CN116083366A - 一种体外高效稳定转导抗原嵌合受体双阴性t细胞的方法 - Google Patents

一种体外高效稳定转导抗原嵌合受体双阴性t细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种安全高效的体外转导双阴性T细胞(DNT)的方法，以及使用所述方法制备得到的细胞和含有所述细胞的制剂。本发明在不添加转导辅助的阳离子试剂的条件下，用慢病毒转导激活和扩增的新鲜富集的或冻存后复苏的双阴性T细胞，即可获得稳定且高效的转导效率。使用本发明的方法制备得到的嵌合抗原受体‑双阴性T细胞(CAR‑DNT)不仅具有更高的细胞活率和纯度，保留有高杀瘤活性，且避免了CAR‑DNT细胞生产中添加阳离子转导试剂带来的高残留隐患。

Description

一种体外高效稳定转导抗原嵌合受体双阴性T细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞治疗技术领域，具体涉及一种体外高效稳定转导抗原嵌合受体双阴性T细胞(Chimeric Antigen Receptor Double Negative T,CAR-DNT)的方法。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T细胞(CART)产品是采用从人外周血分离单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)后，通过基因工程嵌入特定的抗原受体(CAR)，增强PBMC中T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性。CART对肿瘤的杀伤以非MHC限制的方式，通过胞外段单链抗体识别靶细胞上一个或多个特异性的抗原决定簇(epitopes)，随后通过胞内结构域转导该信号，引起CART细胞的活化增殖、分泌细胞溶解毒性和细胞因子以清除靶细胞。CART细胞是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一，截至2021年10月，已有5款CART细胞产品被美国FDA批准上市用于非霍奇金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤治疗，中国也有2款CART细胞产品被国家药监局(NMPA)批准上市用于非霍奇金氏淋巴瘤的治疗。
虽然目前已上市的自体CART细胞疗法在临床上的治疗效果非常显著，但也存在诸多缺陷，除了会导致细胞因子风暴和神经毒性等严重副反应外，还存在3大问题：首先，一些淋巴细胞数量较低或质量较差的晚期患者，由于没有足够数量的自体免疫细胞，失去了CART细胞治疗的机会；其次，已有报道采用病人自体细胞制备的CART产品时，将病毒基因转导到外周血残存肿瘤细胞内，导致病人死亡；再者，由于制备自体CART细胞产品是1对1的个体化治疗，制备成本昂贵，制备工艺要求复杂，导致产品价格昂贵，大多病人无法承受，增加社会医疗负担。目前大部分正在开发的异体通用型CART细胞产品，是通过基因编辑技术敲除可以引起移植物抗宿主病的基因，如TCR受体等，但敲除这些基因需要繁琐的构建过程和大规模测序，并且脱靶率高，安全隐患大，最近有报道美国FDA叫停了Allogene公司通用型CART产品的临床试验，其原因是发现在临床研究中出现一例患者中CART细胞的染色体异常。因此，开发非基因编辑通用型CART细胞产品迫在眉睫。
双阴性T(Double Negative T，DNT)细胞是指外周血中正常存在的CD3+CD4-CD8-成熟T淋巴细胞亚群，约占外周血单个核细胞1-3％。DNT细胞表面表达CD3分子和αβ-或γδ-T细胞受体(T Cell Receptor，TCR)，但不表达CD4和CD8分子，且对于恒定型自然杀伤T(invariant Nature Killer T，iNKT)细胞特异性αGalCer无反应，因此不同于常规的T细胞、NK细胞和NKT细胞。DNT细胞通过多种人体天然机制发挥细胞毒性、抗原呈递功能同时释放细胞因子/趋化因子，激活更广泛的免疫应答。已报导，DNT细胞对多种肿瘤具有细胞毒活性，在AML、淋巴瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌等多种血液或者实体肿瘤中都有较好的体内外杀瘤效果，目前异体DNT细胞治疗复发难治AML的产品RC1012注射液已被中国国家药监局批准进入注册临床试验。
DNT细胞杀死肿瘤细胞不受组织相容性复合物(Major HistocompatibilityComplex，MHC)分子限制，经体外扩增的健康捐赠者来源的同种异体DNT细胞输注到患者体内，对患者体内正常细胞无杀伤毒性且不影响造血干细胞的进一步分化，不会引起移植物抗宿主病(Graft versus Host Disease,GvHD)，也没有宿主抗移植物(Host versusGraft，HvG)反应，这使其具备成为一款非基因编辑现货通用型CART细胞的极佳候选产品。
目前，CART细胞递送CAR基因主要是采用慢病毒系统。然而，与NK细胞相似，DNT细胞在人体外周血单个核细胞中的占比低且具有较强的抗病毒性能，使得DNT细胞在体外用病毒转导时的效率远低于CD3+CD4+/CD3+CD8+的T细胞。同时，慢病毒转导通常需要添加阳离子聚合物，通过电荷屏蔽和病毒聚集两种机制来提高病毒的转导效率。使用阳离子聚合等转导增强试剂可以明显提高病毒的转导效率，但是也存在两方面问题：一是阳离子聚合物对所有细胞都有一定的细胞毒性，添加阳离子聚合物会影响细胞的活力以及降低细胞的功能；二是临床用细胞治疗产品对于阳离子聚合物的残留有很高的要求，添加到培养体系用以提高转导效率的阳离子聚合物在培养过程中难以去除，细胞治疗产品终末的残留检测成为难题，限制其临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全高效的体外转导DNT细胞的方法，以及使用所述方法制备得到的细胞和含有所述细胞的制剂。
本发明的第一方面，提供了一种体外转导双阴性T细胞的方法，所述方法包括步骤：
(i)提供未激活的双阴性T细胞(DNT)；
(ii)在抗人CD3单克隆抗体存在的条件下，使用第一培养基培养所述未激活的双阴性T细胞，从而获得激活的双阴性T细胞；其中，所述抗人CD3单克隆抗体被固化在介质上；
(iii)使用第二培养基扩增培养所述激活的双阴性T细胞，从而获得经扩增的双阴性T细胞；和
(iv)在不添加转导辅助阳离子试剂的条件下，用MOI为1-15的慢病毒载体转导经扩增的双阴性T细胞，从而获得经转导的双阴性T细胞；其中，所述慢病毒载体载有外源性基因序列。
在另一优选例中，所述未激活的双阴性T细胞选自下组：新鲜分离的双阴性T细胞、冻存后复苏的双阴性T细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述双阴性T细胞为外周血进行体外分离纯化得到双阴性T细胞。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述介质选自下组：培养介质(例如培养皿、培养瓶或培养板)、磁珠、可降解微珠、或其组合。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，用20ng/ml-25μg/ml，较佳地，100ng ng/ml-15μg/ml，最佳地，1μg/ml-15μg/ml的抗人CD3单克隆抗体包被培养瓶，从而获得包被有抗人CD3单克隆抗体的培养瓶，在包被有抗人CD3单克隆抗体的培养瓶中培养所述未激活的双阴性T细胞。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，未激活的双阴性T细胞的初始培养浓度为1×106～4×106个细胞/ml。
在另一优选例中，步骤(ii)的培养时间为5-17天，较佳地6-14天，最佳地7-12天。
在另一优选例中，所述激活的双阴性T细胞具有Tscm/Tcm特征。
在另一优选例中，在步骤(iii)中，激活的双阴性T细胞的初始培养浓度为1×106～4×106个细胞/ml。
在另一优选例中，在步骤(iii)中，扩增培养的时间为5-17天，较佳地6-14天，最佳地，7-12天。
在另一优选例中，所述第一培养基包含以下组分：无血清培养基、2％-30％ICSR(Immune Cell Serum Replacement)(v/v)、和500-1000IU/ml的重组人白介素2；所述百分比按第一培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述第一培养基中包含20％ICSR(v/v)，按第一培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述第一培养基中包含10％ICSR(v/v)，按第一培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述第一培养基中包含500IU/ml的重组人白介素2。
在另一优选例中，所述第一培养基中包含1000IU/ml的重组人白介素2。
在另一优选例中，所述第二培养基包含以下组分：无血清培养基、2％-30％ICSR(v/v)和维持富含Tscm特征的DNT细胞的细胞因子；所述百分比按第二培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述维持富含Tscm特征的DNT细胞的细胞因子选自下组：10-1000IU/ml重组人白介素2，5-50ng/ml重组人白介素7，5-50ng/ml重组人白介素12，5-50ng/ml重组人白介素15，5-50ng/ml重组人白介素21，1-10ng/ml重组人白介素1β，或其组合。
在另一优选例中，所述第二培养基中包含10％ICSR(v/v)，按第二培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述第二培养基包含：500IU/ml的重组人白介素2、2ng/ml重组人白介素1β、和5ng/ml重组人白介素21。
在另一优选例中，所述第二培养基包含：1000IU/ml的重组人白介素2、5ng/ml重组人白介素1β、和3ng/ml重组人白介素21。
在另一优选例中，所述无血清培养基包含以下组分：Aly505培养基，8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，30μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，和1μg/ml的油酸。
在另一优选例中，所述无血清培养基包含以下组分：GT551培养基，3μg/ml的重组人转铁蛋白，3μg/ml重组人胰岛素，70μg/ml的抗坏血酸，2μg/ml的乙醇胺，0.5μg/ml的亚油酸，和0.5μg/ml的油酸。
在另一优选例中，在步骤(iv)中，转导时经扩增的双阴性T细胞的细胞密度为1×106-4×106个细胞/ml。
在另一优选例中，在步骤(iv)中，用MOI为5的慢病毒载体转导经扩增的双阴性T细胞。
在另一优选例中，在步骤(iv)中，用MOI为10的慢病毒载体转导经扩增的双阴性T细胞。
在另一优选例中，在步骤(iv)中，所述外源性基因序列为编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)选自下组：CD19、Mesothelin(MSLN)、CD5、CD7、CD20、CD22、CD33、CD123、BCMA、IM19、GPC-3、Claudin18.2、NY-ESO-1、GD2、EGFR、HER2、MUC1、PSMA、或其组合。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)为CD19。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)为MSLN。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(v)使用第三培养基扩增培养所述经转导的双阴性T细胞，并将收获的双阴性T细胞制备为可供临床使用的双阴性T细胞制剂。
在另一优选例中，所述经转导的双阴性T细胞为负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞。
在另一优选例中，所述第三培养基包含：无血清培养基，0％-30％ICSR(v/v)，和维持富含Tscm特征的DNT细胞的细胞因子；其中，所述维持富含Tscm特征的DNT细胞的细胞因子包括：10-1000IU/ml重组人白介素2、5-50ng/ml重组人白介素7、5-50ng/ml重组人白介素12、5-50ng/ml重组人白介素15、5-50ng/ml重组人白介素21、1-10ng/ml重组人白介素1β、或其组合；所述百分比按第三培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述第三培养基中包含5％ICSR(v/v)，按第二培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述第三培养基中包含10％ICSR(v/v)，按第二培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述第三培养基中不包含ICSR。
在另一优选例中，所述第三培养基中包含：1000IU/ml的重组人白介素2，5ng/ml重组人白介素7，和5ng/ml重组人白介素12。
在另一优选例中，所述无血清培养基包含：Aly505培养基，5μg/ml的重组人转铁蛋白，5μg/ml重组人胰岛素，50μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，和1μg/ml的油酸。
在另一优选例中，所述无血清培养基包含：GT551培养基，8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，50μg/ml的抗坏血酸，1μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，1μg/ml的油酸。
本发明的第二方面，提供了一种负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞，所述细胞由本发明第一方面所述的方法制备得到。
在另一优选例中，所述负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞具有以下部分或全部特征：
(1)具有高比例Tscm/Tcm细胞特征；
(2)低比例Teff细胞特征；
(3)细胞增殖能力强且存活率高；
(4)转导效率高且稳定；
(5)靶向杀瘤能力强。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)选自下组：CD19、Mesothelin(MSLN)、CD5、CD7、CD20、CD22、CD33、CD123、BCMA、IM19、GPC-3、Claudin18.2、NY-ESO-1、GD2、EGFR、HER2、MUC1、PSMA、或其组合。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)为CD19。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)为MSLN。
本发明的第三方面，提供了一种嵌合抗原受体-双阴性T细胞制剂，所述制剂包括：(a)如本发明第二方面所述的负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞；和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述制剂中不含有转导辅助阳离子试剂成分。
本发明的第四方面，提供了一种如本发明第二方面所述的细胞或如本发明第三方面所述的制剂的用途，用于制备用于预防肿瘤复发和/或治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述肿瘤选自实体肿瘤和/或血液肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：急性髓细胞性白血病(AML)、淋巴瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、肾脏肿瘤、黑素瘤、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、头颈癌、胰腺癌，或其组合。
本发明的第五方面，提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用本发明第二方面所述的负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞，或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体-双阴性T细胞制剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了CAR-DNT细胞生产工艺流程图。
图2A显示了AO/PI检测体外扩增不同时间的3供者CD19-CAR-DNT细胞存活率曲线；
图2B显示了流式细胞仪检测细胞体外扩增不同时间的3供者CD19-CAR-DNT细胞纯度(CD3+％,CD3+CD4-CD8-％)以及体外扩增第10天供者2细胞纯度流式图；
图2C显示了流式细胞仪检测细胞体外扩增不同时间的3供者CD19-CAR-DNT细胞阳性率曲线以及供者2扩增第10天阳性率流式图；
图2D显示了流式细胞仪检测细胞体外扩增不同时间的3供者CD19-CAR-DNT细胞分化曲线以及供者2体外扩增第10天分化流式图；
图2E显示了RTCA检测细胞体外扩增第10天3供者CD19-CAR-DNT效靶比1：1对Hela/Hela-CD19细胞株共孵育20小时的杀瘤活性(n＝3)以及供者2CD19-CAR-DNT细胞对Hela/Hela-CD19细胞株的实时杀伤曲线；
图2F显示了流式细胞仪检测体外扩增第10天3供者CD19-CAR-DNT细胞对Raji/K562细胞株效靶比4：1共孵育3小时的杀瘤活性。
图3A显示了AO/PI检测体外扩增不同时间2供者MSLN-CAR-DNT细胞存活率曲线；
图3B显示了流式细胞仪检测体外扩增不同时间2供者MSLN-CAR-DNT细胞纯度(CD3+％,CD3+CD4-CD8-％)(n＝2)及体外扩增第9天供者1细胞纯度流式图；
图3C显示了流式细胞仪检测体外扩增不同时间2供者MSLN-CAR-DNT细胞阳性率曲线以及体外扩增第9天供者1细胞阳性率流式图；
图3D显示了体外扩增第10天采用RTCA法检测MSLN-CAR-DNT细胞对AGS细胞株实时杀瘤曲线(效靶比1：1)以及与AGS细胞株共孵育20小时后采用ELISA法检测培养上清中IFNγ释放量(n＝2)；
图3E显示了细胞体外扩增第10天采用RTCA法检测MSLN-CAR-DNT对SK-OV3细胞株实时杀瘤曲线(效靶比2.5：1)以及与SK-OV3细胞株共孵育20小时后采用ELISA检测培养上清中IFNγ释放量(n＝2)。
图4A显示了采用AO/PI检测不同时间采用不同方法转导CD19-CAR-DNT细胞的扩增曲线以及细胞存活率曲线对比图(n＝2)；
图4B显示了流式细胞仪检测不同时间，采用不同方式转导CD19-CAR-DNT细胞纯度(CD3+和CD3+CD4-CD8-细胞)曲线比较图(n＝2)；
图4C显示了流式细胞仪检测不同时间，采用不同方式转导CD19-CAR-DNT细胞阳性率曲线比较图(n＝2)；
图4D显示了流式细胞仪检测不同方式转导CD19-CAR-DNT细胞体外扩增第9天分化亚群(n＝2)；
图4E显示了RTCA方法检测采用不同方式转导CD19-CAR-DNT细胞体外扩增第8天对Hela-CD19细胞株共孵育20小时的杀瘤活性(效靶比1：1)(n＝2)；
图4F显示了ELISA法检测不同方式转导CD19-CAR-DNT细胞体外扩增第8天与Hela-CD19细胞株共孵育20小时上清中IFNγ的释放量(效靶比1:1)(n＝2)。
图5A显示了比较新鲜或冻存复苏后DNT细胞制备CD19-CAR-DNT细胞不同时间点细胞存活率(AO/PI法)曲线图；
图5B显示了比较新鲜或冻存复苏DNT细胞制备CD19-CAR-DNT后不同时间点细胞纯度(流式细胞仪法)曲线图；
图5C显示了比较新鲜或冻存复苏DNT细胞制备CD19-CAR-DNT细胞后不同时间点CART细胞阳性率(流式细胞仪)曲线图；
图5D显示了新鲜或冻存复苏DNT细胞制备CD19-CAR-DNT细胞后体外扩增第9天细胞分化亚群图(流式细胞仪)；
图5E显示了新鲜(上图)或冻存复苏DNT细胞(下图)制备CD19-CAR-DNT细胞后体外扩增第8天对Hela-CD19细胞株实时杀伤曲线图(RTCA方法，效靶比1:1)；
图5F显示了新鲜或冻存复苏DNT细胞制备CD19-CAR-DNT细胞，体外扩增第10天对Raji细胞株的杀瘤活性比较图(流式细胞仪法，效靶比4:1)；
图5G显示了新鲜或冻存复苏DNT细胞制备CD19-CAR-DNT细胞，体外扩增第10天检测与Raji细胞株共孵育3小上清中INFγ的释放量(ELISA方法，效靶比4:1)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现在不添加转导辅助的阳离子试剂的条件下，用慢病毒转导激活和扩增的新鲜富集的或冻存后复苏的双阴性T细胞，即可获得稳定且高效的转导效率。使用本发明的方法制备得到的负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞(CAR-DNT)具有更高的细胞活率和纯度，且保留有高杀瘤活性。此外，本发明方法的转导工艺避免了CAR-DNT细胞生产中添加阳离子转导试剂带来的高残留隐患，使CAR-DNT细胞产品的临床应用更加安全可靠。
在此基础上，完成了本发明。
如本文所用，术语“双阴性T细胞”、“DNT细胞”、“DNT”可互换使用，均指从外周血中分离得到的CD3+CD4-CD8-成熟T淋巴细胞亚群，其细胞表面表达CD3分子和αβ-或γδ-T细胞受体，但不表达CD4和CD8分子。
如本文所用，术语“未激活的双阴性T细胞”是指未经激活处理(抗人CD3单克隆抗体和细胞因子)，不具有Tscm/Tcm特征的双阴性T细胞。
如本文所用，术语“激活的双阴性T细胞”是指经激活处理后，具有Tscm/Tcm特征的双阴性T细胞。激活的双阴性T细胞经扩增培养后可被载有外源性基因序列(如编码嵌合抗原受体的基因序列)的慢病毒载体转导，用于制备嵌合抗原受体-双阴性T细胞(CAR-DNT)。
如本文所用，术语“负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞”、“嵌合抗原受体-双阴性T细胞”和“CAR-DNT”可互换使用，均指在细胞表面表达嵌合抗原受体的双阴性T细胞。
本发明的体外转导双阴性T细胞的方法
本发明提供了一种稳定高效的体外转导双阴性T细胞的方法。具体地，本发明的方法包括以下步骤：
(i)提供未激活的双阴性T细胞(DNT)；所述双阴性T细胞为新鲜分离的双阴性T细胞或冻存后复苏的双阴性T细胞；
(ii)在抗人CD3单克隆抗体存在的条件下，使用第一培养基培养所述未激活的双阴性T细胞，从而获得激活的双阴性T细胞；其中，所述抗人CD3单克隆抗体被固化在介质上；
(iii)使用第二培养基扩增培养所述激活的双阴性T细胞，从而获得经扩增的双阴性T细胞；和
(iv)在不添加转导辅助阳离子试剂的条件下，用MOI为1-15的慢病毒载体转导经扩增的双阴性T细胞，从而获得经转导的双阴性T细胞；其中，所述慢病毒载体载有外源性基因序列。
对于步骤(iv)中获得的经转导的双阴性T细胞，本发明的方法还进一步包括步骤：(v)使用第三培养基扩增培养所述经转导的双阴性T细胞，并将收获的双阴性T细胞制备为可供临床使用的双阴性T细胞制剂。
在本发明的一个实施方式中，使用载有编码CD19 CAR序列的慢病毒载体转导经扩增的双阴性T细胞，从而将经转导的CD19 CAR-DNT细胞制备为可供临床使用的细胞制剂；其包括以下步骤：
(i)提供未激活的双阴性T细胞(DNT)；
(ii)在包被有抗人CD3单克隆抗体(10μg/ml)的培养瓶中，使用第一培养基培养所述未激活的双阴性T细胞，从而获得激活的双阴性T细胞；其中，所述第一培养基包含以下组分：无血清培养基(Aly505培养基，8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，30μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，和1μg/ml的油酸)、20％ICSR(v/v)和1000IU/ml的重组人白介素2；
(iii)使用第二培养基扩增培养所述激活的双阴性T细胞，从而获得经扩增的双阴性T细胞；其中，所述第二培养基包含以下组分：无血清培养基(Aly505培养基，8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，30μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，和1μg/ml的油酸)、20％ICSR(v/v)、1000IU/ml的重组人白介素2、2ng/ml重组人白介素1β、和5ng/ml重组人白介素21；
(iv)在不添加转导辅助阳离子试剂的条件下，用MOI为5的负载有CD19 CAR序列的慢病毒载体转导经扩增的双阴性T细胞，从而获得经转导的双阴性T细胞；和
(v)使用第三培养基扩增培养所述经转导的双阴性T细胞，并将收获的CD19 CAR-DNT制备为可供临床使用的双阴性T细胞制剂；其中，所述第三培养基包含以下组分：无血清培养基(Aly505培养基，5μg/ml的重组人转铁蛋白，5μg/ml重组人胰岛素，50μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，和1μg/ml的油酸)、5％ICSR(v/v)、1000IU/ml的重组人白介素2，5ng/ml重组人白介素7，和5ng/ml重组人白介素12。
在本发明的一个实施方式中，使用载有编码MSLN CAR序列的慢病毒载体转导经扩增的双阴性T细胞，从而将经转导的MSLN CAR-DNT细胞制备为可供临床使用的细胞制剂；其包括以下步骤：
(i)提供未激活的双阴性T细胞(DNT)；
(ii)在包被有抗人CD3单克隆抗体(10μg/ml)的培养瓶中，使用第一培养基培养所述未激活的双阴性T细胞，从而获得激活的双阴性T细胞；其中，所述第一培养基包含以下组分：无血清培养基(GT551培养基，3μg/ml的重组人转铁蛋白，3μg/ml重组人胰岛素，70μg/ml的抗坏血酸，2μg/ml的乙醇胺，0.5μg/ml的亚油酸，和0.5μg/ml的油酸)、20％ICSR(v/v)和1000IU/ml的重组人白介素2；
(iii)使用第二培养基扩增培养所述激活的双阴性T细胞，从而获得经扩增的双阴性T细胞；其中，所述第二培养基包含以下组分：无血清培养基(GT551培养基，3μg/ml的重组人转铁蛋白，3μg/ml重组人胰岛素，70μg/ml的抗坏血酸，2μg/ml的乙醇胺，0.5μg/ml的亚油酸，和0.5μg/ml的油酸)、20％ICSR(v/v)、1000IU/ml的重组人白介素2、5ng/ml重组人白介素1β、和3ng/ml重组人白介素21；
(iv)在不添加转导辅助阳离子试剂的条件下，用MOI为10的负载有MSLNCAR序列的慢病毒载体转导经扩增的双阴性T细胞，从而获得经转导的双阴性T细胞；和
(v)使用第三培养基扩增培养所述经转导的双阴性T细胞，并将收获的MSLN CAR-DNT制备为可供临床使用的双阴性T细胞制剂；其中，所述第三培养基包含以下组分：无血清培养基(GT551培养基，8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，50μg/ml的抗坏血酸，1μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，1μg/ml的油酸)、1000IU/ml的重组人白介素2，5ng/ml重组人白介素7，和5ng/ml重组人白介素12。
本发明的负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞
本发明还提供了一种使用本发明第一方面所述的方法制备得到的负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞(CAR-DNT)。所述CAR-DNT具有以下部分或全部特征：(1)具有高比例Tscm/Tcm细胞特征；(2)低比例Teff细胞特征；(3)细胞增殖能力强且存活率高；(4)转导效率高且稳定；(5)靶向杀瘤能力强等。
所述嵌合抗原受体(CAR)包括(但不限于)选自下组的CAR：CD5、CD7、CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、BCMA、Mesothelin(MSLN)、IM19、GPC-3、Claudin18.2、NY-ESO-1、GD2、EGFR、HER2、MUC1、PSMA、或其组合。
在本发明的一个实施方式中，使用本发明第一方面所述的方法制备得到负载有CD19 CAR的双阴性T细胞(CD19 CAR-DNT)。
在本发明的一个实施方式中，使用本发明第一方面所述的方法制备得到负载有MSLN CAR的双阴性T细胞(MSLN CAR-DNT)。
本发明的嵌合抗原受体-双阴性T细胞制剂
本发明还提供了一种嵌合抗原受体-双阴性T细胞制剂，所述制剂包含：(a)本发明第二方面所述的负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞，和(b)药学上可接受的载体。
在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-DNT细胞的浓度为1×105-1×108个细胞/ml，更优地1×105-1×106个细胞/ml。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水、细胞冻存液等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
治疗性应用
本发明还提供了本发明第二方面的负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞(CAR-DNT)和本发明第三方面所述的嵌合抗原受体-双阴性T细胞制剂的用途，用于制备预防和/或治疗肿瘤(或癌症)的药物，以及用于治疗/或预防肿瘤(或癌症)。
所述的癌症包括各个进展期的肿瘤，包括临床上I期到IV期肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌。
本发明的主要优点包括：
1.本发明的方法工艺流程简单，适合大规模扩增转导DNT细胞并获得具有Tscm/Tcm特征的双阴性T细胞用于临床治疗；
2.慢病毒转导过程不需要添加任何转导辅助的阳离子试剂或者通过机械离心的方式增强转导效率，就可以稳定高效转导DNT细胞；
3.本发明的方法可用于任何靶点CAR的转导；
4.本发明的方法在不同供者间转导效率稳定；
5.使用本发明的方法转导不影响细胞的活率，纯度以及杀瘤活性；
6.本发明的方法既可转导新鲜富集的DNT细胞，也可转导经冻存后复苏的DNT细胞。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
1.1健康捐赠者DNT细胞富集
从3名健康捐赠者收集20～200ml外周血到含肝素钠管中。利用
Figure BDA0003340376140000141
试剂盒(Stem Cell Technologies Inc)去除CD4+、CD8+ T细胞，或者利用CD4磁珠/CD8磁珠去除CD4+、CD8+ T细胞，如此获得的细胞即为去除CD4+与CD8+的DNT细胞，按照5×106个细胞/ml浓度使用程序降温仪梯度降温后放入-196℃液氮中冻存备用。
1.2DNT细胞的复苏与激活
冻存的DNT细胞由液氮中取出，37℃水浴锅中进行复苏，3分钟内完成复苏。复苏的DNT细胞以Aly505培养基洗涤1次，用抗人CD3单克隆抗体(10μg/ml)包被T25培养瓶，用DNT细胞专用无血清培养基(Aly505培养基添加8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，30μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，1μg/ml的油酸)添加20％ICSR(v/v)和1000IU/ml的重组人白介素2，调整成1×106～4×106个细胞/ml的浓度，放入前述包被好的T25培养瓶中，5％CO2培养箱中培养。
1.3体外扩增富含Tscm特征的DNT细胞
第3-4天，用DNT细胞专用无血清培养基(Aly505培养基添加8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，30μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，1μg/ml的油酸)添加20％ICSR(v/v)和1000IU/ml的重组人白介素2，2ng/ml重组人白介素1β，5ng/ml重组人白介素21，将DNT细胞调整成1×106～4×106个细胞/ml的浓度，跟据细胞体积调整为T75培养瓶或者T175培养瓶继续培养。
1.4体外高效转导CD19-CAR-DNT细胞
第5天，体外富集到高纯度DNT时，加入MOI＝5的CD19-CAR慢病毒转导，转导过程不添加转导辅助阳离子试剂，同时也不采用对细胞有损伤的机械离心的方式。
1.5体外扩增CD19-CAR-DNT细胞
第7-14天，用CD19-CAR-DNT细胞专用无血清培养基(Aly505培养基添加5μg/ml的重组人转铁蛋白，5μg/ml重组人胰岛素，50μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，1μg/ml的油酸)添加5％ICSR(v/v)和1000IU/ml的重组人白介素2，5ng/ml重组人白介素7，5ng/ml重组人白介素12，将CD19-CAR-DNT细胞调整成1×106～4×106个细胞/ml的浓度，依据细胞体积调整T175培养瓶或者2L培养袋继续培养。
第10～14天视需要，收获CD19-CAR-DNT细胞。
在培养扩增不同时间点以及培养结束时检测转导效率(CAR-DNT细胞阳性率)、CAR-DNT细胞纯度、细胞存活率以及细胞杀瘤活性。
1.6收获CD19-CAR-DNT细胞制成细胞制剂
第10～14天，视实验需要收获CD19-CAR-DNT细胞。用250ml尖底离心瓶收集细胞，900×g离心10分钟，再以溶媒洗涤。将收集到的CD19-CAR-DNT细胞用CS5/CS10冻存液调整为0.1～1×108个细胞/ml的浓度，经程序降温仪梯度降温后，于-196℃液氮中储存，此为CD19-CAR-DNT细胞制剂成品。样品质检合格后可供临床使用。
1.7CD19-CAR-DNT细胞功能检测
在培养扩增的不同时间或培养结束时检测转导效率(CD19-CAR阳性率)、CD19-CAR-DNT细胞纯度、细胞存活率和细胞杀瘤活性。
实验结果如图2A-2F，表1所示。其中，
(1)通过AO/PI染色方法检测个3供者体外扩增第0、7、10和第14天CD19-CAR-DNT细胞存活率(图2A及表1)。
结果表明，第0、7、10和第14天，3供者CD19-CAR-DNT细胞的存活率分别为95.22±0.13％、85.13±2.3％、91.67±2.6％、88.83±9.39％。
(2)采用流式细胞仪检测3个供者来源CD19-CAR-DNT细胞在体外扩增第7、10和第14天时细胞纯度(CD3+％,CD3+CD4-CD8-％)变化曲线以及供者2第10天DNT细胞CD3+％和CD3+CD4-CD8-％流式图。结果如图2B以及表1所示。
结果显示，供者2体外扩增第10天获得的CD19-CAR-DNT细胞纯度：CD3+％为86.90％，CD3+CD4-CD8-％为94.80％。
(3)使用CD3/FMC63荧光标记抗体，采用流式细胞仪检测CD19-CAR-DNT细胞体外扩增第7、10和第14天转导阳性率如图2C以及表1所示。
结果表明，使用本发明专利中的转导方式体外扩增第7、10和第14天，3个供者CD19-CAR-DNT细胞转导阳性率分别为34.13±15.18％、54.30±10.19％、50.03±11.61％。3供者体外扩增第10天和第14天仍旧维持均值大于50％高阳性率。
表1
Figure BDA0003340376140000161
(4)使用CD45RA/CD62L荧光标记抗体，采用流式细胞仪检测供者2体外扩增第7、10第14天时Tscm/Tcm/Tem/Teff细胞的比例(图2D)以及第10天Tscm/Tcm/Tem/Teff(Tscm＝CD45RA+/CD62L+、Tcm＝CD45RA-/CD62L+、Tem＝CD45RA-/CD62L-、Tem＝CD45RA+/CD62L-)细胞分化流式图(Tscm＝25.90％，Tcm＝33.00％，Tem＝31.00％，Teff10.00％)。使用本专利扩增方法获得CD19-CAR-DNT细胞具有较高比例的Tscm和Tcm细胞以及较低比列的Teff细胞，因此具有更强的自我更新、分化和长久存活能力，可使CD19-CAR-DNT细胞在体内长时间存在，起到长效抗肿瘤作用。
(5)采用RTCA方法(通过特殊工艺将微电子细胞传感器芯片整合到细胞检测板的底部，用以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化等改变的细胞阻抗检测传感系统)检测CD19-CAR-DNT细胞对Hela以及Hela-CD19细胞的实时杀伤曲线(图2E)。
与Hela细胞相比，3个供者来源CD19-CAR-DNT细胞在体外扩增第10天时对Hela-CD19细胞(CD19阳性的模式细胞)具有特异性的杀瘤活性(效靶比1:1)，两者间具有极显著差异。
(6)采用PKH-26标记Raji/K562细胞株后与体外扩增第10天的CD19-CAR-DNT细胞体外共孵育3小时(效靶比4:1)，采用流式细胞仪检测3个供者来源的体外扩增第10天CD19-CAR-DNT细胞对Raji细胞(Raji为CD19阳性的肿瘤细胞株)和K562细胞(CD19阴性的肿瘤细胞株)的杀瘤活性。结果表明，CD19-CAR-DNT细胞对Raji细胞表现为特异性的杀瘤活性，与杀伤K562细胞相比具有极显著差异(图2F)。
实施例2
从2名健康捐赠者收集20～200ml外周血放至含肝素钠管中。
2.1健康捐赠者DNT细胞富集
与实施例1中1.1方法一致。
2.2DNT细胞的复苏与激活
冻存的DNT细胞由液氮中取出，37℃水浴锅中进行复苏，3分钟内完成复苏。复苏的DNT细胞以Aly505培养基洗涤1次，用抗人CD3单克隆抗体(10μg/ml)包被T25培养瓶，用DNT细胞专用无血清培养基(GT551基础培养基添加3μg/ml的重组人转铁蛋白，3μg/ml重组人胰岛素，70μg/ml的抗坏血酸，2μg/ml的乙醇胺，0.5μg/ml的亚油酸，0.5μg/ml的油酸)添加20％(v/v)ICSR和1000IU/ml的重组人白介素2，调整成1×106～4×106个细胞/ml的浓度，放入前述包被好的T25培养瓶中，5％CO2培养箱中培养。
2.3体外扩增富含Tscm特征的DNT细胞
第3-4天，用DNT细胞专用无血清培养基(GT551基础培养基添加3μg/ml的重组人转铁蛋白，3μg/ml重组人胰岛素，70μg/ml的抗坏血酸，2μg/ml的乙醇胺，0.5μg/ml的亚油酸，0.5μg/ml的油酸)添加20％ICSR(v/v)和1000IU/ml的重组人白介素2，5ng/ml重组人白介素1β，3ng/ml重组人白介素21，将DNT细胞调整成1×106～4×106个细胞/ml的浓度，据细胞体积调整为T75培养瓶或者T175培养瓶继续培养。
2.4体外高效转导MSLN-CAR-DNT细胞
第5天，体外富集到高纯度DNT时，加入MOI＝10的MSLN-CAR慢病毒转导，转导过程不添加转导辅助阳离子试剂，同时也不采用对细胞有损伤的机械离心的方式。
2.5体外扩增MSLN-CAR-DNT细胞
第7-14天，用MSLN-CAR-DNT细胞专用无血清培养基(GT551培养基添加8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，50μg/ml的抗坏血酸，1μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，1μg/ml的油酸)，添加1000IU/ml的重组人白介素2，5ng/ml重组人白介素7，5ng/ml重组人白介素15，将MSLN-CAR-DNT细胞调整成1×106～4×106个细胞/ml的浓度依据细胞体积调整T175培养瓶或者2L培养袋继续培养。
第10～14天视实验需要，收获MSLN-CAR-DNT细胞。
在培养扩增过程中以及培养结束时检测转导效率(MSLN阳性率)、MSLN-CAR-DNT细胞纯度、细胞存活率和细胞杀瘤活性。
2.6收获MSLN-CAR-DNT细胞制成细胞制剂
第10～14天，视实验需要，收获MSLN-CAR-DNT细胞。用250ml尖底离心瓶收集细胞，900×g离心10分钟，再以溶媒洗涤。将收集到的MSLN-CAR-DNT细胞用CS5/CS10冻存液调整为0.1～1×108个细胞/ml的浓度，经程序降温仪梯度降温后，于-196℃液氮中储存，此为MSLN-CAR-DNT细胞制剂成品，样品质检合格后可供临床使用。
2.7MSLN-CAR-DNT细胞功能检测
在培养扩增的不同时间点或培养结束时检测转导效率(MSLN阳性率)、MSLN-CAR-DNT细胞纯度、细胞存活率和细胞杀瘤活性。
实验结果如图3A-3E，表2所示。其中，
(1)通过AO/PI染色方法检测2个供者体外扩增第0、7、10和第14天MSLN-CAR-DNT细胞存活率(图3A及表2)。
结果表明，3供者来源的MSLN-CAR-DNT细胞在培养第0、7、9和第10天时的存活率分别为97.03±1.24％、81.80±6.51％、86.10±3.54％、89.05±10.54％。
(2)采用流式细胞仪检测2供者来源体外扩增MSLN-CAR-DNT细胞第7天和第9天时DNT细胞纯度(CD3+％,CD3+CD4-CD8-％)变化曲线以及供者1第9天DNT细胞CD3+％和CD3+CD4-CD8-％流式图。结果如图3B以及表2所示。
结果显示，供者1体外扩增第9天获得的MSLN-CAR-DNT细胞纯度：CD3+％为88.60％，CD3+CD4-CD8-％为97.50％。
(3)使用CD3/MSLN荧光标记抗体，采用流式细胞仪检测MSLN-CAR-DNT细胞体外扩增第7天和第9天时转导阳性率如图3C以及表2所示。
结果表明，使用本发明专利中的转导方式，体外扩增第7天和第9天，2个供者MSLN-CAR-DNT细胞转导阳性率分别为40.80±9.76％、44.70±11.03％。2供者体外扩增第9天仍旧维持比较高CAR阳性率，均值大于40％。
表2
Figure BDA0003340376140000191
(4)采用RTCA方法检测MSLN-CAR-DNT细胞对AGS细胞株(MSLN阳性的胃癌细胞株)的实时杀伤曲线以及与AGS细胞株共孵育20小时后采用ELISA法检测培养上清中IFNγ释放量(图3D)。
从实时杀瘤曲线可知，2个供者体外扩增第10天时MSLN-CAR-DNT细胞对AGS细胞表现为显著的杀瘤活性(效靶比1:1)。
(5)采用RTCA方法检测MSLN-CAR-DNT细胞对SK-OV3细胞株(MSLN阳性的卵巢癌细胞株)的实时杀伤曲线以及与SK-OV3细胞株共孵育20小时后，采用ELISA法检测培养上清中IFNγ释放量(图3E)。
从实时杀瘤曲线可知，2个供者体外扩增第10天时MSLN-CAR-DNT细胞对SK-OV3细胞表现为显著的杀瘤活性(效靶比2.5:1)。
对比例1：
从2名健康捐赠者收集20～200ml外周血放至含肝素钠管中。
3.1健康捐赠者DNT细胞富集
与实施例1中1.1方法一致。
3.2DNT细胞的复苏以及激活
与实施例1中1.2方法一致。
3.3体外扩增富含Tscm特征的DNT细胞
与实施例1中1.3方法一致。
3.4体外转导DNT细胞
第5天，体外富集到高纯度DNT，采用添加助转导试剂和不添加转导试剂进行DNT细胞的转导对比实验。
3.4.1不添加转导辅助阳离子试剂转导
加入MOI＝5的CD19-CAR慢病毒转导，转导过程不添加转导辅助阳离子试剂，同时也不采用对细胞有损伤的机械离心的方式。
3.4.2添加转导辅助阳离子试剂转导
加入10μg/ml DEAE助转导试剂和MOI＝5的CD19-CAR慢病毒一起进行DNT细胞转导。
3.5体外扩增CD19-CAR-DNT细胞
与实施例1中1.5方法一致。
3.6收获CD19-CAR-DNT细胞制成细胞制剂
与实施例1中1.6方法一致。
3.7添加与不添加阳离子转导试剂转导DNT细胞获得的CAR-DNT细胞功能比较：
实验结果如图4A-4F所示。
其中，在培养扩增的过程中或培养结束时检测转导效率(CD19阳性率)、细胞杀瘤活性、DNT细胞纯度和细胞增殖倍数。
(1)用AO/PI染色方法检测2个供者不同的转导工艺转导DNT细胞，体外扩增第7天、第9天、第11天CD19-CAR-DNT细胞的增殖曲线以及细胞存活率变化曲线(n＝2)(图4A)。
结果表明，2种转导工艺对CD19-CAR-DNT细胞的增殖以及细胞存活率无明显影响。
(2)用CD3/CD4/CD8荧光标记抗体，采用流式细胞仪检测2个供者不同的转导工艺转导DNT细胞后体外扩增第7天、第9天、第11天DNT细胞纯度(CD3+％,CD3+CD4-CD8-％)(n＝2)。
图4B表明2种转导工艺对DNT细胞的纯度无明显影响。
(3)使用CD3/FMC63荧光标记抗体，采用流式细胞仪检测2个供者不同的转导工艺转导DNT细胞后体外扩增第7、9和第11天时CD19-CAR-DNT细胞转导阳性率如图4C所示。
结果表明，两种转导工艺制备的CD19-CAR-DNT细胞体外扩增第7、9和第11天时转导阳性率之间无明显差异，未添加转导试剂组的CAR阳性率略高。
(4)用CD45RA/CD62L荧光标记抗体，采用流式细胞仪检测2个供者采用不同的转导工艺转导DNT细胞后体外扩增第9天Tscm/Tcm/Tem/Teff细胞分化比例(n＝2)。
图4D显示，2种转导工艺对CD19-CAR-DNT细胞分化无显著影响。
使用本专利的扩增工艺在体外扩增第9天时获得CD19-CAR-DNT细胞具有较高比例的Tscm和Tcm细胞(Tscm比例高达60以上)以及较低的Teff比例，提示这些细胞具有更强的自我更新、分化和长久存活能力，可使CD19-CAR-DNT细胞在体内长时间存在，起到长效抗肿瘤作用。
(5)采用RTCA方法检测2个供者体外扩增第8天时CD19-CAR-DNT细胞对Hela-CD19细胞的实时杀伤曲线(效靶比1:1)以及共孵育20小时的杀瘤活性(图4E)。
结果表明，2种转导工艺对CD19-CAR-DNT细胞的杀瘤活性无明显差别。
(6)2供者体外扩增第8天CD19-CAR-DNT细胞与Hela-CD19细胞共孵育20小时(效靶比1：1)时采用ELISA法检测培养上清中IFNγ的释放量(图4F)。
结果表明，2种转导工艺对CD19-CAR-DNT细胞与Hela-CD19细胞共孵育后上清中IFNγ的释放量无明显影响。
综上，与添加阳离子转导试剂的工艺相比，采用不添加转导试剂的工艺转导DNT细胞后体外扩增获得的CD19-CAR-DNT细胞在细胞增殖、细胞存活率、CAR细胞阳性率、细胞纯度以及杀瘤活性方面无明显差异，因此采用本发明方法的转导工艺避免了CAR-DNT细胞生产中添加阳离子转导试剂带来的高残留隐患，使CAR-DNT细胞产品的临床应用更加安全可靠。
对比例2
4.1健康捐赠者DNT细胞富集
从1名健康捐赠者收集20～200ml外周血到含肝素钠管中。利用
Figure BDA0003340376140000211
试剂盒(Stem Cell Technologies Inc)，去除CD4+、CD8+ T细胞，或者利用CD4磁珠/CD8磁珠去除CD4+、CD8+ T细胞，如此获得的细胞即为去除CD4+与CD8+的DNT细胞，将其中富集的一半的DNT细胞直接用于1.2步骤的DNT细胞的激活。
剩余的一半按照5×106个细胞/ml浓度使用程序降温仪梯度降温后放入-196℃液氮中冻存备用。
4.2新鲜DNT细胞的激活、转导以及扩增
4.2.1DNT细胞的激活
将新鲜制备的DNT细胞以Aly505培养基洗涤1次，用抗人CD3单克隆抗体(10μg/ml)包被T25培养瓶，用DNT细胞专用无血清培养基(GT551培养基添加8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，30μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，1μg/ml的油酸)添加10％ICSR(v/v)和500IU/ml的重组人白介素2，调整成1×106～4×106个细胞/ml的浓度，放入前述包被好的T25培养瓶中，5％CO2培养箱中培养。
4.2.2体外扩增DNT细胞
第3-4天，用DNT细胞专用无血清培养基(GT551培养基添加8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，30μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，1μg/ml的油酸)添加10％ICSR(v/v)和500IU/ml的重组人白介素2，2ng/ml重组人白介素1β，5ng/ml重组人白介素21，将DNT细胞调整成1×106～4×106个细胞/ml的浓度，跟据细胞体积调整为T75培养瓶或者T175培养瓶继续培养。
4.2.3体外高效转导DNT细胞
第5天，将MOI＝5的CD19-CAR慢病毒转导至体外培养的DNT细胞，该转导过程不添加转导辅助阳离子试剂，同时也不采用对细胞有损伤的机械离心的方式。
4.2.4体外扩增CD19-CAR-DNT细胞
第7-14天，用CD19-CAR-DNT细胞专用无血清培养基(GT551培养基添加5μg/ml的重组人转铁蛋白，5μg/ml重组人胰岛素，50μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，1μg/ml的油酸)添加10％ICSR(v/v)和500IU/ml的重组人白介素2，5ng/ml重组人白介素7，5ng/ml重组人白介素12，将CD19-CAR-DNT细胞调整成1×106～4×106个细胞/ml的浓度，依据细胞体积调整T175培养瓶或者2L培养袋继续培养。
第10～14天视实验需要，收获CD19-CAR-DNT细胞。
4.2.5收获CD19-CAR-DNT细胞制成细胞制剂
第10～14天，视实验需要，收获CD19-CAR-DNT细胞。用250ml尖底离心瓶收集细胞，900×g离心10分钟，再以溶媒洗涤。将收集到的CD19-CAR-DNT细胞用CS5/CS10冻存液调整为0.1～1×108个细胞/ml的浓度，经程序降温仪梯度降温后，于-196℃液氮中储存，此为CD19-CAR-DNT细胞制剂成品，质检合格后可供临床使用。
4.3冻存复苏DNT细胞的激活、转导以及扩增
4.3.1冻存复苏DNT细胞的激活
将冻存1个月后的DNT细胞从液氮罐中取出，37℃水浴锅中进行复苏，3分钟内完成复苏。复苏的DNT细胞以Aly505培养基(含250IU/ml的重组人白介素2)洗涤1次，用抗人CD3单克隆抗体(10μg/ml)包被T25培养瓶，用DNT细胞专用无血清培养基(GT551培养基添加8μg/ml的重组人转铁蛋白，8μg/ml重组人胰岛素，30μg/ml的抗坏血酸，1.5μg/ml的乙醇胺，1μg/ml的亚油酸，1μg/ml的油酸)添加10％ICSR和500IU/ml的重组人白介素2，调整成1×106～4×106个细胞/ml的浓度，放入前述包被好的T25培养瓶中，5％CO2培养箱中培养。
4.3.2体外扩增DNT细胞
与4.2.2方法一致。
4.3.3体外高效转导DNT细胞
与4.2.3方法一致。
4.3.4体外扩增CD19-CAR-DNT细胞
与4.2.4方法一致。
4.3.5收获CD19-CAR-DNT细胞制成细胞制剂
与4.2.5方法一致。
4.4新鲜与冻存复苏后DNT细胞转导扩增CD19-CAR-DNT细胞功能检测对比
在培养扩增的过程中或培养结束时，检测转导效率(CD19阳性率)、细胞存活率、DNT纯度和细胞杀瘤活性。
实验结果如图5A-5G，其中：
(1)转导新鲜或冻存复苏后DNT细胞并进行体外扩增，在第7天、第9天、第11天时采用AO/PI染色方法检测CD19-CAR-DNT细胞存活率变化曲线(图5A)。
结果表明，转导新鲜与冻存复苏DNT细胞后，体外扩增后获得的CD19-CAR-DNT细胞在细胞存活率上无明显差异。
(2)用CD3/CD4/CD8荧光标记抗体，采用流式细胞仪检测转导新鲜或冻存复苏DNT细胞体外扩增第7天、第9天、第11天时DNT细胞纯度(CD3+％和CD3+CD4-CD8-％)。
图5B表明，转导新鲜或冻存复苏DNT细胞后经体外扩增获得的CD19-CAR-DNT细胞在纯度上无明显差异。
(3)使用CD3/FMC63荧光标记抗体，采用流式细胞仪检测转导新鲜与冻存复苏DNT细胞后体外扩增第7、9和11天时CD19-CAR-DNT细胞转导阳性率如图5C所示。
结果表明，使用本发明专利中的转导工艺转导新鲜或冻存复苏DNT细胞后在体外扩增第7、9和11天时，采用流式细胞仪检测CD19-CAR-DNT转导阳性细胞比例无显著差异。
(4)采用CD45RA/CD62L荧光标记抗体，采用流式细胞仪检测转导新鲜或冻存复苏后DNT细胞在体外扩增第9天时CD19-CAR-DNT细胞群体中Tscm/Tcm/Tem/Teff细胞分化比例。
图5D结果表明，转导新鲜或冻存复苏DNT细胞，经体外扩增获得的CD19-CAR-DNT细胞群体在细胞分化比列上无明显差异。
体外扩增第9天时获得CD19-CAR-DNT细胞具有较高比例的Tscm和Tcm细胞以及较低比列的Teff细胞，由此制备的CAR-DNT细胞具有更强的自我更新、分化和长久存活能力，可使CD19-CAR-DNT细胞在体内长时间存在，起到长效抗肿瘤作用。
(5)转导新鲜或冻存复苏DNT细胞后，在体外扩增第8天时，采用RTCA方法检测CD19-CAR-DNT细胞对Hela-CD19细胞在效靶比为1:1条件下的实时杀伤曲线(图5E)。
结果表明，使用新鲜或冻存复苏后DNT细胞在体外扩增第8天时CD19-CAR-DNT细胞对肿瘤细胞的杀瘤活性无明显差异。
(6)转导新鲜或冻存复苏DNT细胞在体外扩增第10天的CD19-CAR-DNT细胞与PKH-26标记的Raji细胞株在效靶比为4:1条件下共孵育3小时，采用流式细胞仪检测对Raji肿瘤细胞的杀瘤活性(图5F)并采用ELISA方法检测CD19-CAR-DNT细胞与Raji细胞株在体外共孵育3小时后培养上清中INFγ的释放量(图5G)。
结果表明，采用转导新鲜或冻存复苏DNT细胞经体外扩增第10天的CD19-CAR-DNT细胞在杀瘤活性以及共培养上清中INFγ释放量方面无明显差异。
综上，转导新鲜或冻存复苏DNT细胞后经体外扩增获得的CD19-CAR-DNT细胞在细胞增殖、细胞存活率、CAR细胞阳性率、细胞纯度以及杀瘤活性间无明显差异；因此采用本专利的扩增以及转导工艺既可以转导新鲜纯化的DNT细胞，也可以转导经过冻存后复苏的DNT细胞，使得CAR-DNT细胞的生产时间更具灵活性，可更便捷的安排细胞生产时间以适应产品供应需求。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种体外转导双阴性T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(i)提供未激活的双阴性T细胞(DNT)；
(ii)在抗人CD3单克隆抗体存在的条件下，使用第一培养基培养所述未激活的双阴性T细胞，从而获得激活的双阴性T细胞；其中，所述抗人CD3单克隆抗体被固化在介质上；
(iii)使用第二培养基扩增培养所述激活的双阴性T细胞，从而获得经扩增的双阴性T细胞；和
(iv)在不添加转导辅助阳离子试剂的条件下，用MOI为1-15的慢病毒载体转导经扩增的双阴性T细胞，从而获得经转导的双阴性T细胞；其中，所述慢病毒载体载有外源性基因序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未激活的双阴性T细胞选自下组：新鲜分离的双阴性T细胞、冻存后复苏的双阴性T细胞、或其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养基包含以下组分：无血清培养基、2％-30％ICSR(Immune Cell Serum Replacement)(v/v)、和500-1000IU/ml的重组人白介素2；所述百分比按第一培养基的总体积计。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培养基包含以下组分：无血清培养基、2％-30％ICSR(v/v)和维持富含Tscm特征的DNT细胞的细胞因子；所述百分比按第二培养基的总体积计。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(iv)中，转导时经扩增的双阴性T细胞的细胞密度为1×106-4×106个细胞/ml。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(iv)中，所述外源性基因序列为编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列，
所述嵌合抗原受体(CAR)选自下组：CD19、Mesothelin(MSLN)、CD5、CD7、CD20、CD22、CD33、CD123、BCMA、IM19、GPC-3、Claudin18.2、NY-ESO-1、GD2、EGFR、HER2、MUC1、PSMA、或其组合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：
(v)使用第三培养基扩增培养所述经转导的双阴性T细胞，并将收获的双阴性T细胞制备为可供临床使用的双阴性T细胞制剂。
8.一种负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞，其特征在于，所述细胞由权利要求1所述的方法制备得到。
9.一种嵌合抗原受体-双阴性T细胞制剂，其特征在于，所述制剂包括：(a)如权利要求8所述的负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞；和(b)药学上可接受的载体。
10.一种如权利要求8所述的细胞或如权利要求9所述的制剂的用途，其特征在于，用于制备用于预防肿瘤复发和/或治疗肿瘤的药物。
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