天换液，待细胞汇合度达85％时常规传代后通过CCK-8法检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞的表面抗原特性、成骨成脂分化试剂盒检测细胞分化能力。
复苏细胞活率＝(7-AAD阴性细胞数/获取的总细胞数)×100％(1)
结果表明，7-AAD标记检测Cry-2、Cry-3、Cry-4这三个配方冻存1个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(84.3％、53.2％、31.8％)，冻存3个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(76.3％、47.9％、30.8％)，冻存6个月的细胞复苏后的细胞活率分别为(75.9％、31.1％、26.4％)，而Cry-1冻存复苏后的细胞活率为95.7％(冻存1个月)、95.2％(冻存3个月)以及95.6％(冻存6个月)，由于Cry-2、Cry-3、Cry-4三个配方冷冻复苏后的细胞活率均低于90.0％，所以后续细胞生长特性的检测实验均使用Cry-1冷冻复苏后的细胞。
Cry-1冷冻复苏后的人子宫内膜间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，待汇合度达90％时出现涡旋状(图18)，通过流式细胞术检测细胞表面抗原发现人子宫内膜间充质干细胞低表达CD34、CD45(分别为0.67±0.01、0.34±0.15)，高表达CD90、CD105(分别为96.84±1.64、97.23±1.54)，且能进行成骨及成脂细胞方向分化(图19)，说明本发明中冷冻复苏后的人子宫内膜间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特性。
Cry-1冷冻复苏后的细胞的24h细胞贴壁率分别为81.8％(冻存1个月)、82.1％(冻存3个月)以及82.0％(冻存6个月)；复苏后的细胞在体外继续培养3代，CCK-8检测细胞增殖情况发现，3组细胞的增殖情况与冷冻保存前无显著性差异，且3组细胞之间也无明显差异(图20)。说明本发明的冷冻保护液能很好保护人子宫内膜间充质干细胞的深低温冷冻保存。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液，其特征在于：包含以下成分：
乙二醇(v/v)15-20％；
Ficoll 70(w/v)10-15％；
人血白蛋白(v/v)15-20％；
人血小板裂解液(v/v)20-25％；
蔗糖0.3M；
ROCK抑制剂Y-27632 5μM。
2.如权利要求1所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液，其特征在于：
所述ROCK抑制剂Y-27632，用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用。
3.如权利要求1所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液，其特征在于：
所述冷冻保护液使用高糖DMEM基础培养基补充剩余体积；所述Ficoll 70及所述蔗糖均使用高糖DMEM基础培养基作为溶剂配制。
4.权利要求1-3中任一项所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：高糖DMEM基础培养基中加入10-15％(w/v)Ficoll 70静置过夜溶解；
步骤二：ROCK抑制剂Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用；
步骤三：将15-20％(v/v)乙二醇、15-20％(v/v)人血白蛋白、20-25％(v/v)人血小板裂解液、0.3M蔗糖以及5μM的Y-27632按照比例混入溶解后的10％Ficoll 70溶液中混匀用高糖DMEM基础培养基补充剩余体积。
5.权利要求4所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于：
所述0.3M蔗糖使用高糖DMEM基础培养基作为溶剂配制。
6.权利要求4所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于，还包括将配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用的步骤。
7.权利要求4-6任一项所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：高糖DMEM基础培养基中加入10％(w/v)Ficoll 70静置过夜溶解；
步骤二：ROCK抑制剂Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用；
步骤三：将15％(v/v)乙二醇、15％(v/v)人血白蛋白、20％(v/v)人血小板裂解液、0.3M蔗糖以及5μM的Y-27632按照比例混入溶解后的10％(w/v)Ficoll 70溶液中混匀用高糖DMEM基础培养基补充剩余体积；
步骤四：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。
8.权利要求4-6任一项所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：40mL高糖DMEM基础培养基中加入10g Ficoll 70静置过夜溶解；
步骤二：ROCK抑制剂Y-27632用生理盐水配制浓度为5mM的储液后以1:1000的比例稀释使用；
步骤三：将15mL乙二醇、15mL人血白蛋白、20mL人血小板裂解液、10.269g蔗糖以及50μL的Y-27632混入溶解后的40mL Ficoll 70溶液中混匀用高糖DMEM基础培养基补充至100mL；
步骤四：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。
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