CN118215498A - 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的结合蛋白 - Google Patents

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的结合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN118215498A
CN118215498A CN202280074706.5A CN202280074706A CN118215498A CN 118215498 A CN118215498 A CN 118215498A CN 202280074706 A CN202280074706 A CN 202280074706A CN 118215498 A CN118215498 A CN 118215498A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
amino acid
seq
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280074706.5A
Other languages
English (en)
Inventor
J·奥尔维斯
M·阿里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitetet i Oslo
Oslo Universitetssykehus hf
Original Assignee
Universitetet i Oslo
Oslo Universitetssykehus hf
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitetet i Oslo, Oslo Universitetssykehus hf filed Critical Universitetet i Oslo
Publication of CN118215498A publication Critical patent/CN118215498A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/464488—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供能够特异性结合以下的结合蛋白：呈递具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列ALYDKTKRI的肽(肽T1)的或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列ALYDKTKRIFL的肽(肽T3)的人白细胞抗原(HLA)复合物A2型，其来源于人末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。该结合蛋白包括抗原结合单元，该抗原结合单元包括α链可变结构域和β链可变结构域，各自包括源自识别肽的TCR的3个互补决定区(CDR)。结合蛋白及表达它们的细胞可用于癌症疗法。

Description

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的结合蛋白
技术领域
本公开涉及基于T细胞受体(TCR)的序列的结合蛋白。结合蛋白能识别包括人白细胞抗原A2(HLA-A2或HLA-A*02)的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类中的人末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的片段。本文公开的结合蛋白及其表达细胞可用于癌症疗法。
背景技术
基于表达嵌合抗原受体(CAR)的自体淋巴细胞的癌症治疗已广为人知。在过去十年中，已经公开了靶向肿瘤相关抗原的各种CAR。然而，传统CAR的主要缺点是其只能靶向细胞表面蛋白的能力。
急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种急需新疗法的血癌。在B细胞ALL(B-ALL)中，以B细胞特异性抗原CD19为靶点的CART细胞疗法经常诱导完全缓解。然而，大约40-50％的B-ALL患者在经抗CD19 CAR-T细胞疗法后复发(Maude et al.,New England Journal ofMedicine 378:439-448,2018；S.A.Grupp et al.,Blood 132,895-895(2018))，最常见的原因是癌症导致CD19的缺失(Shah&Fry,Nature Reviews Clinical Oncology 16:372-385,2019)。此外，由于CD19不是肿瘤特异性抗原，正常和恶性B细胞都会被抗CD19 CAR-T细胞疗法杀死。虽然B细胞缺乏具有相对较好的耐受性，但它需要终生使用免疫球蛋白替代物，并且持续使用CD19特异性CAR-T细胞的长期效果尚不清楚。因此，既能保护正常的B淋巴细胞生成，又不产生与同种异体造血干细胞移植相关的毒性的治疗将是期望的。
尽管有多种T细胞特异性标记物，但没有一种CAR疗法被批准用于T细胞ALL(T-ALL)，该疗法有效靶向所有T-ALL亚型的恶性细胞，并同时保留成熟、健康的T细胞。这一点至关重要，因为耗尽健康的T细胞产生令人望而却步的毒性，或者甚至与生命不相容。此外，在T-ALL中尚未发现肿瘤特异性靶标，并且临床试验也未证明免疫疗法有效。在化疗失败的情况下(15-20％)，T-ALL预后不佳，总存活率低于25％(Sellar et al.,British Journalof Haematology 181:515-522,2018)。
本发明人已经鉴定细胞内酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是B-ALL和T-ALL免疫疗法的靶标。TdT的功能是在T细胞受体(TCR)和B细胞受体基因的重组期间向V-D-J连接添加N-核苷酸(Komori et al.,Science 261:1171-1175,1993)，并且因此TdT的表达受限于B细胞系和T细胞系。TdT在80-94％的ALL和B细胞和T细胞来源的淋巴细胞淋巴瘤中过表达(Drexler et al.,Acta Haematologia 75:12-17,1986)，但在造血干细胞中不表达(Pellin et al.,Nature Communications 10:2395,2019)，并且因此骨髓组织生成(包括红细胞生成和血小板生成)应不受TdT靶向的影响，并且由于TdT在分化期间下调(Li etal.,Journal of Experimental Medicine 178:951-960,1993)，应保留正常成熟的B和T细胞。本发明人已经生成了可识别TdT来源肽的TCR，其可用于ALL疗法。TdT先前已被鉴定为癌症免疫疗法的潜在靶标(US2017/0290897)，但目前靶向TdT的治疗法尚未知。
本文提供的TCR靶向ALL中的癌T细胞和B细胞，但只针对健康T细胞和B细胞的小亚群。因此，本文提供的TCR为治疗大多数T-ALL亚型提供了首创免疫疗法，并为B-ALL提供了一种改进的免疫疗法，这种疗法不会引起终生免疫损伤。
发明内容
本公开提供的结合蛋白能够与呈递SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15所示的TdT肽的人白细胞抗原复合物I类特异性结合。这种结合蛋白(或表达结合蛋白的细胞)可用于靶向表达TdT，特别是ALL的癌细胞。如实例中所表明，在生理条件下，所要求保护的结合蛋白对呈递SEQ ID NO:1所示的TdT肽或SEQ ID NO:15所示的TdT肽的HLA-A*02:01具有极好的特异性。值得注意的是，HLA-A*02:01在患有ALL的欧洲、中东或北非血统的大部分患者中表达。因此，提供了对于T-ALL和B-ALL的新型疗法，其可能对化疗耐药患者特别有益。
因此，在第一方面，本文提供了一种结合蛋白，所述结合蛋白能与呈递具有SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列ALYDKTKRIFL的肽的人白细胞抗原(HLA)复合物A2型特异性结合；
其中，所述蛋白包括含有α链可变结构域和β链可变结构域的抗原结合单元；
其中，所述α链可变结构域包括三个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，其分别包括SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列；以及
所述β链可变结构域包括三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，其分别包括SEQ ID NO:19、20和21所示的氨基酸序列。
在第二方面，本文提供了一种结合蛋白，该结合蛋白能与呈递具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列ALYDKTKRI的肽的人白细胞抗原(HLA)复合物A2型特异性结合的结合蛋白；
其中，所述蛋白包括含有α链可变结构域和β链可变结构域的抗原结合单元；
其中，所述α链可变结构域包括三个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，其分别包括SEQ ID NO:2、3和4所示的氨基酸序列；以及
所述β链可变结构域包括三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，其分别包括SEQ ID NO:5、6和7所示的氨基酸序列。
在第三方面，提供了编码本文所提供的结合蛋白的重组核酸分子。
在第四方面，提供了包括本文提供的重组核酸分子的载体。
在第五个方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括编码结合蛋白的第一链的第一重组核酸分子和编码结合蛋白的第二链的第二重组核酸分子，其中：
(i)所述第一链包括本公开的第一方面的α链可变结构域，以及所述第二链包括本公开的第一方面的β链可变结构域；或者
(ii)所述第一链包括本公开的第二方面的α链可变结构域，以及所述第二链包括本公开的第二个方面的β链可变结构域。
第六方面提供了免疫效应细胞，该免疫效应细胞包括本文提供的重组核酸分子、本文提供的载体或本文提供的试剂盒中包括的重组核酸分子对，以及在其细胞膜中表达本文提供的结合蛋白。
第七方面提供了药物组合物，包括本文提供的免疫效应细胞。
第八方面提供了本文所提供的免疫效应细胞或本文所提供的药物组合物，用于治疗的用途。
第九方面提供了本文提供的免疫效应细胞或本文提供的药物组合物，用于治疗癌症的用途，其中，所述癌症表达末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。
同样，还提供了治疗受试者的癌症的方法，其中，所述癌症表达末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，该方法包括向受试者给药本文提供的免疫效应细胞或本文提供的药物组合物。
还提供了本文所提供的免疫效应细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中，所述癌症表达末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。
根据本文公开内容所治疗的癌症可以特别是(但不限于)急性淋巴细胞白血病(ALL)，例如B细胞急性淋巴细胞性白血病(B-ALL)或T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)。
在第十方面，提供了生成对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)具有特异性的免疫效应细胞的方法，所述方法包括将本文提供的重组核酸分子、本文提供的载体或本文提供的试剂盒中包括的重组核酸分子对引入至免疫效应细胞中。
附图说明
图1：各种TCR构建体的示意图
图1A示出了包括α链和β链的全长TCR。这两条链都包括具有3个CDR的可变结构域(更浅色的矩形)、细胞外恒定结构域、跨膜结构域和短细胞质结构域。
图1B示出了最小结合单元，其包括具有3个CDR的α链可变结构域(更浅色的矩形)和具有3个CDR的β链可变结构域(更浅色的矩形)。
图1C示出了结合单元，其包括具有3个CDR的α链可变结构域(更浅色矩形)和具有3个CDR的β链可变结构域(更浅色矩形)，其中β链可变结构域经由肽接头与α链可变结构域相连(本文称为TCR-scFv)。
图1D示出了受体，其包括结合单元、细胞外恒定结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文称为嵌合TCR)。
图1E示出了截短TCR，其包括α链和β链，包括结合单元的受体、细胞外恒定结构域和两个半胱氨酸桥(本文称为可溶性TCR)。
图1F示出了包括来自图1E的结构的受体，其中链中之一还包括跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文称为TCR-CAR)。
图2-TdT反应性TCR仅限于HLA-A2
图2A示出了T1和T3细胞在与肽脉冲的T2淋巴母细胞共孵育后的活化。EC50＝半最大有效浓度。数据来自3个独立实验，其中每个圆圈代表独立实验中的3个技术重复的平均值。误差棒表示SD。
图2B示出在与来源于一个HLA-A2pos和一个HLA-A2neg供体的EBV-LCL共培养后CD8+T1和T3细胞上的CD137上调。将细胞系用指定浓度的肽-1(T1)或肽-3(T3)进行脉冲，或用编码全长TdT的mRNA进行电穿孔。数据点代表一次实验中的三个技术重复，代表进行的两次实验。
图2C示出了与具有指示的HLA-A2和TdT表达的各种细胞系共培养后T1和T3细胞的活化，该细胞系负载有或不负载TdT肽(2x10-7 M)。后缀+A2表示用HLA-A*02:01转导的细胞系。结果来自一次实验，代表不同T细胞供体进行的2或3次实验，数据点代表技术重复(2-3)，并且误差棒示出范围。
图3：TdT反应性TCR不示出脱靶反应性
图3A示出了T1细胞(顶部)和T3细胞(底部)与EBVL-CL共孵育的培养上清液中IFN-γ浓度的热图，该EBVL-CL用来自模拟表位文库的肽脉冲(肽浓度：2x10-7 M)。列/行交叉处表示特定位置上被替换的氨基酸，并且白色圆圈表示野生型肽中的氨基酸。阳性反应的IFN-γ浓度范围为500-31254pg/mL。每个条件一个重复。
图3B-C示出了T1(B)和T3(C)细胞在与负载指示肽的靶细胞共培养后产生的IFN-γ。包括9-聚体和11-聚体肽，它们包含TdT蛋白序列中野生型肽-1和肽-3上游或下游的氨基酸。另外，还包括含有肽-1和肽-3部分或全部的8至12个氨基酸长肽。每个条件一个重复。
图4：T1和T3细胞被TdTpos HLA-A2pos激活并有效杀死TdTpos HLA-A2pos
白血病细胞系
图4A示出了与T1和T3细胞共培养48h后的活TdTposHLA-A2pos NALM-6和BV173细胞(E:T比率为1:1)，用空白转导的T细胞处理后相应数量的百分比，通过流式细胞术定量。数据点代表进行3次实验中一次实验的技术重复。
图4B示出了BV173细胞与空白细胞、T1细胞和T3细胞共培养48h的流式细胞术图。插入数字显示活肿瘤细胞门控内的事件计数。
图5：在BV173和NALM-6动物模型中，T1和T3细胞在体外和体内有效杀死白血病细胞
图5A-B和D-E示出了携带白血病小鼠在用转导有1G4(对NY-ESO-1有反应)、T1或T3的人T细胞治疗前一天和治疗后21天(BV173，A-B)或14天(NALM-6，D-E)的生物发光成像。包括未经处理的小鼠作为对照组。
图5C和5F示出了携带白血病小鼠的存活分析，这些小鼠或是未经处理(n＝10(BV173)或n＝11(NALM-6))，或是经1G4(n＝7(BV173)或n＝9(NALM-6))、T1(n＝8(BV173))或T3(n＝9(BV173)或n＝11(NALM-6))细胞处理。
图5B和C以及图5E和F中示出的数据来自两个独立实验。图5B和E中的方框图示出了四分位数间距(第25至75个百分位)，中心棒表示中值，胡须型棒(whisker)表示范围。点代表单个小鼠的数据。P＝无显著性(ns)，**P<0.01，***P<0.0001，通过普通单向ANOVA计算，并对与图基(Tukey)后验的多重比较进行调整。存活分析(图5C和F)通过双侧对数秩(Mantel-Cox)检验进行，****P<0.0001。
图5G示出了与1G4处理或未处理的小鼠在牺牲时(第21天)相比，T3处理的小鼠在第60天(M1-M5)的骨髓肿瘤负荷的流式细胞术图。阳性白血病检测的阈值设定为GFP+细胞≥活细胞的0.01％。
图6：T1和T3细胞消耗原发性癌症细胞，同时保留成熟的B和T淋巴细胞以及非谱系定向的造血祖细胞
图6A示出了代表性的T分布随机近邻嵌入(t-SNE)图，示出了活的HLA-A2pos、TdTposB-ALL肿瘤细胞(CD19+CD10+事件，左小图)和T-ALL肿瘤细胞(CD5+CD7+CD99+和表面CD3-CD4-事件，右小图)、正常B细胞(CD19+CD10-)、正常T细胞(CD3+和CD8+或CD4+)和CD34+lin-祖细胞在与空白、T1或T3转导的T细胞共培养72h(E:T比率＝1:1)后，如通过流式细胞术定量。TCR转导的细胞作为CTV阳性事件被排除在分析之外。
图6B示出了患有HLA-A2pos、TdTpos B-ALL或T-ALL的12名患者的诊断样品，如6A所述进行测定。每个点代表与T1(绿色)或T3(紫色)细胞共培养后的活肿瘤细胞、正常B细胞或T细胞的数量，在用空白转导的T细胞处理的培养物中所占的相应数量的百分比。数据点代表3或4个技术重复，并且误差棒表示范围。所示数据来自一项实验，代表每种患者样品进行了至少两次实验。
图7：经T1或T3转导的患者来源的CD8+T细胞有效杀死自体B-ALL细胞
图7A示出了B-ALL患者的外周血诊断样品与T1、T3或空白转导的自体T细胞共培养72h后的t-SNE图。内嵌数字表示与空白细胞、T1细胞和T3细胞共培养后指定细胞群的绝对事件计数。
图7B示出了在进行基于流式细胞术的细胞毒性测定72h后对恶性细胞、正常B细胞、T细胞和CD34+lin-祖细胞的定量。数据点表示进行的2次代表性实验中的一次的技术复制(3-4)，并且误差棒示出范围。
图8：T3细胞能有效清除原发性B-ALL细胞，同时保留体内健康的造血作用
在图8A至8C中，未经处理的n＝5，DMF5处理的n＝8，T3处理的n＝8。该图示出了两个实验的汇总数据。
图8A示出了在移植有原代人B-ALL细胞的T3处理(上)和DMF5处理(下)的NSG小鼠骨髓(BM)中存活单个单核细胞(MNC)的代表性FACS图。
图8B示出了在基线处和T细胞输注后第11天，经人T细胞调节的BM中白血病细胞(hCD45+CD19+CD10+)的百分比。
图8C示出了存在于BM中的白血病细胞数量。
图8D示出了BM中MNC的数量。汇总来自两个独立实验的数据，并且以平均值±SEM的形式显示未处理小鼠、DMF5处理小鼠和T3处理小鼠的治疗后11天的最终分析。根据图8A所示的门控策略，用流式细胞术鉴定群。使用GraphPad Prism软件进行统计分析(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001),通过邓恩氏(Dunn)多重比较检验进行克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)的ANOVA。
具体实施方式
TdT的表达谱如上所述。如前所述，在正常造血作用期间，B和T细胞系两者都会短暂表达TdT，但成熟的B和T细胞以及CD34+造血干细胞则缺乏TdT表达。这允许靶向表达TdT的癌细胞，同时保留造血干细胞和成熟淋巴细胞。因此，靶向TdT的成功治疗将使患者拥有健康的B细胞和T细胞区室，并从而保护他们的适应性免疫应答。如上所述，TdT在大多数ALL中过表达。由于TdT定位于细胞内，因此传统的CAR无法利用抗体的靶向单元对其进行靶向。然而，本文提供的TCR和TCR来源的结合蛋白识别由MHC I类分子呈递时的TdT来源肽，并因此能够靶向表达TdT的细胞。
本文提供的结合蛋白来源于本文称为T1和T3 TCR的TCR。T1和T3 TCR两者都是αβTCR，即异二聚体，其包括α链和β链。αβTCR的一般结构在本领域是众所周知的，并且如图1A所示。结合蛋白可以以多种形式提供，包括经典的或"原始"的全长2链表面受体形式(例如αβ形式)，或具有单链抗原结合单元的形式，或作为可溶性分子等。
众所周知，α和β链的可变结构域各自包括三个互补决定区(CDR)，编号为CDR1、CDR2和CDR3(从N末端开始)。CDR直接与靶标表位/MHC复合物相互作用，并从而决定TCR的特异性，其中CDR3是决定TCR特异性的最重要CDR。CDR被框架序列分隔并侧翼为框架序列，框架序列形成了CDR的支架，使它们的空间排列适合靶标结合。
T3 TCR识别在由包括HLA-A2的I类MHC呈递时的具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列ALYDKTKRIFL的肽。SEQ ID NO:15与人TdT(UniProt条目P04053，SEQ ID NO:27)的氨基酸475-485相对应。T3 TCR的α链包括可变区，其中CDR1(可称为VαCDR1)具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列TSINN；VαCDR2具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列IRSNERE；以及VαCDR3具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列CATDAGAYSGGGADGLTF。T3 TCR的β链包括可变区，其中CDR1(可称为VβCDR1)具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列MNHEY；VβCDR2具有SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列SMNVEV；以及VβCDR3具有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列CASSLSSSYNEQFF。
T1 TCR识别由包括HLA-A2的I类MHC呈递时的具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列ALYDKTKRI的肽。SEQ ID NO:1对应于人TdT的氨基酸475-483。T1 TCR的α链包括可变区，其中VαCDR1具有氨基酸序列VSGLRG，在SEQ ID NO:2所示；VαCDR2具有氨基酸序列LYSAGEE，SEQ ID NO:3所示；以及VαCDR3具有氨基酸序列CAVQASSNSGYALNF，SEQ ID NO:4所示。T1TCR的β链包括可变区，其中VβCDR1具有氨基酸序列SQVTM，SEQ ID NO:5所示；VβCDR2具有氨基酸序列ANQGSEA，SEQ ID NO:6所示；以及VβCDR3具有氨基酸序列CSVEPGYADTQYF，SEQ IDNO:7所示。
因此，本公开的第一方面提供了如上述基于T3 TCR的结合蛋白。
T3 TCR的α链和β链具有分别包括SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的可变结构域。在特定实施方式中，基于T3 TCR的结合蛋白包括含有α链可变结构域的抗原结合单元，该α链可变结构域包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在另一实施方式中，基于T3 TCR的结合蛋白包括含有β链可变结构域的抗原结合单元，该β链可变结构域包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方式中，基于T3 TCR的结合蛋白包括含有α链可变结构域和β链可变结构域的抗原结合单元，该α链可变结构域包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；该β链可变结构域包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
当结合蛋白包括含有SEQ ID NO:22的变体(即与SEQ ID NO:22具有至少90％但小于100％序列同一性的氨基酸序列)的α链可变结构域时，VαCDR序列仍如上文所限定(即VαCDR1、VαCDR2和VαCDR3分别包括以下或分别由以下组成：SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列)。因此，任何序列修饰都是在可变结构域的框架区域内进行的。当结合蛋白包括含有SEQ ID NO:23的变体(即与SEQ ID NO:23具有至少90％但小于100％序列同一性的氨基酸序列)的β链可变结构域时，VβCDR序列仍如上文所限定(即VβCDR1、VβCDR2和VβCDR3分别包括以下或分别由以下组成：SEQ ID NO:19、20和21所示的氨基酸序列)。因此，任何序列修饰都是在可变结构域的框架区域内进行的。
本公开的第二方面提供了上述基于T1 TCR的结合蛋白。
T1 TCR的α链和β链具有分别包括SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的可变结构域。在特定实施方式中，基于T1 TCR的结合蛋白包括含有α链可变结构域的抗原结合单元，该α链可变结构域包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在另一实施方式中，基于T1 TCR的结合蛋白包括含有β链可变结构域的抗原结合单元，该β链可变结构域包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方式中，基于T1 TCR的结合蛋白包括含有α链可变结构域和β链可变结构域的抗原结合单元，该α链可变结构域包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；该β链可变结构域包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
当结合蛋白包括含有SEQ ID NO:8的变体(即与SEQ ID NO:8具有至少90％但小于100％序列同一性的氨基酸序列)的α链可变结构域时，VαCDR序列仍如上文所限定(即VαCDR1、VαCDR2和VαCDR3分别包括以下或分别由以下组成：SEQ ID NO:2、3和4所示的氨基酸序列)。因此，任何序列修饰都是在可变结构域的框架区域内进行的。当结合蛋白包括含有SEQ ID NO:9的变体(即与SEQ ID NO:9具有至少90％但小于100％序列同一性的氨基酸序列)的β链可变结构域时，VβCDR序列仍如上文所限定(即VβCDR1、VβCDR2和VβCDR3分别包括以下或分别由以下组成：SEQ ID NO:5、6和7所示的氨基酸序列)。因此，任何序列修饰都是在可变结构域的框架区域内进行的。
如本文限定的“结合蛋白”是结合(或识别)靶分子的蛋白。如上所述，本文提供的结合蛋白能够特异性地与包括来源自人TdT的肽的MHC-I分子结合。“特异性结合”意指结合蛋白与其特定分子伴侣(molecular partner)(来源自T3 TCR的结合蛋白的分子伴侣是呈递SEQ ID NO:15的TdT肽的HLA-A2分子；以及来源自T1 TCR的结合蛋白的分子伴侣是呈递SEQ ID NO:1的TdT肽的HLA-A2分子)特异性结合。与靶标的特异性结合可与脱靶或非特异性结合区分开来。例如，结合蛋白结合其分子伴侣的亲和力要高于其结合其他分子(或至少大多数其他分子)的亲和力。结合蛋白与靶标的结合可以通过本领域已知的任何合适方法进行测量，例如表面等离激元共振(SPR)。
特别是，结合蛋白结合其分子伴侣(如上限定)的亲和力要高于其结合MHC-肽复合物(包括来源自TdT以外蛋白的肽)的亲和力。结合蛋白与非同源MHC-肽复合物可能显示极少的结合或没有结合，特别是与包括源自TdT以外蛋白的肽的MHC-肽复合物的结合。本文提供的结合蛋白可在生理条件下，即在宿主动物体内，特别是人体内发现的条件下，特异性地与它们的分子伴侣结合。特别地，结合蛋白可在人肿瘤内发现的条件下与它们的分子伴侣特异性结合。
如上所述，T3 TCR特异性结合包括HLA-A2和SEQ ID NO:15的肽的MHC-I复合物，以及T1 TCR特性结合包括HLA-A2和SEQ ID NO:1的肽的MHC-I复合物。值得注意的是，尽管SEQID NO:1和SEQ ID NO:15的肽非常相似(如上所述，肽仅在SEQ ID NO:15的C末端处有两个氨基酸的延伸上不同)，如下面的实施例所示，T3和T1 TCR不显示出与它们各自的结合配偶体的交叉反应性。
如上所述，本文提供的结合蛋白包括含有α链可变结构域和β链可变结构域的抗原结合单元。如本文限定的“α链可变结构域”是来自TCR(特别是人TCR)的α链的可变结构域，或基于其的多肽。类似地，如本文限定的“β链可变结构域”是来自TCR(特别是人TCR)的β链的可变结构域，或基于其的多肽。基于TCR的α或β链的可变结构域的多肽包括例如可变结构域的变体，该可变结构域的变体包括相对于天然可变结构域进行的序列修饰。
本文所称的“抗原结合单元”只是由α链和β链可变结构域形成的结合蛋白的结构域，并结合靶MHC肽复合物。
因此，本公开的最小结合蛋白是包括α链可变结构域和β链可变结构域的抗原结合单元，如图1B所示。
α链可变结构域可以与β链可变结构域共价连接，例如通过肽接头，以形成抗原结合单元，如图1C和图1D所示。WO91/18019(Squibb&Sons,Dana Farber Cancer Institute)、WO96/18105(Harvard)和WO 2000/031239(Yeda R&D)中都公开了这种抗原结合单元和包括它们的蛋白。合适的肽接头可包括例如1至20个氨基酸，诸如1、2、3或4个氨基酸，5、10或15个氨基酸，或方便的1至20范围内的其他中间数。肽接头可以由任何一般方便的氨基酸残基诸如甘氨酸和/或丝氨酸形成。合适的接头的一种实例是Gly4Ser。可以使用这种接头的多聚体，诸如例如二聚体、三聚体、四聚体或五聚体，例如(Gly4Ser)2、(Gly4Ser)3、(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)5。肽接头可以将α链可变结构域的C末端与β链可变结构域的N末端连接，或者将α链可变结构域的N末端与β链可变结构域的C末端连接。
由通过多肽接头(如上所述)与β链可变结构域连接的α链可变结构域组成的结合蛋白在本文中被称为TCR-scFv(类似于源自抗体的可变结构域的标准scFv)。TCR-scFv是最小的可溶性TCR物质，并在图1C所示。在实施方式中，结合蛋白是TCR-scFv。下文将进一步讨论TCR-scFv的用途。
在另一实施方式中，本文提供的结合蛋白包括含有α链可变结构域的第一链；和含有β链可变结构域的第二链。也就是说，α链可变结构域和β链可变结构域可能位于单独的多肽链内(相互结合以形成结合蛋白)。因此，第一链和第二链对应于经典全长αβTCR的α和β链，但不一定包括全长α或β链中天然存在的所有结构域。在实施方式中，第一链和第二链可分别包括α链或β链的所有结构域，即可变结构域、恒定结构域、跨膜结构域和细胞质结构域(内结构域(endodomain))。在其他实施方式中，第一链和第二链可包括可变结构域和恒定结构域。换言之，第一链可以包括α链可变结构域和α链恒定结构域。第二链可以包括β链可变结构域和β链恒定结构域。在还有其他的实施方式中，链可进一步包括跨膜结构域，或者跨膜结构域和细胞质结构域。因此，第一链和第二链可分别对应于以下或可分别代表(或实际上可称为)以下：全长或截短的α链和β链。“全长”，意指链包括α或β链的所有结构域。换句话说，全长链包括可变结构域、恒定结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。虽然跨膜结构域和细胞质结构域可以适当地从α链或β链中获得或衍生，但它们可替代地从任何其他蛋白中获得或衍生。因此，全长的α或β链可以是天然的或者是合成的或修饰的蛋白。“截短”意指链可能缺少恒定结构域、跨膜结构域或细胞质结构域中的任何一个或多个的全部或部分。因此，在根据本文公开的全长或截短的α或β链中，虽然可变结构域和恒定结构域可以是TCRα或β链结构域，但跨膜结构域和细胞质结构域并不局限于从TCRα或β链中获得或衍生的那些结构域。本文中广义使用的术语“第一链”意指至少包含从α链获得或衍生的可变结构域的多肽链，以及本文中广义使用的术语"第二链"意指至少包含从β链获得或衍生的可变结构域的多肽链。因此，第一链可视为“α基链”，以及第二链可视为“β基链”。
在实施方式中，独立的多肽链仍然可以共价连接(例如通过半胱氨酸残基的侧链之间形成的一个或多个二硫键)。例如，已知天然αβTCR的细胞外恒定结构域形成链间二硫桥，据信这是为了稳定异二聚体。链间二硫桥如图1A所示，为连接恒定结构域(C)的实心垂直条。
因此，如上所述，第一链(即全长或截短的α链)和/或第二链(即全长或截短的β链)可包括细胞外恒定结构域。在不受理论约束的情况下，α链恒定结构域和β链恒定结构域之间的相互作用可以稳定抗原结合单元。在一种实施方式中，第一链包括细胞外α链恒定结构域(位于可变结构域的C末端，例如直接位于C末端，使得恒定结构域的N末端氨基酸与可变结构域中的C末端氨基酸通过肽键连接)。在另一实施方式中，第二链包括细胞外β链恒定结构域(位于可变结构域的C-末端，例如直接位于可变结构域的C-末端)。在实施方式中，第一链和第二链两者都包括细胞外恒定结构域。
可以使用任何合适的细胞外恒定结构域。恒定结构域可以是人的TCR恒定结构域，或来自其他动物的TCR恒定结构域，例如恒定结构域可以是鼠的恒定结构域。替代地，恒定结构域可以是合成的恒定结构域，或来自合成蛋白的恒定结构域。当第一链和第二链两者都包括恒定结构域时，两个恒定结构域可以来自同一物种或不同物种。人α链和β链类型1和2的细胞外恒定结构域序列分别在SEQ ID NOs:28-30中所示。在实施方式中，细胞外α链恒定结构域包括SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；和/或细胞外β链恒定结构域包括SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
鼠α链和β链类型1和2的细胞外恒定结构域序列分别在SEQ ID NO:31-33中所示。在特定实施方式中，细胞外α链恒定结构域包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；和/或细胞外β链恒定结构域包括SEQ IDNO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
还已知，可以通过插入或用半胱氨酸残基置换每条链上的合适的氨基酸残基来引入额外的半胱氨酸桥。图1E和1F示出了具有额外半胱氨酸桥的结合蛋白(描绘为连接恒定结构域(C)的实心垂直条)。额外的半胱氨酸残基应在这样的位置引入，使得在引入的残基之间形成二硫键导致形成功能复合物，其中可变区相对于彼此正确定位和定向，例如由Boulter,J.M.et al.(Protein Eng.Des.Sel.16(9):707-711,2003)公开的。
Cohen et al.(Cancer Research 67(8):3898-903,2007)和WO2019/166463中公开了人TCR链恒定区中用于引入半胱氨酸残基的已知合适位置。在SEQ ID NO:28的人TCRα链恒定区中，可以通过用半胱氨酸残基置换位置49处的苏氨酸残基来引入额外的半胱氨酸残基。通过这种Thr49Cys置换获得的修饰的人α链细胞外恒定结构域具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。在SEQ ID NO:29的人TCRβ链1型恒定区或SEQ ID NO:30的2型恒定区中，可以通过用半胱氨酸残基置换位置57处的丝氨酸残基来引入额外的半胱氨酸残基。通过这些Ser57Cys置换获得的修饰的人β链细胞外恒定结构域分别具有SEQ ID NO:35和36所示的氨基酸序列。因此，在实施方式中，第一链包括细胞外α链恒定结构域，该细胞外α链恒定结构域包括SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；以及第二链包括细胞外β链恒定结构域，该细胞外β链恒定结构域包括SEQ IDNO:35或36所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
如上文详述，SEQ ID NOs:34-36的细胞外恒定结构域已被修饰，以形成两个链间二硫键。因此，当本文所提供的结合蛋白包括这些序列中任一个的变体作为细胞外恒定结构域(即与SEQ ID NOs:34-36中任一个序列具有至少90％但小于100％序列同一性的氨基酸序列)时，可保留参与二硫键形成的半胱氨酸残基(即未被置换或缺失)。在SEQ ID NO:34的α链细胞外结构域中，参与二硫键形成的半胱氨酸残基是Cys49和Cys96。在SEQ ID NO:35和36的β链细胞外结构域中，参与二硫键形成的半胱氨酸残基是Cys57和Cys131。
在鼠TCR链细胞外恒定结构域中，与上述人TCR恒定结构域等同的位置适合引入额外的半胱氨酸残基。因此，在SEQ ID NO:31的鼠TCRα链恒定区中，可以通过用半胱氨酸残基置换位置49处的苏氨酸残基来引入额外的半胱氨酸残基。通过这种Thr49Cys置换获得的修饰的鼠α链细胞外恒定结构域具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在SEQ ID NO:32的鼠TCRβ链1型恒定区或SEQ ID NO:33的2型恒定区中，可以通过用半胱氨酸残基置换位置57处的丝氨酸残基来引入额外的半胱氨酸残基。通过这些Ser57Cys置换获得的修饰的鼠β链细胞外恒定结构域分别具有SEQ ID NO:37和11所示的氨基酸序列。因此，在特定的实施方式中，第一链包括细胞外α链恒定结构域，该细胞外α链恒定结构域包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；以及第二链包括细胞外β链恒定结构域，该细胞外β链恒定结构域包括SEQ ID NO:11或37所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
对于上述经修饰的人序列，在SEQ ID NO:10、11和37中任意一个的变体(即与SEQID NO:10、11或37中任意一个的氨基酸序列具有至少90％，但小于100％的序列同一性)中，可保留参与二硫键形成的半胱氨酸残基(即未被置换或缺失)。在SEQ ID NO:10的α链细胞外结构域中，参与二硫键形成的半胱氨酸残基是Cys49和Cys92。在SEQ ID NO:35和36的β链细胞外结构域中，参与二硫键形成的半胱氨酸残基是Cys57和Cys127。
在T1和T3 TCR中，α链包括含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的细胞外α链恒定结构域，以及β链包括含有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的细胞外β链恒定结构域。因此，在特定实施方式中，结合蛋白包括含有细胞外α链恒定结构域的第一链和含有细胞外β链恒定结构域的第二链；该细胞外α链恒定结构域包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；该细胞外β链恒定结构域包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
本文提供的包括第一链和第二链(其各自包括可变结构域和细胞外结构域)的结合蛋白可以是可溶性TCR(即不包埋在膜中)，如图1E所示，并且先前在Walseng et al.(PLoS ONE 10(4):e0119559,2015)和Walseng et al.(Scientific Reports 7:Article10713,2017)中公开。如本文使用的术语“可溶性TCR”意指包括独立的第一链和第二链但不与膜结合的TCR分子。换句话说，可溶性TCR不包括TM结构域或细胞质结构域。可溶性TCR尤其可以包括各自仅由细胞外结构域域组成的第一链和第二链。
第一链和第二链被连接是可溶性TCR的重要方面。如果它们没有被连接，链就会在溶液中扩散开来，并且TCR的功能就会很差，甚至根本无法发挥功能。链可以经共价或非共价连接。截短的α链和β链可以共价连接的一种方法是通过半胱氨酸残基之间的一个或多个二硫键，如上所述。可溶性TCR的截短的α链和β链可以连接的替代方法是通过通过非共价相互作用。在一种实施方式中，亮氨酸拉链用于以非共价方式连接链。在这个实施方式中，截短的α链和β链两者都在其细胞外恒定结构域的C末端处包括亮氨酸拉链结构域。亮氨酸拉链及其序列在该领域是众所周知的，并且在例如Busch&Sassone-Corsi(Trends inGenetics 6:36-40,1990)中进行了评述。共价和非共价相互作用的组合也可用于连接可溶性TCR的截短的α链和β链。
下文将进一步描述可溶性TCR(以及scFv-TCR，它们也是可溶性的，但不落入如本文使用的“可溶性TCR”的定义范围)的用途。可溶性TCR和scFv-TCR可以用亲和标签编码，其可在可溶性TCR或scFv-TCR合成后用于其纯化。在可溶性TCR的情况下，在实施方式中，仅产生具有亲和标签的一条链(即截短的α链或β链)。亲和标签可以位于截短的α链或β链的任一末端处，例如C末端处。亲和标签可以是技术人员已知的任何合适的标签，例如FLAG-标签、His-标签、HA-标签、Strep-标签、S-标签、Myc-标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)等。
接头和/或蛋白酶裂解位点可以位于结合蛋白序列和亲和标签之间。蛋白酶裂解位点的加入可以在纯化后从结合蛋白中去除亲和标签。适当的蛋白酶裂解位点是技术人员众所周知的，并且包括凝血酶、Xa因子、肠激酶、人鼻病毒(HRV)3C和烟草蚀纹病毒(TEV)裂解位点。
第一链和/或第二链可进一步包括跨膜结构域。在第一链或第二链中，跨膜结构域位于细胞外恒定结构域的C-末端。
可以使用任何合适的跨膜结构域。在特定的实施方式中，跨膜结构域是TCR链的跨膜结构域。也就是说，当第一链包括跨膜结构域时，它可以是TCRα链的跨膜结构；并且当第二链包括跨膜结构域时，它可以是TCRβ链的跨膜结构域。在一种实施方式中，跨膜结构域是人TCR链的跨膜结构域。在另一实施方式中，跨膜结构域是鼠TCR链的跨膜结构域。在一种实施方式中，当第一链和第二链两者都包括TCR链跨膜结构域时，TCR跨膜结构域两者都来自同一物种。
人TCRα链跨膜结构域具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，并且因此在一种实施方式中，第一链包括含有以下的跨膜结构域：SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。鼠α链跨膜结构域具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，并且因此在另一实施方式中，第一链包括含有以下的跨膜结构域：SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
人和鼠TCRβ链1型和2型跨膜结构域都具有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。因此，在特定的实施方式中，第二链包括含有以下的跨膜结构域：SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施例中公开的T1和T3 TCR两者均具有带有SEQ ID NO:44的跨膜结构域的α链和带有SEQ ID NO:39的跨膜结构域的β链。因此，在特定的实施方式中，第一链和第二链两者都包括跨膜结构域，并且结合蛋白的第一链的跨膜结构域包括SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；并且结合蛋白的第二链的跨膜结构域包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
替代地，并且如下文所另外讨论的，跨膜结构域可以基于任何其他跨膜蛋白的跨膜结构域或衍生自任何其他跨膜蛋白的跨膜结构域。通常，它可以是以下或者可以来源于以下：来自CD8α、CD28、CD4、CD3ζ、CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域，例如来自这些蛋白中任何一种的人版本。在一种实施方式中，跨膜结构域可以是以下或可以来源于以下：来自CD8α、CD28、CD4或CD3ζ的跨膜结构域，例如来自人CD28、CD4或CD3ζ。
在一种实施方式中，跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域，其具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列，即跨膜结构域可包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
第一链和/或第二链可进一步包括细胞质结构域。如本领域所知，在天然TCR中，α链和β链包括位于C末端处的短细胞质结构域。可以使用任何合适的细胞质结构域。在一种实施方式中，细胞质结构域是TCR链的细胞质结构域。也就是说，当第一链是包括细胞质结构域的α链时，它可能是TCRα链的细胞质结构域；并且当第二条链是包括细胞质结构域的β链时，它可能是TCRβ链的细胞质结构域。
在一种实施方式中，细胞质结构域是人TCR链的细胞质结构域。在另一实施方式中，细胞质结构域是鼠TCR链的细胞质结构域。当第一链和第二链两者都包括TCR链细胞质结构域时，TCR细胞质结构域两者可能都来自同一物种。
人和鼠TCRα链细胞质结构域具有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，并且因此在一种实施方式中，第一链是α链，其包括含有以下的细胞质结构域：SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或者与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。人TCRβ链1型细胞质结构域具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，以及人TCRβ链2型细胞质结构域具有SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。因此，在一种实施方式中，第二链是β链，其包括含有以下的细胞质结构域：SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
鼠TCRβ链1型细胞质结构域具有SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，以及鼠TCRβ链2型细胞质结构域具有SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。因此，在一种实施方式中，第二链是β链，其包括含有以下的细胞质结构域：SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
T1和T3 TCR两者都具有带有SEQ ID NO:41的细胞质结构域的α链和带有SEQ IDNO:47的细胞质结构域的β链。在特定实施方式中，第一链和第二链两者均包括细胞质结构域(即它们是全长α链和β链)，并且α链的细胞质结构域包括SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且β链的细胞质结构域包括SEQ IDNO:47所示的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在另一实施方式中，第一和/或第二链(通常是第一链或第二链)包括含有细胞内信号传导结构域的细胞质结构域。本文的“细胞内信号传导结构域”是指结合蛋白链的结构域，其参与将受体与靶抗原-MHC复合物有效结合的信息传导至表达受体的免疫效应细胞的内部，以激发效应细胞的功能，例如活化、细胞因子产生、增殖和/或细胞毒性活性，包括向结合的靶细胞释放细胞毒性因子，或通过受体与其靶标结合引发的其他细胞应答。
可使用的细胞内信号传导结构域的实例包括来源于CD3ζ、FcRy、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ或FcRγ，例如人CD3ζ或FcRγ。在一种实施方式中，细胞内信号传导结构域是包括以下的人CD3ζ结构域：SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:48具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
此外，为了允许或增强表达受体的免疫效应细胞的完全激活，细胞质结构域可进一步包括共刺激结构域(除细胞内信号传导结构域外)。因此，细胞内信号传导结构域可以引发抗原依赖性初级活化(即可以是一级细胞质信号传导序列)，并且共刺激结构域可以以不依赖抗原的方式提供二级或共刺激信号(即可以是二级细胞质信号传导序列)。
术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指细胞质结构域中包括共刺激分子的细胞内结构域的部分。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，其在与抗原结合时提供免疫效应细胞(例如T细胞)有效激活和功能所需的第二信号。本文可使用的共刺激结构域的实例包括CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKD2C和B7-H2的细胞内结构域，例如其人版本。共刺激结构域可以单独使用或组合使用(即可以包括一个或多个共刺激结构域)。包括一个或多个共刺激信号传导结构域可增强表达本文所提供受体的免疫效应细胞的功效和扩增。在实施方式中，共刺激结构域可以是以下或可以包括以下：具有SEQ ID NO.49的氨基酸序列的人CD28的细胞内结构域，或与SEQ ID NO:49具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
本文中的实例展示了包括α链和β链的全长T1和T3 TCR的功能(术语“全长TCR”在本文中可与术语“TCR”互换)。已经证明，经修饰以表达这些TCR的T细胞，其靶向HLA-A*02:01背景下来自淋巴特异性酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的肽，在体外和弥散性ALL的小鼠模型中特异性消除T和B细胞来源的原发性急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞。相比之下，正常的成熟T细胞和B细胞库以及缺乏TdT表达的非谱系定向造血祖细胞则不存在消除。实施例中描述的广泛TCR反应图谱没有鉴定出与人蛋白质组中任何天然存在的肽有交叉反应，这表明肽的特异性非常高。
如上所述和实施例中所述，T1和T3 TCR包括人TCR可变结构域和鼠TCR细胞外恒定结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。因此，在特定的实施方式中，本文提供的结合蛋白是TCR，具有如图1A所示的结构。在该实施方式中，TCR因此包括α链和β链，α链包括TCRα链可变结构域、TCRα链细胞外恒定结构域、TCRα链跨膜结构域和TCRα链式细胞质结构域；以及β链包括TCRβ链可变结构域、TCRβ链细胞外恒定结构域、TCRβ链跨膜结构域和TCRβ链细胞质结构域。
各种结构域可以具有上述序列。特别地，TCR可以包括α链和β链，它们各自包括人可变结构域和鼠细胞外恒定结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。
在特定的实施方式中，TCR是T3 TCR，包括：
(i)α链，其从N末端至C末端包括：可变结构域，其含有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；细胞外恒定结构域，其含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；跨膜结构域，其含有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；以及细胞质结构域，其含有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)β链，从N末端至C末端包括：可变结构域，其含有SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；细胞外恒定结构域，其含有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；跨膜结构域，其含有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及细胞质结构域，其含有SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
全长成熟T3 TCRα链具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。因此，在一种实施方式中，结合蛋白包括含有以下的α链：SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。全长成熟T3 TCRβ链具有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。因此，在一种实施方式中，结合蛋白包括含有以下的β链：SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在特定的实施方式中，本文提供的TCR是T3 TCR，包括
(i)α链，其含有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)β链，其含有SEQ ID NO:25所示氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一特定的实施方式中，TCR是T1 TCR，包括
(i)α链，从N末端至C末端包括：可变结构域，其含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；细胞外恒定结构域，其含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；跨膜结构域，其含有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；以及细胞质结构域，其含有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)β链，从N末端至C末端包括：可变结构域，其含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；细胞外恒定结构域，其含有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；跨膜结构域，其含有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及细胞质结构域，其含有SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
全长成熟T1 TCRα链具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。因此，在一种实施方式中，结合蛋白包括含有以下的α链：括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。全长成熟T1 TCRβ链具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。因此，在一种实施方式中，结合蛋白包括含有以下的β链：SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在特定的实施方式中，本文提供的TCR是T1 TCR，包括
(i)α链，其含有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)β链，其含有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
如上所述，本文提供的结合蛋白的细胞质结构域可以包括细胞内信号传导结构域(以及可选的共刺激结构域)，而不是TCR细胞质结构域。这种替代性细胞质结构域可用于嵌合受体。
示例性嵌合受体是嵌合TCR，其基本结构如图1D所示。嵌合TCR先前已在WO 2000/031239和WO 2019/166463中描述过。嵌合TCR包括(从N末端至C末端)含有以下的单个多肽链：单链TCR可变区(scFv TCR)、细胞外恒定结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
在本文提供的嵌合TCR中，scFv-TCR如上所述。细胞外恒定结构域可以是α链的恒定结构域或β链的恒定结构域。可以使用TCRα链或β链的任何合适的细胞外恒定结构域，例如如上所述的TCRα链或β链的人或鼠细胞外恒定结构域。嵌合TCR仅包括TCR链的单个细胞外恒定结构域。本文提供的嵌合TCR可包括任何合适的跨膜结构域，诸如上述跨膜结构域。如上所述，嵌合TCR的跨膜结构域可以是TCR链的跨膜结构域，或者可以是非TCR蛋白的跨膜结构域。细胞质结构域包括细胞内信号传导结构域，如上所述。如上所述，细胞质结构域可进一步包括共刺激结构域。
在嵌合TCR的上下文中，跨膜结构域和细胞质结构域共同构成“信号传导尾”。在包括细胞内信号传导结构域和共刺激结构域两者的信号传导尾中，细胞内信号传导结构域和共同刺激结构域可以以任何顺序串联连接到跨膜结构域的C末端。在一种实施方式中，信号传导尾按N末端至C末端的顺序包括CD28跨膜结构域、CD28细胞内结构域和CD3ζ细胞内结构域。
另一示例性嵌合受体是TCR-CAR，其基本结构如图1F所示。在Walseng等人，2017(见上文)中首次描述了TCR-CAR。TCR-CAR基于与标准CAR相同的原理，但标准CAR的scFv被可溶性TCR置换(如上所述)。这提供了具有CAR的功能潜力的构建体，但具有TCR的底物广度(即它们可以针对细胞蛋白降解产生的任何肽)。
因此，TCR-CAR包括如上所述的可溶性TCR，但可溶性TCR构建体不是可溶性蛋白而是其一条链包括信号传导尾，如上文在嵌合TCR的上下文中所述。信号传导尾可能位于第一条(即截短的α链)链或第二条(即截断的β链)链的C末端(细胞外恒定结构域的C末端)。
本文提供的可溶性结合蛋白(即缺乏跨膜结构域的结合蛋白，例如上文所述的TCR-scFvs和可溶性TCR)可使用蛋白表达系统合成，诸如使用原核(例如细菌)细胞或真核(例如酵母、真菌、昆虫或哺乳动物)细胞的细胞表达系统。替代的蛋白表达系统是无细胞的体外表达系统，其中编码结合蛋白的DNA序列在体外被转录成mRNA，并且mRNA被翻译成蛋白。无细胞表达系统试剂盒供应广泛，并可从例如Thermo Fisher Scientific(USA)购买。替代地，也可以在非生物系统例如通过液相或固相合成来化学合成结合蛋白。
合成后，使用本领域已知的技术分离和纯化特异性结合分子。例如，可以使用宿主真核细胞生产结合蛋白。结合蛋白的表达可使其包括引导其输出的前导序列(如下文所述)。在这种情况下，结合蛋白从生产细胞输出到培养基中。然后例如通过离心将培养基与生产细胞分离。然后可以例如通过亲和层析来纯化结合蛋白(如果结合蛋白包括上文所述的亲和标签)。如果标签与成熟的结合蛋白之间存在蛋白酶裂解位点，则可在纯化结合蛋白后使用适当的蛋白酶裂解标签。
本文提供的可溶性结合蛋白(即缺乏跨膜结构域的结合蛋白，例如TCR-scFv和可溶性TCR)可与治疗剂或诊断剂或者包括或包含治疗剂或诊断剂的负载体连接或缀合。治疗剂是用于疗法的药剂。所谓疗法，意指治疗或预防疾病。治疗剂可以是用于治疗赘生性病症，特别是癌症的药剂。
治疗剂可以是药物分子，例如杀死靶细胞的毒素。合适的毒素是指单独使用时无法进入、杀死或以其他方式破坏人细胞，但通过经由缀合分子被人细胞吸收时能够发挥其毒性作用的毒素。因此，这种毒素只能被携带毒素的可溶性结合蛋白(诸如携带毒素的可溶性TCR)结合的细胞吸收，并对其产生靶向效应。
合适的毒素包括缺乏靶向结构域的肽毒素。例如，它可能是缺乏靶向结构域的肽毒素，或可能是相对于其原生形式进行了修饰以去除其靶向结构域的肽毒素。这类毒素的实例包括皂草毒蛋白和多花白树毒蛋白，它们是与例如蓖麻毒蛋白相同科的核糖体失活蛋白(RIP)，但其无法穿过细胞的质膜。类似地，可以使用病原体的细胞毒素的酶促结构域(即催化结构域)，诸如细菌细胞毒素的酶促结构域，例如以下的酶促结构域：白喉毒素、假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素A或梭菌属(Clostridial)细胞毒素，例如索氏梭菌(Clostridium sordellii)的TcsL。
可溶性结合蛋白可以作为融合蛋白编码，毒素位于其C-末端(在可溶性TCR的情况下，毒素可以位于截短的α链或β链的C-末端)处。替代地，可使用本领域已知的任何合适方法(例如使用生物素/链霉亲和素系统)将毒素与可溶性结合蛋白缀合。
治疗剂可以是任何其他有用的治疗剂，例如化疗剂或任何其他抗癌剂，或抗病毒剂等，视情况而定。
诊断剂是用于诊断目的的药剂。例如，这种药剂可以是示踪剂或标记物，即可以被检测到的药剂，以便跟踪其在人体内的经过。示踪剂或标记物可通过扫描(例如PET扫描或CT扫描)检测到。许多示踪剂和标记物(包括放射性标记物)都是本领域已知的。可以使用任何合适的示踪剂或标记物，包括常见的放射性同位素11C、13N、15O、18F、99Tc，和123I以及125I。使用任何合适的标记基团，诸如本领域已知的例如放射性标记的生物素可以将诊断剂与可溶性结合蛋白(例如可溶性TCR)缀合。
与治疗剂缀合的可溶性结合蛋白(例如可溶性TCR)可用于疗法。与诊断剂缀合的可溶性TCR或包括诊断剂的负载体可用于体内诊断方法。
本文提供的不溶性结合蛋白(即包括跨膜结构域的结合蛋白，例如TCR等)是在细胞表达结合蛋白的情况下提供的。这种细胞尤其可以是免疫效应细胞，如下所述，在这种细胞中可以实现结合蛋白的功能性表达。
本文还提供了编码本文提供的结合蛋白和/或抗原结合单元的重组核酸分子。本文提供的核酸分子可以是分离的核酸分子，并且可以包括DNA或RNA或者DNA或RNA的化学衍生物。术语“核酸分子”特别地包括DNA和RNA的单链和双链形式。核酸(例如DNA或RNA)可以是环状或线状的。“重组”核酸分子是利用重组技术例如分子克隆合成的核酸分子。
本文提供的重组核酸分子编码本文提供的结合蛋白。如上所述，结合蛋白可包括两条多肽链(特别是第一链(即全长或截短的α链)和第二链(即全长或截短的β链))。编码包括两条多肽链的结合蛋白的重组核酸分子编码两条多肽链(即第一链和第二链都由同一个重组核酸分子编码)两者。在这种情况下，两条链可以作为两个独立的基因进行编码，每个基因都由自己的启动子控制，使得两条链分别表达。替代地，如下文另外讨论，这两条链可以由单个基因编码在单个多肽内。
在本文的一种特定实施方式中，重组核酸分子包括cDNA分子。特别地，结合蛋白或其链可由cDNA编码。如本文使用的“cDNA”意指真正的且原始意义上的cDNA(即通过逆转录mRNA合成的DNA)、从原始cDNA扩增而来的DNA以及等同于cDNA的DNA。与cDNA相当的DNA是指编码本文所提供的结合蛋白(或其第一链或第二链)的DNA，并且它缺乏内含子，使得其类似于通过逆转录mRNA获得的编码蛋白的序列。在本文一种特定的实施方式中，如本文提供的编码结合蛋白的核酸分子是经过密码子优化的，特别是结合蛋白可以由经过密码子优化的cDNA序列编码。
构建如本文所限定的核苷酸序列的方法是本领域众所周知的，并且包括例如传统的聚合酶链反应(PCR)克隆技术。
核酸分子的分离方法也是本领域众所周知的。例如，可以使用合适的试剂盒分离DNA。可根据制造商的说明使用Miniprep或Maxiprep试剂盒来从细菌中分离质粒DNA。此类试剂盒可从例如Qiagen(德国)获得。基因组DNA可根据制造商的说明使用例如QIAamp DNAMini试剂盒(Qiagen)或DNeasy试剂盒(Qiagen)从真核或原核细胞中提取。替代地，也可以使用传统的苯酚-氯仿提取方法从目的细胞中分离DNA。可以使用试剂盒(例如RNeasy Mini试剂盒，Qiagen)或通过苯酚-氯仿提取与DNA酶处理相组合的传统方法从细胞中提取RNA。cDNA可以通过RNA的逆转录生成，例如使用试剂盒诸如SuperScript第一链合成系统(Thermo Fisher Scientific,USA)。
本文提供的重组核酸分子可在重组构建体中提供，重组构建体包括与异源核酸序列连接的重组核酸分子。如本文所用的“异源”意指与本文所述核酸分子没有天然连接的核酸序列，即在自然界中与本文所述核酸分子没有连接的核酸序列。如本文所用的与构建体有关的术语“连接”可以简单地意指核酸分子直接与异源核酸序列连接。在一种实施方式中，在重组构建体中，本文提供的核酸分子与异源表达控制序列可操作地连接。
术语“表达控制序列”是指位于编码序列上游、内部或下游，并且其影响相关编码序列的转录、RNA处理或稳定性或翻译的核苷酸序列(即影响编码特异性结合分子表达的任何方面)。表达控制序列包括启动子、启动子元件诸如TATA盒或B识别元件、操作子、增强子、翻译前导序列、终止子序列等。
在构建体中，核酸分子可与一个或多个异源表达控制序列可操作地连接。核酸分子通常至少与一个启动子可操作地连接。合适的启动子序列包括巨细胞病毒(CMV)启动子，例如人CMV(HCMV)启动子、PGK启动子、EF1a启动子、组成型猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EBV直接早期启动子和劳斯肉瘤病毒启动子。也可使用人基因启动子，包括但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。在某些实施方式中，可以使用诱导型启动子。它们提供了分子开关，能够打开或关闭核酸分子的表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子或四环素启动子。
术语“可操作地连接”是指在单个核酸片段上连接两个或更多个核酸分子，从而使一个核酸分子的功能受到另一个核酸分子的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即编码序列受启动子的转录控制)时，启动子就与编码序列可操作地连接。
如上所述，本文提供的重组核酸分子编码本文提供的结合蛋白。当结合蛋白包括两条多肽链(即全长或截短的α链以及全长或截短β链)时，例如，如果结合蛋白是TCR，则两条多肽链由相同的核酸分子编码。在这种情况下，可通过将结合蛋白编码为单个多肽来实现第一链和第二链的等摩尔表达，该单个多肽包括与第二链连接的第一链，例如通过接头连接(即结合蛋白可编码为单个多肽链，其中第一链和第二链通过接头分开)。接头可具有任何合适的氨基酸序列。合适的接头是本领域已知的。接头可以是任何合适的长度，例如它可以是1-30个氨基酸长，例如1-25个或1-20个氨基酸长。接头可以是可裂解的，以便分离第一和第二多肽。如果第一和第二多肽不能分离，那么这两条链就可能无法采用第一和第二链的可变区形成抗原结合位点所需的正确构象。技术人员可以选择合适的接头。接头可包括蛋白酶裂解位点，以便对接头进行特异性的翻译后裂解，并从而分离第一和第二多肽。适当的蛋白酶裂解位点是技术人员众所周知的，并且包括凝血酶、因子Xa、肠激酶、人鼻病毒(HRV)3C和烟草蚀纹病毒(TEV)裂解位点。
在特定的实施方式中，接头是自剪接的。自剪接接头能够催化自身的裂解，从而分离第一和第二多肽，而无需主动裂解步骤。自剪接反应的发生不需要刺激或诱导。裂解反应可将接头从单链特异性结合分子上完全切除；替代地，接头或接头的一部分仍可附着在由此产生的一条或两条独立的多肽链上。由接头催化的自剪接反应可能发生在翻译后(即可能是自催化蛋白水解反应)，或者它也可能发生在共翻译过程中。共翻译剪接可通过以下发生：阻止接头内部或者接头与在其任一侧的多肽链中之一之间形成肽键。
自剪接接头可利用核糖体跳跃序列(ribosomal skipping sequence)。这种核糖体跳跃序列是技术人员众所周知的。合适的自剪接接头是从微小核糖核酸病毒自裂解2A肽中提取的。2A肽长为大约20-25个氨基酸，并且末端具有保守序列基序Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:50)。2A肽通过阻止位于接头倒数第二位的保守甘氨酸与C末端脯氨酸残基之间形成肽键，来进行共翻译自剪接，从而得到蛋白在这两个氨基酸之间被有效地切割。切割后，2A肽(C端脯氨酸除外)仍附着在上游蛋白的C末端；最后的脯氨酸残基仍附着在下游蛋白的N末端。2A肽描述于Lewis et al.,2015(J Neurosci Methods 256:22-29)中。
本文的实施例证明了从编码由猪捷申病毒衍生的SEQ ID NO:26的2A序列分离的α链和β链的载体中的TCR的表达。因此，本文提供的核酸分子可以编码本文提供的结合蛋白，其中，该结合蛋白以单个多肽的形式编码，该单个多肽包括通过自剪接2A肽连接到第二链(例如β链)的第一链(例如α链)。2A肽接头可以具有任何合适的序列，使其具有自剪接活性。几种2A肽序列是已知的，其中的任何一种都可以根据本公开使用，例如在Wang等人，2015(Scientific Reports 5:Article No.16273)和WO 2019/166463中公开的2A序列。只要接头在其C末端处包括SEQ ID NO:50的2A肽基序，则基本上可以使用任何序列。在一种实施方式中，自剪接接头是2A肽，其包括SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，或与其具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
本文提供的结合蛋白(或相关的结合蛋白的第一链和第二链)可以用N末端前导序列编码。据信，这些前导序列可将结合蛋白(或其链)引导至细胞膜，以便输出(就可溶性结合蛋白而言)或插入至膜中(就包括跨膜结构域的结合蛋白而言)，并且在蛋白输出或其插入到膜中时，被修剪掉以产生成熟蛋白。示例性的α链N末端前导序列具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，并且示例性的β链N末端前导序列具有SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列(这些前导序列在下面的实施例中使用)。具体而言，SEQ ID NO:52用作T1TCRβ链的前导序列，已经SEQ ID NO:53用作T3 TCRβ链的前导序列。根据本公开，可以使用任何合适的前导序列，但在一种实施方式中，第一链(例如α链)用包括SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列的前导序列编码；以及第二链(例如β链)用包括SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列的前导序列编码。
在一种实施方式中，基于T1 TCR的结合蛋白可包括第一链(例如α链)和第二链(例如β链)，该第一链具有SEQ ID NO:51或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列的前导序列；该第二链具有SEQ ID NO:52或者与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的前导序列。在另一实施方式中，基于T3 TCR的结合蛋白可包括第一链(例如α链)和第二链(例如β链)，该第一链具有SEQ ID NO:51或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列的前导序列；该第二链具有SEQ ID NO:53或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列的前导序列。当结合蛋白仅包括单个多肽链时，可使用任何前导序列，例如来自TCRα链或TCRβ链的前导序列，例如前导序列可包括SEQ ID NO:51、52或53所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
包括T3 TCR链的示例性单个多肽具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。该多肽构建体从N末端至C末端包括具有SEQ ID NO:53的N末端前导的SEQ ID NO:25的β链、SEQ IDNO:26的2A肽接头和具有SEQ ID NO:51的N末端前导的SEQ ID NO:24的α链。包括T1 TCR链的示例性单个多肽具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。该多肽构建体从N末端至C末端包括具有SEQ ID NO:52的N末端前导的SEQ ID NO:13的β链、SEQ ID NO:26的2A肽接头和具有SEQ ID NO:51的N末端前导的SEQ ID NO:12的α链。编码T3单链TCR多肽的DNA序列在SEQ IDNO:55中所示；编码T1单链TCR多肽的DNA序列在SEQ ID NO:54中所示。
本文所提供的重组核酸分子或构建体可以在载体中提供。如本文使用的术语"载体"是指运载体，可将本文提供的核酸分子或构建体引入(例如共价插入)至其中，从其中可表达由核酸分子编码的特异性结合分子和/或克隆核酸分子/构建体。因此，载体可以是克隆载体或表达载体。
载体的实例包括质粒、自主复制序列和转座元件。额外的示例性载体包括但不限于噬菌粒、黏粒、人工染色体诸如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC))、噬菌体诸如λ噬菌体或M13噬菌体以及动物病毒诸如人病毒(即病毒载体)。可用作载体的动物病毒种类的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳头多瘤空泡病毒(papovaviruses)(例如SV40)。表达载体的实例为：用于在哺乳动物细胞中表达的pCl-neo载体(Promega公司)，以及用于慢病毒介导的基因转移和在哺乳动物细胞中表达的pLenti4/V5-DESTTM和pLenti6/V5-DESTTM。
载体可以是细菌或原核载体(即在细菌或原核细胞中使用(例如克隆或表达)的载体)或者真核载体(即在哺乳动物细胞中使用的载体)，例如哺乳动物载体。本文提供的核酸分子或构建体可以在以下中产生或引入至以下：通用克隆载体，诸如细菌克隆载体，例如大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体。典型地，克隆载体是细菌质粒，例如大肠杆菌(E.Coli)质粒。这种克隆载体的实例包括pUC19(可从例如New England Biolabs(NEB)获得)、pBluescript载体(Agilent,USA)和来自Thermo Fisher Scientific的pCR-载体。
本文提供的核酸分子或构建体可以亚克隆至表达载体中，用于表达本文提供的特异性结合分子，诸如哺乳动物表达载体。表达载体可包含多种表达控制序列。表达载体应具有必要的5'上游和3'下游调控元件诸如启动子序列(上文已讨论)，包括TATA盒、翻译起始位点处的Kozak序列和3'UTR AATAAAA多腺苷酸化信号序列，以信号传导转录终止，从而实现基因在各自宿主细胞中的高效转录和翻译。
除了控制转录和翻译的控制序列外，载体可以额外包含具有其他功能的核酸序列，包括例如载体复制、选择性标志物等。适用于选择细菌宿主细胞的选择性标志物的实例包括抗生素抗性基因，诸如氨苄青霉素抗性基因(例如β-内酰胺酶)、卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因(例如氯霉素乙酰转移酶)。适用于哺乳动物宿主细胞的可选择标志物包括：对潮霉素B(hygromycin B)具有抗性的潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)、来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)，其编码对抗生素G418的抗性、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、腺苷脱氨酶(ADA)基因和多重耐药(MDR)基因。这样的选择性标志物允许体外选择携带载体的细胞。
载体可包括使携带载体的免疫效应细胞在体内易受阴性选择影响的标志物。包括这样的标志物，允许选择性地破坏在被给药了这种细胞的个体(例如，使用过继细胞疗法治疗的患者)中的携带载体的免疫效应细胞。如果例如患者在治疗过程中出现严重的副作用，这一点可能非常重要。负选择性表型可能是由于插入了对给药的药剂敏感的基因。负选择性基因是本领域已知的，并且特别地包括：单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-ITK)基因(Wigler et al.,Cell 11(1):223-232,1977)，其赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性；以及细菌胞嘧啶脱氨酶，其赋予5-氟胞嘧啶敏感性(Mullen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33-37(1992))。
载体可以是病毒载体。病毒载体可来源于逆转录病毒，诸如慢病毒或泡沫病毒属(spumavirus)/泡沫病毒。如本文使用的术语“病毒载体”是指携带本文提供的核酸分子或构建体，并能将核酸分子/构建体递送至靶细胞的病毒衍生颗粒。病毒载体可包含本文提供的核酸分子，以代替非必要的病毒基因，或作为天然病毒基因的补充。载体可用于将DNA、RNA或其他核酸体外或离体转移至细胞中。
病毒载体的多种形式是本领域已知的，并且根据本教导可使用任何合适的病毒载体，包括单链和双链RNA病毒载体两者以及DNA病毒载体。单链病毒载体可以是正义或反义病毒载体。在某些实施方式中，病毒载体是逆转录病毒载体(即源自逆转录病毒的病毒载体)，诸如慢病毒载体(即源自慢病毒的病毒载体)。由于逆转录病毒基因组整合至受感染细胞的基因组中，因此本文所述的逆转录病毒载体可用于稳定转导靶细胞，即永久改变靶细胞的基因组成。
病毒载体可以是自失活载体或复制缺陷型载体。复制缺陷型逆转录病毒载体可通过例如修饰(例如缺失或置换)病毒基因组的3'LTR增强子-启动子区(称为U3区)来获得，以防止病毒转录超出第一轮病毒复制。因此，载体只能感染并且然后整合至宿主基因组中一次，并不能继续传代。
本文所用的逆转录病毒载体可衍生自任何已知的逆转录病毒，例如C型逆转录病毒，诸如莫洛尼(Moloney)鼠肉瘤病毒(M-MSV)、哈维(Harvey)鼠肉瘤病毒(Ha-MuSV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒属、弗里德(Friend)病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)；人T细胞白血病病毒诸如HTLV-1和HTLV-2；和逆转录病毒的慢病毒家族，诸如人免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马免疫缺陷病毒(EIV)和其他种类的逆转录病毒。
逆转录病毒包装细胞系(通常是哺乳动物细胞系)可用于生产病毒载体，然后可用于T细胞的转导。包装细胞系可通过转染携带病毒颗粒组装所需的基因的一种或多种载体(例如质粒)来生产病毒载体。举例说明的病毒载体描述于例如WO 2004/054512中。用于生产逆转录病毒载体的示例性质粒是pMP71，如et al.(PLoS ONE 6(11):e27930,2011)中描述。
在另一实施方式中，载体是mRNA载体。mRNA载体是vIJ上述核酸分子或构建体的正义mRNA链。mRNA载体是可翻译的mRNA链，其在递送至靶细胞后，可与核糖体结合并启动编码蛋白的合成。mRNA载体的优势在于，它不需要通过核进入或转录来启动其编码的蛋白的生产，而是可以直接与细细胞质核糖体结合并启动翻译。因此，用mRNA载体转染靶细胞可用于快速生产编码的特异性结合分子。RNA因其固有的不稳定性而仅具有有限的半衰期，并且因此，mRNA载体可用于靶细胞的瞬时转染。
mRNA载体包括用于翻译的基本元件，例如用于核糖体识别的5'7-甲基鸟苷酸帽和多腺苷酸尾。mRNA载体可根据本领域已知的方法，使用细胞或无细胞系统从mRNA表达载体中产生。合适的mRNA表达载体包括pClpA102(-Larssen et al.,J.Immunol.Methods259:191-203,2002)和pCIpA120-G(et al.,同上)。无细胞系统需要包括待转录基因的DNA模板和合适的启动子，并利用RNA聚合酶，通常是噬菌体RNA聚合酶。用于进行体外转录的试剂盒可以从例如Thermo Fisher Scientific(例如the MEGAscriptTMSP6Transcription试剂盒)获得。
本文还提供了试剂盒，其包括编码本文所提供的结合蛋白第一链的第一核酸分子和编码本文所提供的第二链的第二核酸分子。因此，该试剂盒包括一对核酸分子，其中一个编码本文所述的第一链，并且另一个编码第二链。
第一和第二核酸分子可以如上所述，例如他们可以是DNA或RNA、双链或单链、线性或环状等。第一重组核酸分子和第二核酸分子可以在第一重组构建体和第二重组构建体(第一重组构建体包括第一核酸分子，以及第二重组构建体包括第二核酸分子)的内容物的试剂盒中提供，或者以在第一载体和第二载体内来提供。上文讨论了重组构建体和载体。试剂盒中的第一和第二核酸分子是作为单独的分子提供的，即它们并不都位于同一个构建体或载体中。
如上所述，载体可能包括可选择标志物，使得可以对吸收了载体的细胞进行阳性选择。在一种实施方式中，当第一和第二核酸分子以在第一和第二载体中提供时，第一载体和第二载体各自包含可选择的标志物。第一载体和第二载体的标志物通常是不同的，使得可以选择摄取两种载体的细胞，而不是只摄取两种载体中的一种(或两种载体都没有摄取)的细胞。上文讨论了合适的可选择标志物。
试剂盒中的两种核酸分子(例如第一和第二重组构建体或第一和第二载体)可以以在单个容器中(即两种核酸分子的混合物中)，或在不同的容器中提供。核酸分子可以以在水性溶液(例如以在水或适当的缓冲液诸如TE缓冲液中)提供或者可以以冻干形式提供。
由试剂盒中的核酸分子编码的第一链和第二链两者均来自T1或T3 TCR(即试剂盒不包括编码来自T1 TCR的链的一种核酸分子和编码来自T3 TCR的链的一种核酸分子)。
因此，在第一实施方式中，试剂盒包括编码基于T3 TCR结合蛋白的第一链和第二链的核酸分子，该试剂盒包括：
(i)第一核酸分子，其编码包括含有CDR1、CDR2和CDR3的可变结构域的第一链，其分别包括SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列，特别地其中，该可变结构域包括SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)第二核酸分子，编码包括含有CDR1、CDR2和CDR3的可变结构域的第二链，其分别包括SEQ ID NO:19、20和21所示的氨基酸序列，特别地其中，该可变结构域包括SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
因此，如上所述，第一链可以是任何基于T3 TCR的全长或截短的α链，并且如上所述第二链可以是任何基于T3 TCR的全长或截断的β链。
在第二实施方式中，试剂盒包括编码基于T1 TCR的结合蛋白的第一链和第二链的核酸分子，该试剂盒包括
(i)第一核酸分子，其编码包括含有CDR1、CDR2和CDR3的可变结构域的第一链，其分别包括SEQ ID NO:2、3和4所示的氨基酸序列，特别地其中，该可变结构域包括SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)第二核酸分子，其编码包括含有CDR1、CDR2和CDR3的可变结构域的第二链，其分别包括SEQ ID NO:5、6和7所示的氨基酸序列，特别地其中，该可变结构域包括SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
因此，如上所述，第一链可以是任何基于T1 TCR的全长或截短的α链，并且如上所述第二链可以是任何基于T1 TCR的全长β链。
序列同一性可以通过任何方便的方法来评估。然而，为了确定序列之间的序列同一性的程度，进行序列的成对或多重比对的计算机程序是有用的，例如EMBOSS Needle或EMBOSS stretcher(Rice,P.et al.,Trends Genet.,16,(6)pp276—277,2000两者)可用于成对序列比对，而Clustal Omega(Sievers F et al.,Mol.Syst.Biol.7:539,2011)或MUCLE(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Res.32(5):1792-1797,2004)可用于多重序列比对，尽管可以使用任何其他合适的程序。另一种合适的比对程序是BLAST，使用blastp算法进行蛋白比对，并使用blastn算法进行核酸比对。无论比对是成对的还是多重的，都必须在全局范围内(即参照序列的整个范围内)而不是在局部范围内进行。
可使用例如标准的Clustal Omega参数：矩阵Gonnet、空位开放罚分6、空位拓展罚分1来确定序列比对和同一性％计算。替代地，也可使用标准的EMBOSS Needle参数：矩阵BLOSUM62、空位开放罚分10、空位拓展罚分0.5。也可替代地使用任何其他合适的参数。
当序列与本文所述参照序列的同一性低于100％时，可通过相对于参照序列置换、缺失或添加氨基酸(或其任意组合)来改变序列。
本文提供的核酸分子、构建体和载体可通过众所周知的方法引入至细胞，例如免疫效应细胞中。本文提供的试剂盒的第一和第二核酸分子可以类似地共同引入至宿主细胞中。核酸分子、构建体和载体可通过转染(例如通过电穿孔、微注射、脂质感染或基因枪法，或本领域已知的任何其他方法)或使用病毒载体转导来引入至靶真核(如人)细胞中。核酸分子、构建体和载体可通过本领域已知的任何方法例如转化、转导或缀合来引入至靶原核(例如细菌)细胞中。
因此，本文另外提供了细胞，该细胞包括本文提供的重组核酸分子或载体，或者包括在本文提供的试剂盒中的一对核酸分子。
细胞尤其可以是效应细胞，或更特别地是免疫效应细胞，或者其前体或祖细胞，包括本文提供的重组核酸分子或载体，或者来自试剂盒的一对核酸分子，其编码上述包括跨膜结构域的结合蛋白。重组核酸分子、载体或核酸分子对可编码TCR。替代地，还可以编码TCR-CAR或嵌合TCR。当细胞，例如效应细胞或免疫效应细胞，在其细胞膜上表达这种结合蛋白时，它们就可能识别并靶向表达TdT的细胞。因此，包括这种重组核酸分子、载体或核酸分子对的细胞在其细胞膜中表达编码的特异性结合蛋白。也就是说，编码的特异性结合蛋白在细胞膜上表达和定位，并具有功能性。在特定的实施方式中，细胞，例如效应细胞或免疫效应细胞，在其细胞膜中表达功能性TCR。
本文所指的“免疫效应细胞”意指在激活时能够执行效应功能(例如细胞毒性靶细胞杀伤、细胞因子释放等)并能表达功能性TCR的任何免疫细胞。更一般地说，“效应细胞”是指能够执行效应功能的任何细胞。这可以是细胞产生的任何有用效应，或可以是细胞的任何有用特性。效应细胞包括干细胞。所谓“功能性TCR”，意指能够在识别靶标后启动免疫效应功能的TCR。效应细胞(该术语尤其包括免疫效应细胞)可被视为以下或可包括以下：适用于治疗用途的细胞，例如用于过继细胞转移疗法的用途的细胞。因此，效应细胞也可称为治疗性细胞或用于疗法的细胞。
术语“免疫效应细胞”尤其可包括成熟的或完全分化的免疫效应细胞，但如上所述，在本文的公开和用途范围内还包括其前体(或祖细胞)细胞，包括干细胞(例如造血干细胞、HSC)，或由HSC或其他干细胞来源的细胞，以及更定向的祖细胞。因此，免疫效应细胞的前体可以是获得自或来源于CD34+细胞群中所含的HSC的细胞，该CD34+细胞群来源于造血组织，例如骨髓、脐带血或血液，例如动员的外周血，其在向受试者给药时分化为成熟的免疫效应细胞，或者其可在体内或体外被诱导分化为免疫效应细胞。干细胞也可以是诱导多能干细胞(iPSC)，并且因此免疫效应细胞的前体可以是iPSC或者获自或来源于iPSC细胞的细胞。
在特定的实施方式中，免疫效应细胞是T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞。例如，它可能是细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)、辅助性T细胞(CD4+T细胞)、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、幼稚T细胞、记忆T细胞或任何其他类型的T细胞。T细胞可以是辅助性T细胞或细胞毒性T细胞。在另一特定的实施方式中，免疫效应细胞是自然杀伤细胞(NK细胞)。
因此，免疫效应细胞可以从细胞毒性T细胞、NK细胞和辅助性T细胞中选择。在一种实施方式中，免疫效应细胞是NK细胞，并且表达的结合蛋白是TCR。在这种情况下，可能需要额外表达一条或多条CD3链，如WO 2016/116601和WO 2018/129199中所公开的。
如本文所述，包括重组核酸分子、载体或核酸分子对的T细胞或NK细胞可通过转染或转导靶T细胞或NK细胞来获得。待转染的T细胞或NK细胞可以来源于现有的细胞系，或者也可以是原代T细胞或NK细胞，其是从目的受试者(其可以是待治疗的患者或供体)中分离出来的。T细胞或NK细胞也可以在被修饰以表达结合分子之前和/或之后在体外被活化和刺激以增殖(这种活化和刺激以增殖可称为扩增)。可以使用WO 2014/037422中描述的方法来扩增和激活NK细胞。
T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。T细胞可使用本领域已知的任何方法进行分离。T细胞可从PBMC中获得，而PBMC可从全血密度梯度离心获得的血沉棕黄层中分离出来。可以通过阳性或阴性选择技术来进一步分离特定的T细胞亚群，诸如CD4+或CD8+T细胞。例如，通过阴性选择富集T细胞群可以通过针对阴性选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来实现。这种阴性选择可通过例如荧光激活细胞分选(FACS)来进行。
同样，NK细胞也可采用本领域已知的标准方法诸如上文所述的那些从与T细胞相同的来源获得。例如，可以使用来自细胞系的NK细胞，例如NK-92细胞。原代NK细胞可从血液中分离，例如PBMC或脐带血(UCB)，例如Becker et al.(Cancer Immunology,Immunotherapy 65:477-484,2016)or Spanholtz et al.(PLoS ONE 6(6):e20740,2011)中的描述。
本文使用的细胞，例如效应细胞或免疫效应细胞，可以是人的。效应细胞，例如表达TCR(或本文提供的其他膜结合蛋白)的免疫效应细胞，可以是自体的或同种异体的。也就是说，当细胞，例如效应细胞或免疫效应细胞用于治疗用途时，它可以是自体细胞：即来源于待治疗的患者，这就确保了组织相容性和非免疫原性，其意指，一旦经过基因修饰，它就不会诱导患者的免疫应答。替代地，细胞可以是用于治疗用途的非自体细胞(即从患者以外的个体获得的供体细胞)，在这种情况下，细胞可以是同种异体的。
用于治疗用途的非自体细胞可以是非免疫原性的，使得它在向给受试者给药时不会生成影响、干扰或阻止细胞用于治疗的免疫应答。如果非自体细胞(例如免疫效应细胞或其前体等)与患者的HLA相匹配，则非自体细胞可以是天然的非免疫原性细胞。非自体细胞可通过以下来使其成为非免疫原性细胞：通过修饰来减少或消除其MHC分子的表达，例如通过敲除或敲低编码MHC蛋白的基因的表达。这些细胞可能是HLA阴性的人细胞。在实施方式中，I类MHC表达的破坏可以通过敲除编码β2-微球蛋白(β2-m)的基因来进行。
细胞(例如效应细胞，或者更特别地免疫效应细胞)也可以在向受试者给药之前进行辐照。在希望受到理论约束下，我们认为对细胞进行辐照导致细胞只在受试者体内短暂存在，从而减少受试者的免疫系统对细胞产生免疫应答的时间。虽然这些细胞可能在其细胞表面表达功能性MHC分子，但它们也可能被视为非免疫原性细胞。辐照可以来自α、β或γ辐照的任何来源，也可以是X射线辐照或紫外光。5-10Gy的辐射剂量可能足以抑制增殖。替代地，可以对细胞进行修饰以表达“自杀基因”，从而使细胞在外部刺激下被诱导杀死或阻止复制。
本文提供的细胞可以替代地是生产宿主细胞并且重组核酸分子、载体或核酸分子编码如上所述的可溶性结合蛋白(例如可溶性TCR)。生产宿主细胞是适用于蛋白生产的任何细胞。适当的生产宿主是本领域已知的。生产宿主可以是原核生物，例如经优化用于真核蛋白生产的大肠杆菌(E.coli)菌株，诸如罗塞塔(Rosetta)菌株。生产宿主可以是真核细胞，例如真菌细胞诸如酵母细胞，例如毕赤酵母(Pichia pastoris)。生产宿主可以是哺乳动物细胞，诸如人细胞或非人细胞。如果使用的是非人哺乳动物细胞，则可对该细胞进行优化，以利于人蛋白的表达。尽管可以使用任何合适的细胞系或类型，合适的哺乳动物细胞包括Cos细胞，例如COS-7细胞、HEK293细胞和CHO细胞。CHO(中国仓鼠卵巢)细胞是生产蛋白的通常使用的细胞，也可根据本公开使用。可以对编码特异性结合分子的基因进行密码子优化，以便在所选宿主中表达。
本文提供的细胞可以替代是在合成本文提供的重组核酸或载体期间使用的克隆宿主，或者是由试剂盒提供的核酸分子对中的一个。原核细胞可用作上述核酸分子、构建体或载体的克隆宿主。用作克隆宿主的合适的原核细胞包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希菌属(Escherichia)诸如大肠杆菌，和杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。克隆宿主可以替代地是真核细胞诸如真菌细胞，例如毕赤酵母(Pichia pastoris)，或酵母细胞，或甚至是更高级真核细胞诸如哺乳动物细胞。
本公开的另一方面提供了生成TdT特异性细胞，或更特别地效应细胞，或免疫效应细胞(即本文提供的免疫效应细胞)或其前体的方法，该方法包括将本文提供的重组核酸分子、本文提供的载体或本文提供的试剂盒中包括的重组核酸分子对引入至细胞(例如免疫效应细胞或其前体)中。免疫效应细胞可以是上述任何免疫效应细胞，特别地T细胞(诸如细胞毒性T细胞或辅助性T细胞)或NK细胞，以及前体可包括任何干细胞，例如iPSC或由此衍生的细胞。还如上所述，一种或多种核酸分子或载体可通过本领域已知的任何方法例如通过转染或转导来引入至细胞中。如上所述，可对细胞进行另外的修饰(例如，使其具有非免疫原性或表达另外的目的蛋白，例如，如上所述，可对NK细胞进行修饰，使其表达TCR和CD3链两者，以引起对功能性TCR-CD3复合物的表达)。如上所述，效应细胞也可以扩增。细胞的修饰和扩增可按任何顺序进行。
本文还提供了一种药物组合物，包括本文所提供的细胞，特别是效应细胞，以及更特别地是免疫效应细胞或其前体。还提供了药物组合物，包括本文提供的可溶性结合蛋白(例如TCR-scFv或可溶性TCR)。如下文所述，包括本文提供的细胞的药物组合物可用于癌症治疗。类似地，包括本文提供的可溶性结合蛋白的药物组合物可用于癌症治疗或诊断，如上文和下文所讨论的。
本文提供的药物组合物包括活性药物剂(即细胞或可溶性结合蛋白)和至少一种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。该组合物可以根据药物领域中已知的技术和程序，以任何方便的方式配制。如本文使用的术语“药学上可接受的”是指与组合物的其他成分相容的以及受体生理学上可接受的成分。组合物的性质、负载体或赋形剂材料、剂量等可根据选择和所需的给药途径、治疗目的等按常规方式进行选择。
药物组合物可以通过任何合适的方式制备，以便向受试者给药。这种给药可以是例如口服、鼻腔或肠胃外给药。如本文所用的口服给药包括口腔和舌下给药。如本文限定的肠胃外给药包括皮下、肌内、静脉内、腹腔内和真皮内给药。
如本文提供的药物组合物包括液体溶液或糖浆、固体组合物诸如粉末、颗粒、片剂或胶囊、乳膏、软膏以及本领域常用的组合物的任何其他类型。用于此类组合物的合适的药学上可接受的稀释剂、负载体和赋形剂是本领域众所周知的。
例如，合适的赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐、植物油、蜡、脂肪和多元醇。合适的负载体或稀释剂包括羧甲基纤维素(CMC)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、右旋糖、海藻糖、脂质体、聚乙烯醇、药物级淀粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖(和其他糖)、碳酸镁、明胶、油、醇、洗涤剂和乳化剂诸如聚山梨醇酯。还可以使用稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂等。
液体药物组合物，无论是溶液、悬浮液或其他类似形式，都可以包括以下的一种或多种：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液(其可以是生理性的)、林格氏溶液、等渗氯化钠、非挥发性油诸如可用作溶剂或悬浮介质的合成的甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如EDTA；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透性的药剂，诸如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射的药物组合物可以是无菌的。
本文提供的是一种细胞，特别是效应细胞，以及更特别是免疫效应细胞或其前体，如本文所述，用于治疗的用途。类似地，本文提供了包括这样的细胞(如上所述)的药物组合物，用于治疗的用途。本文还提供了可溶性结合蛋白(例如TCR-scFv或可溶性TCR)，用于治疗的用途或用于诊断的用途。类似地，本文还提供了包括这种可溶性结合蛋白的药物组合物，用于治疗的用途或用于诊断的用途。在本文提供的可溶性结合蛋白的上下文中，与治疗剂(如上所述)连接或缀合的可溶性结合蛋白可用于治疗，并且与诊断剂(如上所述)连接或缀合的可溶性结合蛋白可用于诊断。
如本文使用的“治疗”意指对任何医疗病症的治疗。这种治疗可以是预防性的(即防御性的)、治愈性的(或旨在治愈的治疗)或姑息性的(即仅为限制、缓解或改善病症的症状而设计的治疗)。该疗法用于治疗人受试者。
使用细胞或包括细胞的组合物进行的疗法是过继转移疗法(替代地称为过继细胞转移)。可以使用已知的技术进行过继转移疗法。可通过以下将细胞配制用于疗法：以治疗有效的量首先从细胞的培养基中收获它们，并且然后将细胞洗涤并浓缩在适用于给药的培养基和容器系统(药学上可接受的负载体)中。合适的输注培养基可以是任何等渗培养基制剂，通常是生理盐水，例如Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但也可以使用5％在水中的右旋糖或林格氏乳酸盐。输注培养基可补充有人血清白蛋白。
本文提供的用于治疗用途的细胞，如上所述表达膜结合特异性结合分子(例如TCR)，可单独给药，或可作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合给药。此类药物组合物如上文所述。
本文提供的细胞用于治疗用途，以及包括这种细胞的药物组合物可以通过任何合适的途径向患者给药。特别地，细胞可以通过静脉内或肿瘤内注射给药。
本文所述的疗法可包括给药药物有效剂量的本文的细胞。药学上有效的剂量可以例如在表达结合蛋白(例如TCR)的1×105至1×1010个细胞的范围内，或更多。药学上有效的剂量可以例如在表达TCR的1×107至5×109个T细胞的范围内。对于本文提供的用途，细胞的体积一般为一升或更小，500ml或更小，甚至250ml或100ml或更小。因此，所需细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/ml、通常108个细胞/ml或更高。可以将临床相关的数量分配到累积等于或超过105、106、107、108、109、1010、1011或1012个细胞的多次输注中。例如，可以每隔24或48小时，或每3、4、5、6或7天，向患者进行2、3、4、5、6或更多次单独输注。输注也可以间隔为每周、每两周或每月一次，或间隔6周或更长时间。细胞组合物可以以在上述讨论范围内的剂量多次给药。如果需要，治疗还可包括给药促分裂原(例如PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、ΜΓΡΤα等)以增强免疫应答的诱导。
在使用如本文提供的可溶性结合蛋白的疗法时，可根据选择和所需的给药途径、治疗目的等按常规方式选择剂量等。剂量也同样取决于患者的性质，例如年龄、大小和状况，以及患者疾病的类型和严重程度。适当的剂量可通过临床试验来确定。如本文提供的可溶性结合蛋白可以替代地用于体内诊断方法，在这种情况下，可溶性结合蛋白与诊断剂连接或缀合，如上所讨论的。适当的体内诊断方法是技术熟练的医生已知的，并且包括在扫描患者时使用与示踪剂或类似物缀合的可溶性结合蛋白，例如放射性标记。
可溶性结合蛋白可以通过本领域常见的任何途径给药，例如通过如上所述的口服、鼻腔或肠胃外途径。
本公开广泛地提供了一种细胞，更具体地说是一种效应细胞或免疫效应细胞或其前体，表达的TCR特异性地结合呈现TdT肽的HLA复合物(或包括上述细胞的药物组合物)，用于治疗T细胞源性癌症的用途。类似地，本公开提供了用于治疗T细胞源性癌症的方法，包括给药含有药学上有效剂量的表达TCR的细胞的药物组合物，该药物组合物特异性地结合递呈TdT肽的HLA复合物。
本文另外提供了细胞，特别是效应细胞，以及更特别是免疫效应细胞或其前体，如本文提供的，如本文提供的可溶性结合蛋白或如本文提供药物组合物，用于治疗癌症的用途，其中，癌症表达TdT。将本文癌症进行宽泛地限定，包括任何赘生性病症，无论是恶性、恶性前期或是非恶性。然而，一般来说，这是恶性病症。实体瘤和非实体瘤两者都包括在内，并且术语"癌细胞"可视为"肿瘤细胞"的同义词。表达TdT的癌症是指其中组成型癌细胞表达TdT的癌症。癌症是否表达TdT可以通过例如分析活检样品来确定。可通过标准活检程序获得固体或液体样品，并进行组织学分析，例如使用抗TdT抗体的免疫组化学法，以鉴定TdT的表达。还可使用其他免疫学方法来鉴定TdT的表达，例如对于活检样品的蛋白质印迹。也可通过mRNA分析例如qPCR或RNA-Seq鉴定TdT的表达。本公开的这一方面可用于治疗携带HLA-A2基因的患者的癌症，这意指癌症细胞表达HLA-A2(即癌症是HLA-A2阳性，或HLA-a*02-阳性，任选地HLA-a*02:01-阳性)。因此，根据本公开治疗的癌症是HLA-A2阳性的。
癌症可以是任何癌症，但尤其可以是血癌。在特定的实施方式中，血癌是急性淋巴细胞白血病(ALL)。癌症可以是B细胞来源的ALL(B-ALL)或T细胞来源的ALL(T-ALL)。在特定的实施方式中，癌症是T-ALL。在另一实施方式中，血癌是非霍奇金淋巴瘤，尤其是淋巴母细胞淋巴瘤。
类似地，本文提供了用于治疗表达TdT的HLA-A*02阳性癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试者给药如本文提供的细胞，特别是效应细胞，以及更特别地免疫效应细胞或其前体、可溶性结合蛋白或药物组合物。这种受试者是患有这种癌症的人受试者(即表达TdT和HLA-A*02的癌症)。癌症尤其可以如上所述。
总之，我们还提供了用于治疗患者TdT阳性癌症的方法，该方法包括以下步骤：给药药物组合物，该药物组合物包括细胞，特别是效应细胞，以及更特别是免疫效应细胞或其前体，这些细胞表达与呈递从TdT中可获得的肽片段的HLA I类分子特异性结合的受体。我们还提供了用于治疗患者的TdT阳性癌症的方法，该方法包括以下步骤：给药药物组合物，该药物组合物包括与呈递从TdT中可获得的肽片段的HLA I类分子特异性结合的细胞毒性蛋白。从TdT中可获得的合适的肽片段可包括8至12个氨基酸残基，以及它们优选可以是TdT独有的。
类似地，本文提供了细胞，特别是效应细胞，以及更特别是免疫效应细胞或其前体，或本文提供的可溶性结合蛋白在制备用于治疗受试者中HLA-a*02-阳性癌症的药物中的用途，其中，该癌症表达TdT。癌症尤其可以是如上所述的癌症。
本文还提供了一种用于诊断HLA-A*02阳性癌症的如本文提供的可溶性结合蛋白，其中，癌症表达TdT。上文详细介绍了可溶性结合蛋白在癌症诊断中的用途。癌症可以是任何癌症，详见上文关于本公开在癌症疗法中的用途。类似地，本文提供了诊断癌症的方法，包括向怀疑患有HLA-A*02阳性且表达TdT的癌症的受试者给药如本文提供的可溶性结合蛋白。
通过下面的非限制性实施例并参考附图，可以更充分地理解本公开。
实施例
材料与方法
原代患者细胞和细胞系
根据嵌合抗原受体(CAR)T细胞试验(临床试验政府标识号NCT02435849和NCT03123939)，将儿童和青少年复发或难治(r/r)B-ALL患者纳入并进行治疗；根据NOPHO-ALL-2008(NCT00816049)将儿童T-ALL患者纳入并进行治疗。
外周血单核细胞(PBMC)通过密度梯度离心(Axis-Shield)从奥斯陆大学医院(Oslo University Hospital)的血库获得的健康供体血沉棕黄层中分离出来。通过流式细胞术对PBMC进行HLA-A2表达分型。爱泼斯坦-巴尔病毒转化的淋巴母细胞样细胞系(EBV-LCL)由HLA-A2pos和HLA-A2neg.PBMC生成，如前所述(Tosato et al.,Current Protocols inImmunology Chapter 7,Unit 7 22(2007))。从血凝块、结缔组织、脂肪组织和坏死组织中清除胸腺组织，并将其切成小块，用连接有宽孔吸头的1-ml微量移液管轻轻研磨，将胸腺细胞释放至冷的RPMI-1640培养基中。将胸腺细胞在培养基中洗涤两次，并然后冷冻保存。
以下细胞系获得自美国类型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)或德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures，DSMZ)：NALM-6、BV173、REH、HPB-ALL、RS4；11、T2、RD、U-2OS、FM-6、HeLa、HaCaT、MCF7、K562、COLO 688、EA.hy926、EST149、U-87MG、Daoy、HCT-116、CHP-212和Phoenix-AMPHO。大多数细胞系都是从ATCC和DSMZ购买的，并且已经确认过，并根据传代标记了冷冻保存的等分样品。仅使用低传代细胞系来开始新的培养。在这些研究之前获得的细胞系的身份通过短串联重复DNA图谱确定，该服务是由Labcorp DNAIdentification Lab,NC,USA(前身为Genetica，https://celllineauthentication.com/)提供。细胞系在37℃、含5％ CO2的湿润细胞培养箱中，在供应商指示的培养基中培养，并定期检测支原体污染。
诱导抗原特异性T细胞
如先前所述(Ali et al.,Nature Protocols 14:1926-1943,2019)进行了对TdT肽有反应的T细胞的诱导和细胞毒性T细胞系和克隆的生成，并进行了一些修饰。简言之，在第4天使用CD14反应性微珠粒和AutoMACS Pro Separator(Miltenyi Biotec)从HLA-A2pos健康供体的PBMC中分离单核细胞，并在包含50IU/ml白介素(IL)-4(PeproTech)和800Iu/mlGM-CSF(Genzyme)的补充有1％(vol/vol)人血清(HS，Trina Biotechnology)和1％(vol/vol)P/S的CellGro GMP DC的培养基(CellGenix)中培养三天。随后，加入最终浓度分别为10ng/ml和100IU/ml的脂多糖(LPS；Sigma-Aldrich)和IFN-γ(PeproTech)，使单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)成熟14-16h。在第-1天，通过使用AutoMACS Pro分离器和与CD45RO-和CD57反应性珠粒混合的CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，从来自HLA-A2neg供体的PBMC中分离幼稚CD8+T细胞。在第0天，收获MoDCs，用编码全长TdT的mRNA进行电穿孔，并在补充有30ng/ml IL-21(PeproTech)的DC-T细胞培养基中以1:4的DC:T细胞比率与幼稚T细胞进行共培养。用使用无关mRNA转染的MoDCs启动平行对照共培养。
pMHC多聚体+CD8+T细胞的分选和克隆
肽-1和肽-3特异性CD8+T细胞的单细胞克隆是按照先前的描述进行的(Aliet al，如上文)。为评估功能性，用使用相关肽脉冲的EBV-LCL和天然表达TdT的NALM-6细胞系刺激T细胞克隆，并评估CD137的上调。
TCR测序和克隆
使用先前描述的方案扩增来自对肽-1反应的三个克隆和对肽-3反应的一个克隆的成对TCRα和β链，该方案被修改并适用于TCRα和β转录物的靶向扩增(Scheper et al.,Nature Medicine 25:89-94,2019；Stronen et al.,Science 352:1337-1341,2016)。简言之，提取并处理RNA，以获得TCR特异性cDNA。使用四对TCRα/β恒定结构域特异性引物对每个克隆进行RT PCR，随后加入poly-G尾和模板切换以获得双链DNA。最后，使用额外的恒定结构域引物和与poly-G结构域中引入的锚序列退火的衔接子引物进行两轮巢式PCR扩增。利用Kappa Illumina试剂盒制备文库，随后在Illumina MiSeq上进行测序。MiTCR脚本用于分析测序数据，并且使用内部Python脚本TCRprimer重建全长TCR链，如先前所述(Scheper etal.,supra；Linnemann et al.,Nature Medicine 19:1534-1541,2013)。在IMGT/V-Quest中手动验证每个样品的输出(Brochet et al.,Nucleic Acids Research 36:W503-508,2008)。Genscript对已鉴定TCR的可变TCRα和TCRβ片段进行了密码子优化、合成和克隆。
将基因转入人PBMC和细胞系
将T1和T3 TCR转导至HLA-A2pos供体来源和患者来源的PBMC中。1G4和DMF5TCR也被转导至HLA-A2pos供体来源的PBMC中作为体内实验的对照。为了刺激人PBMC，在6孔或12孔组织培养处理板上包被抗CD3(克隆OKT3，eBioscience)和抗CD28(克隆CD28.6，eBioscience)抗体。将补充有IL-7和IL-15(各5ng/ml，PeproTech)的T细胞培养基中的PBMC(2x106个细胞/ml)添加至抗体包被的平板中，并在37℃和5％ CO2下孵育72h。为了生成逆转录病毒上清液，将4x106Phoenix AMPHO包装细胞在10cm培养皿中铺板24h，并用γ-逆转录病毒载体DNA转染细胞，将其混合在x-tremeGENE 9DNA转染试剂(Roche Diagnostics)和Opti-MEM中。次日，更新培养基，并将细胞在32℃和5％CO2下孵育24h。随后，收获PBMC，将其重新悬浮在补充有IL-7和IL-15的T细胞培养基中，与逆转录病毒上清液混合，放置在预包被有Retronectin(20μg/ml，Takara)的非组织培养物处理的6孔板中，并以900x g离心转导(spinoculate)60min。在随后的一天用新鲜的逆转录病毒上清液进行第二次离心转导，并在3至5天后通过用抗小鼠TCRβ链抗体和/或pMHC多聚体染色，随后通过流式细胞术来测定转导效率。在功能实验之前，将细胞在含有低浓度细胞因子(0.5ng/ml IL-7和IL-15)的T细胞培养基中培养48-72h。替代地，将细胞冷冻以供以后的实验。
也如上所述生产含有编码全长HLA-A2和TdT的病毒DNA的逆转录病毒上清液，并用于使用HLA-A2转导REH、RD、HeLa、K562、HaCaT、COLO688、EA.hy926和HPB-ALL细胞系，以及使用TdT转导EBV-LCL。在体内实验中，稳定转导BV173细胞系以表达萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)，并被命名为BV173ffluc-eGFP。所有转导的细胞系随后都通过FACS分选进行了纯化、扩增和冷冻，以便在以后的实验中使用。
如先前所述，将TdT和HLA-A2的cDNA克隆到pCIpA102载体中以产生mRNA(Kumariet al.,PNAS111:403-408,2014)。
抗体和流式细胞术
流式细胞术在BD LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行，并且使用FlowJo(TreeStar)或FACSDIVA(BD Biosciences)软件来分析数据。在表面抗体染色时，将抗体加入细胞中在冰上持续15-20min，随后进行洗涤步骤。细胞内染色时，将细胞悬浮在Cytofix/Cytoperm(BD Bioscience)溶液中20分钟，用Perm/Wash缓冲液(BD Bioscience)洗涤，并然后用抗体染色。除非另有说明，否则以下荧光缀合的抗人抗体均获得自BD Biosciences或BioLegend：抗CD14(HCD14)、-HLA-A2(BB7.2)、-CD62L(DREG-56)、CD56(HCD56)、-CD57(HNK-1)、-CD45RO(UCHL1)、-CD45RA(HI100)、-CCR7(150503)、-CD137(4B4-1)、-CD45(HI30)、-TdT(E17-1519)、-CD10(HI10a)、-CD19(HIB19，SJ25C1)、-CD38(HIT2)、-CD34(581)、-CD1a(HI149)、-CD2(S5.2)、-CD3(UCHT1、OKT3)、-CD8a(RPA-T8)、-CD4(RPA-T4)、-CD5(UCHT2、L17F12)、-CD7(M-T701)、抗小鼠CD45(30-F11)、-CD99(DN16，Bio-Rad)和-CD3(SK7，eBioscience)。使用抗小鼠TCRβ链PE(H57-597，BD Biosciences)测试人细胞中T1和T3 TCR的转导效率，并监测用于小鼠体内治疗的转导T细胞。在所有流式细胞术实验中，均使用活/死固定近红外死细胞染色(Live/Dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain)试剂盒(LifeTechnologies)来排除死细胞。
T细胞活化测定
通过测量CD137上调或IFN-γ释放，研究了T细胞克隆和TCR转导的T细胞的反应性。简言之，将100,000个细胞/孔的指定靶细胞系或原代患者肿瘤细胞与T细胞克隆或TCR转导的PBMC(50,000个细胞/孔)共同孵育。在指示下，用指定浓度的肽脉冲靶细胞1-2h，或用编码全长TdT的mRNA电穿孔，洗涤，并然后与效应细胞共培养。在共孵育14-16h后，将板以400x g离心3min。收获培养上清液通过ELISA测量IFN-γ，并且将其余细胞染色用于流式细胞术，以测量活CD8+细胞上CD137的上调。结果以CD137+/CD8+细胞的百分比(转导效率>90％)或TCR转导的CD8+T细胞中CD137+事件的百分比报告。在一些实验中，用0.75μM的荧光细胞染色染料CellTrace Violet(CTV，Life Technologies)或羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CSFE，Life Technologies)对细胞进行标记，以区分靶细胞和效应细胞。以下试剂购自BDPharmingen或R&D Systems：小鼠抗人IFN-γ捕获抗体(NIB42)、生物素小鼠抗人IFN-γ检测抗体(4S.B3)、链霉亲和素-HRP、稳定的四甲基联苯胺和过氧化氢作为底物溶液、硫酸作为终止溶液，并且重组人IFN-γ蛋白作为标准品。根据制造商的说明进行测定。
使用细胞系为靶标的基于流式细胞术的细胞毒性测定
在对B-ALL和T-ALL细胞系进行细胞毒性测定时，在96孔圆底板中将50,000个靶细胞与T1或T3 TCR转导的PBMC在T细胞培养基中共同培养48h，一式三份。将效应细胞限定为PBMC产物中经TCR转导的CD8+T细胞(通常，>90％转导效率，以及55-65％ CD8+T细胞，以及其余为CD4+T细胞)并且效应细胞与靶细胞的比率为1:1。共培养后，收获、洗涤细胞并用人抗CD3、人抗CD8、人抗CD19和活/死固定近红外染色以排除死细胞。15分钟后，洗涤细胞并将其重新悬浮在含有10,000个CountBright Absolute计数珠粒(赛默飞世尔)的200μL FACS缓冲液中。采集数据时，每个孔都记录了相同数量的珠粒事件(5,000个)。将数据进行归一化，并以三个平行孔中与来自同一供体的空白转导T细胞共同培养的平均活肿瘤细胞数的百分比进行报告。
使用原代人B-ALL和T-ALL样品进行基于流式细胞术的T细胞活化和细胞毒性测定
解冻B-ALL和T-ALL患者的外周血或骨髓样品，并将其重悬于包含低浓度IL-7和IL-15(0.5ng/ml)的T细胞培养基中。将细胞转移至圆底96孔板中，用于检测TCR转导T细胞的CD137上调或靶细胞的细胞毒性。在对医院可获得病历中的诊断表型进行审查后，设计了用于识别恶性胚细胞和正常白细胞群的个性化抗体组(panel)和门控策略。实验中使用的是同种异体T细胞，或者患者1N使用的是转导了TCR的源自患者自体的T细胞。TCR转导的细胞预先用CTV染料标记，以便与靶细胞区分开来。如上文所述，用相关肽负载靶细胞1-2h，洗涤，并且然后与TCR转导的T细胞共孵育，以测量CD137的上调。
在细胞毒性测定中，每孔50,000个靶细胞与等量的效应细胞共培养48-72h，每个条件2-4个平行孔，并且然后用个体化抗体组染色，进行流式细胞术测定。使用CountBrightAbsolute计数珠粒进行采集标准化，并如上文所述对数据进行归一化和报告。为了可视化地示出流式细胞术图谱，我们使用了无监督的非线性降维算法诸如使用FlowJo(TreeStar)软件的T分布随机邻域嵌入(t-SNE)。
两种异种移植B-ALL细胞系模型的体内TdT TCR T细胞活性
在这些实验中使用内部培育的8-10周龄雄性和雌性NOD-scid IL2Rgnull(NSG)小鼠。在第-11天，使用MultiRad225 X射线辐照仪(RPS services)对小鼠进行2.5Gy辐照的亚致死辐照。在第-10天通过尾静脉注射表达GFP和萤火虫荧光素酶的人B-ALL细胞系BV173的4x 106个细胞。在第-1天建立白血病并通过生物发光成像(BLI)确定后，用TCR转导的PBMC处理小鼠，用T1、T3或靶向癌症睾丸抗原NY-ESO-1(1G4)的对照TCR进行转导(Rapoport etal.,Nature Medicine 21:914-921,2015)。另一组对照组小鼠没有接受任何T细胞注射。每日给小鼠腹腔内注射2500IU IL-2(R&D Systems)，并在不同时间间隔通过流式细胞术进行BLI成像(IVIS系统，PerkinElmer)和血液分析。为了进行存活分析，观察小鼠是否出现肿瘤扩散的临床体征，并且如果小鼠体重下降超过20％、出现驼背姿势、皮毛蓬乱或肢体瘫痪，则将其处死。实验在注射T细胞后两个月终止，以避免移植物抗宿主疾病的风险，并对治疗组中存活的小鼠进行人道处死。在一个实验队列中，我们在小鼠牺牲时收获了经T3治疗的存活小鼠的骨髓，并对其进行流式细胞术，以分析T细胞和肿瘤细胞的存在以及TdT和HLA-A2的表达。
患者来源的异种移植模型中的体内TdT TCR T细胞活性
建立原代人B-ALL异种移植小鼠，NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG；JacksonLaboratory stock 005557)。通过暴露于间隔4小时的两个剂量的1.65Gy(X射线源)对9-15周龄的小鼠进行亚致死性辐照。通过7AAD排除来鉴定来自HLA-A2pos B-ALL患者20O的活骨髓细胞，并且通过排除CD3+细胞在BD FACS Aria Fusion上对T细胞耗尽的骨髓细胞进行产量分选。在最后一次辐照剂量后4-6小时，经由NSG小鼠的尾静脉注射4×105个活的CD3阴性骨髓细胞。分别在移植后18-19天和20-26天，所有移植小鼠的PB分析和骨髓抽吸两者均证实了稳定的移植。
基于NSG小鼠的移植水平，将其分为未治疗组、DMF5组和T3 T细胞组，以使各治疗组的平均人白血病移植相当。在原代B-ALL细胞移植后22-25天，注射用DMF5TCR或T3 TCR转导的7.5×106mTCRβ+CD8+T细胞，并且所有组每只小鼠每日接受腹腔内(IP)2500IU IL-2(R&D Systems)。在输注T细胞后的3天和10天，在PB中对移植进行监测。在小鼠输注T细胞后11天终止小鼠，用人抗CD45、人抗CD8a、人抗CD4、人抗CD3、人抗CD19、人抗HLA-A2、人抗CD10和小鼠抗CD45、小鼠抗Ter119和小鼠抗TCRβ对骨髓、脾和PB进行详细的流式细胞术分析。对于BM样品的分析，根据NOPHO指南，所有小鼠获得至少1.8x 105个事件，并且除两只T3细胞治疗的小鼠外的所有小鼠获得至少3x 105个事件，以确定MRD水平。
用Sysmex血液细胞计数器对终止小鼠的骨髓(2个胫骨、2个股骨和2个嵴)和脾进行细胞计数。根据制造商的说明，将TrueCount珠粒(BD Biosciences)加入全PB，并进行小鼠CD45.1和人CD45染色，以确定每μL血液中MNC的绝对计数。
分别基于人CD45+CD19+CD10+和人CD45+CD3+CD8+mTCRβ+细胞的频率与总细胞计数的关系，对每个组织的白血病负荷和TCR转导的CD8+细胞进行定量。
人源化NSG小鼠体内T3细胞治疗对正常人造血作用的影响
稳定植入HLA-A2pos人脐带血细胞的NSG小鼠购自Jackson实验室。移植后21周在确认人移植后，终止三只小鼠。用1G4或T3 TCR构建体转导三只移植的NSG的小鼠脾的单细胞悬液，并按上述方法扩增。NSG衍生的1G4和T3细胞的活性通过对BV173细胞进行基于流式细胞术的细胞毒性测定在体外进行验证，平行进行输注至剩余的人源化NSG小鼠中。将107个NSG衍生的1G4或T3细胞经由尾静脉输注到移植的小鼠中，并在T细胞输注后17天在PB、脾、胸腺和骨髓中研究输注的细胞对正常造血作用的影响。由于移植小鼠还包含具有自分泌产生IL-2潜能的内源性脐带血来源的T细胞，因此一半的小鼠没有包括每日500IU IP剂量的IL-2的辅助性输注(因为在具有或不具有IL-2辅助性输注的情况下没有观察到差异，因此将这些组的数据汇总)。使用人抗CD45、人抗CD8a、人抗CD19、人抗CD33、人抗CD4、人抗CD3和小鼠抗CD45、小鼠抗Ter119和TCRβ进行流式细胞术，来监测输注的T细胞在PB中的持久性，并监测疗法对PB、脾、胸腺和骨髓中成熟血细胞系的影响。小鼠胸腺中的人T细胞祖细胞受到的影响是通过使用人抗TdT、人抗CD45、人抗CD8人抗CD19、人抗CD3(细胞内和表面)、人抗CD4、人抗HLA-A2和小鼠抗CD45进行表面和细胞内染色来研究的。用Sysmex血液细胞计数器对终止小鼠的骨髓(2个胫骨、2个股骨和2个嵴)进行细胞计数。
对正常造血祖细胞的克隆生成潜能的体外影响
经知情同意和伦理批准(EPN 2018/901-31)，从卡罗林斯卡大学医院(KarolinskaUniversity Hospital)收集的四名HLA-A2pos健康供体获得骨髓单核细胞。通过DAPI和成熟谱系排除来鉴定活的单个CD34+祖细胞，并在BD FACS Aria Fusion上进行分选。将250CD34+系-祖细胞与500CD4-CD19-(通过抗人CD4-PE-Cy5和抗人CD19-PE-Cy5鉴定，并在BD FACSAria Fusion上分选)1G4、T1或T3 TCR转导的T细胞在37℃、5％CO2下补充有以下的StemSpan SFEM(Stem cell technologies)中共培养：10％ BIT9500(Stem celltechnologies)、青霉素/链霉亲和素(100U/mL；Hyclone Laboratories)、2-巯基乙醇(2-ME；0.1mM；Sigma-Aldrich)、干细胞因子(SCF；10ng/mL)、flt3配体(FL；10ng/mL)、血小板生成素(TPO；10ng/mL)、白介素3(IL3；5ng/mL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF；10ng/mL)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；10ng/mL)、以及促红细胞生成素(EPO；1U/mL)。使用不含T细胞培养的CD34+系-祖细胞作为对照。
72小时后，将来自共培养物的细胞转移至Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM；Gibco)中的含有细胞因子的甲基纤维素(MethoCult H4434，StemCell Technologies)中，该培养基补充有20％胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich)、L-谷氨酰胺(2mM；Sigma Aldrich)、青霉素/链霉亲和素(100U/mL)和2-ME(0.1mM)，以允许菌落生成。在甲基纤维素中14天后，在倒置显微镜下对菌落进行评分，分为髓系或幼红细胞系(erythroid)。作为阳性对照，CD34+谱系-祖细胞在StemSpan SFEM中用1μM肽-1或肽-3外部地负载2h，随后在100nM肽存在下与或不与转导的T细胞共培养48h，如上所述，在将细胞转移至甲基纤维素后10天对集落进行评分。
统计分析
统计分析使用GraphPad Prism 6或7版(GraphPad软件)进行。在BLI信号分析中，采用了普通的单因素方差分析(ANOVA)检验，并通过图基(Tukey)后检验对多重比较进行了调整。存活分析通过对数秩(Mantel-Cox)检验进行。为了确定PDX和人源化NSG小鼠模型中体内治疗组之间的差异，通过邓肯(Dunn)多重比较检验和曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验进行了克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis)ANOVA。P<0.05被认为具有统计学意义。
结果
TCR T1和T3以HLA-A2受限的方式特异性识别TdT肽
将被鉴定为HLA-A2结合体的两种TdT衍生肽(肽-1(SEQ ID NO：1)和肽-3(SEQ IDNO：15))用于获得识别TdT蛋白的T细胞克隆。所分析的三个肽-1反应克隆的TCR序列相同，并被命名为T1，以及来自肽-3反应克隆的序列被命名为T3。
两种TCR都在第三方外周血(PB)CD8+T细胞中有效表达，如用pMHC多聚体或对引入至TCR中的小鼠恒定区有反应的抗小鼠TCR-β抗体染色所证明的(数据未示出)。用抗小鼠TCR-β染色呈阳性的所有T3转导的细胞和大多数T1转导的细胞也是pMHC多聚体阳性，这表明逆转录病毒转导后引入的TCRα和β链优先配对(数据未显示)。
T1和T3以高灵敏度识别其同源肽(T1 EC50＝5.8nM和T3 EC50＝1.2nM，图2A)。
用T1和T3 TCR转导的T细胞(下称T1和T3细胞)以HLA受限的方式识别抗原。T1和T3细胞被呈递外部负载的肽的HLA-A2pos EBV-LCL或来源于编码全长TdT的mRNA的内源性处理的抗原激活，但不被TdTpos HLA-A2neg EBV-LCL激活(图2B)。类似地，只有当引入HLA-A*02:01时，天然TdTpos但HLA-A2neg细胞系REH(B-ALL来源)和HPB-ALL(T-ALL来源)才激活T1和T3细胞。此外，当我们将T1和T3细胞与不同组织来源的大组人TdTneg细胞系共培养时，我们没有观察到任何TCR激活，除非天然或通过基因引入负载相关肽并表达HLA-A2(图2C)。这些结果示出，T1和T3 TCR不会与HLA-A2上呈递的或由细胞系表达的大量其他HLA分子上呈递的非预期靶标发生反应。
绘制TCR T1和T3反应性图谱并不能揭示交叉识别的肽
候选TCR的临床前测试应排除具有潜在临床意义的交叉反应。为此，我们采用了经验和计算机相结合的方法来确定潜在的脱靶毒性。我们首先合成了编码肽-1和肽-3的序列的肽模拟表位文库，其中每个位置处的氨基酸残基都被所有其他天然氨基酸逐一替换。T1和T3细胞与负载有相关文库中单个模拟表位的靶细胞结合。通过IFN-γ的产生或CD137的上调测量得到的T细胞活化是高度相关的(图3A)。接下来，我们通过应用ScanProsite工具(https://prosite.expasy.org/scanprosite/)查询并策划了人蛋白质组数据库UniProtKB/Swiss-Prot和蛋白数据库，以查找在T1或T3细胞中诱导反应性的所有aa置换的组合。搜索结果没有在人蛋白质组中发现与这些组合相匹配的任何天然存在的9-mer或11-mer肽。
当搜索非整合数据库UniProtKB/TrEMBL(其包含的条目数是UniProtKB/Swiss-Prot的大约261倍多)时，我们发现了来自小整体膜蛋白19的一个肽段(GLFMYAKRIFG)，与T3的反应性组合相匹配。然而，在功能性攻击中，这种肽并没有在T3细胞中诱导任何应答(未显示)。综上所述，数据未提供T1和T3的脱靶反应的证据。此外，在TdT蛋白序列中向肽-1和肽-3序列上游和/或下游转移的肽不能激活T1和T3细胞(图3B-C)，除非使用涵盖整个同源肽序列的较长变体。此外，肽-1无法激活T3细胞，而肽-3只有在高浓度时才能激活T1细胞，这可能是由于肽-3在培养过程中分解生成了肽-1。
T1和T3在小鼠模型中介导弥散性白血病的排斥反应
接下来，我们研究了T1和T3细胞能否杀死天然表达TdT的白血病细胞系。T1和T3细胞对B细胞白血病细胞系BV173和NALM-6(天然TdTpos和HLA-A2pos)有强烈反应，如通过IFN-γ的产生、增殖和杀伤(在效应物与靶标低比率(E:T＝1:1)下为96％-99％)所测量的图4A-B)。
为了研究体内功效，我们将BV173ffluc-eGFP细胞移植到NOD-scid IL2Rgnull(NSG)小鼠中，并在白血病建立后开始用T1或T3细胞进行治疗。在第21天(BV173，图5A、B)和第14天(NALM-6，图5D、E)，在这些小鼠中观察到非常低的(T1)肿瘤信号或没有(T3)肿瘤信号，之后不久，由于高肿瘤负荷，不得不处死未处理和1G4处理的对照小鼠(针对NY-ESO-1的对照TCR)(图5C、F)。值得注意的是，在注射白血病细胞后的观察期内，用T3细胞治疗的小鼠中没有一只死于白血病(图5C、F)。在NALM-6模型中，两只经T3细胞治疗的小鼠因不明原因死亡，与白血病扩散无关。在NALM-6模型中，经T3细胞治疗的小鼠在第57天的生物发光成像(BLI)仍为阴性，这与牺牲小鼠骨髓中没有肿瘤的情况一致(未示出)。只有五分之一的T3治疗的BV173小鼠在处死后骨髓中具有GFP+肿瘤细胞(图5G)。对照组1G4 TCR转导的T细胞最初也会扩增，这可能是由于注射了IL-2。用T1细胞治疗的BV173小鼠的存活益处也高度显著(图5C)，但这些小鼠中的一些最终死于肿瘤，这与与T3相比T1的肽敏感性更低相一致。
T1和T3消除B-ALL和T-ALL的原发性胚细胞，但保留正常淋巴细胞和非谱系定向造血祖细胞
接下来，我们对T1和T3细胞在包含正常B细胞和T细胞以及非谱系定向造血祖细胞的样品中选择性识别人原发性ALL细胞的能力进行了量化。将来自9名B-ALL和3名T-ALL患者的冷冻保存的TdTpos和HLA-A2pos诊断样品与T1或T3细胞共培养，这些样品包含不同比例的白血病胚细胞、正常B细胞和T细胞以及正常CD34+造血祖细胞(CD34+lin-)。共培养48-72小时后，T3细胞平均消除97％的白血病胚细胞，以及T1细胞平均消除69％的白血病胚细胞(T3：平均97％，范围92％-99.9％；T1：平均69％，范围13％-96％，n＝12)。与之相比，正常的B细胞和T细胞未受影响(图6A-B)，在四名患者中检测到的非癌性CD34+lin-细胞也未受影响(图6A)。
我们接下来示出，将T3引入至HLA-A2pos TdTpos B-ALL患者的正常T细胞中导致T细胞活化并消除几乎所有的自体肿瘤细胞(图7A)。正常的B、T和CD34+lin-祖细胞得以保留(图7A-B)。总之，这些数据表明，T1和T3细胞针对具有代表性TdT和HLA-A2表达的原发性白血病细胞具有高度的靶向选择性和治疗功效。
进一步研究示出T3细胞在体内有效消除原发性B-ALL细胞，同时保留健康的造血作用
接下来，我们研究了T3细胞治疗稳定移植有来源于原发性B-ALL白血病患者的细胞的NSG小鼠的功效。未处理的小鼠和用对照MART-1(DMF5)(Johnson et al.,J.Immunol.177,6548-6559,2006)或T3 TCR转导的T细胞处理的小鼠在基线处在骨髓中示出高且可比的白血病负荷(未处理的平均值9.7±3.4％，DMF5平均值15.6±5.7％，T3平均值15.4±7.2％)，这代表了测试治疗功效的严格条件。我们使用的T细胞与HLA-A2表达相匹配，但在其他方面与ALL的HLA不匹配。输注的T细胞主要包含幼稚和中央记忆T细胞，并且平均34％的CD4+T细胞，类似于促进过继T细胞疗法中抗肿瘤反应性的临床产品。然而，大部分的幼稚T细胞也会驱动同种异体反应，与待处理小鼠中与T细胞的HLA不匹配的白血病细胞的高负荷存在也会驱动同种异体反应。因此，我们通过比较DMF5(对照TCR)处理小鼠相对于未处理小鼠血液中的白血病吞噬情况，来监测小鼠是否可能出现移植物抗白血病效应，以便在结果受到显著异体反应的干扰之前进行详细的终末阶段分析，同种异体反应在处理10-11天后观察到。在该实验终点，对照小鼠组的白血病负荷非常高，并且在骨髓中具有可比性(未经处理平均42.9±3.4％，DMF5平均40.1±4.5％)，而在用T3细胞治疗后，白血病负荷降低至0.009±0.005％(图8A-D)。
未经处理和经DMF5细胞处理的小鼠中外周血和脾中的白血病负荷低于骨髓中的白血病负荷。然而，在使用T3细胞治疗的小鼠中也观察到了类似的几乎完全消除白血病细胞(PB：平均0.003±0.001％；脾：平均0.002±0.001％)(数据未示出)。总之，根据NOPHO-2008方案(NCT00816049)设定的标准，白血病负荷降至最低残留疾病(MRD)认为的阴性水平(<0.1％)。在所有小鼠的骨髓、PB和脾中都检测到了TCR转导的T细胞(未示出)。在具有白血病移植的小鼠骨髓中受到抑制的小鼠造血作用，在T3小鼠中显著高于DMF5小鼠(未显示)。
正常的外周B细胞和T细胞库是TdT阴性的，并且在体外杀伤测定或转导的细胞的扩增过程中不受T3或T1 TCR的影响(参加例如图6B)。使用追溯性14C测日期法测量正常个体中幼稚T细胞稳态的研究支持这样一种观点，即幼稚T细胞库将足够多样化，即使在年轻个体中也能终身维持外周适应性T细胞免疫，并且，并且即使在长期疗法中，对胸腺细胞的潜在毒性影响也不会成为主要问题。然而，低于20岁的个体中胸腺对外周库的贡献较高，因此提高了该年龄组中毒性更高的可能性。为了解决这个问题，我们研究了人胸腺细胞分化过程中TdT和HLA-A2的表达。有趣的是，我们发现HLA-A2仅在TdTneg胸腺细胞上高表达，包括早期双阴性(DN)和单阳性(SP)细胞，而在向双阳性(DP)细胞过渡的晚期DN细胞上，HLA-A2表达下调同时TdT上调(数据未示出)。
接下来，我们探讨了T3细胞疗法对人源化CD34+NSG小鼠中的胸腺细胞的影响，这些小鼠注射了从小鼠脾收获的T3或1G4转导的自体人T细胞。T3细胞在注射前被证明在体外有效杀死TdTpos细胞系(未显示)。在实验结束时，T3和1G4处理的小鼠中TdTpos胸腺细胞的部分相似。在两个实验组中，与表面CD3+TdTneg胸腺细胞相比，TdTpos胸腺细胞上的HLA-A2水平同样低(未示出)。相应地，在两组中，只有由小鼠胸腺中的脐带血祖细胞补充的小部分人胸腺细胞是TdT高和HLA-A2高，这也在来源于人胸腺的胸腺细胞中观察到(未显示)。实验于T细胞注射后第17天结束，此时PB中仍可检测到TCR转导的T细胞，而PB中1G4转导的T细胞部分比T3转导的T细胞下降得更快，这可能表明T3 T细胞受到了低水平的抗原刺激(未示出)。在分析人髓系和淋巴谱系在PB、骨髓、脾和胸腺中的分布以及骨髓中的细胞时，未观察到1G4组和T3组之间存在差异(未示出)。进一步支持了造血干细胞和髓系祖细胞缺乏毒性，在与T1或T3细胞共培养后，由成人CD34+骨髓祖细胞形成髓系和幼红细胞系集落不会受到负面影响，除非在肽1或3存在下进行共培养(未示出)。
结论
我们的研究示出，在同种异种HLA-A2的背景下，用来自新癌症靶向TdT的TCR识别肽转导的T细胞在体外有效地杀死了B和T细胞的TdTposHLA-A2pos患者来源的淋巴细胞白血病细胞。TdT TCR在杀死大量的TdTpos ALL细胞系以及原发性ALL细胞方面是高效的。此外，TdT TCR在三种不同的B-ALL小鼠模型中介导体内移植白血病的耗竭。我们的数据进一步表明，TCR可以用于治疗，没有有害毒性。
我们进一步生成了本文未呈现的数据，其中通过对TdT敲除或HLA-A2缺失的TdTpos白血病细胞的反应性损失来证实TdT肽和HLA-A2限制的特异性，并通过质谱直接鉴定由原发性白血病细胞的HLA呈递的同源肽。其为TdTneg的多种HLA-A2pos细胞系未被识别，并且TCR反应性的图谱未鉴定出人蛋白质组中与T1或T3反应的置换肽的组合匹配的任何天然存在的9-聚体或11-聚体肽。总之，表明TdT TCR的高效性和特异性的数据与TdT的独特表达谱相结合，为包括在目前预后不佳的患者群体中的TdTpos急性白血病的治疗开辟了新的可能性。
序列列表中的序列描述

Claims (26)

1.一种结合蛋白，所述结合蛋白能够与呈递具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列ALYDKTKRIFL的肽的人白细胞抗原(HLA)复合物A2型特异性结合；
其中，所述蛋白包括含有α链可变结构域和β链可变结构域的抗原结合单元；
其中，所述α链可变结构域包括三个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，其分别包括SEQ ID NO:16、17和18所示的氨基酸序列；以及
所述β链可变结构域包括三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，其分别包括SEQ ID NO:19、20和21所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中：
所述α链可变结构域包括SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
所述β链可变结构域包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
3.一种结合蛋白，所述结合蛋白能够与呈递具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列ALYDKTKRI的肽的人白细胞抗原(HLA)复合物A2型特异性结合；
其中，所述蛋白包括含有α链可变结构域和β链可变结构域的抗原结合单元；
其中，所述α链可变结构域包括三个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，其分别包括SEQ ID NO:2、3和4所示的氨基酸序列；以及
所述β链可变结构域包括三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，其分别包括SEQ ID NO:5、6和7所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的结合蛋白，其中：
所述α链可变结构域包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
所述β链可变结构域包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的结合蛋白，其中，所述结合蛋白包括含有所述α链可变结构域的第一链和含有所述β链可变结构域的第二链。
6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中，所述第一链进一步包括细胞外α链恒定结构域，以及所述第二链进一步包括细胞外β链恒定结构域。
7.根据权利要求6所述的结合蛋白，其中，所述细胞外α链恒定结构域包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸；
以及所述细胞外β链恒定结构域包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的结合蛋白，其中，所述第一链和/或所述第二链进一步包括跨膜结构域。
9.根据权利要求8所述的结合蛋白，其中，所述第一链和/或所述第二链进一步包括细胞质结构域。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的结合蛋白，其中：
(a)所述第一链是包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的α链，以及所述第二链式是包括SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的β链；或者
(b)所述第一链是包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的α链，以及所述第二链式是包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的β链。
11.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子编码权利要求1至10中任一项所限定的结合蛋白。
12.根据权利要求11所述的重组核酸分子，其中，所述核酸分子包括cDNA分子。
13.根据权利要求11或12所述的重组核酸分子，其中，所述核酸分子编码包括与第二链连接的第一链的多肽，优选地其中，所述第一链通过自剪接接头与所述第二链连接。
14.根据权利要求13所述的重组核酸分子，其中，所述自剪接接头是包括以下的2A肽：SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或与其具有至少50％序列同一性的氨基酸序列。
15.一种载体，所述载体包括权利要求11至14中任一项所述的重组核酸分子。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包括编码结合蛋白的第一链的第一核酸分子和编码结合蛋白的第二链的第二核酸分子，其中：
(i)所述第一链和所述第二链分别包括权利要求1或2所限定的α链可变结构域和β链可变结构域；或者
(ii)所述第一链和所述第二链分别包括权利要求3或4所限定的α链可变结构域和β链可变结构域。
17.一种细胞，所述细胞包括权利要求11至14中任一项所限定的重组核酸分子、权利要求15所限定的载体或权利要求16所限定的重组核酸分子对，并在其细胞膜中表达权利要求1至10中任一项所限定的结合蛋白。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中，所述细胞是免疫效应细胞或其前体。
19.根据权利要求17或18所述的免疫效应细胞，其中，所述细胞为T细胞或自然杀伤细胞，或其前体，或其中，所述细胞为干细胞。
20.根据权利要求19所述的免疫效应细胞，其中，所述细胞是辅助性T细胞或细胞毒性T细胞。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求17至20中任一项所限定的细胞。
22.一种权利要求17至20中任一项所限定的细胞或权利要求21所限定的药物组合物，用于治疗的用途。
23.一种权利要求17至20中任一项所限定的细胞或权利要求21所限定的药物组合物，用于治疗癌症的用途，其中，所述癌症表达末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。
24.根据权利要求23所述用途的细胞，其中，所述癌症是急性淋巴细胞白血病，优选是T细胞来源或B细胞来源的急性淋巴细胞白血病。
25.一种生成对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)具有特异性的细胞的方法，所述方法包括将权利要求11至14中任何一项所限定的重组核酸分子、权利要求15所限定的载体或权利要求16所限定的重组核酸分子对引入至所述细胞中。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述细胞为T细胞或NK细胞，或者其前体，优选其中，所述T细胞为辅助性T细胞或细胞毒性T细胞。
CN202280074706.5A 2021-09-21 2022-09-20 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的结合蛋白 Pending CN118215498A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB2113437.4 2021-09-21
GB202113437 2021-09-21
PCT/GB2022/052368 WO2023047089A1 (en) 2021-09-21 2022-09-20 Binding proteins for terminal deoxynucleotidyl transferase (tdt)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118215498A true CN118215498A (zh) 2024-06-18

Family

ID=83558073

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280074706.5A Pending CN118215498A (zh) 2021-09-21 2022-09-20 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的结合蛋白

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4404956A1 (zh)
JP (1) JP2024534537A (zh)
CN (1) CN118215498A (zh)
WO (1) WO2023047089A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023212674A2 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Baylor College Of Medicine Tdt-specific chimeric receptors and methods of their use

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6416971B1 (en) 1990-05-15 2002-07-09 E.R. Squibb & Sons, Inc. Soluble single chain T cell receptors
WO1996018105A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 The President And Fellows Of Harvard College Single chain t-cell receptor
IL127142A0 (en) 1998-11-19 1999-09-22 Yeda Res & Dev Immune cells having predefined biological specificity
ES2348868T3 (es) 2002-12-13 2010-12-16 Genetix Pharmaceuticals Inc. Vectores retrovirales terapeuticos para terapia genica.
GB0721686D0 (en) * 2007-11-05 2007-12-12 Medinnova As Polypeptides
WO2014037422A1 (en) 2012-09-04 2014-03-13 Inven2 As Selective and controlled expansion of educated nk cells
GB201501175D0 (en) 2015-01-23 2015-03-11 Univ Oslo Hf A universal T-cell for personalised medicine
US10357550B2 (en) 2016-04-06 2019-07-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides as targets or active ingredients for use in immunotherapy against AML and other cancers
EP3565565A4 (en) 2017-01-04 2020-12-09 Nova Southeastern University NATURAL KILLER CELLS (NK) FOR THE EXPRESSION OF AN ANTIGENS-SPECIFIC FUNCTIONAL T-CELL RECEPTOR (TCR) COMPLEX, METHOD FOR MANUFACTURING THEREOF AND METHOD FOR THERAPEUTIC USE THEREOF
GB201803178D0 (en) 2018-02-27 2018-04-11 Univ Oslo Hf Specific binding molecules for htert

Also Published As

Publication number Publication date
EP4404956A1 (en) 2024-07-31
JP2024534537A (ja) 2024-09-20
WO2023047089A1 (en) 2023-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12103957B2 (en) Nyeso tcr
US20230159612A1 (en) Mage a4 t cell receptors
WO2021042072A1 (en) Methods and compositions for the modification and delivery of lymphocytes
US10869911B2 (en) Chimeric protein
EP4114400A1 (en) Methods and compositions for the delivery of modified lymphocyte aggregates
CN118215498A (zh) 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的结合蛋白
TWI843716B (zh) hTERT特異性結合分子
KR20240111754A (ko) 키메라 어댑터 폴리펩티드
CA3107680A1 (en) Ha-1 specific t cell receptors and their use
WO2023175069A1 (en) Tcr constant region pairing library for pramevld tcrs
JP2024541976A (ja) キメラアダプターポリペプチド
EA048001B1 (ru) T-клеточные рецепторы, специфичные к mage-a4
NZ735850B2 (en) Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination