CN111405909A - 基于gp96的癌症疗法 - Google Patents

Abstract

本公开尤其涉及用于治疗包括肺癌(例如，非小细胞肺癌)的癌症的组合物和方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用：(a)带有表达载体的细胞，所述表达载体包含编码可分泌的疫苗蛋白的核苷酸序列，和(b)免疫检查点抑制剂。

Description

基于GP96的癌症疗法

技术领域

本公开涉及用于治疗包括肺癌(例如，非小细胞肺癌)在内的癌症的组合物和方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2017年11月27日的美国临时专利申请号62/590,785和提交于2018年2月27日的美国临时专利申请号62/635,958的优先权和权益，其全部内容在此以引用的方式整体并入本文。

以电子方式提交的文本文件的说明

以电子方式提交的文本文件的内容与此一道以引用的方式整体并入本文。序列表的计算机可读格式副本(文件名：HTB-027PC_Sequence Listing_ST25；记录日期：2018年10月23日；文件大小：18.8KB)。

背景

癌症是世界性的重大健康问题。尽管近来在癌症的检测和治疗方面取得了进展，但目前尚无疫苗或其他普遍成功的预防或治疗方法。目前的疗法，通常是基于化疗或手术和放疗的组合，在许多患者中仍然被证明是不够的。

肺癌是美国癌症死亡的主要原因，每年导致超过140万人死亡。早期检测是困难的，因为临床症状会延迟，直到疾病已达到晚期。目前的诊断方法包括胸部X光检查和痰中所含细胞类型的分析以及支气管通道的纤维化检查。治疗方案取决于癌症的类型和阶段，并且包括手术、放疗和/或化疗。尽管对肺癌和其他癌症的疗法进行了大量的研究，但是肺癌仍然难以有效地诊断和治疗。

因此，在本领域中需要用于治疗和预防患者的癌症(特别是肺癌)复发的改进方法。本公开满足这些需要并且进一步提供其他相关优点。

发明内容

在一些方面，本公开涉及使用基于细胞的含gp96的疫苗来活化CD8+T细胞以将“冷”肿瘤转变成“热”肿瘤(例如，肺肿瘤)的方法。因此，在各个方面，本方法提供了肿瘤T细胞调节，使得肿瘤(例如，肺肿瘤)更易受抗肿瘤疗法(例如，检查点抑制疗法)的影响。因此，在各个实施方案中，本方法提供了对检查点抑制剂有应答的患者百分比的扩大或对检查点抑制无应答的患者向应答者的转化(例如作为辅助治疗或新辅助治疗)。

在本公开方法的一个方面中，治疗肺癌包括向有此需要的受试者施用：(a)带有表达载体的细胞，所述表达载体包含编码可分泌的疫苗蛋白的核苷酸序列，及(b)免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂抑制免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述抗PD-1或PD-L1抗体或其抗原结合片段是纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(atezolizumab)或阿维鲁单抗(avelumab)。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体选自纳武单抗和帕博利珠单抗。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。

在本公开的方法的一些实施方案中，所述肺癌是小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述肺癌是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述非小细胞肺癌是腺癌。在一些实施方案中，所述非小细胞肺癌是鳞状细胞癌或大细胞肺癌。

在本公开方法的一些实施方案中，所述方法减少肺癌的复发。在一些实施方案中，所述方法增加受试者中肿瘤抗原特异性T细胞的活化或增殖。在一些实施方案中，所述方法增加受试者中分泌IFN-γ的CD8+T细胞的活化或数量。

在实施方案中，本方法包括特定的治疗方案，诸如，举例来说，每周一次剂量的HS-110持续至少16周和每两周一次剂量的的抗PD-1抗体持续至少16周，或每周一次剂量的HS-110持续至少6周和每两周一次剂量的抗PD-1抗体持续至少6周。在实施方案中，本方法在不能对抗PD-1抗体的单药疗法令人满意地应答的患者群体中有效，诸如PD-L1^阴性或PD-L1^低的患者或肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)低状态(TIL^低)的患者。

在一些实施方案中，所述受试者在施用后表现出免疫应答的强劲增强。在一些实施方案中，免疫应答的强劲增强被定义为CD8+T细胞的活化或增殖比基线高至少2倍的增加。在一些实施方案中，CD8+T细胞分泌IFN-γ。在一些实施方案中，所述方法在减少所述受试者的肺癌复发方面，比对未表现出免疫应答的强劲增强的受试者更有效。在一些实施方案中，所述受试者在施用前表现出少量的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，所述方法在减少受试者的癌症复发或进展方面，与仅用所述免疫检查点抑制剂的治疗相比更有效。

在本公开方法的一些方面，所述载体是哺乳动物表达载体。在一些实施方案中，所述疫苗蛋白是可分泌的gp96-Ig融合蛋白，所述融合蛋白任选地缺少gp96KDEL(SEQ ID NO:3)序列。在一些实施方案中，所述gp96-Ig融合蛋白中的Ig标签包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA或IgE的Fc区。在一些实施方案中，所述表达载体包含DNA。在一些实施方案中，所述表达载体包含RNA。

在一些实施方案中，所述细胞是人肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞是经照射的或活的和减毒的人肿瘤细胞。在一些实施方案中，人肿瘤细胞是来自已建立的NSCLC、膀胱癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、前列腺癌、肉瘤、乳腺癌、鳞状细胞癌、头颈癌、肝细胞癌、胰腺癌或结肠癌细胞系的细胞。在一些实施方案中，所述人肿瘤细胞系是NSCLC细胞系。

在一些实施方案中，在施用(a)带有表达载体的细胞(所述表达载体包含编码可分泌的疫苗蛋白的核苷酸序列)之前，并且在施用(b)免疫检查点抑制剂之前，所述受试者在接受疗法后经历了疾病进展。在一些实施方案中，所述疗法是免疫检查点抑制剂疗法。在一些实施方案中，所述疗法包括化疗。在一些实施方案中，所述受试者是免疫检查点抑制剂疗法的不良应答者。在一些实施方案中，所述受试者的免疫检查点抑制剂疗法失败。在一些实施方案中，即使施用所述免疫检查点抑制剂疗法，所述受试者的所述疾病也已经进展。

在实施方案中，所述患者在接受疗法后经历了疾病进展。在实施方案中，所述疗法是免疫检查点抑制剂疗法。在实施方案中，所述疗法包括化疗。在实施方案中，所述患者是所述免疫检查点抑制剂疗法的不良应答者。在实施方案中，所述患者的所述免疫检查点抑制剂疗法失败。在实施方案中，即使施用所述免疫检查点抑制剂疗法，所述患者的所述疾病也已经进展。

附图说明

图1A是非限制性示意图，示出了在非小细胞肺癌患者中Viagenpumatucel-L(HS-110)与多种治疗方案组合的1b/2期研究(“DURGA”试验)。图1B是HS110-102DURGA试验患者群体的概况，且图1C是DURGA试验设计的概况。

图2是示出了临床试验设计的非限制性示意图。简言之，对晚期且先前治疗过的肺癌患者采用每周一次的viagenpumatucel-L(HS-110)治疗持续18周和每2周一次的3mg/kg纳武单抗治疗直到疾病进展或死亡。测试基线和第10周的活检组织中肿瘤细胞上的CD8+TIL和PD-L1的表达水平。在第1、4、7、13周和HS-110治疗结束时，使用酶联免疫斑点(ELISPOT)测定分析外周血的免疫应答。

图3A是意向治疗(ITT)、符合方案(PP)和完成者群体中初步功效分析的总结。图3B是表格，示出了对于未曾使用过检查点抑制剂(CPI)的ITT患者的5种RECIST应答(RECIST1.1)(左列)；(CR＝完全应答；PR＝部分应答；SD＝疾病稳定；PD＝疾病进展；NE＝无法评估)、CPI ITT患者的数量(中列)和客观应答率(ORR)的百分比。

图4是条形图，示出了在符合方案群体中基于RECIST 1.1的最佳靶病变应答。条形图示出了所有可评估的ITT患者(队列A)的基线和治疗中扫描(n＝38)。

图5是线图，示出了在符合方案(PP)群体(队列A)中靶病变应答的持久性。

图6是生存图，示出了ITT患者群体(队列A)中的总体生存百分比数据。

图7是生存图，示出了完成者群体(队列A)中生存随着治疗持续时间而改善的趋势。顶部曲线是16+个剂量，而底部曲线<16个剂量。

图8是生存图，示出了对于未曾使用过检查点抑制剂(CPI)的群体(队列A)，高TIL(>10％)患者和低TIL(≤10％)患者基于基线时肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)水平的总体生存百分比。第800天的顶部曲线为低TIL，而底部曲线为高TIL。

图9A和图9B是示出了在未曾使用过CPI的ITT群体中的无进展生存期(PFS)(图9A；队列A)，和在未曾使用过CPI的ITT群体中基于基线时TIL水平的无进展生存期(图9B；队列A)的图。在图9A中，平均PFS(mPFS)为58天，而1年PFS为23.9％。在图9B中，低TIL的1年PFS为31.7％，而高TIL的1年PFS为10.6％。在图9B中，第400天的顶部曲线是低TIL，而底部曲线是高TIL。

图10A-B是一对条形图，示出了在未曾使用过CPI的符合方案群体(队列A)中基于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)状态的最佳靶病变应答。图10A示出了在≤10％CD8+TIL中相对于基线的变化，而图10B示出了在>10％CD8+TIL中相对于基线的变化。

图11示出了两个线图，描绘了在符合方案群体(队列A)中基于TIL状态的靶病变应答的持久性。在图11中，“高”应答由虚线表示，而“低”应答由实线表示。

图12是一对条形图，示出了基于PD-L1状态(队列A)的最佳靶病变应答。图12的右图示出了在符合方案群体中在>1％PD-L1肿瘤类型中相对于基线的变化。图12的左图示出了在符合方案群体中在<1％PD-L1肿瘤类型中相对于基线的变化。

图13是一对线图，示出了在符合方案群体中(队列A)基于PD-L1状态的靶病变应答的持久性。图13示出了在>1％PD-L1肿瘤类型中相对于基线的变化，并且示出了在<1％PD-L1肿瘤类型中相对于基线的变化。在图13中，“(-)ive”应答由虚线表示，而“(+)ive”应答由实线表示。

图14是条形图，示出了对于最佳靶病变应答活性的完成者分析(队列A)。其描述了每位完成viagenpumatucel-L研究治疗的患者，并绘制了基于RECIST 1.1的从基线到其最佳评估的肿瘤病变大小的变化百分比。点状虚线代表疾病进展(PD，最长直径的总和[SLD]增加>20％)、疾病稳定(SD，SLD的增加<20％且减少<30％)和部分应答(PR，SLD减少>30％)的RECIST 1.1截止值。阳性ELISPOT应答被确定为δ-INF驱动的活性与基线相比增加≥2倍。

图15是示出了ELISPOT活性和生存期的图(队列A)。高＝ELISPOT活性高于测试患者的中位数。低＝ELISPOT活性低于测试患者的中位数。

图16是示出了与长期和总体生存期相关的ELISPOT应答的图(队列A)。将α概率设置为0.1时，用全细胞HS110疫苗裂解物刺激患者PBMC产生的ELISPOT点的数量与治疗中患者的总体生存期显著相关(p＝0.06)。

图17A和图17B是示出了经历了无进展生存期(PFS)(图17A)或经历了总体生存期(OS)(图17B)的未曾使用过CPI的患者基于PD-L1基线水平的百分比(队列A)。在图17A中，在第200天，顶部曲线(实线)为PD-L1且底部曲线(虚线)为PD-L1。在图17B中，在第414天，顶部曲线(虚线)为PD-L1-且底部曲线(实线)为PD-L1+。

图18是生存图，示出了在无进展生存(PFS)的ITT患者群体中的总体生存百分比数据(队列B)。在此患者群体中，患者先前曾接受过CPI疗法，但是，疾病在6个月或更长时间后进展。“删失”是指失访的患者，这是一种公认的数据管理工具。

图19是表格，示出了对于检查点抑制剂(CPI)进展性ITT患者的5种RECIST应答(RECIST 1.1)(左列)；(CR＝完全应答；PR＝部分应答；SD＝疾病稳定；PD＝疾病进展；NE＝无法评估)、CPI ITT患者的数量(中列)和客观应答率(ORR)的百分比(队列B)。

图20是条形图，示出了检查点抑制剂(CPI)进展性ITT患者的最佳靶病变应答活性(队列B)。

图21是线图，示出了CPI进展性ITT患者群体的靶病变应答的持久性(队列B)。

图22示出了两个条形图，描绘了在检查点抑制剂(CPI)进展性群体中基于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)状态的最佳靶病变应答(队列B)。图22左侧的条形图示出了在≤10％CD8+TIL(低TIL)中相对于基线的变化，且图22右侧的条形图示出了在>10％CD8+TIL(高TIL)中相对于基线的变化。

图23示出了两个线图，描绘了在CPI进展性群体中基于TIL水平的靶病变应答的持久性(队列B)。在图23中，“高”应答由虚线表示，而“低”应答由实线表示。

图24示出了两个条形图，描绘了在CPI进展性群体中基于PD-L1状态的最佳靶病变应答(队列B)。图24左侧的条形图示出了对于CPI进展性群体在<1％PD-L1肿瘤类型中相对于基线的变化。图24右侧的条形图示出了对于CPI进展性群体在≥1％PD-L1肿瘤类型中相对于基线的变化。

图25是一对线图，示出了在CPI进展性群体中基于PD-L1状态的靶病变应答的持久性(队列B)。图25示出了在>1％PD-L1肿瘤类型中相对于基线的变化，且示出了在<1％PD-L1肿瘤类型中相对于基线的变化。在图25中，“(-)ive”应答由虚线表示，而“(+)ive”应答由实线表示。

具体实施方式

本公开基于以下发现：涉及低剂量的表达修饰的和可分泌的热休克蛋白(即，gp96-Ig)的细胞系和免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体或其抗原结合片段)的组合疫苗疗法对于治疗包括非小细胞肺癌(NSCLC)在内的肺癌特别有效。在一些实施方案中，本发明方法协同激活针对肿瘤细胞的免疫应答，从而导致减少的肺癌复发和改善的生存。

(NSCLC)患者可能会以多种方式发生免疫抑制，诸如激活肿瘤微环境中的检查点途径。抗PD-1单克隆抗体等破坏检查点分子信号的药物会对免疫系统释放这一阻碍。PD-1的配体PD-L1的肿瘤表达在患者对检查点抑制剂的应答中发挥重要作用；通常，对检查点抑制剂的临床应答需要PD-L1的肿瘤表达和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的存在。

Viagenpumatucel-L是一种专有的同种异体肿瘤细胞疫苗，其表达具有潜在抗肿瘤活性的重组分泌形式的热休克蛋白gp96融合物(gp96-Ig)。施用viagenpumatucel-L后，经照射的活的肿瘤细胞会连续地将gp96-Ig及其伴随的肿瘤相关抗原(TAA)分泌到皮肤的真皮层，从而活化抗原呈递细胞、自然杀伤细胞并启动有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对内源性肿瘤细胞上存在的TAA的应答。此外，Viagenpumatucel-L诱导可以对抗复发的癌细胞的长寿记忆T细胞。

本发明涉及以下发现：Viagenpumatucel-L与抗PD-1剂的共同施用提高了疫苗的抗肿瘤活性，同时延长或增强了检查点抑制剂的功效，产生协同效应。即使在具有低PD-L1状态(例如，其肿瘤未表现出高水平的PD-L1(PD-L1^高，而是PD-L1^阴性或PD-L1^低，如本文所述)的患者中也观察到这种惊人的效果。也就是说，VIAGENPUMATUCEL-L组合物的添加令人惊讶地甚至使通常不接受抗PD-1抗体治疗的患者也表现出临床益处。

此外，如本文更充分地描述，患有“冷”肿瘤(例如，含有少量CD8+TIL)的患者通常对抗PD-1抗体不是非常有应答性，通常对仅使用纳武单抗表现出约10％的应答率；参见Teng等，Cancer Research75(11)：2015年6月1日。然而，无论患者的TIL状态如何，本文概述的组合疗法惊人地同样有效，表明Viagenpumatucel-L在TIL^低患者中扩大了抗PD-1的治疗功效。

因此，本发明提供了Viagenpumatucel-L与抗PD-1抗体的组合疗法以治疗NSCLC患者。

本发明提供了通过与抗PD-1抗体组合共同施用Viagenpumatucel-L来治疗癌症特别是非小细胞肺癌(“NSCLC”)的方法。如本领域技术人员将理解的，在此上下文中，“共同施用”是指患者在治疗的时间进程中接受Viagenpumatucel-L的剂量以及抗PD-1抗体的剂量。通常，这些疗法是通过单独的施用途径而不是作为混合物递送给患者，特别是因为抗PD-1抗体的递送频率通常低于Viagenpumatucel-L的给药。

本发明提供了Viagenpumatucel-L与抗PD-1抗体的组合。Viagenpumatucel-L(在本文中有时也称为“HS-110”)是一种细胞组合物，其包含编码本文所述的融合蛋白gp96-Ig的载体。热休克蛋白(hsp)gp96充当肽通往抗原呈递细胞或树突状细胞上表达的MHC I类分子的途中的伴侣。从肿瘤细胞处获得并用作疫苗的Gp96可以诱导特异性肿瘤免疫，大概是通过将肿瘤特异性肽转运至抗原呈递细胞(APC)来实现的(J Immunol 1999，163(10)：5178-5182)。例如，在摄取清道夫受体(CD91)后，gp96相关肽通过树突状细胞(DC)交叉呈递至CD8细胞。

因此，本发明提供了包含编码gp-96-Ig融合蛋白的载体的细胞。

本发明的Viagenpumatucel-L组合物包含编码gp-96-Ig融合蛋白的载体。因此，本文提供的载体包含编码gp96-Ig融合蛋白的核苷酸序列。人gp96的编码区的长度为2,412个碱基(SEQ ID NO:1)，并且编码803个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO:2)，该蛋白包括在其氨基末端处的一个21个氨基酸的信号肽、一个富含疏水残基的潜在跨膜区和在其羧基末端处的一个ER保留肽序列(GENBANK登录号X15187；参见Maki等，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87：5658-5562)。

编码人gp96基因的示例性核酸序列、KDEL缺失和核苷酸序列示于SEQ ID NO:4中。另外，如本文所述，gp96的最后4个氨基酸“KDEL”如本文所述缺失。KDEL是通常用作内质网驻留伴侣肽的保留序列，并且本发明依赖于本文所讨论的可分泌的gp96融合蛋白。

在一些实施方案中，gp96-Ig融合蛋白的gp96部分可包含野生型gp96序列(例如，SEQ ID NO:2中所示的人序列)的全部或一部分。例如，可分泌的gp96-Ig融合蛋白可以包含SEQ ID NO:2的前799个氨基酸，以使得它缺少C端KDEL(SEQ ID NO:3；没有内质网保留序列的氨基酸序列示为SEQ ID NO:4)。

另外，与野生型gp96序列的前799个氨基酸相比，融合蛋白的gp96部分可以具有包含一个或多个取代、缺失或添加的氨基酸序列，以使得其与野生型多肽具有至少90％(例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％)的序列同一性。

相对于蛋白质序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列及(如有必要)引入缺口以实现最大的序列同一性百分比之后并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，在候选序列中的氨基酸残基与特定(亲代)序列中的氨基酸残基相同的百分比。。为了测定氨基酸序列同一性百分比而进行的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现，比如，使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。一种特定的程序是美国公布号20160244525的第[0279]段至第[0280]段中概述的ALIGN-2程序，该美国公布通过引用的方式并入本文。用于核酸序列的另一种近似比对是由Smith和Waterman的局部同源性算法,Advances inApplied Mathematics,2:482-489(1981)提供。此算法可以通过使用由Dayhoff,Atlas ofProtein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff编,第5增刊3:353-358,NationalBiomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA开发的评分矩阵被应用到氨基酸序列，并通过Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)进行标准化。

用以测定序列同一性百分比的此算法的一个实现实例是由Genetics ComputerGroup(Madison,WI)的“BestFit”实用应用程序所提供。此方法的默认参数在WisconsinSequence Analysis Package Program Manual,第8版(1995)(可从Genetics ComputerGroup,Madison,WI获得)中进行了描述。在本发明的上下文中建立同一性百分比的另一种方法是使用由爱丁堡大学(University of Edinburgh)拥有版权的MPSRCH程序包，该程序由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，并由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)发行。从这套软件包中，可以使用Smith-Waterman算法，其中将默认参数用于评分表(例如，缺口开放罚分为12，缺口延伸罚分为1和缺口为6)。生成的数据中，“匹配”值反映了“序列同一性”。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其他合适的程序在本领域中通常是已知的，例如，另一个比对程序是BLAST，以默认参数使用。例如，可使用以下默认参数来使用BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝双链；截断＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；筛选＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详细信息可以通过在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi前键入http://的网址上找到。

本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与亲代氨基酸序列之间的同一性程度被计算为在两个序列比对中的精确匹配数目除以“发明序列”的长度或亲代序列的长度，以最短者为准。结果以同一性百分比表示。

因此，在一些实施方案中，如下所述的编码gp96-Ig融合多肽的核酸的gp96组分可以在一个或多个氨基酸位置处编码与野生型gp96多肽不同的氨基酸序列。

本发明的Viagenpumatucel-L组合物利用gp-96作为融合蛋白gp-96-Ig。如本文所述，通过使用任选的接头，用人IgG1的Fc部分代替通常为内质网驻留伴侣肽的gp96的KDEL保留序列，来构建gp96-Ig。如本文所用，人IgG1的Fc部分包含CH2-CH3结构域，并且可以任选地在N端包含铰链区(铰链-CH2-CH3)。SEQ ID NO:5中显示了没有铰链的Fc结构域的序列。在一些情况下，IgG1铰链充当连接gp96蛋白与Fc结构域的接头。

在一些实施方案中，包含gp96-Ig融合蛋白的载体包含接头。在各个实施方案中，接头可衍生自天然存在的多结构域蛋白或者是如以下文献中所述的经验接头：例如，Chichili等，(2013)，Protein Sci.22(2):153-167，Chen等，(2013)，Adv Drug Deliv Rev65(10):1357-1369，其全部内容据此以引用的方式并入。在一些实施方案中，接头可以使用诸如以下文献中所述的彼等接头设计数据库和计算机程序来设计：Chen等，(2013)，AdvDrug Deliv Rev.65(10):1357-1369及Crasto等，(2000)，Protein Eng.13(5):309-312，其全部内容据此以引用的方式并入。

在一些实施方案中，接头是合成接头，诸如PEG。在一些实施方案中，接头是多肽。在一些实施方案中，接头长度小于约100个氨基酸。例如，接头长度可小于约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3或约2个氨基酸。在一些实施方案中，接头是柔性的。在另一个实施方案中，接头是刚性的。在各个实施方案中，接头大体上包含甘氨酸和丝氨酸残基(例如，约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％的甘氨酸和丝氨酸)。

在一些实施方案中，接头是抗体(例如，IgG、IgA、IgD和IgE，包括亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、以及IgA1和IgA2))的铰链区。在IgG、IgA、IgD和IgE类抗体中所见的铰链区充当柔性间隔，由此允许Fab部分在空间中自由移动。与恒定区相反，铰链结构域在结构上是多样的，在免疫球蛋白类和亚类中在序列和长度上都有所不同。例如，IgG亚类中的铰链区的长度和柔性有所不同。IgG1的铰链区包含氨基酸216-231，并且，由于它是自由灵活的，因此Fab片段可以围绕其对称轴旋转并在以两个重链间二硫桥中的第一个为中心的球体内移动。IgG2具有比IgG1短的铰链，带有12个氨基酸残基和四个二硫桥。缺乏甘氨酸残基的IgG2的铰链区相对较短，并且含有刚性的聚脯氨酸双螺旋，通过额外的重链间二硫桥而稳定。这些特性限制了IgG2分子的柔性。IgG3由于其独特的延长铰链区(约为IgG1铰链的四倍长)而与其他亚类不同，所述独特的延长铰链区含有62个氨基酸(包含21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成了非柔性的聚脯氨酸双螺旋。在IgG3中，Fab片段是相对远离Fc片段的，赋予了该分子以更大的柔性。IgG3中的细长铰链还是其比其他亚类具有更高分子量的原因。IgG4的铰链区比IgG1的短，并且其柔性介于IgG1与IgG2的柔性之间。据报道，铰链区的柔性按以下顺序降低：IgG3>IgG1>IgG4>IgG2。

另外的说明性接头包括但不限于具有序列LE、GGGGS、(GGGGS)n(n＝1-4)、(Gly)8、(Gly)6、(EAAAK)n(n＝1-3)、A(EAAAK)nA(n＝2-5)、AEAAAKEAAAKA、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A、PAPAP、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、GSAGSAAGSGEF和(XP)n的接头，其中X表示任何氨基酸，例如，Ala、Lys或Glu。

在一些实施方案中，接头可以是功能性的。例如但不限于，接头可起到提高折叠和/或稳定性、增加表达、改善药代动力学、和/或改善本发明组合物的生物活性的作用。在另一个实例中，接头可以起到将组合物靶向特定的细胞类型或位置的作用。

在一些实施方案中，可以将gp96肽融合至鼠IgG1的铰链CH2和CH3结构域(Bowen等，J Immunol 1996，156：442-449)。IgG1分子的此区域含有三个半胱氨酸残基，所述三个半胱氨酸残基通常与Ig分子中的其他半胱氨酸以二硫键结合。由于肽不需要任何半胱氨酸来充当标签，因此这些半胱氨酸残基中的一个或多个可以被另一种氨基酸残基诸如像丝氨酸取代。

在一些实施方案中，本公开提供了一种编码修饰的和可分泌的热休克蛋白(即gp96-Ig)的载体。可以使用美国专利号8,685,384中描述的方法产生编码gp96-Ig融合序列的核酸，该专利以引用的方式整体并入本文。

编码免疫球蛋白轻链或重链恒定区的DNA是已知的，或可易于从cDNA文库中获得。参见，例如，Adams等，Biochemistry 1980,19:2711-2719；Gough等，Biochemistry 198019:2702-2710；Dolby等，Proc Natl Acad Sci USA 1980,77:6027-6031；Rice等，ProcNatl AcadSci USA 1982,79:7862-7865；Falkner等，Nature 1982,298:286-288；以及Morrison等，Ann Rev Immunol 1984,2:239-256。由于许多免疫试剂和标记系统可用于免疫球蛋白的检测，因此gp96-Ig融合蛋白可易于通过本领域已知的多种免疫学技术来检测和定量，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、和荧光活化细胞分选(FACS)。类似地，如果肽标签是具有容易获得的抗体的表位，则可以将此类试剂与以上提及的技术一起使用，以便检测、定量和分离gp96-Ig融合蛋白。

本领域中已知的各种前导序列也可以用于从细菌和哺乳动物细胞中高效分泌gp96-Ig融合蛋白(参见，von Heijne，J Mol Biol 1985，184：99-105)。前导肽可以基于预期的宿主细胞进行选择，并且可以包括细菌、酵母、病毒、动物和哺乳动物序列。例如，疱疹病毒糖蛋白D前导肽适合用于多种哺乳动物细胞。可以从小鼠免疫球蛋白κ链的V-J2-C区获得用于哺乳动物细胞的另一种前导肽(Bernard等，Proc Natl Acad Sci USA 1981，78：5812-5816)。编码肽标签或前导肽的DNA序列是已知的或可易于从文库或商业供应商处获得，并且适用于本文所述的融合蛋白中。

此外，在一些实施方案中，可以用一种或多种疫苗蛋白代替本公开的gp96。比如，疫苗蛋白中包括多种热休克蛋白。在各个实施方案中，热休克蛋白是小hsp、hsp40、hsp60、hsp70、hsp90和hsp110家族成员中的一种或多种，包括其片段、变体、突变体、衍生物或组合(Hickey等，1989,Mol.Cell.Biol.9:2615-2626；Jindal,1989,Mol.Cell.Biol.9:2279-2283)。

在一些实施方案中，本公开提供了核酸构建体，其编码可以在原核和真核细胞中表达的疫苗蛋白融合蛋白(例如，gp96-Ig融合蛋白)。例如，本公开提供了包含编码疫苗蛋白融合物(例如，gp96-Ig融合物)的核苷酸序列的表达载体(例如，基于DNA或RNA的载体)。另外，本发明提供了用于制备本文所述的载体的方法，以及用于将载体引入合适的宿主细胞中以表达所编码的多肽的方法。通常，本文提供的方法包括构建编码疫苗蛋白融合蛋白(例如，gp96-Ig融合蛋白)的核酸序列，并将编码融合蛋白的序列克隆到表达载体中。可以将表达载体引入宿主细胞中，可以将两者之一施用于受试者以，例如，治疗癌症。例如，可以产生基于gp96-Ig的疫苗以刺激针对肿瘤抗原的抗原特异性免疫应答。

在一些实施方案中，可以使用常规DNA克隆和诱变方法、DNA扩增方法和/或合成方法获得(且如果需要，修饰)编码疫苗蛋白融合物(例如，gp96-Ig融合物)的cDNA或DNA序列。通常，编码疫苗蛋白融合蛋白(例如，gp96-Ig融合蛋白)的序列可以在表达之前插入到克隆载体中以用于遗传修饰和复制。每个编码序列可被可操作地连接至调控元件，诸如启动子，以便在体外和体内在合适的宿主细胞中表达所编码的蛋白质。

在本文提供的方法中，原核和真核载体都可以用于表达疫苗蛋白(例如，gp96-Ig)。原核载体包括基于大肠杆菌序列的构建体(参见，例如，Makrides,Microbiol Rev1996,60:512-538)。可以用于在大肠杆菌中表达的调控区的非限制性实例包括lac、trp、lpp、phoA、recA、tac、T3、T7和λPL。原核表达载体的非限制性实例可包括λgt载体系列，诸如λgt11(Huynh等，在“DNA Cloning Techniques，卷I:A Practical Approach,”1984,(D.Glover编),第49-78页,IRL Press,Oxford中)，以及pET载体系列(Studier等，MethodsEnzymol 1990，185:60-89)。然而，原核宿主-载体系统无法完成哺乳动物细胞的大部分翻译后加工。因此，真核宿主-载体系统可特别有用。

多种调控区可用于疫苗蛋白(例如，gp96-Ig)和T细胞共刺激融合物在哺乳动物宿主细胞中的表达。例如，可以使用SV40早期和晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子和劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV-LTR)启动子。可适用于哺乳动物细胞中的诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白II基因、小鼠乳腺肿瘤病毒糖皮质激素响应性长末端重复(MMTV-LTR)、β-干扰素基因和hsp70基因相关的启动子(参见Williams等，Cancer Res1989，49：2735-42；以及Taylor等，Mol Cell Biol 1990，10：165-75)。热休克启动子或应激启动子也可有利于驱动融合蛋白在重组宿主细胞中的表达。

一方面，本公开设想使用能够瞬时响应于线索实现高水平表达的诱导型启动子。说明性诱导型表达控制区包括那些包含用线索(诸如小分子化合物)刺激的诱导型启动子的诱导型表达控制区。具体的实例可见于例如美国专利号5,989,910、5,935,934、6,015,709和6,004,941中，这些专利各自以引用的方式整体并入本文。

表现出组织特异性并已在转基因动物中得到利用的动物调控区也可用于特定组织类型的肿瘤细胞中：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，Cell 1984,38:639-646；Ornitz等，Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 1986,50:399-409；以及MacDonald,Hepatology 1987,7:425-515)；在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,Nature 1985,315:115-122)；在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，Cell 1984,38:647-658；Adames等，Nature 1985,318:533-538；以及Alexander等，Mol Cell Biol 1987,7:1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴样和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等，Cell 1986,45:485-495)；在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，Genes Devel,1987,1:268-276)；在肝脏中具有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，Mol Cell Biol 1985,5:1639-1648；以及Hammer等，Science 1987,235:53-58)；在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，Genes Devel 1987,1:161-171)；在骨髓细胞中具有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等，Nature 1985,315:338-340；以及Kollias等，Cell 1986,46:89-94)；在脑的少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等，Cell 1987,48:703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani,Nature 1985,314:283-286)；以及在下丘脑中具有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等，Science 1986,234:1372-1378)。

表达载体还可以包含转录增强子元件，诸如在SV40病毒、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、免疫球蛋白基因、金属硫蛋白和β-肌动蛋白中所见的那些(参见，Bittner等，MethEnzymol 1987，153：516-544；以及Gorman，Curr Op Biotechnol 1990，1：36-47)。另外，表达载体可以含有允许载体在一种以上类型的宿主细胞中维持和复制或将载体整合到宿主染色体中的序列。这样的序列包括但不限于复制起点、自主复制序列(ARS)、着丝粒DNA和端粒DNA。

另外，表达载体可以含有一个或多个可选或可筛选的标记基因，所述标记基因用于最初分离、鉴定或追踪包含编码本文所述的融合蛋白的DNA的宿主细胞。在哺乳动物细胞中的稳定表达对于gp96-Ig和T细胞共刺激融合蛋白的长期、高产率产生可为有用的。许多选择系统可用于哺乳动物细胞。例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 1977,11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalski和Szybalski,Proc Natl Acad SciUSA 1962,48:2026)、以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell 1980,22:817)基因可以分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中采用。此外，抗代谢物抗性可用作以下多种酶的选择依据，例如，二氢叶酸还原酶(dhfr)，其赋予甲氨蝶呤抗性(Wigler等，Proc Natl Acad Sci USA1980，77:3567；O’Hare等，Proc Natl Acad Sci USA 1981，78:1527)；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan和Berg,Proc Natl Acad Sci USA 1981,78:2072)；新霉素磷酸转移酶(neo)，其赋予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等，J Mol Biol 1981,150:1)；以及潮霉素磷酸转移酶(hyg)，其赋予潮霉素抗性(Santerre等，Gene1984,30:147)。也可以使用其他可选标记，诸如组氨醇和Zeocin^TM。

许多基于病毒的表达系统也可以与哺乳动物细胞一起使用以产生gp96-Ig。使用DNA病毒骨架的载体已衍生自猿猴病毒40(SV40)(Hamer等，Cell 1979，17：725)、腺病毒(Van Doren等，Mol Cell Biol 1984，4：1653)、腺相关病毒(McLaughlin等，J Virol1988，62：1963)和牛乳头瘤病毒(Zinn等，Proc Natl Acad Sci USA1982，79：4897)。当使用腺病毒作为表达载体时，供体DNA序列可连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三联体前导序列。此融合基因可随后在腺病毒基因组中通过体外或体内重组插入。在病毒基因组的非必需区域(例如，E1或E3区)中的插入可以产生有生存力的且能够在受感染的宿主中表达外源产物的重组病毒。(参见，例如，Logan和Shenk,Proc Natl Acad Sci USA1984,81:3655-3659)。

牛乳头瘤病毒(BPV)可以感染许多高级脊椎动物，包括人，并且其DNA像附加体一样复制。已经开发出许多用于重组基因表达的穿梭载体，它们在哺乳动物细胞中以稳定的、多拷贝(20-300个拷贝/细胞)的染色体外元件形式存在。通常，这些载体含有BPV DNA的片段(整个基因组或69％的转化片段)、具有广泛宿主范围的启动子、多腺苷酸化信号、剪接信号、可选标记以及“无毒”质粒序列以允许载体在大肠杆菌中繁殖。在细菌中构建和扩增后，通过例如磷酸钙共沉淀将表达基因构建体转染到培养的哺乳动物细胞中。对于那些不表现出转化表型的宿主细胞，转化子的选择是通过使用显性可选标记，诸如组氨醇和G418抗性来实现的，

或者，可以使用牛痘7.5K启动子。(参见，例如，Mackett等，Proc Natl Acad SciUSA 1982，79：7415-7419；Mackett等，J Virol1984，49：857-864；以及Panicali等，ProcNatl Acad Sci USA 1982，79：4927-4931)。在使用人宿主细胞的情况下，可以使用基于EB(Epstein-Barr)病毒(EBV)来源(OriP)和EBV核抗原1(EBNA-1；反式作用复制因子)的载体。这种载体可以与广泛的人类宿主细胞一起使用，例如,EBO-pCD(Spickofsky等，DNA ProtEng Tech 1990,2:14-18)、pDR2和λDR2(可从Clontech实验室获得)。

Gp96-Ig融合蛋白也可以用基于逆转录病毒的表达系统来制备。可以使用逆转录病毒，诸如莫洛尼氏(Moloney)鼠白血病病毒，因为可以除去大部分病毒基因序列并用外源编码序列代替，而缺失的病毒功能可以反式提供。与转染相反，逆转录病毒可以有效地感染基因并将其转移到广泛多种细胞类型包括例如原代造血细胞中。此外，可以通过选择用于载体包装的包膜来操纵逆转录病毒载体感染的宿主范围。

例如，逆转录病毒载体可包含5'长末端重复(LTR)、3'LTR、包装信号、细菌复制起点和可选标记。例如，可以将gp96-Ig融合蛋白编码序列插入到5'LTR与3'LTR之间的位置，使得从5'LTR启动子进行的转录可以转录克隆的DNA。5'LTR依次含有启动子(例如，LTR启动子)、R区、U5区和引物结合位点。这些LTR元件的核苷酸序列是本领域中公知的。异源启动子以及多重药物选择标记也可以包含在表达载体中，以促进受感染细胞的选择。参见，McLauchlin等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1990，38：91-135；Morgenstern等，Nucleic Acid Res 1990，18：3587-3596；Choulika等，J Virol 1996，70：1792-1798；Boesen等，Biotherapy 1994，6：291-302；Salmons和Gunzberg，Human Gene Ther 1993，4：129-141；以及Grossman和Wilson，Curr Opin Genet Devel 1993，3：110-114。

可以使用本领域已知的技术从已知的DNA序列合成和组装本文所述的任何克隆和表达载体。调控区和增强子元件可以是多种来源的，天然或合成的都可以。一些载体和宿主细胞可商购获得。有用载体的非限制性实例描述于Appendix 5of Current Protocols inMolecular Biology,1988,Ausubel等编,Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience中，该文献以引用的方式并入本文；以及商业供应商诸如Clontech Laboratories、Stratagene Inc.和Invitrogen,Inc的目录。

在一些实施方案中，本公开利用被编码gp96-Ig融合蛋白的载体转染的细胞。不希望被理论所束缚，据信施用gp96-Ig分泌细胞可触发强劲的抗原特异性CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的扩增，连同先天免疫系统的激活一起。肿瘤细胞分泌的gp96导致DC和自然杀伤(NK)细胞募集到gp96分泌位点，并介导DC活化。此外，gp96及其伴侣肽的内吞摄取触发了通过主要MHC I类的肽交叉呈递，以及不依赖CD4细胞的强的同源CD8活化。

因此，在各个实施方案中，本发明进一步提供了宿主细胞系，所述宿主细胞系带有编码如本文所述的修饰的和可分泌的热休克蛋白(例如，gp96-Ig)的载体。在一些实施方案中，将宿主细胞系施用于受试者以治疗肺癌。

在一些实施方案中，如本文所述的表达载体可被引入到宿主细胞中以产生分泌的疫苗蛋白(例如，gp96-Ig)。存在多种可用于将核酸引入到活细胞中的技术。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、基于聚合物的系统、DEAE-葡聚糖、病毒转导、磷酸钙沉淀法等。对于体内基因转移，也可以使用若干技术和试剂，包括脂质体；基于天然聚合物的递送媒介物，诸如壳聚糖和明胶；病毒载体也适用于体内转导。在一些情况下，需要提供靶向剂，诸如对细胞表面膜蛋白有特异性的抗体或配体。在使用脂质体的情况下，与细胞表面膜蛋白结合并与胞吞作用相关的蛋白可用于靶向和/或促进摄取，例如，对于特定细胞类型有趋向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环过程中发生内化的蛋白质的抗体、靶向细胞内定位并延长细胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术描述于例如Wu等,J.Biol.Chem.262,4429-4432(1987)；以及Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,3410-3414(1990)中。

在适当情况下，也可以使用基因递送因子，诸如，例如整合序列。许多整合序列是本领域中已知的(参见，例如，Nunes-Duby等，Nucleic Acids Res.26:391-406,1998；Sadwoski，J.Bacteriol.165:341-357,1986；Bestor,Cell,122(3):322-325,2005；Plasterk等，TIG 15:326-332,1999；Kootstra等，Ann.Rev.Pharm Toxicol.,43:413-439,2003)。它们包括重组酶和转座酶。实例包括Cre(Sternberg和Hamilton,J.Mol.Biol.,150:467-486,1981)、lambda(Nash,Nature,247,543-545,1974)、FIp(Broach,等，Cell,29:227-234,1982)、R(Matsuzaki,等，J.Bacteriology,172:610-618,1990)、cpC31(参见，例如，Groth等，J.Mol.Biol.335:667-678,2004)、睡美人(sleeping beauty)，水手家族的转座酶(Plasterk等，supra)，以及用于整合病毒诸如AAV、逆转录病毒的组分，以及具有提供病毒整合的组分诸如逆转录病毒或慢病毒的LTR序列和AAV的ITR序列的抗病毒素(Kootstra等，Ann.Rev.Pharm.Toxicol.,43:413-439,2003)。

例如，细胞可在体外培养或被基因工程改造。宿主细胞可以从正常受试者或受影响的受试者(包括健康人、癌症患者以及患有感染性疾病的患者)、私人实验室存储物、公共培养物保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)、或商业供应商处获得。

示例性哺乳动物宿主细胞包括但不限于源自人、猴子和啮齿动物的细胞(参见，例如，Kriegler，“Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual,”1990,New York,Freeman&Co.)。它们包括被SV40转化的猴肾细胞系(例如，COS-7,ATCC CRL 1651)、人胚胎肾系(例如，293、293-EBNA或被亚克隆以便在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等，J GenVirol 1977,36:59)、幼仓鼠肾细胞(例如，BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞DHFR(例如，CHO，Urlaub和Chasin,Proc Natl Acad Sci USA 1980,77:4216)、小鼠支持细胞(Mather,Biol Reprod 1980,23:243-251)、小鼠成纤维细胞(例如，NIH-3T3)、猴肾细胞(例如，CV1ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(例如，VERO-76,ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(例如，HELA,ATCCCCL 2)、犬肾细胞(例如，MDCK,ATCC CCL 34)、水牛大鼠肝细胞(例如，BRL3A,ATCC CRL 1442)、人肺细胞(例如，W138,ATCC CCL75)、人肝细胞(例如，Hep G2,HB8065)、以及小鼠乳腺肿瘤细胞(例如，MMT 060562,ATCC CCL51)。用于表达本文所述的融合蛋白的说明性癌细胞类型包括小鼠成纤维细胞系NIH3T3、小鼠Lewis肺癌细胞系LLC、小鼠肥大细胞系P815、小鼠淋巴瘤细胞系EL4及其卵白蛋白转染子E.G7、小鼠黑色素瘤细胞系B16F10、小鼠纤维肉瘤细胞系MC57、人小细胞肺癌细胞系SCLC#2和SCLC#7、人肺腺癌细胞系，例如，AD100、以及人前列腺癌细胞系，例如PC-3。

可用于在体内产生并分泌gp96-Ig融合蛋白的细胞包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞、血细胞(诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞或粒细胞)、各种干细胞或祖细胞诸如造血干细胞或祖细胞(例如，如从骨髓中获得)、脐带血、外周血、胎肝等、以及肿瘤细胞(例如，人肿瘤细胞)。细胞类型的选择取决于所治疗或预防的肿瘤或感染性疾病的类型，并且可由本领域技术人员来确定。

不同的宿主细胞具有蛋白质翻译后加工和修饰的特征性和特殊机制。可选择以特定方式修饰和加工所表达的基因产物的宿主细胞，该方式类似于受体加工其热休克蛋白(hsp)的方式。为了产生大量gp96-Ig，可能优选的是，宿主细胞的类型已用于表达异源基因，并且被合理地充分表征和开发用于大规模生产过程。在一些实施方案中，宿主细胞对于患者来说是自体的，所述患者随后被施用分泌本发明融合蛋白的本发明的融合或重组细胞。

在一些实施方案中，可以将本文提供的表达构建体引入到抗原细胞中。如本文所用，抗原细胞可以包括被致癌感染剂诸如病毒感染但尚未形成肿瘤的癌前细胞，或例如已暴露于诱变剂或致癌剂(诸如DNA破坏剂或辐射)的抗原细胞。可以使用的其他细胞是癌前细胞，其以形态或生理或生化功能为特征从正常形式过渡到肿瘤形式。

通常，本文提供的方法中使用的癌细胞和癌前细胞是哺乳动物来源的。预期的哺乳动物包括人、伴侣动物(例如，狗和猫)、家畜(例如，绵羊、牛、山羊、猪和马)、实验动物(例如，小鼠、大鼠和兔子)以及圈养或自由的野生动物。

在一些实施方案中，癌细胞(例如人肿瘤细胞)可用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，所述细胞是人肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞是经照射的或活的和减毒的人肿瘤细胞。癌细胞提供抗原性肽，所述抗原性肽变得与所表达的gp96-Ig融合蛋白非共价结合。也可以使用衍生自癌前病变、癌组织或癌细胞的细胞系，限制条件是所述细胞系的细胞具有与靶癌细胞上的抗原共有的至少一个或多个抗原决定簇。可以使用癌组织、癌细胞、被致癌剂感染的细胞、其他癌前细胞和人类来源的细胞系。尽管也可以使用同种异体细胞，但从最终要向其施用融合蛋白的患者中切除的癌细胞可能特别有用。在一些实施方案中，癌细胞可以来自已建立的肿瘤细胞系，诸如但不限于已建立的非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、前列腺癌、肉瘤、乳腺癌、鳞状细胞癌、头颈癌、肝细胞癌、胰腺癌或结肠癌细胞系。一方面，所述癌细胞是人肺癌细胞系。在一些实施方案中，所述肺癌细胞系表达各种已知的肺癌抗原。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白允许呈递各种肿瘤细胞抗原。比如，在一些实施方案中，本发明的疫苗蛋白融合物(例如，gp96融合物)伴随这些各种肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤细胞分泌多种抗原。可被分泌和/或呈递的说明性但非限制性抗原是：癌症/睾丸抗原1A(CTAG1A)及其免疫原性表位CT45A6、CT45A3、CT45A1、CT45A5；精子自身抗原蛋白17(SPA17)；精子相关抗原6(SPAG6)；精子相关抗原8(SPAG8)；锚蛋白重复结构域45(ANKRD45)；赖氨酸脱甲基酶5B(KDM5B)；精子顶体相关3(SPACA3)；精子鞭毛2(SPEF2)；造血蛋白(HEMGN)；蛋白酶；丝氨酸50(PRSS50)；PDZ结合激酶(PBK)；转酮醇酶样蛋白1(TKTL1)；TGFB诱导的因子同源盒2样，；X-连锁的(TGIF2LX)可变电荷，X-连锁的(VCX)；X染色体开放阅读框67(CXORF67)；MART-1/Melan-A；gp100；二肽基肽酶IV(DPPIV)；腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)；亲环蛋白b；结直肠相关抗原(CRC)-0017-1A/GA733；癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2；etv6；aml1；前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；T细胞受体/CD3-ζ链；肿瘤抗原的MAGE家族(例如，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)；肿瘤抗原的GAGE家族(例如，GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9、GAGE12G、GAGE12F、GAGE12I)；BAGE；RAGE；LAGE-1；NAG；GnT-V；MUM-1；CDK4；酪氨酸酶；p53；MUC家族；HER2/neu；p21ras；RCAS1；α-甲胎蛋白；E-钙粘蛋白；α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白；p120ctn；gp100Pmel117；PRAME；NY-ESO-1；cdc27；腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)；胞衬蛋白；连接蛋白37；Ig独特型；p15；gp75；GM2和GD2神经节苷脂；病毒产物诸如人乳头瘤病毒蛋白；Smad家族肿瘤抗原；lmp-1；NA；EBV编码的核抗原(EBNA)-1；脑糖原磷酸化酶；SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1CT-7、c-erbB-2、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD56、CD70、CD74、CD138、AGS16、MUC1、GPNMB、Ep-CAM、PD-L1、PD-L2和PMSA。

PD-1是细胞表面受体，它是受体免疫球蛋白超家族内的T细胞调节因子CD28家族的成员。人PD-1基因位于2q37号染色体上，且全长PD-1cDNA编码与鼠PD-1具有60％同源性的含288个氨基酸残基的蛋白。它在胸腺发育过程中存在于CD4-CD8-(双阴性)胸腺细胞上，并在长时间暴露于抗原后在成熟的造血细胞(诸如T和B细胞、NKT细胞和单核细胞)中活化后表达。

临床上靶向PD-1的主要方法是通过开发抑制PD-1或PD-L1功能的基因工程改造的单克隆抗体。PD-L1还显示出抑制T细胞增殖和细胞因子产生；然而，在癌症中的确切途径仍不清楚。癌细胞在其表面上驱动PD-L1的高水平表达，允许抑制性PD-1受体在浸润肿瘤微环境的任何T细胞上的活化，从而有效地将那些细胞关闭。实际上，已经在许多不同的癌症类型(例如，黑色素瘤[40％-100％]、NSCLC[35％-95％]和多发性骨髓瘤[93％])中证实了PD-L1表达水平的上调，并且PD-L1的高水平表达与不良的临床结局有关。此外，已显示肿瘤浸润T细胞(TIL)比浸润正常组织的T细胞表达显著更高水平的PD-1。认为肿瘤微环境可分泌促炎性细胞因子，包括干扰素-γ(IFNγ)，以便上调肿瘤浸润T细胞上PD-1的表达，从而确保它们可以对肿瘤上高水平表达的PD-L1作出反应。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段是纳武单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、BMS-936559、阿特珠单抗或阿维鲁单抗。

在一些实施方案中，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段是度伐鲁单抗。

美国已经批准了两种特别受关注的抗PD-1抗体即纳武单抗和帕博利珠单抗用于多种不同的癌症，并且还有大量其他抗PD-1抗体在临床测试中。

因此，在一些实施方案中，与Viagenpumatucel-L组合使用的抗PD-1抗体是纳武单抗。合适的剂量和给药方案描述如下。

在一些实施方案中，与Viagenpumatucel-L组合使用的抗PD-1抗体是帕博利珠单抗。合适的剂量和给药方案描述如下。

本文公开的组合和方法适用于治疗癌症或抑制癌细胞增殖，诸如肺癌。在一些实施方案中，所述肺癌是非小细胞肺癌，诸如鳞状细胞癌、腺癌和大细胞肺癌。

一般来说，本发明在通常不会显著受益于抗PD-1疗法的患者中提供了抗PD-1或抗PD-L1抗体功效的提高。例如，在其肿瘤上PD-L1低表达或阴性表达的患者通常不会显著受益于抗PD-1疗法。然而，令人惊讶的是，如本文所示，无论患者肿瘤的PD-L1状态如何，Viagenpumatucel-L与抗PD-1抗体的组合都同样有效。类似地，低TIL状态的患者通常对抗PD-1疗法的应答较差。再次，令人惊讶地，无论患者的肿瘤TIL状态如何，Viagenpumatucel-L与抗PD-1抗体的组合都同样有效。

因此，本发明提供了确定NSCLC患者的PD-L1状态的方法。通常，如本领域中已知，这是通过从患者中获得一个或多个肿瘤活检物并测试PD-L1状态来完成。如本领域中已知，这通常是在活检的肿瘤样品上使用标记的抗体通过免疫组织化学(IHC)测定来完成，并且通常被评为PD-L1^高(染色水平高)、PD-L1^低(染色水平低)和PD-L1^阴性(<1％，未检测到染色)。在一些实施方案中，将抗PD-L1染色与标准化的免疫组织化学测定法一起使用，PD-L1^高对应于≥50％染色阳性的PD-L1肿瘤类型细胞，PD-L1^低是49-1％染色阳性的PD-L1肿瘤类型细胞且PD-L1^阴性<1％被检测到染色。也可以采用抗PD-L1抗体对分离的肿瘤活检物进行FACS染色。

如本领域中已知，如果患者是PD-L1^高的，那么通常用抗PD-1抗体治疗的效果会更好。然而，即使患者是PD-L1^低和PD-L1^阴性的，本发明也能够将抗PD-1抗体与Viagenpumatucel-L组合使用以产生协同效应。

另外，在一些实施方案中，可以确定患者的TIL状态。如本文所述，在肿瘤微环境中具有少量CD8+TIL的肿瘤通常被认为是“冷”肿瘤，例如TIL^低，与CD8+TIL含量高的肿瘤(TIL^高)相比，对免疫-肿瘤治疗应答的可能性较小。

如上，通常如本领域中已知，例如，如本领域中已知通过使肿瘤活检物分离并使用针对CD8+细胞的FACS分选，或通过对肿瘤活检样品进行免疫组织化学(IHC)染色，来评估TIL状态。在一些实施方案中，抗CD8抗体染色被用于评估肿瘤间质中CD8+细胞的百分比。TIL^高对应于肿瘤活检物中>约10％CD8⁺细胞，而TIL^低对应于肿瘤样品中<约10％CD8⁺细胞。

因此，尽管当患者的TIL状态为TIL^高时通常使用抗PD-1抗体方案的效果会更好，但即使患者是TIL^低的，本发明也可以将抗PD-1抗体与Viagenpumatucel-L组合使用以产生协同效应。

本发明提供了Viagenpumatucel-L和抗PD-1抗体向患有NSCLC的患者的共同施用。

在实施方案中，所述患者在接受疗法后经历了疾病进展。在实施方案中，所述疗法是免疫检查点抑制剂疗法。在实施方案中，所述疗法包括化疗。在实施方案中，所述患者是所述免疫检查点抑制剂疗法的不良应答者。在实施方案中，所述患者的所述免疫检查点抑制剂疗法失败。在实施方案中，即使施用所述免疫检查点抑制剂疗法，所述患者的疾病仍已进展。在一些实施方案中，患者先前接受过CPI疗法，但是，疾病在治疗6个月或更长时间后进展。

在一些实施方案中，本公开的方法涉及与抗PD-1抗体组合施用包含编码修饰的和可分泌的热休克蛋白(即，gp96-Ig)的载体的细胞。在一些实施方案中，施用的细胞数量范围在约100,000个细胞至约2,000万个细胞内。

在一些实施方案中，向受试者施用低剂量的细胞。例如，施用于受试者的细胞数量可以是约100,000个细胞、约150,000个细胞、约200,000个细胞、约250,000个细胞、约300,000个细胞、约350,000个细胞、约400,000个细胞、约450,000个细胞、约500,000个细胞、约550,000个细胞、约600,000个细胞、约650,000个细胞、约700,000个细胞、约750,000个细胞、约800,000个细胞、约850,000个细胞、约900,000个细胞，约950,000个细胞或约100万个细胞。在一个实施方案中，向受试者施用约一百万个细胞。

在一些实施方案中，向受试者施用高剂量的细胞。例如，施用于受试者的细胞数量可以是约200万个细胞、约300万个细胞、约400万个细胞、约500万个细胞、约600万个细胞、约700万个细胞、约800万个细胞、约900万个细胞、约1000万个细胞、约1100万个细胞、约1200万个细胞、约1300万个细胞、约1400万个细胞、约1500万个细胞、约1600万个细胞、约1700万个细胞、约1800万个细胞、约1900个细胞、或约2000万个细胞。

在本文所述的组合疗法方案中，发现特别用途的剂量是1X 10⁷Viagenpumatucel-L细胞，以注射方式给予。

在许多实施方案中，与抗PD-1抗体诸如纳武单抗的每两周一次静脉内输注组合，每周一次给予Viagenpumatucel-L细胞，持续至少约6周至至少约16周。

如本领域中所知，将适当剂量的抗PD-1抗体施用于NSCLC患者。通常，每两周一次施用240mg的剂量。

在一些实施方案中，与抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗的方案组合以例如约1×10⁷个细胞的剂量给予Viagenpumatucel-L细胞。比如，在一些实施方案中，将Viagenpumatucel-L细胞(例如以约1×10⁷个细胞的剂量)与纳武单抗的单剂量方案(每两周静脉内给予3mg/kg)组合。在一些实施方案中，将Viagenpumatucel-L细胞(例如以约1×10⁷个细胞的剂量)与纳武单抗的2周给药方案(例如240mg，任选地总共约6周，或任选地总共约16周)组合。在一些实施方案中，将Viagenpumatucel-L细胞(例如以约1×10⁷个细胞的剂量)与纳武单抗的4周给药方案(例如480mg，任选地每4周每30分钟输注)组合。

在一些实施方案中，两种组分的有用给药方案如下：

方案1

周	Viagenpumatucel-L剂量	纳武单抗剂量
			1	1×10<sup>7</sup>个细胞	240mg
2	1×10<sup>7</sup>个细胞	无
			3	1×10<sup>7</sup>个细胞	240mg
4	1×10<sup>7</sup>个细胞	无
			5	1×10<sup>7</sup>个细胞	240mg
6	1×10<sup>7</sup>个细胞	无
			7	1×10<sup>7</sup>个细胞	240mg
8	1×10<sup>7</sup>个细胞	无
			9	1×10<sup>7</sup>个细胞	240mg
10	1×10<sup>7</sup>个细胞	无
			11	1×10<sup>7</sup>个细胞	240mg
12	1×10<sup>7</sup>个细胞	无
			13	1×10<sup>7</sup>个细胞	240mg
14	1×10<sup>7</sup>个细胞	无
			15	1×10<sup>7</sup>个细胞	240mg
16	1×10<sup>7</sup>个细胞	无

方案2

如本领域技术人员将理解，患者可以每周坚持这些方案，直到疾病进展和/或不可接受的毒性或不良事件。

一方面，本公开的方法提供了一种包含低剂量的表达修饰的和可分泌的热休克蛋白(即，gp96-Ig)的细胞系与免疫检查点抑制剂的组合，以及一种使用所述组合治疗疾病(诸如可通过调节肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的免疫细胞谱和/或其他蛋白质来影响其病因的疾病，例如，癌症)的方法。在一些实施方案中，本公开涉及一种包含低剂量的表达修饰的和可分泌的热休克蛋白的细胞系(即，gp96-Ig)与抗PD-1抗体或其抗原结合片段(例如，纳武单抗)的组合。

所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的低剂量的表达修饰的和可分泌的热休克蛋白(即gp96-Ig)的细胞系和抗PD-1抗体或其抗原结合片段(例如，纳武单抗)，例如，通过抑制肿瘤生长、减少肿瘤内的T调节细胞群和/或增加肿瘤中CD8/T调节细胞的比率。

本公开进一步提供了本文所述的任何方法或组合在制造用于治疗疾病的药剂中的用途。这种疾病包括，例如癌症、癌前状态或可通过调节肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的免疫细胞谱和/或其他蛋白质被影响的疾病。

在一些实施方案中，本公开提供了一种组合疗法，其涉及包含编码修饰的和可分泌的热休克蛋白(即，gp96-Ig)的载体的细胞系。低剂量的细胞系与免疫检查点抑制剂诸如抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合片段(例如，纳武单抗)的组合施用减少NSCLC复发。

所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的低剂量的表达修饰的和可分泌的热休克蛋白(即，gp96-Ig)的细胞系和抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)，通过抑制肿瘤生长、减少肿瘤内的T调节细胞群和/或增加肿瘤中CD8/T调节细胞的比率。

本文公开的组合和方法适用于治疗癌症或抑制癌细胞增殖，诸如鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌，例如，非小细胞肺癌。

在一些实施方案中，本文提供的方法可适用于刺激针对肿瘤(例如，肺肿瘤)的免疫应答。在一些实施方案中，这种免疫应答适用于治疗或减轻与肿瘤有关的体征或症状。如本文所用，“治疗”是指与未接受治疗的个体的症状相比，减轻、预防和/或逆转已施用了如本文所述的载体的个体的症状。从业人员应了解，本文所述的方法将与熟练的从业人员(医师或兽医)进行的连续临床评估相结合以确定后续疗法。这类评估将有助于和告知评估是否增加、减少或继续特定的治疗剂量、给药方式等。

在一些实施方案中，本发明的方法可以增加受试者中的肿瘤抗原特异性T细胞的活化或增殖。例如，与施用前受试者中的肿瘤抗原特异性T细胞的活化或增殖水平相比，受试者中肿瘤抗原特异性T细胞的活化或增殖可增加至少5％(例如，包括例如至少约10％、20％、30％、40％、60％、70％、80％，90％或100％)。在一个实施方案中，将所述增加与单独施用免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)进行比较。

在一些实施方案中，本发明方法可以增加受试者中CD8+T细胞的活化或增殖。例如，与施用前受试者中的CD8+T细胞的活化或增殖水平相比，受试者中CD8+T细胞的活化或增殖可以增加至少5％(例如，包括例如至少约10％、20％、30％、40％、60％、70％、80、90％或100％)。在一些实施方案中，CD8+T细胞是分泌IFN-γ的T细胞。在一个实施方案中，将所述增加与单独施用免疫检查点抑制剂进行比较。在一些实施方案中，CD8+T细胞(例如，分泌IFN-γ的CD8+T细胞)的活化或增殖可以通过对例如源自受试者的外周血淋巴细胞进行酶联免疫斑点(ELISPOT)测定来评估。

在一些实施方案中，本发明的方法有效诱导和/或活化肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和/或增加受试者中此类TIL的数量。例如，与施用前相比，受试者中的此类TIL的诱导和/或活化和/或数量的增加可为至少5％(例如，包括例如至少约10％、20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一个实施方案中，将所述增加与单独施用免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)进行比较。

在一些实施方案中，本发明的方法有效地降低了受试者的肺癌复发率。在一些实施方案中，本公开的方法有效降低了已用低剂量的表达修饰的和可分泌的热休克蛋白(即，gp96-Ig)的细胞系与免疫检查点抑制剂(诸如，抗PD-1抗体)的组合治疗的患者中肺癌的复发率。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段是纳武单抗。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括度伐鲁单抗、伊匹单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗、BMS-936559、阿特珠单抗或阿维鲁单抗。

在一个实施方案中，与已用高剂量的本公开的细胞系与免疫检查点抑制剂(诸如，抗PD-1抗体)的组合治疗的受试者相比，本公开的方法在治疗(例如，减少癌症复发)那些已用低剂量的本公开的细胞系与免疫检查点抑制剂(诸如，抗PD-1抗体)的组合治疗的受试者中更有效。

一方面，与已单独用免疫检查点抑制剂(诸如，抗PD-1抗体或其抗原结合片段)治疗的受试者相比，本公开的方法在治疗(例如，减少癌症复发)那些已用低剂量的本发明的细胞系与免疫检查点抑制剂(诸如，抗PD-1抗体或其抗原结合片段)的组合治疗的受试者中更有效。

在一个实施方案中，本发明的细胞系与免疫检查点抑制剂(诸如，抗PD-1抗体或其抗原结合片段)的组合的施用诱导治疗后免疫应答的强劲增加。在一个实施方案中，免疫应答的强劲增加被定义为CD8+T细胞(例如，分泌IFN-γ的CD8+T细胞)的活化或增殖比基线高至少2倍的增加，如通过例如ELISPOT所测量。在一个实施方案中，与不表现出这种免疫应答的受试者相比，本发明的方法在治疗经治疗后表现出强劲的免疫应答的受试者中更有效。在这样的实施方案中，可以用低剂量的本发明的细胞系与免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)的组合来治疗受试者。

在一些实施方案中，本公开提供了一种通过向受试者施用本公开的细胞系与免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)的组合来治疗在治疗之前显示出大量肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的受试者的方法。在一些实施方案中，大量TIL是指高于肿瘤微环境中细胞的10％的TIL数量。

在其他实施方案中，本发明提供了一种通过向受试者施用本发明的细胞系与免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)的组合来治疗在治疗之前显示出少量肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的受试者的方法。在一些实施方案中，少量TIL是指小于或等于肿瘤微环境中细胞的10％的TIL数量。在一些实施方案中，本公开的方法在治疗那些具有少量肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的受试者中可比具有大量TIL的受试者更有效。在一些实施方案中，本公开提供了一种用本公开的细胞系与免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)的组合治疗具有少量TIL的受试者的方法。

如本文所用，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以在受试者(例如，被诊断为患有癌症的人)中提供所需治疗(例如，抗癌或抗肿瘤)作用的量。抗肿瘤和抗癌作用包括但不限于肿瘤生长(例如，肿瘤生长延迟)、肿瘤大小或转移的调节；与特定抗癌剂相关的毒性和副作用的减少；癌症的临床损害或症状的减轻或减少；受试者生存期的延长使其超出在没有这种治疗的情况下所预期的生存期；以及对在施用前(即预防性施用)缺乏肿瘤形成的动物体内的肿瘤生长的预防。在一个实施方案中，本发明减少或预防癌症复发(例如，肺癌复发)。

本文所述的方法适用于肺癌治疗的各个方面。在一些实施方案中，提供了一种抑制个体中的肺癌细胞增殖(诸如肺癌肿瘤生长)的方法。在一些实施方案中，至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％)的细胞增殖得到抑制。在一些实施方案中，小于约20％的细胞增殖得到抑制。

在一些实施方案中，提供了一种抑制个体中肺癌肿瘤转移的方法。在一些实施方案中，至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一个)的转移得到抑制。

在一些实施方案中，提供了一种降低个体中预先存在的肺癌肿瘤转移(诸如肺转移或转移至淋巴结)的发生率或负荷的方法。在一些实施方案中，至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％)的转移被减少。

在一些实施方案中，提供了一种减小个体中的肺癌肿瘤大小的方法。在一些实施方案中，肿瘤大小减小至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％)。

在一些实施方案中，提供了一种减少个体中的肺癌复发的方法。在一些实施方案中，肺癌的复发减少至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％)。

在一些实施方案中，提供了一种延长个体中的肺癌疾病进展时间的方法。在一些实施方案中，所述方法将疾病进展时间延长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周。在一些实施方案中，所述方法将疾病进展时间延长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。

在一些实施方案中，提供了一种延长患有肺癌的个体的生存期的方法。在一些实施方案中，所述方法将个体的生存期延长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24个月。在一些实施方案中，所述方法将个体的生存期延长了至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。

在一些实施方案中，提供了一种减轻患有肺癌(例如，NSCLC)的个体中的一种或多种症状的方法。

实施例

为了使本文所公开的本发明可以更有效地被理解，提供了以下实施例。应理解，这些实施例只是为了说明性目的，而不应视为以任何方式限制本发明。

实施例1：在非小细胞肺癌患者中Viagenpumatucel-L(HS-110)与多重治疗方案组合的1b/2期研究(“DURGA”试验)

试验设计参见图1A、图1B和图1C。

在此所公开的实验的目的尤其在于评估使用viagenpumatucel-L组合策略来调节免疫应答的免疫接种对于在用于不可治愈或转移性疾病的至少一种先前疗法中失败的非小细胞肺腺癌患者是否安全。评估Viagenpumatucel-L(HS-110)与PD-1检查点抑制剂和二线疗法或更高疗法的应答率。根据安全性和功效，患者群体包括1b期，扩大到2期。

NSCLC患者在前18周每周一次接受1X10⁷个HS-110细胞，并且每2周一次接受3mg/kg或240mg纳武单抗，直至不可耐受的毒性或肿瘤进展。在基线时测试组织的PD-L1表达(≥1％高，或<1％；阴性)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。肿瘤基质中有超过10％的CD8+淋巴细胞被定义为TIL高。研究了两个队列：队列A：从未接受过检查点抑制剂疗法的患者(即，未曾接受检查点抑制剂疗法)和队列B：先前接受过检查点抑制剂疗法且疾病在治疗6个月或更长时间后进展的患者。

在基线时测试队列A的患者组织的PD-L1表达(≥1％或<1％)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。肿瘤基质中有超过10％的CD8+淋巴细胞被定义为TIL高。队列A的患者仅接受一种先前治疗，即化疗。非限制性地，目标是安全性和目标应答率(ORR)、PFS和OS。

Viagenpumatucel-L+纳武单抗(低TIL)

低TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)的患者接受每周一次以1×10⁷个细胞的注射液给予的viagenpumatucel-L(HS-110)和纳武单抗(OPDIVO)的组合持续18周或直到治疗终止。最初入选了9名患者(1b期)，根据初步功效，选择扩大到20名患者(2期)。疫苗衍生自被基因工程改造以持续分泌gp96-Ig的经照射的人肺癌细胞。患者按照包装说明书接受纳武单抗用于NSCLC的治疗(每两周3mg/kg经60分钟静脉内输注)，直至疾病进展或出现不可接受的毒性。

Viagenpumatucel-L+纳武单抗(高TIL)

高TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)的患者接受每周一次以1x10⁷个细胞的注射液给予的viagenpumatucel-L(HS-110)和纳武单抗(Opdivo)的组合，持续18周或直到治疗终止。最初入选了9名患者(1b期)，根据初步功效，选择扩大到20名患者(2期)。疫苗衍生自被基因工程改造以持续分泌gp96-Ig的经照射的人肺癌细胞。患者按照包装说明书接受纳武单抗用于NSCLC的治疗(每两周3mg/kg经60分钟静脉内输注)，直至疾病进展或出现不可接受的毒性(参见图2)。

Viagenpumatucel-L+纳武单抗(翻转)

患者接受每周一次以1x10⁷个细胞的注射液给予的viagenpumatucel-L(HS-110)和纳武单抗(Opdivo)的组合，持续18周或直到治疗终止。此分组允许已同意但不能分配到高或低TIL组的患者入选，并且没有正式的限制。使用衍生自被基因工程改造以持续分泌gp96-Ig的经照射的人肺癌细胞的疫苗。患者按照包装说明书接受纳武单抗用于NSCLC的治疗(每两周3mg/kg经60分钟静脉内输注)，直至疾病进展或出现不可接受的毒性(参见图2)。

1b期的主要结局结果通过体格和实验室检查来测量安全性和耐受性长达3年，并且评估每种viagenpumatucel-L组合方案的安全性。2期的主要结局结果测量客观应答率(ORR)长达3年，并且通过实体瘤的应答评价标准(RECIST)评估客观应答率(ORR)，参见图3A和图3B，并且关于CPI进展结果，参见图19。1b期的次要结局结果测量客观应答率(ORR)长达3年，并且通过实体瘤的应答评价标准(RECIST)评估客观应答率(ORR)。2期的次要结局结果通过体格和实验室检查来测量安全性和耐受性长达3年，并且评估每种viagenpumatucel-L组合方案的安全性。通过ELISPOT，使用源自外周血的HS-110裂解物评估接种疫苗后的免疫应答长达3年(图14、图15、图16)，并且评估总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)长达3年(图3A)。

此外，评估其他结局诸如T细胞受体(TCR)成分的表征、流式细胞术分析的外周血免疫应答、流式细胞术的总外周血单核细胞(PBMC)计数(包括淋巴细胞亚群)、疾病控制率(DCR)(包括完全应答、部分应答或稳定应答)长达3年。在治疗前通过免疫组织化学(IHC)评估肿瘤抗原表达且评估活检物或存档组织中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的存在，并在研究药物的首次剂量之后九(9)周评估肿瘤浸润淋巴细胞且通过IHC评估在活检组织中免疫抑制分子的表达。评估入选后6个月和入选后12个月时存活患者的比例。

临床患者群体标准

除健康志愿者外，年龄在18岁及以上的所有性别的人都有资格参加这项研究。纳入标准：非小细胞肺腺癌；RECIST 1.1可测量疾病的一个部位；接受过用于不可治愈或转移性NSCLC的至少一种先前疗法的患者群体；预期寿命≥18周；进入研究时疾病进展；东部合作肿瘤小组(ECOG)的表现状态(PS)≤1。可考虑PS＝2的患者，可允许中枢神经系统(CNS)转移但必须进行治疗且神经稳定；足够的实验室参数；愿意并能够遵守方案并签署知情同意书；具有生育能力的女性患者和可育的男性患者必须同意在整个研究参与过程中使用一种有效的避孕方法；愿意在筛选时和第10周时提供存档或新鲜的肿瘤活检物，并且适合按照包装说明书进行纳武单抗治疗。

排除标准：在过去的21天内接受了全身抗癌疗法；人类免疫缺陷病毒(HIV)；需要积极治疗的与肿瘤无关的乙型或丙型肝炎或严重/无法控制的感染或并发疾病；任何需要同时进行全身免疫抑制疗法的情况；已知的原发性或获得性免疫缺陷病症；已知的柔脑膜病；12个月内发现的活动性肿瘤，但转移或死亡的风险可忽略且预期治愈结局的那些肿瘤除外；怀孕或哺乳；事先用癌症疫苗治疗该适应症；先前参与过viagenpumatucel-L的临床研究；在研究药物首次剂量前30天内施用减毒活疫苗；活动性的、已知的或疑似的自身免疫性疾病及免疫检查点抑制剂的先前治疗。

数据表明，本发明的基于gp96的疫苗通过(不希望受理论束缚)提高肿瘤内的T细胞活性，从而将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤，扩大了对检查点抑制剂有反应的患者的比例(图3A、图3B)。

在第10周时肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)水平升高的患者获得了持久的益处，在一年的随访点时有75％(8名患者中有6名)存活。此外，表现出低TIL的患者中有60％(5名患者中有3名)经历了显著的肿瘤缩小，这与仅用纳武单抗的现有数据所报告的低TIL患者的10％应答率相比具有优势。

在15例ELISPOT分析可评估的患者的12例中观察到T细胞活化、肿瘤缩小与总生存期增加之间的强相关性。重要的是，对HS-110的免疫应答时间与观察到的临床应答的时间相对应，并且这些应答似乎是持续的。

实施例2：患者分析

总共43名患者入选队列A。此患者组包括40例人肺腺癌(AD)患者和3例鳞状细胞癌(SCC)患者。总共18名患者入选队列B(15例AD和3例SCC)。

完成者群体分析

Viagenpumatucel-L(HS-110；ImPACT)是衍生自人腺癌(Ad)细胞系的同种异体细胞疫苗，该细胞系用gp96-Ig融合蛋白转染以分泌gp96细胞衍生的癌症睾丸抗原(CTA)复合物，从而驱动具有临床益处的适应性免疫应答。研究表明，用HS-110和相关的gp96-Ig/CTA产生的疫苗显示出CD8⁺肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的增加与肿瘤应答之间的相关性。如图1和2所示，DURGA试验被设计来评估HS-110与纳武单抗的组合能否引起具有持久记忆的适应性CD8应答，从而能够影响NSCLC患者的临床结局。

为了检查Viagenpumatucel-L和纳武单抗治疗后适应性免疫应答与临床应答之间的相关性，对晚期和先前治疗过的肺腺癌患者采用每周一次剂量的HS-110持续18周和每2周一次3mg/kg纳武单抗治疗直到疾病进展或死亡。测试基线和第10周时的活检组织在肿瘤细胞上的CD8⁺TIL和PD-L1表达水平(图2)。在入选的35名患者中，有6名(17％)获得了部分应答，有14名(40％)得到了疾病控制。完成者分析显示ORR和DCR分别为43％和93％(参见图14)。CPI进展分析显示ORR和DCR分别为22％和50％(参见图20)，这表明Viagenpumatucel-L和纳武单抗的治疗惊人地恢复了未预期有应答的患者中的活性。因此，与单药检查点抑制剂相比，HS-110与纳武单抗的组合具有良好的耐受性，没有额外毒性。阳性适应性免疫应答(定义为最低水平的至少两倍增加)出现在86％所测试的患者中(21名中的18名)。

当比较完成者群体(完成18(+/-2)个剂量的viagenpumatucel-L的研究治疗的患者)与未完成者群体(未完成＜16个剂量的viagenpumatucel-L的研究治疗的患者)时示出更大总体生存期的持续疗法(Time-On-Therapy)显示出总生存期的增加(参见图7)，并且靶病变应答的持久性示于图11中(也参见图5、图11、图13和图23)。此外，显示低至高TIL与临床应答有关。具体来说，在引入viagenpumatucel-L与纳武单抗的组合治疗后，CD8⁺T细胞的水平显著增加，并且与按RECIST 1.1为PR的临床应答有关。

在第1、4、7、13周和HS-110治疗结束时，使用酶联免疫斑点(ELISPOT)测定分析外周血的免疫应答。由用全细胞HS-110疫苗裂解物刺激患者PBMC产生的ELISPOT斑点与接受疗法的患者的总体生存期显著相关(p＝0.06)(参见图16)。

意向治疗和符合方案群体分析

为了检查在用Viagenpumatucel-L和纳武单抗治疗后适应性免疫应答与临床应答的相关性，晚期和先前治疗过的肺腺癌患者接受≥6个剂量的HS-110(每周一次)和≥3个剂量的纳武单抗(抗PD-1)，每两周一次。图4示出了在未曾使用检查点抑制剂(CPI)的ITT患者群体中基于RECIST 1.1的最佳靶病变应答，且图5示出了在未曾使用CPI的符合方案群体中靶病变应答的持久性。类似地，图20示出了基于RECIST 1.1的最佳靶病变应答且图21是线图，示出了针对CPI进展性ITT患者群体的靶病变应答的持久性。图8是生存图，示出了对于未曾使用CPI的群体，高TIL(>10％；n＝14)患者和低TIL(≤10％；n＝14)患者基于基线时肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)水平的总体生存百分比。在图8中，“HR”是指危险比，其中1.0表示与另一组相比(即，低TIL组与高TIL组相比)100％的死亡几率。图8中的结果显示与高TIL患者组相比，低TIL患者组有23％的死亡几率，显著性p值为0.043。

图6示出了ITT群体的总体生存期(OS)曲线，其中位数尚未达到>14.4个月。此患者群体只有一个先前疗程(即化疗)的中位数。同样地，ITT群体是未曾用过CPI的，并且当单独用纳武单抗治疗时，总体生存期中位数为12.2个月。

图9A和图9B是示出了未曾使用CPI的ITT群体中的无进展生存期(PFS)的图(图9A)，以及未曾使用CPI的ITT群体中基于基线时TIL水平的无进展生存期(图9B)。在图9A中，中位PFS(mPFS)为58天，而1年PFS为23.9％。在图9B中，低TIL的1年PFS为31.7％，而高TIL的1年PFS为10.6％。类似地，图18是示出了在ITT患者群体中的PFS的曲线图，该患者群体先前接受了CPI疗法且在6个月或更长时间之后疾病进展，其中mPFS为67天。

图17A和图17B是示出了经历无进展生存期(PFS)的未曾使用CPI的患者的百分比(图17A)或基于PD-L1基线水平的总体生存期(OS)(图17B)的图。PD-L1+(≥1％)患者的1年PFS为30％。就ORR来说，令人惊讶的是，根据基线时PD-L1状态的基于RESIST 1.1的靶病变应答没有差异(图12)。

图12-13示出了在未曾使用CPI的符合方案群体或在CPI进展性群体中基于PD-L1状态的最佳靶病变应答和靶病变应答的持久性(参见图24、图25)。类似地，图10A、10B和图11示出了针对未曾使用CPI的符合方案群体的基于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)状态的最佳靶病变应答和持久性。图22示出了在检查点抑制剂(CPI)进展性群体中基于TIL状态的最佳靶病变应答。图23示出了在CPI进展性群体中基于TIL水平的靶病变应答的持久性。

本文所公开的数据显示，对于队列A，有14名患者(32.6％)为TIL高的，13名(30.2％)为TIL低的，而16名(37.2％)为TIL未知的。在队列A中，ORR、疾病控制率(DCR)、中位无进展生存期(PFS)和1年PFS分别为18.6％、48.8％、1.9个月和23.9％，中位随访时间为432天。在队列B中，当患者同时接受HS-110和纳武单抗时，ORR、DCR和PFS分别为22％、50％和2.2个月，中位随访时间为43天。两个队列均未达到中位总体生存期(mOS)。在队列A中，与TIL高相比，基线时TIL低与mOS增加相关(未达到对比13.8个月，危险比[HR]0.23，95％CI0.068-0.81，p＝0.04)。在队列A中，根据PD-L1状态，mOS没有差异(p＝0.82)。来自队列A和队列B的总共57名(93％)患者经历了至少一种不良事件(AE)，其中39名(64％)为1级或2级。最常见的AE为疲劳(31％)、咳嗽和腹泻(均为19.7％)。有2例由肺栓塞和肿瘤进展引起的5级AE(3.3％)，均与治疗无关。

本文所公开的结果显示，单独使用纳武单抗(抗PD-1)在PD-L1^阴性或PD-L1^低的患者中无效。然而，无论PD-L1状态如何，组合疗法(HS-110+纳武单抗)同样有效。因此，这种组合将纳武单抗的功效扩大至PD-L1_阴性或PD-L1_低的癌症患者以及基线时TIL低的患者。

总之，viagenpumatucel-L(HS-110)与纳武单抗(抗PD-1)的组合是一种安全且有效的治疗。基于ELISPOT的适应性免疫应答与完成HS-110治疗的患者的临床益处以及意向治疗群体的总体生存率提高有关。与未完成者相比，viagenpumatucel-L治疗研究的完成显著提高了总体生存率(p＝0.04)。类似地，低肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)患者对纳武单抗的应答较差。但是，无论TIL状态如何，组合疗法(HS-110+纳武单抗同样有效(例如，在TIL_低和TIL_高中具有类似效果，因此，该组合将纳武单抗的功效扩大到TIL_低的癌症患者，达到其OS益处显著优于TIL_高的患者的程度。此外，在第10周，viagenpumatucel-L与纳武单抗的组合治疗导致CD8⁺T细胞大量浸润于肿瘤组织，并与肿瘤缩小的临床应答相关(根据RECIST 1.1得出部分应答)。

因此，非限制性地，实施例1和2显示了viagenpumatucel-L(HS-110)加纳武单抗在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的临床成功。先前接受过治疗的NSCLC患者在前18周每周一次接受1X10⁷个HS-110细胞，并且每2周一次3mg/kg或240mg纳武单抗，直至不可耐受的毒性或肿瘤进展。在基线时测试组织的PD-L1表达(≥1％或<1％)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。肿瘤基质中有超过10％的CD8+淋巴细胞被定义为TIL高的。在队列A中的患者从未接受过ICB，而在队列B中的患者先前接受过ICB。主要目标是安全性和客观应答率(ORR)。队列A入选了43名患者(40例AD和3例鳞状细胞癌[SCC])，而队列B入选了18名患者(15例AD和3例SCC)。在队列A中，14名患者(32.6％)为TIL高的，13名(30.2％)TIL低的且16名(37.2％)TIL未知。在队列A中，ORR、疾病控制率(DCR)、中位无进展生存期(PFS)和1年PFS分别为18.6％、48.8％、1.9个月和23.9％，中位随访时间为432天。在队列B中，ORR、DCR和PFS分别为22％、50％和2.2个月，中位随访时间为43天。两个队列均未达到中位总体生存期(mOS)。在队列A中，与TIL高相比，基线时TIL低与mOS增加相关(未达到对比13.8个月，危险比[HR]0.23，95％CI 0.068-0.81，p＝0.04)。在队列A中，根据PD-L1状态，mOS没有差异(p＝0.82)。57名(93％)患者经历了至少一种不良事件(AE)，其中39名(64％)为1级或2级。最常见的AE是疲劳(31％)、咳嗽和腹泻(均为19.7％)。有2例由肺栓塞和肿瘤进展引起的5级不良事件(3.3％)，均与治疗无关。

序列

全长人gp-96的核苷酸序列(Genbank登录号X15187)：

Genbank登录号CAA33261的人gp96基因的氨基酸序列：

Gp96的保留序列：KDEL(SEQ ID NO:3)。

缺失KDEL序列的人gp96基因的氨基酸序列：

缺少铰链区的人Fc结构域序列的氨基酸序列：

其他实施方案

应理解，尽管已结合其具体实施方式描述了本公开，但以上描述意为说明性而不是限制本公开的范围，本公开的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在随后的权利要求范围内。

通过引用并入

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序列表

<110> 热生物制品有限公司(HEAT BIOLOGICS, INC.)

<120> 基于GP96的癌症疗法

<130> HTB-027PC

<140> PCT/US18/62621

<141> 2018-11-27

<150> US 62/590,785

<151> 2017-11-27

<150> US 62/635,958

<151> 2018-02-27

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

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770 775 780

Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu

785 790 795

<210> 5

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

Claims (64)

1.一种治疗肺癌的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用：(a)带有表达载体的细胞，所述表达载体包含编码可分泌的疫苗蛋白的核苷酸序列，和(b)免疫检查点抑制剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制免疫检查点基因。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述免疫检查点基因选自程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体1(PD-L2)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)、肿瘤坏死因子受体超家族成员25(TNFRSF25)、死亡受体3(DR3)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)和淋巴细胞活化基因3(LAG-3)。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述免疫检查点基因是PD-1或PD-L1。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段选自纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)，且所述PD-L1抗体或其抗原结合片段是度伐鲁单抗(durvalumab)。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段是纳武单抗。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述肺癌是小细胞肺癌。

10.如权利要求1或9所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。

11.如权利要求1、9或10中任一项所述的方法，其中所述非小细胞肺癌是腺癌。

12.如权利要求1、9或10中任一项所述的方法，其中所述非小细胞肺癌是鳞状细胞癌或大细胞肺癌。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述方法减少肺癌复发。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中的肿瘤抗原特异性T细胞的活化或增殖。

15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中的CD8+T细胞的活化或数量。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中分泌IFN-γ的CD8+T细胞的活化或数量。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用低剂量的所述细胞治疗所述受试者。

18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用约100,000个细胞、约150,000个细胞、约200,000个细胞、约250,000个细胞、约300,000个细胞、约350,000个细胞、约400,000个细胞、约450,000个细胞、约500,000个细胞、约550,000个细胞、约600,000个细胞、约650,000个细胞、约700,000个细胞、约750,000个细胞、约800,000个细胞、约850,000个细胞、约900,000个细胞、约950,000个细胞、或约1,000,000个细胞、或约1,500,000个细胞、或约2,000,000个细胞、或约2,500,000个细胞、或约3,000,000个细胞、或约3,500,000个细胞、或约4,000,000个细胞、或约4,500,000个细胞、或约5,000,000个细胞、或约5,500,000个细胞、或约6,000,000个细胞、或约6,500,000个细胞、或约7,000,000个细胞、或约7,500,000个细胞、或约8,000,000个细胞、或约8,500,000个细胞、或约9,000,000个细胞、或约9,500,000个细胞、或约10,000,000个细胞。

19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者在施用后表现出免疫应答的强劲增加。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述免疫应答的强劲增加被定义为CD8+T细胞的活化或增殖比基线高至少2倍的增加。

21.如权利要求18或19所述的方法，其中所述CD8+T细胞分泌IFN-γ。

22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述方法在减少所述受试者的肺癌复发方面，比未表现出免疫应答强劲增加的受试者更有效。

23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者在施用之前表现出少量的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述方法在减少所述受试者的癌症复发方面，与仅用所述免疫检查点抑制剂的治疗相比更有效。

25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述载体是哺乳动物表达载体。

26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疫苗蛋白是可分泌的gp96-Ig融合蛋白，所述融合蛋白任选地缺少gp96KDEL(SEQ ID NO:3)序列。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述gp96-Ig融合蛋白中的Ig标签包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA或IgE的Fc区。

28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体包含DNA。

29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体包含RNA。

30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是经照射的或活的和减毒的人肿瘤细胞。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述人肿瘤细胞是来自已建立的NSCLC、膀胱癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、前列腺癌、肉瘤、乳腺癌、鳞状细胞癌、头颈癌、肝细胞癌、胰腺癌或结肠癌细胞系的细胞。

32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述人肿瘤细胞系是NSCLC细胞系。

33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用(a)带有包含编码所述可分泌疫苗蛋白的核苷酸序列的所述表达载体的所述细胞之前，且在施用(b)所述免疫检查点抑制剂之前，所述受试者在接受疗法后经历了疾病进展。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述疗法是免疫检查点抑制剂疗法。

35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述疗法包括化疗。

36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述受试者是所述免疫检查点抑制剂疗法的不良应答者。

37.如权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述免疫检查点抑制剂疗法失败。

38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中即使施用所述免疫检查点抑制剂疗法，所述受试者的所述疾病仍已进展。

39.一种治疗NSCLC患者的方法，所述方法包括：

a)向所述患者每周一次施用HS-110的剂量，持续至少6周；以及

b)向所述患者每两周一次施用抗PD-1抗体的剂量，持续至少6周。

40.一种治疗PD-L1^阴性或PD-L1^低状态的NSCLC患者的方法，所述方法包括：

a)向所述患者每周一次施用HS-110的剂量，持续至少16周；以及

b)向所述患者每两周一次施用抗PD-1抗体的剂量，持续至少16周。

41.一种治疗PD-L1^阴性或PD-L1^低状态的NSCLC患者的方法，所述方法包括：

a)向所述患者每周一次施用HS-110的剂量，持续至少6周；以及

b)向所述患者每两周一次施用抗PD-1抗体的剂量，持续至少6周。

42.一种提高抗PD-1疗法在PD-L1^阴性或PD-L1^低状态的NSCLC患者中的功效的方法，所述方法包括：

a)向所述患者每周一次施用HS-110的剂量，持续至少16周；以及

b)向所述患者每两周一次施用抗PD-1抗体的剂量，持续至少16周。

43.一种提高抗PD-1疗法在PD-L1^阴性或PD-L1^低状态的NSCLC患者中的功效的方法，所述方法包括：

a)向所述患者每周一次施用HS-110的剂量，持续至少6周；以及

b)向所述患者每两周一次施用抗PD-1抗体的剂量，持续至少6周。

44.一种提高抗PD-1疗法在具有低肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)状态(TIL^低)的NSCLC患者中的功效的方法，所述方法包括：

a)向所述患者每周一次施用HS-110的剂量，持续至少16周；以及

b)向所述患者每两周一次施用抗PD-1抗体的剂量，持续至少16周。

45.一种提高抗PD-1疗法在具有低肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)状态(TIL^低)的NSCLC患者中的功效的方法，所述方法包括：

a)向所述患者每周一次施用HS-110的剂量，持续至少6周；以及

b)向所述患者每两周一次施用抗PD-1抗体的剂量，持续至少6周。

46.如权利要求39-45中任一项所述的方法，其中HS-110的所述剂量为约1×10⁷个细胞。

47.如权利要求39-46中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体的所述剂量是240mg。

48.如权利要求39-47中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体选自纳武单抗和帕博利珠单抗。

49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者在接受疗法后经历了疾病进展。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述疗法是免疫检查点抑制剂疗法。

51.如权利要求49或50所述的方法，其中所述疗法包括化疗。

52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述患者是所述免疫检查点抑制剂疗法的不良应答者。

53.如权利要求49-52中任一项所述的方法，其中所述患者的所述免疫检查点抑制剂疗法失败。

54.如权利要求49-53中任一项所述的方法，其中即使施用所述免疫检查点抑制剂疗法，所述患者的所述疾病仍已进展。

55.如权利要求39-54中任一项所述的方法，其中所述方法减少肺癌复发。

56.如前述权利要求39-55中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中的肿瘤抗原特异性T细胞的活化或增殖。

57.如权利要求39-56中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中的CD8+T细胞的活化或数量。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中分泌IFN-γ的CD8+T细胞的活化或数量。

59.如权利要求39-58中任一项所述的方法，其中所述受试者在施用后表现出免疫应答的强劲增加。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述免疫应答的强劲增加被定义为CD8+T细胞的活化或增殖比基线高至少2倍的增加。

61.如权利要求60所述的方法，其中所述CD8+T细胞分泌IFN-γ。

62.如权利要求39-61中任一项所述的方法，其中所述方法在减少所述受试者的肺癌复发方面，比未表现出免疫应答的强劲增加的受试者更有效。

63.如权利要求39-62中任一项所述的方法，其中所述受试者在施用之前表现出少量的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。

64.如权利要求39-63中任一项所述的方法，其中所述方法在减少所述受试者的癌症复发方面，与仅用所述免疫检查点抑制剂的治疗相比更有效。

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