BR112020005938A2

BR112020005938A2 - célula imune ou população de células imunes da mesma, célula efetora imune ou célula-tronco, célula que apresenta antígeno, polinucleotídeo recombinante, vetor, composição que compreende uma célula imune efetora ou uma célula-tronco, métodos para produzir uma célula efetora imune que expressa receptor imune de ocorrência não natural, para gerar uma população de células manipuladas por rna, para fornecer imunidade antidoença em um indivíduo, para tratar ou prevenir uma doença associada à expressão de um antígeno, e, uso

Info

Publication number: BR112020005938A2
Application number: BR112020005938-2A
Authority: BR
Inventors: Preet M. Chaudhary
Original assignee: University Of Southern California
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2020-11-17
Also published as: CN111629734A; US20230140802A1; JP2021500861A; KR20200071079A; WO2019067805A1; CA3075806A1; IL273201A; EP3687553A1; ZA202002046B; EA202090839A1; MX2020004185A; ZA202205717B; SG11202002321YA; EP3687553A4; AU2018338647A1; JP2023145589A

Abstract

A divulgação fornece composições e um método que promovem terapia celular adotiva. A divulgação fornece polinucleotídeos, vetores, sistemas e células que compreendem receptores de antígeno quiméricos (CARs), receptores imunes sintéticos (SIRs) e semelhantes em combinação com ativadores específicos da atividade de NFkB, assim melhorando a proliferação celular, expressão e apoptose reduzida, o que melhora a persistência de célula na terapia celular adotiva.

Description

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CÉLULA IMUNE OU POPULAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES DA MESMA, CÉLULA EFETORA IMUNE OU CÉLULA-TRONCO, CÉLULA QUE APRESENTA ANTÍGENO, POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, VETOR, COMPOSIÇÃO QUE COMPREENDE UMA CÉLULA IMUNE EFETORA OU UMA CÉLULA-TRONCO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA CÉLULA EFETORA IMUNE QUE EXPRESSA RECEPTOR IMUNE DE OCORRÊNCIA NÃO NATURAL, PARA GERAR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS MANIPULADAS POR RNA, PARA FORNECER IMUNIDADE ANTIDOENÇA EM UM INDIVÍDUO, PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENÇA ASSOCIADA À EXPRESSÃO DE UM ANTÍGENO, E, USO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O pedido reivindica o benefício disposto no Título 35 do USC § 119(e) do pedido provisório de Número de Série US 62/564.249, depositado em 27 de setembro de 2017, cujas divulgações são incorporadas ao presente documento a título de referência.

CAMPO DA TÉCNICA

[002] São fornecidos neste documento módulos inovadores coestimulantes e receptores de antígeno quiméricos inovadores para terapias celulares adotivas de câncer, infecção, distúrbios alérgicos, degenerativos e imunológicos.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] Acompanhando este depósito é uma Listagem de Sequências intitulada “Sequence_ST25.txt”, criada em 27 setembro de 2018 e com

60.347.260 bytes de dados, formatados em máquina em um IBM-PC, com sistema operacional Windows-MS. A listagem de sequências é incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade para todos os fins.

ANTECEDENTES

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[004] A imunoterapia adotiva de células T tomou a frente das abordagens de tratamento do câncer. As células T podem ser manipuladas geneticamente para expressar os genes de receptores de antígeno quiméricos (CARs) que reconhecem antígenos associados a tumores. Os CARs são receptores imunes manipulados geneticamente, que podem redirecionar as células T para matar seletivamente as células tumorais. A premissa geral para seu uso na imunoterapia contra o câncer é gerar rapidamente células T direcionadas a tumores, ultrapassando as barreiras e a cinética incremental da imunização ativa e, assim, agir como “fármacos vivas”. Ao contrário do receptor fisiológico de células T (TCR), que envolve complexos de peptídeo HLA, os CARs envolvem moléculas que não exigem que o processamento peptídico ou a expressão de HLA sejam reconhecidos. Os CARs, portanto, reconhecem o antígeno em qualquer histórico de HLA, em contrapartida a TCRs, que precisam corresponder ao haplótipo do paciente. Além disso, os CARs podem ter como alvo células tumorais que têm expressão de HLA regulado decrescentemente ou processamento de antígeno proteassomal, dois mecanismos que contribuem para a fuga de tumores da imunidade mediada por TCR. Outra característica da ampla aplicabilidade dos CARs é sua capacidade de se ligar não apenas a proteínas, mas também a estruturas de carboidratos e glicolipídeos, expandindo novamente o leque de alvos em potencial.

SUMÁRIO

[005] A divulgação fornece uma célula imune ou uma população de células imunes expressando (i) pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e (ii) pelo menos um agente de ocorrência não natural que ativa seletivamente a via de sinalização de NF-κB. Em uma modalidade, o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno e pelo menos um domínio transmembranar. Em outra ou em uma outra modalidade, o pelo menos um

3 / 348 receptor imune de ocorrência não natural é capaz de recrutar pelo menos um módulo de sinalização associado ao TCR.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um TCR recombinante.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um domínio de ligação ao antígeno do pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural se liga a um antígeno selecionado a partir de um grupo que consiste em CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (também denominado subconjunto CD2 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα-Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor órfão de tipo tirosina-quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expresso em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina-13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-11Ra); antígeno de célula-tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor alfa de folato (FRa ou FR1); Receptor beta de folato (FRb); Receptor tirosina-proteína quinase ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1);

4 / 348 receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade Proteassoma (Prosome, Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2- 3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o-acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR-1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro 1A (XAGEl);

5 / 348 receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; proteína; survivina; telomerase; antígeno 1 do tumor de carcinoma de próstata (PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil-glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY- TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de domínio de lectina de tipo C (CLEC12A);

6 / 348 antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGL11), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGL11, TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM-CSFR-alfa), TGFbetaR2, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR-beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina (CGHR ou GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), autoanticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, Claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A.2), Glicoproteína p, STEAP1, Liv1, Nectin-4, Cripto, gpA33, BST1/CD157, canal de cloreto de baixa condutância e um antígeno reconhecido por anticorpo TNT.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um agente de ocorrência não natural capaz de ativar seletivamente a via de NF-κB é selecionado a partir do grupo que consiste em vFLIP K13, K13-opt, um mutante NEMO, uma proteína de fusão NEMO, IKK1-S176E-S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, IKKα, IKKβ, Tcl-1, MyD88-L265, qualquer proteína ou fragmento de proteína de ativação de NF-κB, qualquer inibidor de um inibidor de via NF-κB, qualquer sistema de edição de genes com capacidade para ativar seletivamente NF-κB,

7 / 348 qualquer homólogo ou variante do mesmo e qualquer combinação dos mesmos.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é de origem não viral.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar a via de NF-κB é um sistema de edição de gene.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB induz a oligomerização de NEMO/IKKγ.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB induz a ativação do complexo IKK.

Em outra ou em outra modalidade, o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB não ativa a via de AKT.

Em outra ou em outra modalidade, o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF- κB é expresso de maneira constitutiva ou induzível.

Em outra ou em outra modalidade, o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é expresso de modo transiente.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é expresso de modo estável.

Em outra ou em outra modalidade, a atividade do pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é controlada com pós- tradução através do contato da célula com um composto.

Em outra ou em outra modalidade, o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é expresso como um construto de fusão com uma ou mais cópias de um domínio de troca.

Em outra ou em outra modalidade, a atividade do pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-

8 / 348 κB é controlada no nível pós-tradução por administração de quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que induz à dimerização do domínio de troca.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o domínio de troca compreende uma ou mais cópias de um domínio FKBP12. Em outra ou em uma modalidade adicional, o composto é AP20187 ou Rimiducid ou um homólogo do mesmo.

Em outra ou em uma modalidade adicional, a célula imune é um linfócito T (célula T), uma célula CAR-T, uma célula T que expressa TCR, um linfócito infiltrado no tumor (TIL), um linfócito residente de tecido, uma célula-tronco, uma célula-tronco pluripotente induzida ou uma célula Exterminadora Natural (NK). Em outra ou em uma modalidade adicional, a célula imune tem sido manipulada geneticamente para não ter um complexo de sinalização de receptor de célula T (TCR) nativo funcional e/ou microglobulina β2. Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e/ou o pelo menos um agente com capacidade para ativar seletivamente a via de sinalização de NF-κB são clonados em um gene de TCR endógeno, de modo que a expressão de pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e/ou pelo menos um agente com capacidade para ativar seletivamente a via de sinalização de NF- κB esteja sob controle dos elementos reguladores endógenos/promotor para o gene de TCR.

A divulgação também fornece o uso de uma célula imune ou população de células imunitárias, como descrito neste documento, que é usada para a prevenção e tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo de um câncer, doenças infecciosas, doenças imunes e doenças alérgicas.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um polinucleotídeo codifica o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB são expressos a partir de um promotor único.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um polinucleotídeo que codifica o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e o

9 / 348 pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB são expressos com o uso de dois ou mais promotores separados. Em outra ou em outra modalidade, o pelo menos um polinucleotídeo compreende uma primeira sequência de codificação de ácido nucleico que codifica o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural separada de uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica o agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente NF-κB, de modo que, mediante expressão da primeira e segunda sequências de codificação de ácido nucleico, o receptor imune de ocorrência não natural e o agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente NF-κB não estejam fisicamente ou quimicamente ligados. Em outra ou em uma modalidade adicional, o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e/ou o pelo menos um agente com capacidade para ativar seletivamente o polinucleotídeo de codificação de NF-κB (ou polinucleotídeos de codificação de NF-κB) são clonados em um gene de TCR endógeno, de modo que o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e/ou pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente NF-κB estejam sob controle dos elementos reguladores endógenos/promotor para o gene de TCR. Em outra ou em uma modalidade adicional, uma ou mais cadeias constantes dos genes TCR são funcionalmente re-expressas.

[006] A divulgação também fornece pelo menos um polinucleotídeo recombinante que codifica pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural, sendo que o pelo menos um polinucleotídeo recombinante compreende (a) um primeiro domínio de ácido nucleico que codifica um domínio transmembranar parcial ou total e/ou citoplasmático e, opcionalmente, o domínio extracelular de uma proteína endógena, em que a proteína endógena é expressa na superfície de linfócitos e desencadeia a ativação e/ou proliferação do linfócito; (b) opcionalmente, um polinucleotídeo

10 / 348 um ligante; (c) um segundo domínio de ácido nucleico operacionalmente ligado ao primeiro domínio de ácido nucleico, em que o segundo domínio de ácido nucleico codifica um ou mais domínios de ligação ao antígeno de TCR não natural; (d) um terceiro domínio de ácido nucleico opcional que codifica um domínio coestimulante; e (e) um domínio de ácido nucleico adicional opcional que codifica um módulo acessório.

[007] A divulgação também fornece pelo menos um polinucleotídeo recombinante que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica um receptor imune de ocorrência não natural; e um segundo ácido nucleico que codifica um módulo acessório que compreende um ativador seletivo de NF- κB. Em uma modalidade, o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico são separados por um ligante de oligonucleotídeo que codifica um ligante de peptídeo clivável. Em outra modalidade, o pelo menos um compreende dois polinucleotídeos recombinantes, de modo que o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico sejam expressos a partir de vetores separados. Em outra ou em uma outra modalidade, o ativador de NF-κB seletivo é um ativador de NF-κB seletivo de ocorrência não natural. Em outra ou em uma outra modalidade, o receptor imune de ocorrência não natural é selecionado a partir do grupo que consiste em um CAR, um Ab-TCR, um TFP, um cTCR, um SIR e um TCR recombinante. Em outra ou em outra modalidade, o receptor imune de ocorrência não natural compreende (i) um domínio específico de antígeno extracelular, (ii) um domínio transmembranar, e (iii) um domínio de sinalização intracelular opcional que compreende um motivo de ativação com base em tirosina de imunorreceptor (ITAM), em que (iii) está localizado no terminal C do receptor imune de ocorrência não natural. Em outra ou em uma outra modalidade, mediante expressão da primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos, o receptor imune de ocorrência não natural e o polipeptídeo de ativador de NF-κB seletivo não são fisicamente ou quimicamente ligados. Em outra ou em uma outra modalidade,

11 / 348 o domínio específico de antígeno extracelular se liga a qualquer um ou mais dentre CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (também denominado subconjunto CD2 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2- 3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα- Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor órfão de tipo tirosina-quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expresso em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina- 13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-11Ra); antígeno de célula-tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor alfa de folato (FRa ou FR1); Receptor beta de folato (FRb); Receptor tirosina-proteína quinase ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1); complexo AFP/MHC; receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade

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Proteassoma (Prosome, Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o- acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR- 1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1); complexo de WT1/MHC I; Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); complexo de NY-ESO-1/MHC I; Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro 1A (XAGEl); receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; proteína; survivina; telomerase; antígeno 1

13 / 348 do tumor de carcinoma de próstata (PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil-glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY- TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); complexo de HPV E6/MHC I; vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); complexo de HPV E7/MHC I; complexo de AFP/MHC I; complexo de Ras/MHC I; carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de domínio de lectina de tipo C (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3

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(GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGL11), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGL11, TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM-CSFR-alfa), TGFbetaR2, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR- beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina (CGHR ou GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), autoanticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, Claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A2), Glicoproteína p, STEAP1, Liv1, Nectin-4, Cripto, gpA33, BST1/CD157, canal de cloreto de baixa condutância e um antígeno reconhecido por anticorpo TNT.

Em outra ou em uma modalidade adicional, o ativador de NF-κB seletivo é selecionado a partir do grupo que consiste em vFLIP K13, um mutante NEMO, uma proteína de fusão NEMO, IKK1-S176E-S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, FKBPx2-RIP-ID, IKK1, FKBPx2-IKKa, IKK2, FKBPx2-IKK2, Tcl-1, MyD88-L265, qualquer proteína ou fragmento de proteína de ativação de NF- κB, qualquer inibidor de um inibidor de via NF-κB, um sistema de edição de genes com capacidade para ativar seletivamente NF-κB, um sistema de interferência de RNA que ativa seletivamente NF-κB e qualquer combinação dos mesmos.

Em outra ou em uma outra modalidade, o ativador de NF-κB seletivo é expresso como um construto de fusão com uma ou mais cópias de

15 / 348 domínio FKBP. Em outra ou em uma outra modalidade, o domínio específico de antígeno extracelular é selecionado a partir do grupo que consiste em: a região variável da cadeia pesada (vH) de um anticorpo ou um fragmento do mesmo específico para um antígeno alvo predefinido; a região variável da cadeia leve (vL) de um anticorpo ou um fragmento do mesmo específico para um antígeno alvo predefinido; - um fragmento variável de cadeia simples (scFv) ou um fragmento do mesmo específico para um antígeno alvo predefinido; um fragmento de anticorpo (por exemplo, Fv, um Fab, um (Fab')2) específico para um antígeno alvo predefinido; um fragmento de anticorpo de domínio único (SDAB) específico para um antígeno alvo predefinido; um domínio vHH camelídeo específico para um antígeno alvo predefinido; arcabouços de ligação ao antígeno não imunoglobulina específicos para um antígeno alvo predefinido; um receptor específico ou um fragmento do mesmo para um antígeno alvo predefinido; um ligante ou um fragmento do mesmo específico para um antígeno alvo predefinido; um anticorpo biespecífico, -fragmento de anticorpo, -scFV, -vHH, -SDAB, - arcabouço de ligação ao antígeno não imunoglobulina, -receptor ou -ligante específico para um ou mais antígenos alvo predefinidos; e um autoantígeno ou um fragmento do mesmo.

[008] A divulgação também fornece pelo menos um vetor compreendendo pelo menos um polinucleotídeo de qualquer um dos construtos de polinucleotídeos descritos neste documento e acima. Em uma modalidade, o vetor é selecionado a partir do grupo que consiste em um vetor de DNA, um vetor de RNA, um plasmídeo, um vetor de lentivírus, vetor adenoviral, vetor de AAV, um vetor retroviral, um vetor de baculovírus, um vetor de transposão Bela Adormecida e um vetor de transposão piggybac.

[009] A divulgação também fornece uma célula efetora imune ou célula-tronco que compreende pelo menos um polinucleotídeo recombinante, construto ou vetor descrito neste documento e acima. Em uma modalidade, a

16 / 348 célula imune é uma célula que apresenta antígeno. Em outra ou em uma modalidade adicional, a célula efetora imune é uma célula T humana, uma célula NKT humana ou uma célula T sintética, célula NK ou uma célula- tronco que pode gerar uma célula efetora imune, opcionalmente, em que a célula T é deficiente em diaglicerol quinase (DGK) e/ou Ikaros e/ou Brd4.

[0010] A divulgação também fornece um método para (i) prolongar a vida útil de uma célula imune em expressão, (ii) estimular a proliferação de uma célula imune, (iii) estimular a produção de citocinas por uma célula imune, (iv) melhorar a apresentação de antígenos por uma célula imune, (v) proteger uma célula imune da apoptose, em que o método compreende a transfecção ou transformação das células imunes com um polinucleotídeo que codifica um ativador de NF-κB seletivo ou um polipeptídeo estimulante específico de NF-κB. Em uma modalidade, o ativador NF-κB seletivo ou um polipeptídeo estimulante específico de NF-κB é selecionado do grupo que consiste em vFLIP K13, K13-opt, um mutante NEMO, uma proteína de fusão NEMO, IKK1-S176E-S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, IKKα, IKKβ, Tcl-1, MyD88-L265, qualquer proteína de ativação de NF-κB ou fragmento de proteína, qualquer inibidor de um inibidor de via de NF-κB, qualquer homólogo ou variante do mesmo e qualquer combinação dos mesmos. Em outra ou em uma modalidade adicional, o ativador de seletivo ou polipeptídeo estimulante específico de NF-κB é expresso de uma maneira constitutiva ou induzível. Em outra ou em uma modalidade adicional, o ativador de NF-κB seletivo ou um polipeptídeo estimulante específico de NF-κB é controlado pós-tradução através do contato da célula T com um composto. Em outra ou em uma modalidade adicional, o ativador de NF-κB seletivo ou polipeptídeo estimulante específico de NF-κB é expresso como um construto de fusão com uma ou mais cópias de domínio FKBP. Em outra ou em uma modalidade adicional, a atividade do ativador de NF-κB seletivo ou um polipeptídeo estimulante específico de NF-κB é controlada no nível pós-tradução por

17 / 348 administração de quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que induz à dimerização do domínio de FKBP. Em outra ou em uma modalidade adicional, o composto é AP20187 ou Rimiducid.

[0011] A divulgação também fornece um método para produzir uma célula efetora imune que expressa receptor imune de ocorrência não natural que compreende a introdução de pelo menos um vetor ou pelo menos um polinucleotídeo recombinante em uma célula efetora ou em uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora que pode dar origem a uma célula efetora imune, sob condições tais que um receptor imune de ocorrência não natural seja expresso e a célula efetora imune compreenda (i) vida útil prolongada, (ii) proliferação de célula T melhorada e/ou (iii) apoptose reduzida em comparação com uma célula CAR-T que não tem um polipeptídeo estimulante específico de NFkB Em outra ou em uma outra modalidade, o método compreende adicionalmente fornecer uma população de células efetoras imunes; e remover células reguladoras T da população, assim fornecendo uma população de células esgotadas reguladoras T; em que as etapas são realizadas antes da introdução do vetor ou polinucleotídeo recombinante que codifica o polipeptídeo estimulante específico de CAR e/ou NFkB à população. Em outra ou em uma outra modalidade, as células reguladoras T são removidas da população de células com o uso de um anticorpo anti-CD25 ou um anticorpo anti-GITR. Em outra ou em uma outra modalidade, o método compreende adicionalmente a) fornecer uma população de células efetoras imunes; e b) enriquecer células positivas de glicoproteína P (P-gn ou Pgp; MDR1, ABCB1, CD243) da população, assim fornecendo uma população de células enriquecidas de glicoproteína P (P-gn ou Pgp; MDR1, ABCB1, CD243); em que as etapas a) e b) são realizadas antes ou após a introdução do vetor ou polinucleotídeo recombinante que codifica o polipeptídeo estimulante específico de CAR e/ou NFkB. Em outra ou em uma modalidade adicional, as células positivas de glicoproteína P são enriquecidas

18 / 348 com o uso de qualquer um ou mais dos métodos selecionados a partir do grupo que consiste em i) imunosseleção com o uso de um ou um coquetel de anticorpos específicos de glicoproteína P, ii) coloração com um ou mais corantes fluorescentes que são substratos de glicoproteína P, éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), adriamicina e actinomicina-D) sob condições nas quais a glicoproteína P é ativa como bomba e enriquecimento para células que mancham menos com o corante, iii) seleção de células que são resistentes a compostos fototóxicos que são substratos da glicoproteína P, como qualquer um ou mais de TH9402, cloridrato de éster metílico de ácido 2-(4,5-dibromo- 6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzoico, cloridrato de éster etílico de ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzoico, cloridrato de éster octílico 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzoico, cloridrato de éster n-butílico de ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H- xanten-9-il)-benzoico, cloridrato de éster n-butílico de ácido 2-(6-etil amino- 3-etil imino-3H-xanten-9-il)-benzoico, ou derivados dos mesmos ou combinações dos mesmos, e iv) seleção de células que são resistentes a compostos citotóxicos que são substratos de glicoproteína P, como vincristina, vinblastina, taxol, paclitaxel, mitoxantrona, etoposídeo, adriamicina, daunorrubicina e actinomicina-D.

[0012] A divulgação também fornece um método gerar uma população de células manipuladas geneticamente por RNA que compreende a introdução de RNA ou RNAs transcritos in vitro ou RNA ou RNAs sintéticos em uma célula ou população de células, em que o RNA ou RNAs compreendem um polinucleotídeo ou polinucleotídeos recombinantes da divulgação.

[0013] A divulgação também fornece um método fornecer imunidade antidoença em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da célula efetora imune ou uma célula-tronco que pode dar origem a uma célula efetora imune da revelação, em que a célula é uma célula

19 / 348 T autóloga ou uma célula T alogênica ou uma célula NKT autóloga ou uma célula NKT alogênica ou uma célula-tronco hematopoiética autóloga ou alogênica ou um iPSC autólogo ou alogênico que pode dar origem a uma célula efetora imune. Em outra ou em uma outra modalidade, a célula T alogênica ou célula NKT alogênica ou célula-tronco hematopoiética ou iPSC não tem expressão ou tem baixa expressão de um TCR funcional ou um HLA funcional.

[0014] A divulgação também fornece uma composição que compreende uma célula efetora imune ou uma célula-tronco que pode gerar células efetoras imunes que compreendem um receptor imune de ocorrência não natural e um ativador seletivo de NFkB, em que o dito antígeno associado à doença é selecionado de um grupo que consiste em: CD5, CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (também denominado subconjunto CD2 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα-Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor órfão de tipo tirosina-quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expresso em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina-13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-11Ra); antígeno de célula-tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento

20 / 348 endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor alfa de folato; Receptor tirosina-proteína quinase ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1); receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade Proteassoma (Prosome, Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); Fucosil GM1; molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1- 4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o-acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR-1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR

21 / 348 gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro 1A (XAGEl); receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; proteína; survivina; telomerase; antígeno 1 do tumor de carcinoma de próstata (PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil-glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY- TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2);

22 / 348 CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de domínio de lectina de tipo C (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGL11), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGL11, ALK TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM-CSFR- alfa), TGFbetaR2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR- beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina crônica (CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), proteína KSHV-K8.1, proteína KSHV-gH, autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), autoanticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA- DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A.2)), P- glicoproteína, STEAP1, LIV1, NECTIN-4, CRIPTO, GPA33, BST1/CD157, canal de cloreto de baixa condutância e antígeno reconhecido por anticorpo TNT.

[0015] A divulgação também fornece um método para tratar ou

23 / 348 prevenir uma doença associada à expressão de um antígeno associado à doença em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma célula efetora imune que compreende um receptor imune de ocorrência não natural e um ativador de NfkB seletivo, em que o receptor imune de ocorrência não natural compreende um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado à doença, em que o dito antígeno associado à doença é selecionado de um grupo que consiste em: CD5, CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (também denominado subconjunto CD2 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1- 1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα-Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor órfão de tipo tirosina- quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expresso em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina-13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-11Ra); antígeno de célula- tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR- beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor alfa de folato; Receptor tirosina-proteína quinase ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1); receptor de

24 / 348 fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade Proteassoma (Prosome, Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); Fucosil GM1; molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o- acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR- 1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6- AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro

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1A (XAGEl); receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; proteína; survivina; telomerase; antígeno 1 do tumor de carcinoma de próstata (PCT A- 1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N- acetil-glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY-TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de

26 / 348 domínio de lectina de tipo C (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGL11), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGL11, ALK TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM-CSFR-alfa), TGFbetaR2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR-beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina crônica (CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), proteína KSHV- K8.1, proteína KSHV-gH, autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), autoanticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A.2)), P-glicoproteína, STEAP1, LIV1, NECTIN-4, CRIPTO, GPA33, BST1/CD157, canal de cloreto de baixa condutância e antígeno reconhecido por anticorpo TNT, tratando, assim, o indivíduo ou prevenindo uma doença no indivíduo.

Em outra ou em uma outra modalidade, a doença associada à expressão do antígeno associado à doença é selecionada a partir do grupo que consiste em uma doença proliferativa, uma afecção pré-cancerosa, um câncer e uma indicação relacionada a não câncer associada à expressão do antígeno associado à doença.

Em outra ou em outra modalidade, o câncer é um câncer

27 / 348 hematológico escolhido a partir de uma ou mais entre leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemias agudas, leucemia linfoide aguda (LLA), leucemia linfoide aguda de células B (B-ALL), leucemia linfoide aguda de células T (T-ALL), leucemia mieloide crônica (LMC), leucemia prolinocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de efusão primária, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequenas ou grandes, afecções linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de célula dendrítica plasmacitoide, macroglobulinemia de Waldenstrom ou pré-leucemia.

Em outra ou uma modalidade adicional, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de cólon, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer de fígado, carcinoma de células não pequenas do pulmão, câncer de intestino delgado, câncer de esôfago, melanoma, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de testículo, câncer de útero, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer do glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasia do sistema nervoso central (CNS), linfoma primário do CNS, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma de tronco encefálico, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer de células de Merkel, câncer epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de células T, cânceres

28 / 348 induzidas por ambiente, combinações dos denominados cânceres e lesões metastáticas dos ditos cânceres. Em outra ou em outra modalidade, a doença está associada à infecção por um vírus, incluindo, mas sem limitação, HIV1, HIV2, HTLV1, vírus Epstein Barr (EBV), citomegalovírus (CMV), adenovírus, vírus adenoassociado, vírus BK, Herpesvírus Humano 6, Herpesvírus Humano 8, vírus da gripe, vírus da parainfluenza, vírus da gripe aviária, coronavírus MERS e SARS, vírus da febre hemorrágica da República da Crimeia no Congo, rinovírus, enterovírus, vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus do Ebola, vírus de Marburg, vírus da febre de Lassa, vírus zika, RSV, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus de rinoceronte, vírus da varicela, vírus do herpes simplex 1 e 2, vírus da varicela zoster, HIV-1, HTLV1, vírus da hepatite, enterovírus, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus Nipah e da febre do vale Rift, vírus da encefalite japonesa, poliomavírus de células Merkel ou está associado à infecção por mycobacterium tuberculosis, espécies atípicas de micobactérias, Pneumocystis jirovecii, toxoplasmose, rickettsia, nocardia, aspergillus, mucor ou candida. Em outra ou em outra modalidade, a doença é uma doença imune ou degenerativa, incluindo, mas sem limitação, diabetes mellitus, esclerose múltipla, artrite reumatoide, pênfigo vulgar, espondilite anquilosante, tireoidite de Hoshimoto, SLE, sarcoidose, esclerodermia, doença mista do tecido conjuntivo, doença do enxerto versus hospedeiro ou doença de Alzheimer.

[0016] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e desenhos e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0017] A Figura 1 retrata um desenho de um anticorpo atual, receptor de células T (TCR), CAR e CARs e SIRs de próxima geração.

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[0018] A Figura 2 retrata um desenho comparando a atividade e estrutura biológica de CAR de segunda geração com uma modalidade da presente divulgação que retrata um CAR sem CD28 ou 41BB, mas expressando uma molécula estimulante de NF-κB (NEMO e/ou K13, ou mutantes das mesmas).

[0019] A Figura 3 mostra forte ativação de NF-kB por mNEMO- K270A, hNEMO-K277A e ativação fraca por hNEMO-K277I e mutante hNEMO-K277G.

[0020] A Figura 4 mostra atividade de uma engager de células T Biespecífico direcionado a MPL e usando um domínio de alvejamento de scFv-161. As células T e HEL-pLenti-hGluc foram previamente incubadas separadamente com os seguintes sobrenadantes a 4 °C por 2 h apenas em Meio e pLenti-161-StreptagII-CD3-Myc-His-P02 (042517-P02-SC). Após a incubação, as células foram cocultivadas em placa de 96 poços de fundo em U na razão E:T de 1:1 ou 5:1 por 4h a 37 C. 50 μl de células + sup/poço foram transferidos para uma placa de 384 poços em triplicado. O ensaio de hGLuc foi realizado utilizando 15 ul de tampão de ensaio de CTZ (1:100).

[0021] A Figura 5A a C mostra CRISPR/gene TFP mediado por cas9 direcionando dentro do local de TRAC e estratégias para resgatar a expressão de TRAC a, Top, local de TRAC com a extremidade 5’ (cinza) do primeiro éxon de TRAC, o gRNA de TRAC (azul) e a sequência PAM correspondente (consultarmelha). As duas setas azuis indicam a quebra prevista de fita dupla Cas9. Integração inferior, direcionada a CRISPR/Cas9 no local de TRAC. O construto de alvejamento (AAV) contém um aceitador de splicing (SA), seguido por uma sequência de codificação F2A, o gene TFP e uma sequência poliA, flanqueada por sequências homólogas ao local de TRAC (LHA e RHA, braço de homologia esquerdo e direito). Uma vez integrado, o promotor endógeno de TCRα direciona a expressão de TFP, enquanto o local de TRAC é interrompido. B) O construto de alvejamento expressa TFP e coexpressa

30 / 348 TRAC (cadeia constante TCRα) através de uma sequência 2A. C) O construto de alvejamento expressa TFP e coexpressa através de uma sequência 2A um peptídeo sinal que está em quadro com o primeiro éxon presente no RHA, de modo que o promotor TCRα conduz a expressão de TFP, bem como a de TRAC, que não tem a região variável TCRα (TRAV); Região de adesão TRAJ, TCRα; 2A, a sequência 2A de autoclivagem. pA: sequência poliA de SV40/β-globina.

[0022] A Figura 6A a E mostra diversos projetos de construto para cassete de alvejamento para direcionar um Ab-TCR para o local de TRAC.

[0023] A Figura 7A a F mostra vários projetos de construto paro cassete de alvejamento para direcionar um cTCR (SIR) para o local de TRAC.

[0024] A Figura 8A a D mostra vários projetos de construto paro cassete de alvejamento para direcionar um cTCR (SIR) e um TCR para o local de TRAC.

[0025] A Figura 9A a D mostra vários projetos de construto paro cassete de alvejamento para direcionar um cTCR (SIR) de cadeia única para o local de TRAC.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0026] CARs de primeira geração iniciais foram construídos através da fusão de um domínio de ligação a antígeno baseado em scFv (variável de fragmento de cadeia única) a um domínio transmembranar CD8 inerte, ligado a um domínio de sinalização citoplasmático derivado das cadeias γ do receptor CD3-ζ ou Fc (Figura 1).

[0027] Embora a agregação de cadeia de CD3-ζ seja suficiente para permitir a atividade lítica das células T, as mesmas falharam em obter uma resposta robusta de citocinas, incluindo a interleucina-2 (IL-2), e suportam a expansão de células T após exposição repetida ao antígeno. Para ativação e proliferação ideais, as células T requerem o engajamento e a sinalização do receptor de células T, bem como a sinalização coestimulante por meio de

31 / 348 receptores coestimulantes (ou seja, CD28, 4-1BB, OX-40) nas células T que se ligam a ligantes cognatos (ou seja, CD80/86, 4-1BBL, OX-40L) expressos pela célula tumoral alvo ou pelas células que apresentam antígeno. Para superar a falta de coestimulação de células T, CARs de primeira geração foram adicionalmente modificados incorporando os domínios de sinalização citoplasmática dos receptores coestimulantes de células T. Esses CARs de segunda geração aumentaram a força de sinalização e a persistência das células T modificadas, levando a uma atividade antitumoral superior. A sinalização através dos domínios coestimulantes presentes em construtos de CAR de 2ª geração resulta na ativação de várias vias de sinalização, como NF-κB, AKT e ERK. Em particular, a ativação de AKT promove a ativação de células T, mas também demonstrou resultados em diferenciação terminal, exaustão e falta de persistência.

[0028] A Figura 2 retrata um desenho animado de um CAR de 2ª geração, como descrito acima próximo a um CAR de primeira geração mais uma molécula estimulante específica de NF-κB que retrata a atividade biológica associada a cada um.

[0029] Os construtos de CAR no uso clínico atual são de projeto artificial, visto que representam a fusão de várias proteínas diferentes. Em particular, a inclusão do domínio coestimulante no construto CAR de 2ª geração resulta em sinalização não fisiológica através do receptor, o que, por sua vez, poderia contribuir para a sua toxicidade. Alguns CARs mostram sinalização tônica independente de antígeno, o que leva a ativação celular irrestrita, resultando, finalmente, em apoptose, liberação excessiva de citocinas independente de antígenos cognatos e exaustão imunológica. Foi demonstrado que a sinalização tônica através de domínios coestimulantes (por exemplo, domínios 41BB e CD28) impede a sobrevivência das células T. Portanto, é necessário melhorar o projeto de CAR para obter persistência a longo prazo das células T modificadas por CAR sem o risco de toxicidade

32 / 348 excessiva, como a síndrome de liberação de citocinas (SRC).

[0030] Para superar algumas das limitações de projeto de CARs convencionais de 2ª geração, vários projetos alternativos, denominados coletivamente CARs de próxima geração, foram descritos, incluindo Ab-TCR (Documento WO 2017/070608 A1 incorporado neste documento a título de referência), proteínas de fusão de receptores de TCR ou TFP (Documento WO 2016/187349 A1 incorporado neste documento a título de referência), Receptores Imunes Sintéticos (SIRs) (consultar o documento WO 2018/102795 A1, incorporado neste documento a título de referência), acoplador de antígeno de célula T multifuncional (Tri-TAC) (consultar o documento WO 2015/117229 A1, incorporado neste documento a título de referência). Esses projetos alternativos de CAR, em geral, carecem de um domínio coestimulante.

[0031] Para superar as limitações da ativação de AKT e sinalização tônica, esta divulgação demonstra o uso de ativadores NF-κB seletivos, como mutantes NEMO (por exemplo, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A- DeltaV249-K255, NEMO-K270A de camundongo), K13-opt, IKK2-S177E- S181E ou IKK1-S176E-S180E, para fornecer função coestimulante. Em contrapartida aos domínios coestimulantes derivados de 41BB e CD28, que ativam várias vias de sinalização (consultar CARs de 2ª e 3ª geração na Figura 1), ativadores seletivos de NF-κB, como, por exemplo, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-DeltaV249-K255, NEMO-K270A de camundongo, K13- opt, IKK2-S177E-S181E ou IKK1-S176E-S180E, ativam seletivamente a via NF-κB ativando o complexo I-kapKinas (IKK). A divulgação descreve ainda um projeto de receptor imune alternativo de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, no qual a coestimulação é fornecida por um módulo acessório compreendendo um ativador seletivo de NF-κB que é coexpresso com o receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, um CAR). No entanto, em contrapartida aos construtos CAR de 2a geração, no qual o

33 / 348 domínio coestimulante é um componente do polipeptídeo CAR maduro, o módulo acessório que compreende o ativador de NF-kB seletivo não é necessariamente uma parte integral do receptor maduro imune, por exemplo, CAR, polipeptídeo. Esse projeto tem vantagem, pois supera os problemas de sinalização tônica, produção excessiva de citocinas e esgotamento precoce das células T causadas pela agregação e sinalização não fisiológica através dos domínios coestimulantes. A divulgação fornece ainda um método para regular a atividade dos ativadores de NF-κB expressando-os em fusão com domínios de troca, como em fusão com cópias em tandem de um domínio FKBP12v36.

[0032] A divulgação demonstra que a expressão de ativadores seletivos de NF-κB, como, por exemplo, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A- DeltaV249-K255, NEMO-K270A de camundongo, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176-S180E e K13-opt, nas células T estende sua capacidade de proliferar a longo prazo em cultura sem sofrer senescência, demonstrando pela primeira vez que a ativação de uma única via (ou seja, NF-κB) é suficiente para adiar a senescência de células T. Por exemplo, construtos CD19-CAR que coexpressam hNEMO-K277A ou hNEMO-K277A- DeltaV249-K255, mas sem um domínio coestimulante, demonstram eficácia in vivo superior em comparação com o construto CAR de segunda geração que contém o domínio coestimulante 41BB. A divulgação demonstra ainda que a ativação seletiva de NF-κB é suficiente para promover a proliferação de células T, atrasar a senescência e melhorar o desempenho das células T para terapia celular adotiva, incluindo terapia celular CAR-T. Assim, a divulgação fornece composição e métodos para melhorar a sobrevivência, proliferação, secreção de citocinas, retardar a exaustão e senescência e melhorar a expansão in vivo, persistência e atividade antitumoral de uma célula imune, por exemplo, célula T, por exemplo, CAR-T ou célula TCR-T ou SIR-T e/ou uma célula imune que expressa um receptor imune de ocorrência não natural, por meio de ativação seletiva ou preferencial (isto é, sem ativação de AKT) da via

34 / 348 NF-κB na célula imune. Além disso, a divulgação demonstra que o uso de ativadores seletivos de NF-κB, como, por exemplo, hNEMO-K277A ou hNEMO-K277A-DeltaV249-K255, não se limita ao seu uso em células CAR- T, pois podem ser usados em qualquer célula T para terapia celular adotiva, incluindo células T expressando TCR endógeno (por exemplo, linfócitos infiltrantes de tumor), TCR exógeno, SIR e similares.

[0033] A divulgação demonstra ainda que ativadores seletivos de NF- κB, como, por exemplo, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-DeltaV249- K255, NEMO-K270A de camundongo, K13-opt, IKK2-S177E-S181E ou IKK1- S176E-S180E, podem ser usados para melhorar o desempenho de vacinas promovendo a secreção de citocinas e a apresentação de antígenos pelas células imunes, por exemplo, células que apresentam antígenos, por exemplo, células dendríticas. Por exemplo, células dendríticas (DC) derivadas de medula óssea que expressam ativadores seletivos de NF-kB, tais como hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-DeltaV249-K255, nemo-K270A de camundongo, K13-opt, IKK2-S177E-S181E ou IKK1-S176E-S180E, mostram produção superior de citocinas, apresentação de antígenos e resposta imune (por exemplo, resposta antitumoral ou resposta de agente anti- infeccioso) em comparação com a DC de controle.

[0034] A divulgação fornece ainda ativadores de NF-κB, incluindo ativadores seletivos de NF-κB que são de origem humana e, portanto, são menos imunogênicos.

[0035] A divulgação fornece ainda ativadores de NF-κB, incluindo ativadores seletivos de NF-κB que podem ser expressos no citosol. A divulgação fornece ainda ativadores de NF-κB, incluindo ativadores seletivos de NF-κB, que são constitutivamente ativos e não requerem um estímulo, por exemplo, tratamento com um ligante, por sua capacidade de ativar NF-κB.

[0036] A divulgação fornece ainda vários domínios de ligação ao antígeno que podem ser usados na geração de CARs convencionais (por

35 / 348 exemplo, CAR de segunda geração contendo domínio coestimulante de 41BB), bem como CARs da próxima geração, como SIRs, zSIRs, Ab-TCR e TFPs, para aplicações em terapia celular adotiva.

Em algumas modalidades, esses domínios de ligação ao antígeno são derivados de anticorpos e antígenos alvo expressos em neoplasias hematológicas e tumores sólidos.

As SEQ ID Nos. de fragmentos vL, vH e scFv desses domínios de ligação ao antígeno são mostradas nas Tabelas 6A a C.

As SEQ ID Nos das regiões determinantes complementares (CDRs) das cadeias leve (vL) e pesada (vH) são mostradas nas Tabelas 6A a B.

São fornecidas as SEQ IDs de ácidos nucleicos e aminoácidos de CARs de segunda geração exemplificativos que contêm domínios coestimulantes de 41BB e CARs de próxima geração (por exemplo, zCAR-K13, zCAR-NEMO-K277A, SIRs, Ab-TCRs e TFP) com base nesses domínios de ligação ao antígeno nas Tabelas 10 a 14. Os CARs contendo esses domínios de ligação ao antígeno mostram diversas propriedades in vitro e in vivo, como afinidade de ligação aos antígenos alvo, secreção de citocinas, proliferação, citotoxicidade, exaustão e persistência a longo prazo.

Como tal, os receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, CARs, contendo esses antígenos alvo, podem ser usados para gerar uma resposta imune diversa.

O polinucleotídeo, polipeptídeos, construtos de expressão, células manipuladas geneticamente de forma recombinante que expressam CARs compreendendo os domínios de ligação ao antígeno da divulgação, bem como o método de produção e utilização desses polipeptídeos, polinucleotídeos e células são descritos nos métodos conhecidos na técnica e métodos descritos nos documentos PCT/US2017/024843, WO 2014/160030 A2, WO 2016/187349 A1, WO 2017/070608 A1 e WO 2018/102795 A1, que são incorporados neste documento a título de referência na sua totalidade.

As células imunes que expressam os CARs compreendendo esses domínios de ligação ao antígeno podem ser geradas e usadas para terapia celular adotiva de câncer, distúrbios infecciosos e imunológicos usando métodos conhecidos na

36 / 348 técnica e métodos descritos nos documentos WO 2017/070608 A1, WO 2016/187349 A1, WO 2018/102795 A1, WO 2015/117229 A1, que são incorporados neste documento a título de referência na sua totalidade.

[0037] A divulgação fornece ainda novos métodos para gerar células T alogênicas que expressam TCR e CARs, incluindo CARs de próxima geração (por exemplo, TFP, SIR, Ab-TCR, cTCR), com a finalidade de terapia celular adotiva pronta para uso.

[0038] A divulgação fornece ainda novos métodos de terapias combinadas usando células T autólogas e alogênicas que expressam TCR e CARs, incluindo CARs de próxima geração (por exemplo, TFP, SIR, Ab- TCR e cTCR). A divulgação fornece métodos de restauração da expressão e/ou atividade de TFPs com base nas cadeias CD3ε, CD3γ e CDδ em células T sem a expressão das cadeias TCRα, TCRβ, TCRγ ou TCRδ nativas coexpressando nas células que expressam os TFPs as cadeias constantes TCRα, TCRβ, TCRγ ou TCRδ. A divulgação fornece ainda métodos de restauração da expressão e/ou atividade de TFPs com base nas cadeias CD3ε, CD3γ e CDδ em células T sem a expressão das cadeias nativas de TCRα, TCRβ, TCRγ ou TCRδ coexpressando nas células que expressam os TFPs SIRs ou Ab-TCR que codifica o comprimento completo ou fragmentos de cadeias constantes TCRα, TCRβ, TCRγ ou TCRδ. A divulgação garante que TFPs com base em cadeias CD3ε, CD3γ e CDδ podem ser combinados com SIRs ou Ab-TCR que codificam as cadeias constantes de cadeias constantes TCRα, TCRβ, TCRγ ou TCRδ em células T sem as cadeias nativas de TCRα, TCRβ, TCRγ ou TCRδ para fins de terapia alogênica e pronta para uso.

[0039] Conforme usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um(a)” e “o(a)” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “uma célula” inclui uma pluralidade de tais células, e a referência ao “polinucleotídeo” inclui a referência a um ou mais polinucleotídeos e assim

37 / 348 por diante.

[0040] Além disso, o uso de “ou” significa “e/ou”, salvo indicação em contrário. Da mesma forma, “compreendem”, “compreende”, “compreendendo” “incluem”, “inclui” e “incluindo” são intercambiáveis e não pretendem ser limitantes.

[0041] Deve ser entendido ainda que, quando as descrições de várias modalidades usam o termo “compreendendo”, aqueles versados na técnica entenderiam que, em alguns casos específicos, uma modalidade pode ser descrita alternativamente usando a linguagem “consistindo essencialmente em” ou “consistindo em”.

[0042] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por um indivíduo versado na técnica à qual esta invenção pertence. Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22ª ed., Pharmaceutical Press (15 de setembro de 2012); Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton e Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3ª ed., edição revisada. J. Wiley & Sons (Nova Iorque, NY 2006); Smith, March’s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7ª ed., J. Wiley & Sons (Nova York, NY 2013); Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3ª ed., Wiley-Blackwell (28 de novembro de 2012); e Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012), fornecem a um indivíduo versado na técnica um guia geral para muitos dos termos usados no presente pedido. Para referências sobre como preparar anticorpos, consultar Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY, 2013); Köhler e Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. julho de 1976, 6(7): 511 a 519; Queen e

38 / 348 Selick, Humanized immunoglobulins, Patente No US 5.585.089 (dezembro de 1996); e Riechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 24 de março de 1988 332(6.162): 323 a 327 Todos os títulos e subtítulos fornecidos neste documento são apenas para facilitar a leitura e não devem ser interpretados como limitando a invenção. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser utilizados na prática ou no teste da invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento são incorporadas a título de referência na sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos específicos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes.

[0043] Todas as publicações contidas neste documento são incorporadas a título de referência na mesma extensão que se cada publicação individual ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência. Quaisquer referências citadas não admitem que alguma das informações fornecidas neste documento seja técnica anterior ou relevante para a invenção atualmente reivindicada, ou que qualquer publicação especificamente ou implicitamente mencionada seja técnica anterior.

[0044] O termo “cerca de” quando se refere a um valor mensurável, como uma quantidade, uma duração temporal e similares, deve abranger variações de ± 20% ou, em alguns casos, ± 10%, ou, em alguns casos, ± 5%, ou em alguns casos ± 1% ou em alguns casos ± 0,1% do valor especificado, pois essas variações são apropriadas para executar os métodos divulgados ou descrever as composições neste documento. Além disso, qualquer valor ou faixa (por exemplo, menos de 20 ou terminologia semelhante) inclui explicitamente qualquer número inteiro entre esses valores ou até o valor.

39 / 348 Assim, por exemplo, “uma a cinco mutações” inclui explicitamente 1, 2, 3, 4 e/ou 5 mutações.

[0045] O termo “Ab-TCR” ou “AbTCR” se refere a uma plataforma CAR de próxima geração, conforme descrito no documento WO 2017/070608 A1, que é incorporado neste documento a título de referência. Em uma modalidade, um Ab-TCR compreende uma fração de anticorpo que se liga especificamente a um antígeno alvo fundido a um módulo de TCR capaz de recrutar pelo menos um módulo de sinalização de TCR. Módulos de TCR exemplificativos que podem ser utilizados na construto de Ab-TCR são fornecidos na SEQ ID NO: 959 a 964 (Tabela 6D) e no documento WO 2017/070608 A1, que é incorporado neste documento a título de referência. No módulo TCR, TCRb-IAH-6MD, três resíduos de aminoácidos (F133, E136 e Q139) encontrados na cadeia de TCRb humana (SEQ ID NO: 15.053) (consultar as Tabelas 4, 5 e 6D) são mutados para os resíduos Isoleucina, Alanina e Histidina encontrada na cadeia murina de TCRb, respectivamente, de modo a melhorar a expressão desse módulo. Da mesma forma, no módulo TCR IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD, quatro resíduos de aminoácidos (P91, E92, S93, S94) encontrados na cadeia de TCRa humana (SEQ ID NO:

15.041) são mutados para os resíduos S, D, V, P encontrados na cadeia murina de TCRa, de modo a melhorar a expressão desse módulo (consultar as Tabelas 3 e 6D). Ab-TCRs exemplificativos que coexpressam um módulo acessório que codifica NEMO-K277A são fornecidos na SEQ ID NO: 3.124 a

3.523 (Tabela 14). No entanto, o módulo acessório que codifica NEMO- K277A é opcional. O Ab-TCR com os domínios de ligação ao antígeno (isto é, fragmentos de vL e vH, ligantes e receptores, etc.) descritos nesta divulgação pode ser construído sem NEMO-K277A. Como tal, esse módulo acessório, juntamente com a sequência Furine-SGSG-F2A a montante, pode ser excluído do Ab-TCR. Como alternativa, o módulo acessório que codifica NEMO-K277A pode ser substituído por módulos acessórios que codificam

40 / 348 outras proteínas, como hNEMO-K277A-deltaV249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, ou IKK1-S176E-S180E, e MyD88 – L265P, FKBPx2-NEMO, NEMO-L600-FKBPx2, etc. Além disso, os módulos TCR presentes no Ab-TCR podem ser substituídos por outros módulos descritos no documento WO 2017/070608 A1. Por exemplo, o Ab-TCR representado pela SEQ ID NO: 3.124 a 3.323 contém módulos TCR IgCL-TCRb-IAH-6MD (SEQ ID NO: 960) e IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD (SEQ ID NO: 963) que podem ser substituído pelos módulos TCR IgCL-TCRb-wt2-opt-6MD (SEQ ID NO: 961) e IgG1-CH1-TCRa-wt2-opt-6MD (SEQ ID NO: 964), respectivamente. Ab-TCRs exemplificativos que coexpressam um módulo acessório que codifica NEMO-K277A e que contém os módulos TCR IgCL- TCRg-6MD (SEQ ID NO: 959) e IgG1-CH1-TCRd-6MD (SEQ ID NO: 962) são fornecidos na SEQ ID NO: 3.324 a 3.523. A ordem dos domínios de ligação ao antígeno nesses construtos é a mesma que a ordem dos construtos mostrados na Tabela 14 e, portanto, um Ab-TCR baseado em IgCL-TCRg- 6MD (SEQ ID NO: 959) e IgG1-CH1-TCRd -6MD (SEQ ID NO: 962) direcionando um antígeno específico e contendo um domínio de ligação ao antígeno específico pode ser identificado consultando a Tabela 14.

[0046] O termo “módulo acessório” se refere a qualquer um ou mais dentre hNEMO-K277A (ou NEMO-K277A), hNEMO-K277A-delta-V249- K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E (ou IKK2-SS/EE), IKK1-S176E-S180E (ou IKK1-SS/EE), MyD88-L265P, TCL-1a, MTCP-1, CMV-141, 41BBL, CD40L, vFLIP-K13, MC159, cFLIP-L/MRITα, cFLIP- p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, mutante HTLV2 Tax-RS, FKBPx2-K13, FKBPx2-HTLV2-Tax, FKBPx2-HTLV2-Tax-RS, IL6R-304-vHH-Alb8- vHH, IL12f, PD1-4H1 scFV, PD1-5C4 scFV, PD1-4H1-Alb8-vHH, PD1- 5C4-Alb8-vHH, CTLA4-Ipilimumab-scFv, CTLA4-Ipilimumab-Alb8-vHH, IL6-19A-scFV, IL6-19A-scFV-Alb8-vHH, sHVEM, sHVEM-Alb8-vHH, hTERT, Fx06, Brd4 direcionando shRNA, IgSP-[hTRAC-opt2], IgSP-

41 / 348 [hTRBC-opt2] e combinação dos mesmos que seja expressa em uma célula imune (por exemplo, célula T, por exemplo, célula CAR-T ou célula TCR-T) para diminuir, regular ou modificar a atividade da célula imune. Em algumas modalidades, o módulo acessório é coexpresso com um receptor imune como um CAR ou um TCR para aumentar, diminuir, regular ou modificar a expressão ou atividade de um CAR ou um TCR ou uma célula que expressa CAR ou uma célula que expressa TCR. O módulo acessório pode ser coexpresso com um CAR ou um TCR usando um único vetor ou usando dois ou mais vetores diferentes. Em uma modalidade adicional, o módulo acessório compreende uma proteína de fusão FKBP (proteína de ligação a FK506), como FKBPx2-NEMO, cuja atividade pode ser controlada pela administração de uma molécula de dimerizador. Em algumas modalidades, o módulo acessório é expresso em uma célula que apresenta antígeno, por exemplo, uma célula dendrítica.

[0047] Como utilizado neste documento, “afinidade” pretende descrever uma medida da força de ligação. A afinidade, em alguns casos, depende da proximidade do ajuste estereoquímico entre um agente de ligação e um alvo do mesmo (por exemplo, entre um anticorpo e antígeno, incluindo epítopos específicos para o domínio de ligação), do tamanho da área de contato entre os mesmos e da distribuição de grupos carregados e hidrofóbicos. Afinidade geralmente se refere à “capacidade” do agente de ligação para ligar seu alvo. Existem inúmeras maneiras usadas na técnica para medir “afinidade”. Por exemplo, métodos para calcular a afinidade de um anticorpo para um antígeno são conhecidos na técnica, incluindo o uso de experiências de ligação para calcular a afinidade. A afinidade de ligação pode ser determinada usando várias técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ressonância plasmônica de superfície, interferometria de biocamada, interferometria de dupla polarização, espalhamento estático de luz, espalhamento dinâmico de luz, calorimetria de titulação isotérmica, ELISA,

42 / 348 ultracentrifugação analítica e citometria de fluxo. Um método exemplificativo para determinar a afinidade de ligação emprega ressonância plasmônica de superfície. A ressonância plasmônica de superfície é um fenômeno óptico que permite a análise de interações biospecíficas em tempo real pela detecção de alterações nas concentrações de proteínas dentro de uma matriz de biossensores, por exemplo, usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ). Como usado neste documento, o termo “ligação específica” significa o contato entre um anticorpo e um antígeno com uma afinidade de ligação de pelo menos 10-6 M. Em certos aspectos, os anticorpos se ligam a afinidades de pelo menos 10-7 M, e de preferência 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M ou 10-12 M.

[0048] A “Via AKT” ou “Via PI3K-AKT”, conforme usado neste documento, é um caminho de transdução de sinal que promove sobrevivência e crescimento em resposta a sinais extracelulares. As principais proteínas envolvidas são PI3K (fosfatidilinositol 3-quinase) e Akt (Proteína Quinase B).

[0049] O termo “anticorpo”, como utilizado neste documento, se refere a uma proteína ou sequência de polipeptídeos derivada de uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas monoclonais ou policlonais, de cadeia múltipla ou única ou intactas e podem ser derivados de fontes naturais ou de fontes recombinantes. Os anticorpos podem ser tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina. O anticorpo pode ser “humanizado”, “quimérico” ou não humano.

[0050] O termo “fragmento de anticorpo” se refere a pelo menos uma porção de um anticorpo que retém a capacidade de interagir especificamente com (por exemplo, por ligação, impedimento estérico, estabilização/desestabilização, distribuição espacial) um epítopo de um antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém sem limitação, Fab, Fab', F(ab'h, fragmentos Fv, fragmentos de anticorpo scFv,

43 / 348 Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHl, anticorpos lineares, anticorpos de domínio único (sdAb), como vL ou vH, domínios camelídeos vHH, anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos, como um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de articulação e uma CDR isolada ou outros fragmentos de ligação ao epítopo de um anticorpo. Um fragmento de ligação ao antígeno também pode ser incorporado em anticorpos de domínio único, maxibodies, minibodies, nanocodies, intrabodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, v-NAR e bis-scFv (consultar, por exemplo, Hollinger e Hudson, Nature Biotechnology 23: 1.126 a 1.136, 2005). Os fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser enxertados em suportes com base em polipeptídeos, como uma fibronectina tipo III (Fn3) (consultar Patente No US 6.703.199, que descreve os minicorpos do polipeptídeo da fibronectina).

[0051] O termo “cadeia pesada de anticorpo” se refere ao maior dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes nas moléculas de anticorpo em suas conformações que ocorrem naturalmente e que normalmente determina a classe à qual o anticorpo pertence.

[0052] O termo “cadeia leve de anticorpo” se refere ao menor dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes nas moléculas de anticorpo em suas conformações que ocorrem naturalmente. As cadeias leves Kappa (κ) e lambda (λ) se referem aos dois principais isotipos de cadeia leve do anticorpo.

[0053] “Agente anticâncer” se refere a agentes que inibem a divisão e o crescimento celular aberrante, inibem a migração de células neoplásicas, inibem a invasão ou impedem o crescimento e a metástase do câncer. O termo inclui agentes quimioterapêuticos, agente biológico (por exemplo, siRNA, vetores virais, como MLV manipulado geneticamente, adenovírus, vírus do herpes que entregam genes citotóxicos), anticorpos e similares.

[0054] O termo “efeito anticâncer” se refere a um efeito biológico que

44 / 348 pode ser manifestado por vários meios, incluindo, porém sem limitação, uma diminuição no volume do tumor, uma diminuição no número de células cancerígenas, uma diminuição no número de metástases, um aumento na expectativa de vida, diminuição na proliferação de células cancerígenas, diminuição na sobrevivência de células cancerígenas ou melhoria de vários sintomas fisiológicos associados à condição cancerígena. Um “efeito anticâncer” também pode ser manifestado pela capacidade dos CARs na prevenção da ocorrência de câncer em primeiro lugar.

[0055] O termo “antígeno” ou “Ag” se refere a uma molécula que provoca uma resposta imune. Essa resposta imune pode envolver a produção de anticorpos ou a ativação de células específicas imunologicamente competentes, ou ambas. O indivíduo versado na técnica entenderá que qualquer macromolécula, incluindo praticamente todas as proteínas ou peptídeos, pode servir como um antígeno. Além disso, os antígenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico. Um indivíduo versado na técnica entenderá que qualquer DNA, que compreende uma sequência nucleotídica ou uma sequência nucleotídica parcial que codifica uma proteína que provoca uma resposta imune, codifica, portanto, um “antígeno”, como esse termo é usado neste documento. Além disso, um indivíduo versado na técnica entenderá que um antígeno não precisa ser codificado apenas por uma sequência nucleotídica completa de um gene. A divulgação inclui, porém sem limitação, o uso de sequências nucleotídicas parciais de mais de um gene e que essas sequências nucleotídicas estão dispostas em várias combinações para codificar polipeptídeos que provocam a resposta imune desejada. Além disso, um indivíduo versado na técnica entenderá que um antígeno não precisa ser codificado por um “gene”. É prontamente aparente que um antígeno pode ser gerado sintetizado, ou pode ser derivado de uma amostra biológica, ou pode ser macromolécula além de um polipeptídeo. Essa amostra biológica pode incluir, porém sem limitação uma amostra de tecido, uma amostra de

45 / 348 tumor, uma célula ou um fluido com outros componentes biológicos.

[0056] Exemplos não limitantes de antígenos alvo incluem: CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (também denominado subconjunto CD2 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1- 1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα-Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor órfão de tipo tirosina- quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expresso em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina-13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-11Ra); antígeno de célula- tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR- beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor alfa de folato (FRa ou FR1); Receptor beta de folato (FRb); Receptor tirosina-proteína quinase ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1); receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica

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IX (CAlX); Subunidade Proteassoma (Prosome, Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1- 1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o-acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR-1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE- A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro 1A (XAGEl); receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testículo de melanoma (MAD- CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; proteína; survivina; telomerase; antígeno 1 do tumor de carcinoma de próstata

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(PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N- acetil-glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY-TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de domínio de lectina de tipo C (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGL11), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34,

48 / 348 LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGL11, TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM-CSFR-alfa), TGFbetaR2, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR- beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina (CGHR ou GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), autoanticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, Claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A.2), Glicoproteína p, STEAP1, Liv1, Nectin-4, Cripto, gpA33, BST1/CD157, canal de cloreto de baixa condutância e um antígeno reconhecido por anticorpo TNT.

[0057] O termo “célula que apresenta antígeno” ou “APC” se refere a uma célula do sistema imunológico, como uma célula acessória (por exemplo, uma célula B, uma célula dendrítica e similares) que exibe um antígeno estranho complexado com os principais complexos de histocompatibilidade (MHCs)) em sua superfície. As células T podem reconhecer esses complexos usando seus receptores de células T (TCRs). As APCs processam antígenos e os apresentam às células T.

[0058] O termo “efeito anti-infecção” se refere a um efeito biológico que pode ser manifestado por vários meios, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, diminuição do título do agente infeccioso, diminuição da contagem de colônias do agente infeccioso, melhoria de vários sintomas fisiológicos associados à condição infecciosa. Um “efeito anti-infeccioso”

49 / 348 também pode ser manifestado pela capacidade dos peptídeos, polinucleotídeos, células e anticorpos na prevenção da ocorrência de infecção em primeiro lugar.

[0059] O termo “efeito antitumoral” ou “efeito anticâncer” se refere a um efeito biológico que pode ser manifestado por vários meios, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, uma diminuição no volume do tumor, uma diminuição no número de células tumorais, uma diminuição na proliferação de células tumorais ou uma diminuição na sobrevivência de células tumorais.

[0060] Um “domínio de ligação ao antígeno” ou “módulo de ligação ao antígeno” ou “segmento de ligação ao antígeno” ou “domínio específico de antígeno” (ASD) se refere a um polipeptídeo ou peptídeo que, devido à sua sequência primária, secundária ou terciária, modificações pós-traducionais e/ou carga se liga a um antígeno com um alto grau de especificidade. O domínio de ligação ao antígeno pode ser derivado de diferentes fontes, por exemplo, um anticorpo (cadeia pesada de comprimento total, fragmentos Fab, fragmentos de cadeia única Fv (scFv), anticorpos divalentes de cadeia única ou diabetes), uma proteína de ligação não imunoglobulina, um ligante ou um receptor. No entanto, existem inúmeras alternativas, como citocinas ligadas (que levam ao reconhecimento de células portadoras do receptor de citocinas), affibodies, domínios de ligação a ligantes de receptores que ocorrem naturalmente, ligante de proteína/peptídeo solúvel para um receptor (por exemplo, em uma célula tumoral), peptídeos e vacinas para solicitar uma resposta imune, que pode ser usada em várias modalidades da invenção. Em algumas modalidades, quase qualquer molécula que se liga a um determinado antígeno com alta afinidade pode ser usada como um ASD, como será apreciado por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende receptores de células T (TCRs) ou porções dos mesmos. Em modalidades exemplificativas, os ácidos

50 / 348 nucleicos que codificam domínios de ligação ao antígeno compreendendo scFVs são apresentados neste documento nas SEQ ID NOs: 642 a 902 e na Tabela 6C. Em modalidades exemplificativas, os aminoácidos que codificam os domínios de ligação ao antígeno compreendendo scFVs são apresentados neste documento nas SEQ ID NOs: 4.555 a 4.815 na Tabela 6C.

[0061] O termo “constante de associação (Ka)” é definido como a constante de equilíbrio da associação de um receptor e ligante.

[0062] “Autoanticorpo” se refere a um anticorpo que é produzido por uma célula B específica para um autoantígeno.

[0063] O termo “autoantígeno” se refere a um antígeno endógeno que estimula a produção de uma resposta autoimune, como a produção de autoanticorpos. O autoantígeno também inclui um autoantígeno ou antígeno de um tecido normal que é o alvo de uma resposta imune mediada por células ou mediada por anticorpos que pode resultar no desenvolvimento de uma doença autoimune. Exemplos de autoantígenos incluem, porém sem limitação, desmogleína 1, desmogleína 3 e seus fragmentos.

[0064] “Avidez” se refere à força da interação entre um agente de ligação e seu alvo (por exemplo, a força da interação entre um anticorpo e seu alvo de antígeno, um receptor e seu cognato e similares). A avidez pode ser fraca ou forte. Os métodos para calcular a afinidade de um anticorpo para um antígeno são conhecidos na técnica, incluindo o uso de experiências de ligação para calcular a afinidade. A atividade do anticorpo em ensaios funcionais (por exemplo, ensaio de citometria de fluxo) também reflete a afinidade do anticorpo. Os anticorpos e afinidades podem ser caracterizados fenotipicamente e comparados usando ensaios funcionais (por exemplo, ensaio de citometria de fluxo).

[0065] Conforme usado neste documento, o termo “estrutura principal” se refere à combinação específica de CARs (Tabela 1) e módulos acessórios, conforme descrito na Tabela 2. Em modalidades exemplificativas,

51 / 348 combinações específicas de CARs e módulos acessórios que compreendem várias estruturas principais são descritas na Tabela 2. Em uma modalidade, o CAR e o módulo acessório são codificados por uma única molécula de ácido nucleico. Em outra modalidade, o CAR é codificado pela primeira molécula de ácido nucleico, e o módulo acessório é codificado por uma segunda molécula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o módulo acessório é codificado por mais de uma molécula de ácido nucleico, dependendo do número de componentes nos módulos acessórios.

[0066] Conforme usado neste documento, “resultados benéficos” podem incluir, porém sem limitação, diminuir ou aliviar a gravidade da condição da doença, impedir que a condição da doença se agrave, curar a condição da doença, impedir o desenvolvimento da condição da doença, diminuir as chances de um paciente desenvolver a condição da doença e prolongar a vida ou a expectativa de vida de um paciente. Como exemplos não limitantes, “resultados benéficos” ou “resultados desejados” podem ser o alívio de um ou mais sintomas, diminuição da extensão do déficit, estado estabilizado (isto é, não piorando) da progressão do câncer, atraso ou lentidão da metástase ou invasividade e melhoria ou paliação de sintomas associados ao câncer.

[0067] Como usado neste documento, o termo “domínio de ligação” ou “molécula de anticorpo” se refere a uma proteína, por exemplo, uma cadeia de imunoglobulina ou fragmento da mesma, domínio de ligante ou fragmento da mesma (conforme o caso), compreendendo pelo menos um domínio, por exemplo, sequência de domínio variável de imunoglobulina que pode se ligar a um alvo com afinidade maior que um domínio não específico. O termo abrange anticorpos e fragmentos de anticorpo, ou ligantes e fragmentos de ligante. Em outra modalidade, uma molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo multiespecífica, por exemplo, compreende uma pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina, em que

52 / 348 uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em outra modalidade, uma molécula de anticorpo multiespecífica é uma molécula de anticorpo biespecífico. Um anticorpo biespecífico tem especificidade para dois antígenos. Uma molécula de anticorpo biespecífico é caracterizada por uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Uma molécula biespecífica pode ser um anticorpo engajador de célula T biespecífico no qual o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno (por exemplo, CD3ε) expresso nas células T, e o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno expresso em uma célula causadora ou associada à doença (por exemplo, uma célula cancerígena). Os anticorpos biespecíficos podem ser utilizados para induzir citotoxicidade mediada por células T contra células que expressam o antígeno alvo reconhecido pelo seu segundo domínio de ligação ao antígeno. Os domínios de ligação ao antígeno descritos nesta divulgação podem ser usados para construir engagers de células T biespecíficos. As sequências de ácidos nucleicos de exemplos de engagers de células T biespecíficos compreendendo os domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) descritos nesta divulgação são apresentadas nas SEQ ID NO: 3.545 a 3.830 (Tabela 13). As sequências de aminoácidos correspondentes são apresentadas nas SEQ ID NO: 7.458 a 7.721.

[0068] “Liga o mesmo epítopo que” significa a capacidade de um anticorpo, scFv ou outro domínio de ligação ao antígeno se ligar a um antígeno alvo e ter o mesmo epítopo que um anticorpo exemplificado, scFv, ou outro domínio de ligação ao antígeno. Como um exemplo, os epítopos do

53 / 348 anticorpo exemplificado, scFv, ou outro agente de ligação e outros anticorpos podem ser determinados usando técnicas padrão de mapeamento de epítopos.

As técnicas de mapeamento de epítopos, bem conhecidas na técnica incluem Protocolos de Mapeamento de Epítopos em Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E.

Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nova Jersey.

Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados, por exemplo, sintetizando-se simultaneamente um grande número de peptídeos em suportes sólidos, sendo que os peptídeos correspondem a partes da molécula de proteína, e reagindo os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos ainda estão ligados aos suportes.

Tais técnicas são conhecidas na técnica e descritas em, por exemplo, Patente no US 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA 8: 3.998 a 4.002; Geysen et al., (1985) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA 82: 78 a 182; Geysen et al., (1986) Mol.

Imunol. 23: 709 a 715. O epítopo ligado ao domínio de ligação ao antígeno de um CAR também pode ser determinado pelo ensaio classificação (binning) de epítopos.

A classificação de epítopos é um imunoensaio competitivo usado para caracterizar e classificar uma biblioteca de anticorpos monoclonais contra uma proteína alvo.

Os anticorpos contra um alvo semelhante são testados contra todos os outros anticorpos na biblioteca de maneira pareada para ver se os anticorpos bloqueiam a ligação um do outro ao epítopo de um antígeno.

Após cada anticorpo ter um perfil criado contra todos os outros anticorpos da biblioteca, é criado um perfil de bloqueio competitivo para cada anticorpo em relação aos outros na biblioteca.

Perfis de classificação estreitamente relacionados indicam que os anticorpos têm o mesmo epítopo ou um epítopo estreitamente relacionado e são “classificados” juntos.

Da mesma forma, os epítopos conformacionais são facilmente identificados pela determinação da conformação espacial de aminoácidos, como, por exemplo, troca de hidrogênio/deutério, cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear bidimensional.

Consultar, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.

As

54 / 348 regiões antigênicas das proteínas também podem ser identificadas usando gráficos padrão de antigenicidade e hidropatia, como os calculados usando, por exemplo, o programa Omiga versão 1.0, disponível junto ao Oxford Molecular Group. Esse programa de computador emprega o método Hopp/Woods, Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 78: 3.824 a

3.828; para determinar perfis de antigenicidade, e a técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., (1982) J.Mol. Bioi. 157: 105 a 132; para parcelas de hidropatia. Para determinar se os anticorpos monoclonais selecionados contra um alvo (por exemplo, CD19) se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado usando reagentes disponíveis comercialmente (Pierce, Rockford, Ill.). Os estudos de competição usando anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados usando placas de ELISA revestidas com domínio extracelular CD19. A ligação ao mAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda de estrepto-avidina-fosfatase alcalina. Epítopos exemplificativos de antígeno CD20 humano ligados por scFv e CARs da presente divulgação são fornecidos nas SEQ ID NO: 15.149 a 15.154. Epítopos exemplificativos de BCMA humano ligado por scFv e CARs da presente divulgação são fornecidos nas SEQ ID NO: 15.155 a

15.159. Um epítopo exemplificativo do antígeno MPL humano ligado por scFv e CARs da presente divulgação é fornecido na SEQ ID NO: 15.160.

[0069] Conforme usado neste documento, o termo “equivalente biológico do mesmo” deve ser sinônimo de “equivalente do mesmo” ao se referir a uma proteína de referência, anticorpo ou fragmento do mesmo, polipeptídeo ou ácido nucleico, tendo homologia mínima enquanto mantém a estrutura ou funcionalidade desejada. A menos que especificamente recitado neste documento, é contemplado que qualquer um dos acima também inclua seus equivalentes. Por exemplo, um equivalente pretende pelo menos cerca de 70% de homologia ou identidade, ou pelo menos 80% de homologia ou identidade e, alternativamente, ou pelo menos, cerca de 85%, ou

55 / 348 alternativamente, pelo menos, cerca de 90%, ou alternativamente, pelo menos, cerca de 95%, ou alternativamente, pelo menos 98% por cento de homologia ou identidade e exibe atividade biológica substancialmente equivalente à proteína de referência, polipeptídeo, anticorpo ou seu fragmento ou ácido nucleico. Alternativamente, quando se refere a polinucleotídeos, um equivalente é um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o polinucleotídeo de referência ou seu complemento. Alternativamente, quando se refere a polipeptídeos ou proteínas, um equivalente é um polipeptídeo expresso ou proteína de um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o polinucleotídeo ou seu complemento que codifica o polipeptídeo ou proteína de referência.

[0070] Como utilizado neste documento, o termo “CDR” ou “região determinante de complementaridade” pretende significar os locais de combinação de antígenos não contíguos encontrados na região variável dos polipeptídeos das cadeias pesada e leve. Essas regiões particulares foram descritas por Kabat et al., J. Bioi. Chern. 252: 6.609 a 6.616 (1977); Kabat et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991); Chothia et al., J. Mol. Bioi. 196: 901 a 917 (1987); e MacCallum et al., J. Mol. Bioi. 25 262: 732 a 745 (1996), em que as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparadas entre si. Não obstante, a aplicação de qualquer uma das definições para se referir a uma CDR de um anticorpo ou anticorpos enxertados ou variantes dos mesmos deve estar dentro do escopo do termo como definido e usado neste documento. Como utilizado neste documento, as diferentes CDRs de um anticorpo também podem ser definidas por uma combinação das diferentes definições. Por exemplo, o vHCDR1 pode ser definido com base no Kabat e o VHCDR2 pode ser definido com base no Chothia. Os resíduos de aminoácidos que abrangem as CDRs, conforme definido por cada uma das referências citadas acima, são os seguintes:

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DEFINIÇÕES DO CDR Kabat Chothia MacCallum VHCDR1 31 a 35 26 a 32 30 a 35 VHCDR2 50 a 65 53 a 55 47 a 58 VHCDR3 95 a 102 96 a 10 193 a 101 VLCDR1 24 a 34 26 a 32 30 a 36 VLCDR2 50 a 56 50 a 52 46 a 55 VLCDR3 89 a 97 91 a 96 89 a 96

[0071] (Os números de resíduos correspondem à referência identificada).

[0072] As SEQ IDs das CDRs dos diferentes segmentos vL e vH que podem formar domínios de ligação ao antígeno de CARs da divulgação são fornecidas nas SEQ ID NO: 13.204 a 14.121 e SEQ ID NO: 14.122 a 15.039, respectivamente (Tabelas 6A, B) e nas Tabelas 5 a 6 no documento PCT/US2017/064.379, que são incorporadas neste documento a título de referência,.

[0073] Em algumas modalidades, a referência a um módulo de ligação a antígeno (como um módulo de ligação a antígeno tipo Fab ou Fv) que se liga especificamente a um antígeno alvo significa que o módulo de ligação a antígeno se liga ao antígeno alvo com (a) uma afinidade que é pelo menos cerca de 10 (por exemplo, cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1.000 ou mais) vezes sua afinidade de ligação a outras moléculas; ou (b) um Kd não mais do que cerca de 1/10 (por exemplo, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1175, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1.000 ou menos) vezes o seu Kd para se ligar a outras moléculas. A afinidade de ligação pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, como ELISA, análise de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) ou ensaio de radioimunoprecipitação (RIA). Kd pode ser determinado por métodos conhecidos na técnica, tais como ensaio de ressonância de plasmon de superfície (SPR), utilizando, por exemplo, instrumentos de Biacore, ou ensaio de exclusão clínica (KinExA) utilizando, por exemplo, instrumentos Sapidyne.

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[0074] “Câncer” e “cancerígeno” se referem ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, porém sem limitação, linfomas de célula B (linfomas de Hodgkin e/ou linfomas não Hodgkins), linfomas de células T, mieloma, síndrome mielodisplásica, câncer de pele, tumor cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer de esôfago, câncer anal, câncer de local primário desconhecido, câncer endócrino, câncer testicular, câncer de pulmão, câncer hepatocelular, câncer gástrico, câncer de pâncreas, câncer de colo do útero, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de trato urinário, câncer de órgãos reprodutivos, câncer de tireoide, câncer renal, carcinoma, melanoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer no cérebro (por exemplo, glioblastoma multiforme), câncer de próstata, incluindo, porém sem limitação, câncer de próstata dependente de androgênio e câncer de próstata independente de androgênio, e leucemia. Outros cânceres e distúrbios proliferativos celulares serão facilmente reconhecidos na técnica. Os termos “tumorais” e “cancerosas” são utilizados neste documento de modo intercambiável, por exemplo, os dois termos abrangem tumores sólidos e líquidos, por exemplo, difusos ou circulantes. Como utilizado neste documento, o termo “câncer” ou “tumor” inclui pré-malignos, bem como cânceres e tumores malignos. O termo “câncer” deve incluir todos os tipos de crescimentos cancerígenos ou processos oncogênicos, tecidos metastáticos ou células, tecidos ou órgãos transformados malignamente, independentemente do tipo histopatológico ou estágio de invasão. Exemplos de tumores sólidos incluem neoplasias malignas, por exemplo, adenocarcinomas, sarcomas e carcinomas, de vários sistemas orgânicos, como os que afetam mama, fígado, pulmão, cérebro, linfoide, gastrointestinal (por exemplo, cólon), trato geniturinário (por exemplo, células renais, uroteliais), próstata e faringe. Os adenocarcinomas incluem cânceres, como a maioria dos cânceres de cólon, câncer retal,

58 / 348 carcinoma de células renais, câncer de fígado, carcinoma de células não pequenas do pulmão, câncer de intestino delgado e câncer de esôfago.

Em uma modalidade, o câncer é um melanoma, por exemplo, um melanoma em estágio avançado.

As lesões metastáticas dos cânceres mencionados acima também podem ser tratadas ou prevenidas usando os métodos e composições da divulgação.

Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados ou prevenidos incluem câncer de pâncreas, câncer ósseo, câncer de pele, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer de cabeça ou pescoço, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da uretra, câncer de pênis, leucemias crônicas ou agudas, incluindo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, tumores sólidos da infância, linfoma linfocítico, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de pelve renal, neoplasia do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, angiogênese tumoral, tumor no eixo espinal, glioma do tronco cerebral, adenoma hipofisário, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de células T, câncer induzido por ambiente incluindo os induzidos pelo amianto, e combinações dos ditos cânceres.

Tratamento de cânceres metastáticos, por exemplo, cânceres metastáticos que expressam PD-L1 (Iwai et al. (2005) Int.

Immunol. 17: 133 a 144) pode ser efetuado utilizando as moléculas de anticorpo descritas neste documento.

Cânceres exemplificativos cujo crescimento pode ser inibido incluem cânceres tipicamente responsivos à imunoterapia.

Além disso, malignidades recorrentes ou refratárias podem ser tratadas usando as

59 / 348 moléculas descritas neste documento.

[0075] “Agentes quimioterapêuticos” são compostos que são conhecidos por serem usados em quimioterapia para câncer. Exemplos não limitantes de agentes quimioterapêuticos podem incluir agentes alquilantes, como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonatos tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietiiletenofosfosforamida e trietiilenotiofosforamida; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o topotecano análogo sintético); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de oxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda uracil; nitrosureias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, como os antibióticos enedínicos (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama1I e caliqueamicina omegaI1 (consultar, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. Engl., 33: 183 a 186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicinas, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorrubicina,

60 / 348 cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicinas, potifiromicinas, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; um epotilona; etoglucido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; Complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2''-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T- 2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANE® formulação de nanopartículas de paclitaxel, livre de cremofores e projetada com albumina, (American Pharmaceutical Partners,

61 / 348 Schaumberg, Ill.) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); cloranbucil; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE; vinorelbina; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (Camptosar, CPT-11) (incluindo o regime de tratamento de irinotecano com 5-FU e leucovorina); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (VE); oxaliplatina, incluindo o regime de tratamento com oxaliplatina (FOLFOX); lapatinib (Tykerb); inibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por exemplo, erlotinib (Tarceva®)) e VEGF-A que reduzem a proliferação celular e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores ou combinações dos mesmos.

[0076] “Receptores quiméricos de antígeno” (CARs) são receptores de células imunes artificiais (de ocorrência não natural) (por exemplo, células T) contemplados para uso como terapia para o câncer, usando uma técnica chamada transferência de células adotiva. Os CARs também são conhecidos como receptores artificiais de células T, receptores quiméricos de células T ou imunorreceptores quiméricos. As funções de ligação ao antígeno, sinalização e estimulação do complexo foram manipuladas por métodos de recombinação genética a uma única cadeia polipeptídica, geralmente denominada Receptor Quimérico de Antígeno (CAR). Consultar, por exemplo, Eshhar, Pat. no US

7.741.465; Eshhar, Publicação de Pedido de Patente no US 2012/0093842. Os CARs são construídos especificamente para estimular a ativação e proliferação de células T em resposta a um antígeno específico ao qual o CAR se liga. Geralmente, um CAR se refere a um conjunto de polipeptídeos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, que, quando expressos em

62 / 348 uma célula efetora imune, fornecem à célula especificidade para uma célula alvo, tipicamente uma célula cancerígena, e com geração de sinal intracelular.

Em algumas modalidades, um CAR compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno extracelular, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização citoplasmático (também referido neste documento como “um domínio de sinalização intracelular”) compreendendo um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimulante e/ou molécula coestimulante.

Em alguns aspectos, o conjunto de polipeptídeos é contíguo entre si.

Em um aspecto, a molécula estimulante é a cadeia zeta associada ao complexo receptor de células T.

Em um aspecto, o domínio de sinalização citoplasmático compreende ainda um ou mais domínios de sinalização funcionais derivados de pelo menos uma molécula coestimulante, conforme definido abaixo.

Em uma modalidade, a molécula coestimulante é escolhida dentre as moléculas coestimulantes descritas neste documento, por exemplo, 4-lBB (isto é, CD137), CD27 e/ou CD28. Em uma modalidade, o CAR compreende uma sequência líder opcional no terminal amino (N-ter) da proteína de fusão do CAR.

Em uma modalidade, o CAR compreende ainda uma sequência líder no terminal N do domínio extracelular de ligação ao antígeno, em que a sequência líder é opcionalmente clivada do domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um scFv) durante o processamento celular e localização do CAR para a membrana celular.

Em várias modalidades, os CARs são polipeptídeos recombinantes compreendendo um domínio específico de antígeno (ASD), uma região de dobradiça (HR), um domínio transmembranar (TMD), um domínio coestimulante opcional (CSD) e um domínio de sinalização intracelular (ISD). O domínio coestimulante opcional está geralmente ausente nos construtos de CAR de 1a geração.

O antígeno alvo, ligação ao nome de domínio de ligação ao antígeno e sequências de ácidos nucleicos de vários CARS de 1a exemplificativos compreendendo os diferentes domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos vL e

63 / 348 vH, vHH, ligantes e receptores, etc.) descritos nesta divulgação e que coexprimem os módulos de acessórios codificando NEMO-K277A e PAC são apresentados nas SEQ ID NO: 1.594 a 1.899 (Tabelas 12). Esses construtos CAR transportam um peptídeo sinal CD8 humano, uma região transmembrana e dobradiça de CD8 e um domínio de sinalização intracelular de CD3ζ humano. Esses construtos também carregam um ligante MYC entre o domínio de ligação ao antígeno e a região de dobradiça CD8, que é opcional. As sequências de ácidos nucleicos de vários CARS exemplificativos de 1a geração compreendendo os diferentes domínios de ligação ao domínio (por exemplo, fragmentos vL e vH, vHH, ligantes e receptores, etc.) descritos nesta revelação e que coexprimem os módulos de acessórios que codificam vFLIP K13 e PAC de ligação ao antígeno são apresentadas nas SEQ ID NO:

1.016 a 1.317 (Tabela 13). As sequências de ácidos nucleicos de vários CARs de segunda geração exemplificativos compreendendo os diferentes domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos de vL e vH, vHH, ligantes e receptores, etc.) descritos nesta divulgação e incorporando o domínio coestimulante de 41BB são apresentadas nas SEQ ID NO: 1.318 a 1.593 (Tabela 13). Esses construtos de CAR também carregam um ligante MYC entre o domínio de ligação ao antígeno e o domínio transmembranar e um módulo acessório que codifica o gene de resistência à puromicina (PAC) que é separado do cassete CAR por uma sequência Furine-SGSG-T2A. O módulo de acessório que codifica vFLIP-K13, nemo-K277A e PAC é opcional nos CARs de 1a e 2a geração descritos acima. Assim, os CARs com os domínios de ligação ao antígeno (isto é, fragmentos de vL e vH, vHH, ligantes e receptores, etc.) descritos nesta divulgação podem ser construídos sem vFLIP- K13, NEMO-K277A e/ou PAC. Como tal, esses módulos acessórios, juntamente com as sequências de ligante de clivagem a montante (por exemplo, F2A, P2A ou T2A), podem ser excluídos dos CARs representados pelas SEQ ID NO: 1.016 a 1.899. Como alternativa, o módulo acessório que

64 / 348 codifica vFLIP-K13, NEMO-K277A e/ou PAC pode ser substituído por módulos acessórios que codificam outras proteínas, como hNEMO-K277A- deltaV249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E ou IKK1- S176E-S180E e MyD88-L265P, FKBPx2-NEMO, NEMO-L600-FKBPx2, TCL-1A, MTCP-1 e CMV-141, etc. Como usado neste documento, o termo “CAR” ou “CARs” também abrange abordagens mais recentes para conferir especificidade de antígeno às células, como moléculas quiméricas de Anticorpo-TCR ou Ab-TCR ou Ab-TCR (Documento WO 2017/070608 A1 incorporado neste documento a título de referência), proteínas de fusão de receptores de TCR ou TFP (Documento WO 2016/187349 A1 incorporado neste documento a título de referência), Receptores Imunes Sintéticos (SIRs) (consultar o documento WO 2018/102795 A1, incorporado neste documento a título de referência), acoplador de antígeno de célula T multifuncional (Tri- TAC) (consultar o documento WO 2015/117229 A1, incorporado neste documento a título de referência). As sequências de ácidos nucleicos de vários TFPs exemplificativos compreendendo os diferentes domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos de vL e vH, vHH, ligantes e receptores, etc.) descritos nesta divulgação e baseados nas cadeias CD3ε, CD3δ, CD3γ e CD3ζ e coexpressando o módulo acessório opcional NEMO-K277A são apresentadas nas SEQ ID NO: 1.900 a 2.205, 2.206 a 2.511, 2.512 a 2.817,

2.818 a 3.123, respectivamente (Tabela 13). A ordem dos domínios de ligação ao antígeno contidos na construto de diferentes arquiteturas de CAR e BiTE listadas na Tabela 13 é a mesma da ordem dos construtos na arquitetura zCAR-K277A apresentada na Tabela 12. Assim, a SEQ ID NO de aminoácido e ácido nucleico de um CAR pertencente a uma determinada arquitetura (por exemplo, zCAR-K13) e contendo um domínio de ligação a antígeno específico pode ser determinada pelo exame das Tabelas 12 e Tabela

13. Assim, a Tabela 12 mostra que um CAR na arquitetura zCAR-nemo- K277A e contendo o domínio de ligação ao antígeno huFMC63-11-(VL-VH)

65 / 348 do antígeno domínio de ligação é o 2o construo na Tabela 12 e é representado pelas SEQ ID NOs: 1.595 e 5.508 de ácido nucleico e aminoácido, respectivamente.

As SEQ ID NOS de ácido nucleico e de aminoácidos de um CARR correspondente na arquitetura zCAR-K13 podem ser determinadas por exame da Tabela 13, que mostra que o 2o construto nessa arquitetura apresenta as SEQ ID NOS: 1.017 e 4.930 de ácido nucleico e de aminoácidos, respectivamente.

Uma abordagem semelhante pode ser usada para determinar as SEQ ID Nos de ácidos nucleicos e aminoácidos de outros construtos CAR pertencentes a diferentes arquiteturas e BiTEs.

A Tabela 10 fornece as SEQ ID Nos de ácido nucleico e aminoácido de vários CARs exemplificativos pertencentes a diferentes estruturas principais e direcionados à glicoproteína de envelope HIV-1 com base nos domínios de ligação ao antígeno HIV1- N49P6 vL e vH.

A Tabela 11 fornece as SEQ ID Nos de ácido nucleico e aminoácido de vários CARs exemplificativos pertencentes às estruturas principais mostrados na Tabela 10, mas contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno.

Assim, as SEQ ID Nos de ácidos nucleicos e aminoácidos de um CAR em uma estrutura principal específica contendo o domínio de ligação ao antígeno mostrado na Tabela 11 podem ser determinadas determinando primeiro sua ordem de classificação na Tabela 10. Assim, uma vez que o CAR de 1a geração contendo a estrutura principal vFLIP-K13 é o terceiro CAR na lista na Tabela 10, a SEQ ID NO de ácido nucleico de um CAR de 1a geração coexpressando vFLIP-K13 e contendo o domínio de ligação ao antígeno HIV1- N49P7 pode ser facilmente determinada a partir da Tabela 11 como sendo a SEQ ID NO: 8.740 (ou seja, o 3o construto na série começando em 8738). Utilizando uma abordagem semelhante, a SEQ ID NO de aminoácido desse construto de CAR é determinada como sendo SEQ ID NO: 11.438. Como os CARs são de projeto modular, a sequência de ácidos nucleicos e aminoácidos de um CAR/BiTE contendo diferentes domínios de ligação ao antígeno ou módulos acessórios

66 / 348 pode ser facilmente determinada por um indivíduo versado na técnica utilizando a sequência dos diferentes módulos e construtos de CAR e BiTE exemplificativos divulgados nesta divulgação. Tipicamente, são usadas “células CAR-T”, que se referem às células T que foram geneticamente manipuladas para expressar um receptor de antígeno quimérico. Assim, os linfócitos T portadores de tais CARs são geralmente referidos como linfócitos CAR-T. Os CARs também podem ser expressos em células que não sejam células T, como células-tronco hematopoiéticas, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), células NK e macrófagos.

[0077] “Otimização de códon” ou “controle de viés de códon de espécies” se refere ao uso preferencial de códons de uma célula hospedeira específica. Como será entendido por aqueles versados na técnica, pode ser vantajoso modificar uma sequência de codificação para melhorar sua expressão em um hospedeiro específico. O código genético é redundante com 64 códons possíveis, mas a maioria dos organismos geralmente usa um subconjunto desses códons. Os códons que são utilizados com mais frequência em uma espécie são chamados códons ideais, e os que não são utilizados com muita frequência são classificados como códons raros ou de baixo uso.

[0078] Sequências de codificação otimizadas contendo códons preferenciais por um hospedeiro procariótico ou eucariótico específico (consultar também Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 477 a 508) podem ser preparadas, por exemplo, para aumentar a taxa de tradução ou para produzir transcritos de RNA recombinantes com propriedades desejáveis, como uma meia-vida mais longa, em comparação com os transcritos produzidos a partir de uma sequência não otimizada. Os códons de parada de tradução também podem ser modificados para refletir a preferência do hospedeiro. Aqueles versados na técnica reconhecerão que, devido à natureza degenerada do código genético, uma variedade de compostos de DNA que

67 / 348 diferem em suas sequências de nucleotídeos pode ser usada para codificar um determinado polipeptídeo da divulgação.

[0079] Como usado neste documento, “coexpressar” se refere à expressão de dois ou mais polinucleotídeos ou genes. Os genes podem ser ácidos nucleicos que codificam, por exemplo, uma única proteína ou uma proteína quimérica como uma única cadeia polipeptídica. Um CAR ou um TCR descrito neste documento pode ser codificado por uma única cadeia polinucleotídica e expresso como uma cadeia polipeptídica única, que é subsequentemente clivada em polipeptídeos diferentes, cada um representando uma unidade funcional distinta. Em algumas modalidades, em que o CAR ou um TCR consiste em duas ou mais unidades polipeptídicas funcionais, as diferentes unidades funcionais são coexpressas usando uma ou mais cadeias polinucleotídicas. Em uma modalidade, a coestimulação é fornecida por um módulo acessório que é coexpresso com o CAR ou um TCR, mas não é parte integrante do polipeptídeo CAR ou TCR. Tal módulo acessório que fornece coestimulação a uma célula que expressa CAR ou TCR ou qualquer célula, mas não é parte integrante do CAR ou do polipeptídeo TCR, é denominado módulo coestimulante independente de CAR ou CICM. Em outra modalidade, as diferentes cadeias polinucleotídicas são ligadas por sequências de ácidos nucleicos que codificam para ligantes cliváveis (por exemplo, T2A, F2A, P2A, E2A, etc.) (Tabela 6D). Em outra modalidade, um motivo Ser-Gly-Ser-Gly (SGSG) (SEQ ID NO: 4.844) também é adicionado a montante das sequências de ligante cliváveis para aumentar a eficiência da clivagem. Os polinucleotídeos que codificam as diferentes unidades de um CAR ou um TCR podem ser ligados por sequências IRES (Sítios Internos de Entrada Ribossomal). Alternativamente, as diferentes unidades funcionais de um CAR ou TCR são codificadas por dois polinucleotídeos diferentes que não estão ligados por meio de um ligante, mas são codificados por, por exemplo, dois vetores diferentes. As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de

68 / 348 ligantes cliváveis exemplificativos e locais de clivagem Furina são fornecidas na Tabela 6D.

[0080] Uma “substituição conservadora” ou “modificações de sequência conservadoras” se refere a modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram significativamente as características ou funções de ligação da proteína codificada. Por exemplo, “modificações de sequência conservadoras” se refere a modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram significativamente as características ou função de ligação de um construto de CAR da divulgação (por exemplo, uma alteração conservadora na cadeia constante, anticorpo, fragmento de anticorpo ou domínios de ligação a não imunoglobulina). Tais modificações conservadoras incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas por técnicas padrão conhecidas na arte, como mutagênese dirigida ao local e mutagênese mediada por PCR. As substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos que têm cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro de um CAR da divulgação podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeias laterais e o CAR alterado pode ser testado usando os ensaios de ligação e/ou funcionais descritos neste documento.

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[0081] O termo “região constante do receptor de célula T alfa” ou “cadeia constante do receptor de célula T alfa” ou “TCRα” ou “Cα” é definido como a proteína fornecida como SEQ ID NO: 15.041 ou os resíduos equivalentes (isto é, um homólogo) de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares. A divulgação também fornece certas mutações nos polipeptídeos de TCRα que podem ser usadas no construto de SIRs e Ab-TCR (Tabelas 3 e 6D). Por exemplo, os locais de mutação em Cα que demonstram aumento da expressão e diminuição do mau pareamento estão localizados nas posições 91, 92, 93 e 94 da SEQ ID NO

15.041. Um polipeptídeo TCR com uma mutação Thr 48 Cys (T48C) em Cα e uma mutação Ser-57-Cys (S57C) na cadeia Cβ1 ou Cβ2 (descrita mais detalhadamente em outra parte deste documento) resulta em uma ligação dissulfeto adicional entre as duas cadeias constantes do TCR (α e β). Isso, por sua vez, resulta na redução do mau pareamento com cadeias endógenas de TCR em uma célula imune e funcionalidade aprimorada. Da mesma forma, um CAR com uma mutação Ser 61 Arg (S61R) em Cα (SEQ ID NO: 15.048) e uma mutação Arg 79 Gly (R79G) na cadeia Cβ1 ou Cβ2 (descrita mais detalhadamente em outro lugar neste documento) resulta em redução do mau pareamento das cadeias endógenas de TCR e funcionalidade aprimorada devido a um projeto de “botão e orifício” para pareamento. A divulgação fornece polipeptídeos Cα com uma ou mais ou todas as mutações de acordo com a Tabela 3 abaixo, que podem ser usadas na construção de SIRs e Ab- TCR. Tabela 3: Mutações de acordo com a divulgação na região TCR-alfa constante humana (Ca) Aminoácido em tipo Posição (SEQ ID NO: 15.041) Mutação TIPO selvagem 10 Y C ligação dissulfeto 15 S C ligação dissulfeto 45 T C ligação dissulfeto 48 T C ligação dissulfeto 61 S R Botão no Orifício 91 P S Murinização 92 E D Murinização 93 S V Murinização 94 S P Murinização

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[0082] O genoma humano codifica para duas cadeias constantes de TCR beta altamente homólogas; TCR beta1 (TCRβ1 ou TCRb1 ou cβ1) e TCR beta 2 (TCRβ2 ou TCRb2 ou cβ2). Os CARs da divulgação podem compreender qualquer uma dessas duas cadeias. Da mesma forma, as cadeias TCR beta1 ou TCR beta2 de outras espécies de mamíferos podem ser usadas nos métodos da divulgação.

[0083] O termo “cadeia constante do receptor de célula T-beta 1” ou “região constante do receptor de célula T-beta 1” (TCR-beta1 ou TCRβ1 ou TCRb1 ou TCRb1 ou hTCR-beta1 ou Cβ1) é definido como uma proteína fornecida como SEQ ID NO: 15.051 ou os resíduos equivalentes (isto é, um homólogo) de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares.

[0084] O termo “cadeia constante do receptor de célula T-beta 2” ou “região constante do receptor de célula T-beta 2” (TCR-beta2 ou TCRβ2 ou TCRb2 ou Cβ2) é definido como a proteína fornecida como SEQ ID NO:

15.052 ou resíduos equivalentes (isto é, um homólogo) de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares.

[0085] O termo “cadeia constante do receptor de células T-beta” ou “região constante do receptor de células T-beta” (TCR-beta ou TCRβ ou TCRb ou Cβ)” é definido como a proteína fornecida como SEQ ID NO:

15.051 a 15.053 ou os resíduos equivalentes (isto é, um homólogo) de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares.

[0086] As sequências de proteínas para Cβ2 (SEQ ID NO: 15.052) e Cβ1 (SEQ ID NO: 15.051) são conhecidas (Tabela 6D). As diferenças entre as sequências de Cβ2 e β1 são facilmente identificadas pelo alinhamento das sequências usando a habilidade típica e comum na técnica. A divulgação também fornece certas mutações aos TCRβ que podem ser usadas na construto de SIRs e Ab-TCRs. Por exemplo, locais de mutação em Cβs que

71 / 348 demonstram aumento da expressão e diminuição do mau pareamento com as cadeias endógenas de TCRα são fornecidos neste documento. Esses locais de mutação em Cβ1 e Cβ2 estão localizados nas posições 18, 22, 57, 79 133, 136 e 139 das SEQ ID NOs: 15.051 e 15.052 e estão resumidos nas Tabelas 4 e 5 abaixo. Os locais de mutação em Cβ1 e Cβ2 são idênticos em suas posições. A única diferença entre as duas sequências é uma mutação na posição 136. Nessa posição, um ácido glutâmico (E) está presente em Cβ2, enquanto uma valina está presente em Cβ1. Tabela 4: Mutações de acordo com a divulgação na região TCR-beta constante humana1 (Cβ1) Aminoácido em tipo Posição (SEQ ID NO: 15.051) Mutação TIPO selvagem 15 E C ligação dissulfeto 17 S C ligação dissulfeto 18 E K ou R Murinização 22 S A Murinização 57 S C ligação dissulfeto 59 D C ligação dissulfeto 77 S C ligação dissulfeto 79 R G Botão no Orifício 133 F I Murinização 136 V A Murinização 139 Q H Murinização Tabela 5: Mutações de acordo com a divulgação na região TCR-beta constante humana2 (Cβ2) Aminoácido em tipo Posição (SEQ ID NO: 15.052) Mutação TIPO selvagem 15 E C ligação dissulfeto 17 S C ligação dissulfeto 18 E K ou R Murinização 22 S A Murinização 57 S C ligação dissulfeto 59 D C ligação dissulfeto 77 S C ligação dissulfeto 79 R G Botão no Orifício 133 F I Murinização 136 E A Murinização 139 Q H Murinização

[0087] O termo “cadeia constante de TCR-gama” ou “região constante de TCR-gama” (TCR-gama ou TCRγ ou TCRg ou TCR-gama1 ou TCRγ1 ou TCRg1 ou Cγ) é definido como a proteína fornecida como SEQ ID NO: 15.068 ou os resíduos equivalentes (isto é, um homólogo) de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares.

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[0088] O termo “cadeia constante de TCR-delta” ou “região constante de TCR-delta” (TCR-delta ou TCRδ ou TCRd ou Cδ) é definido como as proteínas fornecidas como SEQ ID NO: 15.069 ou os resíduos equivalentes (ou seja, um homólogo) de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares.

[0089] Será reconhecido que as proteínas podem ter identidade ou homologia entre si e reter funções semelhantes ou idênticas. A divulgação inclui regiões constantes do TCR que têm identidade de 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98,5%, 99% ou 99,9% a qualquer uma das sequências descritas neste documento, mantendo a atividade biológica.

[0090] Por conseguinte, a divulgação fornece uma cadeia constante de receptor de células T tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15.041 e que pode ter uma ou mais mutações nas posições 61, 91, 92, 93 e/ou 94; (b) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15.051 e pode ter uma ou mais mutações nas posições 18, 22, 57, 79, 133, 136, e/ou 139; (c) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15.052 e pode ter uma ou mais mutações na posição 18, 22, 57, 79, 133, 136, e/ou 139; (d) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15.068; e (e) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO:

15.069. As cadeias constantes de receptores de células T de qualquer um de (a) a (e) retêm pelo menos uma atividade biológica da cadeia constante de receptores de células T de tipo selvagem com os quais as mesmas têm identidade ou homologia.

[0091] O termo “constitutivamente ativo” se refere a uma molécula, por exemplo, uma proteína, que tem atividade de sinalização sem a necessidade de um estímulo. Proteínas ativas constitutivas exemplificativas são NEMO-K277A e vFLIP K13 visto que podem ativar a sinalização de NF-

73 / 348 κB quando expressas em uma célula adequada, sem a necessidade de estímulo adicional.

[0092] O termo “molécula coestimulante” ou “receptor coestimulante” se refere a um parceiro de ligação cognato em uma célula T que se liga especificamente a um ligante coestimulante, mediando, assim, uma resposta coestimulante pela célula T, como, porém sem limitação, proliferação. Moléculas extracelulares coestimulantes são moléculas de superfície celular que não são receptores de antígenos ou seus ligantes que contribuem para uma resposta imune eficiente. Moléculas coestimulantes incluem, porém sem limitação, uma molécula de MHC classe I, BTLA e um receptor de ligante Toll, além de OX40, Dap10, CD27, CD28, CD2, CD5, CD8, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), Lck, TNFR-I, TNFR- II, Fas, CD30, CD40 e 4-1BB (CD137). Outros exemplos dessas moléculas coestimulantes incluem CD8, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDllc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDlOO (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IP0-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, e um ligante que se liga especificamente a CD83. Um receptor coestimulante pode ser expresso em células de outras células T, como células NK ou macrófagos.

[0093] Um “domínio de sinalização intracelular coestimulante” ou “domínio coestimulante” (CSD) pode ser a porção intracelular de um receptor coestimulante. Uma molécula coestimulante pode ser representada nas

74 / 348 seguintes famílias de proteínas: proteínas receptoras de TNF, proteínas semelhantes a imunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de ativação linfocítica de sinalização (proteínas SLAM) e ativação de receptores de células NK. Exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM- 1, antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1), CD2, CD8, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3 e um ligante que se liga especificamente a CD83 e similares. O domínio de sinalização intracelular pode compreender a porção intracelular inteira, ou o domínio de sinalização intracelular nativo inteiro, da molécula da qual é derivada, ou um fragmento ou derivado funcional da mesma. Os CARs da divulgação pode compreender um ou mais domínios de coestimulantes.

[0094] O termo “cTCR” se refere a uma sequência de codificação de ácido nucleico de TCR do tipo selvagem e à proteína correspondente de TCR do tipo selvagem ligada a um domínio de ligação ao antígeno. cTCRs são usados em algumas modalidades e controles de referência. Por exemplo, um cTCR que tem um domínio de ligação a CD19 e um CD19-CAR (compreendendo uma cadeia de TCR mutante e domínio de ligação a CD19) terá expressão diferente e/ou afinidades de ligação diferentes ao antígeno alvo.

[0095] O termo “citossólico” ou “citoplasmático” se refere a um agente, por exemplo, uma proteína, que está situada no citoplasma de uma célula em sua forma madura. Uma proteína citosólica pode se translocar para o núcleo, mas não é uma proteína transmembranar e não é secretada fora da célula. Uma proteína citosólica exemplificativa é vFLIP K13.

[0096] O termo “distúrbios degenerativos” se refere a uma doença que é o resultado de um processo contínuo baseado em alterações celulares degenerativas, afetando tecidos ou órgãos, que se deterioram cada vez mais

75 / 348 com o tempo, seja devido ao desgaste corporal normal ou a escolhas de estilo de vida, como exercício ou alimentação hábitos. Exemplos de doenças degenerativas incluem doença de Alzheimer, doença de Charcot-Marie-Tooth, doença de Creutzfeldt-Jakob, ataxia de Friedreich, diabetes mellitus (tipo II) e aterosclerose.

[0097] “Derivado de”, como o termo é usado neste documento, indica uma relação entre uma primeira e uma segunda molécula. Refere-se, de modo geral, à similaridade estrutural entre a primeira molécula e uma segunda molécula e não conota ou inclui um processo ou uma fonte de limitação na primeira molécula que é derivada a partir de uma segunda molécula. Por exemplo, no caso de um domínio de ligação ao antígeno que é derivado de uma molécula de anticorpo, o domínio de ligação ao antígeno retém uma estrutura de anticorpo suficiente, de modo que tenha a função necessária, a saber, a capacidade de se ligar a um antígeno. Não conota ou inclui uma limitação a um processo particular de produzir o anticorpo, por exemplo, isso não quer dizer que, para se obter o domínio de ligação ao antígeno, deve-se começar com uma sequência de anticorpo e excluir sequência indesejada, ou impor mutações, para chegar ao domínio de ligação ao antígeno.

[0098] “Molécula de dimerização”, como o termo é usado neste documento, se refere a uma molécula que promove a associação de um primeiro domínio de troca com um segundo domínio de troca. Nas modalidades, a molécula de dimerização não ocorre naturalmente no sujeito ou não ocorre em concentrações que resultariam em dimerização significativa. Nas modalidades, a molécula de dimerização é uma molécula pequena, por exemplo, rapamicina ou um rapálogo, por exemplo, RAD001, Rimiducid ou AP20187. Rimiducid (AP1903) é um análogo de tacrolimus permeável a lipídios com atividade homodimerizante. O Rimiducid homodimeriza um análogo da proteína humana FKBP12 (Fv) que contém uma única substituição ácida (Phe36Val). O Rimiducid é utilizado para homodimerizar os domínios

76 / 348 de ligação a fármaco contendo Fv do receptor imune de ocorrência não natural, resultando na ativação da sinalização a jusante durante a terapia celular. O Rimiducid pode estar em cerca de 0,01 a 1 mg/kg e tem um EC50 em cultura de células de cerca de 0,1 nM. O AP20187 pode ser administrado de cerca de 2 a 10 mg/kg/dia em doses únicas ou múltiplas.

[0099] A frase “doença associada à expressão de um antígeno alvo” ou “antígeno associado à doença, conforme descrito neste documento” inclui, porém sem limitação, uma doença associada à expressão de um antígeno alvo, conforme descrito neste documento, ou afecção associada a células que expressam um antígeno alvo como descrito neste documento, incluindo, por exemplo, doenças proliferativas, como câncer ou malignidade ou uma condição pré-cancerosa, como mielodisplasia, síndrome mielodisplásica ou pré-leucemia; ou uma indicação não relacionada ao câncer associada a células que expressam um antígeno alvo como descrito neste documento. Em um aspecto, um câncer associado à expressão de um antígeno tumoral, como descrito neste documento, é um câncer hematológico. Em um aspecto, um câncer associado à expressão de um antígeno tumoral como descrito neste documento é um câncer sólido. Outras doenças associadas à expressão de um antígeno tumoral descritas neste documento incluem, porém sem limitação, cânceres atípicos e/ou não clássicos, doenças malignas, afecções pré- cancerosas ou doenças proliferativas associadas à expressão de um antígeno tumoral, como descrito neste documento. As indicações não relacionadas ao câncer associadas à expressão de um antígeno alvo, como descrito neste documento, incluem, porém sem limitação, por exemplo, doença autoimune (por exemplo, lúpus), distúrbios inflamatórios (alergia e asma) e transplante. Em algumas modalidades, as células que expressam antígeno alvo expressam, ou expressaram em algum momento,mRNA que codifica o antígeno alvo. Em outra modalidade, as células que expressam antígeno alvo produzem a proteína antigênica alvo (por exemplo, tipo selvagem ou mutante), e a

77 / 348 proteína antigênica alvo pode estar presente em níveis normais ou níveis reduzidos. Em outra modalidade, as células que expressam antígeno alvo produziram níveis detectáveis de uma proteína antigênica alvo em algum momento e subsequentemente produziram substancialmente nenhuma proteína antigênica alvo detectável.

[00100] “Doença direcionada por células geneticamente modificadas”, conforme usado neste documento, abrange o alvejamento de qualquer célula envolvida de qualquer maneira em qualquer doença pelas células geneticamente modificadas da invenção, independentemente de as células geneticamente modificadas atingirem células doentes ou células saudáveis para efetivar um resultado terapeuticamente benéfico. As células geneticamente modificadas incluem, porém sem limitação, células T geneticamente modificadas, células NK, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco embrionárias pluripotentes ou células-tronco embrionárias. As células geneticamente modificadas expressam os CARs convencionais e as estruturas principais inovadoras contendo CARs convencionais com módulos acessórios da invenção, cujos CARs podem atingir qualquer um dos antígenos expressos na superfície das células alvo. Exemplos de antígenos que podem ser direcionados incluem, porém sem limitação, antígenos expressos nas células B; antígenos expressos em carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemia, tumores de células germinativas e blastomas; antígenos expressos em várias células imunes; e antígenos expressos nas células associadas a várias doenças hematológicas, doenças autoimunes e/ou doenças inflamatórias. Outros antígenos que podem ser direcionados serão evidentes para aqueles versados na técnica e podem ser direcionados pelos CARs da invenção em conexão com modalidades alternativas do mesmo.

[00101] O termo “constante de dissociação (K d)” é definido como a constante de equilíbrio da dissociação de uma interação receptor-ligante.

[00102] Como utilizado neste documento, um “conjunto diversificado

78 / 348 de receptores imunes de ocorrência não natural” ou “conjunto diversificado de SIRs” ou “conjunto diversificado de CARs” se refere a uma pluralidade de receptores imunes de ocorrência não natural com o mesmo domínio de ligação vinculado a um conjunto diversificado de cadeias constantes de receptor de célula T ou “estruturas principais” em que cada construto compreendendo um domínio de ligação e uma cadeia constante ou estrutura principal de célula T diferente fornece uma gama diversa de ligação a um antígeno alvo e/ou níveis de expressão variados.

Por exemplo, dependendo da composição de mutação do domínio constante (por exemplo, TCRa + TCRb mutante), a afinidade de ligação do domínio de ligação ao seu alvo varia.

Em algumas modalidades, um SIR da divulgação (fita simples ou heterodímero) compreende uma afinidade de ligação que é maior que um TCR de tipo selvagem (por exemplo, cTCR) com o mesmo domínio de ligação.

Em uma modalidade, um SIR tem um nível de expressão mais alto do que um cTCR em pelo menos 1,25 vezes a cerca de 10.000 vezes mais (e qualquer número intermediário), em que o SIR e o cTCR diferem apenas na mutação no domínio TCR.

Em outra modalidade, um SIR tem uma afinidade de ligação para um alvo que é pelo menos 1,5 vezes superior a cerca de 10.000 vezes superior a um cTCR com um domínio de ligação ao mesmo antígeno.

Em ainda outra modalidade, o SIR tem uma afinidade de ligação mais alta que um cTCR para o mesmo antígeno, mas menor que um receptor de antígeno quimérico (CAR) tendo o mesmo domínio de ligação.

Em algumas modalidades, a ligação de uma célula efetora que expressa SIR ao antígeno alvo é pelo menos 1,25 vezes mais do que a ligação de uma célula efetora expressando cTCR correspondente, mas menos de 100.000 vezes mais que o cTCR correspondente.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno tem uma constante de dissociação (KD, refletindo a sua afinidade de ligação) a partir de entre cerca de 10-4 M a 10-8 M.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antígeno se liga a um ou mais dos antígenos citados

79 / 348 acima. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno tem uma KD de entre cerca de 10- 4 M a 10-8 M, por exemplo, entre cerca de 10- 5 M a 10-7 M, por exemplo, entre cerca de 10-5 M a 10-6 M, para o antígeno alvo. Em uma modalidade, a afinidade de ligação do domínio de ligação ao antígeno é pelo menos cinco vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou

1.000 vezes menos que um anticorpo de referência. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno codificado tem uma afinidade de ligação pelo menos 5 vezes menor que um anticorpo de referência. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo do qual o domínio de ligação ao antígeno é derivado. Por exemplo, a divulgação contempla uma população diversificada de SIRs contra um alvo de antígeno específico que pode ser projetado e rastreado com base na otimização do códon da sequência de ácidos nucleicos e/ou na mutação na cadeia do TCR para promover o emparelhamento ou expressão e/ou o uso de um vinculador entre o domínio de ligação e o domínio TCR.

[00103] Como utilizado neste documento, um “epítopo” é definido como a porção de um antígeno capaz de provocar uma resposta imune ou a porção de um antígeno que se liga a um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Os epítopos podem ser uma sequência ou subsequência proteica.

[00104] O termo “vetor de expressão” se refere a um vetor compreendendo um polinucleotídeo recombinante compreendendo sequências de controle de expressão operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de ação cis suficientes para expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos os conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomos) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus associados a adena) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

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[00105] O termo “porção funcional”, quando usado em referência a um CAR, se refere a qualquer parte ou fragmento do CAR, parte ou fragmento que retém a atividade biológica do CAR do qual faz parte (o CAR de origem). As porções funcionais abrangem, por exemplo, as partes de um CAR que retêm a capacidade de reconhecer células-alvo, ou detectar, tratar ou prevenir uma doença, em uma extensão semelhante, na mesma extensão ou em uma extensão maior, que o CAR de origem.. Em referência ao CAR de origem, a porção funcional pode compreender, por exemplo, cerca de 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% ou mais, do CAR de origem.

[00106] “Células geneticamente modificadas”, “células redirecionadas”, “células geneticamente manipuladas” ou “células modificadas”, conforme utilizadas neste documento, se referem a células que expressam um CAR da divulgação. Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas compreendem vetores que codificam um CAR. Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas compreendem vetores que codificam um CAR e uma ou mais moléculas acessórias no mesmo vetor. Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas compreendem um primeiro vetor que codifica um CAR e um segundo vetor que codifica a molécula acessória. Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas compreendem um primeiro vetor que codifica um CAR e um segundo vetor que codifica mais de uma molécula acessória. Em algumas modalidades, as células geneticamente modificadas compreendem um primeiro vetor que codifica um CAR e um segundo vetor que codifica a primeira molécula acessória e um terceiro vetor que codifica uma segunda molécula acessória.

[00107] “Região de dobradiça” (HR), conforme utilizado neste documento, se refere à região hidrofílica que está entre o domínio de ligação ao antígeno e o domínio transmembranar. As regiões de dobradiça incluem, porém sem limitação, fragmentos Fc de anticorpos ou fragmentos ou

81 / 348 derivados dos mesmos, regiões de dobradiça de anticorpos ou fragmentos ou derivados dos mesmos, regiões CH2 de anticorpos, regiões CH3 de anticorpos, sequências espaçadoras artificiais ou combinações dos mesmos. Exemplos de regiões de dobradiça incluem, porém sem limitação, dobradiça de CD8a, e espaçadores artificiais produzidos a partir de polipeptídeos que podem ser tão pequenos quanto, por exemplo, os domínios Gly3 ou CH1 e CH3 de IgGs (como IgG4 humana). Em algumas modalidades, a região de dobradiça é qualquer uma ou mais de (i) uma região de dobradiça, CH2 e CH3 de IgG4, (ii) uma região de dobradiça de IgG4, (iii) uma região de dobradiça e CH2 de IgG4, (iv) uma dobradiça região de CD8a, (v) uma região de dobradiça, CH2 e CH3 de IgG1, (vi) uma região de dobradiça de IgG1 ou (vi) uma região de dobradiça e CH2 de IgG1. Outras regiões de dobradiça serão evidentes para aqueles versados na técnica e podem ser usadas em conexão com modalidades alternativas da divulgação.

[00108] O termo “distúrbio imunológico” se refere a uma doença caracterizada por disfunção do sistema imunológico. Uma doença autoimune é uma afecção decorrente de uma resposta imune anormal a uma parte normal do corpo. Existem pelo menos 80 tipos de doenças autoimunes.

[00109] “Célula imune”, conforme utilizado neste documento, se refere às células do sistema imunológico de mamíferos, incluindo, entre outras, células que apresentam antígeno, células B, basófilos, células T citotóxicas, células dendríticas, eosinófilos, granulócitos, células T auxiliares, leucócitos, linfócitos, macrófagos, mastócitos, células de memória, monócitos, células exterminadoras naturais, neutrófilos, fagócitos, células plasmáticas e células T.

[00110] “Célula efetora imune”, como esse termo é usado neste documento, se refere a uma célula que está envolvida em uma resposta imune, por exemplo, na promoção de uma resposta efetiva imune. Exemplos de células efetoras imunes incluem células T, por exemplo, células T alfa/beta e

82 / 348 células T gama/delta, células B, células exterminadoras naturais (NK), células exterminadoras naturais T (NKT), mastócitos e fagócitos derivados do mieloide.

[00111] “Função efetiva imune” ou “resposta efetiva imune”, “função efetiva” se refere à função especializada de uma célula diferenciada. A função efetora de uma célula T, por exemplo, pode ser atividade citolítica ou atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas. Por exemplo, uma função ou resposta efetora imune se refere a uma propriedade de uma célula T ou NK que promove a morte ou a inibição do crescimento ou proliferação de uma célula alvo. No caso de uma célula T, a estimulação primária e a coestimulação são exemplos de função ou resposta efetora do sistema imunológico. No caso de células que apresentam antígenos (por exemplo, células dendríticas), a apresentação de antígenos e a secreção de citocinas são exemplos de funções efetoras.

[00112] “Resposta imune”, conforme usado neste documento, se refere a imunidades, incluindo, porém sem limitação, imunidade inata, imunidade humoral, imunidade celular, imunidade, resposta inflamatória, imunidade adquirida (adaptativa), autoimunidade e/ou imunidade hiperativa.

[00113] Um “domínio de sinalização intracelular” (ISD) ou “domínio citoplasmático” como o termo é usado neste documento se refere a uma porção de sinalização intracelular de uma molécula. O domínio de sinalização intracelular gera um sinal que promove uma função efetora imunológica da célula. Exemplos de funções efetoras imunológicas incluem a atividade citolítica e a atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas. Exemplos de domínios que efetuam transdução do sinal da função efetora incluem, porém sem limitação, a cadeia z do complexo receptor de células T ou qualquer um de seus homólogos (por exemplo, cadeia h, cadeias FceR1g e b, cadeia MB1 (Iga), cadeia B29 (Igb), etc.), cadeia zeta CD3 humana, polipeptídeos CD3 (D, d e e), tirosina quinases da família syk (Syk, ZAP 70,

83 / 348 etc.), tirosina quinases da família src (Lck, Fyn, Lyn, etc.) e outras moléculas envolvidas na transdução de células T, como CD2, CD5 e CD28. Outros domínios de sinalização intracelular serão evidentes para aqueles versados na técnica e podem ser usados em conexão com modalidades alternativas da divulgação.

[00114] Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio de sinalização intracelular primário. Os domínios de sinalização intracelular primários exemplificativos incluem aqueles derivados das moléculas responsáveis pela estimulação primária ou simulação dependente de antígeno. Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio intracelular coestimulante. Os domínios de sinalização intracelular coestimulantes exemplificativos incluem aqueles derivados de moléculas responsáveis por sinais coestimulantes ou estimulação independente do antígeno. Por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário pode compreender uma sequência citoplasmática de CD3z, e um domínio de sinalização intracelular coestimulante pode compreender a sequência citoplasmática do correceptor ou molécula coestimulante, como CD28 ou 41BB.

[00115] Um domínio de sinalização intracelular primário pode compreender um motivo de sinalização que é conhecido como um motivo de ativação à base de tirosina imunoreceptora ou ITAM. Exemplos de ITAM contendo sequências primárias de sinalização citoplasmática incluem, porém sem limitação, derivados de CD3 zeta, FeR gama comum (FCER1G), Fe gama RIIa, FeR beta (Fe Epsilon R1b), CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD79a, CD79b, DAPlO e DAP12.

[00116] O termo “isolado”, conforme utilizado neste documento, se refere a moléculas ou produtos biológicos ou celulares sendo substancialmente livres de outros materiais. Em um aspecto, o termo “isolado” se refere a ácido nucleico, como DNA ou RNA, ou proteína ou

84 / 348 polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo ou seu derivado), ou célula ou organela celular, ou tecido ou órgão, separado de outros DNAs ou RNAs, proteínas ou polipeptídeos, células ou organelas celulares, tecidos ou órgãos, respectivamente, que estão presentes na fonte natural. O termo “isolado” também se refere a um ácido nucleico ou peptídeo que é substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura quando produzido por técnicas de DNA recombinante ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. Além disso, um “ácido nucleico isolado” deve incluir fragmentos de ácido nucleico de ocorrência não natural como fragmentos e não seriam encontrados no estado natural. O termo “isolado” também é usado neste documento para se referir a polipeptídeos que são isolados de outras proteínas celulares e é destinado a abranger polipeptídeos purificados e recombinantes. O termo “isolado” também é usado neste documento para se referir a células ou tecidos que são isolados de outras células ou tecidos e é destinado a abranger células ou tecidos cultivados e manipulados geneticamente.

[00117] Como usado neste documento, o termo “ligante” (também “domínio ligante” ou “região ligante”) se refere a um oligo ou polipeptídeo (ou um oligo que codifica o polipeptídeo) que une dois ou mais domínios ou regiões de um polinucleotídeo CAR ou polipeptídeo, respectivamente, divulgado neste documento. O ligante pode ter de 1 a 500 aminoácidos de comprimento ou 3 a 1500 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o “ligante” é clivável ou não clivável. Salvo indicação em contrário, o termo “ligante” utilizado neste documento significa um ligante não clivável. Os referidos ligantes não cliváveis podem ser compostos de resíduos flexíveis que permitem a liberdade de movimento de doaminas proteicas adjacentes uma em relação à outra. Exemplos não limitantes de tais resíduos incluem glicina e serina. Em algumas modalidades, os ligantes incluem resíduos não flexíveis. Exemplos de ligantes cliváveis incluem

85 / 348 ligantes 2A (por exemplo T2A), ligantes do tipo 2A ou seus equivalentes funcionais e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os ligantes incluem o ligante do tipo picornaviral 2A, sequências CHYSEL de teschovírus porcino (P2A), vírus Thosea asigna (T2A) ou combinações, variantes e equivalentes funcionais dos mesmos. Em algumas modalidades, as sequências de ligação podem compreender um motivo que resulta na clivagem entre a glicina 2A e a prolina 2B (consultar, por exemplo, sequência T2A, SEQ ID NO: 4.839 e 4.840, terminal C Gly-Pro). As sequências nucleicas de vários ligantes cliváveis exemplificativos são fornecidas na SEQ ID NO: 925 a SEQ ID NO: 930, e as sequências de aminoácidos de vários ligantes exemplificativos são fornecidas nas SEQ ID NO: 4.838 a SEQ ID NO: 4.843. Outros ligantes cliváveis que podem ser usados neste documento são facilmente observados por aqueles versados na técnica.

[00118] Em uma modalidade, um motivo Ser-Gly-Ser-Gly (SGSG) (SEQ ID NOs: 931 a 32) também é adicionado a montante das sequências de ligação cliváveis para aumentar a eficiência da clivagem. Uma desvantagem potencial dos ligantes cliváveis é a possibilidade de que o pequeno marcador 2A deixado no final da proteína N-terminal possa afetar a função da proteína ou contribuir para a antigenicidade das proteínas. Para superar essa limitação, em algumas modalidades, um local de clivagem furina (RAKR) (SEQ ID NO: 933 a 935) é adicionado a montante dos motivos SGSG para facilitar a clivagem do peptídeo 2A residual após a tradução.

[00119] O termo “ligante polipeptídico flexível”, conforme utilizado neste documento, se refere a um ligante peptídico que consiste em aminoácidos, como resíduos de glicina e/ou serina, utilizados isoladamente ou em combinação, para ligar as cadeias polipeptídicas (por exemplo, regiões variáveis pesadas e variáveis da cadeia leve juntas) Em uma modalidade, o ligante polipeptídico flexível é um ligante Gly/Ser e compreende a sequência de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n, (SEQ ID NO: 4.191 a 4.192) em que n é

86 / 348 um número inteiro positivo igual ou maior que 1. Por exemplo, n = 1, n = 2, n = 3, n = 4, n = 5 e n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 e n = 10. Em uma modalidade, os ligantes polipeptídicos flexíveis incluem, porém sem limitação, (Gly4Ser)4 ou (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 4.193 ou 4.194). Também estão incluídos no escopo da divulgação os ligantes descritos no documento W02012/138475, incorporados neste documento a título de referência).

[00120] O termo “lentivírus” se refere a um gênero da família Retroviridae. Os lentivírus são únicos entre os retrovírus por serem capazes de infectar células que não se dividem; os mesmos podem fornecer uma quantidade significativa de informações genéticas no DNA da célula hospedeira, portanto, são um dos métodos mais eficientes de um vetor de entrega de genes. HIV, SIV e FIV são todos exemplos de vírus lenti.

[00121] O termo “vetor lentiviral” se refere a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de lentivírus, incluindo especialmente um vetor lentiviral autoinativador, conforme fornecido em Milone et al. Mol. Ther. 17 (8): 1.453 a 1.464 (2009). Outros exemplos de vetores de lentivírus que podem ser utilizados na clínica incluem, entre outros, por exemplo, a tecnologia de entrega de genes LENTIVECTOR® da Oxford BioMedica, o sistema de vetores LENTIMAX™ da Lentigen e similares. Tipos não clínicos de vetores lentivirais também estão disponíveis e seriam conhecidos por um indivíduo versado na técnica. Outros exemplos de vetores de lentivírus são pLENTI-EF1α (SEQ ID NO: 3.837), pLENTI-EF1α-DWPRE (SEQ ID NO:

3.838), pCCLc-MNDU3-WPRE (SEQ ID NO: 7.779) e pCCLc-MNDU3- Eco-Nhe -Sal-WPRE (SEQ ID NO: 7.780). O pLenti-EF1a-DWPRE foi derivado do vetor pLENTI-EF1α por deleção da sequência WPRE. Um fragmento Sac II interno foi excluído do promotor EF1α para gerar o promotor EF1alpha (EF1a)-D-SACII (SEQ ID NO: 3.842). Em uma modalidade exemplificativa, o fragmento de ácido nucleico que codifica um CAR, CAR mais módulo (ou módulos) acessório ou o módulo (ou módulos)

87 / 348 acessório pode ser clonado entre os locais Nhe I e Sal I presentes nos vetorespLENTI-EF1α e no pCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE utilizando métodos conhecidos na arte.

[00122] “Mamífero”, conforme usado neste documento, se refere a qualquer membro da classe Mammalia, incluindo, sem limitação, seres humanos e primatas não humanos, como chimpanzés e outros macacos e espécies de macacos; animais de fazenda como gado, ovelhas, porcos, cabras e cavalos; mamíferos domésticos, como cães e gatos; animais de laboratório incluindo roedores, tais como ratinhos, ratos e porquinhos da Índia, e similares. O termo não indica uma idade ou sexo específico. Assim, indivíduos adultos e recém-nascidos, bem como fetos, masculinos ou femininos, devem ser incluídos no escopo deste termo.

[00123] “DNA nu”, como utilizado neste documento, se refere ao DNA que codifica um CAR clonado em um vetor de expressão adequado em orientação adequada para expressão. Os vetores virais que podem ser utilizados incluem, porém sem limitação, vetores lentivirais do SIN, vetores retrovirais, vetores de vírus espumosos, vetores de vírus adeno-associado (AAV), vetores híbridos e/ou transposões plasmídicos (por exemplo, sistema de transposão da Bela Adormecida) ou sistemas de vetor com base em integrase. Outros vetores que podem ser utilizados em conexão com modalidades alternativas da invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica.

[00124] “Nativo” ou “Ocorrendo naturalmente” ou “endógeno”, conforme usado neste documento, se refere a um gene, proteína, ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA, etc.) ou fragmento do mesmo que é nativo a uma célula ou é naturalmente expresso em uma célula. Assim, um polipeptídeo de cadeia TCRα nativo ou endógeno de uma célula T consiste em um domínio variável (Vα) ligado a uma cadeia constante TCRα. O polipeptídeo precursor da cadeia TCRα nativa ou endógena também consiste

88 / 348 em um peptídeo sinal terminal amino que é clivado a partir do polipeptídeo maduro.

[00125] O modulador Essencial NF-Kappa-B (NEMO) se refere a um componente de proteína estrutural do complexo IκB quinase necessário para a ativação de NF-kB. O NF-κB é um fator de transcrição que controla a inflamação, a proliferação celular e a apoptose.

[00126] “Via de NF-κB” ou “via de sinalização de NF-κB” se refere a uma via de transdução de sinal que resulta na translocação nuclear de subunidades de NF-κB e ativação transcricional dos genes responsivos à subunidade de NF-κB. NF-κB se refere à família de fatores de transcrição envolvidos na expressão regulada de vários genes envolvidos na resposta inflamatória e imune. Cinco membros conhecidos dessa família foram caracterizados até à data atual e incluem c-Rel, NF-κB1 (p50 e seu precursor p105), NF-κB2 (p52 e seu precursor p105), p65 (RelA) e RelB. Embora muitas formas diméricas de NF-κB têm sido descritas, o complexo de NF-κB clássico é um heterodímero de p65/RelA e subunidades p50 e é encontrado na maioria das células em associação com uma família de proteínas inibidoras, chamado IκBs, das quais a mais comum é IκBα. Na via clássica de NF-kB, a estimulação por uma série de citocinas, tais como TNFα e IL-1, resulta na ativação de um complexo de multissubunidade IκB quinase (IKK), que contém duas subunidades catalíticas, IKK1/IKKαI e IKK2/IKKβ, e uma subunidade reguladora, NEMO/IKKγ. O complexo IKK ativado leva à fosforilação induzida de proteínas Iκ B e a sua degradação subsequente, libertando, assim, NF-κB a partir de sua influência inibidora. Uma vez liberado, NF-κB está livre para migrar para o núcleo e se ligar ao promotor de genes específicos que têm o seu local de ligação cognato. A atividade transcricional dos dímeros NF-κB no núcleo é ainda modificada por sua fosforilação. Uma via alternativa (ou não canônica) de ativação de NF-κB, que envolve a processamento mediado por proteassoma de p100/NF-κB2 em

89 / 348 subunidade p52, foi descrita.

[00127] “Molécula estimulante de NF-κB” ou “estimulante de NF-κB” ou “ativador de NF-κB” se refere a um subconjunto de moléculas acessórias que promovem a atividade da via de sinalização de NF-κB ou a atividade/expressão dos genes alvo a jusante da via de sinalização de NF-κB. Em algumas modalidades, um ativador de NF-κB é um agente ativador de NF-κB de ocorrência não natural. Um exemplo de agente ativador de NF-κB de ocorrência não natural é o hNEMO-K277A. Em uma modalidade, a molécula estimulante de NF-κB ou estimulante de NF-κB é um estimulante seletivo de NF-κB ou um ativador seletivo de NF-κB. Um “ativador de NF- kB seletivo” ou um “estimulante de NF-kB seletivo”, tal como descrito neste documento, se refere a um agente que ativa a via NF-kB de sinalização seletivamente sem ou com ativação mínima das outras vias de sinalização. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB ativa a via de sinalização de NF-κB sem ativação ou ativação mínima de uma ou mais vias de sinalização selecionadas do grupo de AKT, PI3K, JNK, p38 quinase, ERK, JAK/STAT e vias de sinalização de interferon. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB ativa a via de sinalização de NF-κB sem ativação ou ativação mínima da via de sinalização de AKT. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB ativa a via de sinalização de NF-κB sem ativação ou ativação mínima da via de sinalização de AKT. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB ativa a via de sinalização de NF-κB sem ativação ou ativação mínima da via de sinalização de PI3K. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB ativa a via de sinalização de NF-κB sem ativação ou ativação mínima da via de sinalização de ERK. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB ativa a via de sinalização de NF-κB sem ativação ou ativação mínima da via de sinalização de JNK. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB ativa a via de sinalização de NF-κB sem ativação ou ativação mínima da via de sinalização de p38 quinase. Em uma

90 / 348 modalidade, um ativador seletivo de NF-κB ativa a via de sinalização de NF- κB sem ativação ou ativação mínima da via de sinalização de JAK/STAT.

Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB ativa a via de sinalização de NF-κB sem ativação ou ativação mínima da via de sinalização de interferon.

São conhecidos na técnica vários métodos para medir a ativação das vias de sinalização de NF-κB, incluindo, entre outros, a medição de IκBα fosforilada, p65/RelA fosforilada, translocação nuclear total de IκBα, p65, regulação crescente de genes responsivos a NF-κB, ensaio eletroforético de deslocamento de mobilidade (EMSA) e repórter baseado em NF-κB, etc.

Esses ensaios podem ser usados nos métodos da divulgação isoladamente ou em combinações para identificar ativadores seletivos da via de NF-κB.

Vários métodos para medir a ativação das vias de sinalização (por exemplo, vias de sinalização de AKT, PI3K, JNK, p38 quinase, ERK, JAK/STAT e interferon) são conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando à medição da fosforilação da quinases diferentes e substratos a jusante pertencentes às diferentes vias, translocação nuclear de fatores de transcrição a jusante, regulação positiva dos genes responsivos a jusante, ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e ensaio de repórter baseado em luciferase, etc.

Esses ensaios podem ser usados nos métodos da divulgação individualmente ou em combinações para selecionar ativadores seletivos da via de sinalização de NF-κB.

Um estimulante seletivo de NF-κB ativa especificamente o NF-κB em comparação com outras moléculas acessórias, como 41BB.

Uma molécula estimulante de NF-κB, incluindo um ativador seletivo de NF-κB, tem um ou mais dos seguintes efeitos: (i) estender a vida útil das células T, por exemplo, células CAR-T ou células TCR-T, (ii) estimular a proliferação de células T, (iii) proteger as células T, por exemplo, células CAR-T, da apoptose, (iv) atrasar a senescência das células T, por exemplo, células CAR-T ou células TCR-T (v) atrasar a exaustão das células T, por exemplo, células CAR-T ou células TCR-T, (vi) atrasar a diferenciação

91 / 348 terminal das células T, (vii) promover a produção de citocinas, como IL2, pelas células T, (viii) promover a expansão in vivo das células T, incluindo células CAR-T e células TCR-T, (ix) promover a persistência in vivo de células T, incluindo células CAR-T e células TCR-T, (x) melhorar a atividade in vivo (por exemplo, atividade antitumoral) das células T, incluindo as células CAR-T e TCR-T. Uma molécula estimulante de NF-κB, incluindo um ativador seletivo de NF-κB, pode ser expressa em células que não sejam células T, como células que apresentam antígeno, por exemplo, células dendríticas. Uma molécula estimulante de NF-κB, incluindo um ativador seletivo de NF-κB, pode ser usada para melhorar a presença de antígeno, a produção de citocinas e a resposta imune gerada pelas células que apresentam antígeno. Uma molécula estimulante de NF-κB, incluindo um ativador seletivo de NF-κB, pode ser de origem viral ou não viral (por exemplo, humana). Uma molécula estimulante de NF-κB, incluindo um ativador seletivo de NF-κB, pode ser expressa em uma célula de maneira transitória ou estável. Uma molécula estimulante de NF-κB, incluindo um ativador seletivo de NF-κB, pode ser expressa em uma célula de maneira constitutiva ou induzível. Uma molécula estimulante de NF-κB, incluindo um ativador seletivo de NF-κB, pode ser expressa em uma célula em fusão com um domínio de troca, por exemplo, cópias em tandem de um domínio FKBP12v36. Exemplos de domínio de troca contendo moléculas estimulantes de NF-kB são fornecidos nas SEQ ID NO: 973 a 977, 1.006 a 1.009, 7.763 a

7.767 e 7.781 a 7.782 (Tabela 7). Uma molécula estimulante de NF-κB, incluindo um ativador seletivo de NF-κB, pode ser expressa a partir de um vetor contendo uma sequência de codificação para um CAR/TCR ou pode estar presente em um vetor diferente. Por exemplo, em algumas modalidades, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam CARs/TCRs compreendem ainda polinucleotídeos que codificam proteínas de sinalização virais e celulares que são molécula estimulante de NF-κB ou ativador seletivo

92 / 348 de NF-κB que (i) prolongam a vida útil das células T, por exemplo, células CAR-T ou células TCR-T, (ii) estimulam a proliferação de células T, (iii) protegem as células T, por exemplo, células CAR-T, de apoptose, (iv) atrasam a senescência das células T, por exemplo, células CAR-T ou células TCR-T (v) retardam a exaustão das células T, por exemplo, células CAR-T ou células TCR-T, (vi) atrasam a diferenciação terminal das células T, (vii) promovem a produção de citocinas, como IL2, por T (viii) promovem expansão in vivo de células T, incluindo células CAR-T e células TCR-T, (ix) promovem persistência in vivo de células T, incluindo células CAR-T e células TCR-T, e/ou (x) melhoram a atividade in vivo (por exemplo, atividade antitumoral) das células T, incluindo as células CAR-T e TCR-T.

Em algumas modalidades, a sequência de codificação para uma molécula estimulante de NF-κB é ligada a uma sequência de codificação da estrutura principal CAR por um oligonucleotídeo que codifica um ligante clivável.

Em modalidades exemplificativas, essas moléculas estimulantes de NF-κB incluem, porém sem limitação, vFLIP-K13 do vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi, um K13 otimizado por códon (K13-opt), mutante NEMO (por exemplo, hNEMO-K277A, hNEMO-K277L, hNEMO-K277A-deltaV249-K255, mNEMO-K270A, etc.), IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88- L265P, TCL-1A, MTCP-1, IKKα e IKKβ (Tabela 7) Em uma modalidade, os vetores que codificam os CARs codificam ainda mais o vFLIP-K13. Em outra modalidade, os vetores que codificam os CARs codificam ainda mais o hNEMO-K277A.

Em algumas modalidades, a molécula estimulante de NF- κB é codificada por um vetor que é distinto do vetor que codifica o CAR descrito neste documento.

Em algumas modalidades, as células efetoras compreendendo vetores que codificam CARs também compreendem vetores que codificam a molécula estimulante de NF-κB.

Em algumas modalidades, as moléculas estimulantes de NF-κB são codificadas pela modificação do local genômico que codifica a proteína endógena correspondente.

Por

93 / 348 exemplo, uma ou mais cópias do gene hNEMO podem ser modificadas por recombinação homóloga para modificá-lo para a forma mutante K277A.

Construtos de alvejamento exemplificativos que podem ser usados para criar a mutação K277A no gene NEMO humano endógeno é apresentado pela SEQ ID NO: 7.771. Construtos de alvejamento exemplificativos que podem ser usados para criar a mutação K277A-Delta-V249-K255 no gene NEMO humano endógeno é apresentado pela SEQ ID NO: 7.772. Esses construtos de alvejamento podem ser introduzidas em células T humanas com um sistema de edição de genes direcionado a NEMO, por exemplo, CRISP/Cas9 ou TALON, utilizando técnicas conhecidas na arte.

Sequências alvo de gRNA NEMO exemplificativas para Streptococcus Pyogenes Cas9 são fornecidas nas SEQ ID NO: 7.759 a 7.762. Em uma modalidade, o CAR e a molécula estimulante de NF-κB são codificados por um único polinucleotídeo.

Em outra modalidade, o CAR é codificado pela primeira molécula de ácido nucleico, e a molécula estimulante de NF-κB é codificada por uma segunda molécula de ácido nucleico.

Em algumas modalidades, a molécula estimulante de NF-κB é codificada por mais de uma molécula de ácido nucleico, dependendo do número de moléculas estimulantes de NF-κB.

Em certas porções da divulgação, a abreviação “CAR/NFκB” é usada para indicar, por exemplo, uma célula que expressa um CAR da divulgação e uma molécula estimulante de NF-κB (por exemplo, uma molécula estimulante específica de NF-κB). Por exemplo, o termo “célula T que expressa CAR/NFκB” se refere a células CAR-T com qualquer número possível de domínios de ligação a antígenos diferentes que também expressam, por exemplo, uma molécula estimulante específica de NF-κB selecionada do grupo que consiste em vFLIP-K13 de vírus herpes associado a sarcoma de Kaposi, um códon optimizado K13 (K13-opt), hNEMO-K277A, hNEMO- K277A-deltaV249-K555, mNEMO-K270A, IKK2-S177E-S181E, IKK1- S176E -S180E, MyD88-L265P, TCL-1A, MTCP-1, IKK1/IKKα e

94 / 348 IKK2/IKKβ, ou qualquer combinação dos mesmos. A molécula estimulante de NF-κB pode estar diretamente ligada ao domínio citoplasmático do CAR ou pode ser expressa independentemente na célula. A molécula estimulante de NF-κB pode ser uma molécula que bloqueia a expressão e/ou atividade de um inibidor da via de sinalização de NF-κB. Por exemplo, uma molécula estimulante de NF-κB que bloqueia a expressão e/ou atividade de um inibidor da via de sinalização de NF-κB é um inibidor genético (por exemplo, siRNA, shRNA, gRNA, TALON ou nuclease de dedo de Zn), químico ou biológico de A20. Outras modalidades incluem construtos NEMO-fusão como moléculas estimulantes de NF-kB (por exemplo, hNEMO-FKBPx2, FKBPx2- hNEMO-L600, etc.).

[00128] Como usado neste documento, um “agente de ocorrência não natural” ou “não nativo” ou “exógeno” se refere a um agente que não é expresso naturalmente em uma célula. Em outras palavras, o agente de ocorrência não natural é “manipulado geneticamente” para ser expresso em uma célula. Um agente de ocorrência não natural pode ser uma versão clonada de um agente que ocorre naturalmente. Agentes exemplificativos de ocorrência não natural incluem CARs, SIRs, Ab-TCRs, TFPs, TCR recombinante, NEMO-K277A, vFLIP-K13 e K13-opt. Um agente de ocorrência não natural pode ser expresso em uma célula utilizando técnicas de transferência de genes conhecidas na arte, como transferência de genes mediada por lentivírus ou retrovírus. Um agente de ocorrência não natural pode ser expresso em uma célula imune usando um promotor exógeno (por exemplo, promotor EF1α) ou um promotor endógeno (por exemplo, promotor TCRα). Quando um gene endógeno (por exemplo, IKK1, IKK2, IKKγ/NEMO) é clonado e expresso ectopicamente em uma célula, o mesmo representa outro exemplo de um agente que não é natural.

[00129] Como usado neste documento, um “receptor imune de ocorrência não natural” ou “receptor imune exógeno” se refere a um receptor

95 / 348 imune que não é expresso naturalmente em uma célula imune. Em outras palavras, o receptor imune de ocorrência não natural é “manipulado geneticamente” para ser expresso em uma célula imune. Um receptor imune de ocorrência não natural pode ser uma versão clonada de um receptor imune de ocorrência natural. Alternativamente, um receptor imune de ocorrência não natural pode ser um receptor quimérico que é produzido usando técnicas de biologia molecular recombinante. Receptores imunes de ocorrência não natural exemplificativos incluem CARs, SIR, Ab-TCRs, TFPs e TCR recombinante. Um receptor imune de ocorrência não natural pode ser introduzido em uma célula imune usando técnicas de transferência de genes conhecidas na arte, como transferência de genes mediada por lentivírus ou retrovírus. Um receptor imune de ocorrência não natural pode ser expresso em uma célula imune usando um promotor exógeno (por exemplo, promotor EF1α) ou um promotor endógeno (por exemplo, promotor TCRα).

[00130] Como usado neste documento, um “domínio de ligação ao antígeno do TCR de ocorrência não natural” ou “domínio de ligação ao antígeno do TCR exógeno” se refere a um domínio de ligação operacionalmente ligado a uma região constante do TCR que é quimérica e de ocorrência não natural em relação a um TCR presente na natureza. Em outras palavras, o domínio de ligação ao antígeno do TCR de ocorrência não natural é “geneticamente manipulado” usando técnicas de biologia molecular recombinante para ser operacionalmente ligado a um TCR e, além disso, que o domínio de ligação ao antígeno é obtido ou derivado de uma molécula distinta de um TCR encontrado na natureza. Um domínio de ligação ao antígeno que é distinto de um TCR na natureza inclui fragmentos de anticorpo vH e vL, fragmentos de anticorpo humanizado, fragmentos de anticorpo quimérico, ligantes de receptores e similares.

[00131] Como utilizado neste documento, “origem não viral” se refere a um agente (por exemplo, uma proteína) que não é total ou parcialmente

96 / 348 codificado por um vírus ou tem qualquer domínio ou região com mais de 10 aminoácidos (por exemplo, mais de 15 aminoácidos, 20 aminoácidos, 25 aminoácidos ou 50 aminoácidos) com mais de 80% (por exemplo, mais de 85%, 90%, 95% ou 99%) de homologia de sequência com uma proteína codificada viralmente. Em uma modalidade, um agente de origem não viral é de origem humana. Em uma modalidade, um agente de origem não viral é um ativador seletivo de NF-κB. Um agente exemplificativo de origem não viral que é um ativador seletivo de NF-κB é o NEMO-K277A humano (SEQ ID NO: 4.892).

[00132] O termo “operacionalmente ligado” ou “funcionalmente ligado” se refere à ligação ou associação funcional entre um primeiro componente e um segundo componente, de modo que cada componente possa ser funcional. Por exemplo, operacionalmente ligado inclui a associação entre uma sequência reguladora e uma sequência heteróloga de ácido nucleico, resultando na expressão desta última. Por exemplo, uma primeira sequência de ácidos nucleicos está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos quando a primeira sequência de ácidos nucleicos é colocada em um relacionamento funcional com a segunda sequência de ácidos nucleicos. No contexto de dois polipeptídeos que estão operacionalmente ligados, um primeiro polipeptídeo funciona da maneira que seria independente de qualquer ligação e o segundo polipeptídeo funciona como se não houvesse uma ligação entre os dois.

[00133] “Identidade percentual” no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas se refere a duas ou mais sequências iguais. Duas sequências são “substancialmente idênticas” se duas sequências tiverem uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos iguais (por exemplo, 60% de identidade, opcionalmente 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,

97 / 348 97%, 98%, 99% de identidade em uma região especificada ou, quando não especificado, em toda a sequência) quando comparadas e alinhadas para obter o máximo de correspondência em uma janela de comparação ou região designada conforme medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Opcionalmente, a identidade existe em uma região que tem pelo menos cerca de 50 nucleotídeos (ou 10 aminoácidos) de comprimento, ou mais preferencialmente em uma região que tem 100 a 500 ou 1.000 ou mais nucleotídeos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos) de comprimento.

[00134] Para comparação de sequências, geralmente uma sequência atua como uma sequência de referência à qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. Parâmetros de programa padrão podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula as identidades percentuais das sequências de teste relativas à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Bioi. 48: 443, pela busca do método de similaridade de Pearson e Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85:2444, por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por alinhamento manual e inspeção visual (consultar, por exemplo, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular

98 / 348 Biology).

[00135] Dois exemplos de algoritmos que podem ser usados para determinar a porcentagem de identidade e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, descritos em Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3.389 a 3402; e Altschul et al., (1990) J. Mol. Bioi. 215: 403 a 410, respectivamente. O software para realizar análises BLAST está disponível ao público no National Center for Biotechnology Information.

[00136] A identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11 a 17), que foi incorporado ao programa ALIGN (consultarsão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Bioi. 48: 444 a 453), que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível em www.gcg.com), usando uma matriz Blossom 62 ou uma matriz P AM250 e uma diferença de peso de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[00137] O termo “polinucleotídeo”, “ácido nucleico” ou “ácido nucleico recombinante” se refere a polímeros de nucleotídeos como ácido desoxirribonucleico (DNA) e, quando apropriado, ácido ribonucleico (RNA).

[00138] Uma “proteína” ou “polipeptídeo”, cujos termos são usados de forma intercambiável neste documento, compreende uma ou mais cadeias de blocos de construção químicos chamados aminoácidos que são ligados entre si por ligações químicas chamadas ligações peptídicas.

[00139] O termo “vetor de retrovírus” se refere a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de retrovírus. Exemplos de vetores de retrovírus incluem MSCVneo, MSCV-pac (ou MSCV-puro), MSCV-hygro, conforme disponível em Addgene ou Clontech.

99 / 348

[00140] O termo “Transposão da Bela Adormecida” ou “Vetor de Transposão da Bela Adormecida” se refere a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma do Transposão da Bela Adormecida.

[00141] O termo “região variável de cadeia única” ou “scFv” se refere a uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia leve e pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia pesada, em que a luz e regiões variáveis de cadeia pesada estão contiguamente ligadas, por exemplo, através de um ligante sintético, por exemplo, um ligante polipeptídeo flexível curto e capaz de ser expresso como um polipeptídeo de cadeia única, e em que o scFv retém a especificidade do anticorpo intacto do qual é derivada. A menos que especificado, conforme usado neste documento, um scFv pode ter as regiões variáveis vL e vH em qualquer ordem, por exemplo, com relação às extremidades do terminal N e do terminal C do polipeptídeo, o scFv pode compreender vL-linker-vH ou pode compreender vH-linker-vL. Nesta invenção, um scFv também é descrita como vL-Gly-Ser-Linker-vH. Alternativamente, um scFv também é descrita como (vL + vH) ou (vH + vL).

[00142] O termo “domínio de sinalização” se refere à região funcional de uma proteína que transmite informações dentro da célula para regular a atividade celular através de vias de sinalização definidas gerando segundos mensageiros ou funcionando como efetores respondendo a esses mensageiros.

[00143] O termo “Receptor Imune Sintético” ou, alternativamente, um “SIR” se refere a um conjunto de polipeptídeos, tipicamente dois em algumas modalidades, os quais, quando expressos em uma célula efetora, fornecem à célula especificidade para uma célula alvo, normalmente uma célula cancerígena, e com geração de sinal intracelular. Os SIRs representam as próximas plataformas de geração de CARs descritas no documento WO 2018/102795 A1, que é incorporado neste documento a título de

100 / 348 referência.Em uma modalidade típica, um SIR compreende um ou mais domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, um ligante ou um receptor) que se ligam a antígenos, conforme descrito neste documento e são unidos a uma ou mais regiões ou cadeias constantes de receptores de células T através de um vinculador opcional.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos do conjunto de polipeptídeos são contíguos entre si.

Em algumas modalidades, um SIR compreende dois ou mais conjuntos de dois ou mais polipeptídeos.

Os polipeptídeos de cada conjunto de SIR são contíguos entre si (unidade funcional 1 do polipeptídeo), mas não são contíguos aos polipeptídeos do outro conjunto (unidade funcional 2 do polipeptídeo). Em alguns aspectos, as cadeias (ou regiões) constantes do receptor de células T do SIR são escolhidas a partir da cadeia constante do receptor alfa de células T humanas (TCR-alfa ou TCRα ou TCRa ou TCRa ou hTCR-alfa ou hTCRα ou hTCRa ou Cα), receptor de célula T humana beta1 (TCR-beta1 ou TCRβ1 ou TCRb1 ou hTCR-beta1 ou hTCRβ1 ou hTCRb1 ou Cβ1), receptor humano de célula T beta 2 (TCR- beta2 ou TCRβ2 ou TCRb2 ou hTCR-beta2 ou hTCRβ2 ou hTCRb2 ou Cβ2 também designou TCR-beta, TCRβ ou TCRb ou Cβ), receptor de célula pré-T humana alfa ((preTCR-alfa ou preTCRα ou preTCRa ou preCα), receptor de célula T humana gama (TCR-gama ou TCRγ ou TCRg ou TCRg ou hTCR- gama ou hTCRγ ou hTCRg ou hTCRγ1 ou hTCRgamma1 ou Cγ) ou receptor- delta de células T humanas (TCR-delta ou TCRd ou TCRδ ou TCRδ ou hTCR-delta ou hTCRd ou hTCRδ ou Cδ). Em algumas modalidades, as cadeias constantes de TCR do SIR são codificadas por suas sequências nucleotídicas do tipo selvagem, enquanto em outros aspectos as cadeias constantes do TCR do SIR são codificadas pelas sequências nucleotídicas que não são do tipo selvagem.

Em algumas modalidades, as cadeias constantes de TCR do SIR são codificadas por suas sequências otimizadas por códons.

Em algumas modalidades, as cadeias constantes de TCR do SIR codificam para as

101 / 348 sequências polipeptídicas do tipo selvagem, enquanto em outras modalidades as cadeias constantes de TCR do SIR codificadas para polipeptídeos que transportam uma ou mais mutações.

Em algumas modalidades, as cadeias constantes de TCR do SIR são codificadas por suas sequências otimizadas por códons que carregam uma ou mais mutações.

Um SIR que compreende um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um scFv ou vHH) que tem como alvo um fabricante de tumores específico “X”, como os descritos neste documento, também é referido como X-SIR ou XSIR.

Por exemplo, um SIR que compreende um domínio de ligação ao antígeno que tem como alvo CD19 é referido como CD19-SIR ou CD19SIR.

A cadeia/domínio constante do TCR de um SIR pode ser derivada da mesma espécie na qual o SIR será finalmente utilizado.

Por exemplo, para uso em seres humanos, pode ser benéfico que a cadeia constante de TCR do SIR seja derivada ou compreendida de cadeias constantes de TCR humano.

No entanto, em alguns casos, é benéfico que a cadeia constante do TCR seja derivada da mesma espécie na qual o SIR será finalmente utilizado, mas modificado para transportar substituições de aminoácidos que melhoram a expressão das cadeias constantes do TCR.

Por exemplo, para uso em seres humanos, pode ser benéfico que a cadeia constante de TCR do SIR seja derivada ou compreendida de cadeias constantes de TCR humano, mas nas quais certos aminoácidos são substituídos pelos aminoácidos correspondentes das cadeias constantes de TCR murino.

Tais cadeias constantes de TCR murinizadas fornecem expressão aumentada do SIR.

O SIR ou sua porção funcional, pode incluir aminoácidos adicionais no terminal amino ou carboxi, ou em ambos os terminais, em que aminoácidos adicionais não são encontrados na sequência de aminoácidos do domínio de ligação ao TCR ou ao antígeno que compõe o SIR.

Desejavelmente, os aminoácidos adicionais não interferem com a função biológica do SIR ou porção funcional, por exemplo, reconhecem as células alvo, detectam o câncer, tratam ou previnem o câncer, etc.

Mais desejável, os

102 / 348 aminoácidos adicionais aprimoram a atividade biológica em comparação à atividade biológica do SIR progenitor. As sequências de ácidos nucleicos e aminoácido de SIRs exemplificativos são fornecidas nas SEQ ID NO: 3.878 a

3.879 e nas Tabelas 10 a 11.

[00144] O termo “estimulação” se refere a uma resposta primária induzida pela ligação de uma molécula estimulante (por exemplo, um complexo TCR/CD3) com seu ligante cognato (ou antígeno alvo), mediando, assim, um evento de transdução de sinal, como, porém sem limitação, transdução de sinal por meio de TCR/CD3. A estimulação pode mediar a expressão alterada de certas moléculas.

[00145] O termo “molécula estimulante” se refere a uma molécula expressa por uma célula imune (por exemplo, célula T, célula NK, célula B) que fornece a sequência (ou sequências) de sinalização citoplasmática que regulam a ativação da célula imune de maneira estimulante por pelo menos algum aspecto da via de sinalização de células imunes. Em um aspecto, o sinal é um sinal primário iniciado, por exemplo, pela ligação de um complexo TCR/CD3 a uma molécula de MHC carregada com peptídeo e que leva à mediação de uma resposta de célula T, incluindo, porém sem limitação, proliferação, ativação, diferenciação e similares. Uma sequência de sinalização citoplasmática primária (também referida como um “domínio de sinalização primário”) que atua de maneira estimulante pode conter um motivo de sinalização que é conhecido como motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptora ou ITAM. Exemplos de uma sequência de sinalização citoplasmática contendo ITAM incluem, porém sem limitação, aqueles derivados de CD3 zeta, FeR gama comum (FCERIG), Fe gama RIIa, FeR beta (Fe Epsilon Rib), CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD79a, CD79b, DAPIO e DAP12.

[00146] O termo “sujeito” é destinado a incluir organismos vivos nos quais uma resposta imune pode ser desencadeada (por exemplo, qualquer

103 / 348 mamífero domesticado ou um ser humano).

[00147] “Domínio de troca”, ou um “domínio de dimerização”, conforme usado neste documento, normalmente se refere a uma entidade baseada em polipeptídeo que, na presença de uma molécula de dimerização, se associa a outro domínio de troca. A associação resulta em um acoplamento funcional de uma primeira entidade vinculada a, por exemplo, fundido a, um primeiro domínio de comutação, e uma segunda entidade vinculada a, por exemplo, fundida a, um segundo domínio de comutação. Um primeiro e um segundo domínio do comutador são coletivamente chamados de comutador de dimerização. Em modalidades, o primeiro e o segundo domínios de comutação são iguais entre si, por exemplo, são polipeptídeos com a mesma sequência de aminoácidos primária e são referidos coletivamente como comutador de homodimerização. Nas modalidades, o interruptor é intracelular. Nas modalidades, o domínio de troca é uma entidade baseada em polipeptídeo, por exemplo, FKBP (proteína de ligação à FK506), e a molécula de dimerização é uma molécula pequena, por exemplo, AP20187.

[00148] Os termos “célula T” e “linfócito T” são intercambiáveis e usados neste documento como sinônimos. Os exemplos incluem, porém sem limitação, células T virgens (“progenitores de linfócitos”), células T de memória central, células T de memória efetiva, células T de memória tronco (Tscm), células T derivadas de iPSC, células T sintéticas ou combinações das mesmas.

[00149] O termo “módulo de sinalização associado ao TCR” se refere a uma molécula que tem um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptor (ITAM) citoplasmático que faz parte do complexo TCR-CD3. Os módulos de sinalização associados ao TCR incluem CDγε, CDδε e CD3ζζ.

[00150] “Agentes terapêuticos”, conforme usado neste documento, se refere a agentes que são usados para, por exemplo, tratar, inibir, impedir, mitigar os efeitos de, reduzir a gravidade de, reduzir a probabilidade de

104 / 348 desenvolvimento, retardar a progressão de e/ou curar uma doença. As doenças alvejadas pelos agentes terapêuticos incluem, porém sem limitação, doenças infecciosas, carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemia, tumores de células germinativas, blastomas, antígenos expressos em várias células imunes e antígenos expressos em células associadas a várias doenças hematológicas e/ou doenças inflamatórias.

[00151] “Controles terapêuticos”, conforme usado neste documento, se refere a um elemento usado para controlar a atividade de uma célula que expressa CAR. Em algumas modalidades, os controles terapêuticos para controlar a atividade das células que expressam CAR da invenção compreendem qualquer um ou mais receptores de fator de crescimento epidérmico truncados (tEGFR), receptores de fator de crescimento epidérmico truncados viii (tEGFRviii), CD30 truncado (tCD30), BCMA truncado (tBCMA), CD19 truncado (tCD19), timidina quinase, citosina desaminase, nitroredutase, xantina-guanina fosforibosil transferase, caspase humana 8, caspase humana 9, caspase induzível 9, nucleosídeo purina fosforilase, linamarase/linamarina/glicose oxidase, desoxirribonucleoside quinase, peroxidase de rábano silvestre (HRP)/indol-3-acético (IAA), gama- glutamilcisteína sintetase, CD20/alfaCD20, quimera de CD34/timidina quinase, caspase-2 dependente de dox, timidina quinase mutante (HSV- TKSR39), sistema AP1903/Fas, um receptor quimérico de citocina (CCR), um marcador de seleção e combinações dos mesmos.

[00152] O termo “efeito terapêutico” se refere a um efeito biológico que pode ser manifestado por vários meios, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, diminuição do volume do tumor, uma diminuição do número de células cancerígenas, diminuição do número de metástases, um aumento da expectativa de vida, diminuição da proliferação de células cancerígenas, diminuição da sobrevivência de células cancerígenas, diminuição do título do agente infeccioso, diminuição da contagem de colônias do agente infeccioso,

105 / 348 melhoria de vários sintomas fisiológicos associados a uma condição da doença. Um “efeito terapêutico” também pode ser manifestado pela capacidade dos peptídeos, polinucleotídeos, células e anticorpos na prevenção da ocorrência da doença em primeiro lugar ou na prevenção da recidiva da doença.

[00153] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, conforme utilizado neste documento, se refere à quantidade de uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais peptídeos conforme divulgados neste documento ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, para diminuir pelo menos um ou mais sintomas da doença ou distúrbio, e se refere a uma quantidade suficiente de composição farmacológica para fornecer o efeito desejado. A frase “quantidade terapeuticamente eficaz”, tal como utilizada neste documento, significa uma quantidade suficiente da composição para tratar um distúrbio, com uma razão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico.

[00154] Uma redução terapêutica ou profilaticamente significativa de um sintoma é, por exemplo, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 125%, pelo menos cerca de 150% ou mais em um parâmetro medido em comparação com um sujeito controle ou não tratado ou o estado do sujeito antes da administração dos oligopeptídeos descritos neste documento. Parâmetros medidos ou mensuráveis incluem marcadores clinicamente detectáveis da doença, por exemplo, níveis elevados ou deprimidos de um marcador biológico, bem como parâmetros relacionados a uma escala de sintomas ou marcadores clinicamente aceitos para diabetes. Será entendido, no entanto, que o uso diário total das composições e formulações divulgadas neste documento será decidido pelo médico

106 / 348 assistente, dentro do escopo de um julgamento médico correto. A quantidade exata necessária varia de acordo com fatores como o tipo de doença a ser tratada, sexo, idade e peso do sujeito.

[00155] O termo “proteínas de fusão do receptor TCR ou TFP” se refere a uma plataforma CAR de próxima geração, conforme descrito no documento WO 2016/187349 A1, que é incorporado neste documento a título de referência. Em uma modalidade, um TFP compreende uma fração de anticorpo que se liga especificamente a um antígeno alvo fundido a uma cadeia de TCR, como CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα ou TCRβ. Cadeias de TCR exemplificativas que podem ser usadas na construção de TFP são representadas pelas SEQ ID NOs: 944 a 945, 948, 949 a 950 e 958 e são fornecidas no documento WO 2017/070608 A1 que é incorporado neste documento a título de referência. Um TFP incorporando a cadeia CD3ε é referido como TFP CD3ε. Um TFP que incorpora a cadeia CD3γ é referido como TFP CD3γ. Um TFP que incorpora a cadeia CD3δ é referido como TFP CD3δ. O TFP que incorpora cadeias CD3ε, CD3γ ou CD3δ é coletivamente referido como TFP CD3ε/γ/δ. TFPs exemplificativos que incorporam diferentes domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos de vL e vH, ligantes, receptores, etc.) descritos nesta divulgação e coexpressando um módulo acessório que codifica NEMO-K277A são fornecidos nas SEQ ID NO: 1.900 a 3.123 (Tabela 13). As SEQ ID Nos, domínios de ligação ao antígeno e antígenos alvo desses TFPs podem ser determinados consultando a Tabela 12, pois esses construtos de TFP têm domínios de ligação ao antígeno idênticos aos construtos de CAR da primeira geração que coexpressam NEMO-K277A mostrados na Tabela 12 e são numeradas em ordem idênticas. No entanto, o módulo acessório que codifica NEMO-K277A é opcional. O TFP com os domínios de ligação ao antígeno (isto é, fragmentos de vL e vH, ligantes e receptores, etc.) descritos nesta divulgação pode ser construído sem o NEMO-K277A. Como tal, esse módulo acessório juntamente com a

107 / 348 sequência Furine-SGSG-F2A a montante pode ser excluído dos TFPs representados pelas SEQ ID NO: 1.900 a 3.123. Como alternativa, o módulo acessório que codifica NEMO-K277A pode ser substituído por módulos acessórios que codificam outras proteínas de sinalização, como hNEMO- K277A-deltaV249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E ou IKK1-S176E-S180E e MyD88–L265P, FKBPx2-NEMO, NEMO-L600- FKBPx2 e CMV-141, etc.

[00156] O termo “vetor de transferência” se refere a uma composição de matéria que compreende um ácido nucleico isolado e que pode ser usada para entregar o ácido nucleico isolado ao interior de uma célula. São conhecidos na técnica numerosos vetores, incluindo, porém sem limitação, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos e vírus. Assim, o termo “vetor de transferência” inclui um plasmídeo de replicação autônoma ou um vírus. O termo também deve ser interpretado para incluir ainda compostos não plasmídicos e não virais que facilitam a transferência de ácido nucleico para as células, como, por exemplo, um composto de poli-lisina, lipossoma e similares. Exemplos de vetores de transferência viral incluem, porém sem limitação, vetores adenovirais, vetores de vírus associados a adena, vetores retrovirais, vetores lentivirais e similares.

[00157] “Domínio transmembranar” (TMD), conforme utilizado neste documento, se refere à região do CAR que atravessa a membrana plasmática. O domínio transmembranar do CAR da invenção é a região transmembranar de uma proteína transmembranar (por exemplo, proteínas transmembranares do Tipo I), uma sequência hidrofóbica artificial ou uma combinação das mesmas. Outros domínios transmembranares serão evidentes para aqueles versados na técnica e podem ser usados em conexão com modalidades alternativas da invenção. Em algumas modalidades, o CAR codificado por TMD compreendendo qualquer uma das estruturas principais descritas neste

108 / 348 documento compreende um domínio transmembranar selecionado a partir do domínio transmembranar de uma cadeia alfa, beta ou zeta de um receptor de célula T, CD3γ, CD3ε, CD3δ, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08)), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D e/ou NKG2C.

[00158] Conforme usado neste documento, “Acoplador de antígeno de célula T multifuncional ou Tri-TAC” se refere a uma plataforma CAR de próxima geração descrita no documento WO 2015/117229 A1, que é incorporado neste documento a título de referência. O Tri-TAC direcionado a diferentes antígenos pode ser construído usando os domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos de vL e vH, scFv, vHH, ligantes e receptores, etc.) descritos nesta divulgação usando técnicas conhecidas na arte. Além disso, os diferentes módulos acessórios (por exemplo, NEMO- K277A, mNEMO-K270A, etc.) descritos nesta divulgação podem ser expressos nas células imunes que expressam Tri-TAC, por exemplo, células T, por exemplo, células CAR-T.

[00159] Conforme usado neste documento, os termos “tratar”, “tratamento”, “tratando” ou “melhoria” se referem a tratamentos terapêuticos, nos quais o objetivo é reverter, aliviar, melhorar, inibir, retardar ou interromper a progressão ou severidade de uma afecção associada a uma

109 / 348 doença ou distúrbio. O termo “tratar” inclui reduzir ou aliviar pelo menos um efeito adverso ou sintoma de uma afecção, doença ou distúrbio, como câncer. O tratamento geralmente é “eficaz” se um ou mais sintomas ou marcadores clínicos forem reduzidos. Como alternativa, o tratamento é “eficaz” se a progressão de uma doença for reduzida ou interrompida. Ou seja, “tratamento” inclui não apenas a melhora dos sintomas ou marcadores, mas também a cessação de pelo menos desaceleração do progresso ou a piora dos sintomas que seriam esperados na ausência de tratamento. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, porém sem limitação, alívio de um ou mais sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (ou seja, não piorando) da doença, atraso ou lentidão na progressão, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão (parcial ou total), detectável ou indetectável. O termo “tratamento” de uma doença também inclui proporcionar alívio dos sintomas ou efeitos colaterais da doença (incluindo tratamento paliativo). Em algumas modalidades, o tratamento do câncer inclui a diminuição do volume do tumor, a diminuição do número de células cancerígenas, a inibição das metástases do câncer, o aumento da expectativa de vida, a diminuição da proliferação de células cancerígenas, a diminuição da sobrevivência das células cancerígenas ou a melhoria de vários sintomas fisiológicos associados à condição cancerígena.

[00160] “Tumor”, conforme usado neste documento, se refere a todo crescimento e proliferação de células neoplásicas, malignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerígenos e cancerígenos.

[00161] “Vetor”, “vetor de clonagem” e “vetor de expressão”, conforme usado neste documento, se referem ao veículo pelo qual uma sequência polinucleotídica (por exemplo, um gene estranho) pode ser introduzida em uma célula hospedeira, de modo a transformar o hospedeiro e promover a expressão (por exemplo, transcrição e tradução) da sequência introduzida. Os vetores incluem plasmídeos, fagos, vírus, etc.

110 / 348

[00162] O termo “zeta” ou, alternativamente, “cadeia zeta”, “CD3- zeta” ou “TCR-zeta” é definido como a proteína fornecida como GenBan Ace. no BAG36664.1, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares, e um “domínio estimulante zeta” ou, alternativamente, um “domínio estimulante CD3-zeta” ou um “domínio estimulante TCR-zeta” é definido como os resíduos de aminoácidos do domínio citoplasmático da cadeia zeta, ou seus derivados funcionais, que são suficientes para transmitir funcionalmente um sinal inicial necessário para a ativação das células T. Em um aspecto, o domínio citoplasmático de zeta compreende os resíduos 52 a 164 do GenBank Ace. no BAG36664.1 ou resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares, que são seus ortólogos funcionais. Em um aspecto, o “domínio estimulante zeta” ou um “domínio estimulante CD3-zeta” é a sequência fornecida como SEQ ID NO:

4.853 (Tabela 6D).

[00163] O domínio de ligação do CAR é selecionado para se ligar a um epítopo desejado. Por exemplo, o epítopo reconhecido por um CAR também pode ser determinado a partir do epítopo reconhecido pelo scFv que compreende o CAR. Por exemplo, uma vez que o domínio específico de antígeno do CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (SEQ ID NO: 1.509 e SEQ ID NO: 5.422) direcionado a MPL é composto de scFv MPL-161-(vL-vH) (SEQ ID NO: 808 e SEQ ID NO: 4.721), espera-se que o CAR alveje o mesmo epítopo que o scFv e o anticorpo parental do qual o scFv é derivada. O epítopo reconhecido pelo scFv MPL-161-(vL-vH) (SEQ ID NO: 808 e SEQ ID NO: 4.721) é fornecido na SEQ ID NO: 15.160. Os epítopos reconhecidos por vários scFv e/ou seus anticorpos parentais utilizados na construção dos CARs e estruturas principais desta revelação são conhecidos na técnica. Alternativamente, o epítopo alvo de um CAR (incluindo os CAR que estão presentes como parte de estruturas principais)

111 / 348 pode ser determinado gerando uma série de mutantes de seu antígeno alvo e testando a capacidade dos mutantes de se ligarem às células que expressam CAR.

Como exemplo, o epítopo reconhecido pelo MPL de alvejamento CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC pode ser determinado gerando um painel de mutantes do construto de fusão MPL-ECD-GGSG- Nluc-AcV5 (SEQ ID NO: 1.015 de DNA e SEQ ID NO: 4.928 de PRT). Os construtos mutantes seriam transfectadas em uma linha celular adequada (por exemplo, células 293FT) e o sobrenadante contendo a proteína de fusão coletada e analisada quanto à atividade de NLuc para garantir que as diferentes proteínas de fusão MPL-ECD-GGSG-Nluc-AcV5 mutantes sejam secretadas no sobrenadante.

Posteriormente, as proteínas de fusão seriam testadas quanto à sua capacidade de ligação às células (por exemplo, células Jurkat ou células T) que expressam o construto CAR CD8SP-MPL-161-(vL- vH)-Myc-BBz-T2A-PAC.

O mutante que falha na ligação às células que expressam o CAR é um candidato para conter o epítopo alvo do CAR específico para MPL.

Uma abordagem alternativa para determinar o epítopo reconhecido por um CAR particular pode incluir um ensaio competitivo funcional com diferentes anticorpos de teste.

Por exemplo, as células T que expressam o CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC podem ser cocultivadas com uma linha celular que expressa MPL (por exemplo, células HEL) na ausência e presença de concentrações crescentes de diferentes anticorpos MPL para teste.

Caso o epítopo reconhecido por um anticorpo MPL de teste se sobreponha ao epítopo reconhecido pelo CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC, espera-se que o anticorpo de teste bloqueie a exterminação de célula-alvo e produção de citocinas induzida por células T que expressam o CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)- Myc-BBz-T2A-PAC de maneira dependente da dose.

Um anticorpo não específico do mesmo isotipo que o anticorpo de teste seria incluído como controle e seria esperado que não tivesse efeito na exterminação da célula

112 / 348 alvo e na produção de citocinas induzida pelas células T que expressam o CAR. Da forma similar, um CAR específico pode ser expresso em células Jurkat-NFAT-EGFP e a capacidade de um anticorpo de teste para bloquear a indução de EGFP pelas células Jurkat-NFAT-GFP que expressam CAR após a cocultura com uma linha celular alvo pode ser usada para determinar se o epítopo reconhecido pelo anticorpo de teste se sobrepõe ao epítopo reconhecido pelo referido CAR.

[00164] Também são fornecidas neste documento composições que compreendem um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR e um módulo acessório (incluindo moléculas estimulantes de NF-κB e ativadores seletivos de NF-κB) e método para usar as mesmas no tratamento de doenças, incluindo câncer. Como descrito neste documento, são fornecidas combinações específicas de CARs convencionais (Tabela 1) e módulos acessórios, conforme descrito na Tabela 2.

[00165] Tabela 1: Arquiteturas de CAR Convencional. Os CARs convencionais de primeira geração (CAR I convencional) têm um domínio de sinalização intracelular (ISD) (por exemplo, CD3z) e nenhum domínio coestimulante. As proteínas de fusão do TCR (TFP) são outro exemplo do CAR 1 convencional. Os CARs convencionais de segunda geração (CAR 2 ou CAR II convencional) têm um domínio coestimulante (por exemplo, 41BB ou CD28) e um domínio de sinalização intracelular (ISD) (por exemplo, CD3z). Os CARs convencionais de terceira geração (CAR 3 ou CAR III convencional) têm dois domínios coestimulantes (por exemplo, 41BB e CD28) e um domínio de sinalização intracelular (ISD) (por exemplo, CD3z). Ab-TCRs são receptores de cadeia de duelo e foram descritos no documento PCT/US2016/058305. Os cTCRs são receptores de cadeia única, uma e meia ou dupla, consistindo no domínio de ligação ao antígeno derivado de um fragmento vL e vH que são fundidos a uma ou mais cadeias constantes do TCR e resultam na ativação da sinalização de células T. Receptores imunes

113 / 348 sintéticos são CARs de próxima geração e estão descritos nos documentos US 62/429.597 e WO 2018/102795 A1: Tabela 1 Arquiteturas de CAR Convencional CAR 1 ou CAR I 1 ASD HR TMD ISD (incluindo TFP) 2 CAR 2 (CAR II) ASD HR TMD CSD ISD 3 CAR 3 (CAR III) ASD HR TMD CSD-I CSD-II ISD 4 Ab-TCR vL-cL TCRD(1) 2A vH-CH1 TCRD (II) cTCR/SIR-1 de 5 vL TCR-C(1) 2A vH TCR-C (II) Cadeia Dupla cTCR/SIR-3 de 6 TCR-C(1) 2A ASD TCR-C (II) Uma Cadeia e Meia TABELA 2: ESTRUTURAS PRINCIPAIS EXEMPLIFICATIVAS No de Estrutura Componente CAR Módulo Acessório Principal

SEQ ID ID SEQ

NOME (DNA) (PRT) Estrutura Principal CAR I K13-vFLIP 972 4.885 1 Estrutura Principal CAR I hNEMO-K277A 979 4.892 2 Estrutura Principal CAR I FKBPx2-hNEMO-K277A 1.006 4.919 3 Estrutura Principal CAR I FKBPx2-hNEMO-L753(251) 1.007 4.920 4 Estrutura Principal CAR I FKBPx2-hNEMO-L600(200) 1.008 4.921 5 Estrutura Principal CAR I FKBPx2-RIP-ID 1.009 4.922 6 Estrutura Principal CAR I IKK2-S177E-S181E 1.002 4.915 7 Estrutura Principal CAR I IKK1-S176E-S180E 1.004 4.917 8 Estrutura Principal CAR I MYD88-L265P 1.000 4.913 9 Estrutura Principal CAR I TCL-1A 1.005 4.918 10 Estrutura Principal CAR I IgSP-[hTRAC-opt2] 1.010 4.923 11 Estrutura Principal CAR I IgSP-[hTRBC-opt2] 1.011 4.924 12 Estrutura Principal CAR II K13-vFLIP 972 4.885 13 Estrutura Principal CAR II hNEMO-K277A 979 4.892 14 Estrutura Principal CAR II FKBPx2-hNEMO-K277A 1.006 4.919 15 Estrutura Principal CAR II FKBPx2-hNEMO-L753(251) 1.007 4.920 16 Estrutura Principal CAR II FKBPx2-hNEMO-L600(200) 1.008 4.921 17 Estrutura Principal CAR II FKBPx2-RIP-ID 1.009 4.922 18

114 / 348 No de Estrutura Componente CAR Módulo Acessório Principal

SEQ ID ID SEQ

NOME (DNA) (PRT) Estrutura Principal CAR II IKK2-S177E-S181E 1.002 4.915 19 Estrutura Principal CAR II IKK1-S176E-S180E 1.004 4.917 20 Estrutura Principal CAR II MYD88-L265P 1.000 4.913 21 Estrutura Principal CAR II TCL-1A 1.005 4.918 22 Estrutura Principal CAR II IgSP-[hTRAC-opt2] 1.010 4.923 23 Estrutura Principal CAR II IgSP-[hTRBC-opt2] 1.011 4.924 24 Estrutura Principal CAR III K13-vFLIP 972 4.885 25 Estrutura Principal CAR III hNEMO-K277A 979 4.892 26 Estrutura Principal CAR III FKBPx2-hNEMO-K277A 1.006 4.919 27 Estrutura Principal CAR III FKBPx2-hNEMO-L753(251) 1.007 4.920 28 Estrutura Principal CAR III FKBPx2-hNEMO-L600(200) 1.008 4.921 29 Estrutura Principal CAR III FKBPx2-RIP-ID 1.009 4.922 30 Estrutura Principal CAR III IKK2-S177E-S181E 1.002 4.915 31 Estrutura Principal CAR III IKK1-S176E-S180E 1.004 4.917 32 Estrutura Principal CAR III MYD88-L265P 1.000 4.913 33 Estrutura Principal CAR III TCL-1A 1.005 4.918 34 Estrutura Principal CAR III IgSP-[hTRAC-opt2] 1.010 4.923 35 Estrutura Principal CAR III IgSP-[hTRBC-opt2] 1.011 4.924 36 Estrutura Principal Ab-TCR K13-vFLIP 972 4.885 37 Estrutura Principal Ab-TCR hNEMO-K277A 979 4.892 38 Estrutura Principal Ab-TCR FKBPx2-hNEMO-K277A 1.006 4.919 39 Estrutura Principal Ab-TCR FKBPx2-hNEMO-L753(251) 1.007 4.920 40 Estrutura Principal Ab-TCR FKBPx2-hNEMO-L600(200) 1.008 4.921 41 Estrutura Principal Ab-TCR FKBPx2-RIP-ID 1.009 4.922 42 Estrutura Principal Ab-TCR IKK2-S177E-S181E (IKK2-SS/EE) 1.002 4.915 43 Estrutura Principal Ab-TCR IKK1-S176E-S180E IKK1-SS/EE) 1.004 4.917 44 Estrutura Principal Ab-TCR MYD88-L265P 1.000 4.913 45 Estrutura Principal Ab-TCR TCL-1A 1.005 4.918 46

115 / 348 No de Estrutura Componente CAR Módulo Acessório Principal

SEQ ID ID SEQ

NOME (DNA) (PRT) Estrutura Principal Ab-TCR IgSP-[hTRAC-opt2] 1.010 4.923 47 Estrutura Principal Ab-TCR IgSP-[hTRBC-opt2] 1.011 4.924 48 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR K13-vFLIP 972 4.885 49 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR hNEMO-K277A 979 4.892 50 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR FKBPx2-hNEMO-K277A 1.006 4.919 51 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR FKBPx2-hNEMO-L753(251) 1.007 4.920 52 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR FKBPx2-hNEMO-L600(200) 1.008 4.921 53 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR FKBPx2-RIP-ID 1.009 4.922 54 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR IKK2-S177E-S181E 1.002 4.915 55 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR IKK1-S176E-S180E 1.004 4.917 56 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR MYD88-L265P 1.000 4.913 57 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR TCL-1A 1.005 4.918 58 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR IgSP-[hTRAC-opt2] 1.010 4.923 59 Estrutura Principal DC-cTCR/SIR IgSP-[hTRBC-opt2] 1.011 4.924 60 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR K13-vFLIP 972 4.885 61 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR hNEMO-K277A 979 4.892 62 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR FKBPx2-hNEMO-K277A 1.006 4.919 63 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR FKBPx2-hNEMO-L753(251) 1.007 4.920 64 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR FKBPx2-hNEMO-L600(200) 1.008 4.921 65 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR FKBPx2-RIP-ID 1.009 4.922 66 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR IKK2-S177E-S181E 1.002 4.915 67 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR IKK1-S176E-S180E 1.004 4.917 68 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR MYD88-L265P 1.000 4.913 69 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR TCL-1A 1.005 4.918 70 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR IgSP-[hTRAC-opt2] 1.010 4.923 71 Estrutura Principal OHC-cTCR/SIR IgSP-[hTRBC-opt2] 1.011 4.924 72 TABELA 6A: ANTÍGENOS ALVO, NOMES E SEQ IDs DE FRAGMENTOS vL E SEQ IDs de CDR1-3

116 / 348 ALVO NOME de vL SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vL SEQ ID-vL SEQ ID- vL (DNA) vL (PRT) de CDR1 de CDR2 vL de CDR3 ALK Alk-48-vL 7.792 10.553 13.204 13.510 13.816 ALK Alk-58-vL 7.793 10.554 13.205 13.511 13.817 Amiloide Amiloide-158-vL 7.794 10.555 13.206 13.512 13.818 BCMA BCMA-ET-40-vL 7.795 10.556 13.207 13.513 13.819 BCMA BCMA-ET-54-vL 7.796 10.557 13.208 13.514 13.820 BCMA BCMA-huC12A3-vL 7.797 10.558 13.209 13.515 13.821 BCMA BCMA-J6M0-vL 7.798 10.559 13.210 13.516 13.822 CCR4 CCR4-humAb1567-vL 7.799 10.560 13.211 13.517 13.823 CD123 CD123-CSL362-vL 7.800 10.561 13.212 13.518 13.824 CD138 CD138-vL 7.801 10.562 13.213 13.519 13.825 CD179b CD179b-vL 7.802 10.563 13.214 13.520 13.826 CD19 CD19-4G7-vL 7.803 10.564 13.215 13.521 13.827 CD19 CD19Bu12-vL 7.804 10.565 13.216 13.522 13.828 CD19 CD19MM-vL 7.805 10.566 13.217 13.523 13.829 CD19 FMC63-vL 7.806 10.567 13.218 13.524 13.830 CD19 FMC63-[2]-vL 7.807 10.568 13.219 13.525 13.831 CD19 FMC63-[3]-vL 7.808 10.569 13.220 13.526 13.832 CD19 huFMC63-11-vL 7.809 10.570 13.221 13.527 13.833 CD20 CD20-2F2-vL 7.810 10.571 13.222 13.528 13.834 CD20 CD20-GA101-vL 7.811 10.572 13.223 13.529 13.835 CD22 CD22-h10F4-vL 7.812 10.573 13.224 13.530 13.836 CD22 CD22- 7.813 10.574 13.225 13.531 13.837 H22Rhov2ACDRKA-vL CD22 CD22m971-vL 7.814 10.575 13.226 13.532 13.838 CD276 CD276-17-vL 7.815 10.576 13.227 13.533 13.839 CD30 CD30-5F11-vL 7.816 10.577 13.228 13.534 13.840 CD30 CD30-Ac10-vL 7.817 10.578 13.229 13.535 13.841 CD32 CD32-Med9-vL 7.818 10.579 13.230 13.536 13.842 CD324 CD324-hSC10-17-vL 7.819 10.580 13.231 13.537 13.843 CD324 CD324-SC10-6-vL 7.820 10.581 13.232 13.538 13.844 CD33 CD33-huMyc9-vL 7.821 10.582 13.233 13.539 13.845 CD33 CD33-AF5-vL 7.822 10.583 13.234 13.540 13.846 CD34 CD34-hu4C7-[2]-vL 7.823 10.584 13.235 13.541 13.847 CD34 CD34-hu4C7-vL 7.824 10.585 13.236 13.542 13.848 CD44v6 CD44v6-Biwa8-vL 7.825 10.586 13.237 13.543 13.849 CD5 CD5-18-vL 7.826 10.587 13.238 13.544 13.850 CD5 CD5-9-vL 7.827 10.588 13.239 13.545 13.851 CD70 CD70-h1F6-vL 7.828 10.589 13.240 13.546 13.852 CD79b CD79b-2F2-vL 7.829 10.590 13.241 13.547 13.853 CD79b huMA79bv28-vL 7.830 10.591 13.242 13.548 13.854 CDH17 CDH17-PTA001A4-vL 7.831 10.592 13.243 13.549 13.855 CDH19 CDH19-16A4-vL 7.832 10.593 13.244 13.550 13.856 CDH6 CDH6-NOV710-vL 7.833 10.594 13.245 13.551 13.857 CDH6 CDH6-NOV712-vL 7.834 10.595 13.246 13.552 13.858 CLEC5A CLEC5A-3E12A2-vL 7.835 10.596 13.247 13.553 13.859 CLEC5A CLEC5A-8H8F5-vL 7.836 10.597 13.248 13.554 13.860 CLL1 CLL1-M26-vL 7.837 10.598 13.249 13.555 13.861 CLL1 CLL1-M32-vL 7.838 10.599 13.250 13.556 13.862 Classe I de CMVpp65-F5-vL 7.839 10.600 13.251 13.557 13.863 CMVpp65/MHC CS1 huLuc63-vL 7.840 10.601 13.252 13.558 13.864 CS1 HuLuc64-[2]-vL 7.841 10.602 13.253 13.559 13.865 CS1 HuLuc64-vL 7.842 10.603 13.254 13.560 13.866 CS1 huLuc90-vL 7.843 10.604 13.255 13.561 13.867 CSF2RA CSF2RA-Ab1-vL 7.844 10.605 13.256 13.562 13.868

117 / 348 ALVO NOME de vL SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vL SEQ ID-vL SEQ ID- vL (DNA) vL (PRT) de CDR1 de CDR2 vL de CDR3 CSF2RA CSF2RA-Ab6-vL 7.845 10.606 13.257 13.563 13.869 DLL3 DLL3-hSC16-13-vL 7.846 10.607 13.258 13.564 13.870 DLL3 DLL3-hSC16-56-vL 7.847 10.608 13.259 13.565 13.871 Classe I de EBNA3c-315-vL 7.848 10.609 13.260 13.566 13.872 EBNA3c/MHC EGFR Cetuximab-vL 7.849 10.610 13.261 13.567 13.873 EGFR Nimotuzumabe-vL 7.850 10.611 13.262 13.568 13.874 EGFRviii EGFRviii-139-vL 7.851 10.612 13.263 13.569 13.875 EGFRviii EGFRviii-2173-vL 7.852 10.613 13.264 13.570 13.876 EpCam1 EpCam1-D5K5-vL 7.853 10.614 13.265 13.571 13.877 EpCam1 Epcam1-MM1-vL 7.854 10.615 13.266 13.572 13.878 FITC FITC-vL 7.855 10.616 13.267 13.573 13.879 FLT3 FLT3-NC7-vL 7.856 10.617 13.268 13.574 13.880 Glicoproteína do HIV1-N6-vL 7.857 10.618 13.269 13.575 13.881 envelope do HIV1 Receptor de Folato 1 FR1-huMov19-vL 7.858 10.619 13.270 13.576 13.882 (FR1) GAD GAD-G3H8-vL 7.859 10.620 13.271 13.577 13.883 GD2 GD2-hu14-18-vL 7.860 10.621 13.272 13.578 13.884 GD2 GD2-hu3F8-vL 7.861 10.622 13.273 13.579 13.885 GD3 GD3-KM-641-vL 7.862 10.623 13.274 13.580 13.886 GFRa4 GFRa4-P4-10-2-vL 7.863 10.624 13.275 13.581 13.887 GFRa4 GFRa4-P4-10-vL 7.864 10.625 13.276 13.582 13.888 GFRa4 GFRAlpha4-P4-6-vL 7.865 10.626 13.277 13.583 13.889 GM1 GM1-5B2-vL 7.866 10.627 13.278 13.584 13.890 GM1 GM1-7E5-vL 7.867 10.628 13.279 13.585 13.891 Classe I de gp100-G2D12-vL 7.868 10.629 13.280 13.586 13.892 gp100/MHC Classe I de gp100-vL 7.869 10.630 13.281 13.587 13.893 gp100/MHC GPC3 GPC3-4E5-vL 7.870 10.631 13.282 13.588 13.894 gpNMB gpNMB-115-vL 7.871 10.632 13.283 13.589 13.895 GPRC5D GPRC5D-ET150-18-vL 7.872 10.633 13.284 13.590 13.896 GPRC5D GPRC5D-ET150-5-vL 7.873 10.634 13.285 13.591 13.897 Her2 Her2-Hu4D5-vL 7.874 10.635 13.286 13.592 13.898 HIV1-gag (77- HIV1-E5-vL 7.875 10.636 13.287 13.593 13.899 85)/MHC Glicoproteína do HIV1-3BNC117-vL 7.876 10.637 13.288 13.594 13.900 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-PGT-128-vL 7.877 10.638 13.289 13.595 13.901 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-VR-C01-vL 7.878 10.639 13.290 13.596 13.902 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-X5-vL 7.879 10.640 13.291 13.597 13.903 envelope do HIV1 HMW-MAA HMW-MAA-hIND-vL 7.880 10.641 13.292 13.598 13.904 Classe I de HTLV1- TAX-T3E3-vL 7.881 10.642 13.293 13.599 13.905 TAX/MHC Classe I de HTLV1- TAX-T3F2-vL 7.882 10.643 13.294 13.600 13.906 TAX/MHC IL11Ra IL11Ra-8E2-vL 7.883 10.644 13.295 13.601 13.907 IL13Ra2 IL13Ra2-hu107-vL 7.884 10.645 13.296 13.602 13.908 IL13Ra2 IL13Ra2-Hu108-vL 7.885 10.646 13.297 13.603 13.909 IL6R IL6R-M83-vL 7.886 10.647 13.298 13.604 13.910 Influenza A HA FLU-MEDI-8852-vL 7.887 10.648 13.299 13.605 13.911 KSHV-gH YC15-vL 7.888 10.649 13.300 13.606 13.912

118 / 348 ALVO NOME de vL SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vL SEQ ID-vL SEQ ID- vL (DNA) vL (PRT) de CDR1 de CDR2 vL de CDR3 KSHV-K8.1 4C3-vL 7.889 10.650 13.301 13.607 13.913 L1CAM L1CAM-9-3-HU3-vL 7.890 10.651 13.302 13.608 13.914 LAMP1 LAMP1-humab1-2-vL 7.891 10.652 13.303 13.609 13.915 LAMP1 LAMP1-Mb4-vL 7.892 10.653 13.304 13.610 13.916 LewisY LewisY-huS193-vL 7.893 10.654 13.305 13.611 13.917 Lym1 Lym1-vL 7.894 10.655 13.306 13.612 13.918 Lym2 Lym2-vL 7.895 10.656 13.307 13.613 13.919 Classe I de MART1-CAG10-vL 7.896 10.657 13.308 13.614 13.920 MART1/MHC Classe I de MART1-CLA12-vL 7.897 10.658 13.309 13.615 13.921 MART1/MHC Mesotelina Mesotelina-m912-vL 7.898 10.659 13.310 13.616 13.922 MPL (TPO-R) MPL-111-vL 7.899 10.660 13.311 13.617 13.923 MPL (TPO-R) MPL-161-HL-vL 7.900 10.661 13.312 13.618 13.924 MPL (TPO-R) MPL-161-vL 7.901 10.662 13.313 13.619 13.925 MPL (TPO-R) MPL-175-vL 7.902 10.663 13.314 13.620 13.926 MPL (TPO-R) MPL-178-vL 7.903 10.664 13.315 13.621 13.927 MPL (TPO-R) MPL-huVB22Bw5-vL 7.904 10.665 13.316 13.622 13.928 MPL (TPO-R) MPL-12E10-vL 7.905 10.666 13.317 13.623 13.929 MPL (TPO-R) MPL-AB317-vL 7.906 10.667 13.318 13.624 13.930 Classe I de MUC1-D6-M3A1-vL 7.907 10.668 13.319 13.625 13.931 Muc1/MHC Classe I de Muc1-D6-M3B8-vL 7.908 10.669 13.320 13.626 13.932 Muc1/MHC Muc16 Muc16-4H11-vL 7.909 10.670 13.321 13.627 13.933 NKG2D NKG2D-MS-vL 7.910 10.671 13.322 13.628 13.934 NYBR1 NYBR1-vL 7.911 10.672 13.323 13.629 13.935 Classe I de NY- NY-ESO-T1-vL 7.912 10.673 13.324 13.630 13.936 ESO/MHC PD1 PD1-4H1-vL 7.913 10.674 13.325 13.631 13.937 PD1 PD1-5C4-vL 7.914 10.675 13.326 13.632 13.938 PDL1 PDL1-10A5-vL 7.915 10.676 13.327 13.633 13.939 PDL1 PDL1-Atezoli-vL 7.916 10.677 13.328 13.634 13.940 PDL1 PDL1-SP142-vL 7.917 10.678 13.329 13.635 13.941 Classe I de PR1-vL 7.918 10.679 13.330 13.636 13.942 PR1/MHC PSCA PSCA-Ha14-117-vL 7.919 10.680 13.331 13.637 13.943 PSCA PSCA-Ha14-121-vL 7.920 10.681 13.332 13.638 13.944 PSMA PSMA-006-vL 7.921 10.682 13.333 13.639 13.945 PSMA PSMA-J591-vL 7.922 10.683 13.334 13.640 13.946 PTK7 PTK7-hSC6-23-vL 7.923 10.684 13.335 13.641 13.947 PTK7 PTK7-SC6-10-2-vL 7.924 10.685 13.336 13.642 13.948 ROR1 ROR1-4A5-vL 7.925 10.686 13.337 13.643 13.949 ROR1 ROR1-4C10-vL 7.926 10.687 13.338 13.644 13.950 SLea SLea-5B1-vL 7.927 10.688 13.339 13.645 13.951 SLea SLea-7E3-vL 7.928 10.689 13.340 13.646 13.952 SSEA4 SSEA4-vL 7.929 10.690 13.341 13.647 13.953 TCRB1 TCRB1-E09-vL 7.930 10.691 13.342 13.648 13.954 TCRB1 TCRB1-Jovi1-vL 7.931 10.692 13.343 13.649 13.955 TCRB2 TCRB2-CP01-D05-vL 7.932 10.693 13.344 13.650 13.956 TCRB2 TCRB2-CP01-E05-vL 7.933 10.694 13.345 13.651 13.957 TCRgd TCRgd-G5-4-vL 7.934 10.695 13.346 13.652 13.958 Classe I de TERT-3G3-T865-vL 7.935 10.696 13.347 13.653 13.959 TERT/MHC

119 / 348 ALVO NOME de vL SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vL SEQ ID-vL SEQ ID- vL (DNA) vL (PRT) de CDR1 de CDR2 vL de CDR3 Classe I de TERT-4A9-T540-vL 7.936 10.697 13.348 13.654 13.960 TERT/MHC TGFBR2 TGFBR2-Ab1-vL 7.937 10.698 13.349 13.655 13.961 TIM1 TIM1-HVCR1-270-2-vL 7.938 10.699 13.350 13.656 13.962 TIM1 Tim1HVCR1-ARD5-vL 7.939 10.700 13.351 13.657 13.963 TnAg TnAg-vL 7.940 10.701 13.352 13.658 13.964 Tn-Muc1 Tn-Muc1-hu5E5-vL 7.941 10.702 13.353 13.659 13.965 TROP2 TROP2-ARA47- 7.942 10.703 13.354 13.660 13.966 HV3KV3-vL TROP2 TROP2-h7E6-SVG-vL 7.943 10.704 13.355 13.661 13.967 TSHR TSHR-5C9-vL 7.944 10.705 13.356 13.662 13.968 TSHR TSHR-K1-70-vL 7.945 10.706 13.357 13.663 13.969 TSHR TSHR-KB1-vL 7.946 10.707 13.358 13.664 13.970 TSLRP TSLRP-vL 7.947 10.708 13.359 13.665 13.971 Classe I de Tyro-B2-vL 7.948 10.709 13.360 13.666 13.972 Tirosinase/MHC Classe I de Tyro-Mc1-vL 7.949 10.710 13.361 13.667 13.973 Tirosinase/MHC Classe I de TA2-vL 7.950 10.711 13.362 13.668 13.974 Tirosinase/MHC VEGFR3 VEGFR3-Ab1-vL 7.951 10.712 13.363 13.669 13.975 Classe I de WT1-Ab13-vL 7.952 10.713 13.364 13.670 13.976 WT1/MHC Classe I de WT1-Ab15-vL 7.953 10.714 13.365 13.671 13.977 WT1/MHC Classe I de WT1-Ab1-vL 7.954 10.715 13.366 13.672 13.978 WT1/MHC Classe I de WT1-Ab5-vL 7.955 10.716 13.367 13.673 13.979 WT1/MHC EBV-gp350 EBV-gp350-vL 7.956 10.717 13.368 13.674 13.980 CD123 CD123-1172-vL 7.957 10.718 13.369 13.675 13.981 CDH19 CDH19-4B10-vL 7.958 10.719 13.370 13.676 13.982 Receptor Beta de FRbeta-m923-vL 7.959 10.720 13.371 13.677 13.983 Folato LHR LHR-8B7-vL 7.960 10.721 13.372 13.678 13.984 LHR LHR-5F4-21-vL 7.961 10.722 13.373 13.679 13.985 B7H4 B7H4-hu22Cl0-vL 7.962 10.723 13.374 13.680 13.986 B7H4 B7H4-hu1D11-vL 7.963 10.724 13.375 13.681 13.987 IgE IgE-omalizumab-vL 7.964 10.725 13.376 13.682 13.988 CD23 CD23-p5E8-vL 7.965 10.726 13.377 13.683 13.989 GCC GCC-5F9-vL 7.966 10.727 13.378 13.684 13.990 GCC GCC-Ab229-vL 7.967 10.728 13.379 13.685 13.991 CD200R CD200R-huDx182-vL 7.968 10.729 13.380 13.686 13.992 Classe I de AFP-61-vL 7.969 10.730 13.381 13.687 13.993 AFP/MHC Classe I de AFP-76-vL 7.970 10.731 13.382 13.688 13.994 AFP/MHC Classe I de AFP-79-vL 7.971 10.732 13.383 13.689 13.995 AFP/MHC BCMA BCMA-ET-03-vL 7.972 10.733 13.384 13.690 13.996 BCMA BCMA- 7.973 10.734 13.385 13.691 13.997 huC11.D5.3L1H3-vL BCMA BCMA-huC13-F12-vL 7.974 10.735 13.386 13.692 13.998 CD123 CD123-DART-1-vL 7.975 10.736 13.387 13.693 13.999 CD123 CD123-DART-2-vL 7.976 10.737 13.388 13.694 14.000 CD123 CD123-I3RB18-vL 7.977 10.738 13.389 13.695 14.001

120 / 348 ALVO NOME de vL SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vL SEQ ID-vL SEQ ID- vL (DNA) vL (PRT) de CDR1 de CDR2 vL de CDR3 CD123 CD123-hu3E3-vL 7.978 10.739 13.390 13.696 14.002 CD123 CD123-9F6-vL 7.979 10.740 13.391 13.697 14.003 CD123 CD123-I3RB2-vL 7.980 10.741 13.392 13.698 14.004 CD123 CD123-1176-vL 7.981 10.742 13.393 13.699 14.005 CD123 CD123-8B11-vL 7.982 10.743 13.394 13.700 14.006 CD123 CD123-2B8-vL 7.983 10.744 13.395 13.701 14.007 CD123 CD123-9D7-vL 7.984 10.745 13.396 13.702 14.008 CD123 CD123-3B10-vL 7.985 10.746 13.397 13.703 14.009 CD19 CD19-MEDI-3649-vL 7.986 10.747 13.398 13.704 14.010 CD19 CD19-Medrex-24D1-vL 7.987 10.748 13.399 13.705 14.011 CD19 CD19-MOR0028-vL 7.988 10.749 13.400 13.706 14.012 CD19 CD19-HD37-H2L1-vL 7.989 10.750 13.401 13.707 14.013 CD19 CD19-huBly3-vL 7.990 10.751 13.402 13.708 14.014 CD19 CD19-huSJ25C1-vL 7.991 10.752 13.403 13.709 14.015 CD19 CD19-hB4-vL 7.992 10.753 13.404 13.710 14.016 CD19 CD19-hu-mROO5-1-vL 7.993 10.754 13.405 13.711 14.017 CD19 CD19-hA19-vL 7.994 10.755 13.406 13.712 14.018 CD20 CD20-Leu16-vL 7.995 10.756 13.407 13.713 14.019 CD20 CD20-11B8-vL 7.996 10.757 13.408 13.714 14.020 CD20 CD20-2C6-vL 7.997 10.758 13.409 13.715 14.021 CD20 CD20-2H7-vL 7.998 10.759 13.410 13.716 14.022 CD20 CD20-hA20-vL 7.999 10.760 13.411 13.717 14.023 CD20 CD20-BM-CA-1925-v4- 8.000 10.761 13.412 13.718 14.024 vL CD20 CD20-Ubli-v4-vL 8.001 10.762 13.413 13.719 14.025 CD20 CD20-h1F5-vL 8.002 10.763 13.414 13.720 14.026 CD20 CD20-7D8-vL 8.003 10.764 13.415 13.721 14.027 CD20 CD20-AME-33-vL 8.004 10.765 13.416 13.722 14.028 CD33 CD33-Boehr2800308-vL 8.005 10.766 13.417 13.723 14.029 CD33 CD33-Him3-4-vL 8.006 10.767 13.418 13.724 14.030 CD33 CD33-SGNh2H12-vL 8.007 10.768 13.419 13.725 14.031 CD33 CD33-15G15-33-vL 8.008 10.769 13.420 13.726 14.032 CD33 CD33-33H4-vL 8.009 10.770 13.421 13.727 14.033 CD33 CD33-9C3-2-vL 8.010 10.771 13.422 13.728 14.034 CD99 CD99-hu12E7-vL 8.011 10.772 13.423 13.729 14.035 CLL1 CLL1-21C9-L2H3-vL 8.012 10.773 13.424 13.730 14.036 CLL1 CLL1-6E7L4H1e-vL 8.013 10.774 13.425 13.731 14.037 CLL1 CLL1-hu1075-v1-vL 8.014 10.775 13.426 13.732 14.038 CLL1 CLL1-hu1075-v2-vL 8.015 10.776 13.427 13.733 14.039 CS1 CS1-PDL241-vL 8.016 10.777 13.428 13.734 14.040 CS1 CS1-Hu27A-vL 8.017 10.778 13.429 13.735 14.041 CS1 CS1-ScHu34C3-vL 8.018 10.779 13.430 13.736 14.042 CS1 CS1-Hu31-D2-vL 8.019 10.780 13.431 13.737 14.043 CS1 CS1-Luc34-vL 8.020 10.781 13.432 13.738 14.044 CS1 CS1-LucX2-vL 8.021 10.782 13.433 13.739 14.045 FITC FITC-4M-53-vL 8.022 10.783 13.434 13.740 14.046 FITC FITC-E2-vL 8.023 10.784 13.435 13.741 14.047 GPRC5D GPRC5D-ET150-1-vL 8.024 10.785 13.436 13.742 14.048 GPRC5D GPRC5D-ET150-2-vL 8.025 10.786 13.437 13.743 14.049 HLA-A2 HLA-A2-3PB2-vL 8.026 10.787 13.438 13.744 14.050 Classe I de HPV16- HPV16-7-8-vL 8.027 10.788 13.439 13.745 14.051 E7/MHC Classe I de HPV16- HPV16-2-vL 8.028 10.789 13.440 13.746 14.052 E7/MHC

121 / 348 ALVO NOME de vL SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vL SEQ ID-vL SEQ ID- vL (DNA) vL (PRT) de CDR1 de CDR2 vL de CDR3 Fator 1 de Tecido TF1-98-vL 8.029 10.790 13.441 13.747 14.053 (TF1) Tn-Muc1 Tn-Muc1-5E5-vL 8.030 10.791 13.442 13.748 14.054 Cadeia Leve Kappa Kappa-LC1-vL 8.031 10.792 13.443 13.749 14.055 Ig PTK7 PTK7-7C8-vL 8.032 10.793 13.444 13.750 14.056 PTK7 PTK7-12C6a-vL 8.033 10.794 13.445 13.751 14.057 CD19 hCD19-EUK5-13-vL 8.034 10.795 13.446 13.752 14.058 Classe I de Ras-Ab2-vL 8.035 10.796 13.447 13.753 14.059 Ras/MHC Classe I de Ras-Ab4-vL 8.036 10.797 13.448 13.754 14.060 Ras/MHC CLD18A2 CLD18A2-43A11-vL 8.037 10.798 13.449 13.755 14.061 CLD18A2 CLD18A2-175D10-vL 8.038 10.799 13.450 13.756 14.062 CD43 CD43-huJL-1-257-10-vL 8.039 10.800 13.451 13.757 14.063 CD69L CD69L-DREG200-vL 8.040 10.801 13.452 13.758 14.064 NY-ESO NYESO-35-15-vL 8.041 10.802 13.453 13.759 14.065 Glicoproteína P Pgp-9F11-vL 8.042 10.803 13.454 13.760 14.066 (MDR1) Streptag Streptag-vL 8.043 10.804 13.455 13.761 14.067 BCMA BCMA-huC13-F12- 8.044 10.805 13.456 13.762 14.068 L1H2-vL BCMA BCMA-huC12A3-L3H3- 8.045 10.806 13.457 13.763 14.069 vL MPL/TPO-R Hu-161-2-vL 8.046 10.807 13.458 13.764 14.070 Glicoproteína P Pgp-MRK16-vL 8.047 10.808 13.459 13.765 14.071 (MDR1) CD22 CD22-5-vL 8.048 10.809 13.460 13.766 14.072 CD22 CD22-10-vL 8.049 10.810 13.461 13.767 14.073 CD22 CD22-31-vL 8.050 10.811 13.462 13.768 14.074 CD22 CD22-53-vL 8.051 10.812 13.463 13.769 14.075 CD22 CD22-65-vL 8.052 10.813 13.464 13.770 14.076 CD19 hu-FMC65-1-vL 8.053 10.814 13.465 13.771 14.077 MPL/TPO-R MPL-hu-175-2-vL 8.054 10.815 13.466 13.772 14.078 MPL/TPO-R MPL-hu-111-2-vL 8.055 10.816 13.467 13.773 14.079 CD179a CD179a-2460-B04-vL 8.056 10.817 13.468 13.774 14.080 CD179a CD179a-2462-E07-vL 8.057 10.818 13.469 13.775 14.081 CD37 CD37-TRU-HL-vL 8.058 10.819 13.470 13.776 14.082 CD37 huCD37-Boeh-vL 8.059 10.820 13.471 13.777 14.083 CD70 CD70-13D-vL 8.060 10.821 13.472 13.778 14.084 CD70 CD70-16D-vL 8.061 10.822 13.473 13.779 14.085 CD70 CD70-21D-vL 8.062 10.823 13.474 13.780 14.086 CD70 CD70-1G2D-vL 8.063 10.824 13.475 13.781 14.087 CD70 CD70-hu2H5-vL 8.064 10.825 13.476 13.782 14.088 CD70 CD70-69A7-vL 8.065 10.826 13.477 13.783 14.089 CD70 CD70-10B4-vL 8.066 10.827 13.478 13.784 14.090 CD70 CD70-24D-vL 8.067 10.828 13.479 13.785 14.091 CD70 CD70-25D-vL 8.068 10.829 13.480 13.786 14.092 Glicoproteína do HIV1-N49P6-vL 8.069 10.830 13.481 13.787 14.093 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N49P7-vL 8.070 10.831 13.482 13.788 14.094 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N49P11-vL 8.071 10.832 13.483 13.789 14.095 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P1-1 8.072 10.833 13.484 13.790 14.096 envelope do HIV1

122 / 348 ALVO NOME de vL SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vL SEQ ID-vL SEQ ID- vL (DNA) vL (PRT) de CDR1 de CDR2 vL de CDR3 Glicoproteína do HIV1-N60P25-vL 8.073 10.834 13.485 13.791 14.097 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N49P9-vL 8.074 10.835 13.486 13.792 14.098 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P2-1-vL 8.075 10.836 13.487 13.793 14.099 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P31-1-vL 8.076 10.837 13.488 13.794 14.100 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P22-vL 8.077 10.838 13.489 13.795 14.101 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P38-vL 8.078 10.839 13.490 13796 14.102 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P30-vL 8.079 10.840 13.491 13.797 14.103 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P36-vL 8.080 10.841 13.492 13.798 14.104 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P39-vL 8.081 10.842 13.493 13.799 14.105 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N6039-1-vL 8.082 10.843 13.494 13.800 14.106 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P47-vL 8.083 10.844 13.495 13.801 14.107 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P48-vL 8.084 10.845 13.496 13.802 14.108 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P51-vL 8.085 10.846 13.497 13.803 14.109 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P35-vL 8.086 10.847 13.498 13.804 14.110 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P37-vL 8.087 10.848 13.499 13.805 14.111 envelope do HIV1 Lym1 Hu-Lym1-vL 8.088 10.849 13.500 13.806 14.112 Lym2 Hu-Lym2-vL 8.089 10.850 13.501 13.807 14.113 BCMA BCMA-USC1-vL 8.090 10.851 13.502 13.808 14.114 BCMA BCMA-USC2-vL 8.091 10.852 13.503 13.809 14.115 BCMA BCMA-USC3-vL 8.092 10.853 13.504 13.810 14.116 BCMA BCMA-USC4-vL 8.093 10.854 13.505 13.811 14.117 BCMA BCMA-USC5-vL 8.094 10.855 13.506 13.812 14.118 BCMA BCMA-USC6-vL 8.095 10.856 13.507 13.813 14.119 BCMA BCMA-USC7-vL 8.096 10.857 13.508 13.814 14.120 CD43 CD43-huJL-1-257-10-vL 8.097 10.858 13.509 13.815 14.121

TABELA 6B: ANTÍGENOS ALVO, NOMES E SEQ IDS DE FRAGMENTOS vH E SEQ IDs de CDR1-3 ALVO NOME de vH SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vH SEQ ID-vH SEQ ID- vH (DNA) vH (PRT) de CDR1 de CDR2 vH de CDR3 ALK Alk-48-vH 8.098 10.859 14.122 14.428 14.734 ALK Alk-58-vH 8.099 10.860 14.123 14.429 14.735 Amiloide Amiloide-158-vH 8.100 10.861 14.124 14.430 14.736 BCMA BCMA-ET-40-vH 8.101 10.862 14.125 14.431 14.737 BCMA BCMA-ET-54-vH 8.102 10.863 14.126 14.432 14.738 BCMA BCMA-huC12A3-vH 8.103 10.864 14.127 14.433 14.739 BCMA BCMA-J6M0-vH 8.104 10.865 14.128 14.434 14.740 CCR4 CCR4-humAb1567-vH 8.105 10.866 14.129 14.435 14.741 CD123 CD123-CSL362-vH 8.106 10.867 14.130 14.436 14.742

123 / 348 ALVO NOME de vH SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vH SEQ ID-vH SEQ ID- vH (DNA) vH (PRT) de CDR1 de CDR2 vH de CDR3 CD138 CD138-vH 8.107 10.868 14.131 14.437 14.743 CD179b CD179b-vH 8.108 10.869 14.132 14.438 14.744 CD19 CD19-4G7-vH 8.109 10.870 14.133 14.439 14.745 CD19 CD19Bu12-vH 8.110 10.871 14.134 14.440 14.746 CD19 CD19Bu12-[2]-vH 8.111 10.872 14.135 14.441 14.747 CD19 CD19MM-vH 8.112 10.873 14.136 14.442 14.748 CD19 FMC63-vH 8.113 10.874 14.137 14.443 14.749 CD19 FMC-63-vH 8.114 10.875 14.138 14.444 14.750 CD19 huFMC63-11-vH 8.115 10.876 14.139 14.445 14.751 CD20 CD20-2F2-vH 8.116 10.877 14.140 14.446 14.752 CD20 CD20-GA101-vH 8.117 10.878 14.141 14.447 14.753 CD22 CD22-h10F4-vH 8.118 10.879 14.142 14.448 14.754 CD22 CD22- 8.119 10.880 14.143 14.449 14.755 H22Rhov2ACDRKA-vH CD22 CD22m971-vH 8.120 10.881 14.144 14.450 14.756 CD276 CD276-17-vH 8.121 10.882 14.145 14.451 14.757 CD30 CD30-5F11-vH 8.122 10.883 14.146 14.452 14.758 CD30 CD30-Ac10-vH 8.123 10.884 14.147 14.453 14.759 CD32 CD32-Med9-vH 8.124 10.885 14.148 14.454 14.760 CD324 CD324-hSC10-17-vH 8.125 10.886 14.149 14.455 14.761 CD324 CD324-SC10-6-vH 8.126 10.887 14.150 14.456 14.762 CD33 CD33-huMyc9-vH 8.127 10.888 14.151 14.457 14.763 CD33 CD33-AF5-vH 8.128 10.889 14.152 14.458 14.764 CD34 CD34-hu4C7-vH 8.129 10.890 14.153 14.459 14.765 CD44v6 CD44v6-Biwa8-vH 8.130 10.891 14.154 14.460 14.766 CD5 CD5-18-vH 8.131 10.892 14.155 14.461 14.767 CD5 CD5-9-vH 8.132 10.893 14.156 14.462 14.768 CD70 CD70-h1F6-vH 8.133 10.894 14.157 14.463 14.769 CD79b CD79b-2F2-vH 8.134 10.895 14.158 14.464 14.770 CD79b huMA79bv28-vH 8.135 10.896 14.159 14.465 14.771 CDH17 CDH17-PTA001A4-vH 8.136 10.897 14.160 14.466 14.772 CDH19 CDH19-16A4-vH 8.137 10.898 14.161 14.467 14.773 CDH6 CDH6-NOV710-vH 8.138 10.899 14.162 14.468 14.774 CDH6 CDH6-NOV712-vH 8.139 10.900 14.163 14.469 14.775 CLEC5A CLEC5A-3E12A2-vH 8.140 10.901 14.164 14.470 14.776 CLEC5A CLEC5A-8H8F5-vH 8.141 10.902 14.165 14.471 14.777 CLL1 CLL1-M26-vH 8.142 10.903 14.166 14.472 14.778 CLL1 CLL1-M32-vH 8.143 10.904 14.167 14.473 14.779 Classe I de CMVpp65-F5-vH 8.144 10.905 14.168 14.474 14.780 CMVpp65/MHC CS1 huLuc63-vH 8.145 10.906 14.169 14.475 14.781 CS1 HuLuc64-vH 8.146 10.907 14.170 14.476 14.782 CS1 huLuc90-vH 8.147 10.908 14.171 14.477 14.783 CSF2RA CSF2RA-Ab1-vH 8.148 10.909 14.172 14.478 14.784 CSF2RA CSF2RA-Ab6-vH 8.149 10.910 14.173 14.479 14.785 DLL3 DLL3-hSC16-13-vH 8.150 10.911 14.174 14.480 14.786 DLL3 DLL3-hSC16-56-vH 8.151 10.912 14.175 14.481 14.787 Classe I de EBNA3c-315-vH 8.152 10.913 14.176 14.482 14.788 EBNA3c/MHC EGFR Cetuximabe-vH 8.153 10.914 14.177 14.483 14.789 EGFR Nimotuzumabe-vH 8.154 10.915 14.178 14.484 14.790 EGFRviii EGFRviii-139-vH 8.155 10.916 14.179 14.485 14.791 EGFRviii EGFRviii-2173-vH 8.156 10.917 14.180 14.486 14.792 EpCam1 EpCam1-D5K5-vH 8.157 10.918 14.181 14.487 14.793 EpCam1 Epcam1-MM1-vH 8.158 10.919 14.182 14.488 14.794

124 / 348 ALVO NOME de vH SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vH SEQ ID-vH SEQ ID- vH (DNA) vH (PRT) de CDR1 de CDR2 vH de CDR3 FITC FITC-vH 8.159 10.920 14.183 14.489 14.795 FLT3 FLT3-NC7-vH 8.160 10.921 14.184 14.490 14.796 Glicoproteína do HIV1-N6-vH 8.161 10.922 14.185 14.491 14.797 envelope do HIV1 Receptor de Folato 1 FR1-huMov19-vH 8.162 10.923 14.186 14.492 14.798 (FR1) GAD GAD-G3H8-vH 8.163 10.924 14.187 14.493 14.799 GD2 GD2-hu14-18-vH 8.164 10.925 14.188 14.494 14.800 GD2 GD2-hu3F8-vH 8.165 10.926 14.189 14.495 14.801 GD3 GD3-KM-641-vH 8.166 10.927 14.190 14.496 14.802 GFRa4 GFRa4-P4-10-vH 8.167 10.928 14.191 14.497 14.803 GFRa4 GFRAlpha4-P4-6-vH 8.168 10.929 14.192 14.498 14.804 GM1 GM1-5B2-vH 8.169 10.930 14.193 14.499 14.805 GM1 GM1-7E5-vH 8.170 10.931 14.194 14.500 14.806 Classe I de gp100-G2D12-vH 8.171 10.932 14.195 14.501 14.807 gp100/MHC Classe I de gp100-vH 8.172 10.933 14.196 14.502 14.808 gp100/MHC GPC3 GPC3-4E5-vH 8.173 10.934 14.197 14.503 14.809 gpNMB gpNMB-115-vH 8.174 10.935 14.198 14.504 14.810 GPRC5D GPRC5D-ET150-18-vH 8.175 10.936 14.199 14.505 14.811 GPRC5D GPRC5D-ET150-5-vH 8.176 10.937 14.200 14.506 14.812 Her2 Her2-Hu4D5-vH 8.177 10.938 14.201 14.507 14.813 HIV1-gag (77- HIV1-E5-vH 8.178 10.939 14.202 14.508 14.814 85)/MHC Glicoproteína do HIV1-3BNC117-vH 8.179 10.940 14.203 14.509 14.815 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-PGT-128-vH 8.180 10.941 14.204 14.510 14.816 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-VR-C01-vH 8.181 10.942 14.205 14.511 14.817 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-X5-vH 8.182 10.943 14.206 14.512 14.818 envelope do HIV1 HMW-MAA HMW-MAA-hIND-vH 8.183 10.944 14.207 14.513 14.819 Classe I de HTLV1- TAX-T3E3-vH 8.184 10.945 14.208 14.514 14.820 TAX/MHC Classe I de HTLV1- TAX-T3F2-vH 8.185 10.946 14.209 14.515 14.821 TAX/MHC IL11Ra IL11Ra-8E2-vH 8.186 10.947 14.210 14.516 14.822 IL13Ra2 IL13Ra2-hu107-vH 8.187 10.948 14.211 14.517 14.823 IL13Ra2 IL13Ra2-Hu108-vH 8.188 10.949 14.212 14.518 14.824 IL6R IL6R-M83-vH 8.189 10.950 14.213 14.519 14.825 Influenza A HA FLU-MEDI-8852-vH 8.190 10.951 14.214 14.520 14.826 KSHV-gH YC15-vH 8.191 10.952 14.215 14.521 14.827 KSHV-K8.1 4C3-vH 8.192 10.953 14.216 14.522 14.828 L1CAM L1CAM-9-3-HU3-vH 8.193 10.954 14.217 14.523 14.829 LAMP1 LAMP1-humab1-2-vH 8.194 10.955 14.218 14.524 14.830 LAMP1 LAMP1-Mb4-vH 8.195 10.956 14.219 14.525 14.831 LewisY LewisY-huS193-vH 8.196 10.957 14.220 14.526 14.832 Lym1 Lym1-vH 8.197 10.958 14.221 14.527 14.833 Lym2 Lym2-vH 8.198 10.959 14.222 14.528 14.834 Classe I de MART1-CAG10-vH 8.199 10.960 14.223 14.529 14.835 MART1/MHC Classe I de MART1-CLA12-vH 8.200 10.961 14.224 14.530 14.836 MART1/MHC Mesotelina Mesotelina-m912-[2]-vH 8.201 10.962 14.225 14.531 14.837

125 / 348 ALVO NOME de vH SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vH SEQ ID-vH SEQ ID- vH (DNA) vH (PRT) de CDR1 de CDR2 vH de CDR3 Mesotelina Mesotelina-m912-vH 8.202 10.963 14.226 14.532 14.838 MPL (TPO-R) MPL-111-vH 8.203 10.964 14.227 14.533 14.839 MPL (TPO-R) MPL-161-HL-vH 8.204 10.965 14.228 14.534 14.840 MPL (TPO-R) MPL-161-vH 8.205 10.966 14.229 14.535 14.841 MPL (TPO-R) MPL-175-vH 8.206 10.967 14.230 14.536 14.842 MPL (TPO-R) MPL-178-vH 8.207 10.968 14.231 14.537 14.843 MPL (TPO-R) MPL-huVB22Bw5-vH 8.208 10.969 14.232 14.538 14.844 MPL (TPO-R) MPL-12E10-vH 8.209 10.970 14.233 14.539 14.845 MPL (TPO-R) MPL-AB317-vH 8.210 10.971 14.234 14.540 14.846 Classe I de MUC1-D6-M3A1-vH 8.211 10.972 14.235 14.541 14.847 Muc1/MHC Classe I de Muc1-D6-M3B8-vH 8.212 10.973 14.236 14.542 14.848 Muc1/MHC Muc16 Muc16-4H11-vH 8.213 10.974 14.237 14.543 14.849 NKG2D NKG2D-MS-vH 8.214 10.975 14.238 14.544 14.850 NYBR1 NYBR1-vH 8.215 10.976 14.239 14.545 14.851 Classe I de NY- NY-ESO-T1-vH 8.216 10.977 14.240 14.546 14.852 ESO/MHC Classe I de NY- NY-ESO-T2-vH 8.217 10.978 14.241 14.547 14.853 ESO/MHC PD1 PD1-4H1-vH 8.218 10.979 14.242 14.548 14.854 PD1 PD1-5C4-vH 8.219 10.980 14.243 14.549 14.855 PDL1 PDL1-Atezoli-vH 8.220 10.981 14.244 14.550 14.856 PDL1 PDL1-SP142-vH 8.221 10.982 14.245 14.551 14.857 Classe I de PR1-vH 8.222 10.983 14.246 14.552 14.858 PR1/MHC PSCA PSCA-Ha14-117-vH 8.223 10.984 14.247 14.553 14.859 PSCA PSCA-Ha14-121-vH 8.224 10.985 14.248 14.554 14.860 PSMA PSMA-006-vH 8.225 10.986 14.249 14.555 14.861 PSMA PSMA-J591-vH 8.226 10.987 14.250 14.556 14.862 PTK7 PTK7-hSC6-23-vH 8.227 10.988 14.251 14.557 14.863 PTK7 PTK7-SC6-10-2-vH 8.228 10.989 14.252 14.558 14.864 ROR1 ROR1-4A5-vH 8.229 10.990 14.253 14.559 14.865 ROR1 ROR1-4C10-vH 8.230 10.991 14.254 14.560 14.866 SLea SLea-5B1-vH 8.231 10.992 14.255 14.561 14.867 SLea SLea-7E3-vH 8.232 10.993 14.256 14.562 14.868 SSEA4 SSEA4-vH 8.233 10.994 14.257 14.563 14.869 TCRB1 TCRB1-E09-vH 8.234 10.995 14.258 14.564 14.870 TCRB1 TCRB1-Jovi1-vH 8.235 10.996 14.259 14.565 14.871 TCRB2 TCRB2-CP01-D05-vH 8.236 10.997 14.260 14.566 14.872 TCRB2 TCRB2-CP01-E05-vH 8.237 10.998 14.261 14.567 14.873 TCRgd TCRgd-G5-4-vH 8.238 10.999 14.262 14.568 14.874 Classe I de TERT-3G3-T865-vH 8.239 11.000 14.263 14.569 14.875 TERT/MHC Classe I de TERT-4A9-T540-vH 8.240 11.001 14.264 14.570 14.876 TERT/MHC TGFBR2 TGFBR2-Ab1-vH 8.241 11.002 14.265 14.571 14.877 TIM1 TIM1-HVCR1-270-2-vH 8.242 11.003 14.266 14.572 14.878 TIM1 Tim1HVCR1-ARD5-vH 8.243 11.004 14.267 14.573 14.879 TnAg TnAg-vH 8.244 11.005 14.268 14.574 14.880 Tn-Muc1 Tn-Muc1-hu5E5-vH 8.245 11.006 14.269 14.575 14.881 TROP2 TROP2-ARA47- 8.246 11.007 14.270 14.576 14.882 HV3KV3-vH TROP2 TROP2-h7E6-SVG-vH 8.247 11.008 14.271 14.577 14.883 TSHR TSHR-5C9-vH 8.248 11.009 14.272 14.578 14.884

126 / 348 ALVO NOME de vH SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vH SEQ ID-vH SEQ ID- vH (DNA) vH (PRT) de CDR1 de CDR2 vH de CDR3 TSHR TSHR-K1-70-vH 8.249 11.010 14.273 14.579 14.885 TSHR TSHR-KB1-vH 8.250 11.011 14.274 14.580 14.886 TSLRP TSLRP-vH 8.251 11.012 14.275 14.581 14.887 Classe I de Tyro-B2-vH 8.252 11.013 14.276 14.582 14.888 Tirosinase/MHC Classe I de Tyro-Mc1-vH 8.253 11.014 14.277 14.583 14.889 Tirosinase/MHC Classe I de TA2-vH 8.254 11.015 14.278 14.584 14.890 Tirosinase/MHC VEGFR3 VEGFR3-Ab1-vH 8.255 11.016 14.279 14.585 14.891 Classe I de WT1-Ab13-vH 8.256 11.017 14.280 14.586 14.892 WT1/MHC Classe I de WT1-Ab15-vH 8.257 11.018 14.281 14.587 14.893 WT1/MHC Classe I de WT1-Ab1-vH 8.258 11.019 14.282 14.588 14.894 WT1/MHC Classe I de WT1-Ab5-[2]-vH 8.259 11.020 14.283 14.589 14.895 WT1/MHC Classe I de WT1-Ab5-vH 8.260 11.021 14.284 14.590 14.896 WT1/MHC EBV-gp350 EBV-gp350-vH 8.261 11.022 14.285 14.591 14.897 CD123 CD123-1172-vH 8.262 11.023 14.286 14.592 14.898 CDH19 CDH19-4B10-vH 8.263 11.024 14.287 14.593 14.899 Receptor Beta de FRbeta-m923-vH 8.264 11.025 14.288 14.594 14.900 Folato LHR LHR-8B7-vH 8.265 11.026 14.289 14.595 14.901 LHR LHR-5F4-21-vH 8.266 11.027 14.290 14.596 14.902 B7H4 B7H4-hu22Cl0-vH 8.267 11.028 14.291 14.597 14.903 B7H4 B7H4-hu1D11-vH 8.268 11.029 14.292 14.598 14.904 IgE IgE-omalizumab-vH 8.269 11.030 14.293 14.599 14.905 CD23 CD23-p5E8-vH 8.270 11.031 14.294 14.600 14.906 GCC GCC-5F9-vH 8.271 11.032 14.295 14.601 14.907 GCC GCC-Ab229-vH 8.272 11.033 14.296 14.602 14.908 CD200R CD200R-huDx182-vH 8.273 11.034 14.297 14.603 14.909 Classe I de AFP-61-vH 8.274 11.035 14.298 14.604 14.910 AFP/MHC Classe I de AFP-76-vH 8.275 11.036 14.299 14.605 14.911 AFP/MHC Classe I de AFP-79-vH 8.276 11.037 14.300 14.606 14.912 AFP/MHC BCMA BCMA-ET-03-vH 8.277 11.038 14.301 14.607 14.913 BCMA BCMA- 8.278 11.039 14.302 14.608 14.914 huC11.D5.3L1H3-vH BCMA BCMA-huC13-F12-vH 8.279 11.040 14.303 14.609 14.915 CD123 CD123-DART-1-vH 8.280 11.041 14.304 14.610 14.916 CD123 CD123-DART-2-vH 8.281 11.042 14.305 14.611 14.917 CD123 CD123-13RB18-vH 8.282 11.043 14.306 14.612 14.918 CD123 CD123-hu3E3-vH 8.283 11.044 14.307 14.613 14.919 CD123 CD123-9F6-vH 8.284 11.045 14.308 14.614 14.920 CD123 CD123-I3RB2-vH 8.285 11.046 14.309 14.615 14.921 CD123 CD123-1176-vH 8.286 11.047 14.310 14.616 14.922 CD123 CD123-8B11-vH 8.287 11.048 14.311 14.617 14.923 CD123 CD123-2B8-vH 8.288 11.049 14.312 14.618 14.924 CD123 CD123-9D7-vH 8.289 11.050 14.313 14.619 14.925 CD123 CD123-3B10-vH 8.290 11.051 14.314 14.620 14.926 CD19 CD19-MEDI-3649-vH 8.291 11.052 14.315 14.621 14.927

127 / 348 ALVO NOME de vH SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vH SEQ ID-vH SEQ ID- vH (DNA) vH (PRT) de CDR1 de CDR2 vH de CDR3 CD19 CD19-Medrex-24D1-vH 8.292 11.053 14.316 14.622 14.928 CD19 CD19-MOR0028-vH 8.293 11.054 14.317 14.623 14.929 CD19 CD19-HD37-H2L1-vH 8.294 11.055 14.318 14.624 14.930 CD19 CD19-huBly3-vH 8.295 11.056 14.319 14.625 14.931 CD19 CD19-huSJ25C1-vH 8.296 11.057 14.320 14.626 14.932 CD19 CD19-hB4-vH 8.297 11.058 14.321 14.627 14.933 CD19 CD19-hu-mROO5-1-vH 8.298 11.059 14.322 14.628 14.934 CD19 CD19-hA19-vH 8.299 11.060 14.323 14.629 14.935 CD20 CD20-Leu16-vH 8.300 11.061 14.324 14.630 14.936 CD20 CD20-11B8-vH 8.301 11.062 14.325 14.631 14.937 CD20 CD20-2C6-vH 8.302 11.063 14.326 14.632 14.938 CD20 CD20-2H7-vH 8.303 11.064 14.327 14.633 14.939 CD20 CD20-hA20-vH 8.304 11.065 14.328 14.634 14.940 CD20 CD20-BM-CA-1925-v4- 8.305 11.066 14.329 14.635 14.941 vH CD20 CD20-Ubli-v4-vH 8.306 11.067 14.330 14.636 14.942 CD20 CD20-h1F5-vH 8.307 11.068 14.331 14.637 14.943 CD20 CD20-7D8-vH 8.308 11.069 14.332 14.638 14.944 CD20 CD20-AME-33-vH 8.309 11.070 14.333 14.639 14.945 CD33 CD33-Boehr2800308-vH 8.310 11.071 14.334 14.640 14.946 CD33 CD33-Him3-4-vH 8.311 11.072 14.335 14.641 14.947 CD33 CD33-SGNh2H12-vH 8.312 11.073 14.336 14.642 14.948 CD33 CD33-15G15-33-vH 8.313 11.074 14.337 14.643 14.949 CD33 CD33-33H4-vH 8.314 11.075 14.338 14.644 14.950 CD33 CD33-33H4-2-vH 8.315 11.076 14.339 14.645 14.951 CD33 CD33-9C3-2-vH 8.316 11.077 14.340 14.646 14.952 CD99 CD99-hu12E7-vH 8.317 11.078 14.341 14.647 14.953 CLL1 CLL1-21C9-L2H3-vH 8.318 11.079 14.342 14.648 14.954 CLL1 CLL1-6E7L4H1e-vH 8.319 11.080 14.343 14.649 14.955 CLL1 CLL1-hu1075-v1-vH 8.320 11.081 14.344 14.650 14.956 CLL1 CLL1-hu1075-v2-vH 8.321 11.082 14.345 14.651 14.957 CS1 CS1-PDL241-vH 8.322 11.083 14.346 14.652 14.958 CS1 CS1-Hu27A-vH 8.323 11.084 14.347 14.653 14.959 CS1 CS1-ScHu34C3-vH 8.324 11.085 14.348 14.654 14.960 CS1 CS1-Hu31-D2-vH 8.325 11.086 14.349 14.655 14.961 CS1 CS1-Luc34-vH 8.326 11.087 14.350 14.656 14.962 CS1 CS1-LucX2-vH 8.327 11.088 14.351 14.657 14.963 FITC FITC-4M-53-vH 8.328 11.089 14.352 14.658 14.964 FITC FITC-E2-vH 8.329 11.090 14.353 14.659 14.965 GPRC5D GPRC5D-ET150-1-vH 8.330 11.091 14.354 14.660 14.966 GPRC5D GPRC5D-ET150-2-vH 8.331 11.092 14.355 14.661 14.967 HLA-A2 HLA-A2-3PB2-vH 8.332 11.093 14.356 14.662 14.968 Classe I de HPV16- HPV16-7-8-vH 8.333 11.094 14.357 14.663 14.969 E7/MHC Classe I de HPV16- HPV16-2-vH 8.334 11.095 14.358 14.664 14.970 E7/MHC Fator 1 de Tecido TF1-98-vH 8.335 11.096 14.359 14.665 14.971 (TF1) Tn-Muc1 Tn-Muc1-5E5-vH 8.336 11.097 14.360 14.666 14.972 Cadeia Leve Kappa Kappa-LC1-vH 8.337 11.098 14.361 14.667 14.973 Ig PTK7 PTK7-7C8-vH 8.338 11.099 14.362 14.668 14.974 PTK7 PTK7-12C6a-vH 8.339 11.100 14.363 14.669 14.975 CD19 hCD19-EUK5-13-vH 8.340 11.101 14.364 14.670 14.976

128 / 348 ALVO NOME de vH SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vH SEQ ID-vH SEQ ID- vH (DNA) vH (PRT) de CDR1 de CDR2 vH de CDR3 Classe I de Ras-Ab2-vH 8.341 11.102 14.365 14.671 14.977 Ras/MHC Classe I de Ras-Ab4-vH 8.342 11.103 14.366 14.672 14.978 Ras/MHC CLD18A2 CLD18A2-43A11-vH 8.343 11.104 14.367 14.673 14.979 CLD18A2 CLD18A2-175D10-vH 8.344 11.105 14.368 14.674 14.980 CD43 CD43-huJL-1-257-10-vH 8.345 11.106 14.369 14.675 14.981 CD69L CD69L-DREG200-vH 8.346 11.107 14.370 14.676 14.982 NY-ESO NYESO-35-15-vH 8.347 11.108 14.371 14.677 14.983 Glicoproteína P Pgp-9F11-vH 8.348 11.109 14.372 14.678 14.984 (MDR1) Streptag Streptag-vH 8.349 11.110 14.373 14.679 14.985 BCMA BCMA-huC13-F12- 8.350 11.111 14.374 14.680 14.986 L1H2-v2-vH BCMA BCMA-huC12A3-L3H3- 8.351 11.112 14.375 14.681 14.987 v2-vH MPL/TPO-R Hu-161-2-vH 8.352 11.113 14.376 14.682 14.988 Glicoproteína P Pgp-MRK16-vH 8.353 11.114 14.377 14.683 14.989 (MDR1) CD22 CD22-5-vH 8.354 11.115 14.378 14.684 14.990 CD22 CD22-10-vH 8.355 11.116 14.379 14.685 14.991 CD22 CD22-31-vH 8.356 11.117 14.380 14.686 14.992 CD22 CD22-53-vH 8.357 11.118 14.381 14.687 14.993 CD22 CD22-65-vH 8.358 11.119 14.382 14.688 14.994 CD19 hu-FMC65-1-vH 8.359 11.120 14.383 14.689 14.995 MPL/TPO-R MPL-hu-175-2-vH 8.360 11.121 14.384 14.690 14.996 MPL/TPO-R MPL-hu-111-2-vH 8.361 11.122 14.385 14.691 14.997 CD179a CD179a-2460-B04-vH 8.362 11.123 14.386 14.692 14.998 CD179a CD179a-2462-E07-vH 8.363 11.124 14.387 14.693 14.999 CD37 CD37-TRU-HL-vH 8.364 11.125 14.388 14.694 15.000 CD37 huCD37-Boeh-vH 8.365 11.126 14.389 14.695 15.001 CD70 CD70-13D-vH 8.366 11.127 14.390 14.696 15.002 CD70 CD70-16D-vH 8.367 11.128 14.391 14.697 15.003 CD70 CD70-21D-vH 8.368 11.129 14.392 14.698 15.004 CD70 CD70-1G2D-vH 8.369 11.130 14.393 14.699 15.005 CD70 CD70-hu-2H5-vH 8.370 11.131 14.394 14.700 15.006 CD70 CD70-69A7-vH 8.371 11.132 14.395 14.701 15.007 CD70 CD70-10B4-vH 8.372 11.133 14.396 14.702 15.008 CD70 CD70-24D-vH 8.373 11.134 14.397 14.703 15.009 CD70 CD70-25D-vH 8.374 11.135 14.398 14.704 15.010 Glicoproteína do HIV1-N49P6-vH 8.375 11.136 14.399 14.705 15.011 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N49P7-vH 8.376 11.137 14.400 14.706 15.012 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N49P11-vH 8.377 11.138 14.401 14.707 15.013 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P1-1-vH 8.378 11.139 14.402 14.708 15.014 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P25-vH 8.379 11.140 14.403 14.709 15.015 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N49P9-vH 8.380 11.141 14.404 14.710 15.016 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P2-1-vH 8.381 11.142 14.405 14.711 15.017 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P31-1-vH 8.382 11.143 14.406 14.712 15.018 envelope do HIV1

129 / 348 ALVO NOME de vH SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID-vH SEQ ID-vH SEQ ID- vH (DNA) vH (PRT) de CDR1 de CDR2 vH de CDR3 Glicoproteína do HIV1-N60P22-vH 8.383 11.144 14.407 14.713 15.019 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P38-vH 8.384 11.145 14.408 14.714 15.020 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P30-vH 8.385 11.146 14.409 14.715 15.021 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P36-vH 8.386 11.147 14.410 14.716 15.022 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P39-vH 8.387 11.148 14.411 14.717 15.023 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N6039-1-vH 8.388 11.149 14.412 14.718 15.024 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P47-vH 8.389 11.150 14.413 14.719 15.025 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P48-vH 8.390 11.151 14.414 14.720 15.026 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P51-vH 8.391 11.152 14.415 14.721 15.027 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P35-vH 8.392 11.153 14.416 14.722 15.028 envelope do HIV1 Glicoproteína do HIV1-N60P37-vH 8.393 11.154 14.417 14.723 15.029 envelope do HIV1 Lym1 hu-Lym1-vH 8.394 11.155 14.418 14.724 15.030 Lym2 hu-Lym2-vH 8.395 11.156 14.419 14.725 15.031 BCMA BCMA-USC1-vH 8.396 11.157 14.420 14.726 15.032 BCMA BCMA-USC2-vH 8.397 11.158 14.421 14.727 15.033 BCMA BCMA-USC3-vH 8.398 11.159 14.422 14.728 15.034 BCMA BCMA-USC4-vH 8.399 11.160 14.423 14.729 15.035 BCMA BCMA-USC5-vH 8.400 11.161 14.424 14.730 15.036 BCMA BCMA-USC6-vH 8.401 11.162 14.425 14.731 15.037 BCMA BCMA-USC7-vH 8.402 11.163 14.426 14.732 15.038 CD43 CD43-huJL-1-257-10-vH 8.403 11.164 14.427 14.733 15.039 TABELA 6C: FRAGMENTOS scFV SEQ ID- SEQ ID- SEQ ID- Alvo NOME SEQ ID-PRT Alvo NOME

DNA DNA PRT CDH17- CD19 FMC63 8.404 11.165 CDH17 8.443 11.204 PTA001A4 CD19 huFMC63-11 8.405 11.166 CDH19 CDH19-16A4 8.444 11.205 CD19 CD19Bu12 8.406 11.167 EGFR Cetuximabe 8.445 11.206 CLEC5A- CD19 CD19MM 8.407 11.168 CLEC5A 8.446 11.207 8H8F5 CLEC5A- CD19 CD19-4G7 8.408 11.169 CLEC5A 8.447 11.208 3E12A2 HIV1-env HIV1-N6 8.409 11.170 CLL1 CLL1-M26 8.448 11.209 ALK Alk-48 8.410 11.171 CLL1 CLL1-M32 8.449 11.210 ALK Alk-58 8.411 11.172 CMVpp65 CMVpp65-F5 8.450 11.211 Amiloide Amiloide-158 8.412 11.173 CS1 CS1-huLuc63 8.451 11.212 CD45 BC8-CD45 8.413 11.174 CS1 CS1-HuLuc64 8.452 11.213 BCMA BCMA-J6M0 8.414 11.175 CS1 CS1-huLuc90 8.453 11.214 BCMA- BCMA huC12A3- 8.415 11.176 CSF2RA CSF2RA-Ab6 8.454 11.215 L3H3 BCMA BCMA-ET-40 8.416 11.177 CSF2RA CSF2RA-Ab1 8.455 11.216 DLL3-hSC16- BCMA BCMA-ET-54 8.417 11.178 DLL3 8.456 11.217 13

130 / 348 CCR4- DLL3-hSC16- CCR4 8.418 11.179 DLL3 8.457 11.218 humAb1567 56 CD5 CD5-9 8.419 11.180 EBNA3c EBNA3c-315 8.458 11.219 CD5 CD5-18 8.420 11.181 Ebv-gp350 EBV-gp350 8.459 11.220 CD20 CD20-2F2 8.421 11.182 EGFRviii EGFRvIII-139 8.460 11.221 EGFRvIII- CD20 CD20-GA101 8.422 11.183 EGFRviii 8.461 11.222 2173 CD22- CD22 8.423 11.184 EpCam1 Epcam1-MM1 8.462 11.223 h10F4v2 CD22- CD22 H22Rhov2AC 8.424 11.185 EpCam1 Epcam1-D5K5 8.463 11.224

DRKA CD22 CD22-m971 8.425 11.186 FLT3 FLT3-NC7 8.464 11.225 CD30 CD30-5F11 8.426 11.187 FITC FITC 8.465 11.226 Influenza A FLU-MEDI- CD30 CD30-Ac10 8.427 11.188 8.466 11.227 HA 8852 CD32 CD32-Med9 8.428 11.189 FR1 FR1-huMov19 8.467 11.228 CD33 CD33-AF5 8.429 11.190 GAD GAD-G3H8 8.468 11.229 CD33 CD33-huMyc9 8.430 11.191 GD2 GD2-hu14-18 8.469 11.230 CD34 CD34-hu4C7 8.431 11.192 GD2 GD2-hu3F8 8.470 11.231 CD44v6- CD44v6 8.432 11.193 GD3 GD3-KM-641 8.471 11.232 Biwa8 GFRAlpha4- CD70 CD70-h1F6 8.433 11.194 GFRa4 8.472 11.233 P4-6 CD79b CD79b-2F2 8.434 11.195 GFRa4 GFRa4-P4-10 8.473 11.234 CD123- CD123 8.435 11.196 GM1 GM1-5B2 8.474 11.235 CSL362 CD138 CD138 8.436 11.197 GM1 GM1-7E5 8.475 11.236 GPRC5D- CD179b CD179b 8.437 11.198 GPRC5D 8.476 11.237 ET150-5 GPRC5D- CD276 CD276-17 8.438 11.199 GPRC5D 8.477 11.238 ET150-18 CD324-SC10- CD324 8.439 11.200 gp100 gp100 8.478 11.239 6 CD324- CD324 8.440 11.201 gp100 gp100-G2D12 8.479 11.240 hSC10-17 CDH6- CDH6 8.441 11.202 GPC3 GPC3-4E5 8.480 11.241 NOV710 CDH6- CDH6 8.442 11.203 gpNMB gpNMB-115 8.481 11.242 NOV712 GRP78 GRP78-GC18 8.482 11.243 PDL1 PDL1-SP142 8.522 11.283 HIV1-gag HIV1-E5 8.483 11.244 PDL1 PDL1-10A5 8.523 11.284 (77-85) HIV1- PSCA-Ha14- HIV1-env 8.484 11.245 PSCA 8.524 11.285 3BNC117 121 HIV1-PGT- PSCA-Ha14- HIV1-env 8.485 11.246 PSCA 8.525 11.286 128 117 HIV1-env HIV1-VR-C01 8.486 11.247 PR1 PR1 8.526 11.287 HIV1-env HIV1-X5 8.487 11.248 PSMA PSMA-006 8.527 11.288 HMW-MAA- HMW-MAA 8.488 11.249 PSMA PSMA-J591 8.528 11.289 hIND HTLV-TAX- PTK7-hSC6- HTLV1-TAX 8.489 11.250 PTK7 8.529 11.290 T3F2 23 HTLV-TAX- PTK7-SC6-10- HTLV1-TAX 8.490 11.251 PTK7 8.530 11.291 T3E3 2 IL11Ra-8E2- IL11Ra 8.491 11.252 ROR1 ROR1-4A5 8.531 11.292 Ts107

131 / 348 IL13Ra2- IL13Ra2 8.492 11.253 ROR1 ROR1-4C10 8.532 11.293 hu107 SD1-vHH- IL13Ra2- IL13Ra2 8.493 11.254 Mesotelina Linker-SD2- 8.533 11.294 Hu108 vHH KSHV-K8.1 KSHV-4C3 8.494 11.255 SLea SLea-7E3 8.534 11.295 LAMP1- LAMP1 8.495 11.256 SLea SLea-5B1 8.535 11.296 humab1-2 LAMP1 LAMP1-Mb4 8.496 11.257 SSEA4 SSEA4 8.536 11.297 LewisY- TCRB1-CP01- LewisY 8.497 11.258 TCRB1 8.537 11.298 huS193 E09 L1CAM-9-3- L1CAM 8.498 11.259 TCRB1 TCRB1-Jovi1 8.538 11.299 HU3 TCRB2-CP01- Lym1 Lym1 8.499 11.260 TCRB2 8.539 11.300 D05 TCRB2-CP01- Lym2 Lym2 8.500 11.261 TCRB2 8.540 11.301 E05 CD79b huMA79bv28 8.501 11.262 TCRgd TCRgd-G5-4 8.541 11.302 MART1- TERT-4A9- MART1 8.502 11.263 TERT 8.542 11.303 CAG10 T540 MART1- TERT-3G3- MART1 8.503 11.264 TERT 8.543 11.304 CLA12 T865 Mesotelina- Mesotelina 8.504 11.265 TGFBR2 TGFBR2-Ab1 8.544 11.305 m912 TIM1- MPL MPL-175 8.505 11.266 TIM1 8.545 11.306 HVCR1-270-2 TIM1- MPL MPL-161 8.506 11.267 TIM1 HVCR1- 8.546 11.307 ARD5 MPL MPL-161-HL 8.507 11.268 TnAg TnAg 8.547 11.308 TnMuc1- MPL MPL-111 8.508 11.269 Tn-Muc1 hu5E5-RHA8- 8.548 11.309 RKA-2 TROP2- MPL MPL-178 8.509 11.270 TROP2 ARA47- 8.549 11.310 HV3KV3 TROP2-h7E6- MPL MPL-AB317 8.510 11.271 TROP2 8.550 11.311

SVG MPL MPL-12E10 8.511 11.272 TSHR TSHR-K1-70 8.551 11.312 MPL- MPL 8.512 11.273 TSHR TSHR-KB1 8.552 11.313 huVB22Bw5 Muc1-D6- Muc1 8.513 11.274 TSHR TSHR-5C9 8.553 11.314 M3B8 MUC1-D6- Muc1 8.514 11.275 TSLRP TSLRP 8.554 11.315 M3A1 Muc16 Muc16-4H11 8.515 11.276 Tirosinase Tyros-B2 8.555 11.316 Nimotuzumab EGFR 8.516 11.277 Tirosinase Tyros-MC1 8.556 11.317 e NKG2D NKG2D-MS 8.517 11.278 Tirosinase Tyros-TA2 8.557 11318 NYBR1 NYBR1 8.518 11.279 VEGFR3 VEGFR3-Ab1 8.558 11.319 NY-ESO NYESO-T1 8.519 11.280 WT1 WT1-Ab1 8.559 11.320 NY-ESO NYESO-T1 8.520 11.281 WT1 WT1-Ab5 8.560 11.321 PDL1 PDL1-Atezoli 8.521 11.282 WT1 WT1-Ab13 8.561 11.322 WT1 WT1-Ab15 8.562 11.323 CD22 CD22-65 8.658 11.356 CD123 CD123-1172 8.563 11.324 CD19 hu-FMC65 8.659 11357 CDH19 CDH19-4B10 8.564 11.325 MPL MPL-hu-175-2 8.660 11.358 FRbeta FRbeta-m923 8.565 11.326 MPL MPL-hu-111-2 8.661 11.359

132 / 348 CD179a-2460- LHR-8B7 LHR-8B7 8.566 11.327 CD179a 8.662 11.360 B04 CD179a-2462- LHR-5F4-21 LHR-5F4-21 8.567 11.328 CD179a 8.663 11.361 E07 B7H4- CD37-TRU- B7H4 8.568 11.329 CD37 8.664 11.362 hu22Cl0 HL B7H4- B7H4-hu1D11 8.569 11.330 CD37 huCD37-Boeh 8.665 11.363 hu1D11 IgE- IgE 8.570 11.331 CD70 CD70-13D 8.666 11.364 omalizumabe CD23 CD23-p5E8 8.571 11.332 CD70 CD70-16D 8.667 11.365 GCC GCC-5F9 8.572 11.333 CD70 CD70-21D 8.668 11.366 GCC GCC-Ab229 8.573 11.334 CD70 CD70-1G2D 8.669 11.367 CD200R- CD200R 8.637 11.335 CD70 CD70-hu2H5 8.670 11.368 huDx182 Tn-Muc1-5E5 Tn-Muc1-5E5 8.638 11.336 CD70 CD70-69A7 8.671 11.369 Cadeia leve Kappa-LC1 8.639 11.337 CD70 CD70-10B4 8.672 11.370 de Igk PTK7 PTK7-7C8 8.640 11.338 CD70 CD70-24D 8.673 11.371 PTK7 PTK7-12C6a 8.641 11.339 CD70 CD70-25D 8.674 11.372 hCD19-EUK5- CD19 8.642 11.340 HIV1-env HIV1-N49P6 8.675 11.373 13 Ras Ras-Ab2 8.643 11.341 HIV1-env HIV1-N49P7 8.676 11.374 Ras Ras-Ab4 8.644 11.342 HIV1-env HIV1-N49P11 8.677 11.375 CLD18A2- HIV1-N60P1- CLD18A2 8.645 11.343 HIV1-env 8.678 11.376 43A11 1 CLD18A2- CLD18A2 8.646 11.344 HIV1-env HIV1-N60P25 8.679 11.377 175D10 CD43-huJL-1- CD43 8.647 11.345 HIV1-env HIV1-N49P9 8.680 11.378 257-10 CD69L- HIV1-N60P2- CD69L 8.648 11.346 HIV1-env 8.681 11.379 DREG200 1 HIV1- NY-ESO NYESO-35-15 8.649 11.347 HIV1-env 8.682 11.380 N60P31-1 Pgp Pgp-9F11 8.650 11.348 HIV1-env HIV1-N60P22 8.683 11.381 Streptag Streptag 8.651 11.349 HIV1-env HIV1-N60P38 8.684 11.382 MPL Hu-161-2 8.652 11.350 HIV1-env HIV1-N60P30 8.685 11.383 Pgp Pgp-MRK16 8.653 11.351 HIV1-env HIV1-N60P36 8.686 11.384 CD22 CD22-5 8.654 11.352 HIV1-env HIV1-N60P39 8.687 11.385 CD22 CD22-10 8.655 11.353 HIV1-env HIV1-N6039.1 8.688 11.386 CD22 CD22-31 8.656 11.354 HIV1-env HIV1-N60P47 8.689 11.387 CD22 CD22-53 8.657 11.355 HIV1-env HIV1-N60P48 8.690 11.388 HIV1-env HIV1-N60P51 8.691 11.389 BCMA BCMA-USC3 8.698 11.396 HIV1-env HIV1-N60P35 8.692 11.390 BCMA BCMA-USC4 8.699 11.397 HIV1-env HIV1-N60P37 8.693 11.391 BCMA BCMA-USC5 8.700 11.398 Lym1 hu-Lym1 8.694 11.392 BCMA BCMA-USC6 8.701 11.399 Lym2 hu-Lym2 8.695 11.393 BCMA BCMA-USC7 8.702 11.400 CD33- BCMA BCMA-USC1 8.696 11.394 CD33 8.727 15.099 SGNh2H12 CD33-15G15- BCMA BCMA-USC2 8.697 11.395 CD33 8.728 15.100 33 CD19-MEDI- CD19 8.698 15.070 CD33 CD33-33H4 8.729 15.101 3649 CD19- CD19 8.699 15.071 CD33 CD33-9C3-2 8.730 15.102 Medrex-24D1 CD8SP-Ritx- CD19 CD19- 8.700 15.072 CD99 CD99-hu12E7 8.731 15.103 MOR0028

133 / 348 CD19-HD37- CD123- CD19 8.701 15.073 CD123 8.732 15.104 H2L1 DART1-1 CD123- CD19 CD19-huBly3 8.702 15.074 CD123 8.733 15.105 DART1-2 CD19- CD123- CD19 8.703 15.075 CD123 8.734 15.106 huSJ25C1 I3RB18 CD8SP-Ritx- CD19 8.704 15.076 CD123 CD123-hu3E3 8.735 15.107 CD19-hB4 CD19-hu- CD19 8.705 15.077 CD123 CD123-9F6 8.736 15.108 mROO5-1 CD19 CD19-hA19 8.706 15.078 CD123 CD123-I3RB2 8.737 15.109 AFP/MHC I AFP-61 8.707 15.079 CD123 CD123-1176 8.738 15.110 CD8SP-Ritx2- AFP/MHC I AFP-76 8.708 15.080 CD123 8.739 15.111 CD123-8B11 AFP/MHC I AFP-79 8.709 15.081 CD123 CD123-2B8 8.740 15.112 BCMA BCMA-ET-03 8.710 15.082 CD123 CD123-9D7 8.741 15.113 BCMA- BCMA huC11.D5.3L1 8.711 15.083 CD123 CD123-3B10 8.742 15.114 H3 BCMA- CLL1-21C9- BCMA 8.712 15.084 CLL1 8.743 15.115 huC13-F12 L2H3 CLL1- CD20 CD20-11B8 8.713 15.085 CLL1 8.744 15.116 6E7L4H1e CLL1-hu1075- CD20 CD20-2C6 8.714 15.086 CLL1 8.745 15.117 v1 CLL1-hu1075- CD20 CD20-2H7 8.715 15.087 CLL1 8.746 15.118 v2 CD20 CD20-hA20 8.716 15.088 CS1 CS1-PDL241 8.747 15.119 CD20-BM- CD20 8.717 15.089 CS1 CS1-Hu27A 8.748 15.120 CA-1925-v4 CS1- CD20 CD20-Ubli-v4 8.718 15.090 CS1 8.749 15.121 ScHu34C3 CD20 CD20-2H7 8.719 15.091 CS1 CS1-Hu31-D2 8.750 15.122 CD20 CD20-h1F5 8.720 15.092 CS1 CS1-Luc34 8.751 15.123 CD20 CD20-7D8 8.721 15.093 CS1 CS1-LucX2 8.752 15.124 CD20-7D8- CD20 vL-linker-GA- 8.722 15.094 FITC FITC-4M-53 8.753 15.125 Tag-VH CD20-AME- CD20 8.723 15.095 FITC FITC-E2-HL 8.754 15.126 33 CD43-huJL-1- GPRC5D- CD43 8.703 11.401 GPRC5D 8.755 15.127 257-10 ET150-1 CD22-m971- GPRC5D- CD22 8.724 15.096 GPRC5D 8.756 15.128 HL ET150-2 CD8SP-Ritx2- HLA-A2- CD33 BC33- 8.725 15.097 HLA-A2 8.757 15.129 3PB2 Boehr2800308 CD8SP-Ritx2- HPV16/MHC CD33 8.726 15.098 HPV16-7-8 8.758 15.130 CD33-Him3-4 I HPV16/MHC TF1 TF1-98 8.760 15.132 HPV16-2 8.759 15.131

I TABELA 6D: COMPONENTES CAR SEQ ID SEQ ID Componente CAR SEQ ID

SEQ ID NO Componente CAR NO NO NO (PRT) (DNA) (PRT) (DNA) F2A 925 4.838 IgG1-CH1-TCRd-6MD 962 4.875 T2A 926 4.839 IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD 963 4.876

134 / 348 IgG1-CH1-TCRa-wt2-opt- P2A 928 4.841 964 4.877 6MD E2A 930 4.843 hTCRa-WT 3.885 15.041 Ligante SGSG 931 4.844 hTCRa-CSDVP 3.886 15.042 LOCAL FURINO 933 4.846 hTCRa-opt2 3.887 15.043 hCD8-Dobradiça-TM 936 4.849 hTCRa-T48C-opt 3.889 15.045 hCD8-Dobradiça-TM-BBz 937 4.850 hTCRa-S61R 3.892 15.048 Domínio citosólico 4-1BB 939 4.852 constante hTCR-b1 3.895 15.051 Domínio citosólico CD3z 940 4.853 constante hTCR-b2 3.896 15.052 CD28-Dobradiça-TM-CP 942 4.855 hTCRb-WT 3.897 15.053 CD3d-ECDTMCP-opt2 944 4.857 hTCRb-S57C-opt1 3.898 15.054 CD3eECDTMCP-opt2 948 4.861 hTCRb-KACIAH 3.899 15.055 CD3g-ECDTMCP-opt2 949 4.862 hTCRb-opt2 3.900 15.056 CD3zECDTMCP-opt2 958 4.871 hTCRb-R79G 3.910 15.066 IgCL-TCRg-6MD 959 4.872 hTCRg-(hTCR-gama) 3.912 15.068 IgCL-TCRb-IAH-6MD 960 4.873 hTCR-(hTCR-delta) 3.913 15.069 IgCL-TCRb-wt2-opt-6MD 961 4.874 Peptídeo sinal de CD8 1 3.914 Peptídeo sinal de IgH 5 3.918 (GGGGS) x3_LINKER 278 4.191 Myc-Tag 903 4.816 Etiqueta V5 908 4.821 RiTX2-TAG 918 4.831 RITX4 TAG 919 4.832 PG4SP 288 4.201 EAAAK 292 4.205 PG4SP-v2-U 289 4.202 EAAAK-v2 293 4.206 E-coil 290 4.203 K-coil 291 4.204 TCRa-opt-6MD 15.141 15.133 TCRg-6MD 15.143 15.135 TCRb-opt-6MD 15.142 15.134 TCRd-6MD 15.144 15.136

TABELA 7: MÓDULOS ACESSÓRIOS EXEMPLIFICATIVOS Módulo Acessório SEQ ID SEQ ID NO Módulo Acessório SEQ ID SEQ ID NO (PRT) NO NO (DNA) (DNA) (PRT) K13-opt 7.768 10.538 IKK1-S176E-S180E 1.004 4.917 K13-vFLIP 972 4.885 FKBPx2-hNEMO-K277A 1.006 4.919 FKBP-K13 973 4.886 FKBPx2-hNEMO- 1.007 4.920 L753(251) FKBPX2-K13 974 4.887 FKBPx2-hNEMO- 1.008 4.921 L600(200) Myr-FKBPx2-K13 975 4.888 FKBPx2-RIP-ID 1.009 4.922 FKBPx2-HTLV2-Tax-RS 976 4.889 hNEMO-FL-GS- 7.763 10.533 FKBPv36X2 FKBPx2-Flag-HTLV2-Tax- 977 4.890 hNEMO-L825-GS- 7.764 10.534 RS FKBPv36x2 hNEMO-K277A 979 4.892 hNEMO-L753-GS- 7.765 10.535 FKBPv36x2 hNEMO-D23V-K277A 980 4.893 hNEMO-L600-GS- 7.766 10.536 FKBPv36x2 hNEMO-K277A-L1161 986 4.899 hNEMO-K277A-Delta- 7.767 10.537 V249-K255 hNEMO-K277A-L1014 989 4.902 IKK1-delta-SCD- 7.781 10.541 FKBPv36x2 mNEMO-K270A 992 4.905 IKK2-delta-SCD- 7.782 10.542 FKBPv36x2 RIP-ID 998 4.911 TCL-1A 1.005 4.918 MyD88 999 4.912 MTCP-1 7.769 10.539 MYD88-L265P 1.000 4.913 CMV-141 7.770 10.540 IKK2 1.001 4.914 IgSP-[hTRAC-opt2] 1.010 4.923 IKK2-S177E-S181E 1.002 4.915 IgSP-[hTRBC-opt2] 1.011 4.924 IKK1 1.003 4.916 IgSP-TCRa-opt-6MD 15.145 15.137 IgSP-TCRg-6MD 15.147 15.139

135 / 348 Módulo Acessório SEQ ID SEQ ID NO Módulo Acessório SEQ ID SEQ ID NO (PRT) NO NO (DNA) (DNA) (PRT) IgSP-TCRb-opt-6MD 15.146 15.138 IgSP-TCRd-6MD 15.148 15.140

TABELA 8: PEPTÍDEOS RESTRITOS AO MHC I (HLA-A2) USADOS PARA GERAÇÃO DE CARs Proteína/Epítopo SEQ ID NO: Proteína/Epítopo SEQ ID NO: gp100 10.511 MART (26-35) 10.521 gp100 10.512 EBNA-3A (596-604) 10.522 gp100 10.513 EBNA-3c 10.523 MUC1-A7 (130-138) 10.514 WT1 10.524 MUC1-D6 (13-21) 10.515 PR1 10.525 TAX (11-19) 10.516 Ras9-G12V 10.526 hTERT (540-548) 10.517 HPV16-E7 10.527 hTERT (865-873) 10.518 NY-ESO-1-(155-163) 10.528 Antígeno específico a grupo de 10.519 NY-ESO-1-(157-165) 10.529 HIV1 (77-85) CMV-pp65 (495-503) 10.520 NY-ESO-1-(157-167) 10.530

TABELA 9: CAR/BiTE “X” DOENÇA EXEMPLIFICATIVA ALVEJADA POR CARs (isto é, CARs ALVO convencionais e CARs de próxima geração.

Por exemplo, SIR, Ab-TCR e TFP) e engagers de células T Biespecíficos (BiTE) CD19 LLA, LLC, linfoma, crise linfática da LMC, mieloma múltiplo, distúrbios imunológicos ALK Câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), ALCL (linfoma anaplásico de células grandes), IMT (tumor miofibroblástico inflamatório) ou neuroblastoma CD45 Cânceres do sangue BCMA Mieloma, LPE, leucemia de células plasmáticas, macroglobinemia de Waldenstrom CD5 Câncer do sangue, leucemia de células T, linfoma de células T CD20 Cânceres do sangue, leucemia, LLA, LLC, linfoma, distúrbios imunológicos CD22 Câncer do sangue, leucemia, LLA, LLC, linfoma, crise linfática da LMC, distúrbios imunológicos CD23 Cânceres do sangue, leucemia, LLA, LLC, linfoma, doenças autoimunes CD30 Linfoma de Hodgkins, linfoma cutâneo de células T CD32 Tumores sólidos CD33 Cânceres do sangue, LMA, SMD CD34 Cânceres do sangue, LMA, SMD CD44v6 Cânceres do sangue, LMA, SMD CD70 Cânceres do sangue, linfoma, mieloma, macroglobulinemia de Waldenstrom, câncer de rim CD79b Câncer do sangue, LLA, Linfoma CD123 Cânceres do sangue, LMA, SMD CD138 Cânceres do sangue, mieloma, LPE, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenstrom CD179b Câncer do sangue, LLA, Linfoma CD276/B7-H3 Sarcoma de Ewing, neuroblastoma, rabdomíniossarcoma, câncer de ovário, colorretal e de pulmão CD324 Tumores sólidos, câncer de esôfago, próstata, colorretal, mama, pulmão CDH6 Tumores sólidos, câncer de rim, ovário, tireoide CDH17 Adenocarciniomas, câncer gastrointestinal, pulmonar, ovário, endometrial CDH19 Tumor sólido, Melanoma EGFR Câncer de cólon, câncer de pulmão CLEC5A Cânceres do sangue, Leucemia, LMA GR/LHR Câncer de próstata, câncer de ovário ou câncer de mama

136 / 348 CAR/BiTE “X” DOENÇA EXEMPLIFICATIVA ALVEJADA POR CARs (isto é, CARs ALVO convencionais e CARs de próxima geração.

Por exemplo, SIR, Ab-TCR e TFP) e engagers de células T Biespecíficos (BiTE) CLL1 Câncer do sangue, Leucemia CMVpp65 Infecção por CMV, colite por CMV, pneumonite por CMV CS1 Câncer do sangue, mieloma, LPE, leucemia de células plasmáticas CSF2RA LMA, LMC, SMD CD123 Cânceres do sangue, LMA, SMD DLL3 Melanoma, câncer de pulmão ou câncer de ovário EBNA3c/MHC I Infecção pelo vírus Epstein Barr e doenças relacionadas, incluindo cânceres EBV-gp350 Infecção pelo vírus Epstein Barr e doenças relacionadas EGFR Tumores sólidos, câncer de cólon, câncer de pulmão EGFRvIII Tumores sólidos, glioblastoma EpCam1 Câncer gastrointestinal FLT3 Câncer do sangue, LMA, SMD, LLA Receptor alfa de Câncer de ovário, CPCNP, câncer de endométrio, câncer de rim ou outros tumores folato (FR1 ou sólidos FOLR1) FSHR Câncer de próstata, câncer de ovário ou câncer de mama GD2 Neuroblastoma GD3 Melanoma GFRa4 Câncer, câncer medular da tireoide Fucosil-GM1(GM1) Câncer de pulmão de pequenas células GPRC5D Mieloma, LPE, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenstrom gp100 Melanoma GPC3 Tumores sólidos, Câncer de pulmão gpNMB Melanoma, tumores cerebrais, câncer gástrico GRP78 Mieloma Her2 Tumores sólidos, câncer de mama, câncer de estômago Her3 Câncer colorretal, de mama HMW-MAA Melanoma HTLV1-TAX/MHC Doenças associadas à infecção pelo HTLV1, leucemia-linfoma de células T do I adulto IL11Ra Câncer do sangue, LMA, LLA, LMC, SMD, sarcomas IL6Ra Tumores sólidos, Câncer de fígado IL13Ra2 Glioblastomas KSHV-K8.1 Sarcoma de Kaposi, LPE, doença multicêntrica de Castleman LAMP1 Câncer do sangue, LMA, LLA, SMD, LLC, LMC LewisY Cânceres L1CAM Tumores sólidos, cânceres de ovário, mama, endométrio, melanoma LHR Câncer de próstata, câncer de ovário ou câncer de mama Lym1 Câncer do sangue, Leucemia, Linfoma Lym2 Câncer do sangue, Leucemia, Linfoma CD79b Cânceres do sangue, linfoma MART1/MHC I Melanoma Mesotelina Mesotelioma, câncer de ovário, câncer de pâncreas Muc1/MHC I Câncer de mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão ou outros tumores sólidos Muc16 Câncer do ovário NKG2D Leucemia, linfoma ou mieloma NYBR1 Câncer de mama PSCA Câncer de próstata PR1/MHC I Câncer do sangue, Leucemia Receptor de Câncer de mama, câncer de células renais cromofóbico prolactina PSMA Câncer de próstata PTK7 Melanoma, câncer de pulmão ou câncer de ovário

137 / 348 CAR/BiTE “X” DOENÇA EXEMPLIFICATIVA ALVEJADA POR CARs (isto é, CARs ALVO convencionais e CARs de próxima geração. Por exemplo, SIR, Ab-TCR e TFP) e engagers de células T Biespecíficos (BiTE) ROR1 Câncer do sangue, malignidade de células B, linfoma, LLC SLea Câncer de pâncreas, câncer de cólon SSEA4 Câncer de pâncreas Tirosinase/MHC I Melanoma TCRB1 Leucemias e linfomas de células T, distúrbios autoimunes TCRB2 Leucemias e linfomas de células T, distúrbios autoimunes TCRgd Leucemias e linfomas de células T, distúrbios autoimunes hTERT Tumores sólidos, câncer do sangue TGFBR2 Tumores sólidos, queloides TIM1/HAVCR1 Câncer renal, câncer de fígado TROP2 Tumores sólidos, câncer de mama, câncer de próstata TSHR Câncer de tireoide, leucemia de células T, linfoma de células T TSLPR Cânceres do sangue, Leucemias, LMA, SMD Tirosinase/MHC I Melanoma VEGFR3 Tumores sólidos WT1/MHC I Cânceres do sangue, LMA Receptor β de folato LMA, mieloma B7H4 Câncer de mama ou câncer de ovário CD23 Câncer do sangue, Leucemias, LLC GCC Câncer gastrointestinal CD200R Cânceres do sangue, LMA, SMD AFP/MHC I Tumores sólidos, Câncer de fígado CD99 Câncer de fígado GPRC5D Mieloma, macroglobinemia de waldenstrom HPV16-E7/MHC I Cânceres associados ao HPV16, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço Fator 1 de Tecido Tumores sólidos (TF1) Tn-Muc1 Tumores sólidos e cânceres do sangue Cadeia leve de Igk Mieloma, leucemia de células plasmáticas Ras G12V/MHC I Tumores sólidos e cânceres do sangue CLD18A2 (Claudin Câncer gástrico, pancreático, esofágico, ovário ou pulmonar

18.2) CD43 Cânceres do sangue, LMA NY-ESO-1/MHC I Mieloma MPL/TPO-R Câncer do sangue, LMA, SMD, LMC, LLA Glicoproteína P Câncer renal, câncer de fígado, mieloma (MDR1) CD179a Cânceres do sangue, leucemia aguda, LLC, LLA, linfoma STEAP1 Câncer gástrico ou da próstata, ou linfoma Liv1 (SLC39A6) Câncer de mama ou próstata Nectina4 (PVRL4) Câncer de bexiga, renal, cervical, de pulmão, de cabeça e pescoço ou de mama Cripto (TDGF1) Câncer colorretal ou endometrial ou ovariano gpA33 Câncer colorretal ou endometrial ou ovariano FLT3 Câncer do sangue, LMA, LLA, SMD BST1/CD157 Cânceres do sangue, LMA, SMD IL1RAP Câncer de fígado, colorretal, cervical, pulmão ou ovário Canal de cloreto Glioma IgE Alergia HLA-A2 Doença enxerto vs. hospedeiro, rejeição de tecido (SIR expresso em células T reguladoras) Amiloide Amiloidose, doença de alzheimer HIV1-env HIVI/AIDS e afecções relacionadas HIV1-gag HIV1/AIDS e afecções relacionadas Influenza A HA Infecção por influenza A

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TABELA 10: CARs EXEMPLIFICATIVOS DIRECIONADOS À GLICOPROTEÍNA DO ENVELOPE DO HIV-1 COM BASE NOS DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO DE vL E vH HIV1-N49P6 TIPO DE CAR Módulo Acessório NOME DE CAR SEQ ID NO SEQ ID (DNA) NO (PRT) CAR de 2a Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-Gly-Ser- 8.704 11.402 Geração Linker-HIV1-N49P6-vH-Myc-CD8TM- BBz CAR de 2a Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vH-Gly-Ser- 8.705 11.403 Geração Linker-vL-Myc-CD8TM-BBz CAR de 1a vFLIP-K13 CD8SP-HIV1-N49P6-vL-Gly-Ser- 8.706 11.404 Geração Linker-HIV1-N49P6-vH-Myc-CD8TM- z-P2A-K13 CAR de 1a hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-(vL-vH)-Myc-z- 8.707 11.405 Geração P2A-hNEMO-K277A TFP hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-(vL-vH)-CD3e- 8.708 11.406 ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO-K277A TFP hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-(vL-vH)-CD3d- 8.709 11.407 ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO-K277A TFP hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-(vL-vH)-CD3g- 8.710 11.408 ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO-K277A TFP hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-(vL-vH)-CD3z- 8.711 11.409 ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO-K277A TFP hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-(vH-vL)-CD3e- 8.712 11.410 ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO-K277A TFP hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-(vH-vL)-CD3d- 8.713 11.411 ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO-K277A TFP hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-(vH-vL)-CD3g- 8.714 11.412 ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO-K277A TFP hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-(vH-vL)-CD3z- 8.715 11.413 ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO-K277A SIR DC Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[hTCRb- 8.716 11.414 KACIAH]-F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH- [hTCRa-CSDVP] SIR DC Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[hTCRa- 8.717 11.415 CSDVP]-F-F2A-SP-HIV1-N49P6-vH- [hTCRb-KACIAH] SIR DC Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-PG4SP-v2- 8.718 11.416 [hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-HIV1- N49P6-vH-PG4SP-[hTCRa-CSDVP] SIR DC Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-E-Coil- 8.719 11.417 [hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-HIV1- N49P6-vH-K-Coil-[hTCRa-CSDVP] SIR DC Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-EAAAK- 8.720 11.418 [hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-HIV1- N49P6-vH-EAAAK-v2-[hTCRa- CSDVP] SIR DC Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-V5-[hTCRb- 8.721 11.419 KACIAH]-F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH- Myc4-[hTCRa-CSDVP] SIR DC hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[hTCRb- 8.722 11.420 KACIAH]-F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH- [hTCRa-CSDVP]-F-F2A-hNEMO- K277A

139 / 348 TIPO DE CAR Módulo Acessório NOME DE CAR SEQ ID NO SEQ ID (DNA) NO (PRT) SIR DC hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[hTCRa- 8.723 11.421 CSDVP]-F-F2A-SP-HIV1-N49P6-vH- [hTCRb-KACIAH]-F-P2A-hNEMO- K277A Ab-TCR hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[IgCL-TCRg- 8.724 11.422 6MD]-F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH- [IgG1-CH1-TCRd-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A Ab-TCR hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[IgCL-TCRb- 8.725 11.423 IAH-6MD]-F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH- [IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A Ab-TCR hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[IgCL-TCRb- 8.726 11.424 wt2-opt-6MD]-F-P2A-SP-HIV1-N49P6- vH-[IgG1-CH1-TCRa-wt2-opt-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CAR de 1a hNEMO-K277A- CD8SP-HIV1-N49P6-vL-Gly-Ser- 8.727 11.425 Geração Delta-V249-K255 Linker-HIV1-N49P6-vH-CD8TM-z- P2A-hNEMO-K277A-Delta-V249-K255 CAR de 1a IKK2-S177E- CD8SP-HIV1-N49P6-vL-Gly-Ser- 8.728 11.426 Geração S181E Linker-HIV1-N49P6-vH-CD8TM-z- P2A-IKK2-S177E-S181E SIR DC hNEMO-K277A CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[hTCRa- 8.729 11.427 T48C]-F-F2A-SP-HIV1-N49P6-vH- [hTCRb-S57C]-F-P2A-hNEMO-K277A SIR DC IKK1-S176E- CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[hTCRb- 8.730 11.428 S180E S57C]-F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH- [hTCRa-T48C]-F-F2A-IKK1-S176E- S180E SIR DC hNEMO-K277A- CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[hTCRb- 8.731 11.429 Delta-V249-K255 S57C]-F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH- [hTCRa-T48C]-F-F2A-hNEMO-K277A- Delta-V249-K255 OHC SIR Nenhum CD8SP-MYC-[hTCRa-T48C-opt1]-F- 8.732 11.430 F2A-SP-HIV1-N49P6-vL-Gly-Ser- Linker-HIV1-N49P6-vH-V5-[hTCRb- S57C-opt1] SIR DC Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-V5-[hTCRb- 8.733 11.431 S57C-opt]-F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH- Myc-[hTCRa-T48C-opt] SIR DC Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[hTCRb-opt2]- 8.734 11.432 F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH-[hTCRa- opt2] SIR DC Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-[hTCRb-opt2]- 8.735 11.433 F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH-Myc- [preTCRa-Del48] OHC SIR Nenhum CD8SP-[hTCRb-opt2]-F-P2A-CD8SP- 8.736 11.434 HIV1-N49P6-vL-Gly-Ser-Linker-HIV1- N49P6-vH-Myc4-[preTCRa-Del48] SIR DC Nenhum CD8SP-HIV1-N49P6-vL-V5-[hTCRg1- 8.737 11.435 opt]-F-P2A-SP-HIV1-N49P6-vH-Myc- [hTCRd-opt]

[00166] Abreviações; CAR de 1a Geração, CAR de Primeira Geração; CAR de 2a Geração, CAR de Segunda Geração; DC SIR, SIR de cadeia dupla; OHC SIR, SIR de meia cadeia.

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[00167] Os módulos acessórios nos construtos exemplificativos acima na Tabela 10 são opcionais e podem ser excluídos ou substituídos por outros módulos acessórios. TABELA 11: SEQ ID NOs DE CARs QUE CONTÊM DIFERENTES DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO USANDO SEQ ID NOs DE CARs COM HIV1-N49P6 COMO REFERÊNCIA Antígeno Alvo Domínio de ligação ao SEQ ID NOs de CAR SEQ ID NO de CAR antígeno (DNA) (PRT) HIV1 Env HIV1-N49P6 8.704 a 8.737 11.402 a 11.435 HIV1 Env HIV1-N49P7 8.738 a 8.771 11.436 a 11.469 HIV1 Env HIV1-N49P11 8.806 a 8.839 11.504 a 11.537 HIV1 Env HIV1-N60P1-1 8.840 a 8.873 11.538 a 11.571 HIV1 Env HIV1-N60P25 8.942 a 8.975 11.640 a 11.673 HIV1 Env HIV1-N49P9 8.772 a 8.805 11.470 a 11.503 HIV1 Env HIV1-N60P2-1 8.874 a 8.907 11.572 a 11.605 HIV1 Env HIV1-N60P31-1 9.010 a 9.043 11.708 a 11.741 HIV1 Env HIV1-N60P22 8.908 a 8.941 11.606 a 11.639 HIV1 Env HIV1-N60P38 9.146 a 9.179 11.844 a 11.877 HIV1 Env HIV1-N60P30 8.976 a 9.009 11.674 a 11.707 HIV1 Env HIV1-N60P36 9.078 a 9.111 11.776 a 11.809 HIV1 Env HIV1-N60P39 9.180 a 9.213 11.878 a 11.911 HIV1 Env HIV1-N6039-1 9.316 a 9.349 12.014 a 12.047 HIV1 Env HIV1-N60P47 9.214 a 9.247 11.912 a 11.945 HIV1 Env HIV1-N60P48 9.248 a 9.281 11.946 a 11.979 HIV1 Env HIV1-N60P51 9.282 a 9.315 11.980 a 12.013 HIV1 Env HIV1-N60P35 9.044 a 9.077 11.742 a 11.775 HIV1 Env HIV1-N60P37 9.112 a 9.145 11.810 a 11.843 Lym1 hu-Lym1 10.370 a 10.403 13.068 a 13.101 Lym2 hu-Lym2 10.404 a 10.437 13.102 a 13.135 BCMA BCMA-USC1 9.418 a 9.451 12.116 a 12.149 BCMA BCMA-USC2 9.452 a 9.485 12.150 a 12.183 BCMA BCMA-USC3 9.486 a 9.519 12.184 a 12.217 BCMA BCMA-USC4 9.520 a 9.554 12.218 a 12.252 BCMA BCMA-USC5 9.555 a 9.587 12.253 a 12.285 BCMA BCMA-USC6 9.588 a 9.621 12.286 a 12.319 BCMA BCMA-USC7 9.622 a 9.655 12.320 a 12.353 CD43 CD43-huJL-1-257-10 9.758 a 9.791 12.456 a 12.489 BCMA BCMA-huC11.D5.3L1H3 9.350 a 9.383 12.048 a 12.081 BCMA BCMA-huC13-F12 9.384 a 9.417 12.082 a 12.115 CD20 CD20-Ubli-v4 9.656 a 9.689 12.354 a 12.387 CD37 CD37-TRU-HL 9.724 a 9.757 12.422 a 12.455 CD70 CD70-1G2D 9.792 a 9.825 12.490 a 12.523 CD70 CD70-10B4 9.826 a 9.859 12.524 a 12.557 CD70 CD70-13D 9.860 a 9.893 12.558 a 12.591 CD70 CD70-16D 9.894 a 9.927 12.592 a 12.625 CD70 CD70-21D 9.928 a 9.961 12.626 a 12.659 CD70 CD70-24D 9.962 a 9.995 12.660 a 12.693 CD70 CD70-25D 9.996 a 10.029 12.694 a 12.727 CD70 CD70-69A7 10.030 a 10.063 12.728 a 12.761 CD70 CD70-hu-2H5 10.064 a 10.097 12.762 a 12.795 CD123 CD123-DART-1 10.098 a 10.131 12.796 a 12.829 CD123 CD123-DART-2 10.132 a 10.165 12.830 a 12.863

141 / 348 Antígeno Alvo Domínio de ligação ao SEQ ID NOs de CAR SEQ ID NO de CAR antígeno (DNA) (PRT) CD179a CD179a-2460-B04 10.166 a 10.199 12.864 a 12.897 CD179a CD179a-2462-E07 10.200 a 10.233 12.898 a 12.931 FITC FITC-4M-53 10.234 a 10.267 12.932 a 12.965 FITC FITC-E2 10.268 a 10.301 12.966 a 12.999 MPL Hu-161-2 10.302 a 10.335 13.000 a 13.033 CD37 huCD37-Boeh 10.336 a 10.369 13.034 a 13.067 Cadeia Leve de Kappa-LC1 10.438 a 10.471 13.136 a 13.169 Kappa MPL MPL-hu-111-2 10.472 a 10.505 13.170 a 13.203 TABELA 12. CONSTRUTOS DE CAR DE 1a GERAÇÃO

EXEMPLIFICATIVO COEXPRESSANDO OS MÓDULOS ACESSÓRIOS hNEMO-K277A E PAC. AMBOS OS MÓDULOS ACESSÓRIOS SÃO OPCIONAIS. Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) CD19 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.594 5.507 Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-huFMC63-11-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.595 5.508 K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-huFMC63-11-N203Q-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.596 5.509 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.597 5.510 K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-2-CD19MM-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.598 5.511 K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19-4G7-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.599 5.512 K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19-MEDI-3649-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.600 5.513 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19-Medrex-24D1-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.601 5.514 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-Ritx-CD19-MOR0028-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.602 5.515 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19-HD37-H2L1-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.603 5.516 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19-huBly3-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.604 5.517 K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19-huSJ25C1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.605 5.518 K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-Ritx-CD19-hB4-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.606 5.519 K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.607 5.520 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19-hA19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.608 5.521 K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-AFP-61-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.609 5.522 de AFP/MHC Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-AFP-76-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.610 5.523 de AFP/MHC Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-AFP-79-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.611 5.524 de AFP/MHC Flag-T2A-PAC

142 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) Glicoproteína do CD8SP-HIV1-N6-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.612 5.525 envelope do HIV1 Flag-T2A-PAC ALK CD8SP-Alk-48-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.613 5.526 Flag-T2A-PAC ALK CD8SP-Alk-58-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.614 5.527 Flag-T2A-PAC Amiloide SP-Amyloid-158-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.615 5.528 Flag-T2A-PAC Biotina CD8SP-dc-Avidin-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag- 1.616 5.529 T2A-PAC CD45 CD8SP-BC8-CD45-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.617 5.530 K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-J6M0-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.618 5.531 K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-huC12A3-L3H3-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.619 5.532 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-ET-40-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.620 5.533 K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-ET-54-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.621 5.534 K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-ET-03-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.622 5.535 K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-huC11.D5.3L1H3-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.623 5.536 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-huC13-F12-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.624 5.537 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CCR4 CD8SP-CCR4-humAb1567-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.625 5.538 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC Glicoproteína do CD8SP-CD4-ECD-Linker-DC-SIGN-Myc-z-P2A- 1.626 5.539 envelope do HIV1 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD5 CD8SP-CD5-9-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.627 5.540 Flag-T2A-PAC CD5 CD8SP-CD5-18-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.628 5.541 Flag-T2A-PAC Ig Fc CD8SP-CD16A-V158-ECD-v2-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.629 5.542 K277A-Flag-T2A-PAC Ig Fc CD8SP-CD16A-V158-ECD-v1-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.630 5.543 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-2F2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.631 5.544 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-GA101-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.632 5.545 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-Leu16-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.633 5.546 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-11B8-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.634 5.547 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-2C6-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.635 5.548 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-2H7-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.636 5.549 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-hA20-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.637 5.550 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-BM-CA-1925-v4-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.638 5.551 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-Ubli-v4-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.639 5.552 K277A-Flag-T2A-PAC

143 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) CD20 CD8SP-CD20-2H7-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.640 5.553 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-h1F5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.641 5.554 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-7D8-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.642 5.555 K277A-Flag-T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-AME-33-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.643 5.556 K277A-Flag-T2A-PAC CD22 CD8SP-CD22-h10F4v2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.644 5.557 K277A-Flag-T2A-PAC CD22 CD8SP-CD22-H22Rhov2ACDRKA-(vL-vH)-Myc-z- 1.645 5.558 P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD22 CD8SP-CD22-m971-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.646 5.559 K277A-Flag-T2A-PAC CD22 CD8SP-CD22-m971-HL-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.647 5.560 K277A-Flag-T2A-PAC CD30 CD8SP-CD30-5F11-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.648 5.561 K277A-Flag-T2A-PAC CD30 CD8SP-CD30-Ac10-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.649 5.562 K277A-Flag-T2A-PAC CD32 CD8SP-CD32-Med9-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.650 5.563 K277A-Flag-T2A-PAC CD33 CD8SP-CD33-AF5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.651 5.564 K277A-Flag-T2A-PAC CD33 CD8SP-CD33-huMyc9-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.652 5.565 K277A-Flag-T2A-PAC CD33 CD8SP-CD33-Boehr2800308-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.653 5.566 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD33 CD8SP-CD33-Him3-4-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.654 5.567 K277A-Flag-T2A-PAC CD33 CD8SP-CD33-SGNh2H12-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.655 5.568 K277A-Flag-T2A-PAC CD33 CD8SP-CD33-15G15-33-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.656 5.569 K277A-Flag-T2A-PAC CD33 CD8SP-CD33-33H4-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.657 5.570 K277A-Flag-T2A-PAC CD33 CD8SP-CD33-9C3-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.658 5.571 K277A-Flag-T2A-PAC CD34 CD8SP-CD34-hu4C7-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.659 5.572 K277A-Flag-T2A-PAC CD44v6 CD8SP-CD44v6-Biwa8-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.660 5.573 K277A-Flag-T2A-PAC CD70 CD8SP-CD70-h1F6-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.661 5.574 K277A-Flag-T2A-PAC CD79b CD8SP-CD79b-2F2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.662 5.575 K277A-Flag-T2A-PAC CD79b CD8SP-huMA79bv28-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.663 5.576 K277A-Flag-T2A-PAC CD99 CD8SP-CD99-hu12E7-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.664 5.577 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-CSL362-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.665 5.578 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-1172-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.666 5.579 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-DART-1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.667 5.580 K277A-Flag-T2A-PAC

144 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) CD123 CD8SP-CD123-DART-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.668 5.581 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-I3RB18-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.669 5.582 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-hu3E3-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.670 5.583 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-9F6-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.671 5.584 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-I3RB2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.672 5.585 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-1176-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.673 5.586 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-Ritx2-CD123-8B11-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.674 5.587 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-2B8-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.675 5.588 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-9D7-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.676 5.589 K277A-Flag-T2A-PAC CD123 CD8SP-CD123-3B10-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.677 5.590 K277A-Flag-T2A-PAC CD138 CD8SP-CD138-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.678 5.591 Flag-T2A-PAC CD179b CD8SP-CD179b-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.679 5.592 Flag-T2A-PAC CD276 CD8SP-CD276-17-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.680 5.593 K277A-Flag-T2A-PAC CD324 CD8SP-CD324-SC10-6-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.681 5.594 K277A-Flag-T2A-PAC CD324 CD8SP-CD324-hSC10-17-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.682 5.595 K277A-Flag-T2A-PAC CDH6 CD8SP-CDH6-NOV710-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.683 5.596 K277A-Flag-T2A-PAC CDH6 CD8SP-CDH6-NOV712-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.684 5.597 K277A-Flag-T2A-PAC CDH17 CD8SP-CDH17-PTA001A4-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.685 5.598 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CDH19 CD8SP-CDH19-16A4-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.686 5.599 K277A-Flag-T2A-PAC EGFR CD8SP-Cetuximab-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.687 5.600 K277A-Flag-T2A-PAC CLEC5A CD8SP-CLEC5A-8H8F5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.688 5.601 K277A-Flag-T2A-PAC CLEC5A CD8SP-CLEC5A-3E12A2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.689 5.602 K277A-Flag-T2A-PAC GR/LHR (receptor de SP-CGHb-Linker-CGHa-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.690 5.603 gonadotrofina) Flag-T2A-PAC CLL1 CD8SP-CLL1-M26-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.691 5.604 K277A-Flag-T2A-PAC CLL1 CD8SP-CLL1-M32-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.692 5.605 K277A-Flag-T2A-PAC CLL1 CD8SP-CLL1-21C9-L2H3-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.693 5.606 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CLL1 CD8SP-CLL1-6E7L4H1e-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.694 5.607 K277A-Flag-T2A-PAC CLL1 CD8SP-CLL1-hu1075-v1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.695 5.608 K277A-Flag-T2A-PAC

145 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) CLL1 CD8SP-CLL1-hu1075-v2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.696 5.609 K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-CMVpp65-F5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.697 5.610 de CMVpp65/MHC K277A-Flag-T2A-PAC CS1 (SLAMF7) CD8SP-CS1-huLuc63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.698 5.611 K277A-Flag-T2A-PAC CS1 (SLAMF7) CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.699 5.612 K277A-Flag-T2A-PAC CS1 (SLAMF7) CD8SP-CS1-huLuc90-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.700 5.613 K277A-Flag-T2A-PAC CS1 (SLAMF7) CD8SP-CS1-PDL241-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.701 5.614 K277A-Flag-T2A-PAC CS1 (SLAMF7) CD8SP-CS1-Hu27A-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.702 5.615 K277A-Flag-T2A-PAC CS1 (SLAMF7) CD8SP-CS1-ScHu34C3-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.703 5.616 K277A-Flag-T2A-PAC CS1 (SLAMF7) CD8SP-CS1-Hu31-D2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.704 5.617 K277A-Flag-T2A-PAC CS1 (SLAMF7) CD8SP-CS1-Luc34-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.705 5.618 K277A-Flag-T2A-PAC CS1 (SLAMF7) CD8SP-CS1-LucX2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.706 5.619 K277A-Flag-T2A-PAC CSF2RA CD8SP-CSF2RA-Ab6-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.707 5.620 K277A-Flag-T2A-PAC CSF2RA CD8SP-CSF2RA-Ab1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.708 5.621 K277A-Flag-T2A-PAC CXCR4 e CD123 CD8SP-CXCR4-1-vHH-Linker-CD123-1-vHH-Myc-z- 1.709 5.622 P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CXCR4 e CD123 CD8SP-CXCR4-2-VHH-Linker-CD123-2-VHH-Myc-z- 1.710 5.623 P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC DLL3 (Ligante 3 CD8SP-DLL3-hSC16-13-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.711 5.624 Similar a Delta) K277A-Flag-T2A-PAC DLL3 CD8SP-DLL3-hSC16-56-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.712 5.625 K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-EBNA3c-315-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.713 5.626 de EBNA3c/MHC K277A-Flag-T2A-PAC EBV-gp350 CD8SP-EBV-gp350-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.714 5.627 K277A-Flag-T2A-PAC EGFR CD8SP-EGFR1-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag- 1.715 5.628 T2A-PAC EGFR & CEA CD8SP-EGFR1-vHH-Linker-CEA1-vHH-Myc-z-P2A- 1.716 5.629 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC EGFR & CEA CD8SP-EGFR33-vHH-Linker-CEA5-vHH-Myc-z-P2A- 1.717 5.630 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC EGFRvIII CD8SP-EGFRvIII-139-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.718 5.631 K277A-Flag-T2A-PAC EGFRvIII CD8SP-EGFRvIII-2173-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.719 5.632 K277A-Flag-T2A-PAC EpCam1 CD8SP-Epcam1-MM1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.720 5.633 K277A-Flag-T2A-PAC EpCam1 CD8SP-Epcam1-D5K5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.721 5.634 K277A-Flag-T2A-PAC FLT3 CD8SP-FLT3-NC7-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.722 5.635 K277A-Flag-T2A-PAC FITC CD8SP-FITC-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.723 5.636 Flag-T2A-PAC

146 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) FITC CD8SP-FITC-4M-53-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.724 5.637 K277A-Flag-T2A-PAC FITC CD8SP-FITC-E2-HL-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.725 5.638 K277A-Flag-T2A-PAC Influenza A HA CD8SP-FLU-MEDI-8852-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.726 5.639 K277A-Flag-T2A-PAC FR1 (Receptor Alfa de CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.727 5.640 Folato) K277A-Flag-T2A-PAC FSHR (Receptor de CD8SP-FSHb-Linker-CGHa-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.728 5.641 Hormônio Estimulante K277A-Flag-T2A-PAC de Folículos) Complexo de classe I CD8SP-GAD-G3H8-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.729 5.642 de GAD (ácido K277A-Flag-T2A-PAC glutâmico descarboxilase)/MHC GD2 CD8SP-GD2-hu14-18-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.730 5.643 K277A-Flag-T2A-PAC GD2 CD8SP-GD2-hu3F8-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.731 5.644 K277A-Flag-T2A-PAC GD3 CD8SP-GD3-KM-641-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.732 5.645 K277A-Flag-T2A-PAC GFRa4 (Receptor Alfa CD8SP-GFRAlpha4-P4-6-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.733 5.646 de Família GDNF 4) K277A-Flag-T2A-PAC GFRa4 CD8SP-GFRa4-P4-10-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.734 5.647 K277A-Flag-T2A-PAC GM1 CD8SP-GM1-5B2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.735 5.648 Flag-T2A-PAC GM1 CD8SP-GM1-7E5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.736 5.649 Flag-T2A-PAC GPRC5D (membro D CD8SP-GPRC5D-ET150-5-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.737 5.650 de grupo 5 da família C hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC do receptor acoplado à proteína G) GPRC5D CD8SP-GPRC5D-ET150-18-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.738 5.651 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC GPRC5D CD8SP-GPRC5D-ET150-1-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.739 5.652 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC GPRC5D CD8SP-GPRC5D-ET150-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.740 5.653 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-gp100-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.741 5.654 de gp100/MHC Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-gp100-G2D12-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.742 5.655 de gp100/MHC K277A-Flag-T2A-PAC GPC3 (Glipicano 3) CD8SP-GPC3-4E5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.743 5.656 K277A-Flag-T2A-PAC gpNMB (Glicoproteína CD8SP-gpNMB-115-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.744 5.657 nmb) K277A-Flag-T2A-PAC GRP78 CD8SP-GRP78-GC18-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.745 5.658 K277A-Flag-T2A-PAC Her2 CD8SP-Her2-5F7-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.746 5.659 Flag-T2A-PAC Her2 IgHSP-Her2-Affi-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag- 1.747 5.660 T2A-PAC Her2 CD8SP-Her2-1-Darpin-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.748 5.661 Flag-T2A-PAC Her2 IgHSP-Her2-2-Darpin-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag- 1.749 5.662 T2A-PAC

147 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) Her2 CD8SP-Her2-5F7-vHH-Linker-Her2-47D5-vHH-Myc-z- 1.750 5.663 P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC Her2 CD8SP-Her2-Hu4D5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.751 5.664 K277A-Flag-T2A-PAC Her3 CD8SP-Her3-17B05So-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.752 5.665 K277A-Flag-T2A-PAC Her3 CD8SP-Her3-Affi-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag- 1.753 5.666 T2A-PAC Her2 e Her3 CD8SP-Her3-17B05So-vHH-Linker-Her2-2D3-vHH- 1.754 5.667 Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-HIV1-E5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.755 5.668 de HIV1-gag/MHC Flag-T2A-PAC Glicoproteína do CD8SP-HIV1-3BNC117-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.756 5.669 envelope do HIV1 K277A-Flag-T2A-PAC Glicoproteína do CD8SP-HIV1-PGT-128-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.757 5.670 envelope do HIV1 K277A-Flag-T2A-PAC Glicoproteína do CD8SP-HIV1-VR-C01-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.758 5.671 envelope do HIV1 K277A-Flag-T2A-PAC Glicoproteína do CD8SP-HIV1-X5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.759 5.672 envelope do HIV1 Flag-T2A-PAC HLA-A2 CD8SP-HLA-A2-3PB2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.760 5.673 K277A-Flag-T2A-PAC HMW-MAA CD8SP-HMW-MAA-hIND-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.761 5.674 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-HPV16-7-8-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.762 5.675 de HPV16-E7/MHC K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-HPV16-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.763 5.676 de HPV16-E7/MHC Flag-T2A-PAC Complexo de Classe I CD8SP-HTLV-TAX-T3F2-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.764 5.677 de HTLV1-TAX/MHC hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de Classe I CD8SP-HTLV-TAX-T3E3-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.765 5.678 de HTLV1-TAX/MHC hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC IL11Ra CD8SP-IL11Ra-8E2-Ts107-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.766 5.679 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC IL6Ra IgHSP-IL6R-304-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.767 5.680 Flag-T2A-PAC IL13Ra2 CD8SP-IL13Ra2-hu107-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.768 5.681 K277A-Flag-T2A-PAC IL13Ra2 CD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.769 5.682 K277A-Flag-T2A-PAC KSHV-K8.1 CD8SP-KSHV-4C3-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.770 5.683 K277A-Flag-T2A-PAC LAMP1 (proteína 1 da CD8SP-LAMP1-humab1-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.771 5.684 membrana associada ao hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC lisossomo) LAMP1 CD8SP-LAMP1-Mb4-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.772 5.685 K277A-Flag-T2A-PAC LewisY CD8SP-LewisY-huS193-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.773 5.686 K277A-Flag-T2A-PAC L1CAM CD8SP-L1CAM-9-3-HU3-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.774 5.687 K277A-Flag-T2A-PAC LHR SP-LHb-Linker-CGHa-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.775 5.688 Flag-T2A-PAC Lym1 CD8SP-Lym1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.776 5.689 Flag-T2A-PAC Lym2 CD8SP-Lym2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.777 5.690 Flag-T2A-PAC

148 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) CD79b CD8SP-huMA79bv28-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.778 5.691 K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-MART1-CAG10-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.779 5.692 de MART1/MHC K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-MART1-CLA12-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.780 5.693 de MART1/MHC K277A-Flag-T2A-PAC Mesotelina CD8SP-mesotelina-m912-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.781 5.694 K277A-bandeira-T2A-PAC cMet CD8SP-cMet-171-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.782 5.695 Flag-T2A-PAC cMet e Her3 CD8SP-cMET-171-vHH-Linker-Her3-21F06-vHH-Myc- 1.783 5.696 z-P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-MPL-175-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.784 5.697 Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.785 5.698 Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-MPL-161-HL-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.786 5.699 K277A-Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-2-MPL-111-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.787 5.700 K277A-Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-MPL-178-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.788 5.701 Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-MPL-AB317-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.789 5.702 K277A-Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-MPL-12E10-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.790 5.703 K277A-Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-MPL-huVB22Bw5-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.791 5.704 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-Muc1-D6-M3B8-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.792 5.705 de duc1/MHC K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-MUC1-D6-M3A1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.793 5.706 de duc1/MHC K277A-Flag-T2A-PAC Muc16 CD8SP-Muc16-4H11-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.794 5.707 K277A-Flag-T2A-PAC EGFR CD8SP-Nimotuzumabe-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.795 5.708 K277A-Flag-T2A-PAC Ligante NKG2D CD8SP-NKG2D-(GGGGS-GGGGD)-Myc-z-P2A- 1.796 5.709 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC NKG2D CD8SP-NKG2D-MS-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.797 5.710 K277A-Flag-T2A-PAC NY-BR1 CD8SP-NYBR1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.798 5.711 Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-NYESO-T1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.799 5.712 de NY-ESO/MHC K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-NYESO-T1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.800 5.713 de NY-ESO/MHC K277A-Flag-T2A-PAC Ligante PD1 (por CD8SP-PD1-ECD-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag- 1.801 5.714 exemplo, PDL1) T2A-PAC PDL1 CD8SP-PDL1-Atezoli-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.802 5.715 K277A-Flag-T2A-PAC PDL1 CD8SP-PDL1-SP142-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.803 5.716 K277A-Flag-T2A-PAC PDL1 CD8SP-PDL1-10A5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.804 5.717 K277A-Flag-T2A-PAC PSCA (antígeno de CD8SP-PSCA-Ha14-121-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.805 5.718 células-tronco da K277A-Flag-T2A-PAC próstata)

149 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) PSCA (antígeno de CD8SP-PSCA-Ha14-117-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.806 5.719 células-tronco da K277A-Flag-T2A-PAC próstata) Complexo de classe I CD8SP-PR1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag- 1.807 5.720 de PR1/MHC T2A-PAC PSMA (Antígeno de CD8SP-PSMA-006-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.808 5.721 membrana específico K277A-Flag-T2A-PAC da próstata) PSMA CD8SP-PSMA-J591-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.809 5.722 K277A-Flag-T2A-PAC PTK7 (proteína tirosina CD8SP-PTK7-hSC6-23-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.810 5.723 similar a quinase 7) K277A-Flag-T2A-PAC PTK7 CD8SP-PTK7-SC6-10-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.811 5.724 K277A-Flag-T2A-PAC ROR1 CD8SP-ROR1-4A5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.812 5.725 K277A-Flag-T2A-PAC ROR1 CD8SP-ROR1-4C10-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.813 5.726 K277A-Flag-T2A-PAC Mesotelina CD8SP-SD1-vHH-Linker-SD2-vHH-Myc-z-P2A- 1.814 5.727 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC SLea CD8SP-SLea-7E3-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.815 5.728 Flag-T2A-PAC SLea CD8SP-SLea-5B1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.816 5.729 Flag-T2A-PAC SSEA4 (antígeno CD8SP-SSEA4-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.817 5.730 embrionário 4 de Flag-T2A-PAC estágio específico) TCRB1 (cadeia CD8SP-TCRB1-CP01-E09-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.818 5.731 constante de TCR beta hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC 1) TCRB1 CD8SP-TCRB1-Jovi1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.819 5.732 K277A-Flag-T2A-PAC TCRB2 (cadeia CD8SP-TCRB2-CP01-D05-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.820 5.733 constante de TCR beta hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC 2) TCRB2 CD8SP-TCRB2-CP01-E05-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.821 5.734 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC TCRgd (TCR CD8SP-TCRgd-G5-4-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.822 5.735 gama/delta) K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-TERT-4A9-T540-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.823 5.736 hTERT/MHC K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-TERT-3G3-T865-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.824 5.737 hTERT/MHC K277A-Flag-T2A-PAC Fator 1 do tecido CD8SP-TGFBR2-Ab1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.825 5.738 K277A-Flag-T2A-PAC TGFBR2 CD8SP-TF1-98-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.826 5.739 Flag-T2A-PAC TIM1/HAVCR CD8SP-TIM1-HVCR1-270-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.827 5.740 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC TIM1/HAVCR CD8SP-TIM1-HVCR1-ARD5-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.828 5.741 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC TnAg CD8SP-TnAg-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.829 5.742 Flag-T2A-PAC Tn-Muc1 CD8SP-TnMuc1-hu5E5-RHA8-RKA-2-(vL-vH)-Myc-z- 1.830 5.743 P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-hTPO-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A- 1.831 5.744

PAC

150 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) TROP2 (antígeno 2 da CD8SP-TROP2-ARA47-HV3KV3-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.832 5.745 superfície celular de hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC trofoblastos) TROP2 CD8SP-TROP2-h7E6-SVG-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.833 5.746 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC TSHR SP-TSHb-Linker-CGHa-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.834 5.747 Flag-T2A-PAC TSHR CD8SP-TSHR-K1-70-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.835 5.748 K277A-Flag-T2A-PAC TSHR CD8SP-TSHR-KB1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.836 5.749 K277A-Flag-T2A-PAC TSHR CD8SP-TSHR-5C9-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.837 5.750 K277A-Flag-T2A-PAC TSLPR (receptor de CD8SP-TSLPR-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.838 5.751 linfopoietina estromal Flag-T2A-PAC do timo) Complexo de classe I CD8SP-Tyros-B2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.839 5.752 de tirosinase/MHC Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-Tyros-MC1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.840 5.753 de tirosinase/MHC K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-Tyros-TA2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.841 5.754 de tirosinase/MHC K277A-Flag-T2A-PAC VEGFR3 CD8SP-VEGFR3-Ab1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.842 5.755 K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-WT1-Ab1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.843 5.756 de WT1/MHC Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-WT1-Ab5-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.844 5.757 de WT1/MHC Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-MYC3-WT1-Ab13-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.845 5.758 de WT1/MHC hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de classe I CD8SP-MYC3-WT1-Ab15-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.846 5.759 de WT1/MHC hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CDH19 CD8SP-CDH19-4B10-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.847 5.760 K277A-Flag-T2A-PAC Receptor Beta de CD8SP-FRbeta-m923-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.848 5.761 Folato K277A-Flag-T2A-PAC LHR (Receptor do CD8SP-LHR-8B7-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.849 5.762 hormônio luteinizante) Flag-T2A-PAC LHR CD8SP-LHR-5F4-21-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.850 5.763 K277A-Flag-T2A-PAC B7H4 CD8SP-B7H4-hu22Cl0-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.851 5.764 K277A-Flag-T2A-PAC B7H4 CD8SP-B7H4-hu1D11-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.852 5.765 K277A-Flag-T2A-PAC IgE CD8SP-IgE-omalizumab-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.853 5.766 K277A-Flag-T2A-PAC CD23 CD8SP-CD23-p5E8-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.854 5.767 K277A-Flag-T2A-PAC GCC (Guanilil ciclase CD8SP-GCC-5F9-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.855 5.768 C) Flag-T2A-PAC GCC CD8SP-GCC-Ab229-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.856 5.769 K277A-Flag-T2A-PAC CD200R CD8SP-CD200R-huDx182-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.857 5.770 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC Tn-Muc1 CD8SP-Tn-Muc1-5E5-HL-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.858 5.771 K277A-Flag-T2A-PAC

151 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) CD22 CD8SP-CD22-5-HL-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.859 5.772 K277A-Flag-T2A-PAC CD22 CD8SP-CD22-10-HL-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.860 5.773 K277A-Flag-T2A-PAC CD22 CD8SP-CD22-31-HL-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.861 5.774 K277A-Flag-T2A-PAC CD22 CD8SP-CD22-53-HL-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.862 5.775 K277A-Flag-T2A-PAC CD22 CD8SP-CD22-65-HL-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.863 5.776 K277A-Flag-T2A-PAC Tn-Muc1 CD8SP-Tn-Muc1-5E5-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.864 5.777 K277A-Flag-T2A-PAC Cadeia leve de Kappa CD8SP-Kappa-LC1-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.865 5.778 K277A-Flag-T2A-PAC PTK7 CD8SP-PTK7-7C8-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.866 5.779 K277A-Flag-T2A-PAC PTK7 CD8SP-PTK7-12C6a-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.867 5.780 K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-hCD19-EUK5-13-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.868 5.781 K277A-Flag-T2A-PAC Ras CD8SP-Ras-Ab2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.869 5.782 Flag-T2A-PAC Ras CD8SP-Ras-Ab4-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.870 5.783 Flag-T2A-PAC Claudin 18.2 CD8SP-CLD18A2-43A11-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.871 5.784 K277A-Flag-T2A-PAC Claudin 18.2 CD8SP-CLD18A2-175D10-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.872 5.785 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD43 CD8SP-CD43-huJL-1-257-10-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.873 5.786 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD69L CD8SP-CD69L-DREG200-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.874 5.787 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC Complexo de NY- CD8SP-NYESO-35-15-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.875 5.788 ESO-1/MHC I K277A-Flag-T2A-PAC Pgp CD8SP-Pgp-9F11-(vH-vL)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.876 5.789 Flag-T2A-PAC Streptag CD8SP-Streptag-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.877 5.790 Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-MPL-Hu-161-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.878 5.791 K277A-Flag-T2A-PAC Pgp CD8SP-Pgp-MRK16-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.879 5.792 K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-353-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.880 5.793 Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-917-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.881 5.794 Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-353-vHH-Linker-BCMA917-vHH-Myc- 1.882 5.795 z-P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD38 CD8SP-CD38-717-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.883 5.796 Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-346-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.884 5.797 Flag-T2A-PAC CD38-BCMA CD8SP-CD38-717-vHH-Ecoil-BCMA-346-vHH-Myc-z- 1.885 5.798 P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-348-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.886 5.799 Flag-T2A-PAC

152 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do SEQ ID NO SEQ ID domínio de ligação ao antígeno (DNA) NO (PRT) CD38 CD8SP-CD38-331-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.887 5.800 Flag-T2A-PAC BCMA-CD38 CD8SP-BCMA-vHH-348-Ecoil-CD38-331-vHH-Myc-z- 1.888 5.801 P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag- 1.889 5.802 T2A-PAC CD20 CD8SP-CD20-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag- 1.890 5.803 T2A-PAC CD19 CD8SP-CD19-vHH-Linker-CD20-vHH-Myc-z-P2A- 1.891 5.804 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-948-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.892 5.805 Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-972-vHH-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- 1.893 5.806 Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-948-vHH-PG4SP-BCMA-972-vHH-Myc- 1.894 5.807 z-P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC BCMA CD8SP-BCMA-948-vHH-PG4SP-BCMA-972-vHH- 1.895 5.808 Ecoilx4-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-MPL-hu-175-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.896 5.809 K277A-Flag-T2A-PAC MPL CD8SP-MPL-hu-111-2-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO- 1.897 5.810 K277A-Flag-T2A-PAC CD179a CD8SP-CD179a-2460-B04-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.898 5.811 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC CD179a CD8SP-CD179a-2462-E07-(vL-vH)-Myc-z-P2A- 1.899 5.812 hNEMO-K277A-Flag-T2A-PAC TABELA 13. IDENTIFICAÇÃO SEQ ID DE CARs/BITES USANDO DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DESCRITOS PARA zCAR- NEMO-K277A (TABELA 12) COMO UM MODELO

ARQUITETU CAR SEQ ID NO DNA SEQ ID NO PRT RA DE CAR EXEMPLIFICATIVO/Engager de células T Biespecífico zCAR-NEMO- CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z- 1.594 a 1.857 1.858 a 5.507 a 5.771 a K277A P2A-hNEMO-K277A-Flag-T2A- 1.899 5.770 5.812

PAC zCAR-K13 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z- 1.016 a 1.285 4.929 a P2A-K13-Flag-T2A-PAC 5.192 BBz CAR CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc- 1.318 a 1.581 5.231 a BBz-T2A-PAC 5.494 CD3ε-TFP- CD8SP-FMC63-(vL-vH)-CD3e- 1.900 a 2.163 2.164 a 5.813 a 6.077 a NEMO-K277A ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- 2.205 6.076 6.118 K277A-Flag-T2A-PAC CD3δ-TFP- CD8SP-FMC63-(vL-vH)-CD3d- 2.206 a 2.469 2.470 a 6.119 a 6.383 a NEMO-K277A ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- 2.511 6.382 6.424 K277A-Flag-T2A-PAC CDγ-TFP- CD8SP-FMC63-(vL-vH)-CD3g- 2.512 a 2.775 2.776 a 6.425 a 6.689 a NEMO-K277A ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- 2.817 6.688 6.730 K277A-Flag-T2A-PAC CDζ-TFP- CD8SP-FMC63-(vL-vH)-CD3z- 2.818 a 3.081 3.082 a 6.731 a 6.995 a NEMO-K277A ECDTMCP-opt2-P2A-hNEMO- 3.123 6.994 7.036 K277A-Flag-T2A-PAC Engager da CD8SP-FMC63-scFv-Linker- 3.545 a 3.814 7.458 a células T CD3-scFv-Myc-His 7.721 Biespecífico

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TABELA 14: CONSTRUTOS Ab-TCR COM DIFERENTES DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO.

Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) CD19 CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.124 7.037 FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD19 CD8SP-huFMC63-11-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.125 7.038 SP-huFMC63-11-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CD19 CD8SP-CD19Bu12-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.126 7.039 CD19Bu12-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD19 CD8SP2-CD19MM-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.127 7.040 CD19MM-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD19 CD8SP-CD19-4G7-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.128 7.041 CD19-4G7-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A HIV1-env CD8SP-HIV1-N6-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.129 7.042 HIV1-N6-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A ALK CD8SP-Alk-48-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-Alk- 3.130 7.043 48-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A ALK CD8SP-Alk-58-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-Alk- 3.131 7.044 58-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A Amiloide SP-Amyloid-158-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.132 7.045 Amyloid-158-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A Biotina CD8SP-dc-Avidin-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-dc- 3.133 7.046 Avidin-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A CD45 CD8SP-BC8-CD45-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.134 7.047 BC8-CD45-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A BCMA CD8SP-BCMA-J6M0-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.135 7.048 SP-BCMA-J6M0-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A BCMA CD8SP-BCMA-huC12A3-L3H3-vL-[IgCL-TCRb-IAH- 3.136 7.049 6MD]-F-P2A-SP-BCMA-huC12A3-L3H3-vH-[IgG1-CH1- TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A BCMA CD8SP-BCMA-ET-40-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.137 7.050 SP-BCMA-ET-40-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A BCMA CD8SP-BCMA-ET-54-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.138 7.051 SP-BCMA-ET-54-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CCR4 CD8SP-CCR4-humAb1567-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.139 7.052 P2A-SP-CCR4-humAb1567-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A HIV1-env CD8SP-CD4-ECD-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-DC- 3.140 7.053 SIGN-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A CD5 CD8SP-CD5-9-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.141 7.054 CD5-9-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A

154 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) CD5 CD8SP-CD5-18-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.142 7.055 CD5-18-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A IgFc CD8SP-CD16A-V158-ECD-v1-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]- 3.143 7.056 P2A-CD8SP2-CD16A-V158-ECD-v2-[IgG1-CH1-TCRa- SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A IgFc CD8SP-CD16A-V158-ECD-v1-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]- 3.144 7.057 P2A-SP-CD123-1-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD20 CD8SP-CD20-2F2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.145 7.058 CD20-2F2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD20 CD8SP-CD20-GA101-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.146 7.059 SP-CD20-GA101-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CD22 CD8SP-CD22-h10F4v2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.147 7.060 SP-CD22-h10F4v2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CD22 CD8SP-CD22-H22Rhov2ACDRKA-vL-[IgCL-TCRb-IAH- 3.148 7.061 6MD]-F-P2A-SP-CD22-H22Rhov2ACDRKA-vH-[IgG1- CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A CD22 CD8SP-CD22-m971-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.149 7.062 SP-CD22-m971-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD30 CD8SP-CD30-5F11-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.150 7.063 CD30-5F11-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD30 CD8SP-CD30-Ac10-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.151 7.064 CD30-Ac10-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD32 CD8SP-CD32-Med9-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.152 7.065 SP-CD32-Med9-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD33 CD8SP-CD33-AF5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.153 7.066 CD33-AF5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD33 CD8SP-CD33-huMyc9-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.154 7.067 SP-CD33-huMyc9-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CD34 CD8SP-CD34-hu4C7-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.155 7.068 SP-CD34-hu4C7-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CD44v6 CD8SP-CD44v6-Biwa8-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.156 7.069 SP-CD44v6-Biwa8-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CD70 CD8SP-CD70-h1F6-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.157 7.070 CD70-h1F6-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD79b CD8SP-CD79b-2F2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.158 7.071 CD79b-2F2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD123 CD8SP-CD123-CSL362-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.159 7.072 P2A-SP-CD123-CSL362-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A CD138 CD8SP-CD138-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.160 7.073 CD138-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A

155 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) CD179b CD8SP-CD179b-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.161 7.074 CD179b-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD276 CD8SP-CD276-17-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.162 7.075 CD276-17-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD324 CD8SP-CD324-SC10-6-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.163 7.076 SP-CD324-SC10-6-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CD324 CD8SP-CD324-hSC10-17-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.164 7.077 P2A-SP-CD324-hSC10-17-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A CDH6 CD8SP-CDH6-NOV710-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.165 7.078 P2A-SP-CDH6-NOV710-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A CDH6 CD8SP-CDH6-NOV712-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.166 7.079 P2A-SP-CDH6-NOV712-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A CDH17 CD8SP-CDH17-PTA001A4-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.167 7.080 P2A-SP-CDH17-PTA001A4-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A CDH19 CD8SP-CDH19-16A4-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.168 7.081 SP-CDH19-16A4-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A EGFR CD8SP-Cetuximab-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.169 7.082 Cetuximab-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CLEC5A CD8SP-CLEC5A-8H8F5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.170 7.083 P2A-SP-CLEC5A-8H8F5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A CLEC5A CD8SP-CLEC5A-3E12A2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.171 7.084 P2A-SP-CLEC5A-3E12A2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A GR/LHR SP-CGHb-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-CGHa-[IgG1- 3.172 7.085 CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A CLL1 CD8SP-CLL1-M26-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.173 7.086 CLL1-M26-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CLL1 CD8SP-CLL1-M32-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.174 7.087 CLL1-M32-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CMVpp65 CD8SP-CMVpp65-F5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.175 7.088 SP-CMVpp65-F5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CS1 CD8SP-CS1-huLuc63-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.176 7.089 SP-huLuc63-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CS1 CD8SP-HuLuc64-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.177 7.090 HuLuc64-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CS1 CD8SP-CS1-huLuc90-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.178 7.091 SP-huLuc90-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CSF2RA CD8SP-CSF2RA-Ab6-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.179 7.092 SP-CSF2RA-Ab6-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A

156 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) CSF2RA CD8SP-CSF2RA-Ab1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.180 7.093 SP-CSF2RA-Ab1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CD123 IgHSP-CD123-2-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.181 7.094 CD123-1-vHH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD123 & IgHSP-CD123-2-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.182 7.095 IgFc CD8SP1-CD16A-V158-ECD-v1-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A CD123 & IgHSP-CD123-2-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.183 7.096 IgFc CD8SP2-CD16A-V158-ECD-v2-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A CD123 & IgHSP-CD123-2-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.184 7.097 MPL CD8SP-MPL-161-HL-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CXCR4 & CD8SP-CXCR4-1-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.185 7.098 CD123 CD123-1-vHH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CXCR4 & CD8SP-CXCR4-2-VHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.186 7.099 CD123 SP-CD123-2-VHH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A DLL3 CD8SP-DLL3-hSC16-13-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.187 7.100 P2A-SP-DLL3-hSC16-13-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A DLL3 CD8SP-DLL3-hSC16-56-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.188 7.101 P2A-SP-DLL3-hSC16-56-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A EBNA3c CD8SP-EBNA3c-315-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.189 7.102 SP-EBNA3c-315-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A EBV-gp350 CD8SP-EBV-gp350-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.190 7.103 EBV-gp350-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A EGFR CD8SP-EGFR1-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.191 7.104 CEA1-vHH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A EGFR CD8SP-EGFR33-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.192 7.105 CEA5-vHH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A EGFRvIII CD8SP-EGFRvIII-139-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.193 7.106 SP-EGFRvIII-139-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A EGFRvIII CD8SP-EGFRvIII-2173-vH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.194 7.107 P2A-SP-EGFRvIII-2173-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A EpCam1 CD8SP-Epcam1-MM1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.195 7.108 SP-Epcam1-MM1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A EpCam1 CD8SP-Epcam1-D5K5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.196 7.109 SP-Epcam1-D5K5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A FLT3 CD8SP-FLT3-NC7-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.197 7.110 FLT3-NC7-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A FITC CD8SP-FITC-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-FITC- 3.198 7.111 vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A

157 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) Influenza A CD8SP-FLU-MEDI-8852-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.199 7.112 HA P2A-SP-FLU-MEDI-8852-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A Receptor de CD8SP-FR1-huMov19-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.200 7.113 Folato 1 SP-FR1-huMov19-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A FSHR CD8SP-FSHb-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.201 7.114 CGHa-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A GD2 CD8SP-GD2-hu14-18-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.202 7.115 SP-GD2-hu14-18-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A GD2 CD8SP-GD2-hu3F8-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.203 7.116 GD2-hu3F8-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A GD3 CD8SP-GD3-KM-641-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.204 7.117 SP-GD3-KM-641-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A GFRa4 CD8SP-GFRAlpha4-P4-6-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.205 7.118 P2A-SP-GFRAlpha4-P4-6-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A GFRa4 CD8SP-GFRa4-P4-10-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.206 7.119 SP-GFRa4-P4-10-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A FUCOSYL- CD8SP-GM1-5B2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.207 7.120 GM1 GM1-5B2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A FUCOSYL- CD8SP-GM1-7E5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.208 7.121 GM1 GM1-7E5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A GPRC5D CD8SP-GPRC5D-ET150-5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.209 7.122 P2A-SP-GPRC5D-ET150-5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A GPRC5D CD8SP-GPRC5D-ET150-18-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.210 7.123 P2A-SP-GPRC5D-ET150-18-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A gp100 CD8SP-gp100-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.211 7.124 gp100-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A gp100 CD8SP-gp100-G2D12-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.212 7.125 SP-gp100-G2D12-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A GPC3 CD8SP-GPC3-4E5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.213 7.126 GPC3-4E5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A gpNMB CD8SP-gpNMB-115-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.214 7.127 SP-gpNMB-115-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A GRP78 CD8SP-GRP78-GC18-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.215 7.128 SP-GRP78-GC18-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A Her2 CD8SP-Her2-1-Darpin-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.216 7.129 Her2-2-Darpin-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A Her2 CD8SP-Her2-5F7-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.217 7.130 Her2-47D5-vHH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A

158 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) Her2 CD8SP-Her2-Hu4D5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.218 7.131 SP-Her2-Hu4D5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A Her2 & Her3 CD8SP-Her3-17B05So-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.219 7.132 P2A-SP-Her2-2D3-vHH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A HIV1-gag CD8SP-HIV1-E5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.220 7.133 HIV1-E5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A HIV1-env CD8SP-HIV1-3BNC117-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.221 7.134 P2A-SP-HIV1-3BNC117-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A HIV1-env CD8SP-HIV1-PGT-128-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.222 7.135 SP-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A HIV1-env CD8SP-HIV1-VR-C01-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.223 7.136 SP-HIV1-VR-C01-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A HIV1-env CD8SP-HIV1-X5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.224 7.137 HIV1-X5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A HMW-MAA CD8SP-HMW-MAA-hIND-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.225 7.138 P2A-SP-HMW-MAA-hIND-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A HTLV1-TAX CD8SP-HTLV-TAX-T3F2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.226 7.139 P2A-SP-TAX-T3F2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO- K277A HTLV1-TAX CD8SP-HTLV-TAX-T3E3-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.227 7.140 P2A-SP-TAX-T3E3-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO- K277A IL11Ra CD8SP-IL11Ra-8E2-Ts107-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.228 7.141 P2A-SP-IL11Ra-8E2-Ts107-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A IL6Ra & IgHSP-IL6R-304-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.229 7.142 CD19 FMC63-scFV-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A IL13Ra2 CD8SP-IL13Ra2-hu107-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.230 7.143 P2A-SP-IL13Ra2-hu107vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]- F-F2A-hNEMO-K277A IL13Ra2 CD8SP-IL13Ra2-Hu108-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.231 7.144 P2A-SP-IL13Ra2-Hu108-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A KSHV-K8.1 CD8SP-KSHV-4C3-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.232 7.145 4C3-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A LAMP1 CD8SP-LAMP1-humab1-2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.233 7.146 P2A-SP-LAMP1-humab1-2vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A LAMP1 CD8SP-LAMP1-Mb4-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.234 7.147 SP-LAMP1-Mb4-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A LewisY CD8SP-LewisY-huS193-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.235 7.148 P2A-SP-LewisY-huS193-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A L1CAM CD8SP-L1CAM-9-3-HU3-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.236 7.149 P2A-SP-L1CAM-9-3-HU3-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]- F-F2A-hNEMO-K277A

159 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) LHR SP-LHb-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-CGHa-[IgG1- 3.237 7.150 CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A Lym1 CD8SP-Lym1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.238 7.151 Lym1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A Lym2 CD8SP-Lym2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.239 7.152 Lym2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A CD79b CD8SP-huMA79bv28-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.240 7.153 SP-huMA79bv28-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A MART1 CD8SP-MART1-CAG10-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.241 7.154 P2A-SP-MART1-CAG10-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A MART1 CD8SP-MART1-CLA12-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.242 7.155 P2A-SP-MART1-CLA12-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A Mesotelina CD8SP-Mesotelina-m912-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.243 7.156 P2A-SP-m912-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A cMet CD8SP-cMET-171-vHH-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.244 7.157 SP-Her3-21F06-vHH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A MPL CD8SP-MPL-175-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.245 7.158 175-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A MPL CD8SP-MPL-161-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.246 7.159 161-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A MPL CD8SP2-MPL-111-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.247 7.160 MPL-111-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A MPL CD8SP-MPL-178-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.248 7.161 178-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A MPL CD8SP-MPL-AB317-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.249 7.162 SP-AB317-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A MPL CD8SP-MPL-12E10-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.250 7.163 SP-12E10-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A MPL CD8SP-MPL-huVB22Bw5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.251 7.164 P2A-SP-MPL-huVB22Bw5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A Muc1 CD8SP-Muc1-D6-M3B8-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.252 7.165 P2A-SP-Muc1-D6-M3B8-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A Muc1 CD8SP-MUC1-D6-M3A1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.253 7.166 P2A-SP-MUC1-D6-M3A1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A Muc16 CD8SP-Muc16-4H11-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.254 7.167 SP-Muc16-4H11-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A EGFR CD8SP-Nimotuzumab-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.255 7.168 SP-Nimotuzumab-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A

160 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) NKG2D CD8SP-NKG2D-(G4SG4D)-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.256 7.169 P2A-SP-NKG2D-(G4SG4D)-v2-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A NKG2D CD8SP-NKG2D-MS-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.257 7.170 SP-NKG2D-MS-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A NYBR1 CD8SP-NYBR1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.258 7.171 NYBR1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A NY-ESO CD8SP-NYESO-T1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.259 7.172 NYESO-T1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A NY-ESO CD8SP-NYESO-T1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.260 7.173 NYESO-T2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A Ligante PD1 SP-PD1-ECD-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-P2A-SP-PD1-opt- 3.261 7.174 ECD-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A PDL1 CD8SP-PDL1-Atezoli-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.262 7.175 SP-PDL1-Atezoli-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A PDL1 CD8SP-PDL1-SP142-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.263 7.176 SP-PDL1-SP142-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A PDL1 CD8SP-PDL1-10A5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.264 7.177 SP-PDL1-10A5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A PSCA CD8SP-PSCA-Ha14-121-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.265 7.178 P2A-SP-PSCA-Ha14-121-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A PSCA CD8SP-PSCA-Ha14-117-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.266 7.179 P2A-SP-PSCA-Ha14-117-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A PR1 CD8SP-PR1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-PR1- 3.267 7.180 vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A PSMA CD8SP-PSMA-006-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.268 7.181 PSMA-006-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A PSMA CD8SP-PSMA-J591-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.269 7.182 SP-PSMA-J591-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A PTK7 CD8SP-PTK7-hSC6-23-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.270 7.183 SP-PTK7-hSC6-23-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A PTK7 CD8SP-PTK7-SC6-10-2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.271 7.184 P2A-SP-PTK7-SC6-10-2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]- F-F2A-hNEMO-K277A ROR1 CD8SP-ROR1-4A5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.272 7.185 ROR1-4A5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A ROR1 CD8SP-ROR1-4C10-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.273 7.186 SP-ROR1-4C10-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A Mesotelina CD8SP-SD1-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-SD2- 3.274 7.187 [IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A SLea CD8SP-SLea-7E3-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.275 7.188 SLea-7E3-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A

161 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) SLea CD8SP-SLea-5B1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.276 7.189 SLea-5B1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A SSEA4 CD8SP-SSEA4-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.277 7.190 SSEA4-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A Tirosinase CD8SP-TA2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-TA2- 3.278 7.191 vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A TCRB1 CD8SP-TCRB1-CP01-E09-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.279 7.192 P2A-SP-TCRB1-CP01-E09-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A TCRB1 CD8SP-TCRB1-Jovi1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.280 7.193 SP-TCRB1-Jovi1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A TCRB2 CD8SP-TCRB2-CP01-D05-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.281 7.194 P2A-SP-TCRB2-CP01-D05-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A TCRB2 CD8SP-TCRB2-CP01-E05-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.282 7.195 P2A-SP-TCRB2-CP01-E05-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A TCRgd CD8SP-TCRgd-G5-4-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.283 7.196 SP-TCRgd-G5-4-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A hTERT CD8SP-TERT-4A9-T540-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.284 7.197 P2A-SP-TERT-4A9-T540-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A hTERT CD8SP-TERT-3G3-T865-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.285 7.198 P2A-SP-TERT-3G3-T865-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A TGFBR2 CD8SP-TGFBR2-Ab1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.286 7.199 SP-TGFBR2-Ab1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A TIM1 CD8SP-TIM1-HVCR1-270-2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]- 3.287 7.200 F-P2A-SP-TIM1-HVCR1-270-2-vH-[IgG1-CH1-TCRa- SDVP-6MD]- F-F2A-hNEMO-K277A TIM1 CD8SP-TIM1-HVCR1-ARD5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]- 3.288 7.201 F-P2A-SP-TIM1-HVCR1-ARD5vH-[IgG1-CH1-TCRa- SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A TnAg CD8SP-TnAg-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.289 7.202 TnAg-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO- K277A Tn-Muc1 CD8SP-TnMuc1-hu5E5-RHA8-RKA-2-vL-[IgCL-TCRb- 3.290 7.203 IAH-6MD]-F-P2A-SP-TnMuc1-hu5E5-RHA8-RKA-2vH- [IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD ]-F-F2A-hNEMO-K277A TROP2 CD8SP-TROP2-ARA47-HV3KV3-vL-[IgCL-TCRb-IAH- 3.291 7.204 6MD]-F-P2A-SP-TROP2-ARA47-HV3KV3-vH-[IgG1-CH1- TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A TROP2 CD8SP-TROP2-h7E6-SVG-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.292 7.205 P2A-SP-TROP2-h7E6-SVG-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A TSHR SP-TSHb-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-CGHa-[IgG1- 3.293 7.206 CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A TSHR CD8SP-TSHR-K1-70-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.294 7.207 SP-TSHR-K1-70-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A TSHR CD8SP-TSHR-KB1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.295 7.208 TSHR-KB1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A

162 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) TSHR CD8SP-TSHR-5C9-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.296 7.209 TSHR-5C9-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A TSLPR CD8SP-TSLPR-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.297 7.210 TSLPR-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A Tirosinase CD8SP-Tyros-B2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.298 7.211 Tyros-B2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A Tirosinase CD8SP-Tyros-MC1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.299 7.212 Tyros-MC1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A Tirosinase CD8SP-Tirosinase-B2-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.300 7.213 SP-Tirosinase-B2-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A VEGFR3 CD8SP-VEGFR3-Ab1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.301 7.214 SP-VEGFR3-Ab1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A WT1 CD8SP-WT1-Ab1-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.302 7.215 WT1-Ab1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A WT1 CD8SP-WT1-Ab5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.303 7.216 WT1-Ab5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A WT1 CD8SP-MYC3-WT1-Ab13-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.304 7.217 P2A-SP-WT1-Ab13-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO- K277A WT1 CD8SP-MYC3-WT1-Ab15-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.305 7.218 P2A-SP-WT1-Ab15-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO- K277A CD123 CD8SP-CD123-1172-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.306 7.219 SP-CD123-1172-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CDH19 CD8SP-CDH19-4B10-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.307 7.220 SP-CDH19-4B10-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A Receptor Beta CD8SP-FRbeta-m923-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.308 7.221 de Folato SP-FRbeta-m923-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A LHR CD8SP-LHR-8B7-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.309 7.222 LHR-8B7-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A LHR CD8SP-LHR-5F4-21-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.310 7.223 SP-LHR-5F4-21-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A B7H4 CD8SP-B7H4-hu22Cl0-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.311 7.224 SP-B7H4-hu22Cl0-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A B7H4 CD8SP-B7H4-hu1D11-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.312 7.225 SP-B7H4-hu1D11-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A IgE CD8SP-IgE-omalizumab-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.313 7.226 P2A-SP-IgE-omalizumab-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A CD23 CD8SP-CD23-p5E8-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.314 7.227 CD23-p5E8-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A

163 / 348 Alvo Nome dos construtos de CAR, incluindo o nome do domínio SEQ ID NO SEQ ID NO de ligação ao antígeno (DNA) (PRT) GCC CD8SP-GCC-5F9-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.315 7.228 GCC-5F9-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A GCC CD8SP-GCC-Ab229-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.316 7.229 SP-GCC-Ab229-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD200R CD8SP-CD200R-huDx182-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F- 3.317 7.230 P2A-SP-CD200R-huDx182-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP- 6MD]-F-F2A-hNEMO-K277A Tn-Muc1 CD8SP-Tn-Muc1-5E5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A- 3.318 7.231 SP-Tn-Muc1-5E5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F- F2A-hNEMO-K277A CD22 CD8SP-CD22-5-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.319 7.232 CD22-5-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD22 CD8SP-CD22-10-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.320 7.233 CD22-10-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD22 CD8SP-CD22-31-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.321 7.234 CD22-31-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD22 CD8SP-CD22-53-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.322 7.235 CD22-53-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A CD22 CD8SP-CD22-65-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP- 3.323 7.236 CD22-65-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A- hNEMO-K277A

[00168] Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam os CARs convencionais 1 a 6 (Tabela 1), em que o domínio específico de antígeno do CAR tem como alvo um ou mais antígenos específicos, conforme descrito nas Tabelas 6A a C ou nas Tabelas 5 e 6 no documento PCT/US2017/064379, que são incorporada neste documento a título de referência. Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam qualquer uma ou mais das estruturas principais 1 a 72 (Tabela 2), em que o domínio específico de antígeno do CAR codificado tem como alvo um ou mais antígenos específicos, conforme descrito nas Tabelas 6A a C ou Tabelas 5 e 6 no documento PCT/US2017/064379. Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam a estrutural principal-1, em que o domínio específico de antígeno do CAR na estrutural principal-1 tem como alvo um ou mais antígenos específicos para o câncer, conforme descrito neste documento nas Tabelas 6A a C ou Tabelas 5 e 6 do documento

164 / 348 PCT/US2017/064379. Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam a estrutural principal-1, em que o domínio específico de antígeno do CAR na estrutural principal-2 tem como alvo um ou mais antígenos específicos para o câncer, conforme descrito neste documento nas Tabelas 6A a C ou Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam a estrutural principal-1, em que o domínio específico de antígeno do CAR na estrutural principal-37 tem como alvo um ou mais antígenos específicos para o câncer, conforme descrito neste documento nas Tabelas 6A a C ou Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam a estrutural principal-1, em que o domínio específico de antígeno do CAR na estrutural principal-38 tem como alvo um ou mais antígenos específicos para o câncer, conforme descrito neste documento nas Tabelas 6A a C ou Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam a estrutural principal-1, em que o domínio específico de antígeno do CAR na estrutural principal 49 tem como alvo um ou mais antígenos específicos para o câncer, conforme descrito neste documento nas Tabelas 6A a C ou Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em algumas modalidades, as composições compreendem ácidos nucleicos que codificam a estrutural principal-1, em que o domínio específico de antígeno do CAR na estrutural principal 50 tem como alvo um ou mais antígenos específicos para o câncer, conforme descrito neste documento nas Tabelas 6A a C ou Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379.

[00169] Em várias modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam o receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, componentes das estruturas principais descritas neste

165 / 348 documento, codificam um, dois, três ou mais domínios específicos de antígeno. Por exemplo, um ou mais ASD que se ligam especificamente a um antígeno associado ao câncer, como descrito neste documento, podem ser usados. As sequências do ASD são contíguas com e no mesmo quadro de leitura que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o restante da uma ou mais cadeias de CAR.

[00170] Em uma modalidade, cada região específica de antígeno compreende a cadeia pesada de IgG de comprimento total (específica para o antígeno alvo) com os domínios VH, CH1, dobradiça e CH2 e CH3 (Fc) Ig, se o domínio VH sozinho é suficiente para conferir especificidade ao antígeno (“anticorpos de domínio único”). A cadeia pesada de IgG de comprimento total pode ser ligada a um domínio coestimulante e a um domínio de sinalização intracelular opcional por meio do domínio transmembranar apropriado. Se ambos os domínios VH e VL são necessários para gerar uma região de alvejamento específica de antígeno totalmente ativa, o receptor imune de ocorrência não natural que contém VH, por exemplo, um CAR e a cadeia leve lambda de comprimento total (IgL) são introduzidos nas células para gerar uma região de alvejamento específica de antígeno ativa.

[00171] Em algumas modalidades, o domínio específico de antígeno do receptor imune não natural codificado, por exemplo, uma molécula CAR compreende um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um scFv, um Fv, um Fab, um (Fab')2, um único anticorpo de domínio (SDAB), um domínio vH ou vL ou um domínio vHH camelídeo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno do receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, é um fragmento de anticorpo scFv que é humanizado em comparação com a sequência murina de scFv do qual é derivado.

[00172] Em alguns casos, os scFvs podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242: 423 a 426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5.879 a

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5.883). As moléculas de ScFv podem ser produzidas ligando as regiões VH e VL usando ligantes polipeptídicos flexíveis. As moléculas de scFv compreendem um ligante (por exemplo, um ligante Ser-Gly) com um comprimento otimizado e/ou composição de aminoácidos (por exemplo, para otimizar o dobramento, etc.). um scFv pode compreender um vinculador de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais resíduos de aminoácidos entre suas regiões VL e VH. Em algumas modalidades, a sequência do ligante compreende os aminoácidos glicina e serina. Em outra modalidade, a sequência do ligante compreende conjuntos de repetições de glicina e serina. A variação no comprimento do ligante pode reter ou aprimorar a atividade, dando origem a uma eficácia superior nos estudos de atividade. Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo scFv específicos do antígeno são funcionais, pois se ligam ao mesmo antígeno com a mesma afinidade ou comparável ao anticorpo IgG do qual é derivado. Em outras modalidades, o fragmento de anticorpo tem uma menor afinidade de ligação ao antígeno em comparação com o anticorpo do qual é derivado, mas é funcional na medida em que fornece uma resposta biológica descrita neste documento. Em uma modalidade, a molécula de CAR compreende um fragmento de anticorpo que tem uma afinidade de ligação KD de 10-4 M a 10-8 M, 10-5 M a 10-7 M, 10-6 M ou 10-8 M, para o antígeno alvo.

[00173] Em uma modalidade, o domínio específico de antígeno compreende uma, duas ou todas as três CDRs de cadeia pesada (hc), hcCDR1, hcCDR2 e hcCDR3 de um anticorpo ou um scFv listado neste documento (Tabela 6B; SEQ ID NOs: 14.122 a 15.039) e/ou um, dois ou todos os três CDRs de cadeia leve (lc), lcCDRl, lcCDR2 e lcCDR3 de um anticorpo ou scFv listados neste documento (Tabelas 6A; SEQ ID NOs: 13.204 a 14.121) (também consultar as Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379) Em algumas modalidades, o ASD compreende um fragmento VL (ou vL) que

167 / 348 compreende todas as três CDRs de cadeia leve pertencentes a um scFv específico (Tabelas 6A; SEQ ID NOs: 13.204 a 14.121) ou um fragmento VH (ou vH) compreendendo todos os três CDRs de cadeia pesada pertencentes a um scFv específico (Tabela 6B ; SEQ ID NOs: 14.122 a 15.039) (consultar também, Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379). A Tabela 6C fornece os nomes, antígenos alvo e SEQ ID Nos dos diferentes scFvs cujos fragmentos de vL e vL e CDRs estão listados nas Tabelas 6A e 6B. Os fragmentos de vL e vH e os scFvs correspondentes podem ser usados em várias modalidades da divulgação para construir os CARs descritos neste documento.

[00174] Em outra modalidade, o domínio específico de antígeno compreende um anticorpo humanizado ou um fragmento de anticorpo. Em alguns aspectos, um anticorpo não humano é humanizado, em que sequências ou regiões específicas ao anticorpo são modificadas para aumentar a similaridade com um anticorpo produzido naturalmente em um ser humano ou um fragmento do mesmo. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno é humanizado. Um anticorpo humanizado pode ser produzido usando uma variedade de técnicas conhecidas na arte, incluindo, porém sem limitação, enxerto de CDR, revestimento ou recapeamento e embaralhamento de cadeias.

[00175] Em uma modalidade adicional, cada domínio específico de antígeno do receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, pode compreender um fragmento variável de cadeia única divalente (ou bivalente) (di-scFvs, bi-scFvs). Em, por exemplo, CARs compreendendo di- scFVs, dois scFvs específicos para cada antígeno são ligados em conjunto, produzindo uma única cadeia peptídica com duas regiões VH e duas regiões VL, produzindo scFvs em tandem. (Xiong, Cheng-Yi; Natarajan, A; Shi, XB; Denardo, GL; Denardo, SJ (2006). “Development of tumor targeting anti- MUC-1 multimer: effects of di-scFv unpaired cysteine location on

168 / 348 PEGylation and tumor binding”. Protein Engineering Design and Selection 19 (8): 359 a 367; Kufer, Peter; Lutterbuse, Ralf; Baeuerle, Patrick A. (2004). “A revival of bispecific antibodies”. Trends in Biotechnology 22 (5): 238 a 244). Os CARs que compreendem pelo menos duas regiões de alvejamento específicas de antígeno expressariam dois scFvs específicos para cada um dos dois antígenos. O ASD resultante é unido ao domínio coestimulante e ao domínio de sinalização intracelular através de uma região de dobradiça e um domínio transmembranar. Alternativamente, o receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, compreendendo duas regiões de alvejamento específicas de antígeno, expressaria dois vHH específicos para cada um dos dois antígenos ou dois epítopos do mesmo antígeno. CARs exemplificativos direcionados a dois antígenos são representados pelas SEQ ID NOs: 1.307 e 1.310.

[00176] Em outra modalidade, cada ASD do receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, compreende um diabody. Em um diabody, os scFvs são criados com peptídeos ligantes que são muito curtos para as duas regiões variáveis se dobrarem, levando os scFvs a dimerizar. Ligantes ainda mais curtos (um ou dois aminoácidos) levam à formação de trímeros, os chamados triabodies ou tribodies. Tetrabodies também podem ser usados.

[00177] Em algumas modalidades, o ASD do receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, compreende fragmentos VHH (nanobodies) como descrito neste documento (consultar as Tabelas 5 a 6 do documento PCT/US2017/064379). Em algumas modalidades, o ASD do receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, compreende affibodies como descrito neste documento (consultar as Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379).

[00178] Em outra modalidade, o domínio de ligação específico de antígeno compreende um ligante para um cognato expresso em uma célula

169 / 348 alvo.

[00179] Em uma modalidade, um domínio específico de antígeno de um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno, por exemplo, CDRs, de fragmentos de vHH direcionados a esse antígeno (consultar as Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379).

[00180] Em uma modalidade, um domínio específico de antígeno de um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno de um suporte não imunoglobulínico direcionado a esse antígeno (consultar as Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379).

[00181] Em uma modalidade, um domínio específico de antígeno de um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, contra um antígeno alvo é uma porção de ligação ao antígeno de um receptor que se sabe ligar este antígeno alvo (consultar, Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379).

[00182] Em outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno é um receptor de célula T (“TCR”), ou um fragmento do mesmo, por exemplo, um TCR de cadeia única (scTCR). Os métodos para produzir esses TCRs são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Willemsen RA et al., Gene Therapy 7: 1.369 a 1.377 (2000); Zhang T et al., Cancer Gene Ther 11: 487 a 496 (2004); Aggen et al., Gene Ther. 19 (4): 365 a 74 (2012) (referências são incorporadas neste documento na sua totalidade). Por exemplo, scTCR podem ser manipulados geneticamente que contêm os genes Vα e νβ de um clone de células T ligadas por um ligante (por exemplo, um peptídeo flexível). Essa abordagem é muito útil para o alvo associado ao câncer que é intracelular; no entanto, um fragmento desse antígeno (peptídeo) é apresentado na superfície das células cancerígenas pelo MHC.

[00183] Em algumas modalidades, o domínio específico de antígeno é

170 / 348 um receptor de célula T específico para o antígeno alvo ou um fragmento do receptor de célula T, em que o fragmento retém a especificidade para o antígeno alvo.

[00184] Em algumas modalidades, o domínio específico de antígeno de um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, descrito neste documento se liga a um peptídeo apresentado pelo MHC. Normalmente, peptídeos derivados de proteínas endógenas preenchem os bolsos das moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e são reconhecidos pelos receptores de células T (TCRs) nos linfócitos T CD8+. Os complexos de classe I de MHC são expressos constitutivamente por todas as células nucleadas. No câncer, complexos peptídicos/MHC específicos para vírus e/ou para tumor representam uma classe única de alvos de superfície celular para imunoterapia. Anticorpos do tipo TCR direcionado a peptídeos derivados de antígenos virais ou tumorais no contexto do antígeno leucocitário humano (HLA)-A1 ou HLA-A2 foram descritos (consultar, por exemplo, Sastry et al., J Viral. 2011 85 (5): 1.935 a 1.942; Sergeeva et al. Blood, 2011117 (16): 4.262 a 4.272; Verma et al., Jlmmunol2010 184 (4):

2.156 a 2.165; Willemsen et al. Gene Ther20018 (21): 1.601 a 1.608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5 (176): 176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19 (2): 84 a 100). Por exemplo, o anticorpo semelhante ao TCR pode ser identificado a partir da triagem de uma biblioteca, como uma biblioteca exibida em fago de scFv humano. CARs exemplificativos que são baseados em anticorpos do tipo TCR direcionados a WT1 em associação com HLA-A2 são representados pelas SEQ ID NO: 1.266 a SEQ ID NO: 1.268. Na presente invenção, os CARs foram gerados usando o domínio de ligação ao antígeno derivado de anticorpos do tipo TCR contra vários peptídeos intracelulares restritos a HLA-A2. Os antígenos de proteína alvo, o fragmento peptídico e a sequência do peptídeo são mostrados na Tabela 8.

[00185] Em algumas modalidades, os antígenos específicos para a

171 / 348 doença que podem ser direcionados pelo receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, quando expressos sozinhos ou com os módulos acessórios, conforme descrito neste documento incluem, porém sem limitação, um ou mais CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (também denominado subconjunto CD2 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2- 3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα- Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor órfão de tipo tirosina-quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expresso em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina- 13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-11Ra); antígeno de célula-tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor alfa de folato (FRa ou FR1); Receptor beta de folato (FRb); Receptor tirosina-proteína quinase ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1); receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto

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(FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade Proteassoma (Prosome, Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2- 3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o-acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR-1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro 1A (XAGEl); receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína

173 / 348 tumoral p53 (p53); mutante p53; proteína; survivina; telomerase; antígeno 1 do tumor de carcinoma de próstata (PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil-glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY- TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de domínio de lectina de tipo C (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e

174 / 348 polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGL11), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGL11, TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM-CSFR-alfa), TGFbetaR2, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR-beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina (CGHR ou GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), autoanticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, Claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A.2), Glicoproteína p, STEAP1, Liv1, Nectin-4, Cripto, gpA33, BST1/CD157, canal de cloreto de baixa condutância e um antígeno reconhecido por anticorpo TNT ou combinações dos mesmos.

[00186] Em algumas modalidades, os antígenos específicos para uma doença que podem ser direcionados pelo receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, quando expressos sozinhos ou com os módulos acessórios, conforme descrito neste documento incluem, porém sem limitação, um ou mais dentre 4-1BB, 5T4, antígeno de adenocarcinoma, alfa- fetoproteína, BAFF, célula de linfoma B, antígeno C242, CA-125, anidrase carbônica 9 (CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (receptor IgE), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CD123, CEA, CNTO888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, domínio extra B de fibronectina,

175 / 348 receptor de folato 1, GD2, gangliosídeo GD3, glicoproteína 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, receptor quinase do fator de dispersão humano, IGF-1, IGF- I, IgG1, L1 -CAM, IL-13, IL-6, receptor do fator de crescimento semelhante à insulina I, integrina α5β1, integrina αvβ3, LAMP1, MORAb-009, MS4A1, MUC1, mucina CanAg, ácido N-glicolilneurâmico, NPC-1C, PDGF-R α, PDL192, fosfatidilserina, células de carcinoma de próstata, RANKL, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, tenascina C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina ou combinações dos mesmos. Outros antígenos específicos para o câncer serão evidentes para aqueles versados na técnica e podem ser usados em conexão com modalidades alternativas da divulgação.

[00187] Um CAR, quando usado sozinho ou com módulos acessórios, como descrito neste documento pode compreender um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) que se liga a um antígeno de suporte a doenças (por exemplo, um antígeno de suporte a doenças, como descrito neste documento). Em algumas modalidades, o antígeno de suporte a doenças é um antígeno presente nas células que suportam a sobrevivência e a proliferação de células causadoras de doenças. Em algumas modalidades, o antígeno de suporte a doenças é um antígeno presente em uma célula estromal ou em uma célula supressora derivada de mieloide (MDSC). As células estromais podem secretar fatores de crescimento e citocinas para promover a proliferação celular no microambiente. As células MDSC podem bloquear a proliferação e ativação de células T. Sem desejar ser limitado pela teoria, em algumas modalidades, as células que expressam CAR destroem as células de suporte da doença, bloqueando indiretamente, dessa forma, o crescimento ou a sobrevivência das células causadoras de doenças.

[00188] Em certas modalidades, um antígeno de células estromais é selecionado dentre um ou mais dos seguintes: antígeno de células estromais

176 / 348 da medula óssea 2 (BST2), proteína de ativação de fibroblastos (FAP) e tenascina. Em uma modalidade, o anticorpo específico de FAP é, compete pela ligação com ou tem as mesmas CDRs que o sibrotuzumab. Nas modalidades, o antígeno MDSC é selecionado a partir de um ou mais dentre: CD33, CDllb, C14, CD15 e CD66b. Por conseguinte, em algumas modalidades, o antígeno de suporte a doenças é selecionado a partir de um ou mais dos seguintes: antígeno de células estromais da medula óssea 2 (BST2), proteína de ativação de fibroblastos (FAP) ou tenascina, CD33, CDllb, C14, CD15 e CD66b.

[00189] Em outra modalidade, a divulgação fornece receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, que se liga ao mesmo epítopo em diferentes alvos descritos nas Tabelas 6A a C que qualquer um dos receptores imunes de ocorrência não natural da divulgação (por exemplo, CARs que têm a capacidade de competir de forma cruzada pela ligação a diferentes alvos com qualquer um dos CARs da divulgação). Em algumas modalidades, os domínios específicos de antígeno desses receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, podem ser derivados de fragmentos de vL, fragmentos de vH ou fragmentos de anticorpos scFv. Em algumas modalidades, os anticorpos de referência para estudos de competição cruzada para determinar o epítopo alvo reconhecido por um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, da divulgação são scFvs descritos na Tabela 6C neste documento tendo sequências como mostrado nas SEQ ID NOs: 4.555 a 4815, 11.165 a 11.401, 15.070 a 15.132 (Tabela 6C) ou conforme descrito nas Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em uma modalidade exemplificativa, o scFv FMC63 de referência (vL-vH) representado pela SEQ ID NO: 4.555 pode ser usado em estudos de concorrência cruzada para determinar o epítopo alvo reconhecido pelos CARs convencionais e estruturas principais baseados em FMC63 da divulgação. Em algumas modalidades, os fragmentos de vHH de referência para estudos de

177 / 348 competição cruzada para determinar o epítopo alvo reconhecido por um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, da divulgação descrito neste documento são fragmentos de vHH com sequências como mostrado nas SEQ ID NOs: 4.474 a 4.514. Em algumas modalidades, os suportes de ligação ao antígeno não imunoglobulínicos de referência para estudos de competição cruzada para estudos de competição cruzada para determinar o epítopo alvo reconhecido por um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, um CAR, da divulgação descrito neste documento são suportes de ligação ao antígeno não imunoglobulínicos com sequências como mostrado nas SEQ ID NOs: 4.515 a 4.519. Em algumas modalidades, os ligantes de referência para estudos de competição cruzada para determinar o epítopo alvo reconhecido por um CAR da divulgação descrito neste documento são ligantes com sequências SEQ ID Nos: 4.544 a 4.554. Em algumas modalidades, os CARs de referência para estudos de competição cruzada contra diferentes alvos são CARs cujas SEQ IDs são mostrados nas Tabelas 10 a 14.

[00190] Em outra modalidade, os anticorpos de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos alvo reconhecidos pelos CARs de direcionados a MPL da divulgação são anticorpos mAb-1.6, mAb-

1.111, mAb-1.75, mAb-1.78, mAb-1.169 e mAb-1.36 descritos no pedido de patente US 2012/0269814 A1.

[00191] Em outra modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a MPL da divulgação são scFvs tendo sequências como mostrado nas SEQ ID NOs: 4.720 a 4.727, na Tabela 6C ou conforme descrito nas Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379.

[00192] Em outra modalidade, os ligantes de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a MPL da divulgação são ligandos de TPO e mTPO com

178 / 348 sequências listadas nas SEQ ID NOs: 4.544 a 4.545.

[00193] Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a MPL da divulgação são CARs tendo sequências como mostrado nas SEQ ID NOs: 5.120 a 5.126.

[00194] Na modalidade preferencial, os CARs direcionados a MPL da divulgação se ligam a um epítopo correspondente às sequências mostradas na SEQ ID NO: 15.160.

[00195] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CD19 da invenção são scFvs tendo sequências como mostrado nas SEQ ID NOs: 4.555 a 4.568 e na Tabela 6C ou conforme descrito nas Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CD19 da invenção são CARs tendo sequências como mostrado nas SEQ ID NOs:

4.929 a 4.943.

[00196] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos-alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CD20 da invenção são scFvs direcionados a CD20 e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 6C ou conforme descrito nas Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a CD20 da invenção são CARs direcionados a CD20 e com SEQ IDs conforme listado nas Tabelas 12.

[00197] Na modalidade preferencial, os CARs direcionados a CD20 da divulgação se ligam aos epítopos correspondentes a uma ou mais das sequências mostradas nas SEQ ID NO: 15.149 a 15.154.

[00198] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de

179 / 348 competição cruzada para determinar os epítopos alvo reconhecidos pelos CARs direcionados a BCMA da invenção são scFvs direcionados a CD20 e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 6C ou conforme descrito nas Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada para determinar os epítopos alvo reconhecidos pelos CARs direcionados ao BCMA da invenção são CARs direcionados ao BCMA e com SEQ IDs conforme listado nas Tabelas 12.

[00199] Na modalidade preferencial, os CARs direcionados a BCMA da divulgação se ligam aos epítopos correspondentes a uma ou mais das sequências mostradas nas SEQ ID NO: 15.155 a 15.159.

[00200] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada contra CARs direcionados a DLL3 da invenção são scFvs direcionados a DLL3 e com SEQ IDs, conforme listado na Tabela 6C ou conforme descrito nas Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada contra os CARs direcionados a DLL3 da invenção são os CARs direcionados a DLL3 e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 12.

[00201] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada contra CARs direcionados a LAMP1 da invenção são scFvs direcionados a LAMP1 e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 6C ou conforme descrito nas Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada contra os CARs direcionados a LAMP1 da invenção são CARs direcionados a LAMP1 e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 12.

[00202] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada contra CARs direcionados a TROP2 da invenção são scFvs direcionados a TROP2 e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 6C ou conforme descrito nas Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379.

180 / 348 Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada contra os CARs direcionados a TROP2 da invenção são CARs direcionados a TROP2 e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 12.

[00203] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada contra CARs direcionados a PTK7 da invenção são scFvs direcionados a PTK7 e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 6C ou conforme descrito nas Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada contra os CARs direcionados a PTK7 da invenção são os CARs direcionados a PTK7 e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 12.

[00204] Em uma modalidade, os scFvs de referência para estudos de competição cruzada contra CD22, CD123, CD33, CD37, CD70, CD138, CS1, IL13Ra2, Receptor α de Folato, Receptor β de Folato, TCRB1, TCRB2, TCRγδ, CD30, Mesotelina, Her2, EGFRviii e os CARs direcionados ao HIV1 da invenção são scFvs direcionados a esses antígenos e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 6C ou conforme descrito nas Tabelas 5 e 6 do documento PCT/US2017/064379. Em outra modalidade, os CARs de referência para estudos de competição cruzada contra CD22, CD123, CD33, CD37, CD70, CD138, CS1, IL13Ra2, Receptor α de Folato, Receptor β de Folato, TCRB1, TCRB2, TCRγδ, CD30, Mesotelina, Her2, EGFRviii, e os CARs direcionados a HIV1 da invenção são os CARs direcionados a esses antígenos e com SEQ IDs conforme listado na Tabela 12.

[00205] Em algumas modalidades, os CARs descritos neste documento compreendem uma dobradiça ou uma região ligante entre o domínio de antígeno específico e o domínio transmembranar. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende qualquer um ou mais dentre CD8α humano ou um fragmento Fc de um anticorpo ou um equivalente funcional, fragmento ou derivado do mesmo, uma região de dobradiça de CD8α humano ou um anticorpo ou um equivalente funcional, fragmento ou derivado do mesmo,

181 / 348 uma região CH2 de um anticorpo, uma região CH3 de um anticorpo, uma sequência espaçadora artificial e combinações dos mesmos. Em modalidades exemplificativas, a região de dobradiça compreende qualquer um ou mais dentre (i) uma região de dobradiça, CH2 e CH3 de IgG4, (ii) uma região de dobradiça de IgG4, (iii) uma região de dobradiça e CH2 de IgG4, (iv) uma região de dobradiça de CD8α, (v) uma região de dobradiça, CH2 e CH3 de IgG1, (vi) uma região de dobradiça de IgG1, (vi) uma região de dobradiça e CH2 de IgG1, ou (vii) combinações dos mesmos.

[00206] Em algumas modalidades, dois ou mais domínios funcionais de receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, CARs, como descrito neste documento, são separados por um ou mais ligantes. Os ligantes são uma região de oligo ou polipeptídeos de cerca de 1 a 100 aminoácidos de comprimento, que ligam juntamente qualquer um dos domínios/regiões dos receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, CARs, da divulgação. Em algumas modalidades, os ligantes podem ter, por exemplo, 5 a 12 aminoácidos de comprimento, 5 a 15 aminoácidos de comprimento ou 5 a 20 aminoácidos de comprimento. Os ligantes podem ser compostos de resíduos flexíveis como glicina e serina, de modo que os domínios proteicos adjacentes estejam livres para se mover um em relação ao outro. Os ligantes mais longos, por exemplo aqueles com mais de 100 aminoácidos, podem ser usados em conexão com modalidades alternativas da divulgação e podem ser selecionados para, por exemplo, garantir que dois domínios adjacentes não interfiram estereotipicamente entre si.

[00207] Como descrito neste documento, os CARs descritos neste documento compreendem um domínio transmembranar. O domínio transmembranar pode compreender a sequência transmembranar de qualquer proteína que tem um domínio transmembranar, incluindo qualquer uma das proteínas transmembranares do tipo I, tipo II ou tipo III. O domínio transmembranar do CAR da divulgação também pode compreender uma

182 / 348 sequência hidrofóbica artificial. Os domínios transmembranares dos CARs descritos neste documento podem ser selecionados para que o domínio transmembranar não se dimerize. Em algumas modalidades, o CAR compreende qualquer uma das estruturas principais descritas neste documento com um domínio transmembranar selecionado a partir do domínio transmembranar de uma cadeia alfa, beta ou zeta de um receptor de célula T, CD3ε, CD3ζ, CD3γ, CD3δ, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, e/ou NKG2C.

[00208] Um domínio transmembranar pode incluir um ou mais aminoácidos adicionais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 a 15 aminoácidos) em cada extremidade da região transmembranar (por exemplo, um ou mais aminoácidos se estendendo extracelularmente e/ou um ou mais aminoácidos se estendendo intracelularmente) para a região transmembranar. Em um aspecto, o domínio transmembranar é contíguo com um dos outros domínios do CAR. Em uma modalidade, o domínio transmembranar pode ser da mesma proteína da qual o domínio de sinalização, domínio coestimulante ou domínio de dobradiça é derivado. Em outro aspecto, o domínio transmembranar não é derivado da mesma proteína da qual qualquer outro domínio do CAR é derivado.

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[00209] Em várias modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, componentes CAR das estruturais principais descritas neste documento, codificam zero, um, dois, três ou mais domínios de sinalização intracelular.

[00210] Como descrito neste documento, os receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, CARs, descritos neste documento podem opcionalmente compreender um domínio de sinalização intracelular. Esse domínio pode ser citoplasmático e pode transduzir o sinal da função efetora e direcionar a célula para desempenhar sua função especializada. Exemplos de domínios de sinalização intracelulares incluem, porém sem limitação, ςcadeia do receptor de células T ou de qualquer um de seus homólogos (por exemplo, cadeia η, CD3ε, CD3γ, CD3δ, FcεR1γ e cadeiasβ, cadeia MB1 (Igα), B29 (cadeia Igβ), etc.), polipeptídeos CD3 (Δ, δ e ε), tirosina-quinases da família Syk (Syk, ZAP 70, etc.), tirosina quinases da família src (Lck, Fyn, Lyn, etc.) e outras moléculas envolvidas na transdução de células T, como CD2, CD5 e CD28. Especificamente, o domínio de sinalização intracelular pode ser de cadeia zeta CD3 humano, FcγRIII, FcεRI, caudas citoplasmáticas de receptores Fc, motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) contendo receptores citoplasmáticos ou combinações dos mesmos. Domínios de sinalização intracelular adicionais serão evidentes para aqueles versados na técnica e podem ser usados em conexão com modalidades alternativas da invenção. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização de um ou mais dentre uma cadeia zeta CD3 humana, FcgRIII, FceRI, uma cauda citoplasmática de um receptor Fc, um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) contendo receptores citoplasmáticos e combinações dos mesmos.

[00211] Em várias modalidades, as moléculas de ácido nucleico

184 / 348 isoladas que codificam o receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, componentes das estruturas principais descritas neste documento, codificam zero, um, dois, três ou mais domínios coestimulantes. Em modalidades exemplificativas, o domínio coestimulante compreende um domínio de sinalização de qualquer um ou mais dentre CD28, CD137 (4- 1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 e combinações dos mesmos. Vários componentes de receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, CARs, da divulgação são fornecidos acima e em outros locais neste documento. Novamente, deve-se reconhecer que a divulgação fornece, por exemplo, CARs compreendendo um ecto-domínio compreendendo um domínio de ligação específico de antígeno conectado através de uma “dobradiça” de ligante a um domínio transmembranar, que por sua vez está ligado a um endo-domínio compreendendo um ou mais domínios estimulantes e, opcionalmente, um ou mais domínios de sinalização intracelular.

[00212] São fornecidos neste documento um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs convencionais 1 a 6 (Tabela 1) ou qualquer um ou mais das estruturas principais 1 a 72 descritas neste documento (Tabela 2).

[00213] São fornecidos neste documento, também, um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs convencionais 1 a 6. Em algumas modalidades, o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para um, dois, três ou mais antígenos nas células alvo, como células cancerígenas. Como descrito neste documento, cada componente do CAR é contíguo e no mesmo quadro de leitura com cada outro componente do CAR. Em algumas modalidades, o CAR que compreende a estrutural principal compreende mais de um domínio específico de antígeno, sendo que cada um dos domínios específicos do antígeno é contíguo e no mesmo quadro de leitura que os outros domínios

185 / 348 específicos do antígeno no mesmo CAR.

[00214] São fornecidos neste documento, também, um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as estruturas principais 1 a 10 compreendendo CAR I convencional e um módulo acessório que codifica uma molécula estimulante de NF-κB (por exemplo, vFLIP-K13, hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-K277A, FKBPx2- hNEMO-L753(251), FKBPx2-hNEMO-L600(200), FKBPx2-RIP-ID, IKK2- S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A ou suas variantes dos mesmos) como descrito neste documento. O módulo acessório nas estruturas principais 1 a 10 pode ser substituído por outros módulos acessórios que codificam moléculas diferentes, incluindo diferentes ativadores de NF-κB (por exemplo, K13-opt, hNEMO-K277A-delta-V249-K255 ou hNEMO-K277L, etc.). São fornecidos neste documento, também, um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as estruturas principais 11 a 12 compreendendo CAR I convencional e um módulo acessório que codifica IgSP-[hTRAC-opt2] e IgSP-[hTRBC-opt2]. Em algumas modalidades, o domínio específico de antígeno do CAR compreendendo estruturas principais-1 a 12 é específico para um, dois, três ou mais antígenos nas células alvo, como células cancerígenas. Como descrito neste documento, cada componente do CAR é contíguo e no mesmo quadro de leitura com cada outro componente do CAR que compreende estruturas principais 1 a 12. Em algumas modalidades, o CAR que compreende estruturais principais 1 a 12 compreende mais de um domínio específico de antígeno, sendo que cada um dos domínios específicos do antígeno é contíguo e no mesmo quadro de leitura que os outros domínios específicos do antígeno no mesmo CAR.

[00215] São fornecidos neste documento, também, um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as estruturas principais 13 a 22 compreendendo CAR II

186 / 348 convencional e um módulo acessório que codifica uma molécula estimulante de NF-κB (por exemplo, vFLIP-K13, hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO- K277A, FKBPx2-hNEMO-L753(251), FKBPx2-hNEMO-L600(200), FKBPx2-RIP-ID, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A ou variantes dos mesmos) como descrito neste documento. O módulo acessório nas estruturas principais 13 a 22 pode ser substituído por outros módulos acessórios que codificam moléculas diferentes, incluindo diferentes ativadores de NF-κB (por exemplo, K13-opt, hNEMO-K277A- delta-V249-K255 ou hNEMO-K277L, etc.). Em algumas modalidades, o domínio específico de antígeno do CAR compreendendo estruturas principais- 13-22 é específico para um, dois, três ou mais antígenos nas células alvo, como células cancerígenas. Como descrito neste documento, cada componente do CAR é contíguo e no mesmo quadro de leitura com cada outro componente do CAR compreendendo estruturas principais 13-24. Em algumas modalidades, o CAR que compreende estruturas principais 13-24 compreende mais de um domínio específico de antígeno, sendo que cada um dos domínios específicos do antígeno é contíguo e no mesmo quadro de leitura que os outros domínios específicos do antígeno no mesmo CAR.

[00216] São fornecidos neste documento, também, um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as estruturas principais 37 a 46 compreendendo Ab-TCR e um módulo acessório que codifica uma molécula estimulante de NF-κB (por exemplo, vFLIP-K13, hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-K277A, FKBPx2- hNEMO-L753(251), FKBPx2-hNEMO-L600(200), FKBPx2-RIP-ID, IKK2- S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A ou variantes dos mesmos) como descrito neste documento. O módulo acessório nas estruturas principais 37 a 46 pode ser substituído por outros módulos acessórios que codificam moléculas diferentes, incluindo diferentes ativadores de NF-κB (por exemplo, K13-opt, hNEMO-K277A-delta-V249-K255 ou

187 / 348 hNEMO-K277L, etc.).

[00217] São fornecidos neste documento, também, um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as estruturas principais 49 a 58 compreendendo cTCR/SIR de cadeia dupla e um módulo acessório que codifica uma molécula estimulante de NF-κB (por exemplo, vFLIP-K13, hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO- K277A, FKBPx2-hNEMO-L753(251), FKBPx2-hNEMO-L600(200), FKBPx2-RIP-ID, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A ou variantes dos mesmos) como descrito neste documento. O módulo acessório nas estruturas principais 49 a 58 pode ser substituído por outros módulos acessórios que codificam moléculas diferentes, incluindo diferentes ativadores de NF-κB (por exemplo, K13-opt, hNEMO-K277A- delta-V249-K255 ou hNEMO-K277L, etc.).

[00218] São fornecidos neste documento, também, um ou mais polipeptídeos codificados por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as estruturas principais 61 a 70 compreendendo cTCR/SIR de uma cadeia e meia e um módulo acessório que codifica uma molécula estimulante de NF-κB (por exemplo, vFLIP-K13, hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO- K277A, FKBPx2-hNEMO-L753(251), FKBPx2-hNEMO-L600(200), FKBPx2-RIP-ID, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A ou variantes dos mesmos) como descrito neste documento. O módulo acessório nas estruturas principais 61 a 70 pode ser substituído por outros módulos acessórios que codificam moléculas diferentes, incluindo diferentes ativadores de NF-κB (por exemplo, K13-opt, hNEMO-K277A- delta-V249-K255 ou hNEMO-K277L, etc.).

[00219] Em várias modalidades, os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura

188 / 348 principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal- 50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, compreendem uma, duas, três ou mais moléculas estimulantes de NF-κB (por exemplo, K13-vFLIP, K13opt, NEMO, NEMO K277A, NEMO-K277L humano, NEMO-K277A- DeltaV249-K255 humano ou NEMO K270A de camundongo ou variantes dos mesmos).

[00220] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutural principal-1, estrutural principal-2, estrutural principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal- 50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o receptor de trombopoietina, MPL. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD19. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico

189 / 348 de antígeno dos CARs é específico para CD20. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD22. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD23. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelo moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD30. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal-

190 / 348

38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD32. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD33. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD123. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD138. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura

191 / 348 principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD200R.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD276. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD324. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para BCMA.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que

192 / 348 fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CS1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para ALK1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para ROR1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CDH6. Em algumas modalidades,

193 / 348 são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelo moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CDH16. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CDH17. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CDH19. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou

194 / 348 estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para EGFRviii.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para Her2. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para Her3. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico da mesotelina.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-

195 / 348

14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o receptor alfa de folato.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal- 50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o receptor beta de folato.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CLL-1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CLEC5A.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem

196 / 348 parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o complexo de classe I de NY-ESO/MHC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o complexo de classe I de WT1/MHC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o complexo de

197 / 348 classe I de AFP/MHC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o complexo de classe I de HPV16-E7/MHC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o complexo de classe I de gp100/MHC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o complexo de classe I de hTERT/MHC.

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14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o complexo de classe I de MART1/MHC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico ao complexo de classe I de HTLV1-Tax/MHC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal- 49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o complexo de classe I de PR1/MHC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o complexo de classe I de HIV1-gag/MHC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que

199 / 348 codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para gp120 do envelope do HIV1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para DLL3. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para PTK7. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é

200 / 348 específico para TROP2. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para LAMP1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para Tim1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para TCR gama-delta.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-

201 / 348

49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico da cadeia constante do TCR beta1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para a cadeia constante do TCR beta2. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o CCG.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para B7H4. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste

202 / 348 documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para LHR.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para TSHR.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para Tn-Muc1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para TSLPR.

203 / 348 codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o fator tecidual.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para SSEA-4. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-32 ou estrutura principal-33, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para SLea.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o complexo de classe I de Muc1/MHC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas

204 / 348 moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para Muc16. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para NYBR-1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para IL13Ra2. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é

205 / 348 específico para IL11Ra.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para L1CAM.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para EpCAM1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para gpNMB.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49,

206 / 348 estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para GRP78. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para GPC3. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para GRPC5D.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para GFRa4. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura

207 / 348 principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para FITC.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD79b.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para Lym1. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para Lym2. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs

208 / 348 convencionais 1 a 4 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal- 38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CLD18A2. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 4 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal- 14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para o epítopo CD43 expresso em células de leucemia.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 4 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal-37, estrutura principal-38, estrutura principal- 49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para CD179a.

Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs que fazem parte dos CARs convencionais 1 a 6 ou fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61, em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico da porção Fc de um anticorpo (ou seja, Ig

209 / 348 Fc). Um CAR exemplificativo com o domínio específico de antígeno específico para Ig Fc é representado pela SEQ ID NO: 1.629 e contém o domínio extracelular de CD16-V158 como o domínio específico de antígeno. Em qualquer um dos anteriores, a molécula de ácido nucleico que codifica para o construo de CAR compreende adicionalmente uma sequência de codificação do ativador de NF-kB, ou alternativamente, uma sequência de codificação do ativador de NF-kB pode estar presente em uma segunda molécula de ácido nucleico.

[00221] As sequências de ácidos nucleicos que codificam para os componentes desejados dos receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, CARs e/ou uma sequência de codificação seletiva do ativador de NF-κB descrita neste documento podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, como, por exemplo, pesquisando bibliotecas de células que expressam a molécula de ácido nucleico derivando a molécula de ácido nucleico de um vetor conhecido por incluir o mesmo ou isolando diretamente de células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas padrão. Alternativamente, o ácido nucleico de interesse pode ser produzido sinteticamente, em vez de clonado.

[00222] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica os receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, CARs e/ou moléculas acessórias (por exemplo, uma sequência ativadora de NF-κB) descrita neste documento é fornecida como um transcrito de RNA mensageiro (mRNA). Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico que codifica os receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, CARs e/ou moléculas acessórias (por exemplo, uma sequência de codificação seletiva do ativador de NF-κB) descrita neste documento é fornecida como um construto de DNA.

[00223] Os métodos de clonagem e expressão serão evidentes para um indivíduo versado na técnica e podem ser como descrito no documento WO

210 / 348 2015/142675; Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 a 4, Cold Spring Harbor Press, NY; June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704 a 716; documento WO 01/96584; documento WO 01/29058; Pat. no US 6.326.193, cujo conteúdo de cada um dos mesmos é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade como se fosse apresentado neste documento. Os métodos físicos para a introdução de polinucleotídeos nas células hospedeiras, como transfecção de fosfato de cálcio e similares, são bem conhecidos na técnica e serão evidentes para um indivíduo versado na técnica. Em modalidades exemplificativas, esses métodos são apresentados em Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 a 4, Cold Spring Harbor Press, NY); Pat. US nos 5.350.674 e

5.585.362, cujo conteúdo de cada um dos mesmos é incorporado neste documento a título de referência na sua totalidade como se fosse apresentado neste documento. Em outra modalidade, um vetor CAR é transduzido em uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, causando perturbações transitórias na membrana celular usando um dispositivo de microfluido, conforme descrito no pedido de patente WO 2013/059343 A1 (PCT/US2012/060646) e em Ding X et al., Nat. Biomed. Eng. 1, 0039 (2017), o conteúdo de cada um dos quais é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade como se apresentado neste documento.

[00224] A divulgação fornece um construto de ácido nucleico recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ou mais domínios de ligação ao antígeno, em que as sequências de nucleotídeos que codificam cada um dos domínios de ligação ao antígeno são contíguas com e no mesmo quadro de leitura que as sequências de ácidos nucleicos que codificam a: (i) dobradiça/ligante

211 / 348 opcional, (ii) domínio transmembranar e (iii) domínio intracelular opcional ou (a) uma cadeia constante do receptor de células T. Uma cadeia constante de receptor de célula T exemplificativa que pode ser usada no construto de SIR inclui, porém sem limitação, cadeia constante TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, preTCRα e variantes e mutantes dos mesmos. Em algumas modalidades, uma sequência de codificação de ativador de NF-κB (por exemplo, um ativador seletivo de NF-κB) está no mesmo construto de ácido nucleico recombinante, mas, após a expressão, não está ligada ao receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, mas é, em vez disso, clivado (por exemplo, através de um ligante clivável de peptídeo) ou faz parte de sua próprio cassete de expressão no polinucleotídeo.

[00225] A divulgação também fornece um vetor ou vetores compreendendo uma sequência ou sequências de ácidos nucleicos que codificam um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, descrito neste documento e um módulo acessório. Em algumas modalidades, o módulo acessório codifica um ativador de NF-κB, por exemplo, um ativador seletivo de NF-κB. Em alguma modalidade, o ativador seletivo de NF-κB é um ativador de NF-κB de ocorrência não natural. Em uma modalidade, o receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, e o módulo acessório, por exemplo, um módulo acessório que codifica um ativador NF- κB, são codificados por um único vetor. Em outra modalidade, o receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, e o módulo acessório, por exemplo, um módulo acessório que codifica um ativador de NF-κB, são codificados por mais de um vetor. Em ainda outra modalidade, um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, e o módulo acessório, por exemplo, um módulo acessório que codifica um ativador de NF-κB, são, cada um, codificados por um vetor separado ou por ácidos nucleicos separados. Em uma modalidade, as duas unidades polipeptídicas funcionais (por exemplo, CAR e módulo acessório) são codificadas por um único vetor

212 / 348 ou um único ácido nucleico. Em uma modalidade, o vetor ou os vetores são escolhidos a partir de vetor (ou vetores) de DNA, vetor (ou vetores) de RNA, plasmídeo (ou plasmídeos), vetor (ou vetores) de lentivírus, vetor (ou vetores) adenoviral, vetor (ou vetores) retrovírus, vetor (ou vetores) de baculovírus, vetor (ou vetores) de transposão da Bela Adormecida ou transposão (ou transposôes) de piggyBac. Em uma modalidade, o vetor é um vetor de lentivírus ou um vetor retroviral. Em outra modalidade, o vetor é um vetor de transposão da Bela Adormecida. As sequências de ácidos nucleicos de vetores exemplificativas são fornecidas nas SEQ ID NO: 3.840 a 3.841. Os vetores pLenti-EF1α (SEQ ID NO: 3.840) e pLenti-EF1α-DWPRE (SEQ ID NO:

3.841) são vetores lentivirais vazios que diferem pelo fato de que pLenti- EF1α-DWPRE não tem a região WPRE. A sequência de ácidos nucleicos do vetor pCCL3-MNDU3-WPRE é dada na SEQ ID NO: 7.779. Uma sequência de codificação do receptor imune de ocorrência não natural da divulgação pode ser clonada entre os locais NheI e SalI nesses vetores.

[00226] Um vetor retroviral também pode ser, por exemplo, um vetor gamarretroviral. Um vetor gamaretroviral pode incluir, por exemplo, um promotor, um sinal de empacotamento (ψ), um local de ligação ao iniciador (PBS), uma ou mais (por exemplo, duas) repetições terminais longas (LTR) e um transgene de interesse, por exemplo, um gene que codifica um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR. Um vetor gamaretroviral pode não ter genes estruturais virais, como gag, pol e env. Vetores gamarretrovirais incluem o vírus da leucemia murina (MLV), o vírus formador do foco do baço (SFFV) e o vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV) e vetores derivados do mesmo. Outros vetores gamaretrovirais são descritos, por exemplo, em Tobias Maetzig et al., vírus de “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application”. Junho de 2011; 3 (6): 677 a

713. Em outra modalidade, o vetor compreendendo o ácido nucleico que codifica os receptores imunes de ocorrência não natural desejados da

213 / 348 divulgação é um vetor adenoviral (A5/35).

[00227] Em algumas modalidades, um vetor da divulgação pode ainda compreender um promotor. Exemplos não limitantes de um promotor incluem, por exemplo, um promotor MNDU3, um promotor do gene CMV IE, um promotor de EF-la, um promotor de ubiquitina C, um promotor de núcleo ou um promotor de fosfoglicerato quinase (PGK). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de EF-1. Em algumas modalidades, o vetor compreende uma cauda de poli(A). Em algumas modalidades, o vetor compreende um 3'UTR.

[00228] A divulgação também inclui um construto de RNA que pode ser diretamente transfectado em uma célula. Um método para gerar ARNm para utilização em transfecção envolve transcrição (IVT) in vitro de um modelo com os iniciadores especialmente projetados, seguido por adição poli A, para produzir um construto contendo sequência não traduzida em 3' e 5' ('UTR') (por exemplo, uma UTR em 3’ e/ou 5' descrita neste documento), um cap de 5’ (por exemplo, um cap de 5' descrito neste documento) e/ou Local Interno de Entrada de Ribossomo (IRES) (por exemplo, um IRES descrito neste documento), o ácido nucleico a ser expresso e uma cauda poli A, tipicamente com 50 a 2.000 bases de comprimento (SEQ ID NO: 3.855). O RNA assim produzido pode transfectar eficientemente diferentes tipos de células. Em uma modalidade, o modelo inclui sequências para o receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, e/ou a molécula estimulante de NF-kB. Em uma modalidade, um vetor CAR-NFκB de RNA é transduzido em uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, por eletroporação. Em outra modalidade, um vetor CAR de RNA e/ou um vetor ativador de NF-κB é transduzido em uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, causando perturbações transitórias na membrana celular usando um dispositivo de microfluido. As diferentes cadeias (ou unidades polipeptídicas funcionais) também podem ser introduzidas em uma célula

214 / 348 usando um ou mais dentre um vetor, uma combinação de diferentes vetores ou técnicas. Em outra modalidade, um receptor de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, pode ser introduzido utilizando um vector retroviral, enquanto o módulo acessório que codifica um ativador de NF-kB é introduzido utilizando um vector lentiviral. Em outro aspecto, um receptor de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, é introduzido utilizando um vector lentiviral, enquanto o módulo acessório (por exemplo, um ativador de NF-kB) é introduzido utilizando um transposão de Bela Adormecida. Em ainda outro aspecto, um receptor de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, é introduzido utilizando um vector lentiviral, enquanto o módulo acessório (por exemplo, um ativador de NF-kB) é introduzido usando uma transfecção de ARN. Em ainda outro aspecto, um receptor de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, é produzido em uma célula por recombinação genética nos locais da cadeia de TCR endógena utilizando técnicas de alvejamento de gene conhecidas na arte, enquanto o módulo de acessório é introduzido usando um vetor lentiviral ou retroviral.

[00229] O RNA pode ser introduzido nas células alvo usando qualquer um de vários métodos diferentes, por exemplo, métodos disponíveis comercialmente que incluem, porém sem limitação, eletroporação (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colônia, Alemanha)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Massachusetts) ou o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colorado), Multiporator (Eppendort, Hamburgo Alemanha), transfecção mediada por lipossomas catiônicos usando lipofecção, encapsulamento de polímeros, transfecção mediada por peptídeos ou sistemas de distribuição de partículas como “armas de genes” (consultar, por exemplo, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12 (8): 861 a 870 (2001) ou causando perturbações transitórias nas membranas celulares usando um dispositivo microfluídico (consultar, por exemplo, pedidos de patente WO 2013/059343 A1 e PCT/US2012/060646).

215 / 348

[00230] Em algumas modalidades, o método não viral inclui o uso de um transposão (também chamado de elemento de transposão). Em algumas modalidades, um transposão é um pedaço de DNA que pode se inserir em um local em um genoma, por exemplo, um pedaço de DNA que é capaz de se autorreplicar e inserir sua cópia em um genoma ou um pedaço de DNA que pode ser emendado a partir de um ácido nucleico mais longo e inserido em outro local em um genoma. Por exemplo, um transposão compreende uma sequência de DNA composta por genes de flanqueamento de repetições invertidas para transposição.

[00231] Métodos exemplificativos de entrega de ácido nucleico usando um transposão incluem um sistema de transposão da Bela Adormecida (SBTS) e um sistema de transposão piggyBac (PB). Consultar, por exemplo, Aronovich et al. Cantarolar. Mol. Genet. 20.R1 (2011): R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15 (2008): 2.961 a 2.971; Huang et al. Mol. Ther. 16 (2008): 580 a 589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18 (2010): 1.200 a 1.209; Kebriaei et al. Blood. 122.21 (2013): 166; Williams. Molecular Therapy 16.9 (2008): 1.515 a 1.516; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12 (2007): 3.153 a 3.165; e Ding et al. Cell.

122.3(2005): 473 a 483, todos os quais são incorporados neste documento a título de referência.

[00232] O SBTS inclui dois componentes: 1) um transposão contendo um transgene e 2) uma fonte da enzima transposase. A transposase pode transpor o transposão de um plasmídeo transportador (ou outro DNA doador) para um DNA alvo, como um cromossomo/genoma da célula hospedeira. Por exemplo, a transposase se liga ao plasmídeo transportador/DNA doador, corta o transposão (incluindo transgene (ou transgenes)) do plasmídeo e o insere no genoma da célula hospedeira. Consultar, por exemplo, Aronovich et al. supra.

[00233] Transposões exemplificativos incluem um transposão à base de pT2. Consultar, por exemplo, Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3 (2013): 1.829 a 1.847; e Singh et al. Cancer Res. 68.8 (2008): 2.961 a 2.971,

216 / 348 todos os quais são incorporados neste documento a título de referência. Transposases exemplificativas incluem uma transposase Tc1/do tipo mariner, por exemplo, a transposase SB 10 ou a transposase SB 11 (uma transposase hiperativa que pode ser expressa, por exemplo, de um promotor de citomegalovírus). Consultar, por exemplo, Aronovich et al.; Kebriaei et al.; e Grabundzija et al., todos os quais são incorporados aqui a título de referência.

[00234] O uso do SBTS permite a integração e expressão eficientes de um transgene, por exemplo, um ácido nucleico que codifica um CAR e/ou um ativador de NF-κB descrito neste documento. São fornecidos neste documento métodos de geração de uma célula, por exemplo, célula T ou NKT ou célula-tronco ou iPSC ou célula T sintética, que expressa de maneira estável um CAR e/ou um ativador de NF-κB descrito neste documento, por exemplo, usando um sistema de transposão como o SBTS.

[00235] De acordo com os métodos descritos neste documento, em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos, por exemplo, plasmídeos, contendo os componentes SBTS são entregues a uma célula (por exemplo, célula T ou NKT ou célula-tronco ou iPSC ou célula T sintética). Por exemplo, os ácidos nucleicos são entregues por métodos padrão de entrega de ácido nucleico (por exemplo, DNA plasmídico), por exemplo, métodos descritos neste documento, por exemplo, eletroporação, transfecção ou lipofecção. Em algumas modalidades, o ácido nucleico contém um transposão que compreende um transgene, por exemplo, um ácido nucleico que codifica um receptor de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, e/ou um ativador de NF-kB descrito neste documento. Em algumas modalidades, o ácido nucleico contém um transposão que compreende um transgene (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um receptor de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, e/ou um ativador de NF-kB descrito neste documento), bem como uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma enzima transposase. Em outras modalidades, é fornecido um sistema com dois

217 / 348 ácidos nucleicos, por exemplo, um sistema de plasmídeo duplo, por exemplo, em que um primeiro plasmídeo contém um transposão compreendendo um transgene e um segundo plasmídeo contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma enzima transposase. Por exemplo, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são entregues codificados em uma célula hospedeira.

[00236] Como descrito acima e em outras partes deste documento, a divulgação demonstra que a coexpressão de um receptor imune (por exemplo, um CAR, um TCR endógeno ou um TCR recombinante) da divulgação com uma molécula estimulante de NF-κB (por exemplo, um ativador de NF-κB seletivo, por exemplo, um agente ativador de NF-κB de ocorrência não natural, por exemplo, hNEMO-K277A) melhora as funções das células imunes, como sobrevivência, expansão, proliferação, ativação, persistência, produção de citocinas e atividade in vivo. Em algumas modalidades, o receptor imune é um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR ou TCR recombinante). Em algumas modalidades, o receptor imune é um receptor imune de ocorrência natural (por exemplo, um TCR nativo). Em uma modalidade, uma molécula estimulante de NF-κB é coexpressa com um CAR de primeira geração, segunda geração, terceira geração, TFP, AbTCR ou SIR. Como mencionado acima, a molécula estimulante de NF-κB pode estar, mas de preferência não está, ligada a uma estrutura principal CAR, TCR ou SIR. Além disso, em certas modalidades, um CAR da divulgação não inclui um domínio CD28 ou 41BB e, opcionalmente, inclui um domínio CD3.

[00237] Em uma modalidade, a divulgação demonstra que a expressão de um ativador NF-κB seletivo melhora as funções das células imunes (por exemplo, células T, células dendríticas, células CAR-T ou células TCR-T, etc.), como sobrevivência, expansão, proliferação, ativação, persistência, produção de citocinas e atividade in vivo. Um ativador seletivo de NF-κB, como descrito neste documento, se refere a um agente que ativa a via de sinalização de NF-κB seletivamente sem ou com ativação mínima das outras

218 / 348 vias de sinalização. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB ativa a via de sinalização de NF-κB sem ativação ou ativação mínima de uma ou mais vias de sinalização selecionadas do grupo de AKT, PI3K, JNK, p38 quinase, ERK, JAK/STAT e vias de sinalização de interferon. São conhecidos na técnica vários métodos para medir a ativação das vias de sinalização de NF-κB, AKT, PI3K, JNK, p38 quinase, ERK, JAK/STAT e interferon. Esses ensaios podem ser utilizados nos métodos da divulgação isoladamente ou em combinações para identificar ativadores seletivos da via NF-κB.

[00238] Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via AKT conforme medido usando o anticorpo Phospho-Akt (Ser473) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle. Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via JNK, conforme medido usando o anticorpo Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (por exemplo, clone G9; Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto a ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle. Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA), mas

219 / 348 menos de 20% de aumento na atividade da via da p38 quinase conforme medido usando o anticorpo Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (por exemplo, clone D3F9; Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto a ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via STAT conforme medido usando o anticorpo Phospho-Stat1 (Tyr701) (por exemplo, Clone D4A7 ; Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF- κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA), mas um aumento inferior a 20% na atividade da via STAT conforme medido usando o anticorpo Phospho-Stat2 (Tyr690) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF- κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via STAT conforme medido usando o anticorpo Phospho-Stat3 (Tyr705) (por exemplo, Clone D3A7, Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto ou expresso em uma célula T humana de teste em

220 / 348 comparação com uma célula T humana de controle. Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via STAT conforme medido usando o anticorpo Phospho-Stat5 (Tyr694) (por exemplo, Clone D47E7 Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto a ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle. Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF- κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via ERK, conforme medido usando Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (por exemplo, Clone D13.14.4E, Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto a ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

[00239] Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-IκBα (Ser32) (por exemplo, 14D4, Tecnologia de Sinalização Celular de Clonagem; em Danvers, MA), mas com aumento inferior a 20% na atividade da via AKT conforme medido usando o anticorpo Phospho-Akt (Ser473) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle. Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento

221 / 348 na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-IκBα (Ser32) (por exemplo, 14D4, Tecnologia de Sinalização Celular de Clonagem; em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via JNK, conforme medido usando o anticorpo Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (por exemplo, clone G9; Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-IκBα (Ser32) (por exemplo, 14D4, Tecnologia de Sinalização Celular de Clonagem; em Danvers, MA), mas um aumento inferior a 20% na atividade da via da p38 quinase conforme medido usando o anticorpo Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (por exemplo, clone D3F9; Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-IκBα (Ser32) (por exemplo, 14D4, Tecnologia de Sinalização Celular de Clonagem; em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via STAT conforme medido usando o anticorpo Phospho-Stat1 (Tyr701) (por exemplo, Clone D4A7; Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto a ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-IκBα (Ser32) (por exemplo, 14D4, Tecnologia de

222 / 348

Sinalização Celular de Clonagem; em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via STAT conforme medido usando o anticorpo Phospho-Stat2 (Tyr690) (Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-IκBα (Ser32) (por exemplo, 14D4, Tecnologia de Sinalização Celular de Clonagem; em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via STAT conforme medido usando o anticorpo Phospho-Stat3 (Tyr705) (por exemplo, Clone D3A7, Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto a ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-IκBα (Ser32) (por exemplo, 14D4, Tecnologia de Sinalização Celular de Clonagem; em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via STAT conforme medido usando o anticorpo Phospho-Stat5 (Tyr694) (por exemplo, Clone D47E7, Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando exposto a ou expresso em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB induz mais de 20% (por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) de aumento na atividade de NF-κB conforme medido usando o anticorpo Phospho-IκBα (Ser32) (por exemplo, 14D4, Tecnologia de Sinalização Celular de Clonagem; em Danvers, MA), mas menos de 20% de aumento na atividade da via ERK conforme medido usando Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)

223 / 348 (Thr202/Tyr204) (por exemplo, Clone D13.14.4E, Tecnologia de Sinalização Celular em Danvers, MA) quando expostos a ou expressos em uma célula T humana de teste em comparação com uma célula T humana de controle.

[00240] Métodos alternativos para medir a ativação das vias de sinalização NF-κB, AKT, JNK, p38, ERK, JAK/STAT e interferon são conhecidos na técnica e podem ser usados para identificar ativador seletivo da via de sinalização de NF-κB. Por exemplo, um ativador seletivo de NF-κB induz um aumento maior na atividade de ligação ao DNA de NF-κB quando exposto ou expresso em uma célula alvo (por exemplo, uma célula T ou célula 293FT) em comparação ao aumento em atividades de ligação ao DNA de c- Jun, c-Fos, JunD, ATF2, STAT3, NFAT1c, ELK-1, CREB, IRF3 ou IRF7. Estão disponíveis comercialmente kits para medir atividades de ligação ao DNA de diferentes fatores de transcrição pertencentes a diferentes vias de sinalização (por exemplo, Ensaios de Fator de Transcrição TransAM®; Motivo Ativo) e podem ser usados para identificar ativador seletivo da via de sinalização de NF-κB.

[00241] Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB induz maior aumento na razão de aumento da fosforilação de IκBα para aumentar a fosforilação de AKT em comparação com CD28 quando ambos são expressos em células T humanas ou quando a sinalização através de ambos é ativada em células T humanas em condições comparáveis. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB induz um aumento maior na razão de aumento da fosforilação de IκBα para aumentar a fosforilação de AKT em comparação com 41BB quando ambos são expressos em células T humanas em condições comparáveis ou quando a sinalização através de ambos é ativada em células T humanas em condições comparáveis. Em uma modalidade, um ativador de NF-kB seletivo quando coexpresso com um CAR de 1a geração sem um domínio coestimulante induz maior aumento da razão de aumento em fosforilação de IκBα para aumentar em fosforilação de Akt em comparação

224 / 348 com um CAR de 2ª geração contendo um domínio coestimulante de CD28 quando ambos são expressos em células T humanas e expostos a células contendo antígeno alvo em condições comparáveis.

Em uma modalidade, um ativador de NF-kB seletivo quando coexpresso com um CAR de 1a geração sem um domínio coestimulante (por exemplo, um CAR representado pela SEQ ID NO: 1.016) induz maior aumento da razão de aumento em fosforilação de IκBα para aumento na fosforilação de AKT em comparação com um CAR de 2ª geração contendo um domínio coestimulante de 41BB (por exemplo, um CAR representado pela SEQ ID NO: 1.318) quando ambos são expressos em células T humanas e expostos a células contendo antígeno alvo (por exemplo, RAJI) em condições comparáveis.

Por exemplo, as células T que expressam o CAR de primeira geração direcionado a CD19 que coexpressam K13 (CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A- PAC; SEQ ID NO: 1.016) mostram maior aumento na razão de fosforilação de IκBα para fosforilação de AKT em comparação com células T que expressam o CAR de 2ª geração direcionado a CD19 com domínio coestimulante de 41BB (CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC; SEQ ID NO: 1.318) quando ambas as células CAR-T são expostas a células RAJI na razão E:T de 1:5 por 1 a 24 horas.

A fosforilação de IκBα e AKT é calculada usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, imunotransferência ou citometria de fluxo) usando anticorpos específicos para suas formas fosforiladas.

O aumento da fosforilação de IκBα é calculado subtraindo a fosforilação de IκBα em células T de controle sem a expressão de CAR da fosforilação de IκBα em células CAR-T após exposição a células RAJI.

O aumento da fosforilação de AKT é calculado subtraindo a fosforilação de AKT em células T de controle sem a expressão de CAR da expressão de CAR da fosforilação de AKT em células CAR-T após exposição a células RAJI.

A razão de aumento de IκBα para aumentar a fosforilação de AKT é calculada dividindo-se o aumento na fosforilação de IκBα do aumento

225 / 348 na fosforilação de AKT.

[00242] Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB induz maior aumento na razão de aumento da fosforilação de p65/RelA para aumentar a fosforilação de AKT em comparação com CD28 quando ambos são expressos em células T humanas ou quando a sinalização através de ambos é ativada em células T humanas em condições comparáveis. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-κB induz maior aumento de vezes na razão de aumento na fosforilação de p65/RelA para aumentar na fosforilação de AKT em comparação com 41BB quando ambos são expressos em células T humanas em condições comparáveis ou quando a sinalização através de ambos é ativada em células T humanas sob condições comparáveis. Em uma modalidade, um ativador seletivo de NF-kB quando coexpresso com um CAR de 1a geração sem um domínio coestimulante induz maior aumento da razão de aumento em fosforilação de p65/RelA para aumentar em fosforilação de Akt quando comparada com um CAR de 2a geração contendo um domínio coestimulante de CD28 quando ambos são expressos em células T humanas e expostos a células contendo antígeno alvo em condições comparáveis. Em uma modalidade, um ativador de NF-kB seletivo quando coexpresso com um CAR de 1a geração sem um domínio coestimulante (por exemplo, um CAR representado pela SEQ ID NO: 1.016) induz maior aumento da razão de aumento em fosforilação de p65/RelA para aumento da fosforilação de Akt quando comparado com um CAR de 2a geração contendo um domínio coestimulante 41BB (por exemplo, um CAR representado pela SEQ ID NO:

1.318) quando ambos são expressos em células T humanas e expostos a células contendo antígeno alvo (por exemplo, RAJI) em condições comparáveis. Por exemplo, as células T que expressam o CAR de primeira geração direcionado a CD19 que coexpressam K13 (CD8SP-FMC63-(vL- vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC; SEQ ID NO: 1.016) mostram maior aumento na razão entre fosforilação de p65/RelA e fosforilação de Akt em

226 / 348 comparação com as células T que expressam o CAR de 2a geração direcionado a CD19 com o domínio coestimulante 41BB (CD8SP-FMC63- (VL-vH)-Myc-BBz-T2A-APA; SEQ ID NO: 1.318) quando ambas as células CAR-T são expostas a células RAJI na razão Efetor:Alvo (E:T) de 1:5 por entre 1 a 24 horas (por exemplo, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 12 horas ou 24 horas). A fosforilação de p65/RelA e AKT é calculada usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, imunotransferência ou citometria de fluxo) usando anticorpos específicos para suas formas fosforiladas. O aumento na fosforilação de p65/RelA é calculado subtraindo a fosforilação de p65/RelA em células T de controle sem a expressão de CAR da fosforilação de p65/RelA em células CAR-T depois que ambas são expostas a células RAJI. O aumento na fosforilação de AKT é calculado subtraindo a fosforilação de AKT em células T de controle sem a expressão de CAR da fosforilação de AKT em células CAR-T depois de ambas serem expostas a células RAJI. A razão entre o aumento de p65/RelA e o aumento da fosforilação de AKT é calculada dividindo o aumento na fosforilação de p65/RelA do aumento na fosforilação de AKT.

[00243] Em uma modalidade, um ativador de NF-kB seletivo quando coexpresso com um CAR de 1a geração sem um domínio coestimulante (por exemplo, um CAR representado pela SEQ ID NO: 1.016) induz maior aumento da razão de aumento em fosforilação de IκBα para aumento na fosforilação de JNK, ERK ou p38 quinase em comparação com um CAR de 2a geração contendo um domínio coestimulante de 41BB (por exemplo, um CAR representado pela SEQ ID NO: 1.318) quando ambos são expressos em células T humanas e expostos ao antígeno alvo contendo células (por exemplo, RAJI) por um intervalo de tempo apropriado (por exemplo, 1 a 24 horas) em condições comparáveis. Em uma modalidade, um ativador de NF- kB seletivo quando coexpresso com um CAR de 1a geração sem um domínio coestimulante (por exemplo, um CAR representado pela SEQ ID NO: 1.016)

227 / 348 induz maior aumento da razão de aumento em fosforilação de p65/RelA para aumento em fosforilação de JNK, ERK ou p38 quinase em comparação com um CAR de 2a geração contendo um domínio coestimulante 41BB (por exemplo, um CAR representado pela SEQ ID NO: 1.318) quando ambos são expressos em células T humanas e expostos a direcionar células contendo antígeno (por exemplo, RAJI) por um intervalo de tempo apropriado (por exemplo, 1 a 24 horas) em condições comparáveis.

[00244] Em uma modalidade, um ativador de NF-κB, incluindo um ativador seletivo de NF-κB, é um agente de ocorrência não natural e é expresso na célula exogenamente. Em uma modalidade, o ativador seletivo de NF-kB é de origem viral, isto é, que é codificado por um vírus ou é derivado de uma proteína codificada por vírus ou tem um domínio de mais de 10 resíduos de aminoácidos (por exemplo, mais de 15 resíduos de aminoácidos, 20 resíduos de aminoácidos, 30 resíduos de aminoácidos ou 50 resíduos de aminoácidos) com mais de 80% (por exemplo, mais de 85%, 90%, 95%, ou 99%) de identidade com uma ou mais proteínas virais. Um ativador NF-κB seletivo exemplificativo de origem viral é o vFLIP K13 (SEQ ID NO:) que é derivado do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi. Em outra modalidade, o ativador seletivo de NF-κB é de origem celular ou de mamífero. Ativadores seletivos de NF-kB exemplificativos de origem mamífera são mutante NEMO-K277A humano, mutante NEMO-K277- deltaV249-K255 humano, mutante NEMO-K270A de camundongo, IKK2- S177E-S181E e IKK1-S176E-S180E. Em outra modalidade, o ativador seletivo de NF-κB é de origem humana; isto é, tem um domínio com mais de 10 resíduos de aminoácidos (por exemplo, mais de 15 resíduos de aminoácidos, 20 resíduos de aminoácidos, 30 resíduos de aminoácidos ou 50 resíduos de aminoácidos) com mais de 80% (por exemplo, mais de 85%, 90%, 95% ou 99%) de identidade com uma ou mais proteínas humanas. Em algumas modalidades, um ativador seletivo de NF-κB é composto por duas ou

228 / 348 mais proteínas de fusão (por exemplo, FKBPx2-NEMO). Em algumas modalidades, os dois ou mais parceiros de fusão de um ativador NF-κB seletivo são, cada um, derivados de proteínas humanas ou têm mais de 80% de identidade com as proteínas humanas.

[00245] Em algumas modalidades, o ativador seletivo de NF-κB é codificado pela sequência de ácidos nucleicos do tipo selvagem, enquanto em outras modalidades o ativador seletivo de NF-κB é codificado pela sequência de ácidos nucleicos otimizada por códon ou uma sequência mutante. Em uma modalidade exemplificativa, o vFLIP K13 é codificado pela sequência de ácidos nucleicos otimizada para códon humano, por exemplo, K13-opt (SEQ ID NO: 7.768).

[00246] Em algumas modalidades, as células imunes expressam um único ativador seletivo de NF-κB, enquanto em outras modalidades as células imunes expressam mais de um ativador seletivo de NF-κB (por exemplo, NEMO-K277A mais K13-opt ou IKK2-S177E-S181E mais IKK1-S176E- S180E).

[00247] Em algumas modalidades, o ativador seletivo de NF-κB é expresso em uma célula imune de uma maneira constitutiva. Em outras modalidades, o ativador seletivo de NF-κB é expresso em uma célula imune de uma maneira induzível. Em uma modalidade exemplificativa, a expressão induzível de um ativador seletivo de NF-κB pode ser alcançada através do uso de um promotor induzível. Exemplos de promotores induzíveis incluem, porém sem limitação, um promotor induzível por metalotionina, um promotor induzível por glicocorticoides, um promotor induzível por progesterona e um promotor induzível por tetraciclina. O sistema RheoSwitch® representa outra plataforma reguladora da transcrição para controlar a expressão de uma proteína.

[00248] Os métodos para controlar a atividade das proteínas são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para controlar a atividade do

229 / 348 ativador de NF-κB, incluindo o ativador seletivo de NF-κB. Em uma modalidade exemplificativa, isso envolve a expressão na célula alvo, como uma célula T ou uma célula NK, de um NEMO ou mutante NEMO fundido a um domínio de dimerização ou um domínio de comutação. Em uma modalidade exemplificativa, o domínio do comutador compreende uma ou mais cópias de um domínio FKBP12 ou de um domínio FKBP12v36. Em algumas modalidades, o domínio de comutação é anexado ao terminal carboxi do ativador NF-κB (por exemplo, NEMO), enquanto em outras modalidades o domínio de comutação é anexado ao terminal amino do ativador NF-κB (por exemplo, NEMO). A exposição de células alvo que expressam essa proteína de fusão a um dimerizador adequado (por exemplo, Rimiducid) resulta em oligomerização de NEMO, que por sua vez leva à ativação de NF-κB. Em uma modalidade alternativa, a atividade dos ativadores seletivos de NF-κB também pode ser controlada fundindo os mesmos ao domínio de ligação ao ligante de um receptor de estrogênio mutado, conforme foi descrito (Matta H et al., Journal of Biological Chemistry, 282, 34 2007). O receptor de estrogênio mutado não se liga ao ligante fisiológico estrogênio, mas se liga com uma afinidade muito alta ao ligante sintético 4-OHT (4- hidroxitamoxifeno) e regula a atividade do parceiro de fusão (por exemplo, ativador NF-κB, por exemplo, vFLIP K13 ou NEMO) de maneira dependente de 4-OHT.

[00249] Em algumas modalidades, o ativador seletivo de NF-κB é expresso nas células imunes por alteração em sua cópia genômica usando técnicas de edição de genes conhecidas na arte. Em uma modalidade exemplificativa, um sistema de edição de genes (por exemplo, TALON, nuclease de dedo de Zn ou CRISP/Cas9) é usado para converter um ou ambos os alelos de NEMO humano em forma mutante de NEMO-K277A humano. Em outra modalidade exemplificativa, um sistema de edição de genes é usado para converter um ou ambos os alelos de NEMO humano na forma mutante

230 / 348 de NEMO-K277A-delta-V249-K255 humano. A sequência de construtos de alvejamento de gene NEMO humano que podem ser usados para induzir mutações K277A e K277A-delta-V249-K255 é fornecida nas SEQ ID NO:

7.771 e 7.772, respectivamente. Essas sequências podem ser clonadas em um vetor adequado (por exemplo, vetor lentiviral com defeito de integração, vetor AAV ou vetor adenoviral). Exemplos de sequências alvo genômicas para NEMO humano para que os gRNAs de CRISP/Cas9 compreendendo sequências de alvejamento complementares podem ser gerados são fornecidos em SEQ ID NO: 7.759 a 7.762. As sequências de gRNA são clonadas no vetor pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene). Alternativamente, as sequências de gRNA podem ser clonadas no vetor pLenti-CRISPR-v2 disponível na Addgene (Plasmídeo #52961) e seguindo as instruções fornecidas pelo distribuidor. A introdução do construto de alvejamento NEMO e dos construtos de codificação de gRNA nas células T é realizada essencialmente como descrito anteriormente (Knipping F et al, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, Vol. 4, 2017).

[00250] Em outra modalidade ou modalidade adicional de qualquer uma das modalidades anteriores descritas neste documento, as células efetoras imunes que expressam um módulo acessório que codifica um ativador NF-κB seletivo (por exemplo, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-deltaV249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E ou IKK1-S176E-S180E) mostram melhoria em atividade in vitro (por exemplo, antígeno alvo induziu produção de IL-2, proliferação, expansão e atraso em diferenciação terminal, atraso na senescência, etc.) contra uma célula que expressa o antígeno alvo em comparação com uma célula efetora imune correspondente que não tem o módulo acessório quando comparada em condições semelhantes. A ativação de NF-κB nas células efetoras imunes é medida usando técnicas conhecidas na arte, incluindo, porém sem limitação, medição de IκBα fosforilada, p65 fosforilada, translocação nuclear de IκBα, p65 total, regulação crescente de

231 / 348 genes responsivos a NF-κB, ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA) e ensaio de repórter à base de NF-κB, etc.

Em algumas modalidades, a ativação seletiva de NF-κB é determinada medindo o aumento de vezes na ativação de NF-κB nas células efetoras imunes sobre o aumento da ativação da via de AKT.

Em algumas modalidades, as células efetoras imunes que expressam um módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-κB (por exemplo, K13-opt (K13 otimizado por códon humano) ou hNEMO-K277A) mostram maior atividade in vitro (por exemplo, produção de IL2 induzida por antígeno alvo, proliferação, expansão e atraso na diferenciação terminal e atraso na senescência) em direção às células que expressam antígeno alvo em comparação com as células efetoras imunes correspondentes que não têm a expressão de um módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-κB (por exemplo, K13-opt ou hNEMO- K277A) quando ambos são testados sob condições experimentais semelhantes.

Em modalidades exemplificativas, as células efetoras imunes que expressam CD19-CAR que expressam um módulo acessório que codifica um ativador NF-κB seletivo (por exemplo, K13-opt (K13 otimizado por códon humano) ou hNEMO-K277A) mostram maior atividade in vitro (por exemplo, produção de IL2 induzida por antígeno alvo, proliferação, expansão e atraso na diferenciação terminal e atraso na senescência) em direção às células Nalm6 em comparação com as células efetoras que expressam CD19- CAR correspondentes que não expressam um módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-κB (por exemplo, K13-opt ou hNEMO-K277A) quando ambos são testados em condições experimentais semelhantes.

Em algumas modalidades, a atividade in vitro (por exemplo, produção de IL2 induzida por antígeno alvo, proliferação, expansão e atraso na diferenciação terminal e atraso na senescência) das células efetoras imunes que expressam um módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-κB contra células que expressam antígeno alvo (isto é, células alvo) são pelo menos 5%,

232 / 348

10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 100% mais do que a atividade in vitro de células efetoras imunes correspondentes que não expressam um módulo acessório que codifica um ativador de NF-κB seletivo.

Em algumas modalidades, a atividade in vitro (por exemplo, produção de IL2 induzida por antígeno alvo, proliferação, expansão e atraso na diferenciação terminal e atraso na senescência) das células efetoras imunes que expressam um ativador seletivo de NF-κB (por exemplo, hNEMO-K277A) contra as células alvo de expressão de antígeno (ou seja, células alvo) é pelo menos 1,25 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 5 vezes ou 10 vezes mais que a atividade in vitro das células efetoras imunes correspondentes que não têm a expressão do ativador seletivo de NF- κB.

Em uma modalidade, as células T efetoras imunológicas (por exemplo, células CD19-CAR-T) que expressam um ativador NF-κB seletivo produzem pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 100% mais IL2 quando expostas a uma célula que expressa o antígeno alvo (por exemplo, células Nalm-6) em comparação com as células T efetoras do controle imune (por exemplo, células CD19-CAR-T) que não têm a expressão do ativador seletivo de NF-κB.

Em uma modalidade, as células T efetoras imunes (por exemplo, células CD19-CAR-T) que expressam um ativador seletivo de NF-κB mostram pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 100% mais proliferação quando expostas a uma célula que expressa o antígeno alvo (por exemplo, células Nalm-6) em comparação com as células T efetoras do controle imune (por exemplo, células CAR-T) que não têm a expressão do ativador seletivo de NF-κB.

Em uma modalidade, as células T efetoras imunes (por exemplo, células CD19-CAR-T) que expressam um ativador seletivo de NF-κB mostram pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 100% menos marcadores de exaustão quando expostas a uma célula que expressa o antígeno alvo (por exemplo, células Nalm-6) em comparação com as células T efetoras do controle imune (por exemplo, células CAR-T) que não têm a expressão do ativador seletivo de NF-κB.

Em uma modalidade, as

233 / 348 células T efetoras imunes (por exemplo, células CD19-CAR-T) que expressam um ativador seletivo de NF-κB mostram pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 100% menos marcadores de diferenciação terminal quando expostas a uma célula que expressa o antígeno alvo (por exemplo, células Nalm-6) em comparação com as células T efetoras do controle imune (por exemplo, células CAR-T) que não têm a expressão do ativador seletivo de NF-κB. Em uma modalidade, as células T efetoras imunes (por exemplo, células CD19-CAR-T) que expressam um ativador seletivo de NF-κB mostram pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 100% mais citotoxicidade quando expostas serialmente a células que expressam antígenos alvo (por exemplo, células Nalm-6) por um período de 3 a 4 semanas em comparação com as células T efetoras imunes de controle (por exemplo, células CAR-T) que não têm a expressão da seletiva Ativador de NF-κB. Em algumas modalidades, a célula efetora imune que expressa um módulo acessório que codifica um ativador NF-κB seletivo é uma célula T (por exemplo, uma célula T CD8, uma célula T CD4, uma célula CAR-T, uma célula TIL, uma célula TREG, uma célula NKT), uma célula NK (por exemplo, uma célula CAR-NK), um macrófago (por exemplo, um macrófago que expressa CAR), uma célula que apresenta antígeno (por exemplo, uma célula dendrítica), uma célula-tronco, uma célula-tronco pluripotente induzida (iPSC) ou uma célula-tronco que pode dar origem a uma célula efetora imune.

[00251] Em outra modalidade ou modalidade adicional de qualquer uma das modalidades anteriores descritas neste documento, as células efetoras imunes que expressam um módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-kB mostram uma maior atividade in vivo (por exemplo, expansão in vivo, persistência in vivo, redução do tumor, redução no valor de bioluminescência obtido de um tumor que expressa luciferase ou sobrevivência animal) contra uma célula que expressa antígeno alvo em comparação com células efetoras imunes de controle que não expressam o

234 / 348 módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-κB quando ambas são testados em condições semelhantes.

A ativação de NF-κB nas células efetoras imunes é medida usando técnicas conhecidas na arte, incluindo, porém sem limitação, medição de IκBα fosforilada, translocação nuclear de IκBα, p65 total, regulação crescente de genes responsivos a NF-κB, ensaio de desvio de mobilidade eletroforética (EMSA) e ensaio repórter à base de NF- κB, etc.

Em algumas modalidades, a ativação seletiva de NF-κB é determinada medindo o aumento de vezes na ativação de NF-κB nas células efetoras imunes sobre o aumento de vezes na ativação da via do AKT.

Por exemplo, em algumas modalidades, as células efetoras imunes que expressam CD19-CAR que expressam um módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-κB (por exemplo, K13-opt (K13 otimizado por códon humano) ou hNEMO-K277A) apresentam maior atividade in vivo (por exemplo, expansão in vivo, persistência in vivo, redução do tumor, redução do valor de bioluminescência obtido a partir de um tumor que expressa FLuc ou sobrevivência animal) na direção de células Nalm6-Fluc em um modelo de xenoenxerto de camundongo NSG em comparação com as células efetoras que expressam CD19-CAR correspondentes que não têm um módulo acessório que codifica um ativador NF-κB seletivo (por exemplo, K13-opt (K13 otimizado por códon humano) ou hNEMO-K277A) quando testado em condições experimentais semelhantes.

Em algumas modalidades, a atividade in vivo (por exemplo, expansão in vivo, persistência in vivo, redução do tumor, redução do valor de bioluminescência obtido a partir de um tumor que expressa FLuc ou sobrevivência animal) das células imunes efetoras (por exemplo, células CD19-CAR-T) que expressam um módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-κB contra as células que expressam antígeno alvo (por exemplo, Nalm-6) em um modelo de xenoenxerto de camundongo NSG é pelo menos 5, 10, 20, 30, 40, 50% ou 100% mais do que a atividade in vivo das células efetoras imunes correspondentes que não têm

235 / 348 um módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-κB. Em algumas modalidades, a atividade in vivo (por exemplo, expansão in vivo, persistência in vivo, redução do tumor, redução do valor de bioluminescência obtido a partir de um tumor que expressa FLuc ou sobrevivência animal) das células imunes efetoras (por exemplo, células CD19-CAR-T) que codificam um módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-κB contra as células que expressam antígeno alvo (por exemplo, Nalm-6) em um modelo de xenoenxerto de camundongo NSG é pelo menos 1,25 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 5 vezes ou 10 vezes mais do que a atividade in vivo das células efetoras imunes correspondentes que não têm um módulo acessório que codifica um ativador seletivo de NF-κB. Em algumas modalidades, a célula efetora imune que expressa um módulo acessório que codifica um ativador NF-κB seletivo é uma célula T (por exemplo, uma célula T CD8, uma célula T CD4, uma célula CAR-T, uma célula TIL, uma célula TREG, uma célula NKT), uma célula NK (por exemplo, uma célula CAR-NK), um macrófago (por exemplo, um macrófago que expressa CAR), uma célula que apresenta antígeno (por exemplo, uma célula dendrítica), uma célula-tronco, uma célula-tronco pluripotente induzida (iPSC) ou uma célula-tronco que pode dar origem a uma célula efetora imune.

[00252] Em outra modalidade ou modalidade adicional de qualquer uma das modalidades anteriores descritas neste documento, as células efetoras imunes que expressam um módulo acessório, por exemplo, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-deltaV249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E- S181E, IKK1-S176E-S180E, ou MYD88-L265P, mostram uma maior atividade in vivo (por exemplo, expansão in vivo, persistência in vivo, redução do tumor, redução no valor de bioluminescência obtido de um tumor que expressa Fluc ou sobrevivência animal) contra uma célula que expressa antígeno alvo em comparação com uma célula efetora imune correspondente que não tem o módulo acessório quando comparadas em condições similares.

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Por exemplo, em algumas modalidades, as células efetoras imunes que expressam CD19-CAR que também coexpressam hNEMO-K277A, hNEMO- K277A-deltaV249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, ou MYD88-L265P mostram maior atividade in vivo (por exemplo, expansão in vivo, persistência in vivo, redução do tumor, redução do valor de bioluminescência obtido a partir de um tumor que expressa FLuc ou sobrevivência animal) na direção de células Nalm6-FLuc em um modelo de xenoenxerto de camundongo NSG em comparação com as células efetoras que expressam CD19-CAR correspondentes que não têm expressão de hNEMO-K277A quando testadas em condições experimentais semelhantes.

Em algumas modalidades, a atividade in vivo (por exemplo, expansão in vivo, persistência in vivo, redução do tumor, redução do valor de bioluminescência obtido a partir de um tumor que expressa FLuc ou sobrevivência animal) das células imunes efetoras que expressam o módulo acessório descrito neste documento (por exemplo, hNEMO-K277A, hNEMO- K277A-deltaV249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, ou MYD88-L265P) contra as células que expressam antígeno alvo (isto é, células alvo) em um modelo de xenoenxerto de camundongo NSG é pelo menos 5, 10, 20, 30, 40, 50% ou 100% mais do que a atividade in vivo de uma célula efetora imune correspondente que não tem a expressão do módulo acessório.

Em algumas modalidades, a atividade in vivo (por exemplo, expansão in vivo, persistência in vivo, redução do tumor, redução do valor de bioluminescência obtido a partir de um tumor que expressa FLuc ou sobrevivência animal) das células imunes efetoras que expressam o módulo acessório descrito neste documento (por exemplo, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-deltaV249-K555, mNEMO-K270A, K13- opt, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, ou MYD88-L265P) contra as células que expressam antígeno alvo (isto é, células alvo) em um modelo de xenoenxerto de camundongo NSG é pelo menos 1,25 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 5

237 / 348 vezes, 40 vezes mais do que a atividade in vivo de uma célula efetora imune correspondente que não tem a expressão do módulo acessório. Em algumas modalidades, a célula efetora que expressa o módulo acessório é uma célula T (por exemplo, uma célula T CD8, uma célula T CD4, uma célula CAR-T, uma TIL, uma célula TREG, uma célula NKT), uma célula NK (por exemplo, uma célula CAR-NK), um macrófago (por exemplo, um macrófago que expressa CAR), uma célula que apresenta antígeno (por exemplo, uma célula dendrítica), uma célula-tronco pluripotente induzida (iPSC) ou uma célula- tronco que pode dar origem a uma célula efetora imune.

[00253] A divulgação garante ainda que a expressão de um ativador seletivo de NF-κB pode ser usada para melhorar a secreção de citocinas, apresentação de antígeno e resposta imune gerada por células que apresentam antígeno, incluindo células dendríticas. A divulgação fornece ainda um método para melhorar a eficácia da vacina, incluindo vacinas contra o câncer, pela expressão de um ativador seletivo de NF-κB nas células que apresentam antígeno ex vivo ou in vivo. Em uma modalidade, o uso de ativadores seletivos de NF-κB aumenta a produção de citocinas (por exemplo, TNFα) por células que apresentam antígeno (por exemplo, células dendríticas) em mais de pelo menos 15%.

[00254] A divulgação garante ainda que um módulo acessório que codifica CMV-141 (SEQ ID NO: 7.770) pode ser expresso nas células efetoras imunes, por exemplo, células T, por exemplo, células CAR-T ou células TCR-T, para retardar sua exaustão e melhorar sua persistência a longo prazo. O CMV-141 pode ser expresso em células efetoras imunes de maneira induzível ou constitutiva.

[00255] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células- tronco, ou células T ou NKT, ou IPSC, ou células T sintéticas, são geradas que expressam um receptor de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, e/ou uma molécula estimulante de NF-κB descritos neste documento usando

238 / 348 uma combinação de inserção de genes usando o SBTS e edição genética usando uma nuclease (por exemplo, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), Nucleases Efetoras do Tipo Ativador de Transcrição (TALENs), sistema CRISPR/Cas ou meganucleases manipuladas geneticamente novamente manipuladas geneticamente próximas a endonucleases)

[00256] Em outra modalidade, a divulgação fornece um método para produzir uma célula (por exemplo, uma célula efetora imune ou população da mesma) compreendendo introduzir (por exemplo, realizar transdução) em uma célula, por exemplo, uma célula T, uma célula NKT ou uma célula- tronco ou uma iPSC ou uma célula T sintética descritas neste documento, com um vector que compreende um ácido nucleico que codifica um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, e/ou uma molécula estimulante de NF-κB.

[00257] Em várias modalidades, as células para modificações com um receptor imune não natural e/ou molécula estimulante de NF-κB descrita neste documento, incluindo células T ou células NK, podem ser obtidas a partir de um sujeito que deseja terapia. As células T podem ser obtidas de várias fontes, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido linfonodal, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascites, derrame pleural, tecido do baço e tumores. As células T podem ser células T gama-delta residentes em tecidos, que podem ser cultivadas e expandidas in vitro antes da expressão do receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR e/ou molécula estimulante NF-kB.

[00258] Em uma modalidade, a divulgação fornece inúmeros receptores de antígeno quiméricos (CAR) compreendendo um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, TCR ou fragmento de TCR) manipulado geneticamente para ligação específica a um antígeno associado à doença, por exemplo, um antígeno tumoral descrito neste documento. Em uma modalidade, a divulgação fornece uma célula

239 / 348 efetora imune (por exemplo, célula T, célula NK) manipulada geneticamente para expressar um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, um CAR ou um TCR recombinante) e/ou molécula estimulante de NF-κB, em que a célula efetora imune manipulada geneticamente exibe uma propriedade terapêutica.

Em uma modalidade, a divulgação fornece uma célula efetora imune (por exemplo, célula T, célula NK) manipulada geneticamente para expressar um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, um CAR ou um TCR recombinante) e/ou molécula estimulante de NF-κB, em que a célula efetora imune manipulada geneticamente exibe propriedades anticâncer ou anti-inflamatórias (por exemplo, anti-HIV-1). Em algumas modalidades, a molécula estimulante de NF-κB pode ser expressa em uma célula T (por exemplo, um linfócito infiltrante de tumor ou TIL) com seu TCR endógeno, em que a célula efetora imune manipulada geneticamente exibe propriedades anticâncer ou anti-inflamatórias (por exemplo, anti-HIV - 1). Em uma modalidade, uma célula é transformada com o receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, um CAR ou um TCR recombinante) e uma molécula estimulante de NF-κB e o receptor imune de ocorrência não natural é expresso na superfície da célula.

Em algumas modalidades, a célula (por exemplo, célula T, célula NK) é submetida à transdução com um vetor viral que codifica um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, um CAR ou um TCR recombinante) e/ou molécula estimulante de NF-κB.

Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral.

Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor lentiviral.

Em algumas dessas modalidades, a célula pode expressar de maneira estável o receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, um CAR ou um TCR recombinante) e/ou molécula estimulante de NF-κB.

Em outra modalidade, a célula (por exemplo, célula T, célula NK) é transfectada com um ácido nucleico, por exemplo, mRNA, cDNA, DNA, codificando um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, um CAR ou um TCR recombinante) e/ou molécula

240 / 348 estimulante de NF-kB. Em algumas dessas modalidades, a célula pode expressar transitoriamente o receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, um CAR ou um TCR recombinante) e/ou molécula estimulante de NF-κB. Em algumas modalidades, a molécula estimulante de NF-κB pode ser expressa em uma célula T (por exemplo, um linfócito infiltrador de tumor ou TIL) com seu TCR endógeno.

[00259] A divulgação fornece células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são projetadas para conter um ou mais receptores imunes de ocorrência não natural (por exemplo, CARs/TCRs) e/ou moléculas estimulantes de NF-κB que direcionam as células efetoras imunes para células doentes ou células associadas a doenças, como células cancerígenas. Isso é alcançado através de um domínio de ligação ao antígeno no receptor imune que é específico para um antígeno associado ao câncer. Existem duas classes de antígenos associados ao câncer (antígenos tumorais) que podem ser direcionados pelos CARs da divulgação: (1) antígenos associados ao câncer que são expressos na superfície das células cancerígenas; e (2) antígenos associados ao câncer que são intracelulares, no entanto, um fragmento desse antígeno (peptídeo) é apresentado na superfície das células cancerígenas pelo MHC (principal complexo de histocompatibilidade). A divulgação também fornece células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que contêm TCRs endógenos e/ou manipuladas geneticamente para expressar uma ou mais moléculas estimulantes de NF-κB que direcionam as células efetoras imunes para células doentes ou células associadas a doenças, como células cancerígenas.

[00260] Além disso, a divulgação fornece CARs, TCRs e células que expressam CAR/TCR que também expressam uma molécula estimulante de NF-κB e seu uso em fármacos ou métodos para tratamento, entre outras doenças, câncer ou qualquer doença maligna ou autoimune ou doença infecciosa ou degenerativa doença ou doença alérgica que envolve células ou

241 / 348 tecidos que expressam um antígeno tumoral ou antígeno associado à doença, como descrito neste documento.

[00261] Em uma modalidade, a divulgação fornece uma célula efetora imune (por exemplo, célula T, célula NK) manipulada geneticamente para expressar um receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR e/ou TCR, e uma molécula estimulante de NF-κB, em que as células efetoras imunes manipuladas geneticamente exibem uma propriedade anti-doença, como a propriedade antitumoral. Um tipo de antígeno é um antígeno associado ao câncer (isto é, antígeno tumoral) descrito neste documento. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno do receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, compreende um fragmento de anticorpo parcialmente humanizado. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno do receptor imune de ocorrência não natural, por exemplo, CAR, compreende um scFv parcialmente humanizado. Por conseguinte, a divulgação fornece receptores imunes de ocorrência não natural, por exemplo, CARs, que compreendem um domínio de ligação ao antígeno humanizado e são manipulados geneticamente em uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, em que a célula também expressa uma molécula estimulante de NF-κB e métodos para uso dos mesmos para terapia adotiva.

[00262] Em uma modalidade, a divulgação fornece uma célula efetora imune (por exemplo, célula T, célula NK) com seu receptor imune endógeno (por exemplo, um TCR) que é manipulado geneticamente para expressar uma molécula estimulante de NF-κB, em que a célula efetora imune manipulada geneticamente exibe um propriedade anti-doença, como propriedade antitumoral ou propriedade anti-HIV-1.

[00263] São ainda fornecidas neste documento células geneticamente modificadas, compreendendo os polinucleotídeos e/ou os receptores imunes de ocorrência não natural descritos neste documento. Em algumas

242 / 348 modalidades, a célula é um linfócito T (célula T). Em algumas modalidades, a célula é uma célula T virgem, uma célula T de memória central, uma célula T de memória efetora, uma célula T reguladora (Treg) ou uma combinação das mesmas.

Em algumas modalidades, a célula é uma célula exterminadora natural (NK), uma célula-tronco hematopoiética (HSC), uma célula-tronco embrionária ou uma célula-tronco pluripotente.

As células geneticamente modificadas que podem compreender e expressar os receptores imunes de ocorrência não natural (por exemplo, CARs e/ou TCRs) da divulgação em combinação com uma molécula estimulante de NF-κB, incluem, porém sem limitação, linfócitos T (células T), células T virgens (TN), células T de memória (por exemplo, células T de memória central (TCM), células de memória efetoras (TEM)), células exterminadoras naturais, células-tronco hematopoiéticas e/ou células-tronco embrionárias/induzidas pluripotentes capaz de dar origem a progênie terapeuticamente relevante.

Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas são células autólogas.

Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas são células alogênicas.

A título de exemplo, as células T individuais da invenção podem ser CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4-/CD8- ou CD4+/CD8+. As células T podem ser uma população mista de células CD4+/CD8- e CD4-/CD8+ ou uma população de um único clone.

Células T CD4+ da presente invenção podem produzir IL-2, IFNγ, TNFα e outras citocinas efetoras de células T, quando cocultivadas in vitro com células que expressam os antígenos-alvo (por exemplo, células tumorais CD20+ e/ou CD19+). As células T CD8+ da invenção podem lisar células alvo específicas de antígeno quando cocultivadas in vitro com as células alvo.

Em algumas modalidades, as células T podem ser qualquer uma ou mais das células virgens CD45RA+ CD62L+, células de memória central CD45RO+ CD62L+, células de memória efetoras de CD62L- ou uma combinação das mesmas (Berger et al., Adoptive transfer of virus-specific and tumor-specific T cell immunity.

Curr Opin Immunol

243 / 348 2009 21 (2) 224 a 232). As células geneticamente modificadas podem ser produzidas transfectando de maneira estável as células com DNA que codifica os receptores imunes de ocorrência não natural (por exemplo, CARs e/ou TCRs) e/ou molécula estimulante de NF-κB da divulgação. As células transfectadas que demonstram presença de um único vetor não rearranjado integrado e expressão dos receptores imunes de ocorrência não natural (por exemplo, CARs e/ou TCRs) e/ou molécula estimulante de NF-κB podem ser expandidas ex vivo. Em uma modalidade, as células selecionadas para expansão ex vivo são CD8+ e demonstram a capacidade de reconhecer e lisar especificamente células alvo específicas de antígeno.

[00264] A estimulação das células T por um antígeno em condições adequadas resulta em proliferação (expansão) das células e/ou produção de IL-2. As células compreendendo os receptores imunes de ocorrência não natural (por exemplo, CARs e/ou TCRs) e/ou a molécula estimulante de NF- κB da divulgação se expandirão em número em resposta à ligação de um ou mais antígenos às regiões de alvejamento específico de antígeno dos receptores imunes de ocorrência não natural (por exemplo, CARs e/ou TCRs). A divulgação também fornece um método de produção e expansão de células que expressam um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR). O método compreende transfectar ou transduzir as células com o vetor (ou vetores) que expressa o receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou a molécula estimulante de NF-κB e estimular as células com células que expressam os antígenos alvo, antígenos alvo recombinantes ou um anticorpo contra o receptor a causar proliferação celular, de modo a produzir e expandir células T. Em uma modalidade, as células podem ser qualquer um ou mais linfócitos T (células T), células exterminadoras naturais (NK), células-tronco hematopoiéticas (HSCs) ou células-tronco embrionárias/induzidas pluripotentes capazes de dar origem a descendentes terapeuticamente relevantes. Em uma modalidade, a molécula

244 / 348 estimulante de NF-κB pode ser expressa nas células (por exemplo, células T, células NK ou células-tronco que podem dar origem a células imunes) sem a introdução de receptores imunes de ocorrência não natural (por exemplo, CARs e/ou TCRs).

[00265] Células efetoras imunes, como células T e células NK, compreendendo receptores imunes de ocorrência não natural (por exemplo, CARs e/ou TCRs) e/ou molécula estimulante de NF-κB, conforme descrito neste documento, podem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como os descritos, por exemplo, nas patentes US 6.352.694;

6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681;

7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223;

6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; e na Publicação do Pedido de Patente no US

20060121005.

[00266] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam os CARs 1 a 6 convencionais ou os CARs 1 a 6 convencionais que fazem parte das estruturas principais descritas neste documento, como estrutura principal-1, estrutura principal-2, estrutura principal-13, estrutura principal-14, estrutura principal- 37, estrutura principal-38, estrutura principal-49, estrutura principal-50, estrutura principal-60 ou estrutura principal-61 e uma molécula estimulante de NF-κB em que o domínio específico de antígeno dos CARs é específico para MPL, CD19, CD20, BCMA, CD22, CD30, CD33, CD123, CD138, CLL1, cadeia constante de TCR-beta 1, cadeia constante de TCR-beta2, TCRgama/delta, mesotelina, IL13Ra2, ALK, PTK7, DLL3, TROP2, Tim1, LAMP1, CS1, Lym1, Lym2, TSHR, complexo de classe i de NY-ESO- 1/MHC, complexo de classe I de WT1/MHC, complexo de classe i de Ras/MHC, complexo de classe i de AFP/MHC, complexo de casse i de HPV- E6/MHC, Complexo de classe i de HPV-E7/MHC, epítopo CD179a, CLD18A2, CD43 ou proteína gp120 do envelope do HIV1.

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[00267] Em uma modalidade, a célula é uma célula T e a célula T é deficiente em uma ou mais cadeias de receptores endógenos de células T. As células T que carecem de expressão estável de um TCR funcional de acordo com a divulgação podem ser produzidas usando uma variedade de abordagens, como o uso de nucleases de dedo de Zn (ZFN), CRISP/Cas9 e shRNA alvejando as cadeias receptoras de células T endógenas. Um método exemplificativo não limitante relacionado a shRNAs é descrito no documento US 2012/0321667A1, que é incorporado neste documento a título de referência. Outro método exemplificativo não limitante relacionado à eliminação da expressão TCR endógeno usando ZFNs alvejando regiões constantes de cadeias α e β de TCRs é descrito em Torikai H et al. (Blood, 119 (24), 14 de junho de 2012).

[00268] Uma célula T sem um TCR endógeno funcional pode ser, por exemplo, manipulada geneticamente para não expressar nenhum TCR endógeno funcional em sua superfície, manipulada geneticamente para que não expresse uma ou mais subunidades (por exemplo, cadeias constantes TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ ou pre-TCRα) que compreendem um TCR endógeno funcional ou manipuladas geneticamente de modo a produzir muito pouco TCR endógeno funcional em sua superfície. Alternativamente, a célula T pode expressar um TCR endógeno substancialmente prejudicado, por exemplo, pela expressão de formas mutadas ou truncadas de uma ou mais das subunidades do TCR. O termo “TCR substancialmente comprometido” significa que esse TCR não provocará uma reação imune adversa em um hospedeiro. Ainda em uma alternativa adicional, um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou uma molécula estimulante de NF-κB podem ser clonados em um local de TCR em um genoma da célula T e, assim, os receptores imunes de ocorrência não natural (por exemplo, CARs e/ou TCRs) e/ou molécula estimulante de NF-κB estariam sob o controle do sistema de expressão de células T endógenas.

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[00269] A divulgação mostra que, em contrapartida à situação com os construtos de CAR de 1a ou 2a geração, TFPs baseado em cadeias CD3ε, CD3γ e CD3δ (designado como TFPs CD3ε/γ/δ) têm uma fraca expressão e atividade quando expressos em células T αβ que carecem ou apresentam polipeptídeo de cadeia TCRα nativo ou endógeno funcional em sua superfície. Por exemplo, observa-se que TFPs CD3ε/γ/δ apresentam expressão e atividade prejudicadas (por exemplo, ativação de células T, proliferação, produção de citocinas e citotoxicidade, etc.) na célula T αβ na qual o local genômico de TRAC endógeno foi interrompido pelo cassete de expressão TFP. A divulgação fornece uma solução para esse problema expressando novamente um polipeptídeo de cadeia constante TCRα (cadeia TRAC) ou um fragmento do mesmo em células T nas quais a expressão do polipeptídeo de cadeia TCRα de comprimento total nativo foi reduzida ou eliminada. Em uma modalidade, o polipeptídeo de cadeia constante TCRα ou o fragmento de cadeia constante TCRα expresso novamente permite a reconstituição de um complexo de sinalização TFP CD3ε/γ/δ-TCR-CD3 funcional em uma célula T αβ na qual a expressão da cadeia constante TCRα nativa é prejudicada, reduzida ou eliminada. Em uma modalidade, a cadeia constante TCRα ou fragmento de cadeia constante TCRα expresso novamente melhora em mais de 15% (por exemplo, mais de 20%, 50%, 75% ou 100%, etc.) a produção de citocina induzida por antígeno alvo (por exemplo, IL2, TNFα, IFNγ), proliferação e/ou atividade citotóxica da célula T αβ que expressa TFP CD3ε/γ/δ na qual a expressão da cadeia constante TCRα nativo é prejudicada, reduzida ou eliminada. Em uma modalidade, a cadeia constante TCRα ou o fragmento de cadeia constante TCRα expresso novamente permite a expressão aprimorada do TFP CD3ε/γ/δ em uma célula T αβ na qual a expressão da cadeia constante TCRα nativo é prejudicada, reduzida ou eliminada. Em uma modalidade, a cadeia constante TCRα ou o fragmento de cadeia constante TCRα expresso novamente permite mais de 15% (por

247 / 348 exemplo, mais de 20%, 50%, 75% ou 100%, etc.) de aumento na expressão do TFP CD3ε/γ/δ em uma célula T αβ na qual a expressão da cadeia constante TCRα nativo é prejudicada, reduzida ou eliminada.

Em uma modalidade exemplificativa, a atividade de expressão e sinalização de TFPs CD3ε/γ/δ pode ser restaurada em células T αβ nas quais a expressão da cadeia TCRα nativa é reduzida ou eliminada pela introdução nessas células T de um ácido nucleico que codifica uma cadeia constante TCRα exógeno (cadeia TRAC) (por exemplo, SEQ ID NO: 1.010). Em uma modalidade preferencial, a sequência nucleotídica que codifica a cadeia de TRAC exógeno é otimizada por códon e difere da cadeia constante TCRα endógena ou nativo em sua sequência nucleotídica.

Em uma modalidade alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a cadeia TRAC exógena é otimizada por códon e carrega uma ou mais substituições de aminoácidos que são conhecidas por melhorar a expressão da cadeia constante TCRα humano (consultar Tabela 3). Em uma modalidade exemplificativa, as cadeias de TRAC exógeno que podem ser usadas para permitir a nova expressão e/ou atividade do complexo TFP-TCR-CD3 em células T αβ nas quais a expressão do gene TCRα endógeno foi regulada decrescentemente ou eliminada tem sequência como mostrado nas SEQ ID NO: 3.886 a 3.894 ou tem sequências que codificam polipeptídeos com mais de 80% de homologia com os polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas nas SEQ ID NO: 3.886 a 3.894. Para permitir a sua expressão na superfície celular, a sequência nucleotídica que codifica a cadeia constante exógena de TCRα (TRAC) é operacionalmente ligada à sequência nucleotídica que codifica um peptídeo sinal.

Em uma modalidade, sequências adicionais de ocorrência não natural (por exemplo, ligantes ou domínio de ligação ao antígeno) podem ser opcionalmente adicionadas à sequência que codifica a cadeia TRAC desde que não interfiram com sua capacidade de recrutar outros componentes complexo de sinalização TCR-CD3 e/ou TFP CD3ε/γ/δ.

Em uma modalidade, o polipeptídeo de cadeia

248 / 348 constante exógeno de TCRα não está operacionalmente ligado à sequência Vα nativa (isto é, domínio de ligação ao antígeno) presente na célula T na qual é o mesmo expresso. Em uma modalidade, a expressão do polipeptídeo de cadeia constante exógena de TCRα não permite que a célula T αβ recupere sua especificidade e/ou afinidade de reconhecimento de antígeno nativo, por exemplo, para reconhecer o complexo de antígeno MHC-peptídeo que foi reconhecido pela célula T com sua cadeia endógena de TCRα. Em uma modalidade exemplificativa, o módulo acessório que codifica uma cadeia constante TCRα exógeno pode ser expresso em células T αβ por si só (SEQ ID NO: 1.010) usando um método apropriado (por exemplo, transferência de genes mediada por lentivírus) ou pode ser coexpresso com os cassetes de expressão TFP usando um único vetor (por exemplo, um vetor lentiviral). Métodos alternativos de entrega e expressão de dois ou mais genes ou RNAs são conhecidos na técnica e descritos nesta divulgação e podem ser utilizados nas modalidades alternativas da invenção. A sequência nucleotídica de construtos exemplificativos que coexpressam uma cadeia constante TCRα com construtos de TFP CD3ε/γ/δ alvejando MPL são mostradas nas SEQ ID NOs: 3.538, 3.540 e 3.542. No construto exemplificativo CD8SP-MPL-Hu- 161-2-(vL-vH)-CD3e-ECDTMCP-opt2-F-P2A-IgSP-[TRAC-opt2] (SEQ ID NO: 3.538), o primeiro cassete codifica um CD3ε-TFP compreendendo um peptídeo sinal CD8 seguido por um scFv humanizado visando a proteína MPL humana e o domínio extracelular, transmembranar e citosólico de CD3ε. Esse cassete de codificação de TFP é seguido no quadro por um ligante que codifica Furine-SGSG-P2A e um cassete que codifica um peptídeo sinal (IgSP) e uma sequência nucleotídica otimizada por códon que codifica TRAC. Em uma modalidade exemplificativa, todo o cassete pode ser expresso em células T αβ sem cadeia TCRα endógena usando um vetor lentiviral.

[00270] Em uma modalidade alternativa, a expressão do polipeptídeo de cadeia constante TCRα pode ser restaurada nas células T αβ que carecem

249 / 348 ou têm polipeptídeo de cadeia TCRα endógena ou nativo funcional prejudicado na sua superfície utilizando o gene da cadeia constante TCRα endógena. Em uma modalidade exemplificativa, a expressão do polipeptídeo de cadeia constante TCRα pode ser restaurada nas células T αβ que carecem ou têm polipeptídeo de cadeia TCRα endógena ou nativo funcional prejudicado na sua superfície ligando funcionalmente em quadro uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo sinal de pelo menos uma cópia do gene da cadeia constante TCRα endógena usando técnicas de edição de genes conhecidas na arte. Em uma modalidade exemplificativa, a sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo sinal está operacionalmente ligada no quadro ao primeiro éxon de pelo menos um dos genes da cadeia constante TCRα endógena, de modo a permitir a expressão de um polipeptídeo da cadeia constante do TCRα na superfície do Células T. Em uma modalidade, o cassete de expressão que codifica o peptídeo sinal e o gene da cadeia constante TCRα está sob o controle regulador de transcrição do promotor de TCRα endógena. Em uma modalidade, o cassete de expressão que codifica o peptídeo sinal e o gene da cadeia constante TCRα compartilha a sequência não traduzida em 3’ e o controle regulador do gene TCRα endógeno. Em uma modalidade alternativa, o cassete de expressão que codifica o peptídeo sinal e o gene da cadeia constante TCRα está sob um promotor exógeno (por exemplo, promotor EF1α ou CMV).

[00271] Em uma modalidade exemplificativa, a expressão do polipeptídeo de cadeia constante TCRα pode ser restaurada em células T αβ nas quais o gene da cadeia TCRα endógena ou nativo foi interrompido pela integração direcionada de um cassete que codifica um TFP ao projetar o cassete de alvejamento de modo que o cassete TFP seja seguido no quadro por um ligante clivável 2A, um peptídeo sinal (por exemplo, um peptídeo sinal CD8 ou um peptídeo sinal IgH) e o primeiro éxon da cadeia constante do TCRα (TRAC) (Figura 5C). Um exemplo de tal construto de alvejamento é

250 / 348 representado pela SEQ ID NO: 3.860. Nessa modalidade, a cadeia constante TCRα é expressa a partir do gene da cadeia constante TCRα endógena (TRAC), cuja expressão da superfície celular é facilitada pelo peptídeo sinal presente no cassete alvo. Nessa modalidade, a cadeia constante TCRα é expressa sob o controle regulador do promotor do gene TCRα e da região não traduzida em 3’ de TCRα. Um construto de alvejamento exemplificativo alternativo é representado pela SEQ ID NO: 3.859 e pode ser usada em modalidades alternativas da divulgação para interromper a cadeia TCRα endógena alvejando a integração de um cassete que codifica uma TFP, permitindo simultaneamente a nova expressão de uma cadeia constante TCRα de um cassete de expressão que codifica um peptídeo sinal seguido por um cDNA da cadeia constante TCRα otimizado por códon e uma sequência poliA (a Figura 5B).

[00272] A revelação também demonstra que, em contrapartida à situação com os construtos de CAR de 1a ou 2a geração, TFPs CD3ε/γ/δ perdem a sua atividade quando expressa em células T αβ (isto é, as células T que expressam as cadeias TCRα E TCRβ) que não têm ou têm polipeptídeos de cadeia TCRβ1 e TCRβ2 endógenas ou nativas funcionais em sua superfície. Por exemplo, a divulgação garante que os TFP CD3ε/γ/δ apresentem expressão e atividade prejudicadas (por exemplo, ativação de células T, proliferação, produção de citocinas e citotoxicidade, etc.) em células αβ T nas quais os locais genômicos endógenos de TCRβ1 e TCRβ2 foram interrompidos. A divulgação fornece uma solução para esse problema expressando novamente polipeptídeos de cadeia constante TCRβ1 ou TCRβ2 ou um fragmento dos mesmos em células T nas quais a expressão de polipeptídeos nativos de cadeia TCRβ1 e TCRβ2 de comprimento completo foi reduzida ou eliminada. Em uma modalidade, o polipeptídeo de cadeia constante TCRβ1/β2 ou o fragmento de cadeia constante TCRβ1/β2 expresso novamente permite a reconstituição de um complexo de sinalização TFP-

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TCR-CD3 funcional em uma célula T, por exemplo, uma célula T αβ, na qual a expressão da cadeia constante TCRβ1 e/ou p2 nativa é prejudicada, reduzida ou eliminada.

Em uma modalidade, a cadeia constante TCRβ1/β2 ou o fragmento de cadeia constante TCRβ1/β2 expresso novamente melhora em mais de 15% (por exemplo, mais de 20%, 50%, 75% ou 100%, etc.) produção de citocina induzida por antígeno alvo (por exemplo, IL2, TNFα, IFNγ), proliferação e/ou atividade citotóxica da célula αβ que expressa TFP na qual a expressão da cadeia constante nativa de TCRβ1 e/ou β2 é prejudicada, reduzida ou eliminada.

Em uma modalidade, a cadeia constante TCRβ1/β2 ou o fragmento de cadeia constante TCRβ1/β2 expresso novamente permite a expressão aprimorada do TFP CD3ε/γ/δ em uma célula T αβ na qual a expressão das cadeias constantes nativas TCRβ1 e/ou TCRβ2 é prejudicada, reduzida ou eliminada.

Em uma modalidade, a cadeia constante TCRβ1/β2 ou o fragmento de cadeia constante TCRβ1/β2 expresso novamente permite mais de 15% (por exemplo, mais de 20%, 50%, 75% ou 100%, etc.) de aumento na expressão do TFP CD3ε/γ/δ em uma célula T αβ na qual a expressão da cadeia constante nativa TCRβ1 e/ou TCRβ2 é prejudicada, reduzida ou eliminada.

Em uma modalidade exemplificativa, a atividade de expressão e sinalização de TFPs CD3ε/γ/δ pode ser restaurada em células T nas quais a expressão da cadeia TCRβ1 e/ou TCRβ2 nativa é reduzida ou eliminada pela introdução nessas células T de um construto de ácido nucleico que codifica uma cadeia constante TCRβ1/β2 exógena (cadeia TRBC) (por exemplo, SEQ ID NO: 1.011). Em uma modalidade preferencial, a sequência nucleotídica que codifica a cadeia constante exógena TCRβ1/β2 é otimizada por códon e difere das cadeias constantes endógenas ou nativas TCRβ1 e TCRβ2 em sua sequência nucleotídica.

Em uma modalidade alternativa, a sequência nucleotídica que codifica a cadeia constante exógena TCRβ1/β2 é otimizada por códon e carrega uma ou mais substituições de aminoácidos que são conhecidas por melhorar a expressão da cadeia constante TCRβ1/β2 humana

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(consultar Tabela 4a, 4b). Em uma modalidade exemplificativa, as cadeias exógenas TCRβ1/β2 que podem ser usadas para permitir a nova expressão e/ou atividade do complexo TFP-TCR-CD3 em células T nas quais a expressão de cadeias endógenas TCRβ1 e β2 foi regulada decrescentemente ou eliminada têm a sequência mostrada nas SEQ ID NO: 3.895 a 3.900 ou têm sequências que codificam polipeptídeos com mais de 80% de homologia com os polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas nas SEQ ID NO: 3.895 a 3.900. Para permitir a sua expressão na superfície celular, a sequência nucleotídica que codifica a cadeia constante exógena TCRβ1/β2 (TRBC) está operacionalmente ligada à sequência nucleotídica que codifica um peptídeo sinal.

Em uma modalidade, sequências adicionais de ocorrência não natural (por exemplo, ligantes ou domínio de ligação ao antígeno) podem ser opcionalmente adicionadas à sequência que codifica a cadeia constante TCRβ1/β2 (TRBC) desde que não interfira em sua capacidade de recrutar outros componentes do complexo de sinalização TCR-CD3 e/ou TFP.

Em uma modalidade, o polipeptídeo da cadeia constante exógena TCRβ1/β2 não está operacionalmente ligado à sequência Vβ nativa (isto é, domínio de ligação ao antígeno) presente na célula T na qual é o mesmo é expresso.

Em uma modalidade, a expressão do polipeptídeo exógeno de cadeia constante TCRβ1/β2 não permite que a célula T recupere sua afinidade e/ou especificidade de reconhecimento de antígeno nativo, por exemplo, para reconhecer o complexo de antígeno MHC-peptídeo que foi reconhecido pela célula T com sua cadeia TCRβ1/β2 endógena.

Em uma modalidade exemplificativa, o módulo acessório que codifica a cadeia constante exógena de TCRβ1/β2 pode ser expresso em células T por si só (por exemplo, SEQ ID NO: 1.011) usando um método apropriado (por exemplo, transferência de genes mediada por lentivírus) ou pode ser coexpresso com os cassetes de expressão de TFP CD3ε/γ/δ usando um único vetor (por exemplo, um vetor lentiviral). Métodos alternativos de entrega e expressão de dois ou mais genes

253 / 348 ou RNAs são conhecidos na técnica e descritos nesta divulgação e podem ser utilizados nas modalidades alternativas da divulgação. A sequência nucleotídica de construtos exemplificativos que coexpressam uma cadeia constante TCRβ com construtos de TFP direcionados a MPL são mostradas nas SEQ ID NOs: 3.537, 3.539 e 3.541. No construto exemplificativo CD8SP-MPL-Hu-161-2-(vL-vH)-CD3e-ECDTMCP-opt2-F-P2A-IgSP- [TRBC-opt2] (SEQ ID NO: 3.537), o primeiro cassete codifica uma TFP compreendendo um peptídeo sinal CD8 seguido por um scFv humanizado visando a proteína MPL humana e o domínio extracelular, transmembranar e citosólico de CD3ε. Esse cassete de codificação TFP é seguido em quadro por um ligante que codifica Furine-SGSG-P2A e um cassete que codifica um peptídeo sinal (IgSP) e uma sequência nucleotídica otimizada para códon que codifica uma cadeia constante TCRβ (TRBC). Em uma modalidade exemplificativa, todo o cassete pode ser expresso em células T sem a cadeia endógena TCRβ usando um vetor lentiviral.

[00273] Em uma modalidade alternativa, a expressão do polipeptídeo de cadeia constante TCRβ1 ou β2 pode ser restaurada em células T αβ que não têm ou têm polipeptídeo de cadeia TCRα endógena ou nativa funcional prejudicado em sua superfície usando o gene de cadeia constante TCRβ1 ou β2 endógena. Em uma modalidade exemplificativa, a expressão do polipeptídeo de cadeia constante TCRβ1/β2 e do TFP coexpresso pode ser restaurada em células T αβ que não têm ou têm polipeptídeo de cadeia TCRβ endógena ou nativa funcional em sua superfície ligando operacionalmente no quadro uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo sinal a pelo menos uma cópia do gene da cadeia constante TCRβ1 ou TCRβ2 endógena usando técnicas de edição de genes conhecidas na arte. Em uma modalidade exemplificativa, a sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo sinal é operacionalmente ligada no quadro ao primeiro éxon de pelo menos um dos genes de cadeia constante endógena TCRβ1 ou TCRβ2, de

254 / 348 modo a permitir a expressão de um polipeptídeo de cadeia constante TCRβ1/β2 e a TFP coexpressa na superfície das células T. Em uma modalidade, o cassete de expressão que codifica o peptídeo sinal e a cadeia constante TCRβ1/β2 está sob o controle regulador da transcrição do promotor de TCRβ1/β2 endógena. Em uma modalidade, o cassete de expressão que codifica o peptídeo sinal e a cadeia constante TCRβ1/β2 está sob a sequência não traduzida em 3’ e o controle regulador do gene de TCRβ1/β2 endógena. Em uma modalidade alternativa, o cassete de expressão que codifica o peptídeo sinal e a cadeia constante TCRβ1/β2 está sob um promotor exógeno (por exemplo, promotor EF1α ou CMV).

[00274] Em uma modalidade exemplificativa, a expressão do polipeptídeo de cadeia constante TCRβ1/β2 pode ser restaurada em células T αβ nas quais os genes de cadeia TCRβ1 e TCRβ2 endógena ou nativa foram interrompidos pela integração direcionada de cassetes que codificam uma TFP ao projetar o cassete de alvejamento de modo que o cassete de TFP seja seguido em quadro por um ligante clivável 2A, um peptídeo sinal (por exemplo, um peptídeo sinal CD8 ou um peptídeo sinal IgH) e o primeiro éxon da cadeia constante TCRβ1/β2 (TRBC).

[00275] Observou-se que direcionar o cassete CAR para o local de TRAC resulta em aproximadamente 95% de células T se tornando negativas para TCR. Tais células T negativas para TCR podem ser usadas em um ambiente alogênico, pois são menos propensas a causar doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH). No entanto, a nova expressão da cadeia TRAC em células T nas quais o local de TRAC foi alvo de um cassete TFP potencialmente levaria à expressão da cadeia TCRβ de comprimento total, incluindo a região Vβ. Tais células T, mesmo sem o reconhecimento de MHC fornecido pela região Vα, seriam potencialmente capazes de reconhecer aloantígenos apresentados pelo complexo MHC através de suas cadeias de TCRβ e, portanto, potencialmente causar GVHD. Em modalidades

255 / 348 alternativas da divulgação, as cadeias TCRα e TCRβ1 ou β2 são expressas novamente nas células T αβ que expressam TFP CD3ε/γ/δ nas quais a expressão das cadeias endógenas de TCRα e TCRβ1 e TCRβ2 foi regulada decrescentemente ou eliminada.

[00276] No exemplo acima, uma TRAC ou TRBC exógena é coexpressa com um construto que expressa TFP para restaurar a expressão e/ou atividade de TFP CD3ε/γ/δ em células T α/β nas quais a expressão de cadeias TCRα e/ou TCRβ endógenas foram reguladas decrescentemente ou eliminadas por, por exemplo, alvejamento de seus locais genômicos. Em uma modalidade alternativa da invenção, a expressão de cadeias constantes exógenas TCRα e/ou TCRβ1/β2 é usada para restaurar a expressão do complexo TCR/CD3 em qualquer célula T a/β, incluindo uma célula T a/β do tipo selvagem ou uma célula T a/β que expressa um receptor de antígeno quimérico, um receptor de célula T quimérica (cTCR), um AbTCR ou um receptor imune sintético. Finalmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para restaurar a expressão de CAR/TFP e/ou TCR/CD3 em células T γ/δ nas quais a expressão de cadeias endógenas de TCRγ e/ou TCRδ foi regulada decrescentemente ou eliminada. Cadeias constantes exemplificativas de TCRγ (TRGC) e TCRδ (TRDC) que podem ser expressas em células T γ/δ nas quais a expressão de cadeias endógenas de TCRγ e/ou TCRδ foi regulada ou decrescentemente ou eliminada são representadas pelas SEQ ID NO: 3.912 e 3.913.

[00277] A divulgação também garante que a expressão e a atividade de TFP CD3ε/γ/δ podem ser restauradas em células T com deficiência ou falta de expressão das cadeias TCRα/β/γ ou δ nativas pela nova expressão de fragmentos ou variantes das cadeias constantes TCRα/β/γ ou δ. Os fragmentos/variantes de cadeias constantes TCRα/β/γ e δ que podem ser usados para restaurar a expressão de TFP CD3ε/γ/δ em células sem as cadeias TCRα/β/γ ou δ nativas são fornecidos nas SEQ ID Nos: 15.141 a 15.144

256 / 348 (Tabela 6D). Os cassetes de expressão que codificam essas cadeias com um peptídeo sinal de IgH estão listadas nas SEQ ID Nos: 15.145 a 15.148 (Tabela 7).

[00278] A divulgação fornece ainda que a expressão e a atividade de TFP CD3ε/γ/δ podem ser restauradas em células T com cadeias TCRα/β/γ ou δ nativas prejudicadas ou sem expressão das mesmas por coexpressão de um SIR ou um Ab-TCR compreendendo as cadeias constantes TCRα/β/γ ou δ que faltam. Assim, em células T aβ com deficiência ou falta de expressão da cadeia TCRα nativa, a expressão e a atividade de uma TFP CD3ε/y/δ podem ser resgatadas pela expressão de um SIR compreendendo uma cadeia constante TCRα. Em uma modalidade exemplificativa, em uma célula T αβ com deficiência ou falta de expressão da cadeia TCRα nativa, a expressão e a atividade de uma TFP CD3ε/γ/δ (por exemplo, uma TFP codificada por SEQ ID NOs: 8.708 a 8.714) podem ser resgatadas pela expressão de um SIR (por exemplo, um SIR representado pela SEQ ID NO: 9.668, 9.669 ou 9.684, etc.) compreendendo uma cadeia constante TCRα. Em outra modalidade exemplificativa, em células T aβ com deficiência ou falta de expressão da cadeia TCRα nativa, a expressão e a atividade de uma TFP CD3ε/γ/δ (por exemplo, uma TFP codificada por SEQ ID NOs: 8.708 a 8.714) podem ser resgatadas pela expressão de um Ab-TCR (por exemplo, um Ab-TCR representado pela SEQ ID NO: 9.677 ou 9.678, etc.) compreendendo uma porção da cadeia constante TCRα. A divulgação garante que, para terapias combinadas com células T alogênicas envolvendo dois CARs, um TF3 CD3α/γ/δ é preferencialmente combinado com um SIR e/ou um Ab-TCR que incorporam a cadeia constante TCR ou fragmento de cadeia constante TCR cuja expressão é reduzida ou ausente nas células T alogênicas.

[00279] A divulgação garante ainda que, em células T aβ com deficiência ou falta de expressão das cadeias TCRβ nativas, a expressão e a atividade de uma TFP CD3ε/γ/δ podem ser resgatadas pela expressão de um

257 / 348 SIR compreendendo uma cadeia constante de TCRβ. Em uma modalidade exemplificativa, em células αβ T com deficiência ou falta de expressão das cadeias TCRβ1/22 nativas, a expressão e a atividade de uma TFP CD3ε/γ/δ (por exemplo, uma TFP codificada por SEQ ID NOs: 8.708 a 8.714) podem ser resgatadas pela expressão de um SIR (por exemplo, um SIR representado pela SEQ ID NO: 9.668, 9.669 ou 9.684, etc.) compreendendo uma cadeia constante TCRβ. Em outra modalidade exemplificativa, em células T aβ com deficiência ou falta de expressão da cadeia TCRα nativa, a expressão e a atividade de uma TFP CD3ε/γ/δ (por exemplo, uma TFP codificada por SEQ ID NOs: 8.708 a 8.714) podem ser resgatadas pela expressão de um Ab-TCR (por exemplo, um Ab-TCR representado pela SEQ ID NO: 9.677 ou 9.678, etc.) compreendendo uma porção da cadeia constante TCRβ.

[00280] A divulgação garante ainda que, em células T γδ com deficiência ou falta de expressão da cadeia TCRγ nativa, a expressão e a atividade de uma TFP CD3ε/γ/δ podem ser resgatadas pela expressão de um SIR compreendendo uma cadeia constante TCRγ. Em uma modalidade exemplificativa, em células T γδ com deficiência ou falta de expressão da cadeia TCRγ nativa, a expressão e a atividade de um TFP CD3ε/γ/δ (por exemplo, um TFP codificado por SEQ ID NOs: 8.708 a 8.714) podem ser resgatadas pela expressão de um SIR (por exemplo, um SIR representado pela SEQ ID NO: 9.689) compreendendo uma cadeia constante TCRγ. Em outra modalidade exemplificativa, em células T γδ com deficiência ou falta de expressão da cadeia TCRγ nativa, a expressão e a atividade de uma TFP CD3ε/γ/δ (por exemplo, uma TFP codificada por SEQ ID NOs: 8.708 a

8.714) podem ser resgatadas pela expressão de um Ab-TCR (por exemplo, um Ab-TCR representado pela SEQ ID NO: 9.676) compreendendo uma porção da cadeia constante TCRγ.

[00281] A divulgação garante ainda que, em células T γδ com deficiência ou falta de expressão da cadeia TCRδ nativa, a expressão e a

258 / 348 atividade de um TFP CD3ε/γ/δ podem ser resgatadas pela expressão de um SIR compreendendo uma cadeia constante de TCRδ. Em uma modalidade exemplificativa, em células T γδ com deficiência ou falta de expressão da cadeia TCRδ nativa, a expressão e a atividade de uma TFP CD3ε/γ/δ (por exemplo, uma TFP codificada por SEQ ID NOs: 8.708 a 8.714) podem ser resgatadas pela expressão de um SIR (por exemplo, um SIR representado pela SEQ ID NO: 9.689) compreendendo uma cadeia constante TCRδ. Em outra modalidade exemplificativa, em uma célula T γδ com deficiência ou falta de expressão da cadeia TCRδ nativa, a expressão e a atividade de uma TFP CD3ε/γ/δ (por exemplo, uma TFP codificada por SEQ ID NOs: 8.708 a

8.714) podem ser resgatadas pela expressão de um Ab-TCR (por exemplo, um Ab-TCR representado pela SEQ ID NO: 9.676) compreendendo uma porção da cadeia constante TCRδ.

[00282] A divulgação também fornece métodos e construtos que permitem que um CAR da próxima geração (por exemplo, SIR e AbTCR), cTCR e TCR sejam expressos sob os mecanismos de regulação fisiológica proporcionados pelos genes endógenos de TCR. A divulgação também fornece métodos e construtos que permitem que um CAR da próxima geração (por exemplo, SIR e AbTCR), cTCR e TCR sejam expressos sob o promotor e mecanismos reguladores não traduzidos em 3’ proporcionados pelos genes endógenos de TCR. Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos para que um cassete de expressão que codifique um SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR seja direcionado para o local gênico de TCRα, TCRβ1/β2, TCRγ ou TCRδ endógena. Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do gene TCRα endógeno (TRAC), de modo que a cadeia constante TCRα do SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR seja expressa total ou parcialmente a partir do gene da cadeia constante TCRα nativa endógena. Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do gene TCRα endógeno (TRAC) de modo que a cadeia constante TCRα do

259 / 348 SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR seja codificada total ou parcialmente por pelo menos um dos éxons do gene da cadeia constante TCRα endógena. Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do gene TCRα endógeno (TRAC), de modo que a cadeia constante TCRα da SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR compartilhe total ou parcialmente a região não traduzida em 3’ e a sequência de poliadenilação do gene da cadeia constante TCRα nativa/endógena.

[00283] Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do gene TCRβ endógeno (TRBC) de modo que a cadeia constante de TCRβ do SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR seja expressa total ou parcialmente a partir do gene da cadeia constante TCRβ1 ou TCRβ2 nativa endógena. Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do gene TCRβ1/β2 endógeno (TRBC) de modo que a cadeia constante de TCRβ do SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR seja codificada completamente ou em parte por pelo menos um dos éxons do gene da cadeia constante TCRβ endógena. Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado ao local do gene TCRβ1/β2 endógeno (TRBC), de modo que a cadeia constante de TCRβ da SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR compartilhe completamente ou em parte a região não traduzida em 3’ e a sequência de poliadenilação do gene da cadeia constante TCRβ nativa/endógena.

[00284] Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do gene TCRγ endógeno (TRGC), de modo que a cadeia constante TCRγ do SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR seja expressa total ou parcialmente a partir do gene da cadeia constante TCRγ nativa endógena. Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do gene TCRγ endógeno (TRGC), de modo que a cadeia constante TCRγ do SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR seja codificada total ou parcialmente por pelo menos um dos éxons do gene da cadeia constante do TCRγ endógena. Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do

260 / 348 gene TCRγ endógeno (TRGC), de modo que a cadeia constante TCRγ da SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR compartilhe total ou parcialmente a região não traduzida em 3’ e a sequência de poliadenilação do gene da cadeia constante TCRγ nativa/endógena.

[00285] Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do gene TCRδ endógeno (TRDC), de modo que a cadeia constante de TCRδ da SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR seja expressa total ou parcialmente a partir do gene da cadeia constante TCRδ nativa endógena. Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do gene TCRδ endógeno (TRGC), de modo que a cadeia constante de TCRδ da SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR seja codificada completamente ou em parte por pelo menos um dos éxons do gene da cadeia constante TCRδ endógena. Em uma modalidade, o SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR é direcionado para o local do gene TCRδ endógeno (TRDC), de modo que a cadeia constante de TCRδ da SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR compartilhe total ou parcialmente a região não traduzida em 3’ e sequência de poliadenilação do gene da cadeia constante TCRδ nativa/endógena.

[00286] As células T ou natural killer (NK) ou células-tronco podem ser obtidas de um sujeito. O termo “sujeito” pretende incluir organismos vivos nos quais uma resposta imune pode ser provocada (por exemplo, mamíferos). Exemplos de sujeitos incluem seres humanos, macacos, chimpanzés, cães, gatos, camundongos, ratos e espécies transgênicas dos mesmos. As células T podem ser obtidas de várias fontes, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido linfonodal, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascites, derrame pleural, tecido do baço e tumores. As células T podem ser células T gama-delta residentes em tecidos, que podem ser cultivadas e expandidas in vitro antes da expressão do CAR/TCR e/ou uma molécula estimulante de NF- κB.

261 / 348

[00287] Em certas modalidades da divulgação, as células efetoras imunes, por exemplo, células T, podem ser obtidas a partir de uma unidade de sangue coletada de um sujeito usando qualquer número de técnicas conhecidas pelo especialista, como a separação Ficoll™. Em um aspecto preferencial, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas por aférese. O produto de aférese geralmente contém linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e plaquetas. Em um aspecto, as células coletadas por aférese podem ser lavadas para remover a fração plasmática e, opcionalmente, para colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes. Em uma modalidade, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em uma modalidade alternativa, a solução de lavagem não tem cálcio e pode não ter magnésio ou pode não ter muitos, se não todos, cátions divalentes.

[00288] As etapas de ativação inicial na ausência de cálcio podem levar à ativação ampliada. Como aqueles versados na técnica observariam prontamente, uma etapa de lavagem pode ser realizada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, como o uso de uma centrífuga semiautomática “de fluxo contínuo” (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, o Baxter CytoMate ou o Haemonetics Cell Saver 5) de acordo com as instruções do fabricante. Após a lavagem, as células podem ser suspensas novamente em uma variedade de tampões biocompatíveis, como, por exemplo, PBS sem Ca, PBS sem Mg, PlasmaLyte A ou outra solução salina com ou sem tampão. Alternativamente, os componentes indesejáveis da amostra de aférese podem ser removidos e as células novamente suspensas diretamente no meio de cultura.

[00289] Éreconhecido que os métodos de aplicação podem utilizar condições de meios de cultura compreendendo 5% ou menos, por exemplo 2%, de soro AB humano, e empregam condições e composições de meio de

262 / 348 cultura conhecidos, por exemplo, aqueles descritos em Smith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translacional Immunology (2015) 4, E31; doi: 10.1038/cti.2014.31.

[00290] Em um aspecto, as células T são isoladas dos linfócitos do sangue periférico por lisação dos glóbulos vermelhos e depleção dos monócitos, por exemplo, por elutriação centrífuga de contrafluxo ou centrifugação através de um gradiente PERCOLL™.

[00291] Em uma modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento ou prevenção de uma doença, fornecendo ao sujeito necessitado dos mesmos células efetoras imunes (por exemplo, células T) ou células- tronco que podem dar origem a células efetoras imunes que são manipuladas geneticamente para expressar um X-CAR ou um X-TCR e uma molécula estimulante de NF-κB, em que X representa um antígeno associado à doença como descrito neste documento, e em que as células causadoras ou associadas à doença expressam o dito antígeno X. A Tabela 9 fornece uma lista de antígenos diferentes e as doenças exemplificativas que podem ser prevenidas, inibidas ou tratadas usando células efetoras imunes que expressam os CARs direcionados a esses antígenos.

[00292] Em outra modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento ou prevenção de câncer, infecção, doenças autoimunes ou alérgicas fornecendo ao sujeito em necessidade dos mesmos células efetoras imunes (por exemplo, células T) ou células-tronco que podem dar origem a células efetoras imunes que são manipuladas geneticamente para expressar um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) da divulgação e/ou uma molécula estimulante de NF-kB. Em uma modalidade, a molécula estimulante de NF-κB é um ativador seletivo de NF- κB. Em uma modalidade, o ativador de NF-κB, por exemplo, um ativador seletivo de NF-κB, é um ativador de NF-κB não viral. Em uma modalidade, o

263 / 348 ativador de NF-κB, por exemplo, um ativador seletivo de NF-κB, não é uma proteína transmembranar e é expresso no citosol ou está preferencialmente presente no citosol. Em uma modalidade, o ativador de NF-κB, por exemplo, um ativador seletivo de NF-κB, é constitutivamente ativo. Em uma modalidade, o ativador de NF-κB, por exemplo, um ativador seletivo de NF- κB, não é constitutivamente ativo. Em uma modalidade, o ativador seletivo de NF-κB é ativado pela administração de um indutor (por exemplo, um dimerizador). Em uma modalidade, o ativador seletivo de NF-κB é vFLIP K13, NEMO-K277A ou derivados dos mesmos. As células efetoras imunes que expressam moléculas estimulantes de CAR/NF-kB são administradas ao paciente. Em um aspecto, a célula associada à doença é uma célula cancerígena, uma célula infectada (por exemplo, célula infectada por HIV-1) ou uma célula plasmática ou uma célula B ou uma célula T.

[00293] Em outra modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento ou prevenção de câncer, infecção, doenças autoimunes ou alérgicas fornecendo ao sujeito em necessidade dos mesmos células efetoras imunes (por exemplo, células T) ou células-tronco que podem dar origem a células efetoras imunes que são manipuladas geneticamente para expressar um receptor imune de ocorrência natural (por exemplo, um TCR nativo) e uma molécula estimulante de NF-kB. Em uma modalidade, a molécula estimulante de NF-κB é um ativador seletivo de NF-κB. Em uma modalidade, o ativador de NF-κB, por exemplo, um ativador seletivo de NF-κB, é um ativador de NF-κB não viral. Em uma modalidade, o ativador de NF-κB, por exemplo, um ativador seletivo de NF-κB, não é uma proteína transmembranar e é expresso no citosol ou está preferencialmente presente no citosol. Em uma modalidade, o ativador de NF-κB, por exemplo, um ativador seletivo de NF- κB, é constitutivamente ativo. Em uma modalidade, o ativador de NF-κB, por exemplo, um ativador seletivo de NF-κB, não é constitutivamente ativo. Em uma modalidade, o ativador seletivo de NF-κB é ativado pela administração

264 / 348 de um indutor (por exemplo, um dimerizador). Em uma modalidade, o ativador seletivo de NF-κB é vFLIP K13, NEMO-K277A ou derivados dos mesmos. As células efetoras imunes que expressam moléculas estimulantes de TCR e NF-κB nativas são administradas ao paciente. Em um aspecto, a célula associada à doença é uma célula cancerígena, uma célula infectada (por exemplo, célula infectada por HIV-1) ou uma célula plasmática ou uma célula B ou uma célula T.

[00294] Em outra modalidade, a divulgação fornece métodos de tratamento ou prevenção de câncer, infecção, doenças autoimunes ou alérgicas fornecendo ao sujeito em necessidade dos mesmos células efetoras imunes (por exemplo, células T) ou células-tronco que podem dar origem a células efetoras imunes que são manipuladas geneticamente para expressar um receptor imune de ocorrência natural (por exemplo, TCR nativo) ou um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR recombinante) da divulgação e/ou uma molécula estimulante de NF-κB. Em algumas modalidades, a atividade das células CAR-T ou TCR-T pode ser controlada usando um sal solúvel em água de Dasatinib.

[00295] Em outro aspecto, um método de tratamento de um sujeito, por exemplo, redução ou melhoria de um distúrbio ou afecção hiperproliferativa (por exemplo, um câncer), por exemplo, tumor sólido, tumor de tecidos moles, câncer do sangue ou lesão metastática em um sujeito é fornecido.

[00296] Em ainda outra modalidade, a divulgação se refere a um método de tratamento de uma doença em um sujeito. O método compreende a administração ao sujeito de uma célula que expressa um receptor imune de ocorrência natural e/ou um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR recombinante) da divulgação e/ou uma molécula estimulante de NF-kB da divulgação de modo que a doença seja tratada no sujeito. Em um aspecto, o método compreende a administração ao sujeito de uma célula que expressa seu TCR endógeno (ou nativo) e uma molécula

265 / 348 estimulante de NF-κB da divulgação de modo que a doença seja tratada no sujeito. Em um aspecto, a doença associada à expressão de um antígeno associado à doença como descrito neste documento é uma doença infecciosa. Em um aspecto, a doença infecciosa é uma doença associada à infecção pelo HIV1, HIV2, HTLV1, vírus Epstein Barr (EBV), citomegalovírus (CMV), adenovírus, vírus adeno-associado, vírus BK, vírus humano BK, herpesvírus humano 6, herpesvírus humano 8, vírus influenza A, vírus da parainfluenza, vírus influenza B, vírus da gripe aviária, coronavírus MERS e SARS, vírus da febre hemorrágica do Congo da Criméia, vírus do rinoceronte, enterovírus, vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus do Ebola, vírus de Marburg, vírus da febre de Lassa, vírus do zika, RSV, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus de rinoceronte, vírus da varicela, vírus do herpes simplex 1 e 2, vírus da varicela zoster, HIV-1, HTLV1, vírus da hepatite, enterovírus, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus da febre do vale de Nipah e Rift, Vírus da encefalite japonesa, mycobacterium tuberculosis, espécies atípicas de micobactérias, Pneumocystis jirovecii, toxoplasmose, rickettsia, nocardia, aspergillus, mucor ou candida.

[00297] Em algumas modalidades, o receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) se liga especificamente a um antígeno de HIV. Em algumas modalidades, o antígeno do HIV é um antígeno do HIV-

1. Em algumas modalidades, o antígeno do HIV é uma proteína do envelope do HIV ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, o antígeno do HIV é gpl20 ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, o antígeno do HIV é o local de ligação a CD4 na gpl20. Em algumas modalidades, o antígeno do HIV é o local de ligação induzido por CD4 na gpl20. Em algumas modalidades, o antígeno do HIV é o N-glicano na gpl20. Em algumas modalidades, o antígeno do HIV é o V2 da gpl20. Em algumas modalidades, o antígeno do HIV é a região proximal da membrana na gp41.

[00298] A divulgação inclui um tipo de terapia celular em que células

266 / 348 efetoras imunes (por exemplo, células T ou células-tronco que dão origem a células T) são geneticamente modificadas para expressar um CAR ou TCR da divulgação e/ou uma molécula estimulante de NF-κB e a célula T ou célula- tronco que expressa CAR é infundida em um receptor em necessidade da mesma. A divulgação também inclui um tipo de terapia celular em que células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células-tronco que dão origem a células T) são geneticamente modificadas para expressar uma molécula estimulante de NF-κB e essas células são infundidas em um destinatário em necessidade das mesmas. As células infundidas são capazes de exterminar as células associadas à doença (por exemplo, células tumorais ou células infectadas por vírus) no receptor. Diferentemente das terapias com anticorpos, as células efetoras imunes modificadas pelo ativador NF-κB (por exemplo, células T, células-tronco) são capazes de se replicar in vivo, resultando em persistência a longo prazo que pode levar ao controle sustentado do tumor. Em vários aspectos, o ativador de NF-κB modificou células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células-tronco que podem dar origem a células T) administradas ao paciente, ou sua progênie, persistir no paciente por pelo menos quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze meses, quatorze meses, quinze meses, dezesseis meses, dezessete meses, dezoito meses, dezenove meses, vinte meses, vinte e um meses, vinte e dois meses, vinte e três meses, dois anos, três anos, quatro anos ou cinco anos após a administração da célula T ou células-tronco ao paciente.

[00299] A divulgação também inclui um tipo de terapia celular em que células-tronco (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas ou células-tronco linfoides ou células-tronco embrionárias ou células-tronco pluripotentes induzidas) que são capazes de dar origem a células efetoras imunes (por exemplo, células T) são modificadas para expressar um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) da divulgação e/ou uma

267 / 348 molécula estimulante de NF-kB e são administradas a um receptor com necessidade do mesmo.

As células-tronco administradas dão origem a células efetoras imunes (por exemplo, células T) após o transplante no receptor, que (isto é, as células efetoras imunes) são capazes de exterminar as células associadas à doença no receptor.

Assim, em vários aspectos, as células efetoras imunes (por exemplo, células T) que são produzidas no paciente após a administração de células-tronco que expressam o ativador de CAR/NFκB, persistem no paciente por pelo menos uma semana, 2 semanas, 3 semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze meses, quatorze meses, quinze meses, dezesseis meses, dezessete meses, dezoito meses, dezenove meses, vinte meses, vinte e um meses, vinte e dois meses, vinte e três meses, dois anos, três anos, quatro anos, cinco anos, dez anos ou vinte anos após a administração da célula T ou células-tronco para o paciente.

A divulgação também inclui um tipo de terapia celular em que células-tronco capazes de dar origem a células efetoras imunes (por exemplo, células T) são modificadas para expressar um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) da divulgação e/ou uma molécula estimulante de NF-κB e são diferenciadas in vitro para gerar células efetoras imunes que são infundidas a um receptor em necessidade da mesma.

As células efetoras imunes infundidas (por exemplo, células T) após a infusão no receptor são capazes de exterminar as células associadas à doença no receptor.

Assim, em vários aspectos, as células efetoras imunes (por exemplo, células T) que são administradas ao paciente persistem no paciente por pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, uma semana, 2 semanas, 3 semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze meses, quatorze meses, quinze meses, dezesseis meses, dezessete meses, dezoito meses, dezenove meses, vinte meses, vinte e um meses, vinte e dois

268 / 348 meses, vinte e três meses, dois anos, três anos, quatro anos, cinco anos, dez anos ou vinte anos.

[00300] A divulgação inclui um tipo de terapia celular em que células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células-tronco que dão origem a células T) são geneticamente modificadas para expressar CARs direcionados a dois ou mais antígenos diferentes na mesma célula, e essa célula T ou célula-tronco é infundida em um receptor em necessidade da mesma. Em uma modalidade, pelo menos um dos CARs tem como alvo um antígeno expresso nas células hematopoiéticas. Em uma modalidade, pelo menos um dos CARs tem como alvo um antígeno selecionado do grupo de CD19, CD20, CD22, BCMA, CS1, CD138, Lym1, Lym2, CD33 e CD123. Em uma modalidade, pelo menos um dos CARs tem como alvo um antígeno expresso nas células hematopoiéticas e pelo menos um outro dentre os CARs tem como alvo um antígeno expresso nos tumores sólidos. Em uma modalidade, pelo menos um dos CARs tem como alvo um antígeno selecionado a partir do grupo de CD19, CD20, CD22, BCMA, CS1, CD138, Lym1, Lym2, CD33 ou CD123 e pelo menos um outro CAR tem como alvo um antígeno selecionado a partir do grupo de Mesotelina, Her2, Receptor de Folato 1, ROR1, IL13Ra2, AFP, WT1, Ras, NY-ESO-1, DLL3, CD70 e PTK7. Em uma modalidade, pelo menos um dos CARs é um SIR. Em uma modalidade, pelo menos um dos CARs é um Ab-TCR. Em uma modalidade, pelo menos um dos CARs é um SIR e o outro CAR é um TFP CD3ε/γ/δ. Em uma modalidade, pelo menos um dos CARs é um Ab-TCR e o outro CAR é um TFP CD3ε/γ/δ. Em uma modalidade, as células têm expressão prejudicada de pelo menos uma das cadeias TCR nativas. A divulgação também inclui um tipo de terapia celular em que células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células-tronco que dão origem a células T) são geneticamente modificadas para expressar CARs visando dois antígenos diferentes e uma molécula estimulante de NF-κB, e essas células são infundidas a um receptor em necessidade da mesma. Na

269 / 348 modalidade, as células são autólogas, enquanto em outras modalidades as células são alogênicas. As células infundidas são capazes de exterminar as células associadas à doença (por exemplo, células tumorais ou células infectadas por vírus) no receptor.

[00301] No que diz respeito a imunização ex vivo, pelo menos um dos seguintes ocorre in vitro antes da administração da célula em um mamífero: i) expansão das células, ii) introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) da divulgação e/ou uma molécula estimulante de NF-κB para as células ou iii) criopreservação das células.

[00302] Os procedimentos ex vivo são bem conhecidos na técnica e são discutidos mais detalhadamente abaixo. Resumidamente, as células são isoladas a partir de um mamífero (por exemplo, um ser humano) e geneticamente modificado (isto é, transduzidas ou transfectadas in vitro) com um ou mais vectores que expressam um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) da divulgação e/ou uma molécula estimulante de NF-κB divulgada neste documento. O receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e a célula modificada por ativador de NF-kB pode ser administrada a um receptor mamífero para proporcionar um benefício terapêutico. O receptor de mamífero pode ser um ser humano e o receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR), e a célula modificada por ativador de NF-κB pode ser autóloga em relação ao receptor. Alternativamente, as células podem ser alogênicas, singênicas ou xenogênicas em relação ao receptor.

[00303] O procedimento para expansão ex vivo de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras é descrito na Patente no US 5.199.942, incorporada neste documento a título de referência, e pode ser aplicado às células da presente invenção. Outros métodos adequados são conhecidos na técnica, portanto, a presente invenção não está limitada a nenhum método

270 / 348 particular de expansão ex vivo das células. Resumidamente, a cultura ex vivo e a expansão de células efetoras imunes (por exemplo, células T) compreendem: (1) coletar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas CD34+ de um mamífero da coleta de sangue periférico ou explantes da medula óssea; e (2) expandir essas células ex vivo. Além dos fatores de crescimento celular descritos na Pat. no US 5.199.942, outros fatores tais como flt3-L, IL-1, IL-3 e ligante c-kit, podem ser utilizados para cultura e expansão das células.

[00304] Geralmente, as células ativadas e expandidas como descritas neste documento podem ser utilizadas no tratamento e prevenção de doenças que surgem em indivíduos imunocomprometidos. Em certos aspectos, as células da divulgação são usadas no tratamento de pacientes em risco de desenvolver doenças, distúrbios e afecções associados à expressão de um antígeno associado à doença, como descrito neste documento. Assim, a divulgação fornece métodos para o tratamento ou prevenção de doenças, distúrbios e afecções associados à expressão de um antígeno associado à doença, como descrito neste documento, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade da mesma uma quantidade terapeuticamente eficaz das células-tronco ou células efetoras imunes modificadas por moléculas estimulantes de CAR/TCR/NF-κB (por exemplo, células T) que são capazes de gerar células efetoras imunes da divulgação.

[00305] Em um aspecto, as células que expressam moléculas estimulantes de CAR/TCR/NF-κB das divulgações podem ser usadas para tratar uma doença proliferativa como um câncer ou malignidade ou é uma afecção pré-cancerosa, como uma mielodisplasia, uma síndrome mielodisplásica ou uma pré-leucemia. Além disso, uma doença associada a um antígeno associado ao câncer, como descrito neste documento, inclui, porém sem limitação, por exemplo, cânceres atípicos e/ou não clássicos,

271 / 348 doenças malignas, afecções pré-cancerosas ou doenças proliferativas que expressam um antígeno associado ao câncer, como descrito neste documento. As indicações não relacionadas ao câncer associadas à expressão de um antígeno associado à doença, conforme descrito neste documento, incluem, porém sem limitação, por exemplo, doença autoimune (por exemplo, lúpus), distúrbios inflamatórios (alergia e asma), afecções infecciosas (por exemplo, HIV1, CMV, EBV, gripe) e transplante.

[00306] As células efetoras imunes modificadas por molécula estimulante de CAR/TCR/NF-κB (por exemplo, células T) da divulgação podem ser administradas isoladamente ou como uma composição farmacêutica em combinação com diluentes e/ou com outros componentes como IL-2 ou outras citocinas ou populações de células.

[00307] O câncer hematológico ou afecções de câncer no sangue são os tipos de câncer, como leucemia, linfoma e afecções linfoproliferativas malignas que afetam o sangue, a medula óssea e o sistema linfático.

[00308] A leucemia pode ser classificada como leucemia aguda e leucemia crônica. A leucemia aguda pode ainda ser classificada como leucemia mieloide aguda (LMA) e leucemia linfoide aguda (LLA). A leucemia crônica inclui leucemia mieloide crônica (LMC) e leucemia linfoide crônica (LLC). Outras afecções relacionadas incluem síndromes mielodisplásicas (SMD, anteriormente conhecidas como “pré-leucemia”), que são uma coleção diversificada de afecções hematológicas unidas por produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides e risco de transformação em LMA.

[00309] O linfoma é um grupo de tumores de células sanguíneas que se desenvolvem a partir de linfócitos. Linfomas exemplificativos incluem linfoma não Hodgkin e linfoma de Hodgkin.

[00310] A divulgação fornece composições e métodos para o tratamento e prevenção de câncer. Em um aspecto, o câncer é um câncer

272 / 348 hematológico ou câncer do sangue, incluindo, porém sem limitação, câncer hematológico, uma leucemia ou um linfoma. Em um aspecto, as células que expressam CAR/TCR/NFκB da divulgação podem ser usadas para tratar cânceres e neoplasias como, porém sem limitação, por exemplo, leucemias agudas incluindo, porém sem limitação, por exemplo, leucemia linfoide aguda de células B (“LLAB”), leucemia linfoide aguda de células T (“LLAT”), leucemia linfoide aguda (LLA); uma ou mais leucemias crônicas incluindo, porém sem limitação, por exemplo, leucemia mieloide crônica (LMC), leucemia linfocítica crônica (LLC); cânceres hematológicos adicionais ou afecções hematológicas, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, leucemia prolinocítica das células B, neoplasia celular dendrítica plasmocitoide blástica, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células cabeludas, linfoma folicular de células pequenas ou células grandes, afecções linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células do manto, linfoma da zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma não Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macrobemia de Waldenstrom e “pré-leucemia” que é uma coleção diversa de afecções hematológicas unidas pela produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides e similares. Além disso, uma doença associada a um antígeno associado ao câncer, como descrito neste documento, inclui, porém sem limitação, por exemplo, cânceres atípicos e/ou não clássicos, doenças malignas, afecções pré-cancerosas ou doenças proliferativas que expressam um antígeno associado ao câncer, como descrito neste documento.

[00311] A divulgação fornece um método para administrar a um sujeito uma quantidade eficaz de uma célula, por exemplo, uma célula efetora imune ou uma população da mesma, em que cada célula compreende um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou

273 / 348 molécula estimulante de NF-κB, opcionalmente em combinação com um agente que aumenta a eficácia e/ou a segurança da célula imune. Em várias modalidades, o agente que aumenta a eficácia e/ou segurança da célula imune é selecionado a partir do grupo que consiste em (i) um inibidor da proteína fosfatase; (ii) um inibidor de quinase; (iii) uma citocina; (iv) um inibidor de uma molécula inibidora imune; (v) um agente que diminui o nível ou a atividade de uma célula TREG; (vi) um agente que aumenta a proliferação e/ou a persistência de células modificadas por um CAR/molécula estimulante de NF-kB; (vii) uma quimiocina; (viii) um agente que aumenta a expressão de CARs/TCRs; (ix) um agente que permita a regulação da expressão ou atividade de um CAR; (x) um agente que permite o controle sobre a sobrevivência e/ou persistência das células modificadas; (xi) um agente que controla os efeitos colaterais das células modificadas; (xii) um inibidor de Brd4; (xiii) um agente que entrega um agente terapêutico (por exemplo, sHVEM) ou profilático no local da doença; (xiv) um agente que aumenta a expressão do antígeno alvo contra o qual o CAR é direcionado; (xv) um antagonista do receptor da adenosina A2a; e (xvi) qualquer combinação de (i) a (xv).

[00312] Em algumas modalidades, a doença a ser tratada ou evitada é um câncer hematológico. Em outras modalidades, o câncer hematológico é leucemia. Exemplos não limitantes de leucemias agudas incluem leucemia linfoide aguda de células B (“LLAB”), leucemia linfoide aguda de células T (“LLAT”), leucemia linfoide aguda (LLA); uma ou mais leucemias crônicas incluindo, porém sem limitação, por exemplo, leucemia mieloide crônica (LMC), leucemia linfocítica crônica (LLC); cânceres hematológicos adicionais ou afecções hematológicas, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, leucemia prolinocítica das células B, neoplasia celular dendrítica plasmocitoide blástica, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células cabeludas, linfoma folicular de

274 / 348 células pequenas ou células grandes, afecções linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células do manto, linfoma da zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macrobemia de Waldenstrom e “pré-leucemia” que é uma coleção diversa de afecções hematológicas unidas pela produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides, e doenças associadas à expressão de um antígeno tumoral descrito neste documento incluem, porém sem limitação, cânceres atípicos e/ou não clássicos, doenças malignas, afecções pré-cancerosas ou doenças proliferativas que expressam um antígeno tumoral conforme descrito neste documento; e qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade, a doença associada a um antígeno tumoral descrito neste documento é um tumor sólido.

[00313] Em algumas modalidades, o antígeno tumoral associado à doença é selecionado dentre: CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (também denominado subconjunto CD2 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2- 8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα-Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor órfão de tipo tirosina-quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expresso em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina-

275 / 348

13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-11Ra); antígeno de célula-tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor de folato alfa (FRa ou FR1); Receptor de folato beta (FRb); Receptor tirosina-proteína quinase ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1); receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade Proteassoma (Prosome, Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2- 3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o-acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR-1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor

276 / 348 beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro 1A (XAGEl); receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; proteína; survivina; telomerase; antígeno 1 do tumor de carcinoma de próstata (PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil-glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY- TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1

277 / 348 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de domínio de lectina de tipo C (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGL11), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGL11, TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM-CSFR-alfa), TGFbetaR2, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR-beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina (CGHR ou GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), autoanticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, Claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A.2), Glicoproteína p, STEAP1, Liv1, Nectin-4, Cripto, gpA33, BST1/CD157, canal de cloreto de baixa condutância

278 / 348 e um antígeno reconhecido por anticorpo TNT.

[00314] Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é uma doença infecciosa incluindo, porém sem limitação, infecção por HIV1, HIV2, HTLV1, vírus Epstein Barr (EBV), citomegalovírus (CMV), adenovírus, vírus adeno-associado, vírus BK, Herpesvírus humano 6, Herpesvírus humano 8, vírus da gripe, vírus da parainfluenza, vírus da gripe aviária, coronavírus MERS e SARS, vírus da febre hemorrágica da República Democrática do Congo da Crimeia, vírus de rinoceronte, enterovírus, vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus do Ebola, vírus de Marburg, vírus da febre de Lassa, vírus zika, RSV, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus de rinoceronte, vírus da varicela, vírus do herpes simplex 1 e 2, vírus da varicela zoster, HIV- 1, HTLV1, vírus da hepatite, enterovírus, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus da febre do vale Nipah e Rift, vírus da encefalite japonesa, mycobacterium tuberculosis, espécies atípicas de micobactérias, Pneumocystis jirovecii, toxoplasmose, rickettsia, nocardia, aspergillus, mucor ou candida. Em tais doenças, o antígeno alvo associado à doença é selecionado dentre: glicoproteína do envelope do HIV1, HIV1-gag, HTLV1- Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, hemaglutinina da influenza A (HA) e GAD.

[00315] A doença a ser tratada ou evitada pelos métodos e composições da divulgação pode ser uma doença imune ou degenerativa, por exemplo, diabetes mellitus, esclerose múltipla, artrite reumatoide, pênfigo vulgar, espondilite anquilosante, tireoidite de Hoshimoto, LES, sarcoidose, esclerodermia, doença mista do tecido conjuntivo, doença do enxerto versus hospedeiro ou doença de Alzheimer. Em tais modalidades, o antígeno alvo associado à doença é um autoanticorpo.

[00316] Exemplos não limitantes adicionais de doenças associadas à expressão de um antígeno alvo incluem qualquer um dos seguintes cânceres ou afecções relacionadas: câncer de cólon, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer de fígado, carcinoma de células não pequenas do pulmão,

279 / 348 câncer de intestino delgado, câncer de esôfago, melanoma, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de testículo, câncer de útero, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer do glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasia do sistema nervoso central (CNS), linfoma primário do CNS, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma de tronco encefálico, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer de células de Merkel, câncer epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de células T, cânceres induzidas por ambiente, combinações dos denominados cânceres e lesões metastáticas dos ditos cânceres.

[00317] Em certas modalidades dos métodos ou usos descritos neste documento, a célula que expressa CAR/TCR que compreende um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou molécula estimulante de NF-kB é administrada em combinação com um agente que aumenta a eficácia da célula efetora imune, por exemplo, um ou mais inibidores da proteína fosfatase, inibidor da quinase, uma citocina, uma quimiocina, um fragmento scFV, um anticorpo Biespecífico, inibidor de uma molécula inibidora imune; uma proteína de sinalização celular, uma proteína de sinalização viral ou um agente que diminui o nível ou a atividade de uma célula TREG. Exemplos não limitantes de inibidores de proteína fosfatase incluem um inibidor de SHP-1 e/ou um inibidor de SHP-2. Exemplos não limitantes de inibidores de quinase incluem um inibidor de CDK4, um inibidor de CDK4/6 (por exemplo, palbociclib), um inibidor de BTK (por

280 / 348 exemplo, ibrutinib ou RN-486), um inibidor de mTOR (por exemplo, rapamicina ou everolimus (RAD001)), um inibidor de MNK ou um inibidor duplo de P13K/mTOR.

Em uma modalidade, o inibidor de BTK não reduz ou inibe a atividade de quinase induzível por interleucina 2(ITK). Exemplos não limitantes de um antagonista do receptor A2a incluem Vipadenant.

Em algumas modalidades, o agente que inibe a molécula inibidora imunológica pode ser um ou mais dentre um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um ácido nucleico inibitório, repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas e agrupadas (CRISPR), uma nuclease efetiva do tipo ativador de transcrição (TALEN) ou uma endonuclease de dedo de zinco (ZFN) que inibe a expressão da molécula inibidora.

Em outras modalidades dos métodos ou usos descritos neste documento, o agente que diminui o nível ou a atividade das células TREG é escolhido dentre ciclofosfamida, anticorpo antiGITR, depleção de CD25 ou uma combinação dos mesmos.

Em certas modalidades dos métodos ou usos descritos neste documento, a molécula inibidora imune é selecionada do grupo que consiste em PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR beta, CEACAM-1, CEACAM-3 e CEACAM-5. Em outras modalidades, a citocina é escolhida dentre IL2, IL-7, IL-15 ou IL-21, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outras modalidades, a célula efetora imune compreendendo o CAR/TCR e/ou a molécula estimulante de NF-κB e uma segunda, por exemplo, qualquer uma das terapias combinadas divulgadas neste documento (por exemplo, o agente que aumenta a eficácia da célula efetora imune) são administradas de modo substancialmente simultâneo ou sequencial.

Em uma modalidade, a citocina é administrada ao indivíduo simultaneamente (por exemplo, administrada no mesmo dia) com ou logo após a administração (por exemplo, administrada 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias ou 7 dias após a administração) da célula ou população de células compreendendo um CAR/TCR e/ou uma molécula estimulante de NF-kB.

Em outras modalidades, a citocina é

281 / 348 administrada ao sujeito após um período prolongado de tempo (por exemplo, pelo menos 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas ou mais) após a administração da célula ou população de células ou após avaliação da resposta do indivíduo à célula.

[00318] Em outras modalidades, as células que expressam um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou uma molécula estimulante de NF-κB são administradas em combinação com um agente que melhora um ou mais efeitos colaterais associados à administração de uma célula que expressa um CAR/TCR e/ou uma molécula estimulante de NF-κB. Os efeitos colaterais associados à célula de expressão de CAR/TCR e/ou molécula estimulante de NF-κB podem ser escolhidos entre a síndrome de liberação de citocinas (SRC), linfohistiocitose hemofagocítica (HLH) ou complicações neurológicas. Exemplos de tais agentes incluem esteroides (por exemplo, prednisona, dexametasona), antagonistas da IL6R (por exemplo, tocilizumab), antagonistas da IL1R (por exemplo, anakinra), inibidores da src quinase (por exemplo, dasatinibe ou um sal solúvel em água de dasatinibe), um inibidor da quinase (por exemplo, Ibrutinibe), inibidores da calcineurina (por exemplo, tacrolimus ou ciclosporina A) ou fármacos quimioterápicos (por exemplo, ciclofosfamida, metotrexato ou vincristina).

[00319] Em uma modalidade, as células que expressam um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou molécula estimulante de NF-κB são administradas em combinação com uma dose baixa e de melhora imunológica de um inibidor de mTOR. Embora não se deseje ficar vinculado à teoria, acredita-se que o tratamento com uma dose baixa e de melhora imunológica (por exemplo, uma dose não suprime completamente o sistema imunológico, mas é suficiente para melhorar a função imunológica) é acompanhado por uma redução em células T positivas para PD- 1 ou um aumento nas células negativas para PD-1. As células T positivas para PD-1, mas não as células T negativas para PD-1, podem ser

282 / 348 esgotadas por acoplamento com células que expressam um ligante PD-1, por exemplo, PD-L1 ou PD-L2.

[00320] As composições farmacêuticas da divulgação podem compreender uma célula que expressa receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou molécula estimulante de NF-kB, por exemplo, uma pluralidade de células que expressam CAR/TCR e/ou moléculas estimulantes de NF-kB, como descrito neste documento, em combinação com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmacêutica ou fisiologicamente aceitáveis. Tais composições podem compreender tampões, tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e similares; carboidratos como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições da divulgação podem ser formuladas para administração intravenosa. A composição pode compreender adicionalmente um agente ativo secundário (por exemplo, um agente anticâncer, antiviral ou antibiótico).

[00321] As composições farmacêuticas da divulgação podem ser administradas de maneira apropriada à doença a ser tratada (ou evitada). A quantidade e a frequência da administração serão determinadas por fatores como a condição do paciente e o tipo e a gravidade da doença do paciente. Quando “uma quantidade imunologicamente eficaz”, “uma quantidade eficaz antitumoral”, “uma quantidade eficaz inibidora de tumor” ou “quantidade terapêutica” ou “anti-infecciosa” é indicada, a quantidade das composições da divulgação a serem administradas pode ser determinada por um médico, considerando as diferenças individuais em idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástase e condição do paciente (sujeito), conforme o caso. Pode-se, em geral, afirmar que uma composição farmacêutica compreendendo as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células

283 / 348 NK) descritas neste documento pode ser administrada a uma dosagem de 104 a 109 células/kg de peso corporal, em alguns casos, 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro dessas faixas. As composições de células T também podem ser administradas várias vezes nessas dosagens. As células podem ser administradas usando técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (consultar, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1.676, 1988).

[00322] Em certos aspectos, pode ser desejável administrar células efetoras imunes ativadas (por exemplo, células T, células NK) a um sujeito e, posteriormente, coletar sangue novamente (ou realizar uma aférese), ativar células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK), de acordo com a divulgação, e reinfundir o paciente com essas células efetoras imunes ativadas e expandidas (por exemplo, células T, células NK). Esse processo pode ser realizado várias vezes a cada poucas semanas. Em certos aspectos, células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) podem ser ativadas a partir de coleta de sangue de 10 cm³ a 400 cm³. Em certos aspectos, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) são ativadas a partir de coleta de sangue de 20 cm³, 30 cm³, 40 cm³, 50 cm³, 60 cm³, 70 cm³, 80 cm³, 90 cm³ ou 100 cm³.

[00323] Em algumas modalidades, os indivíduos podem sofrer leucaférese, em que os leucócitos são coletados, enriquecidos ou esgotados ex vivo para selecionar e/ou isolar as células de interesse, por exemplo, células T. Esses isolados de células T podem ser expandidos por métodos conhecidos na técnica e tratados e/ou transformados de modo que um ou mais construtos da divulgação possam ser introduzidos, criando, assim, uma célula CAR-T ou TCR-T da divulgação que coexpressa um módulo acessório que codifica um ativador de NF-κB. Os indivíduos necessitados podem subsequentemente ser submetidos a tratamento padrão com quimioterapia em altas doses seguido de transplante de células-tronco do sangue periférico. Em certos aspectos, após

284 / 348 ou simultaneamente ao transplante, os indivíduos recebem uma infusão das células CAR-T ou células TCR-T expandidas da divulgação que opcionalmente coexpressam um módulo acessório que codifica um ativador de NF-κB. Em um aspecto adicional, as células expandidas são administradas antes ou após a cirurgia.

[00324] Também são fornecidos kits para praticar a divulgação. Por exemplo, kits para tratar um câncer em um sujeito ou produzir uma célula que expressa um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou molécula estimulante de NF-κB divulgados neste documento. Os kits podem incluir pelo menos uma molécula de ácido nucleico ou vetor que codifica um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou molécula estimulante de NF-κB junto com um método para introduzir o ácido nucleico nas células efetoras imunes. O kit pode incluir um vírus compreendendo um ácido nucleico que codifica um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou molécula estimulante e produtos químicos NF-κB, como polibreno, para melhorar a transdução do vírus. O kit pode conter componentes para o isolamento de células T para a expressão de um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR). Alternativamente, o kit pode conter células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK) ou as células-tronco que expressam um receptor imune de ocorrência não natural (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou molécula estimulante de NF-κB. Mais de um dentre o receptor imune não ocorre naturalmente (por exemplo, CAR e/ou TCR) e/ou as moléculas estimulantes de NF-kB divulgados podem ser incluídos no kit. O kit pode incluir um recipiente e uma etiqueta ou bula no recipiente ou associada ao mesmo.

[00325] Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente tipicamente

285 / 348 contém uma composição que inclui uma ou mais moléculas de ácido nucleico, vírus, vetores, células T, etc. Em várias modalidades, o recipiente pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Um rótulo ou bula indica que a composição é usada para tratar a afecção específica. O rótulo ou bula normalmente inclui ainda instruções para o uso de componentes divulgados, por exemplo, em um método de tratamento ou prevenção de um tumor ou de produção de uma célula T-CAR. A bula inclui tipicamente instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou avisos sobre o uso desses produtos terapêuticos. Os materiais instrucionais podem ser escritos em formato eletrônico (como um disquete ou disco compacto) ou podem ser visuais (como arquivos de vídeo). Os kits também podem incluir componentes adicionais para facilitar a aplicação específica para a qual o kit foi projetado. Assim, por exemplo, o kit pode adicionalmente conter meios para medir a expressão de um CAR e/ou molécula estimulante de NF-κB nas células T ou dentro das mesmas ou para determinar o número ou porcentagem de células T que expressam o CAR e/ou a molécula estimulante de NF-κB ou para determinar a funcionalidade das células. Os kits podem adicionalmente incluir tampões e outros reagentes usados rotineiramente para a prática de um método específico. Esses kits e conteúdo apropriado são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00326] A divulgação é adicionalmente descrita a título de referência aos seguintes exemplos experimentais. Esses exemplos são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não devem ser limitantes, a menos que especificado de outra forma. Assim, a divulgação não deve de maneira alguma ser interpretada como limitada aos exemplos a seguir, mas deve ser interpretada de modo a abranger toda e qualquer variação que se torne evidente como

286 / 348 resultado do ensino fornecido neste documento.

EXEMPLOS

[00327] Linhas celulares manipuladas geneticamente para expressar luciferases (por exemplo, GLuc ou NLuc) para medir a citotoxicidade de diferentes construtos visando diferentes antígenos de superfície celular e intracelulares são fornecidas na Tabela A. As linhas celulares usadas nessas experiências, os antígenos alvo nas linhas celulares e meios de crescimento dos mesmos são mostrados na Tabela A a seguir. As células foram cultivadas a 37 °C, em uma incubadora umidificada com CO2 a 5%. As linhas celulares foram obtidas no programa de reagentes ATCC, NIH AIDS ou estavam disponíveis no laboratório. TABELA A: Linha celular Condições de Cultura Antígenos Alvo de CAR Exemplificativos Expressos BC-1 RPMI, FCS a 20% BCMA, GPRC, CD138 BC-3 RPMI, FCS a 20% BCMA, GPRC, CD138 BCBL-1 RPMI, FCS a 20% GPRC, CD138 JSC-1 RPMI, FCS a 20% GPRC, CD138 MM1S RPMI, FCS a 10% CD38, GPRC, CD44, CD200R U266 RPMI, FCS a 10% BCMA, WT1/HLA-A2 +, CS1, CLL1, CD138, c-MET, IL6R, CD179b, NY-ESO/HLA-A2, NYBR, LAMP1 L363 RPMI, FCS a 10% BCMA, GPRC, WT1/HLA-A2 +, CS1, CLL1, CD138, NY- ESO/HLA-A2, NYBR, LAMP1 K562 RPMI, FCS a 10% CD33, IL1Ra, TnAg BV173 RPMI, FCS a 10% CD123, CD179b, IL1Ra, WT1/HLA-A2+, CXCR4, FLT3, CD179a Nalm6 RPMI, FCS a 10% CD19, CD20, CD22, CD179b, CD179a HL60 RPMI, FCS a 10% CD33, CD34, CLL1, IL6R, CD32, CD179 U937 RPMI, FCS a 10% CD4, CLL1 RS:411 RPMI, FCS a 20% CD19, Receptor Beta de Folato (FRbeta), TGFbeta, CD179b, NKG2DNKG2D, FLT3, CD179a MV:411 RPMI, FCS a 10% FLT3, CD123, FRbeta Raji RPMI, FCS a 10% CD19, CD20, CD22, BCMA, CD38, CD70, CD79, Receptor Beta de Folato, CLL1 HEL-92.1.7 RPMI, FCS a 10% MPL, CD33, CD32, CD200R (HEL) Jurkat RPMI, FCS a 10% TnAg, TSLRP, TSHR, CD4, CD38 Daudi RPMI, FCS a 10% BCMA, FRbeta REC-1 RPMI, FCS a 10% NKG2DNKG2D, ROR1 KG-1 RPMI, FCS a 20% CD33, CD34, CD123, TSLRP CEM RPMI, FCS a 10% CD5, CD43 U937 RPMI, FCS a 10% CD4, CLL1 LAMA5 RPMI, FCS a 10% WT1/HLA-A2 A549 DMEM, FCS a 10% ROR1, CD22, TIM1, CDH17 HT29 DMEM, FCS a 10% EGFR, SLEA, c-MET Molm-13 RPMI, FCS a 20% FLT3, IL6R, LAMP1, TSLRP, CD4, CSF2RA, CXCR4, IL6R, CSF2RA, GPC3 A431 DMEM, FCS a 10% EGFR, Receptor Alfa de Folato, Her3

287 / 348 Linha celular Condições de Cultura Antígenos Alvo de CAR Exemplificativos Expressos P19 DMEM, FCS a 10% SSEA THP-1 RPMI, FCS a 10% CD32, CD33, CXCR4, CD123, CD44, IL6R, Receptor Beta de Folato, CD70, LAMP1, FLT3, CSF2RA U87MG DMEM, FCS a 10% CD276, gpNMB, IL13RA2 LoVo DMEM, FCS a 10% Fator de Tecido, CDH17, EGFR SKOV-3 DMEM, FCS a 10% Receptor Alfa de Folato (FR1), FSHR, Her2, Her3, LHR, MSLN, TIM1, EPCAM NCI-H1993 DMEM, FCS a 10% EGFR Kasumi-1 RPMI, FCS a 20% CLEC5A, PR1/HLA-A2, TGFbeta, Jeko-1 RPMI, FCS a 20% BCMA, ROR1 PC-3 DMEM, FCS a 10% CGH, TROP2, PSCA, PSMA. EPCAM, FSHR, CLD18A2 (CLDN18.2) HeLa DMEM, FCS a 10% EGFR, FR1, MSLN, TSHR LnCap DMEM, FCS a 10% EGFR, FSHR, PSCA, PSMA, CD22, Her3, CD22, LHR, CLD18A2 (CLDN18.2) OVCAR-3 DMEM, FCS a 10% B7H4, CDH6, DLL3, FR1, FSH, LHR, MSLN, PTK7, TnAg, TSHR, L1CAM MEL-624 DMEM, FCS a 10% CDH19, GD2, GD3, gp100/HLA-A2, gpNMB, HMWMAA, NYESO/HLA-A2, MART1/HLA-A2 LS174-T DMEM, FCS a 10% CEA MEL-526 DMEM, FCS a 10% GD2 MDA-MB231 DMEM, FCS a 10% CD324, Muc1 L1236 RPMI, FCS a 20% CD30, CD23, PDL1 L428 RPMI, FCS a 20% CD30, CD123, CCR4, PDL1 L540 RPMI, FCS a 20% CD30, CCR4, PDL1 Molt-16 RPMI, FCS a 20% IL1ra, NKG2DNKG2D CEM RPMI, FCS a 10% CD5 MG-63 DMEM, FCS a 10% IL13RA2 Karpass-299 RPMI, FCS a 20% Alk, GPRC, PDL1 MCF7 DMEM, FCS a 10% B7D4, CD276, TROP2, Her3, Muc1, LewisY, LHR AA-2 RPMI, FCS a 10% Glicoproteína do envelope do HIV1 (gp120) HL2/3 DMEM, FCS a 10% Glicoproteína do envelope do HIV1 (gp120) TF228.1.16 DMEM, FCS a 10% glicoproteína do envelope do HIV1 (gp120), CCR4 TT DMEM, FCS a 10% TGF-Beta, TSHR, GFRalpha4 DMS79 RPMI, FCS a 10% Fucosyl-GM1, Slea (CA19.9; Antígeno Sialyl Lewis) LAN-5 DMEM, FCS a 10% ALK, DLL3, GFRalpha4, FUCOSYL-GM1 PEER1 RPMI, FCS a 10% TSHR SK-MEL-37 DMEM, FCS a 10% DLL3, GD2 F9 DMEM, FCS a 10% SSEA HepG2 DMEM, 10% de FBS GPC3, AFP/HLA-A2

[00328] A linhagem celular Jurkat (clone E6-1) manipulada geneticamente com um gene repórter EGFP (ou GFP) dependente de NFAT foi um presente do Dr. Arthur Weiss da Universidade da Califórnia em São Francisco e foi descrita para estudar a sinalização de CAR ((Wu, CY et al., Science 350: 293 a 302,2015). As células Jurkat foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, penicilina e estreptomicina.

GERAÇÃO DE VETORES LENTIVIRAIS QUE CODIFICAM RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICOS CONTRA MPL

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[00329] O vetor pLENTI-Blast foi derivado do vetor pLenti6v5gw_lacz (Invitrogen; ThermoFisher Scientific) por remoção do gene LacZ. O pLenti-MP2 foi um presente de Pantelis Tsoulfas (plasmídeo Addgene # 36097) e foi usado para gerar o vetor lentiviral pLenti-EF1a ou pLenti-EF1α [SEQ ID NO: 3.837] pela substituição do promotor CMV pelo promotor EF1α humano usando técnicas de biologia molecular padrão. O pLenti-EF1a-DWPRE [SEQ ID NO: 3.838] foi derivado do vetor pLENTI- EF1α por deleção da sequência WPRE. Um fragmento Sac II interno foi excluído do promotor EF1α para gerar o promotor EF1alpha (EF1a)-D-SACII (SEQ ID NO: 3.842). O vetor psPAX2 foi um presente de Didier Trono (plasmídeo Addgene # 12260). O plasmídeo de envelope de pLP/VSVG e as células 293FT foram obtidos junto à Invitrogen (ThermoFisher Scientific). O vetor de transferência retroviral MSCVneo, MSCVhygro e MSCVpac e o vetor de embalagem pKAT foram obtidos no laboratório do Dr. Robert Illaria. O plasmídeo phRGTK Renilla Luciferase era da Promega.

[00330] A geração de receptor de antígeno quimérico contendo vetores com estruturas principais BBz, CD28z e z-K13, a geração e uso de proteínas de fusão GGS-NLuc e a geração e uso de linhas de células repórteres de luciferase (por exemplo, GLuc) para medição da citotoxicidade celular usando os ensaios Matador foram descritos (documentos PCT/US2017/024843, PCT/US2017/025602 e PCT/US2017/052344).

VETORES DE LENTIVÍRUS E RETROVÍRUS

[00331] Os lentivírus foram gerados por transfecção à base de fosfato de cálcio em células 293FT, essencialmente como descrito anteriormente (Matta H et al., Cancer biology and therapy. 2 (2): 206 a 210. 2003). As células 293FT foram cultivadas em DMEM com L-glutamina a 4 mM em FCS a 10%, aminoácidos não essenciais MEM a 0,1 mM e piruvato de sódio MEM a 1 mM (referido neste documento como DMEM-10). Para a geração de lentivírus, células 293FT foram colocadas em placas em 10 ml de meio

289 / 348 DMEM-10 sem antibióticos em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm, de modo que fiquem aproximadamente 80 confluentes no dia da transfecção. No dia seguinte, as células foram transfectadas pelo método de transfecção com fosfato de cálcio usando 10 µg de plasmídeo de expressão lentiviral que codifica genes diferentes, 7,5 µg de plasmídeo PSPAX2 e 2 µg de plasmídeo PLP/VSVG. Aproximadamente 15 a 16 horas após a transfecção, 9 ml de meio foram removidos e substituídos por 5 ml de meio fresco. Aproximadamente, 48 horas após a transfecção, foram coletados 5 ml de sobrenadante (primeira coleta) e substituídos por 5 ml de meio fresco. Aproximadamente 72 horas após a transfecção, todos os meios foram coletados (segunda coleta, geralmente em torno de 6 ml). Os sobrenadantes recolhidos foram reunidos e centrifugados a 1.000 rpm durante 1 minuto para remover quaisquer detritos celulares e células não aderentes. O sobrenadante livre de células foi filtrado através de filtro de seringa de 0,45 μm. Em alguns casos, o sobrenadante foi ainda mais concentrado por ultracentrifugação a

18.500 rpm por 2 horas a 4 °C. O pélete viral foi novamente suspenso em 1/10 do volume inicial em meio XVIVO. O vírus foi ou usado fresco para infectar as células alvo ou armazenado congelado em alíquotas a -80 °C.

INFECÇÃO DE CÉLULAS T E PBMC

[00332] As células do creme leucocitário foram obtidas de doadores adultos não identificados e saudáveis do Banco de Sangue do Hospital Infantil de Los Angeles e usadas para isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por centrifugação em gradiente Ficoll-Hypaque. Os PBMC foram usados como tal ou usados para isolar células T usando microesferas magnéticas CD3 (Miltenyi Biotech) e seguindo as instruções do fabricante. As células PBMC ou T isoladas foram suspensas novamente em meio XVIVO (Lonza) suplantado com 10 ng/ml de anticorpo CD3, 10ng/ml de anticorpo CD28 e 100 UI de IL2 humana recombinante. As células foram cultivadas a 37 °C, em uma incubadora umidificada com CO2 a 5%. As

290 / 348 células foram ativadas no meio acima por 1 dia antes da infecção com vetores lentivirais. Em geral, as células primárias (por exemplo, células T) foram infectadas pela manhã usando infecção giratória (spin infection) (1.800 rpm por 90 minutos a 37 °C com 300 μl de vírus concentrado que foi novamente suspenso em meio XVIVO na presença de 8 μg/ml de Polybrene® (Sigma, no de catálogo H9268). O meio foi trocado à noite e a infecção foi repetida por mais dois dias, totalizando 3 infecções. Após a 3ª infecção, as células foram sedimentadas e novamente suspensas em meio XVIVO fresco contendo 10 ng/ml de anticorpo CD3, 10 ng/ml de anticorpo CD28 e 100 UI de IL2 humana recombinante e suplementadas com os respectivos antibióticos (se indicado) e colocadas no balão de cultura celular para seleção, salvo indicação em contrário. As células foram cultivadas no meio acima por 10 a 15 dias caso nenhuma seleção de fármacos fosse usada e por 20 a 30 dias caso a seleção de fármacos fosse usada. Nos casos em que as células foram infectadas com um EGFP expressando lentivírus, as mesmas foram expandidas sem seleção de fármacos ou ordenadas por fluxo para enriquecer as células que expressam EGFP. Para infecção de linhas celulares de câncer, aproximadamente 500.000 células foram infectadas com 2 ml do sobrenadante viral não concentrado em um volume total de 3 ml com Polybrene® (Sigma, no de catálogo H9268). Então, na manhã seguinte, as células foram sedimentadas e novamente suspensas no meio com os respectivos antibióticos e colocadas no balão de cultura celular para seleção.

[00333] Essencialmente, um procedimento semelhante ao descrito acima para a produção de vetores de lentivírus foi usado para geração de vetores retrovirais, com a exceção de que as células 293FT foram geralmente transfectadas em placas de cultura de tecidos de 10 cm em 10 ml de meio DMEM-10 usando 10 μg de construto retroviral, 4 μg de pKAT e 2 μg de plasmídeo VSVG. A coleta do vírus e a infecção das células alvo foram realizadas essencialmente como descrito acima para vetores lentivirais.

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ANTICORPOS E FÁRMACOS

[00334] O blinatumomab foi obtido junto à Amgen. A digitonina foi adquirida na Sigma (no Cat. D141) e uma solução mãe de 100 mg/ml foi produzida em DMSO. Foi feito um estoque diluído de 1 mg/ml em PBS. A concentração final de digitonina usada para a lise celular foi de 30 μg/ml, a menos que indicado de outra forma.

ELISA

[00335] A IL2 humana, IFNγ, IL6 e TNFα foram medidas no sobrenadante da cultura de células de células efetoras Jurkat-NFAT-GFP ou células T que expressam CAR que foram cocultivadas com as linhas celulares específicas por 24 a 96 horas usando kits ELISA disponíveis comercialmente junto à R&D systems (Minneapolis, MN) e BD Biosciences e seguindo as recomendações do fabricante.

ANÁLISE FACS PARA DETECTAR EXPRESSÃO DE CAR

[00336] O Anticorpo Monoclonal conjugado com APC c-Myc anti- humano de camundongo (número de catálogo IC3696A) foi de R&D Systems (Minneapolis, MN). A proteína L biotinilada foi adquirida junto à GeneScript (Piscataway, NJ), reconstituída em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 1 mg/ml e armazenada a 4 °C.Estreptavidina-APC (SA1005) foi adquirido junto à ThermoFisher Scientific.

[00337] Para a detecção de CARs usando coloração com Myc, 1 x 106 células foram colhidas e lavadas três vezes com 3 ml de 1 x PBS gelado contendo tampão de lavagem de albumina de soro bovino (BSA) a 4%. Após a lavagem, as células foram novamente suspensas em 0,1 ml do tampão de lavagem gelado contendo 10 ml de anticorpo Myc conjugado com APC e incubadas no escuro por 1 hora, seguido por duas lavagens com tampão de lavagem gelado.

[00338] Para a detecção de CARs utilizando coloração de Proteína L, 1 x 106 células foram colhidas e lavadas três vezes com 3 ml de 1 x PBS gelado

292 / 348 contendo tampão de lavagem de albumina de soro bovino (BSA) a 4%. Após a lavagem, as células foram novamente suspensas em 0,1 ml do tampão de lavagem gelado contendo 1 μg de proteína L a 4 °C por 1 hora. As células foram lavadas três vezes com tampão de lavagem gelado e depois incubadas (no escuro) com 10 ml de estreptavidina conjugada com APC em 0,1 ml do tampão de lavagem por 30 minutos, seguido por duas lavagens com tampão de lavagem gelado. O FACS foi realizado usando o analisador FACSVerse da BD Biosciences.

ENSAIO DE EXTERMÍNIO CELULAR

[00339] Para medir o extermínio celular, um ensaio inovador baseado na expressão citosólica ectópica de Gluc, NLuc e outras luciferases foi utilizado como descrito no documento PCT/US2017/052344 “A Non- Radioactive Cytotoxicity Assay”. O método envolve a expressão de um repórter nas células alvo de uma maneira que seja preferencialmente retido dentro das células saudáveis, mas seja liberado das células exterminadas e em extermínio ou cuja atividade possa ser preferencialmente medida nas células exterminadas e em extermínio. O repórter preferencial para esse ensaio são 1) formas não secretadas de luciferases dos copépodes, como Gaussia princeps, 2) repórteres de luciferase manipulados geneticamente a partir de camarões do fundo do mar, como o NanoLuc. A sequência de vários desses vetores repórter exemplificativos é fornecida nas SEQ ID NO: 3.845 a SEQ ID NO:

3.851. Os vetores acima foram usados para gerar retrovírus e lentivírus que, por sua vez, foram usados para gerar população policlonal de várias linhas de células-alvo expressando estavelmente GLuc, NLuc ou TurboLuc após a seleção com antibióticos apropriados. Salvo indicação em contrário, as células alvo que expressam de forma estável as diferentes luciferases foram colocadas em placa em triplicado em uma placa de 384 poços no meio utilizado para o crescimento das células alvo. As células alvo que crescem em suspensão foram colocadas, de modo geral, em placa uma concentração de 2 a 3 x 104

293 / 348 por poço, enquanto que as células-alvo que crescem como monocamadas aderentes foram colocadas em placa a uma concentração de 1 a 2 x 104 por poço. Salvo indicação em contrário, as células alvo foram cocultivadas com as células T geneticamente modificadas (isto é, aquelas que expressam CAR) na razão Efetor:Alvo (E:T) variando de 1:1 a 10:1 por 4 horas a 96 horas. No caso de as células alvo crescerem como células aderentes (por exemplo, células HeLa), as mesmas foram permitidas fixar-se ao fundo dos poços durante a noite antes de as células T serem adicionadas. A indução de lise das células alvo mediada por células T foi avaliada pelo aumento da atividade da luciferase, conforme medido pelo leitor de placas de sinergia BioTek, injetando diretamente 0,5 x tampão de ensaio CTZ contendo coeloentrazina nativa (Nanaolight), como descrito abaixo.

ENSAIO CTZ

[00340] Uma solução mãe 100X de coelenterazina nativa (CTZ; Nanolight, número de catálogo 303) foi produzida dissolvendo 1 mg de pó de CTZ liofilizado em 1,1 ml de metanol a 100% suplementado com 30 µl de HCl 6N para evitar a oxidação da CTZ com o tempo. Para produzir o tampão de ensaio de CTZ, a solução mãe 100X de CTZ foi diluída até uma concentração de 0,5X em PBS. Salvo indicação em contrário, um volume total de 15 μl do tampão de ensaio CTZ (como preparado acima) foi adicionado a cada poço de uma placa branca de 384 poços (Greiner, placa branca de 384 poços, número de catálogo 781075) contendo células que expressam a forma não secretória da luciferase em aproximadamente 50 a 60 μl de volume de meio e as placas foram lidas para luminescência usando o leitor de placas BioTek synergyH4. Para placas de 96 poços, as células foram colocadas em placa em 200 μl de meio e foram adicionados aproximadamente 50 μl de tampão de ensaio 0,5X CTZ. Salvo indicação em contrário, o tampão de ensaio 0,5X CTZ foi utilizado para avaliar a atividade de GLuc, TurboLuc16 e MLuc7. O tampão de ensaio CTZ (diluído para uma

294 / 348 concentração de 0,125X) também foi utilizado para medir a atividade de NLuc em algumas experiências. Em geral, a menos que indicado de outra forma, o volume de tampão de ensaio 0,5X CTZ adicionado foi aproximadamente 1/4 do volume do líquido no poço que contém as células, embora o ensaio também tenha funcionado quando o ensaio 0,5X CTZ foi adicionado ao meio contendo as células em volume 1:1. A atividade de Gluc em poços contendo apenas o meio (Med) e nos poços em que as células-alvo foram incubadas com células T que não foram infectadas com qualquer construto CAR (T-UI) foi usada como controle, quando indicado.

ENSAIO PARA DETECTAR A EXPRESSÃO DE ANTÍGENOS NAS CÉLULAS-ALVO E DETERMINAR A ATIVIDADE DE LIGAÇÃO AO

ANTÍGENO DE VÁRIAS PORÇÕES QUÍMICAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO USADAS NA CONSTRUÇÃO DOS CARs E BiTes

[00341] A expressão de antígenos nas células alvo foi determinada por abordagens de bioinformática em combinação com imunocoloração com anticorpos específicos para antígenos ou um ensaio de detecção de antígeno altamente sensível, conforme descrito no documento PCT/US2017/025602 e incorporado neste documento na sua totalidade a título de referência. Esse ensaio envolve a fusão de um fragmento repórter GLuc ou NLuc ao domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo, um scFv, um vHH ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno ou qualquer receptor e ligante. A proteína de fusão resultante é incubada com as células alvo que expressam o antígeno de teste e a ligação da proteína de fusão é determinada pela adição de coelentrazina ou outro substrato adequado do repórter da luciferase.

GERAÇÃO DE UM CONJUNTO DIVERSIFICADO DE CÉLULAS T CAR

[00342] Os ensaios acima foram usados para rastrear os diferentes módulos de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv, vHH, receptores, ligantes) usados na construção dos CARs desta invenção, e os módulos de ligação ao antígeno que mostraram atividade específica de ligação foram

295 / 348 selecionados para a construção dos CARs. Além disso, alguns fragmentos de scFV também foram selecionados com base em sua atividade conhecida na literatura ou em nosso laboratório.

[00343] É possível que diferentes CARs ou subconjunto de CARs sejam adequados de maneira ideal para diferentes afecções de doença, dependendo de vários fatores, incluindo, entre outros, a prevalência e o nível de expressão do antígeno alvo nas células causadoras e associadas à doença, carga da doença e taxa de progressão da doença. Diferentes CARs podem ser perfeitamente adequados, mesmo para uma única afecção de doença em diferentes pacientes, dependendo de seu perfil de eficácia e toxicidade e da condição do paciente. A divulgação fornece uma solução para os obstáculos técnicos e logísticos significativos para gerar uma resposta imune adotiva diversa.

[00344] A diversidade normal do TCR é produzida por rearranjo genético. Os rigorosos processos de seleção positiva e negativa no timo garantem que apenas as células T que expressam o TCR αβ restrito ao reconhecimento de autopeptídeos/MHC dentro de uma faixa de baixa afinidade possam preencher a periferia. Assim, o ambiente tímico permite a geração de um conjunto de células T αβ que são autorrestritas, mas não autorreativas.

[00345] A geração de um conjunto diversificado de células CAR-T a partir de diferentes domínios de ligação ao antígeno é limitada pelos obstáculos técnicos e financeiros para gerar e testar vários domínios de ligação ao antígeno. Mais importante, como cada um dos domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos de vL e vH de um anticorpo) tem um potencial de ligação a outros antígenos e causa toxicidade fora do alvo, um conjunto diversificado de CARs baseado apenas em uma pluralidade de domínios de ligação ao antígeno potencialmente tem um risco aumentado de toxicidade. Portanto, a diversidade potencial de tal conjunto teria que ser

296 / 348 limitada para reduzir a toxicidade fora do alvo. A divulgação atual supera esse problema gerando um conjunto diversificado de CARs a partir de um único ou alguns domínios de ligação ao antígeno, anexando-os a diferentes variantes de cadeias TCR, domínios de sinalização e estruturas principais. A diversidade do conjunto de CARs é aumentada ainda mais pelo uso de diferentes ligantes. A diversidade de células T que expressam o conjunto pode ser aumentada ainda mais pelo uso de diferentes módulos acessórios descritos na divulgação.

[00346] Esse conjunto diversificado de CARs pode ser utilizado para proporcionar uma resposta imune diversa contra células causadoras de doenças ou associadas a doenças que expressam o dito antígeno. Alternativamente, o conjunto diversificado de CARs pode ser opcionalmente codificado em código de DNA usando técnicas conhecidas na arte e subsequentemente usado para selecionar um único ou um subgrupo de CARs com características clínicas e biológicas ideais. Essas características podem incluir, porém sem limitação, desempenho nos ensaios biológicos in vitro (por exemplo, citotoxicidade, secreção de citocinas, afinidade de ligação, expressão da superfície celular, efeitos fora do alvo, proliferação de células T, expressão de marcadores de exaustão e diferenciação terminal, etc.), desempenho nos ensaios in vivo (por exemplo, sobrevivência, redução de tumor, persistência de células T, expansão de células T, etc.) e experiência clínica (por exemplo, remissão da doença, taxa de recidiva, toxicidades, etc.). Os CARs da divulgação podem ser usados isoladamente ou em combinação com outros CARs e outros receptores imunes naturais e sintéticos conhecidos na técnica para gerar um conjunto diversificado de células efetoras imunes para a prevenção e tratamento de várias afecções de doenças causadas por ou associadas a células expressando seus antígenos alvo.

[00347] Uso de seleção in vitro e vivo para selecionar CARs com as propriedades desejadas. Um conjunto de CARs direcionados para CD19 (SEQ

297 / 348

ID NO: 1.594 a 1.608, 1.016 a 1.026, 1.900 a 1.910) é direcionado para o local de TRAC em células T usando TRAC gRNA e técnicas conhecidas na arte.

O vetor alvo também carrega códigos de barras de DNA localizados a jusante do códon de parada das inserções do CAR.

As células T podem ser derivadas do sangue periférico.

Em uma modalidade alternativa, as células T são derivadas de um único clone de iPSC ou células-tronco hematopoiéticas usando técnicas conhecidas na arte.

As células T que expressam o conjunto de CARs são cocultivadas com células RAJI in vitro por 1 a 21 dias.

Alíquotas dos conjuntos de células CAR-T são coletadas antes da cultura com as células alvo e em diferentes dias após a cocultura.

As amostras são submetidas ao sequenciamento da próxima geração para determinar a frequência relativa de diferentes CARs após a exposição às células alvo.

As análises de bioinformática são usadas para determinar os CARs associados a uma melhor resposta proliferativa após a cocultura com as células-alvo.

Essencialmente, uma abordagem semelhante é usada para determinar que os CARs que conferem maior potencial proliferativo às células T in vivo e/ou persistem a longo prazo in vivo e/ou estão presentes em maior frequência quando normalizados por sua frequência na população inicial de células T em animais sobreviventes em comparação com animais que sucumbem a novos tumores.

Em modalidade alternativa da divulgação, essencialmente uma abordagem semelhante é usada em amostras clínicas humanas para identificar CARs que estão associados a diferentes propriedades e/ou resultados, incluindo, porém sem limitação, melhor sobrevida a longo prazo, menor incidência de síndrome de liberação de citocinas, menor neurotoxicidade e/ou maior persistência a longo prazo.

Tais CARs podem ser subsequentemente utilizados, isoladamente ou em várias combinações, para desenvolver subconjuntos diferentes de CARs, contendo CARs direcionados para o mesmo domínio ou diferentes domínios de ligação ao antígeno, com propriedades diversas para o tratamento de diferentes doenças e pacientes diferentes.

Em outras

298 / 348 habilitações, as células CAR-T são expostas à sua linha celular alvo e depois classificadas em diferentes conjuntos com base no grau de IFNγ intracelular, conforme determinado por citometria de fluxo. A frequência de diferentes CARs na população de IFNγ baixa versus alta é determinada pelo sequenciamento da próxima geração e normalizada com sua frequência na população de células CAR-T de controle, isto é, células CAR-T que não foram expostas à linha celular alvo ou estão expostas a uma linha celular que não expressa o alvo de CARs. A partir dessa análise, os CARs associados a diferentes níveis de produção de IFNγ podem ser determinados. Uma abordagem semelhante é usada para rastrear e selecionar CARs com qualquer propriedade ou atributo desejado ou uma combinação de propriedades ou atributos desejados, incluindo, porém sem limitação, menor expressão de marcadores de exaustão, menor expressão de marcadores de diferenciação terminal e/ou maior expressão de marcadores de citotoxicidade.

USO DE MUTANTES NEMO PARA FORNECER COESTIMULAÇÃO

[00348] Sabe-se que o NEMO-K270A de camundongo (SEQ ID NO: 992) ativa NF-κB de forma constitutiva. Para demonstrar a capacidade desse mutante para proporcionar coestimulação de células T, células T CD3+ve foram criadas em cultura em meio XVIVO (Lonza) suplantado com 10 ng/ml de anti-CD3 solúvel, 10 ng/ml de anti-CD28 solúvel e 100 UI de IL2 humana recombinante. As células foram cultivadas a 37 °C, em uma atmosfera de incubadora umidificada com CO2 a 5%, e depois de 1 dia infectadas com um vector lentiviral (pLENTI-EGFP-Blasticidin) expressando vectores EGFP e lentivirais que expressam mutantes de NEMO-K270A de camundongo (pLENTI-mNEMO-K270A-FLAG-Blasticidin e pLENTI-mNEMO-K270A- HA-Blasticidin) ou NEMO-wt de camundongo (pLENTI-mNEMO-FLAG- Blasticidin). As sequências de mNEMO-K270A e mNEMO-wt são fornecidas nas SEQ ID NOs: 992 e 991, respectivamente. Aproximadamente 1 dia após a infecção, as células foram selecionadas com blasticidina e os números de

299 / 348 células calculados periodicamente. As células T infectadas com lentivírus que codificam os mutantes NEMO-K270A de camundongo (pLENTI-mNEMO- K270A-FLAG-Blasticidin e pLENTI-mNEMO-K270A-HA-Blasticidin) mostraram proliferar com mais vigor do que as células T infectadas com lentivírus que codificam EGFP ou NEMO-peso do rato (pLENTI-mNEMO- FLAG-Blasticidin).

[00349] O NEMO humano é mais longo que o NEMO de camundongo e o mutante humano NEMO-K277A (hNEMO-K277A; SEQ ID NO: 979) corresponde ao mutante de camundongo NEMO-K270A (mNEMO-K270A). Para testar se o mutante hNEMO-K277A também ativa NF-κB, foi gerado o vetor de expressão (pCDNA3) que codifica esse mutante. Além disso, construtos de expressão que codificam vários outros mutantes de hNEMO em que Lys (K) no resíduo de aminoácido 277 foi substituído por diferentes resíduos de aminoácidos (por exemplo, K277Q, K277T, K277I, K277N, K277S, K277M, K277G, K277R). Os diferentes construtos foram transfectados em células 293FT juntamente com um construto de repórter NF- κB-Luciferase e um construto repórter RSV-LacZ (controle de normalização) e testadas quanto à sua capacidade de ativar NF-κB usando o ensaio descrito anteriormente. A Figura 3 mostra forte ativação de NF-κB por mNEMO- K270A, hNEMO-K277A e fraca ativação por hNEMO-K277I e hNEMO- K277G. Em uma experiência semelhante, os mutantes hNEMO-K277L e hNEMO-K277A-DeltaV249-K255 também mostraram ativação de NF-κB quando transfectados nas células 293FT. O mutante hNEMO-K277A- DeltaV249-K255 não tem os resíduos de aminoácidos V249-K255 do NEMO humano e também carrega a mutação K277A. Esses resultados sugerem que mutantes ativos constitutivos de NEMO podem ser rapidamente gerados e identificados pela mutação do resíduo NEMO K270 de camundongo e do resíduo humano NEMO K277. Uma abordagem semelhante pode ser usada para gerar mutantes em outros resíduos NEMO que têm a capacidade de

300 / 348 ativar NF-κB.

[00350] Gerou-se um construto de CAR CAR CD19 à base de FMC63 que coexpressou com o mutante hNEMO-K277A ou hNEMO-L753 de comprimento total (codificando os aminoácidos 1 a 251) em fusão com um domínio de dimerizador FKBPx2 N-terminal. Os construtos foram transfectados em células 293FT juntamente com um construto repórter de NF- kB-Luciferase e um construto repórter de RSV-LacZ. Aproximadamente 8 horas após a transfecção, as células foram deixadas sem tratamento ou tratadas com AP20187 (100 nM). Após aproximadamente 72 horas, os lisados celulares foram preparados e analisados quanto às atividades de NF-κB luciferase e LacZ, como descrito anteriormente. A atividade de NF-κB-Luc foi normalizada para a atividade de LacZ para controlar a diferença na eficiência da transfecção. Os resultados mostraram que o tratamento com AP20187 levou ao aumento da atividade de NF-κB em células 293FT transfectadas com construtos de codificação de CAR que coexpressam mutantes FKBPx2-hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1.006) e FKBPx2- hNEMO-L753 (SEQ ID NO: 1.007). Esses resultados demonstram a capacidade de ativar NF-κB de maneira induzível em um construto de CAR ou TCR ou TCR quimérico por coexpressão de NEMO de comprimento total ou seus mutantes de exclusão em fusão com um domínio dimerizador seguido pela adição de um dimerizador.

[00351] Células J-N-G são infectadas com CARs de 1a geração à base de FMC63 direcionados a CD19 que coexpressam FKBPx2-hNEMO-K277A ou FKBPx2-hNEMO-L753. As células são cocultivadas com células-alvo RAJI na ausência e presença do composto AP20187 e demonstram induzir a expressão de EGFP, demonstrando que FKBPx2-hNEMO-K277A ou FKBPx2-hNEMO-L753 podem ser coexpressos com um CAR sem interferir em sua atividade.

[00352] Além do NEMO, sabe-se que várias outras proteínas celulares

301 / 348 ativam o NF-κB constitutivamente e podem ser usadas em modalidades alternativas da invenção para fornecer coestimulação às células T com a finalidade de terapias celulares adotivas. Proteínas exemplificativas incluem TCL-1A (SEQ ID NO: 1.005) e mutantes ativos constitutivos de IKKα/IKK1 (IKK1-S176E-S180E; SEQ ID NO: 1.004), IKKβ/IKK2 (IKK2-S177E- S181E; SEQ ID NO: 1.002) e MYD88-L265P (SEQ ID NO: 1.000). Em uma modalidade, essas proteínas são expressas sem um domínio dimerizador para fornecer coestimulação constitutiva às células T com a finalidade de terapia celular adotiva. Essas proteínas podem ser expressas nas células T usando qualquer método de entrega de genes conhecido na técnica como vetor (por exemplo, vetores de transposão lentiviral, retroviral, AAV ou Bela Adormecida) ou método não vetor (transfecção de DNA ou RNA). Alternativamente, essas proteínas podem ser expressas pela alteração de suas cópias genômicas, utilizando técnicas de alteração de genes (por exemplo, Cas9, Talons, nucleases de dedos de Zn) conhecidas na arte. Em uma modalidade exemplificativa, uma ou mais cópias genômicas de hNEMO são mutadas para hNEMO-K277A usando recombinação homóloga em células T usando técnicas conhecidas na arte.

[00353] A expressão dessas proteínas coestimulantes pode ser controlada expressando as mesma utilizando promotores induzíveis conhecidos na técnica, como promotor induzível por Tet ou sistema RheoGene. Em uma modalidade, o mutante hNEMO-K277A e hNEMO- K277A-DeltaV249-K255 são clonados no vetor pSLIK-Tet-On (Gopalakrishnan et al, Clinical Cancer Res; 19 (18), 2013) e o vírus resultante é usado para infectar células T. O tratamento de células T com doxiciclina mostrou induzir a expressão de hNEMO-K277A e hNEMO-K277A- DeltaV249-K255 e atividade de NF-κB. A atividade de NF-κB é medida pelo anticorpo Fosfo-IkBα conjugado com AlexaFlour e citometria de fluxo.

[00354] Em modalidades alternativas da invenção, outras proteínas

302 / 348 ativadoras de NF-κB ou seus domínios de sinalização (por exemplo, IKK1, IKK2, RIP, etc.) são expressas como fusão com um domínio dimerizador para fornecer coestimulação às células T de uma maneira induzível. O uso dessas proteínas ativadoras de NF-κB constitutivas ou induzíveis da invenção não se limita a fornecer coestimulação às células T, visto que podem ser usadas para fornecer coestimulação a outras células imunes (por exemplo, células NK, células dendríticas, células que apresentam antígenos, etc.)) em que a ativação de NF-κB é conhecida por melhorar sua função. Como o NF-κB é conhecido por proteger contra a apoptose e promover a sobrevivência celular, essas proteínas ativadoras de NF-κB constitutivas e induzíveis também podem ser usadas na manipulação genética celular para melhorar a sobrevivência das células usadas na fabricação de produtos biológicos. Em uma modalidade exemplificativa, as células de hibridoma são projetadas para expressar hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-DeltaV249-K255 (SEQ ID NO: 7.769), K13, IKKα/IKK1 (IKK1-SS/EE; SEQ ID NO: 1.004), IKKβ/IKK2 (IKK2- S177E-S181E; SEQ ID NO: 1.002) ou MYD88-L265P (SEQ ID NO: 1.000) constitutivamente para melhorar sua proliferação e capacidade de crescer em alta densidade celular.

[00355] Ativadores de NF-κB para terapia celular adotiva de células T.

[00356] Células do creme leucocitário são obtidas a partir de doadores adultos desidentificados saudáveis a partir de um Banco de Sangue e utilizado para isolar as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por centrifugação em Ficoll-Hypaque de gradiente. Células T são isoladas usando microesferas de CD3 (Miltenyi), cultivadas em meio suplementado XVIVO 15 com Dynabeads de CD3/CD28 e 50 UI/ml de IL-2 recombinante. Alternativamente, as células T são suspensas novamente em meio XVIVO (Lonza) suplantado com 10 ng/ml de anticorpo CD3, 10 ng/ml de anticorpo CD28 e 100 UI de IL-2 recombinante humana.

[00357] No dia seguinte, as células T são infectadas com vetores

303 / 348 lentivirais codificadores de CARs direcionados a CD19 (incluindo CARs de próxima geração) na estrutura principal pCCL3-MND3. As sequências de ácidos nucleicos dos CARs são mostradas na SEQ ID NO: 1.016 a 1029,

1.318 a 1.331, 1.594 a 1.604, 1.900 a 1.913, 2.206 a 2.219, 2.512 a 2.525,

2.818 a 2.831, 3.124 a 3.127, 3.324 a 3.327. Além disso, as células T são infectadas com os construtos CAR correspondentes aos construtos acima, mas sem o módulo hNEMO-K277A. Para cada infecção, 18 milhões de células T são infectadas com 500 µl de vírus concentrado que codifica os diferentes construtos de CAR e 8 µg/ml de Polybrene por infecção giratória a 2.800 rpm, 32 °C por 90 min. em placas de 6 poços. As placas são incubadas a 37 °C durante 6 horas. As células são coletadas, centrifugadas para remover o vírus e o Polybrene, novamente suspensas em meio de cultura fresco e cultivadas durante a noite a 37 °C.

[00358] No dia seguinte, a infecção giratória é repetida e as células são transferidas para balões de cultura de células T-75 com meio XVIVO 15 suplementado com Dynabeads de CD3/CD28, 50 UI/ml de IL2 e FBS a 5%.

[00359] Após 4 dias de expansão, as células CAR-T são verificadas quanto à expressão de CAR usando coloração com proteína L, ligação a CD19, produção de citocinas (IL2, IFNγ, TNFa) e citotoxicidade (ensaio Matador).

[00360] Após 10 dias de expansão, as células CAR/SIR-T são usadas para experimento in vivo. Para esse fim, os camundongos NSG são injetados com 106 células Nalm-6-Luc por injeção na veia caudal. Dois dias mais tarde, injetados com 3 x 106 células CAR/SIR-T. Os camundongos são submetidos semanalmente a imaginologia de bioluminescência após a administração de D-Luciferina e seguidos para sobrevivência.

[00361] Observa-se que as células T que expressam os CARs de primeira geração juntamente com hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1.594 a

1.604) mostram produção de IL-2 superior como medido por ELISA quando

304 / 348 expostas a células Raji em comparação com as células T que expressam CARs de 2a geração (SEQ ID NO: 1.594 a 1.604) com um domínio coestimulante de BBz. Além disso, as células T que expressam os CARs de primeira geração juntamente com o hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1.594 a

1.604) mostram menos sinais de exaustão, conforme medido pela proliferação celular, produção de citocinas (IL2, IFNγ, TNFα), expressão de marcadores de exaustão (por exemplo, PD1) e citotoxicidade (ensaio de citotoxicidade Matador) quando cocultivadas com células RAJI durante um período de 3 semanas em comparação com células T que expressam CARs de 2a geração (SEQ ID NO: 1.594 a 1.604) com um domínio coestimulante de BBz. Finalmente, as células T que expressam os CARs de primeira geração juntamente com o hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1.594 a 1.604) mostram atividade in vivo superior quando administradas a camundongos NSG xenoenxertados com células NALM-6-Luc, conforme determinado pela expansão e persistência das células T in vivo, redução no crescimento do tumor e melhor sobrevida. As células T que expressam os CARs de primeira geração, juntamente com hNEMO-K277A (Estrutura Principal 2; SEQ ID NO: 1.594 a 1.604) em geral, mostram uma produção mais fraca de citocinas (por exemplo, IL2, IFNγ e TNFα) quando expostas a células RAJI em comparação com T células que expressam CARs de primeira geração e coexpressam vFLIP K13 (isto é, estrutura principal 1; SEQ ID NO: 1.016 a

1.029).

[00362] As células T que expressam os construtos CAR correspondentes à SEQ ID NO: 1.900 a 1.913, 2.206 a 2.219, 2.512 a 2.525,

2.818 a 2.831, 3.124 a 3.127, 3.324 a 3.327 que expressam hNEMO-K277A mostram atividade in vitro e in vivo superior em comparação às células T que expressam construtos semelhantes, mas que não têm o módulo hNEMO- K277A. A coexpressão do módulo hNEMO-K277A também é mostrada para melhorar o desempenho in vitro e in vivo de células T expressando um SIR

305 / 348 (SEQ ID NO: 9.683) alvejando CD20. Esses resultados demonstram que a coexpressão do módulo acessório hNEMO-K277A aprimora a atividade in vitro (por exemplo, proliferação, produção de citocinas, atraso na exaustão) e atividade in vivo (por exemplo, expansão aprimorada das células T e atividade antitumoral) não apenas dos construtos CAR de primeira geração, mas também TFP, Ab-TCR e SIRs.

[00363] Também é observada uma diferença entre os diferentes construtos que contêm a mesma estrutura principal, mas com diferentes domínios de ligação ao antígeno. Assim, dentre os construtos de CAR de primeira geração que coexpressam construtos de hNEMO-K277A (Estrutura Principal 2) contendo o domínio de ligação ao antígeno derivado de scFV 4G7 (por exemplo, SEQ ID NO: 1.599), huBly3 (por exemplo, SEQ ID NO:

1.604) e huSJ25C1 (por exemplo, SEQ ID NO: 1.605) são geralmente mais fracos em comparação com construtos contendo o domínio de ligação ao antígeno derivado de scFv à base de FMC63 (por exemplo, SEQ ID NO:

1.594), hu-FMC63-11 (por exemplo, SEQ ID NO: 1.595), huFMC63-11- N203Q (por exemplo, SEQ ID NO: 1.596), Bu12 (por exemplo, SEQ ID NO:

1.597), CD19-MOR0028 (por exemplo, SEQ ID NO: 1.602) e CD19-hu- mROO5 (por exemplo, SEQ ID NO: 1.607). Uma tendência semelhante é observada na atividade in vitro e in vivo de CARs em outras estruturas principais com base na natureza de seus domínios de ligação ao antígeno.

[00364] Nas experiências anteriores, o módulo hNEMO-K277A é coexpresso com o módulo CAR nas células T usando um único vetor. A experiência é repetida na qual os dois módulos são expressos usando dois vetores lentivirais separados. A SEQ ID de construto de ácido nucleico que codifica um CAR CD20 exemplificativo sem um módulo hNEMO-K277A é apresentada na SEQ ID: 9.668. As células T são coinfectadas com os dois vetores lentivirais na multiplicidade de infecção de 5 e a razão entre os dois vetores (isto é, CAR: hNEMO-K277A) varia de 1:1 a 1:10. As células T são

306 / 348 expandidas e testadas nos ensaios in vitro e in vivo. A coexpressão de hNEMO-K277A juntamente com um construto CAR é mostrada para melhorar o desempenho in vitro e in vivo de células CAR-T, conforme determinado por ensaios para produção de IL2, proliferação celular, falta de exaustão, expansão in vivo e atividade antitumoral.

[00365] Em uma modalidade alternativa, a recombinação homóloga usando técnicas de edição de genes conhecidas na arte (por exemplo, nucleases de dedo CRISP/Cas9, TALON, Zn, etc.) é usada para induzir a mutação K277A em uma ou ambas as cópias do gene NEMO humano endógeno em células T. As células T resultantes que transportam a mutação hNEMO-K277A são, então, usadas para terapia celular adotiva, inclusive para expressar os construtos CAR direcionados para CD19 e construtos de TCR direcionados para NY-ESO-1. As células T que transportam as mutações de hNEMO-K277A demonstram proliferação aumentada, produção de citocinas, expansão, persistência a longo prazo in vivo e atividade antitumoral em comparação com as células T de controle sem a mutação de hNEMO-K277A.

[00366] As experiências descritas nos parágrafos anteriores são repetidas usando construtos de CAR nos quais o módulo acessório hNEMO- K277A é substituído por módulos acessórios que codificam FKBPx2- hNEMO, FKBPx2-hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1.006), FKBPx2-hNEMO- L753(251) (SEQ ID NO: 1007), FKBPx2-hNEMO-L600(200) (SEQ ID NO:

1.008), IKK2-delta-SCD-FKBPv36x2 (SEQ ID NO: 7.782), IKK1-delta- SCD-FKBPv36x2 (SEQ ID NO: 7.781) e FKBPx2-RIP-ID (SEQ ID NO:

1.009). As células T que expressam o CAR e esses módulos acessórios são testadas usando ensaios in vitro na ausência e presença do dimerizador AP20187 (100 nM). A adição de AP20187 é mostrada para induzir a proliferação e produção de citocinas pelas células CAR-T que expressam os módulos FKBPx2-hNEMO, FKBPx2-hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1.006), FKBPx2-hNEMO-L753(251) (SEQ ID NO: 1.007), IKK2-delta-SCD-

307 / 348 FKBPv36x2 (SEQ ID NO: 7.782), IKK1-delta-SCD-FKBPv36x2 (SEQ ID NO: 7.781), FKBPx2-hNEMO-L600 (200) (SEQ ID NO: 1.008) e FKBPx2- RIP-ID (SEQ ID NO: 1.009) quando expostas ao antígeno alvo (isto é, CD19) que expressa células RAJI. Em um experimento in vivo, os camundongos NSG (n = 12 por grupo) são xenoenxertados com 2 milhões de células RAJI- Luc por injeção na veia caudal e 3 dias depois administram 5 milhões de células T expressando um CD19-CAR e coexpressando os módulos FKBPx2- hNEMO, FKBPx2-hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1.006), FKBPx2-hNEMO- L753(251) (SEQ ID NO: 1.007), FKBPx2-hNEMO-L600(200) (SEQ ID NO:

1.008) e FKBPx2-RIP-ID (SEQ ID NO: 1.009). Metade dos camundongos de cada grupo (n = 6) recebe 40 µg de AP20187 todos os dias por 10 dias por injeção intraperitoneal como descrito anteriormente (Chinnery et al., J Immunol 2009; 182: 2.738 a 2.744). A administração de AP20187 mostrou promover a expansão das células CAR-T. Em uma modalidade alternativa, o experimento é repetido usando construtos nos quais os dois domínios FKBP carregam a mutação FKBP12V36 que se liga ao ligante dimerizante permeável a lipídios, Rimiducid, com alta afinidade. A dimerização das proteínas de fusão é provocada pela administração de Rimiducid. Para experiências in vitro, o Rimiducid é utilizado na concentração final de 10 a 100 nM. Para estudos in vivo em camundongos NSG, o Rimiducid é administrado semanalmente por injeção intraperitoneal (ip) a 5 mg/kg.

[00367] As experiências descritas nos parágrafos anteriores são repetidas usando construtos nos quais o módulo acessório hNEMO-K277A é substituído por módulos acessórios que codificam hNEMO-K277A- DeltaV249-K255, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MYD88- L265P, TCL-1A e MTCP-1. As células CAR-T que expressam os módulos acessórios hNEMO-K277A-DeltaV249-K255, IKK2-S177E-S181E, IKK1- S176E-S180E, MYD88-L265P demonstram aumento da produção de citocinas, proliferação, expansão in vivo e atividade antitumoral em

308 / 348 comparação com as células CAR-T sem o módulo acessório. As células CAR- T que expressam o módulo acessório TCL-1A e MTCP-1 apresentam uma resposta proliferativa aumentada.

[00368] Uso de NEMO-K277A humano, NEMO-K277A-deltaV249- K255 humano, NEMO-K270A de camundongo e IKK2-S177E-S181E em vacinação

[00369] Os vetores lentivirais são gerados expressando NEMO-K277A humano, NEMO-K277A-deltaV249-K255 humano, NEMO-K270A de camundongo e IKK2-S177E-S181E. Os vetores lentivirais também estão gerando resíduos de aminoácidos de ovalbumina de frango amina expressos 242 a 353 e o terminal C da cadeia invariante classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (Ii-OVA), como descrito em Rowe HM et al., Molecular Therapy, 13, 2, 2006. Finalmente, são gerados vetores lentivirais que coexpressam um cassete que codifica NEMO-K277A humano, NEMO- K277A-deltaV249-K255 humano, NEMO-K270A de camundongo ou IKK2- S177E-S181E com um cassete que codifica Ii-OVA, em que os dois cassetes são separados por uma sequência de clivagem 2A.

[00370] Transdução de DCs e citometria de fluxo. As células dendríticas (DCs) derivadas da medula óssea murina são preparadas como descrito anteriormente. As DC imaturas são submetidas a transdução no dia 4 em um MOI de 20 com vetores lentivirais, conforme descrito (Rowe HM et al., Molecular Therapy, 13, 2, 2006) e alimentadas a cada 4 dias com meio fresco contendo fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (50 ng/ml; da Peprotech). No dia 5 pós-transdução, as DCs são coletadas, lavadas e bloqueadas para os receptores Fc antes da coloração da superfície dos marcadores de maturação com os seguintes Abs conjugados à biotina: anti-CD11c, anti-CD86 e anti-I-Ab (classe II de MHC) (todos da BD Pharmingen); anti-CD40 (da Serotec); e anti-CD80, anti-ICAM-1 e anti-Kb (classe I de MHC) (todos da eBioscience). Um controle de isotipo de hâmster

309 / 348 Ab (conjugado com biotina) é adquirido junto à BD Pharmingen. Abs são, então, marcados com reagente estreptavidina RPE Cy-5 2o (DakoCytomation) antes da citometria de fluxo. O lipopolissacarídeo (LPS) (50 ng/ml) (Sigma) é adicionado às DCs sem transdução e deixado durante a noite como um controle positivo para a maturação. O tratamento com zymosan A (10 μg/ml) (por 30 min. a 37 °C) é usado como controle para a ativação de ERK.

[00371] ELISA. Os sobrenadantes das culturas são coletados a partir de DCs em placa a 5 x 105 células por poço (em 1,5 ml). A IL-12p70 e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) são detectados pelo ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), usando kits da eBioscience, de acordo com as diretrizes do fabricante.

[00372] Purificação de DC a partir de linfonodos. Os camundongos C57/BL6 (Harlan) são injetados por via subcutânea (sc) na base da cauda com 1 × 108 unidades infecciosas (i.u.) de lentivetor. Seis dias depois, os linfonodos (para-aórticos e inguinais) são colhidos (células de camundongos de cada grupo foram reunidas), incubados com colagenase CLS-4 (Worthington) e esmagados para obter suspensões de células únicas. Os receptores Fc são bloqueados antes que as células positivas para CD11c sejam selecionadas usando microesferas MACS (Miltenyi Biotec).

[00373] Coloração Pentamer. Um milhão de esplenócitos por amostra são incubados com 10 μl de pentâmero ou tetrâmero SIINFEKL/Kb conjugado com fitoeritrina (Proimmune) por 12 minutos em temperatura ambiente. As células são, então, lavadas e incubadas em gelo com anti-CD8 conjugado com biotina (Serotec) por 15 minutos antes de serem lavadas e incubadas com estreptavidina-aloficocianina (eBioscience) por 15 minutos. As amostras são lavadas e adquiridas em uma máquina BD LSR usando o software Cell-Quest (BD Biosciences).

[00374] Coloração intracelular de citocinas. Os esplenócitos são incubados durante a noite com ou sem peptídeo OVA257-264. Solução de

310 / 348 monensina (eBiosciences; concentração final, 2 μM) é adicionada e deixada por 3 h antes de coloração da superfície das células para CD8. As células são, então, fixadas e permeabilizadas usando um kit Cytofix/Cytoperm da BD Biosciences. Um interferon anti-gama conjugado com aloficocianina (anti- IFN-γ) Ab (BD Pharmingen) é, então, adicionado e deixado por 30 minutos antes que as células sejam lavadas e as amostras sejam executadas em uma máquina BD LSR.

[00375] Ensaio ELISPOT. As placas de imunospot ligadas a enzimas (ELISPOT) (Millipore) são revestidas durante a noite a 4 °C com anti-IFN-γ purificado (BD Pharmingen). Os ensaios ELISPOT ex vivo são realizados com diluições em série dos esplenócitos totais em triplicado com ou sem peptídeo classe I OVA257-264 (Proimune). As placas são cultivadas durante a noite e desenvolvidas de acordo com as instruções do fabricante. Os pontos são contados usando um contador e software AID ELISPOT.

[00376] Terapia tumoral. As células tumorais EG7.OVA são cultivadas em RPMI mais 0,4 mg/ml de G418 (Invitrogen). Camundongos C57BL/6 são desafiados com células de 2 x 106 de tumor injetadas s.c. no flanco e em seguida vacinados. Os animais são mortos quando o tumor atinge um diâmetro > 15 mm.

[00377] As células dendríticas (DCs) derivadas de BM de camundongo são infectadas com os lentivetores que codificam NEMO-K277A humano, NEMO-K277A-deltaV249-K255 humano, NEMO-K270A e IKK2-S177E- S181E de camundongo quer isoladamente ou em combinação com Ii-OVA. A expressão de NEMO-K277A humano, NEMO-K277A-deltaV249-K255 humano, NEMO-K270A e IKK2-S177E-S181E de camundongo é mostrada como resultado da translocação nuclear de p65 (RelA) nos núcleos das DCs em um nível semelhante àquele nas DCs tratadas com LPS, mas não nas DCs de vetor de controle ou não tratadas, nas quais o nível de p65 citoplasmático é maior. A atividade de ligação de NF-kB nuclear aumentada também é

311 / 348 detectada em DCs com transdução de NEMO-K277A humano, NEMO- K277A-deltaV249-K255 humano, NEMO-K270A e IKK2-S177E-S181E de camundongo, mas não há efeito sobre a ativação da via MAPK conforme determinado pela atividade de ligação a AP1 nuclear.

[00378] Após a transdução de DCs derivadas de BM com NEMO- K277A humano, NEMO-K277A-deltaV249-K255 humano, NEMO-K270A e IKK2-S177E-S181E de camundongo, são analisados marcadores de maturação nas células transduzidas ou não transduzidas. CD86, CD40, ICAM-1 e CD80 são regulados crescentemente em DCs que expressam NEMO-K277A humano, NEMO-K277A-deltaV249-K255 humano, NEMO- K270A e IKK2-S177E-S181E de camundongo em comparação com DCs transduzidas no grupo de vetores de controle. Além disso, DCs transduzidas com NEMO-K277A- humano, NEMO-K277A-deltaV249-K255- humano, NEMO-K270A- e IKK2-S177E-S181E de camundongo mostraram reter seu CD86 regulado crescentemente por várias semanas em cultura. Verificou-se que a secreção de IL-12p70 e TNF-α é regulada positivamente na cultura de DCs transduzidas com NEMO-K277A- humano, NEMO-K277A-deltaV249- K255- humano, NEMO-K270A- e IKK2-S177E-S181E de camundongo.

[00379] Após a injeção s.c. de lentivetor, DCs transduzidas são detectadas nos linfonodos de drenagem. Uma porcentagem semelhante de DCs de linfonodos (classe II de CD11c+/MHC+) é transduzida após a injeção s.c. com o controle ou o vetor deNEMO-K277A- humano, NEMO-K277A- deltaV249-K255- humano, NEMO-K270A- e IKK2-S177E-S181E de camundongo. No entanto, há uma regulação crescente de CD86 em DCs nos animais injetados com NEMO-K277A- humano, NEMO-K277A-deltaV249- K255- humano, NEMO-K270A- e IKK2-S177E-S181E de camundongo em comparação com os animais injetados com vetor de controle.

[00380] A capacidade dos vetores que codificam NEMO-K277A-2A- Ii-OVA humano, NEMO-K277A-deltaV249-K255-2A-Ii-OVA humano,

312 / 348 NEMO-K270A-2A-Ii-OVA, IKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVA e Ii-OVA de camundongo para induzir uma resposta de células T CD8+ específica de Ova em camundongos após a vacinação s.c. ser examinada. A dose de vector de 5 × 105 i.u. é usado. Os camundongos vacinados com NEMO-K277A-2A-Ii- OVA humano, NEMO-K277A-deltaV249-K255-2A-Ii-OVA humano, NEMO-K270A-2A-Ii-OVA e IKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVA de camundongos mostram células T CD8+ positivas para pentâmero SIINFEKL/Kb e células T CD8+ que secretam IFN-γ conforme medido por classificação de célula ativada por fluorescência intracelular ou ensaio ELISPOT.

[00381] Os camundongos são inoculados com uma dose letal de células tumorais EG7.OVA antes de serem vacinados com DCs transduzidas ou com os vetores de NEMO-K277A- humano, NEMO-K277A-deltaV249-K255- humano, NEMO-K270A- e IKK2-S177E-S181E- de camundongo diretamente. Todos os camundongos mostram desenvolver tumores. Após injeção de DC transduzida ou injeção direta de lentivetor, o número de camundongos livres de tumor no grupo NEMO-K277A- humano, NEMO- K277A-deltaV249-K255- humano, NEMO-K270A- e IKK2-S177E-S181E- de camundongo é maior que o do grupo controle. A eficácia dos vetores de NEMO-K277A-2A-Ii-OVA, NEMO-K277A-deltaV249-K255-2A-Ii-OVA humano, NEMO-K270A-2A-Ii-OVA de camundongo, IKK2-S177E-S181E- 2A-Ii-OVA é testada em um modelo de proteção contra parasitas (Polley R et al., Infect. Immun. 74: 773 a 776, 2016) usando ovalbumina que expressa L. donovani.

[00382] Uso de NEMO-K277A humano, NEMO-K277A-deltaV249- K255 humano, NEMO-K270A de camundongo e IKK2-S177E-S181E em vacinação

[00383] As células que apresentam antígeno coletadas em uma única leucaférese são transduzidas com o vetor adenoviral que codifica NEMO-

313 / 348 K277A humano, NEMO-K277A-deltaV249-K255 humano, NEMO-K270A e IKK2-S177E-S181E de camundongo, seguido de incubação com a proteína PA001, que contém o domínio extracelular do antígeno de membrana específico da próstata humana. Homens com mCRPC progressivo após ≤ 1 regime de quimioterapia anterior são inscritos para avaliar três doses da vacina resultante (4 × 106, 12,5 × 106 e 25 × 106 células) administradas por via intradérmica a cada 2 a 4 semanas. Não há toxicidades limitantes da dose. A regulação crescente imune e a atividade antitumoral são observadas com os declínios do PSA.

CONSTRUÇÃO E TESTE DE CAR MPL HUMANIZADO À BASE DE FRAGMENTO scFv DERIVADO DO ANTICORPO 161

[00384] O anticorpo monoclonal murino 161 tem como alvo o MPL humano (receptor de trombopoietina ou TPO-R). Para gerar um CAR direcionado a MPL, mas com imunogenicidade reduzida, humanizou-se a sequência do fragmento scFV compreendendo o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo murino 161. O fragmento scFv humanizado 161 (SEQ ID NO: 891), designado Hu-161-2, foi clonado na estrutural principal de CAR de 2a geração contendo o domínio coestimulante 41BB e domínio de ativação CD3z (SEQ ID NO: 1.582). Células Jurkat-NFAT-EGFP (J-N-G) foram transduzidas de maneira estável com o lentivírus que codifica o construto de CAR MPL-hu-161-2 humanizado. As Jurkats parentais e que expressam CAR foram subsequentemente cocultivadas com células HEL e a indução da expressão de EGFP monitorada por análise FACS após 4 h. A cocultura de células Jurkat que expressam a construto CAR MPL-hu-161-2 com células HEL levou a um aumento na expressão de EGFP em comparação com células que não haviam sido expostas a células HEL, indicando a capacidade do construto CAR MPL-hu-161-2 humanizado de reconhecer o antígeno alvo e ativar a sinalização. Resultados essencialmente semelhantes são obtidos quando o experimento é repetido com CARs de primeira geração

314 / 348 incorporando scFV hu-161-2 e coexpressando vFLIP K13 (SEQ ID NO:

1.286) ou o mutante hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1.878).

CONSTRUÇÃO E TESTE DE CAR MPL HUMANIZADO COM BASE NO FRAGMENTO scFv DERIVADO DO ANTICORPO 175 E 111

[00385] Os monoclonais murinos 175 e 111 também se ligam ao MPL humano. Portanto, a sequência dos fragmentos scFv compreendendo o domínio de ligação ao antígeno desses anticorpo é humanizada e usada para produzir os construtos de CAR de 2a geração correspondente (CAR II) (SEQ ID NOS: 1.583 e 1.584), bem como estruturas principais 1 e 2 de coexpressando vFLIP K13 (SEQ ID NO: 1.287, 1.288) e hNEMO-K277A (SEQ ID NOs: 1.896 e 1.897). A experiência é repetida como no exemplo anterior. A cocultura de células Jurkat que expressam construtos de CAR MPL-hu-175-2 e hu-111-2 com células HEL levou a um aumento na expressão de EGFP em comparação com células que não haviam sido expostas a células HEL, indicando a capacidade de construtos de CAR MPL- hu-175-2 e hu-111-2 humanizados de reconhecer o antígeno alvo e ativar a sinalização. CONSTRUÇÃO E TESTE DE CARs DIRECIONADOS A CD70

[00386] São construídos vários construtos alvejando CD70 (SEQ ID NO: 9.781 a 10.086; e 7.783 a 7.789). Os construtos são expressos em células J-N-G e T e testados quanto a ativação e citotoxicidade de células T contra as linhas celulares alvo expressando CD70 RAJI e THP-1 utilizando ensaios in vitro e in vivo.

[00387] Construção e teste de CARs direcionados a CD70, PTK7, cadeia leve kappa, Claudin18A2, complexo Ras/HLA-A2, complexo NY- ESO/HLA-A2, Streptag e um epítopo de CD43 expresso em células de leucemia.

[00388] Os construtos de CAR são gerados alvejando PTK7, cadeia leve kappa, Claudin18A2, complexo Ras/HLA-A2, complexo NY-ESO/HLA-

315 / 348 A2, Streptag e um epítopo de CD43 expresso em células de leucemia em uma estrutura principal de 2a geração (por exemplo, CAR II convencional) ou estrutural principal 1 e 2 coexpressando vFLIP K13 ou hNEMO-K277A. A experiência é repetida como no exemplo anterior. A cocultura de células Jurkat que expressam os diferentes construtos de CAR com suas respectivas células-alvo levou a um aumento na expressão de EGFP em comparação com as células que não haviam sido expostas às células-alvo. Similarmente, a cocultura de células T expressando os diferentes construtos de CAR com suas respectivas células-alvo expressando GLuc levou a um aumento na morte celular, conforme medido pelo aumento da atividade de GLuc.

TFP DIRECIONADO A MPL

[00389] Vários CARs à base de TFP são construídos alvejando MPL com base no hu-161-2 scFV como o domínio de ligação ao antígeno. A sequência desses construtos de CAR TFP é mostrada na SEQ ID NO: 3.526 a

3.533. As células Jurkat-NFAT-EGFP (J-N-G) são transduzidas com lentivírus que codificam os CAR TFP direcionados a MPL e selecionados com puromicina. As células J-N-G que expressam os CARs TFP direcionados a MPL mostram induzir a expressão de EGFP após cocultura com células HEL.92.1.7 (HEL) for por 4 horas. Os CARs TFP direcionados a MPL também são expressos em células T primárias e testados quanto à sua capacidade de induzir a lise de células HEL-GLuc após cocultura por 4 horas. Os construtos CAR TFP MPL com base em 175, 111, hu-175-2 e hu-111-2 scFv (SEQ ID NO: 1.0476 a 1.0483) são similarmente construídos e testados usando células J-N-G e T primárias, como descrito acima para CARs TFP à base de hu-161-2. J

TFP DIRECIONADO A OUTROS ANTÍGENOS

[00390] Em seguida, são construídos CARs TFP direcionados a vários antígenos diferentes. Para fornecer coestimulação, os construtos também coexpressam hNEMO-K277A. Os construtos são expressos em células J-N-G

316 / 348 e T primárias e testados quanto à sua capacidade de reconhecer células que expressam seu antígeno alvo usando os ensaios descritos acima. Os CARs TFP que expressam células J-N-G demonstram induzir a expressão de EGFP após cocultura com a célula alvo expressando seu antígeno cognato. As células T que expressam esses CARs TFP direcionados a diferentes antígenos mostram induzir citotoxicidade das células alvo que expressam o antígeno correspondente usando o ensaio de citotoxicidade à base de GLuc descrito acima. A Tabela A mostra as linhas de células alvo que expressam os diferentes antígenos alvo que são utilizados no ensaio. As linhas celulares adicionais que expressam os diferentes antígenos alvo são conhecidas na arte ou podem ser geneticamente modificadas para expressar um antígeno desejado por técnicas conhecidas na arte. No exemplo acima, os construtos TFP contêm um módulo acessório que coexpressa o mutante hNEMO-K277A para fornecer coestimulação. Em uma modalidade alternativa, também são construídos construtos de TFP que carecem de um módulo acessório para fornecer coestimulação ou contêm um módulo acessório que fornece coexpressão através da coexpressão de outras proteínas, como vFLIP K13. A experiência é repetida como acima pela expressão dos construtos de TFP em células J-N-G e T primárias com resultados semelhantes. Ab-TCR DIRECIONADO A MPL

[00391] Vários Ab-TCR são construídos visando o MPL com base no scFV 161 murino como o domínio de ligação ao antígeno. Para melhorar a expressão de Ab-TCR à base de TCRα e TCRβ, mutações específicas são introduzidas em seus módulos receptores de TCR. A sequência do TCRγ/TCRd, TCRα/TCRβ de tipo selvagem (marcado como wt-op2) e TCRα/TCRβ mutante (marcado como SDVP-IAH) contendo construtos de Ab-TCR são mostrados na SEQ ID NO: 959 a 964. As células Jurkat-NFAT- EGFP (J-N-G) são transduzidas com lentivírus que codificam os Ab-TCRs direcionados a MPL (SEQ ID NO: 2.091, 2.397, 2.703) e selecionados com

317 / 348 puromicina. As células J-N-G que expressam os Ab-TCRs direcionados a MPL mostram induzir a expressão de EGFP após cocultura com células HEL por 4 horas, demonstrando a capacidade dos Ab-TCRs direcionados a MPL de reconhecer MPL e ativar a sinalização. Os Ab-TCRs direcionados a MPL também são expressos em células T primárias e testados quanto à sua capacidade de induzir a lise de células HEL-GLuc após cocultura por 4 horas. As células T que expressam Ab-TCRs MPL mostram induzir a lise das células HEL-GLuc, conforme medido pelo aumento da atividade de GLuc. Construtos Ab-TCR MPL com base em scFv 175 e 111 murino (SEQ ID NO:

10.492 a 10.493) são similarmente construídos e testados usando células J-N- G e T primárias, como descrito acima para Ab-TCRs à base de 161. Ab-TCRs DIRECIONADO A OUTROS ANTÍGENOS

[00392] Em seguida, são construídos Ab-TCR direcionados a vários antígenos diferentes. Para fornecer coestimulação, os construtos também coexpressam o hNEMO-K277A. Os construtos são expressos em células J-N- G e T primárias e testados quanto à sua capacidade de reconhecer células que expressam seu antígeno alvo usando os ensaios descritos acima. Os Ab-TCRs que expressam células J-N-G mostram induzir a expressão de EGFP após cocultura com a célula alvo expressando seu antígeno cognato. As células T que expressam esses Ab-TCRs direcionados a diferentes antígenos mostram induzir citotoxicidade das células alvo que expressam o antígeno correspondente usando o ensaio de citotoxicidade à base de GLuc descrito acima. A Tabela A mostra as linhas de células alvo que expressam os diferentes antígenos alvo que são utilizados no ensaio. As linhas celulares adicionais que expressam os diferentes antígenos alvo são conhecidas na arte ou podem ser geneticamente modificadas para expressar um antígeno desejado por técnicas conhecidas na arte. No exemplo acima, os construtos de Ab-TCR contêm um módulo acessório que coexpressa o mutante hNEMO- K277A para fornecer coestimulação. Em modalidades alternativas, também

318 / 348 são construídos construtos de Ab-TCR que não têm um módulo acessório para fornecer coestimulação ou contêm um módulo acessório que fornece coexpressão através da coexpressão de outras proteínas, como vFLIP K13. A experiência é repetida como acima pela expressão dos construtos de Ab-TCR em células J-N-G e T primárias com resultados semelhantes.

CITOMETRIA DE FLUXO PARA PROLIFERAÇÃO MEDIADA POR CAR DE LINFÓCITOS T CD8+ TRANSDUZIDOS EM RESPOSTA A CÉLULAS-ALVO INFECTADAS POR HIV-1

[00393] Vários CARs direcionados à glicoproteína do envelope do HIV1 são gerados e são representados pela SEQ ID NO: 8.704 a 9.349. Os ensaios a seguir são usados para testar sua atividade anti-HIV1 in vitro. Os construtos ativos são usados individualmente ou em combinação para o tratamento de pacientes com HIV1 e AIDS.

[00394] Células T2 infectadas com HIV-1, que têm classe I de MHC baixo devido a uma exclusão no transportador associado ao processamento (TAP) (Salter, et al. (1986) EMBO J 5: 943 a 949) e anteriormente demonstraram ser células alvo adequadas para um CAR específico para HIV- 1 (Severino et al. (2003) Virology 306: 371 a 375), serviram como células alvo. Essas são infectadas com um excesso de vírus repórter à base de NL4-3 HIV-1 contendo um gene para CD24 murino (mCD24) no local vpr (Ali, et al. (2003) J Virol Methods 110: 137 a 142) para produzir > 90% de células infectadas por 3 ou 4 dias após a infecção, conforme descrito anteriormente (Bennett, et al. (2007) J Virol 81: 4.973 a 4.980; Yang, et al. (1996) J Virol 70: 5.799 a 5.806; e Yang et ai (1997) J. Virol 71: 3.120 a 3.128). Essas são irradiadas imediatamente antes do uso com 10.000 rads em um irradiador de césio, bem como células mononucleares do sangue periférico de um doador saudável com 3.000 rads (PBMCs de alimentação). Os linfócitos T CD8+ transduzidos por HIV1-CAR são marcados com CellTrace Violet e lavados de acordo com as instruções do fabricante (ThermoFisher Scientific, Grand

319 / 348 Island, NY). Em uma placa com 48 poços, 5 x 105 células transduzidas marcadas são adicionadas a 5 x 105 células T2 irradiadas infectadas e 2 x 106 PBMC de alimentação irradiadas, e cultivadas em 1 ml de R10-50 durante cinco dias com uma alteração do meio depois três dias. A citometria de fluxo (citômetro LSR Fortessa II, BD Biosciences) foi, então, realizada com cocoloração para CD8 humano (PerCP-anti-humano CD8, número de catálogo 30130, Biolegend, San Diego, CA) e análise da proliferação usando o software FlowJo (FlowJo, Ashland, OR). As células T transduzidas por HIV1-CAR demonstram proliferar quando expostas a células T2 infectadas por HIV-1.

ENSAIOS DE SUPRESSÃO DE VÍRUS

[00395] A capacidade dos linfócitos T CD8+ transduzidos por HIV1- CAR e clones expandidos e enriquecidos dos mesmos para suprimir a replicação do HIV-1 é testada como descrito anteriormente (Yang, et al. (1997) PNAS USA 94: 11.478 a 11.483; Yang, et. al. (1997) J. Virol 71:

3.120 a 3.128). As estirpes de HIV-1 testadas são obtidas junto à NIH AIDS Reference and Reagent incluindo 94US_3393 IN (número de catálogo 11250), 90JJS873 (número de catálogo 11251), 96TH_NP1538 (número de catálogo 11252), 00TZ_A246 (número de catálogo 11256). Em resumo, as células Tl transduzidas com CCR5 humano são infectadas em uma multiplicidade de 0,1 doses infecciosas de cultura de tecidos por célula e cocultivadas em uma placa de 96 poços com células transduzidas por CAR HIV1 na razão de 5 x 104 a 1,25 x 104 células, respectivamente, em 200 µl de Rl 0-50, ou nenhuma célula efetora como controle. Confirma-se que as células efetoras são > 90% transduzidas. Cada condição é executada em triplicado, e a replicação viral é monitorada usando ELISA quantitativo para p24 (XpressBio, Frederick, MD). Demonstrou-se que a exposição às células CAR HIV1 leva à supressão de HIV1 conforme medido por ELISA p24.

[00396] As células efetoras que expressam o HIV1-CAR também são

320 / 348 testadas quanto à atividade antiviral contra células CD4+ infectadas. As células T2-CCR5 são infectadas com um painel de estirpes de HIV-1 incluindo isolados trópicos R5 primários e cultivadas na ausência ou presença das células efetoras transduzidas por HIV1-CAR. A replicação do vírus é avaliada por medição do antígeno p24 entre os dias 7 a 10 da cultura. A supressão da replicação é calculada como a diferença de unidades de logio de p24 entre culturas sem versus com células efetoras, que é, então, normalizada como a razão da replicação total sem células efetoras.

ENSAIOS DE EXTERMÍNIO POR LIBERAÇÃO DE CROMO PARA EXTERMINAÇÃO MEDIADA POR CAR DE CÉLULAS-ALVO INFECTADAS POR HIV-1

[00397] Células T2-gluc infectadas com a estirpe de HIV-1 NL4-3 como acima são utilizados como células alvo para os linfócitos T CD8 + primários transduzidos por HIV-1-CAR no ensaio Matador ou utilizando ensaios de libertação de 51Cr padrão como descrito anteriormente (Bennett et al. (2007) J Virol 81: 4.973 a 4.980; Yang, et al. (1996) J Virol 70: 5.799 a

5.806; e Bennett, et al. (2010) Aids 24: 2.619 a 2.628). Resumidamente, as células T2 infectadas e não infectadas por controle são marcadas com 51Cr por 1 hora e incubadas com ou sem linfócitos T CD8+ efetores por 4 horas em razões celulares variadas em uma placa de fundo em U de 96 poços. Os sobrenadantes são, então, colhidos para a medição de 51Cr extracelular por contagem de microcintilação de 204 em placas de 96 poços. A liberação espontânea é medida nas células alvo sem células efetoras, e a liberação máxima é medida nas células alvo lisadas com Triton X-100 a 2,5%. A lise específica é calculada como: (cromo liberado experimentalmente - liberação espontânea) ÷ (liberação máxima - liberação espontânea).

ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DIRECIONADOS A MPL

[00398] Anticorpos Biespecíficos, como Engager de células T Biespecíficos (BiTE) e redirecionamento de Dupla Afinidade (DART),

321 / 348 podem ser usados para redirecionar as células T para uma célula-alvo que expressa um antígeno específico.

[00399] Um MPL de direcionamento baseado em agente T biespecífico com base em scFV 161 à medida que o domínio de ligação ao antígeno é construído. A sequência desse construto biespecífico é mostrada na SEQ ID NO: 3.736. Os construtos biespecíficos contêm um ligante GGGSG- Streptagx2-Tag (SEQ ID NO: 287), mas ligantes alternativos (por exemplo, SGGGS) podem ser usados.

[00400] O construto biespecífico foi transfectado em células 293FT, e o sobrenadante contendo a proteína de fusão coletado após 48 a 96 horas. Foi demonstrado que as células HEL-GLuc cultivadas com células T na presença da proteína de fusão biespecífica MPL-161 sofrem lise celular, conforme determinado pelo ensaio GLuc, em comparação com as células cultivadas com a proteína de fusão biespecífica sozinha ou apenas células T.

[00401] Anticorpos biespecíficos que codificam construtos com base em scFv 175, 111, hu-161-2, hu-175-2 e hu-111 são construídos em seguida e observados ter atividade no ensaio de citotoxicidade HEL-GLuc. Finalmente, os anticorpos biespecíficos direcionados a vários outros antígenos, incluindo PTK7, DLL3, TROP2, CD179a, CD179b, CD23, LAMP1, CDH1, CDH17, CD32, CDH19, glicoproteína do envelope do HIV1-gp120, etc., são construídos de maneira semelhante e são observados ter atividade quando cocultivados com as linhas celulares alvo que expressam seu antígeno cognato.

[00402] Figura 4. Atividade de um engager de células T Biespecífico direcionado a MPL e utilizando um domínio de direcionamento 161-scFv. As células T e HEL-pLenti-hGluc foram previamente incubadas separadamente com os seguintes sobrenadantes a 4 °C por 2 h apenas em Meio e pLenti-161- StreptagII-CD3-Myc-His-P02 (042517-P02-SC). Após a incubação, as células foram cocultivadas em placa de 96 poços de fundo em U na razão E:T de 1:1

322 / 348 ou 5:1 por 4h a 37 C. 50 μl de células + sup/poço foram transferidos para uma placa de 384 poços em triplicado. O ensaio de hGLuc foi realizado utilizando 15 ul de tampão de ensaio de CTZ (1:100).

[00403] Expressão e atividade de TFPs em células Jurkat sem expressão de TCRα e TCRβ.

[00404] As células Jurkat-NFAT-GFP (J-N-G) (linfoma de células T) são infectadas com vetores lentivirais que expressam gRNAs direcionados a cadeias constantes TCRα e TCRβ1/β2 e coexpressando Cas9Streptococcus Pyogenes. As sequências alvo de gRNA exemplificativas para cadeias TCRα são dadas na SEQ ID NO: 7.754 e 7.755. As sequências alvo de gRNA exemplificativas para cadeias TCRβ1/β2 são dadas na SEQ ID NO: 7.756 a

7.758. Em uma modalidade alternativa, os locais da cadeia constante TCRα e TCRβ1/β2 são direcionados usando gRNA e TALONs, conforme descrito no documento Knipping F et al, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, Vol. 4, 2017. As células J-N-G sem a expressão das cadeias TCRα ou TCRβ1/β2 são purificadas por classificação celular utilizando anticorpos direcionados contra o complexo TCR/CD3. Os vetores lentivirais que expressam TFPs dirigidos contra MPL humano (SEQ ID NO: 2.184,

2.490, 2.796) sob o promotor EF1α são usados para infectar células J-N-G parentais (controle) e aquelas sem a expressão de cadeias TCRα ou TCRβ1/β2. A expressão de TFPs nas células é determinada por imunocoloração com coloração com Proteína L e por coloração com proteína de fusão MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 (SEQ ID NO: 4.923). As células parentais J-N-G mostram expressão robusta de TFP na superfície celular, enquanto as células J-N-G sem as cadeias TCRα ou TCRβ1/β2 mostram expressão de TFP pobre a ausente. As diferentes populações de células J-N-G são expostas às células alvo HEL.92.1.7 por 24 horas e examinadas quanto ao aumento da expressão de GFP impulsionada pelo promotor de NFAT e da produção de IL2. As células parentais J-N-G que expressam TFPs específicos

323 / 348 de MPL mostram aumento acentuado na fluorescência de GFP e secreção de IL2 após cocultura com células HEL.92.1.7. Em contrapartida, as células J-N- G que expressam TFP específicas de MPL com cadeias ausentes de TCRα ou TCRβ1/β2 mostram fraca ou nenhuma indução de GFP e secreção de IL2. Resultados essencialmente semelhantes são obtidos quando a experiência é repetida com células parentais de J-N-G e células com deficiência de TCRα ou TCRβ1/β2 após a expressão de TFPs direcionados a CD19 (SEQ ID NO:

1.913, 2.219, 2.525), CD20 (SEQ ID NO: 1.945, 2.251, 2.557) e CD22 (SEQ ID NO: 1.950, 2.256, 2.562) e após cocultura com células alvo RAJI e Nalm6.

[00405] Os próximos vetores lentivirais que expressam a cadeia constante TCRα otimizada por códon (IgSP-[hTRAC-opt2]; SEQ ID NO: 1010) ou a cadeia constante TCRβ (IgSP-[hTRBC-opt2]; SEQ ID NO: 1.011) sob o promotor EF1α são usados para infectar as diferentes populações de células J-N-G. A expressão da cadeia constante TCRα em células J-N-G que expressam TFP específicas de MPL, nas quais a cadeia TCRα foi interrompida por nocaute genético mediado por gRNA, resulta em aumento da expressão de TFP na superfície celular e indução da expressão de GFP e secreção de IL2 na cocultura com células alvo HEL.92.1.7. Da mesma forma, a expressão da cadeia constante TCRβ em células J-N-G que expressam TFP específicas de MPL, nas quais a cadeia TCRβ1/β2 foi interrompida por nocaute mediado por gRNA, resulta em aumento da expressão de TFP na superfície celular e na indução da expressão de GFP e secreção de IL2 após cocultura com células alvo HEL.92.1.7

[00406] Expressão e atividade de Ab-TCR e cTCR/SIRs em células Jurkat sem expressão de TCRα e TCRβ.

[00407] A experiência acima é repetida com a exceção de que cassetes de expressão que codificam Ab-TCRs e SIRs direcionados a CD19 humano são usados no lugar de TFPs direcionados a CD19. Os Ab-TCRs direcionados a CD19 são representados pela SEQ ID NO: 3.124. Os cTCR/SIRs

324 / 348 direcionados a CD19 são representados pela SEQ ID NO: 3.878 a 3.880. A expressão de Ab-TCR, cTCR e SIR em células J-N-G sem expressão de TCRα ou TCRβ1/β2 é mostrada como resultado em aumento da expressão e atividade em comparação com sua expressão nas células J-N-G parentais.

[00408] Células T alogênicas e prontas para uso que expressam CAR, TFP e Ab-TCR da divulgação

[00409] As células CAR-T alogênicas ou prontas para uso são geradas diminuindo ou eliminando a expressão da cadeia TCRα e/ou TCRβ endógena usando TALON, CRISP/Cas9 ou outras nucleases.

[00410] Os cassetes de TFP específicas de MPL (SEQ ID Nos: 3.527,

3.529, 3.531) são clonadas em construtos de alvejamento projetados para alvejar local genômico TRAC e contendo os braços de homologia direito e esquerdo derivados de sequências genômicas TRAC. Uma sequência de poliadenilação é inserida a jusante do códon de parada dos TFPs. O esquema da construto de alvejamento e a estratégia de alvejamento é mostrado na Figura 5A. As sequências dos construtos de alvejamento são fornecidas na SEQ ID NO: 3.858, 7.773 e 7.776. Os construtos de alvejamento são clonados em um vetor lentiviral com defeito de integração (IDLV) e em um vetor Viral Associado a Adeno (AAV). Os construtos são direcionadas ao local de TRAC em células T humanas purificadas usando CRISP/Cas9 (Figura 5A) como descrito nas técnicas conhecidas na arte e usando a sequência de gRNA do TRAC (SEQ ID NO: 7.751): 5′C*A*G*GGUUCUGGAUAUCUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCA

AGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCA CCGAGUCGGUGCU* U* U* U-3′. O asterisco (*) representa 2’ -O-metil 3' fosforotioato. Exemplos de técnicas para entregar construtos de alvejamento ao local de TRAC usando IDLV e AAV são descritos em Knipping F et al, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, Vol. 4, 2017 e Eyquem J et al Nature, 543 (7643): 113 a 117, 2017, respectivamente. Em

325 / 348 paralelo, as células T humanas purificadas também são transduzidas usando a abordagem convencional com vetores lentivirais que codificam os construtos de TFP correspondentes (SEQ ID NO: 2.184, 2.490, 2.796) sob o promotor EF1α para gerar células que expressam as diferentes TFPs. A expressão de TCRαβ e TFPs nas células T é determinada por imunocoloração com anticorpos TCR/CD3 e coloração com Proteína L, respectivamente. A expressão de TFPs em células T também é examinada por coloração com a proteína de fusão MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 (SEQ ID NO: 4.923). As diferentes populações de células T são expostas às células alvo HEL.92.1.7- GLuc e são comparadas usando ensaios in vitro e in vivo de ativação celular, proliferação, produção de citocinas (por exemplo, IL2), lise de células alvo, senescência, exaustão, expansão in vivo, persistência in vivo e atividade antitumoral in vivo. As TFPs mostram expressão prejudicada na superfície das células T e atividade reduzida ou ausente (por exemplo, ativação de células T, proliferação, produção de citocinas e citotoxicidade, etc.) na célula T quando sua expressão é direcionada ao local de TRAC em comparação com quando são expressas usando vetores de lentivírus. Em seguida, é testado se a expressão da cadeia constante TCRα (cadeia TRAC) pode ser usada para restaurar a expressão e sinalização e atividade de TFP em células T nas quais o local genômico endômico de TRAC foi interrompido pela fita de expressão de TFP. Para esse fim, são construídos construtos de alvejamento que coexpressam TFPs com um módulo acessório que codifica uma cadeia constante TCRα com um peptídeo sinal de terminal amino (IgSP) (Figura 5B). O módulo acessório é separado da sequência de codificação de TFP por um ligante Furine-SGSG-P2A. A sequência nucleotídica de construtos de alvejamento exemplificativos que coexpressam uma cadeia constante TCRα com construtos de TFP direcionadas a MPL é mostrada nas SEQ ID NOs:

3.859, 7.774 e 7.777). A sequência nucleotídica da cadeia constante TCRα nesses construtos é otimizada por códon e difere da cadeia constante

326 / 348 endógena TCRα em sua sequência nucleotídica. Em uma modalidade alternativa, a cadeia TRAC é otimizada por códon e carrega substituições de aminoácidos que são conhecidas por melhorar a expressão da cadeia constante TCRα humano. A sequência nucleotídica de cadeias TRAC exógenas exemplificativas que podem ser usadas para permitir nova expressão do complexo TCR/CD3 em células T nas quais a expressão do gene endógeno de TCRα foi regulada decrescentemente ou eliminada por alvejamento é mostrada na SEQ ID NO: 3.886 a 3.894. O TRAC exógeno pode ser expresso em células T por si só (SEQ ID NO: 1.010) ou pode ser coexpresso com os cassetes de expressão de TFP usando um único vetor.

[00411] Os construtos de TFP específicas de MPL (SEQ ID Nos:

3.858, 7.773 e 7.776) e construtos de TFP-TRAC (SEQ ID NOs: 3.859, 7.774 e 7.777) são clonadas no vetor IDLV e AAV e são direcionadas para o local de TRAC essencialmente como descrito anteriormente.

[00412] As células que expressam os construtos são expostas às células alvo HEL.92.1.7-GLuc e testadas em ensaios funcionais como descrito acima. As células T nas quais os construtos de TFP-TRAC são direcionados para o local de TRAC mostram melhor expressão de TFP na superfície celular em comparação com as células T nas quais os construtos de TFP sozinhos (isto é, sem coexpressão da cadeia exógena TRAC) são direcionados para o local de TRAC. Além disso, as células T em que os construtos de TFP-TRAC são dirigidos para o local de TRAC mostram maior proliferação, ativação, produção de citoquinas (por exemplo, IL-2 e TNFa), citotoxicidade, expansão in vivo, atividade antitumoral in vivo contra as células alvo em comparação com células T nas quais os construtos de TFP sozinhos (isto é, sem coexpressão da cadeia TRAC exógena) são direcionados para o local de TRAC.

[00413] A expressão e a atividade de TFPs também são restauradas em células T nas quais o local de TRAC endógeno foi interrompido projetando o

327 / 348 cassete de alvejamento de modo que o cassete de TFP seja seguido no quadro por um ligante clivável 2A, um peptídeo sinal (por exemplo, um peptídeo sinal CD8 ou um peptídeo sinal de IgH) e o primeiro éxon da cadeia TCRα (TRAC) (Figura 5C). A sequência nucleotídica de construtos de alvejamento exemplificativos é mostrada na SEQ ID NO: 3.860, 7.775 e 7.778. Nessa modalidade, a proteína TRAC é produzida pela cadeia TRAC endógena cuja expressão de superfície celular é facilitada pelo peptídeo sinal fornecido no cassete de alvejamento.

[00414] A alorreatividade das células T que expressam TFP-TRAC que não têm expressão da cadeia TCRα nativa, mas nas quais a expressão e a atividade de superfície celular de TFP são resgatadas pela expressão da cadeia constante TCRα, são testadas usando a reação de cultura de linfócitos mista usando células T irradiadas de um doador alogênico. As células T que expressam TFP-TRAC que não têm a expressão de TCRα nativa mostram uma redução acentuada à ausência de alorreatividade, medida pela resposta proliferativa, em comparação com as células T nas quais as TFPs são expressas usando vetores lentivirais. A capacidade das células T humanas que expressam TFP-TRAC e que não têm expressão de TCRα nativa de induzir a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) é examinada pela administração de 5 milhões de células T deficientes em TCRα que expressam TFP-TRAC por animal em camundongos NSG imunodeficientes (Jackson Lab). Os animais são observados por mais de 90 dias. As células T humanas nas quais os cassetes TFP-TRAC são direcionadas para o local de TRAC mostram-se marcadamente reduzidas à ausência de Doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) quando infundidas em camundongos NSG imunodeficientes (Jackson Lab) enquanto a GVHD é observada em animais que recebem células T nas quais TFP é expressa usando vetores lentivirais. A capacidade das células T humanas deficientes em TCRα e que expressam TFP-TRAC em induzir a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD)

328 / 348 também é examinada pela administração de 1 milhão de células por quilograma em receptores humanos alogênicos que receberam quimioterapia com linfodepletação. As células T alogênicas nas quais os cassetes de TFP- TRAC são direcionados para o local de TRAC mostram incidência e severidade marcadamente reduzidas de Doença do Enxerto contra o Hospedeiro (GVHD) quando administradas a receptores alogênicos.

[00415] Resultados essencialmente semelhantes são obtidos quando o experimento é repetido com células T nas quais as TFPs são direcionadas para o local de TRBC. A sequência alvo do gRNA direcionado ao TRBC é mostrada na SEQ ID NO: 7.756 a 7.758. Esses gRNAs são utilizados em combinação com Cas9 Streptococcuc Pyogenes utilizando métodos conhecidos na arte. Direcionar os cassetes de expressão de TFP para o local genômico de TRBC mostra resultar em atividade prejudicada dos TFPs específicos de MPL. No entanto, a atividade das TFPs é restaurada pela coexpressão da cadeia constante TCRβ exógena (TRBC). A sequência nucleotídica de cadeias TRBC exógenas exemplificativas que podem ser usadas para restaurar a função de sinalização complexa de TCR/CD3 é mostrada na SEQ ID NO: 3.899 a 3.910. O TRBC exógeno pode ser expresso em células T por si só (SEQ ID NO: 1.011) ou pode ser coexpresso com os cassetes de expressão de TFP a partir de um único vetor. A sequência nucleotídica de construtos exemplificativos que coexpressam uma cadeia TRBC com construtos de TFP direcionados a MPL é mostrada na SEQ ID NO: 3.537, 3.539 e 3.541. Esses construtos de expressão de TFP podem ser clonados em vetores direcionados a TRBC adequados, utilizando técnicas conhecidas na arte. Em uma modalidade alternativa, a expressão de TRBC pode ser restaurada em células T nas quais o local de TRBC endógena foi interrompido projetando o cassete de alvejamento de modo que o cassete de TFP seja seguido no quadro por um ligante clivável 2A, um peptídeo sinal (por exemplo, um peptídeo sinal CD8 ou peptídeo sinal IgH) e o primeiro

329 / 348 éxon da cadeia TCRβ (TRBC). DIRECIONANDO OS CONSTRUTOS DE Ab-TCR PARA O LOCAL DE

TRAC

[00416] Dois construtos de Ab-TCR direcionados a CD19 com base em scFv FMC63 são gerados no vetor lentiviral (SEQ ID NO: 3.837) conduzido pelo promotor EF1α. As sequências nucleotídicas desses construtos, CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-FMC63- vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD] e CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRg- 6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD], são representadas pelas sequências nucleotídicas que codificam o componente Ab-TCR da SEQ ID NO: 3.124 e 3.324. As células T humanas primárias são infectadas com os correspondentes sobrenadantes lentivirais e analisadas quanto à expressão de superfície celular dos Ab-TCRs usando o sobrenadante FLAG-CD19-ECD- GGSG-NLuc-AcV5 (SEQ ID NO: 1.014) e quanto à citotoxicidade contra células RAJI-GLuc. As células T que expressam os Ab-TCRs mostram expressão e atividade modestas. A expressão dos Ab-TCRs é direcionada para o local de TRAC essencialmente como descrito por Eyquem J et al (Nature, 543 (7643): 113 a 117, 2017) usando construtos de alvejamento de genes (consultar a Figura 6) e representada pela SEQ ID NO: 3.861 a 3.864. O construto de alvejamento contém um aceitador de splicing (SA), seguido por uma sequência de codificação F2A, o cassete de Ab-TCR, flanqueado por sequências homólogas ao local de TRAC (LHA e RHA, braço de homologia esquerdo e direito). Nos cassetes A e B (SEQ ID NO: 3.861 a 3.862), a sequência nucleotídica que codifica os cassetes de expressão de Ab-TCR é seguida por um códon de parada, sequências polyA, Éxon 1 de TRAC e a sequência homóloga ao local de TRAC (RHA: braço de homologia direito). No cassete C, a sequência nucleotídica que codifica o cassete de expressão de Ab-TCR é seguido por um códon de parada, o Éxon 1 do TRAC, e a sequência homóloga ao local de TRAC (RHA: braço de homologia direito),

330 / 348 mas sem uma sequência poli A para que o transcrito carregue na sua extremidade 3' o gene TRAC e a sua sequência de poliadenilação.

No cassete D, o cassete de Ab-TCR não tem o seu próprio módulo TCRα e se estende apenas até a região IgG1-CH1, que é fundida no quadro a 3’ da metade do primeiro éxon do TRAC.

Assim, nesse construto, o módulo TCRα é codificado pelo local genômico de TRAC contendo parte do éxon 1 e todo o éxon 2 e éxon 3. O cassete E se assemelha ao cassete D, exceto que o RHA no construto de alvejamento carrega mutações (SDVP) que podem melhorar a expressão do TRAC.

Células T nas quais os cassetes de Ab-TCR são direcionados para o local de TRAC uniforme e expressão fisiológica e persistência e atividade a longo prazo do transgene, conforme determinado utilizando ensaios in vivo e in vitro, em comparação com os cassetes de Ab- TCR expressos usando vetores lentivirais.

As células T que expressam Ab- TCR são purificadas por coloração com PE-proteína L seguido de classificação de fluxo.

A alorreatividade das células T que expressam Ab- TCR é testada usando reação mista de cultura de linfócitos usando células T irradiadas derivadas de um doador alogênico.

As células T nas quais os Ab- TCRs são direcionados para o local de TRAC mostram alorreatividade acentuadamente reduzida à ausente, conforme medido pela resposta proliferativa, em comparação com as células T nas quais os Ab-TCRs são expressos usando vetores lentivirais.

A capacidade das células T humanas que expressam Ab-TCR de induzir a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) é examinada pela administração de 5 milhões de células T que expressam Ab-TCR por animal em camundongos NSG imunodeficientes (Jackson Lab). Os animais são observados por mais de 90 dias.

As células T humanas nas quais os cassetes de Ab-TCR são direcionados para o local de TRAC mostram uma redução acentuada à ausência de Doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) quando infundidas em camundongos NSG imunodeficientes (Jackson Lab) enquanto a GVHD é observada em animais

331 / 348 que receberam células T nas quais os Ab-TCRs são expressos usando vetores lentivirais. A capacidade das células T humanas que expressam Ab-TCR em induzir a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) também é examinada pela administração de células T que expressam Ab-TCR (1 milhão de células por quilograma) em receptores humanos alogênicos. As células T alogênicas nas quais os cassetes de Ab-TCR são direcionados para o local de TRAC mostram incidência e severidade marcadamente reduzidas de Doença do Enxerto contra Hospedeiro (GVHD) quando dadas a receptores alogênicos. Resultados essencialmente semelhantes são obtidos utilizando células T nas quais o Ab-TCR é expresso direcionando os cassetes de expressão para o local de TRBC.

DIRECIONANDO O TCR QUIMÉRICO OU CONSTRUTOS DE RECEPTORES IMUNES SINTÉTICOS (SIR) PARA O LOCAL DE TRAC

[00417] Três construtos de cTCRs (ou SIR) direcionados a CD19 com base em scFv FMC63 são gerados no vetor lentiviral (SEQ ID NO: 3.837) conduzido pelo promotor EF1α. As sequências nucleotídicas desses construtos são representadas pela SEQ ID NO: 3.878, 3.879 e 3.880, respectivamente. Todos têm as mesmas regiões vL e vH. Enquanto a SEQ ID NO: 3.880 tem a sequência nucleotídica do tipo selvagem das cadeias constantes TCRα e TCRβ, as SEQ ID NO: 3.878 e 3.879 têm sequências de códons otimizadas. A SEQ ID NO: 3.878 carrega ainda várias substituições de aminoácidos para melhorar a expressão e o emparelhamento de bases das cadeias constantes TCRα e TCRβ. As células T humanas primárias são infectadas com os correspondentes sobrenadantes lentivirais e analisadas quanto à expressão de superfície celular do SIR usando o sobrenadante FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 (SEQ ID NO: 1.014) e quanto à citotoxicidade contra células RAJI-GLuc. O construto de cTCR/SIR com a SEQ ID NO: 3.880 não é observada expressar bem ou induzir a lise da célula alvo. Os cTCR/SIR também são direcionados para o local de TRAC

332 / 348 essencialmente como descrito por Eyquem J et al (Nature, 543 (7643): 113 a 117, 2017) usando construtos de alvejamento genético exemplificativos (consultar a Figura 7) representadas pelas SEQ ID NO: 3.865 a 3.868 e 3.873. O construto de alvejamento contém um aceitador de splicing (SA), seguido por uma sequência de codificação F2A, o cassete de Ab-TCR, flanqueado por sequências homólogas ao local de TRAC (LHA e RHA, braço de homologia esquerdo e direito). Nos cassetes A e B (SEQ ID NO: 3.865, 3.866 e 3.873), a sequência nucleotídica que codifica os cassetes de expressão de SIR é seguida por um códon de parada, sequências poliA, Éxon 1 de TRAC e a sequência homóloga ao local de TRAC (RHA: braço de homologia direito). No cassete E, a sequência nucleotídica que codifica o cassete de expressão de SIR é seguida por um códon de parada, o Éxon 1 de TRAC, e a sequência homóloga ao local de TRAC (RHA: braço de homologia direito), mas sem uma sequência poli A intermediária, de modo que o transcrito carregue em sua extremidade 3’ o gene TRAC e sua sequência de poliadenilação. No cassete D, o cassete de SIR não tem seu próprio módulo TCRα e se estende apenas até a região FMC63-vH, que é fundida em quadro ao primeiro éxon de TRAC presente no construto de alvejamento. Assim, nesse construto, o módulo TCRα é codificado pelo local genômico de TRAC contendo parte do éxon 1 e todo o éxon 2 e 3. O cassete F se assemelha ao cassete E, exceto que o RHA no construto de alvejamento carrega mutações (CSDVP) nos éxons 1 e 2 do TRAC que podem melhorar a expressão do TRAC. As células T nas quais os cassetes de cTCR/SIR são direcionados para o local de TRAC (SEQ ID NO:

3.873) mostram expressão uniforme e fisiológica e persistência e atividade a longo prazo do transgene, conforme determinado usando ensaios in vivo e in vitro, em comparação com cassetes de cTCR/SIR expressos usando vetores lentivirais. Outros cTCRs (SEQ ID NO: 3.865 a 3.868) também mostram expressão e atividade uniformes quando direcionados para o local de TRAC. As células T que expressam cTCR e SIR são purificadas por coloração com

333 / 348 anticorpo CD3 conjugado com FITC e com proteína PE-L seguido por classificação de fluxo.

A alorreatividade das células T que expressam cTCR e SIR é testada usando a reação mista de cultura de linfócitos usando células T irradiadas derivadas de um doador alogênico.

As células T nas quais o cTCR/SIR são direcionados para o local de TRAC mostram alorreatividade marcadamente reduzida a ausente, conforme medido pela resposta proliferativa, em comparação com as células T nas quais cTCR/SIR são expressos usando vetores lentivirais.

A capacidade das células T humanas que expressam cTCR/SIR de induzir a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) é examinada pela administração de 5 milhões de células T que expressam cTCR/SIR por animal em camundongos NSG imunodeficientes (Jackson Lab). Os animais são observados por mais de 90 dias.

As células T humanas nas quais os cassetes de cTCR/SIR são direcionados para o local de TRAC mostram Doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) marcadamente reduzida a ausente quando infundidas em camundongos NSG imunodeficientes (Jackson Lab) enquanto a GVHD é observada em animais que recebem células T nas quais cTCR/SIR são expressos usando vetores lentivirais.

A capacidade das células T humanas que expressam cTCR e SIR em induzir a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) também é examinada pela administração de células T que expressam cTCR/SIR (1 milhão de células por quilograma) em receptores humanos alogênicos que receberam quimioterapia com linfodepletação.

As células T alogênicas nas quais os cassetes de cTCR/SIR são direcionados para o local de TRAC mostram incidência e severidade marcadamente reduzidas de Doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) quando administradas a receptores alogênicos.

Resultados essencialmente semelhantes são obtidos utilizando células T nas quais cTCR e SIR são expressos direcionando os cassetes de expressão para o local de TRBC.

DIRECIONANDO CONSTRUTOS DE TCR OU cTCR/SIR PARA O

334 / 348

LOCAL DE TRAC

[00418] Um construto de TCR e um construto de cTCRs (ou SIR) direcionados ao complexo NY-ESO-1/HLA-A2 são gerados no vetor lentiviral (SEQ ID NO: 3.837) e são baseados no TCR NYESO-1G4 e no anticorpo mimético TCR NYESO-35-15. As sequências nucleotídicas desses construtos são representadas pelas SEQ ID NO: 3.883 e 3.882, respectivamente. Os dois construtos também são direcionadas ao local de TRAC usando os construtos de alvejamento representadas pelas SEQ ID NO:

3.874 a 3.877. O projeto do construto de alvejamento é mostrado na Figura 8. As células T nas quais o TCR ou cTCR NY-ESO-1 é direcionado ao local de TRAC mostram expressão uniforme do transgene, bom reconhecimento das células alvo que expressam o complexo NY-ESO-1/HLA-A2 e apresentam desempenho igualmente bom ou melhor que células T nas quais os construtos acima são expressos usando transferência gênica mediada por lentivírus usando ensaios in vivo. As células T humanas nas quais o TCR NY-ESO-1 ou cTCR é direcionado ao local de TRAC também mostram alorreatividade reduzida na reação mista de linfócitos e GVHD reduzida no modelo de xenoenxerto de camundongos NSG em comparação com as células T nas quais o NY-ESO- 1 ou cTCR são expressos usando transferência gênica mediada por lentivírus. DIRECIONANDO UM CONSTRUTO DE CADEIA ÚNICA cTCR/SIR AO

LOCAL DE TRAC

[00419] Os cTCR/SIRs de cadeia simples nos quais o FMC63-scFv está ligado à cadeia constante TCRa otimizada por códon ou à cadeia constante TCRa murinizada otimizada mais a murinizada (SEQ ID NO: 3881) são expressos em células T usando o vetor lentiviral e mostram expressão e atividade ruins. Os mesmos construtos são direcionados para o local de TRAC usando os construtos de alvejamento mostrados na Figura 9 e representados pelas SEQ ID NO: 3.869 a 3.872. As células T nas quais os

335 / 348 cTCRs/SIRs de cadeia única são direcionados para o local de TRAC mostram expressão e atividade uniformes do cTCR quando analisadas usando os ensaios descritos anteriormente. Além disso, as células T nas quais o cTCR/SIR de cadeia única são direcionadas ao local de TRAC mostram incidência reduzida de alorreatividade usando MLR e incidência reduzida de GVHD usando o modelo de xenoenxerto de camundongos NSG em comparação com as células T nas quais o NY-ESO- 1 ou cTCR são expressos usando transferência gênica mediada por lentivírus.

[00420] Nos exemplos acima, os CAR/TFP/Ab-TCR/TCR/cTCRs são direcionados para o local de TRAC. Essencialmente, um procedimento semelhante pode ser usado para direcionar o CAR/TFP/Ab-TCR/TCR/cTCR ou um módulo acessório para os locais de TCBC, CD3ε, CD3δ, CD3γ e CD3ζ usando técnicas conhecidas na arte.

[00421] Um promotor EF1α mais curto mantém forte atividade promotora nas células T e é adequado para terapia celular adotiva

[00422] O uso de fortes promotores virais em aplicações de terapia celular adotiva carrega o risco de ativação de oncogenes a jusante e desenvolvimento de câncer. Como tal, o promotor do fator de alongamento humano 1α (EF1α) é frequentemente usado em aplicações de terapia celular adotiva, pois fornece expressão forte e é de origem humana. Uma limitação do promotor EF1α, no entanto, é seu tamanho relativamente grande. Embora um promotor mini-EF1α tenha sido descrito, o mesmo é muito mais fraco em comparação com o promotor EF1α. Para determinar se uma deleção interna no promotor EF1α permitiria encurtar seu comprimento enquanto preserva sua força de promotor, um fragmento SacII foi excluído do promotor EF1α. A sequência nucleotídica do promotor EF1α-D-SacII resultante é apresentada na SEQ ID NO: 3.842. Os vetores lentivirais que codificam um CAR FMC63- BBz direcionado a CD19 foram construídos nos vetores com o promotor EF1α do tipo selvagem (SEQ ID NO: 3.840) ou promotor EF1α-D-SacII

336 / 348 (SEQ ID NO: 3.839). Os vetores também coexpressaram o gene de resistência a EGFP e blasticidina por meio de ligantes 2A. Os lentivírus foram gerados em células 293FT e usados para infectar células J-N-G. As células infectadas foram selecionadas com blasticidina e depois testadas quanto à sua capacidade de induzir a expressão de EGFP após cocultura com células RAJI CD19+ve. Observou-se uma indução quase equivalente da expressão de EGFP em células J-N-G transduzidas com qualquer construto lentiviral. Além disso, foi observada expressão quase equivalente do CAR FMC63-BBz na superfície das células J-N-G transduzidas com qualquer construto conforme determinado pela ligação com a proteína de fusão CD19-ECD-GGS-NLuc. Esses resultados demonstram que o promotor EF1α-D-SacII pode ser utilizado para aplicações de terapia celular adotiva. Os resultados demonstram ainda que o promotor EF1α-D-SacII não é mais propenso a silenciamento do que o promotor EF1α de tipo selvagem e pode ser utilizado para expressão de transgene a longo prazo.

USO DE SAL DE DASATINIB SOLÚVEL EM ÁGUA PARA CONTROLE DE SÍNDROME DE LIBERAÇÃO DE CITOCINAS E COMPLICAÇÕES NEUROLÓGICAS OBSERVADAS DURANTE A TERAPIA CELULAR ADOTIVA

[00423] O Dasatinib é um fármaco pouco solúvel em água e o Dasatinib comercial é um monohidrato e relatado ter solubilidade de 8 μg/ml a 24 °C. Como os pacientes com RSC e complicações neurológicas têm dificuldade em tomar a forma oral do Dasatinib, é desejável a forma solúvel em água do Dasatinib. Sais solúveis em água de Dasatinib foram descritos no documento WO2015107545 A1. As composições injetáveis compreendendo sais solúveis de Dasatinib metanossulfonato monohidratado podem ser preparadas de acordo com o método do documento WO2015107545 A1 e usadas para tratar pacientes com RSC e complicações neurológicas associadas à administração de células CAR-T e Blinatumomab. A dose de Dasatinib

337 / 348 metanossulfonato monohidratado pode ser titulada até atingir uma concentração plasmática eficaz. Em uma modalidade exemplificativa, a concentração plasmática de Dasatinib é mantida acima de 10 nM, 20 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM ou 300 nM. Em outra modalidade exemplificativa, a concentração plasmática de Dasatinib é mantida acima de 5 ng/ml, 15 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml ou 75 ng/ml. Finalmente, o metanol sulfonato de Dasatinib monohidratado dissolvido em solução salina normal também pode ser usado para administração intratecal em pacientes com complicações neurológicas proveniente de células CAR-T e Blinatumomab. Em uma modalidade exemplificativa, a dose intratecal de metanossulfonato de Dasatinib é ajustada para atingir uma concentração no LCR superior a 10 nM, 20 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM ou 300 nM. Em uma modalidade exemplificativa, a dose intratecal de metanossulfonato de Dasatinib é ajustada para atingir uma concentração no LCR superior a 5 ng/ml, 15 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml ou 75 ng/ml.

USO DE CÉLULAS T AUTÓLOGAS QUE EXPRESSAM CARS E ESTRUTURAS PRINCIPAIS CONVENCIONAIS 1 A 72 DIRECIONADAS

A MÚLTIPLOS ANTÍGENOS PARA TERAPIA CELULAR ADOTIVA

[00424] Pacientes com muitas doenças diferentes, incluindo doenças infecciosas (por exemplo, HIV1, EBB, CMV, HTLV1, etc.), doenças degenerativas (por exemplo, doença de Alzheimer), doenças alérgicas (por exemplo, urticária idiopática crônica) e vários cânceres serão incluídos no estudo clínico de fase I aprovado por IRB de imunoterapia com células CAR- T autólogas transferidas adotivamente que coexpressam NEMO-K277A (estrutura principal 2) direcionadas a diferentes antígenos causadores ou associados a doenças. O CAR para diferentes doenças será selecionado com base na expressão conhecida de seu antígeno alvo nas células causadoras ou associadas a doenças. Quando possível, a expressão do alvo de CAR nas células causadoras ou associadas à doença será confirmada pela ligação com a

338 / 348 proteína de fusão GGS-NLuc do domínio de ligação ao antígeno em que o domínio de ligação ao antígeno do CAR está fundido à forma não secretora de proteína NLuc através de um ligante flexível. Alternativamente, imuno- histoquímica ou citometria de fluxo usando anticorpos disponíveis comercialmente serão usadas para confirmar a expressão do antígeno alvo do CAR em células causadoras ou associadas a doenças. As células T serão coletadas dos indivíduos utilizando leucoférese, transduzidas com os vetores de lentivírus apropriados e expandidas ex vivo usando microesferas de CD3/CD28 em um sistema fechado. Após os produtos celulares resultantes terem sido submetidos a testes de controle de qualidade (incluindo testes de esterilidade e citotoxicidade específica de tumores), os mesmos serão criopreservados. Os produtos de células CAR-T serão administrados aos indivíduos como descrito no exemplo anterior. Estudos de acompanhamento clínico e laboratorial correlacionados podem ser realizados a critério do médico. Essencialmente, uma abordagem semelhante é usada para testar os CARs em outras estruturas principais descritas nesta divulgação.

USO DE CÉLULAS T ALOGÊNICAS QUE EXPRESSAM CARS E ESTRUTURAS PRINCIPAIS CONVENCIONAIS 1 A 72 DIRECIONADAS

A MÚLTIPLOS ANTÍGENOS PARA TERAPIA CELULAR ADOTIVA

[00425] Pacientes com muitas doenças diferentes, incluindo doenças infecciosas (por exemplo, HIV1, EBB, CMV, HTLV1, etc.), doenças degenerativas (por exemplo, doença de Alzheimer), doenças alérgicas (por exemplo, urticária idiopática crônica) e vários cânceres serão incluídos em um ensaio clínico de fase I aprovado por IRB de imunoterapia com células CAR- T alogênicas transferidas adotivamente direcionadas a diferentes antígenos causadores de doenças ou associados a doenças. O CAR para diferentes doenças será selecionado com base na expressão conhecida de seu antígeno alvo nas células causadoras ou associadas a doenças. Quando possível, a expressão do alvo de CAR nas células causadoras ou associadas à doença será

339 / 348 confirmada pela ligação com a proteína de fusão GGS-NLuc do domínio de ligação ao antígeno em que o domínio de ligação ao antígeno do CAR está fundido à forma não secretora de proteína NLuc através de um ligante flexível. Alternativamente, imuno-histoquímica ou citometria de fluxo usando anticorpos disponíveis comercialmente serão usadas para confirmar a expressão do antígeno alvo do CAR em células causadoras ou associadas a doenças. As células T serão coletadas de um doador saudável usando leucoférese. O cassete de expressão de CAR (SEQ ID NO: 1.900 a SEQ ID NO: 2.205) é clonado no vetor de alvejamento e o módulo de CAR é direcionado para o local de TRAC nas células T essencialmente como descrito por (Eyquem J et al., Nature 543 (7643): 113 a 117). As células T sem expressão de CD3 na superfície são selecionadas por purificação imunomagnética e depois expandidas ex vivo usando esferas de CD3/CD28 em um sistema fechado. Após os produtos celulares resultantes terem sido submetidos a testes de controle de qualidade (incluindo testes de esterilidade e citotoxicidade específica de tumores), os mesmos serão criopreservados. Os produtos de células CAR-T serão administrados aos indivíduos como descrito no exemplo anterior. Estudos de acompanhamento clínico e laboratorial correlacionados podem ser realizados a critério do médico. Essencialmente, uma abordagem semelhante é usada para testar os CARs em outras estruturas principais, incluindo os CARs que coexpressam a cadeia constante TCRα (TRAC) sem o domínio Vα, descrito nesta divulgação. INFUSÃO ARTERIAL HEPÁTICA DE CÉLULAS CAR-T

[00426] Além da infusão intravenosa, as células T que expressam os CARs e as estruturas principais convencionais 1 a 72 descritas nesta invenção podem ser infundidas intra-arterialmente para fornecer alta concentração de células CAR-T em uma área local ou órgão envolvido com uma doença. No exemplo a seguir, essa abordagem é usada no caso de um paciente com metástases hepáticas de um câncer gastrointestinal que expressa o Receptor

340 / 348 alfa de Folato (FR1). Essencialmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para infusão intra-arterial de células T que expressam CARs convencionais e estruturas principais 1 a 72 visando outros antígenos tumorais.

[00427] Um angiograma de mapeamento será realizado através da abordagem da artéria femoral comum direita na linha de base. As artérias gastroduodenais e gástricas direitas, além de outras fontes potenciais de perfusão extra-hepática, serão embolizadas com microbobinas. O mesmo procedimento de acesso arterial será realizado para administração de células T que expressam o construto CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A- hNEMO-K277A-T2A-PAC (SEQ ID NO: 1.727). As células T serão coletadas do paciente no dia 0 e serão infectadas com lentivírus que codificam o construto CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A- T2A-PAC e expandidas conforme descrito nos exemplos anteriores. As células CAR-T serão administradas de forma a aumentar a dose no dia 14 (107 células CAR-T), dia 28 (108 células CAR-T) e dia 44 (109 células CAR-T). As células CAR-T serão injetadas manualmente através de uma seringa de 60 cm3 a uma taxa de < 2 cm3/segundo. O volume total de infusão será de aproximadamente 100 cm3. A angiografia com taxa de contraste calibrada será realizada após a primeira infusão de 50 cm3 e no final da infusão de CAR-T para confirmar o fluxo arterial preservado. As infusões serão entregues na artéria hepática adequada quando possível. Certos pacientes podem ter anatomia arterial hepática aberrante, em que a artéria hepática direita ou esquerda não surge da artéria hepática adequada. Nesses casos, a dose de células CAR-T será dividida com base nos cálculos do volume lobar. Nesses casos, doses divididas serão entregues separadamente nas artérias hepáticas direita e esquerda para garantir a entrega proporcional de CAR-T para ambos os lobos hepáticos. ADMINISTRAÇÃO INTRAPERITONEAL DE CÉLULAS CAR-T

341 / 348

[00428] As células CAR-T também podem ser administradas intraperitonealmente, essencialmente como descrito em Koneru M et al (Journal of Translational Medicine; 2015; 13: 102). No exemplo a seguir, essa abordagem é usada em pacientes com envolvimento peritoneal com câncer de ovário que expressa o Receptor alfa de Folato (FR1). Essencialmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para infusão intraperitoneal de células CAR-T direcionadas a outros antígenos tumorais descritos nesta divulgação.

[00429] Um consentimento informado de triagem será oferecido aos pacientes com câncer de ovário seroso de alto grau recorrente para testar seu câncer quanto à expressão de FR1. Após a expressão da FR1 ser confirmada por imuno-histoquímica, os pacientes terão um produto de leucaférese obtido do sangue periférico. O excesso de contaminação por plaquetas e glóbulos vermelhos será removido do produto da leucaférese, e o produto será congelado. Na fase de tratamento do estudo, o produto da leucaférese será descongelado e lavado. Posteriormente, as células T CD3+ serão isoladas do produto de leucaférese descongelada por separação magnética usando microesferas CD3/CD28. As células T ativadas serão transduzidas lentiviralmente com o construto CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A- hNEMO-K277A-T2A-PAC e adicionalmente expandidas usando o protocolo de expansão de microesfera de CD3/CD28.

[00430] Pacientes com carcinoma de trompa de Falópio, peritoneal ou de ovário de alto grau seroso recorrente demonstrando expressar antígeno FR1 confirmado por análise imuno-histoquímica (IHC) de tumor depositado (parafinado) ou recentemente biopsiado serão potencialmente elegíveis para o estudo.

[00431] A dosagem de escalonamento da dose de fase I será usada no estudo. Coortes de 3 a 6 pacientes receberão doses crescentes de células T modificadas para estabelecer a dose máxima tolerada (MTD). Haverá quatro níveis de dose planejada: 3 x 105, 1 x 106, 3 x 106 e 1 x 107 células CAR-T/kg.

342 / 348 Coortes I e II serão tratadas com 3 x 105 células CAR-T/kg, mas pacientes em coorte II também receberão ciclofosfamida de linfodepleção. As coortes II a V receberão doses crescentes das células T modificadas após o pré-tratamento com ciclofosfamida. A ciclofosfamida de linfodepleção, com dose de 750 mg/m2, será administrada 2 a 4 dias antes da infusão inicial de células T. Um esquema padrão de escalonamento de 3 + 3 doses será seguido.

[00432] Um cateter IP será colocado antes da infusão de células T. Os pacientes serão admitidos na unidade de internação do hospital antes da primeira infusão de células T CAR e permanecerão hospitalizados até pelo menos 3 dias após a segunda infusão de células T CAR. A primeira coorte de pacientes a ser tratada e o primeiro paciente tratado em cada coorte subsequente serão admitidos na unidade de terapia intensiva (UTI); pacientes subsequentes podem ser admitidos no serviço de internação oncológica médica (sujeito ao julgamento clínico do médico assistente).

[00433] Os pacientes receberão uma dose única de quimioterapia com ciclofosfamida de linfodepleção (750 mg/m2 IV) 2 a 4 dias antes do início do tratamento com células T modificadas com CAR. As células T transduzidas serão testadas quanto à qualidade para o número, pureza, viabilidade e esterilidade antes da infusão. Todos os pacientes receberão 50% da dose de células T geneticamente modificadas por via intravenosa. Os pacientes serão monitorados de perto quanto a toxicidades. Um a três dias depois, a dose restante de células T será administrada como uma infusão IP. Pelo menos 3 pacientes serão tratados no nível de dose 1, com um acúmulo de não mais de 2 pacientes por mês dentro de cada nível de dose. Todos os pacientes tratados na coorte anterior serão observados por um período mínimo de 4 semanas a partir do dia da infusão inicial de células T antes que a escalação para a próxima coorte ocorra. Serão obtidas amostras de sangue de todos os pacientes antes e após o tratamento para avaliar a toxicidade, os efeitos terapêuticos e a sobrevivência das células T geneticamente modificadas.

343 / 348 USO DE CÉLULAS CAR-T PARA INJEÇÃO INTRATUMORAL

[00434] As células CAR-T também podem ser administradas intra- tumoralmente, essencialmente como descrito em Brown CE, et al., Clin Cancer Res. 2015 15 de setembro; 21 (18): 4.062 a 4.072. No exemplo a seguir, essa abordagem será usada no caso de pacientes com glioblastoma recorrente (GBM) que expressa IL13Ra2. Essencialmente, uma abordagem semelhante pode ser usada para injeção intra-tumoral de células T que expressam CARs convencionais ou CARs convencionais que expressam módulos acessórios (estruturas principais 1 a 72) visando outros antígenos tumorais.

[00435] Um estudo piloto de segurança e viabilidade será conduzido para testar as células T CD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A- hNEMO-K277A-T2A-PAC (SEQ ID NO: 1.769) que expressam células T em GBM recorrente. Todos os pacientes participantes deverão dar um consentimento informado por escrito. O protocolo clínico será aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Califórnia do Sul e conduzido sob um Pedido de Investigação de Novos Fármacos, e registrado no ClinicalTrials.gov. Os pacientes elegíveis incluirão adultos (18 a 70 anos) com glioma de grau III ou IV supratentorial recorrente ou refratário cujos tumores não mostram comunicação com as vias ventriculares/LCR e são passíveis de ressecção. A participação nesse estudo será independente da situação do antígeno tumoral IL13Rα2 (ou IL13Ra2). Os pacientes serão inscritos após o diagnóstico inicial de glioma de alto grau (grau III ou IV de acordo com OMS), quando serão submetidos à leucaférese para coleta de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Essas células serão usadas para projetar células T para expressar o construto CD8SP-IL13Ra2- Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC contendo o gene de resistência à puromicina (PAC) após infecção pelo vector lentiviral correspondente, como descrito nos exemplos anteriores. Alternativamente, as

344 / 348 células CAR-T podem ser geradas após infecção com um vetor retroviral ou usando o transposão da Bela Adormecida ou por transfecção de mRNA de IVT.

Subsequentemente, as células CAR-T terapêuticas testadas para liberação serão criopreservadas e armazenadas para uso posterior.

No momento da primeira recorrência do tumor, o participante da pesquisa será submetido à ressecção do tumor juntamente com a colocação de um reservatório/cateter de Rickham.

Simultaneamente, as células terapêuticas CAR-T serão descongeladas e novamente expandidas in vitro usando o protocolo de expansão rápida baseado em microesferas CD3/CD28. Após a recuperação da cirurgia e da ressonância magnética pós-basal, as células CAR-T serão administradas diretamente na cavidade de ressecção por meio do cateter de permanência, essencialmente como descrito (Brown CE, et al., Clin Cancer Res. 2015 21 (18): 4.062 a 4.072). As células serão injetadas manualmente no reservatório de Rickham usando uma agulha borboleta de calibre 21 para fornecer um volume de 2 ml por 5 a 10 minutos, seguido por 2 ml de lavagem com solução salina normal livre de conservantes por 5 minutos.

O plano de tratamento de protocolo especificará uma programação de escalonamento de dose intrapaciente com uma meta de 12 doses de células T administradas intracranialmente por um período de 5 semanas composto por ciclos semanais de tratamento.

Durante os ciclos 1, 2, 4 e 5, as infusões de células T serão realizadas nos dias 1, 3 e 5 da semana do ciclo, e a semana 3 será um ciclo de descanso.

Por segurança, no ciclo 1, será utilizada uma estratégia de escalonamento de dose intrapaciente, com doses de células T CAR de 107, 5 × 107 e 108 células por infusão administrada nos dias 1, 3 e 5, respectivamente, e será seguido por 9 infusões adicionais de células T CAR de 108 células ao longo de 4 semanas.

Imaginologia para avaliar a resposta será realizado durante o ciclo de descanso da semana 3 e após a semana 5. As diretrizes fornecidas nos Critérios Comuns de Toxicidade da NCI versão 2.0 (https://ctep.ifo.nih.gov/l) serão seguidas para o monitoramento da notificação

345 / 348 de toxicidade e eventos adversos. USO DE CÉLULAS CAR-T PARA PURGA EX VIVO DE MEDULA ÓSSEA OU PREPARAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO DO SANGUE

PERIFÉRICO ANTES DO TRANSPLANTE

[00436] As células T CAR podem ser usadas para purgar a medula óssea ou a preparação de células-tronco do sangue periférico de células cancerígenas antes do transplante de células-tronco. No exemplo a seguir, as células T que expressam CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A- hNEMO-K277A-T2A-PAC (SEQ ID NO: 1.699) serão usadas para purgar células-tronco de medula óssea ou sangue periférico obtidas de um paciente com mieloma múltiplo antes do transplante autólogo de células-tronco (ou medula óssea).

[00437] O paciente será submetido a leucoférese para coletar células mononucleares do sangue periférico (PBMC). As células T serão purificadas utilizando microesferas CD3. Essas células serão usadas para manipular geneticamente células T para expressar o CAR CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL- vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC após infecção com o vetor lentiviral correspondente, conforme descrito nos exemplos anteriores. Posteriormente, as células CAR-T terapêuticas testadas para liberação serão criopreservadas e armazenadas para uso posterior ou usadas frescas. As células da medula óssea e os produtos de células progenitoras do sangue periférico serão coletados de um paciente com mieloma múltiplo seguindo procedimentos padrão. Para a mobilização de células-tronco do sangue periférico, os pacientes receberão ciclofosfamida, 3 gm/m2 seguido de G-CSF, 10 μg/kg por via subcutânea a cada dia, começando 24 h após a ciclofosfamida até que a ferese esteja completa. As células-tronco do sangue periférico serão coletadas quando a contagem de células CD34+ no sangue periférico for de 15 células/µl. O objetivo da coleta será processar três volumes de sangue por dia até que no mínimo 2,0 vezes 106 células

346 / 348 CD34+/kg sejam atingidas após o processamento. Os produtos da medula óssea e das células-tronco do sangue periférico serão opcionalmente esgotados de glóbulos vermelhos e/ou enriquecidos para células que expressam CD34 usando o CliniMACS Prodigy® System da Miltenyi Biotec e seguindo as recomendações do fabricante. Os produtos serão utilizados para purga ex vivo frescos ou criopreservados. Para a purga, os produtos da medula óssea ou das células-tronco do sangue periférico serão cocultivados com células CAR-T descongeladas na razão efetor-alvo variando de 5:1 a 30:1 por 4 a 24 horas em meio XVIVO (Lonza) suplantado com 100 UI de IL2 humana recombinante. As células serão cultivadas a 37 °C, em uma incubadora umidificada com CO2 a 5%. No final do período de cocultura, uma alíquota das células será coletada para testes de esterilidade e qualidade (incluindo a medição de CFU-GM e citometria de fluxo para células positivas para CD34 e CD138). A amostra restante será administrada por via intravenosa ao paciente que recebeu quimioterapia mieloablativa anteriormente (por exemplo, alta dose de Melfalan em duas doses divididas de 70 mg/m2 para uma dose total de 140 mg/m2).

USO DE ENGAGERS DE CÉLULAS T BIESPECÍFICOS

[00438] As proteínas codificadas pelos engagers de células T Biespecíficos são expressas em células Hela usando os construtos que têm as SEQ ID Nos listadas na Tabela 13. As proteínas são purificadas usando a etiqueta de afinidade de metal ou as colunas StrepTag II usando técnicas padrão de purificação de proteínas. As proteínas purificadas são testadas em ensaios clínicos de fase I. Os pacientes são selecionados com base na expressão dos antígenos alvo dos anticorpos biespecíficos usando diferentes ensaios conhecidos na técnica. Os anticorpos biespecíficos são administrados por infusão de 24 horas. As diretrizes fornecidas nos Critérios Comuns de Toxicidade da NCI versão 2.0 (http[s://]ctep.ifo.nih.gov/l) são seguidas para o monitoramento da notificação de toxicidade e eventos adversos.

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USO DE COMBINAÇÕES DE CAR

[00439] Os pacientes com mesotelioma e glioblastomas recebem células T infectadas com lentivírus que codificam a seguinte combinação de CARs direcionados à mesotelina (expressa em mesotelioma), IL13Ra2 (expressa em glioblastomas) e marcadores hematopoiéticos (CD19, CD20, CD22, BCMA). As células T são qualquer uma dentre as cadeias de TCR do tipo selvagem ou têm a cadeia TCRα nocauteada pela abordagem CRISP/Cas9. Observa-se que a coexpressão nas mesmas células T com as cadeias de TCR de tipo selvagem de um CAR direcionado a mesotelina com um CAR direcionado a CD19, CD20, CD22 ou BCMA resulta em expansão da célula T aumentada in vivo em comparação à expressão de mesotelina isolada. Resultados essencialmente semelhantes são obtidos com o CAR direcionado a glioblastoma. No entanto, em células T defeituosas nas cadeias de TCR, a coexpressão de CARs baseados em TFP direcionados a CD20 (SEQ ID NO: 9.660) não induz expansão in vivo enquanto a coexpressão de SIR (SEQ ID NO: 9.668) ou Ab-TCR (SEQ ID NO: 9.676) com base em CARs induz com sucesso a expansão de células T. TABELA 15. EFEITO DA COMBINAÇÃO DE CAR NA EXPANSÃO DE

CÉLULAS T IN VIVO Doença Situação do Antígeno alvo SEQ ID do Antígeno SEQ ID Expansão de TCR das células do 1o CAR 1o CAR alvo do 2o do 2o células T

T CAR CAR Mesotelioma Tipo Selvagem Mesotelina 1.505 Nenhum Pobre Mesotelioma Tipo Selvagem Mesotelina 1.505 CD19 1.016 Boa Mesotelioma Tipo Selvagem Mesotelina 1.505 CD19 1.607 Boa Mesotelioma Tipo Selvagem Mesotelina 1.505 CD20 1.631 Boa Mesotelioma Tipo Selvagem Mesotelina 1.505 CD22 1.644 Boa Mesotelima Tipo Selvagem Mesotelina 1.505 BCMA 1.624 Boa Glioblastoma Tipo Selvagem IL13Ra2 1.493 Nenhum Pobre Glioblastoma Tipo Selvagem IL13Ra2 1.493 CD19 1.016 Boa Glioblastoma Tipo Selvagem IL13Ra2 2.075 CD19 1.607 Boa Glioblastoma Tipo Selvagem IL13Ra2 2.381 CD20 1.631 Boa Glioblastoma Tipo Selvagem IL13Ra2 2.687 CD22 1.644 Boa Glioblastoma Tipo Selvagem IL13Ra2 2.687 BCMA 1.624 Boa Glioblastoma TCR-alpha-ve IL13Ra2 2.075 CD20 9.660 Pobre Glioblastoma TCR-alpha-ve IL13Ra2 2.381 CD20 9.660 Pobre Glioblastoma TCR-alpha-ve IL13Ra2 2.687 CD20 9.660 Pobre Glioblastoma TCR-alpha-ve IL13Ra2 1.493 Nenhum Pobre Glioblastoma TCR-alpha-ve IL13Ra2 1.493 CD20 9.668 Boa

348 / 348 Glioblastoma TCR-alpha-ve IL13Ra2 2.075 CD20 9.676 Boa Glioblastoma TCR-alpha-ve IL13Ra2 2.381 CD20 9.668 Boa Glioblastoma TCR-alpha-ve IL13Ra2 2.687 BCMA 9.362 Boa Glioblastoma TCR-alpha-ve IL13Ra2 2.687 BCMA 9.362 Boa

[00440] Os vários métodos e técnicas descritos acima fornecem várias maneiras de realizar a aplicação. Obviamente, deve ser entendido que nem todos os objetivos ou vantagens descritos podem ser alcançados de acordo com qualquer modalidade específica descrita neste documento. Assim, por exemplo, aqueles versados na técnica reconhecerão que os métodos podem ser executados de uma maneira que atinja ou otimize uma vantagem ou grupo de vantagens conforme ensinado neste documento, sem necessariamente alcançar outros objetivos ou vantagens conforme ensinado ou sugerido neste documento. Uma variedade de alternativas é mencionada neste documento. Deve ser entendido que algumas modalidades preferenciais incluem especificamente um, outro ou vários recursos, enquanto outras excluem especificamente um, outro ou vários recursos, enquanto outras ainda mitigam um recurso específico pela inclusão de um, outro ou vários recursos vantajosos.

[00441] Além disso, o indivíduo versado na técnica reconhecerá a aplicabilidade de várias características de diferentes modalidades. Da mesma forma, os vários elementos, características e etapas discutidos acima, bem como outros equivalentes conhecidos para cada um desses elementos, características ou etapas, podem ser empregados em várias combinações por um indivíduo versado na técnica para executar métodos de acordo com os princípios descritos neste documento. Entre os vários elementos, recursos e etapas, alguns serão especificamente incluídos e outros especificamente excluídos em diversas modalidades.

[00442] Um número de modalidades foi estabelecido acima para ilustrar a divulgação. As reivindicações a seguir estabelecem ainda o que as Requerentes consideram como sua invenção.

Claims

1 / 30 REIVINDICAÇÕES

1. Célula imune ou população de células imunes da mesma, caracterizada pelo fato de que expressa (i) pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e (ii) pelo menos um agente de ocorrência não natural que ativa seletivamente a via de sinalização de NF-κB.

2. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno e pelo menos um domínio transmembranar.

3. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural tem capacidade para recrutar pelo menos um módulo de sinalização associado ao TCR.

4. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um TCR recombinante.

5. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno do pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural se liga a um antígeno selecionado de um grupo que consiste em CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (também denominado CD2 subconjunto 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2- 3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα- Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor

2 / 30 órfão de tipo tirosina-quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expressado em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina- 13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-llRa); antígeno de célula-tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor de folato alfa (FRa ou FR1); Receptor de folato beta (FRb); Receptor tirosina-proteína quinase ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1); receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade Proteassoma (Prosome, Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2- 3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o-acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6

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(CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR-1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro lA (XAGEl); receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testítulo de melanoma (MAD-CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; prosteína; survivina; telomerase; antígeno 1 do tumor de carcinoma de próstata (PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil-glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1);

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Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY- TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de domínio de lectina de tipo C (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGLL1), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276 / B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM-CSFR-alfa), TGFbetaR2, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR-beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio folículo estimulante (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina (CGHR ou GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1,

5 / 30 HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), auto anticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, Claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A.2), Glicoproteína p, STEAP1, Liv1, Nectin-4, Cripto, gpA33, BST1 / CD157, canal de cloreto de baixa condutância e um antígeno reconhecido por anticorpo TNT.

6. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é selecionado a partir do grupo que consiste em vFLIP K13, K13-opt, um mutante NEMO, uma proteína de fusão NEMO, IKK1-S176E- S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, IKKα, IKKβ, Tcl-1, MyD88-L265, qualquer proteína ou fragmento de proteína de ativação de NF-κB, qualquer inibidor de um inibidor de via NF-κB, qualquer sistema de edição de genes com capacidade para ativar seletivamente NF-κB, qualquer homólogo ou variante do mesmo e qualquer combinação dos mesmos.

7. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é de origem não viral.

8. Célula imune ou população de células imunes dos mesmos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar a via de NF- κB é um sistema de edição de gene.

9. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um

6 / 30 agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB induz a oligomerização de NEMO/IKKγ.

10. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB induz a ativação do complexo IKK.

11. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB não ativa a via de AKT.

12. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é expresso de maneira constitutiva ou induzível.

13. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é expresso de modo transiente.

14. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é expresso de modo estável.

15. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a atividade do pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é controlada pós-tradução através do contato da célula com um composto.

16. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um

7 / 30 agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é expressado como um construto de fusão com uma ou mais cópias de um domínio de troca.

17. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a atividade do pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB é controlada no nível pós-tradução por administração de quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que induz à dimerização do domínio de troca.

18. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que o domínio de troca compreende uma ou mais cópias de um domínio FKBP12.

19. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o composto é AP20187 ou Rimiducid ou um homólogo do mesmo.

20. Célula imune ou população de células imunes dos mesmos de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula imune é um linfócito T (célula T), uma célula CAR-T, uma célula T que expressa TCR, um linfócito infiltrado no tumor (TIL), um linfócito residente de tecido, uma célula-tronco, uma célula-tronco pluripotente induzida ou uma célula Exterminadora Natural (NK).

21. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula imune tem sido manipulada para não ter um complexo de sinalização de receptor de célula T (TCR) nativo funcional e/ou microglobulina β2.

22. Célula imune ou população de célula imune da mesma de acordo com a reivindicação 1 e 21, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e/ou o pelo menos um agente com capacidade para ativar seletivamente a via de sinalização de NF-

8 / 30 κB são clonados em um gene de TCR endógeno, de modo que a expressão de pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e/ou pelo menos um agente com capacidade para ativar seletivamente a via de sinalização de NF- κB esteja sob controle dos elementos reguladores endógenos/promotor para o gene de TCR.

23. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, que é usada para a prevenção e o tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo de um câncer, doenças infecciosas, doenças imunes, e doenças alérgicas.

24. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo codifica o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB são expressados a partir de um promotor único.

25. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo que codifica o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e o pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente a via de NF-κB são expressados com o uso de dois ou mais promotores separados.

26. Célula imune ou população de células imunes da mesma de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo compreende uma primeira sequência de codificação de ácido nucleico que codifica o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural separada de uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica o agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente NF-κB, de modo que, mediante expressão da primeira e segunda sequências de codificação de ácido nucleico, o receptor imune de

9 / 30 ocorrência não natural e o agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente NF-κB não estejam fisicamente ou quimicamente ligados.

27. Célula imune ou população de célula imune da mesma de acordo com a reivindicação 24 e 25, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e/ou o pelo menos um agente com capacidade para ativar seletivamente o polinucleotídeo de codificação de NF-κB (ou polinucleotídeos de codificação de NF-κB) são clonados em um gene de TCR endógeno, de modo que o pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural e/ou pelo menos um agente de ocorrência não natural com capacidade para ativar seletivamente NF-κB estejam sob controle dos elementos reguladores endógenos/promotor para o gene de TCR.

28. Célula imune ou população de célula imune da mesma de acordo com as reivindicações 21 ou 27, caracterizada pelo fato de que uma ou mais cadeias constantes dos genes TCR são funcionalmente re-expressadas.

29. Polinucleotídeo recombinante que codifica pelo menos um receptor imune de ocorrência não natural, sendo que o pelo menos um polinucleotídeo recombinante é, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro domínio de ácido nucleico que codifica um domínio transmembranar parcial ou total e/ou citoplasmático e, opcionalmente, o domínio extracelular de uma proteína endógena, em que a proteína endógena é expressa na superfície de linfócitos e desencadeia a ativação e/ou proliferação do linfócito; (b) opcionalmente, um polinucleotídeo um ligante; (c) um segundo domínio de ácido nucleico operacionalmente ligado ao primeiro domínio de ácido nucleico, em que o segundo domínio de ácido nucleico codifica um ou mais domínio(s) de ligação ao antígeno de TCR não natural;

10 / 30 (d) um terceiro domínio de ácido nucleico opcional que codifica um domínio coestimulante; e (e) um domínio de ácido nucleico adicional opcional que codifica um módulo acessório.

30. Polinucleotídeo recombinante caracterizado pelo fato de que compreende: a) um primeiro ácido nucleico que codifica um receptor imune de ocorrência não natural; e b) um segundo ácido nucleico que codifica um módulo acessório que compreende um ativador de NF-κB seletivo.

31. Polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico são separados por um ligante de oligonucleotídeo que codifica um ligante de peptídeo clivável.

32. Polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende dois polinucleotídeos recombinantes, de modo que o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico sejam expressos a partir de vetores separados.

33. Polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o ativador de NF-κB seletivo é um ativador de NF-κB seletivo de ocorrência não natural.

34. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o receptor imune de ocorrência não natural é selecionado a partir do grupo que consiste em um CAR, um Ab-TCR, um TFP, um cTCR, um SIR e um TCR recombinante.

35. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o receptor imune de ocorrência não natural compreende (i) um domínio específico de antígeno extracelular, (ii) um domínio transmembranar, e (iii) um domínio de sinalização intracelular

11 / 30 opcional que compreende um motivo de ativação com base em tirosina de imunorreceptor (ITAM), em que (iii) está localizado no terminal C do receptor imune de ocorrência não natural.

36. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que, mediante expressão da primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos, o receptor imune de ocorrência não natural e o polipeptídeo de ativador de NF-κB seletivo não são fisicamente ou quimicamente ligados.

37. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o domínio específico de antígeno extracelular se liga a qualquer um ou mais dentre CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (também denominado subconjunto CD2 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2- 8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα-Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor órfão de tipo tirosina-quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expressado em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina- 13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-llRa); antígeno de célula-tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de

12 / 30 crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor de folato alfa (FRa ou FR1); Receptor de folato beta (FRb); Receptor tirosina-proteina quinase ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1); complexo AFP/MHC; receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade Proteassoma (Prosome, Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o- acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR- 1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1);

13 / 30 complexo de WT1/MHC I; Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); complexo de NY-ESO-1/MHC I; Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro lA (XAGEl); receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testítulo de melanoma (MAD-CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; prosteína; survivina; telomerase; antígeno 1 do tumor de carcinoma de próstata (PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil-glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY- TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); complexo de HPV E6/MHC I; vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); complexo de HPV E7/MHC I; complexo de

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AFP/MHC I; complexo de Ras/MHC I; carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de domínio de lectina de tipo C (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGLL1), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276 / B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM-CSFR-alfa), TGFbetaR2, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR- beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio folículo estimulante (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina (CGHR ou GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), auto anticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, Claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A2), Glicoproteína p, STEAP1, Liv1, Nectin-4, Cripto, gpA33, BST1 / CD157, canal de cloreto de baixa condutância e um antígeno reconhecido por anticorpo TNT.

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38. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o ativador de NF-κB seletivo é selecionado a partir do grupo que consiste em vFLIP K13, um mutante NEMO, uma proteína de fusão NEMO, IKK1-S176E-S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, FKBPx2-RIP-ID, IKK1, FKBPx2-IKKa, IKK2, FKBPx2-IKK2, Tcl-1, MyD88-L265, qualquer proteína ou fragmento de proteína de ativação de NF- κB, qualquer inibidor de um inibidor de via NF-κB, um sistema de edição de genes com capacidade para ativar seletivamente NF-κB, um sistema de interferência de RNA que ativa seletivamente NF-κB e qualquer combinação dos mesmos.

39. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o ativador de NF-κB seletivo é expresso como um construto de fusão com uma ou mais cópias de domínio FKBP.

40. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o domínio específico de antígeno extracelular é selecionado a partir do grupo que consiste em: - a região variável da cadeia pesada (vH) de um anticorpo ou um fragmento do mesmo específico para um antígeno alvo predefinido; - a região variável da cadeia leve (vL) de um anticorpo ou um fragmento do mesmo específico para um antígeno alvo predefinido; - um fragmento variável de cadeia simples (scFv) ou um fragmento do mesmo específico para um antígeno alvo predefinido; - um fragmento de anticorpo (por exemplo, Fv, um Fab, um (Fab')2) específico para um antígeno alvo predefinido; - um fragmento de anticorpo de domínio único (SDAB) específico para um antígeno alvo predefinido; - um domínio vHH camelídeo específico para um antígeno alvo predefinido; - arcabouços de ligação ao antígeno não imunoglobulina

16 / 30 específicos para um antígeno alvo predefinido; - um receptor específico ou um fragmento do mesmo para um antígeno alvo predefinido; - um ligante ou um fragmento do mesmo específico para um antígeno alvo predefinido; - um anticorpo biespecífico, -fragmento de anticorpo, -scFV, - vHH, -SDAB, -arcabouço de ligação ao antígeno não imunoglobulina, - receptor ou -ligante específico para um ou mais antígenos alvo predefinidos; e - um autoantígeno ou um fragmento do mesmo.

41. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 40.

42. Vetor de acordo com a reivindicação 41, sendo que o vetor é caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em um vetor de DNA, um vetor de RNA, um plasmídeo, um vetor de lentivírus, vetor adenoviral, vetor de AAV, um vetor retroviral, um vetor de baculovírus, um vetor de transposon de beleza do sono e um vetor de transposon piggybac.

43. Célula efetora imune ou célula-tronco, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotídeo recombinante, de qualquer uma das reivindicações 30 a 40.

44. Célula efetora imune ou célula-tronco caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um vetor de acordo com a reivindicação

41.

45. Célula efetora imune ou célula-tronco caracterizada pelo fato de que compreende o pelo menos um vetor de acordo com a reivindicação 42.

46. Célula que apresenta antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um vetor de acordo com a reivindicação 41.

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47. Célula efetora imune ou célula-tronco de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizada pelo fato de que a célula efetora imune é uma célula T humana, uma célula NKT humana ou uma célula T sintética, célula NK ou uma célula-tronco que pode gerar uma célula efetora imune, opcionalmente, em que a célula T é deficiente em diaglicerol quinase (DGK) e/ou Ikaros e/ou Brd4.

48. Método, caracterizado pelo fato de que é para (i) prolongar a vida útil de uma célula imune em expressão, (ii) estimular a proliferação de uma célula imune, (iii) estimular a produção de citocinas por uma célula imune, (iv) melhorar a apresentação de antígenos por uma célula imune, (v) proteger uma célula imune da apoptose, em que o método compreende a transfecção ou transformação das células imunes com um polinucleotídeo que codifica um ativador de NF-κB seletivo ou um polipeptídeo estimulante específico de NF-κB.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o ativador NF-κB seletivo ou um polipeptídeo estimulante específico de NF-κB é selecionado do grupo que consiste em vFLIP K13, K13-opt, um mutante NEMO, uma proteína de fusão NEMO, IKK1-S176E- S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, IKKα, IKKβ, Tcl-1, MyD88-L265, qualquer proteína de ativação de NF-κB ou fragmento de proteína, qualquer inibidor de um inibidor de via de NF-κB, qualquer homólogo ou variante do mesmo e qualquer combinação dos mesmos.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o ativador de NF-κB seletivo ou um polipeptídeo estimulante específico de NF-κB é expresso de uma maneira constitutiva ou induzível.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o ativador de NF-κB seletivo ou um polipeptídeo estimulante específico de NF-κB é controlado pós-tradução através do contato da célula T com um composto.

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52. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o ativador de NF-κB seletivo ou polipeptídeo estimulante específico de NF-κB é expresso como um construto de fusão com uma ou mais cópias de domínio FKBP.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a atividade do ativador de NF-κB seletivo ou um polipeptídeo estimulante específico de NF-κB é controlada no nível pós- tradução por administração de quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que induz à dimerização do domínio de FKBP.

54. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o composto é AP20187 ou rimiducid.

55. Método para produzir uma célula efetora imune que expressa receptor imune de ocorrência não natural, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução de pelo menos um vetor de acordo com a reivindicação 41, ou pelo menos um polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 29, em uma célula efetora ou em uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora que pode dar origem a uma célula efetora imune, sob condições tais que um receptor imune de ocorrência não natural seja expressado e a célula efetora imune compreenda (i) vida útil prolongada, (ii) proliferação de célula T melhorada e/ou (iii) apoptose reduzida em comparação com uma célula CAR-T que não tem um polipeptídeo estimulante específico de NFkB.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: a) fornecer uma população de células efetoras imunes; e b) remover células reguladoras T da população, assim fornecendo uma população de células esgotadas reguladoras T; em que as etapas a) e b) são realizadas antes da introdução do vetor ou polinucleotídeo recombinante que codifica o polipeptídeo

19 / 30 estimulante específico de CAR e/ou NFkB à população.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que as células reguladoras T são removidas da população de células com o uso de um anticorpo anti-CD25 ou um anticorpo anti-GITR.

58. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: a) fornecer uma população de células efetoras imunes; e b) enriquecer células positivas de glicoproteína P (gp-Pp ou Pgp; MDR1, ABCB1, CD243) da população, assim fornecendo uma população de células enriquecidas de glicoproteína P (gp-P ou Pgp; MDR1, ABCB1, CD243); em que as etapas a) e b) são realizadas antes ou após a introdução do vetor ou polinucleotídeo recombinante que codifica o polipeptídeo estimulante específico de CAR e/ou NFkB.

59. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que as células positivas de glicoproteína P são enriquecidas com o uso de qualquer um ou mais dos métodos selecionados a partir do grupo que consiste em: i) imunosseleção com o uso de um ou um coquetel de anticorpos específicos de glicoproteína P, ii) coloração com um ou mais corantes fluorescentes que são substratos de glicoproteína P, éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), adriamicina e actinomicina-D) sob condições nas quais a glicoproteína P é ativa como bomba e enriquecimento para células que mancham menos com o corante, iii) seleção de células que são resistentes a compostos fototóxicos que são substratos da glicoproteína P, como qualquer um ou mais de TH9402, cloridrato de éster metílico de ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3- imino-3H-xanten-9-il)-benzoico, cloridrato de éster etílico de ácido 2-(4,5-

20 / 30 dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzoico, cloridrato de éster octílico 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzoico, cloridrato de éster n-butílico de ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H- xanten-9-il)-benzoico, cloridrato de éster n-butílico de ácido 2-(6-etil amino- 3-etil imino-3H-xanten-9-il)-benzoico, ou derivados dos mesmos ou combinações dos mesmos, e iv) seleção de células que são resistentes a compostos citotóxicos que são substratos de glicoproteína P, como vincristina, vinblastina, taxol, paclitaxel, mitoxantrona, etoposídeo, adriamicina, daunorrubicina e actinomicina-D.

60. Método para gerar uma população de células manipuladas por RNA, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução de RNA ou RNAs transcritos in vitro ou RNA ou RNAs sintéticos em uma célula ou população de células, em que o RNA ou RNAs compreendem um polinucleotídeo ou polinucleotídeos recombinantes de acordo com a reivindicação 30.

61. Método para fornecer imunidade antidoença em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da célula efetora imune ou uma célula- tronco que pode dar origem a uma célula efetora imune de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, em que a célula é uma célula T autóloga ou uma célula T alogênica ou uma célula NKT autóloga ou uma célula NKT alogênica ou uma célula-tronco hematopoiética autóloga ou alogênica ou um iPSC autólogo ou alogênico que pode dar origem a uma célula efetora imune.

62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a célula T alogênica ou célula NKT alogênica ou célula- tronco hematopoiética ou iPSC não tem expressão ou tem baixa expressão de um TCR funcional ou um HLA funcional.

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63. Composição que compreende uma célula imune efetora ou uma célula-tronco que pode gerar células efetoras imunes que compreendem um receptor imune de ocorrência não natural e um ativador de NfkB seletivo, caracterizada pelo fato de que o receptor imune de ocorrência não natural compreende um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado à doença, em que o dito antígeno associado à doença é selecionado de um grupo que consiste em: CD5, CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (também denominado subconjunto CD2 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2- 3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα- Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor órfão de tipo tirosina-quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expressado em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina- 13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-llRa); antígeno de célula-tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor de folato alfa; Receptor tirosina-proteina quinase ERBB2 (Her2 / neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1); receptor de fator de crescimento epidérmico

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(EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade Proteassoma (Prosome, Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); Fucosil GM1; molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1- 4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o-acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR-1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro lA (XAGEl);

23 / 30 receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testítulo de melanoma (MAD-CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; prosteína; survivina; telomerase; antígeno 1 do tumor de carcinoma de próstata (PCT A-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil-glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY- TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de domínio de lectina de tipo C (CLEC12A);

24 / 30 antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGLL1), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276 / B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM- CSFR-alfa), TGFbetaR2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR-beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio folículo estimulante (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina crônica (CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), proteína KSHV-K8.1, proteína KSHV-gH, autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), auto anticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A.2)), P-glicoproteína, STEAP1, LIV1, NECTIN-4, CRIPTO, GPA33, BST1 / CD157, canal de cloreto de baixa condutância e antígeno reconhecido por anticorpo TNT.

64. Método para tratar ou prevenir uma doença associada à expressão de um antígeno associado à doença em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma célula efetora imune que compreende um receptor imune de ocorrência não natural e um ativador de NfkB seletivo, em que o receptor imune de ocorrência não natural compreende um domínio de ligação ao

25 / 30 antígeno que se liga a um antígeno associado à doença, em que o dito antígeno associado à doença é selecionado de um grupo que consiste em: CD5, CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (também denominado subconjunto CD2 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 de tipo lectina de tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante III de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFRviii); gangliosídeo G2 (GD2); gangliosídeo GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1- 1)Cer); maturação de célula B de membro da família de receptores de TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα-Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de próstata (PSMA); receptor órfão de tipo tirosina- quinase 1 (ROR1); Fms como tirosina quinase de tipo Fms 3 (FLT3); Glicoproteína 72 associada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; um epítopo CD43 glicosilado expressado em leucemia ou linfoma agudo, mas não em progenitores hematopoiéticos, um epítopo CD43 glicosilado expresso em cânceres não hematopoiéticos, antígeno carcinoembrionário (CEA); Molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidade alfa-2 de receptor de interleucina-13 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; Receptor alfa da interleucina 11 (IL-llRa); antígeno de célula- tronco de próstata (PSCA); Protease serina 21 (testina ou PRSS21); receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno Lewis (Y); CD24; Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR- beta); Antígeno embrionário-4 específico de estágio (SSEA-4); CD20; Receptor de folato alfa; Receptor tirosina-proteina quinase ERBB2 (Her2 / neu); Mucina 1 associada à superfície celular (MUC1); receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão de célula neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (receptor de IGF-1), anidrase carbônica IX (CAlX); Subunidade Proteassoma (Prosome,

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Macropain), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste na região de grupamento de ponto de interrupção (BCR) e homólogo 1 de oncogene viral de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor de efrina tipo A 2 (EphA2); Fucosil GM1; molécula de adesão sialil de Lewis (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o- acetil-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); relacionado ao marcador endotelial tumoral 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante de tireoide (TSHR); grupo 5 de classe C de receptor acoplado à proteína G, membro D (GPRC5D); quadro de leitura aberta de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásica (ALK); Ácido polissiálico; 1 específico de placenta (PLAC1); porção hexassacarídica de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR- 1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor 1 celular de vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); Receptor 20 acoplado à proteína G (GPR20); complexo de antígeno de linfócito 6, lócus K9 (LY6K); Receptor olfativo 51E2 (OR51E2); Proteína de quadro de leitura alternada de TCR gama (TARP); Proteína tumoral de Wilms (WT1); Antígeno 1 de câncer/testículo (NY-ESO-1); Antígeno 2 de câncer/testículo (LAGE-1a); Antígeno 1 associado ao melanoma (MAGE-A1); Gene 6 da variante de translocação de ETS, localizado no cromossomo 12p (ETV6- AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Família de Antígenos X, Membro lA (XAGEl); receptor 2 de superfície de célula de ligação à angiopoietina (Tie 2); antígeno 1 de câncer de testítulo de melanoma (MAD-CT-1); antígeno 2 de câncer de testículo de melanoma (MAD-CT-2); Antígeno 1 relacionado a Fos; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; prosteína; survivina; telomerase; antígeno 1 do tumor de carcinoma de próstata (PCT A-1 ou

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Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MelanA ou MARTI); Mutante de sarcoma de rato (Ras); transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de interrupção de translocação de sarcoma; inibidor de apoptose de melanoma (ML-IAP); ERG (protease transmembranar, gene de fusão ETS serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil- glucosaminil-transferase V (NA17); proteína de caixa pareada Pax-3 (PAX3); Receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neuroblastoma de oncogene viral de mielocitomatose aviária v-myc (MYCN); Membro C de Família de Homólogo Ras (RhoC); Proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP- 2); Citocromo P450 lB 1 (CYPlB 1); Tipo (BORIS ou Brother of the Regulator of Imprinted Sites) de Fator de Ligação ao CCCTC (Proteína do Dedo de Zinco), antígeno de carcinoma de células escamosas reconhecido pelas células T 3 (SART3); Proteína de caixa emparelhada Pax-5 (PAX5); proteína sp32 de ligação à proacrosina (OY-TESl); proteína tirosina quinase específica de linfócitos (LCK); Uma proteína âncora de quinase 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, X ponto de interrupção 2 (SSX2); Receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE-1); 1 ubíquo renal (RU1); ubíquo renal 2 (RU2); legumaína; vírus do papiloma humano E6 (HPV E6); vírus do papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; Receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos (LAIRl); Fragmento Fc de receptor de IgA (FCAR ou CD89); Membro 2 de subfamília A de receptor de tipo imunoglobulina de leucócito (LILRA2); Membro f de família de tipo molécula CD300 (CD300LF); Membro A de família 12 de domínio de lectina de tipo C (CLEC12A); antígeno 2 de células estromais de medula óssea (BST2); Módulo de tipo EGF que contém receptor de hormônio de tipo mucina 2 (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); Receptor Fc de tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo 1 de tipo lâmbda da imunoglobulina (IGLL1), MPL, Biotina, etiqueta de epítopo c-MYC, CD34,

28 / 30 LAMP1 TROP2, GFRalfa4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Antígeno Sialila de Lewis); Fucosil-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276 / B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK TCRgama-delta, NKG2D, CD32 (FCGR2A), CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1 CSF2RA (GM-CSFR-alfa), TGFbetaR2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, cadeia TCR-beta1, cadeia TCR-beta2, cadeia gama TCR, cadeia TCR-delta, FITC, receptor de hormônio leutenizante (LHR), receptor de hormônio estimulante de folículo (FSHR), receptor de hormônio folículo estimulante (FSHR), receptor de hormônio gonadotrofina crônica (CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, glicoproteína de envelope de HIV1, HTLV1- Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, hemaglutinina de influenza A (HA), GAD, PDL1, guanilil ciclase C (GCC), proteína KSHV-K8.1, proteína KSHV-gH, autoanticorpo para desmogleína 3 (Dsg3), auto anticorpo para desmogleína 1 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, Fator de Tecido 1 (TF1), AFP, GPRC5D, claudina18.2 (CLD18A2 ou CLDN18A.2)), P-glicoproteína, STEAP1, LIV1, NECTIN-4, CRIPTO, GPA33, BST1 / CD157, canal de cloreto de baixa condutância e antígeno reconhecido por anticorpo TNT, assim tratando o indivíduo ou prevenindo uma doença no indivíduo.

65. Uso ou método de acordo com a reivindicação 63 ou 64, caracterizado pelo fato de que a doença associada à expressão do antígeno associado à doença é selecionada a partir do grupo que consiste em uma doença proliferativa, uma afecção pré-cancerosa, um câncer e uma indicação relacionada a não câncer associada à expressão do antígeno associado à doença.

66. Uso ou método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer hematológico escolhido a

29 / 30 partir de uma ou mais entre leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemias agudas, leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia linfoide aguda de células B (B-ALL), leucemia linfoide aguda de células T (T-ALL), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia prolinocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de efusão primária, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequenas ou grandes, afecções linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma não-Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de célula dendrítica plasmacitoide, macroglobulinemia de Waldenstrom ou pré-leucemia.

67. Uso ou método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de cólon, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer de fígado, carcinoma de células não pequenas do pulmão, câncer de intestino delgado, câncer de esôfago, melanoma, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de testículo, câncer de útero, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, linfoma não- Hodgkin, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer do glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasia do sistema nervoso central (CNS), linfoma primário do CNS, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma de tronco encefálico, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer de células de Merkel, câncer

30 / 30 epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de células T, cânceres induzidas por ambiente, combinações dos denominados cânceres e lesões metastáticas dos ditos cânceres.

68. Uso ou método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a doença está associada à infecção por um vírus, incluindo, mas sem limitação, HIV1, HIV2, HTLV1, vírus Epstein Barr (EBV), citomegalovírus (CMV), adenovírus, vírus adenoassociado, vírus BK, Herpesvírus Humano 6, Herpesvírus Humano 8, vírus da gripe, vírus da parainfluenza, vírus da gripe aviária, coronavírus MERS e SARS, vírus da febre hemorrágica da República da Crimeia no Congo, rinovírus, enterovírus, vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus do Ebola, vírus de Marburg, vírus da febre de Lassa, vírus zika, RSV, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus de rinoceronte, vírus da varicela, vírus do herpes simplex 1 e 2, vírus da varicela zoster, HIV-1, HTLV1, vírus da hepatite, enterovírus, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus Nipah e da febre do vale Rift, vírus da encefalite japonesa, poliomavírus de células Merkel ou está associado à infecção por mycobacterium tuberculosis, espécies atípicas de micobactérias, Pneumocystis jirovecii, toxoplasmose, rickettsia, nocardia, aspergillus, mucor ou candida.

69. Uso ou método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a doença é uma doença imune ou degenerativa, incluindo, mas sem limitação, diabetes mellitus, esclerose múltipla, artrite reumatoide, pênfigo vulgar, espondilite anquilosante, tireoidite de Hoshimoto, SLE, sarcoidose, esclerodermia, doença mista do tecido conjuntivo, doença do enxerto versus hospedeiro ou doença de Alzheimer.