JP2018172414A - 新生物を治療するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】癌を治療する方法の提供。
【解決手段】有効量のＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより癌を改善することを含む、被験者において癌を改善する方法。前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、前記方法。前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、前記方法。前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、前記方法。
【選択図】図１

Description

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下で為された発明への権利の記載

本研究は、認可番号ＣＡ０９７５５０の下に国立衛生研究所からの助成金による支援を受けた。政府は本発明に一定の権利を有する。

米国において、膀胱癌（本明細書では尿路上皮癌とも称する）は、男性では４番目に多く、女性では９番目に多いタイプの癌であり、年間当たり新しい症例は推定７０，５００例（男性５２，７６０例および女性１７，７７０例）、死亡は推定１４，６８０例（男性１０，４１０例および女性４，２７０例）にのぼる（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ，６０：２７７−３００，２０１０）。限局性疾患はしばしば、免疫療法（カルメット‐ゲラン杆菌）、サイトスコープに接続された電気メス装置を用いてまたは膀胱切除術によって治療される。進行した疾患は、化学療法または化学療法と放射線の併用によって治療されることが多い。従来の単剤化学療法で治療された転移性の筋層浸潤性膀胱癌患者に関して、平均生存期間はおよそ７〜８か月である（Ｒａｇｈａｖａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３２２：１１２９−１１３８，１９９０）。メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシンおよびシスプラチン（ＭＶＡＣ）ならびにゲムシタビンとシスプラチン（ＧＣ）を含む併用細胞傷害性レジメンが転移性膀胱癌の管理に導入されたことにより、平均生存期間の数字は１３か月以上とほぼ倍加し、約２０％〜２５％が３年の生存期間である（Ｌｏｅｈｒｅｒ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１０：１０６６−１０７３，１９９２；ｖｏｎ ｄｅｒ Ｍａａｓｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１８：３０６８−３０７７，２０００）。それにもかかわらず、癌による死亡は最終的にこのような症例の９０％超で起こっており、この２０年間、進行／転移性膀胱癌のための新薬は認可されていない。現在の治療選択肢の限られた効果を考慮すると、さらなる治療方法が必要である。

Ｊｅｍａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ，６０：２７７−３００，２０１０ Ｒａｇｈａｖａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３２２：１１２９−１１３８，１９９０ Ｌｏｅｈｒｅｒ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１０：１０６６−１０７３，１９９２ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｍａａｓｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１８：３０６８−３０７７，２０００

以下で述べるように、本発明は癌を治療する方法に関する。好ましい実施形態では、本発明は、癌を有する被験者にＩＬ−２融合タンパク質を１つまたは複数の治療薬と組み合わせて癌を治療するための有効量で投与することに関する。

１つの態様では、本発明は一般に、有効量のＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより癌を改善することを含む、被験者において癌を改善する方法に関する。

別の態様では、本発明は、有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより腫瘍体積を低減することを含む、被験者において腫瘍負荷を低減する方法に関する。

さらに別の態様では、本発明は、有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより化学療法抵抗性癌を治療することを含む、被験者において化学療法抵抗性癌を治療する方法に関する。

さらなる態様では、本発明は、有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより癌に対する持続的な免疫記憶応答を誘導することを含む、被験者において癌に対する持続的な免疫記憶応答を誘導する方法に関する。

さらに別の態様では、本発明は、有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより被験者の生存率を高めることを含む、癌を有する被験者の生存率を高める方法に関する。

別の態様では、本発明は、ＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を含む、膀胱癌の治療のためのキットに関する。

上記態様のいずれかまたは本明細書で説明する本発明の他の態様の様々な実施形態において、ＩＬ−２融合タンパク質は癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない。別の実施形態では、ＩＬ−２融合タンパク質はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞受容体ドメインは一本鎖Ｔ細胞受容体である。さらなる実施形態では、１つまたは複数の治療薬は、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される。他の実施形態では、１つまたは複数の治療薬は、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される。さらに別の実施形態では、癌は、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される。さらなる実施形態では、癌は膀胱癌または尿路上皮癌である。なおさらなる実施形態では、癌は化学療法抵抗性である。他の実施形態では、ＩＬ−２融合タンパク質と１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する。さらなる他の実施形態では、ＩＬ−２融合タンパク質と１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する。付加的な実施形態では、ＩＬ−２融合タンパク質はＡＬＴ−８０１であり、１つまたは複数の治療薬はシスプラチンである。さらなる実施形態では、１つまたは複数の治療薬はゲムシタビンである。さらなる付加的な実施形態では、ＩＬ−２融合タンパク質は癌細胞を特異的に標的とする。一部の実施形態では、ＩＬ−２融合タンパク質は、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする。

本発明によって定義される組成物および製品は、単離されているかまたはさもなければ以下で提供される実施例に関連して製造された。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。

定義

「腫瘍細胞量」とも称される「腫瘍負荷」とは、癌細胞の数、腫瘍の大きさ、または体内の癌の量を意味する。

「ＩＬ−２融合タンパク質」とは、第二のポリペプチドに融合した完全長ＩＬ−２タンパク質全体またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドを意味する。第二のポリペプチドは、標的化ポリペプチド、すなわち抗体またはその抗原結合フラグメント；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそのペプチド結合フラグメント；受容体またはそのリガンド結合ドメイン等であり得、第二ポリペプチドは、ＩＬ−２融合タンパク質を特異的に癌細胞に標的化するまたはＩＬ−２融合タンパク質を特異的に癌細胞へと向かわせる。あるいは、第二ポリペプチドは非標的化ポリペプチド、すなわちＩＬ−２融合タンパク質を特異的に癌細胞に標的化しないまたはＩＬ−２融合タンパク質を特異的に癌細胞へと向かわせないポリペプチドであってもよい。

「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメイン」とは、適切なＭＨＣまたはＨＬＡ分子において提示されるコグネイトペプチドに結合するのに必要なＴ細胞受容体の部分すべてを含むポリペプチドを意味する。ＴＣＲドメインの非限定的な例は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４５６，２６３号；米国特許第６，５３４，６３３号；米国特許出願公開第２００３／０１４４４７４号；および米国特許出願公開第２０１１／００７０１９１号に記載されている。

「ＡＬＴ−８０１」とは、ＩＬ−２と、ヒトｐ５３ペプチド（アミノ酸２６４〜２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１に結合することができるＴＣＲドメインとの融合物（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２）を意味する。シグナル配列を含む、ＡＬＴ−８０１の例示的なアミノ酸配列は以下のとおりである：

Ｍｅｔｄｔｌｌｌｗｖｌｌｌｗｖｐｇｓｔｇｑｓｖｔｑｐｄａｒｖｔｖｓｅｇａｓｌｑｌｒｃｋｙｓｙｓｇｔｐｙｌ ｆｗｙｖｑｙｐｒｑｇｌｑｌｌｌｋｙｙｓｇｄｐｖｖｑｇｖｎｇｆｅａｅｆｓｋｓｎｓｓｆｈｌｒｋａｓｖｈｗｓｄ ｓａｖｙｆｃｖｌｓｅｄｓｎｙｑｌｉｗｇｓｇｔｋｌｉｉｋｐｄｔｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｓ ｓｎｓｋｖｉｑｔｐｒｙｌｖｋｇｑｇｑｋａｋｍｒｃｉｐｅｋｇｈｐｖｖｆｗｙｑｑｎｋｎｎｅｆｋｆｌｉｎｆｑｎ ｑｅｖｌｑｑｉｄｍｔｅｋｒｆｓａｅｃｐｓｎｓｐｃｓｌｅｉｑｓｓｅａｇｄｓａｌｙｌｃａｓｓｌｓｇｇｇｔｅｖ ｆｆｇｋｇｔｒｌｔｖｖｅｄｌｎｋｖｆｐｐｅｖａｖｆｅｐｓｅａｅｉｓｈｔｑｋａｔｌｖｃｌａｔｇｆｆｐｄｈｖ ｅｌｓｗｗｖｎｇｋｅｖｈｓｇｖｓｔｄｐｑｐｌｋｅｑｐａｌｎｄｓｒｙｃｌｓｓｒｌｒｖｓａｔｆｗｑｎｐｒｎｈ ｆｒｃｑｖｑｆｙｇｌｓｅｎｄｅｗｔｑｄｒａｋｐｖｔｑｉｖｓａｅａｗｇｒａｄｖｎａｋｔｔａｐｓｖｙｐｌａｐ ｖｓｇａｐｔｓｓｓｔｋｋｔｑｌｑｌｅｈｌｌｌｄｌｑｍｉｌｎｇｉｎｎｙｋｎｐｋｌｔｒｍｌｔｆｋｆｙｍｐｋｋ ａｔｅｌｋｈｌｑｃｌｅｅｅｌｋｐｌｅｅｖｌｎｌａｑｓｋｎｆｈｌｒｐｒｄｌｉｓｎｉｎｖｉｖｌｅｌｋｇｓｅｔ ｔｆｍｃｅｙａｄｅｔａｔｉｖｅｆｌｎｒｗｉｔｆｃｑｓｉｉｓｔｌｔ。

シグナル配列を含まない、成熟ＡＬＴ−８０１の例示的なアミノ酸配列は以下のとおりである：

ｑｓｖｔｑｐｄａｒｖｔｖｓｅｇａｓｌｑｌｒｃｋｙｓｙｓｇｔｐｙｌｆｗｙｖｑｙｐｒｑｇｌｑｌｌｌｋｙｙｓｇ ｄｐｖｖｑｇｖｎｇｆｅａｅｆｓｋｓｎｓｓｆｈｌｒｋａｓｖｈｗｓｄｓａｖｙｆｃｖｌｓｅｄｓｎｙｑｌｉｗｇｓ ｇｔｋｌｉｉｋｐｄｔｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｓｓｎｓｋｖｉｑｔｐｒｙｌｖｋｇｑｇｑｋａ ｋｍｒｃｉｐｅｋｇｈｐｖｖｆｗｙｑｑｎｋｎｎｅｆｋｆｌｉｎｆｑｎｑｅｖｌｑｑｉｄｍｔｅｋｒｆｓａｅｃｐｓ ｎｓｐｃｓｌｅｉｑｓｓｅａｇｄｓａｌｙｌｃａｓｓｌｓｇｇｇｔｅｖｆｆｇｋｇｔｒｌｔｖｖｅｄｌｎｋｖｆｐｐ ｅｖａｖｆｅｐｓｅａｅｉｓｈｔｑｋａｔｌｖｃｌａｔｇｆｆｐｄｈｖｅｌｓｗｗｖｎｇｋｅｖｈｓｇｖｓｔｄｐｑ ｐｌｋｅｑｐａｌｎｄｓｒｙｃｌｓｓｒｌｒｖｓａｔｆｗｑｎｐｒｎｈｆｒｃｑｖｑｆｙｇｌｓｅｎｄｅｗｔｑｄｒ ａｋｐｖｔｑｉｖｓａｅａｗｇｒａｄｖｎａｋｔｔａｐｓｖｙｐｌａｐｖｓｇａｐｔｓｓｓｔｋｋｔｑｌｑｌｅｈｌ ｌｌｄｌｑｍｉｌｎｇｉｎｎｙｋｎｐｋｌｔｒｍｌｔｆｋｆｙｍｐｋｋａｔｅｌｋｈｌｑｃｌｅｅｅｌｋｐｌｅｅｖ ｌｎｌａｑｓｋｎｆｈｌｒｐｒｄｌｉｓｎｉｎｖｉｖｌｅｌｋｇｓｅｔｔｆｍｃｅｙａｄｅｔａｔｉｖｅｆｌｎｒｗ ｉｔｆｃｑｓｉｉｓｔｌｔ。

ＡＬＴ−８０１をコードする例示的な核酸配列は以下のとおりである：

ａｔｇｇａｇａｃａｇａｃａｃａｃｔｃｃｔｇｔｔａｔｇｇｇｔａｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｔｔｃｃａｇｇｔｔ ｃｃａｃｃｇｇｔｃａｇｔｃａｇｔｇａｃｇｃａｇｃｃｃｇａｔｇｃｔｃｇｃｇｔｃａｃｔｇｔｃｔｃｔｇａａｇｇ ａｇｃｃｔｃｔｃｔｇｃａｇｃｔｇａｇａｔｇｃａａｇｔａｔｔｃｃｔａｃｔｃｔｇｇｇａｃａｃｃｔｔａｔｃｔｇ ｔｔｃｔｇｇｔａｔｇｔｃｃａｇｔａｃｃｃｇｃｇｇｃａｇｇｇｇｃｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｃｃｔｃａａｇｔａｃｔ ａｔｔｃａｇｇａｇａｃｃｃａｇｔｇｇｔｔｃａａｇｇａｇｔｇａａｔｇｇｃｔｔｃｇａｇｇｃｔｇａｇｔｔｃａｇ ｃａａｇａｇｔａａｃｔｃｔｔｃｃｔｔｃｃａｃｃｔｇｃｇｇａａａｇｃｃｔｃｔｇｔｇｃａｃｔｇｇａｇｃｇａｃ ｔｃｔｇｃｔｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｔｇｔｔｔｔｇａｇｃｇａｇｇａｔａｇｃａａｃｔａｔｃａｇｔｔｇａｔｃｔ ｇｇｇｇｃｔｃｔｇｇｇａｃｃａａｇｃｔａａｔｔａｔａａａｇｃｃａｇａｃａｃｔａｇｔｇｇｔｇｇｃｇｇｔｇｇ ｃａｇｃｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｃｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇｔｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｔｔｃｃｔｃｇ ａｇｃａａｔｔｃａａａａｇｔｃａｔｔｃａｇａｃｔｃｃａａｇａｔａｔｃｔｇｇｔｇａａａｇｇｇｃａａｇｇａｃ ａａａａａｇｃａａａｇａｔｇａｇｇｔｇｔａｔｃｃｃｔｇａａａａｇｇｇａｃａｔｃｃａｇｔｔｇｔａｔｔｃｔｇ ｇｔａｔｃａａｃａａａａｔａａｇａａｃａａｔｇａｇｔｔｔａａａｔｔｔｔｔｇａｔｔａａｃｔｔｔｃａｇａａｔ ｃａａｇａａｇｔｔｃｔｔｃａｇｃａａａｔａｇａｃａｔｇａｃｔｇａａａａａｃｇａｔｔｃｔｃｔｇｃｔｇａｇｔ ｇｔｃｃｔｔｃａａａｃｔｃａｃｃｔｔｇｃａｇｃｃｔａｇａａａｔｔｃａｇｔｃｃｔｃｔｇａｇｇｃａｇｇａｇａ ｃｔｃａｇｃａｃｔｇｔａｃｃｔｃｔｇｔｇｃｃａｇｃａｇｔｃｔｇｔｃａｇｇｇｇｇｃｇｇｃａｃａｇａａｇｔｔ ｔｔｃｔｔｔｇｇｔａａａｇｇａａｃｃａｇａｃｔｃａｃａｇｔｔｇｔａｇａｇｇａｃｃｔｇａａｃａａｇｇｔｇｔ ｔｃｃｃａｃｃｃｇａｇｇｔｃｇｃｔｇｔｇｔｔｔｇａｇｃｃａｔｃａｇａａｇｃａｇａｇａｔｃｔｃｃｃａｃａｃ ｃｃａａａａｇｇｃｃａｃａｃｔｇｇｔｇｔｇｃｃｔｇｇｃｃａｃａｇｇｃｔｔｃｔｔｃｃｃｔｇａｃｃａｃｇｔｇ ｇａｇｅｔｇａｇｅｔｇｇｔｇｇｇｔｇａａｔｇｇｇａａｇｇａｇｇｔｇｃａｃａｇｔｇｇｇｇｔｃａｇｃａｃｇｇ ａｃｃｃｇｃａｇｃｃｃｃｔｃａａｇｇａｇｃａｇｃｃｃｇｃｃｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｃａｇａｔａｃｔｇｃｃｔ ｇａｇｃａｇｃｃｇｃｃｔｇａｇｇｇｔｃｔｃｇｇｃｃａｃｃｔｔｃｔｇｇｃａｇａａｃｃｃｃｃｇｃａａｃｃａｃ ｔｔｃｃｇｃｔｇｔｃａａｇｔｃｃａｇｔｔｃｔａｃｇｇｇｃｔｃｔｃｇｇａｇａａｔｇａｃｇａｇｔｇｇａｃｃｃ ａｇｇａｔａｇｇｇｃｃａａａｃｃｃｇｔｃａｃｃｃａｇａｔｃｇｔｃａｇｃｇｃｃｇａｇｇｃｃｔｇｇｇｇｔａｇ ａｇｃａｇａｃｇｔｔａａｃｇｃａａａｇａｃａａｃｃｇｃｃｃｃｔｔｃａｇｔａｔａｔｃｃａｃｔａｇｃｇｃｃｃ ｇｔｔｔｃｃｇｇａｇｃａｃｃｔａｃｔｔｃａａｇｔｔｃｔａｃａａａｇａａａａｃａｃａｇｃｔａｃａａｃｔｇｇ ａｇｃａｔｔｔａｃｔｇｃｔｇｇａｔｔｔａｃａｇａｔｇａｔｔｔｔｇａａｔｇｇａａｔｔａａｔａａｔｔａｃａａ ｇａａｔｃｃｃａａａｃｔｃａｃｃａｇｇａｔｇｃｔｃａｃａｔｔｔａａｇｔｔｔｔａｃａｔｇｃｃｃａａｇａａｇ ｇｃｃａｃａｇａａｃｔｇａａａｃａｔｃｔｔｃａｇｔｇｔｃｔａｇａａｇａａｇａａｃｔｃａａａｃｃｔｃｔｇｇ ａｇｇａａｇｔｇｃｔａａａｔｔｔａｇｃｔｃａａａｇｃａａａａａｃｔｔｔｃａｃｔｔａａｇａｃｃｃａｇｇｇａ ｃｔｔａａｔｃａｇｃａａｔａｔｃａａｃｇｔａａｔａｇｔｔｃｔｇｇａａｃｔａａａｇｇｇａｔｃｔｇａａａｃａ ａｃａｔｔｃａｔｇｔｇｔｇａａｔａｔｇｃｔｇａｔｇａｇａｃａｇｃａａｃｃａｔｔｇｔａｇａａｔｔｔｃｔｇａ ａｃａｇａｔｇｇａｔｔａｃｃｔｔｔｔｇｔｃａａａｇｃａｔｃａｔｃｔｃａａｃａｃｔａａｃｔｔａａ。

「ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２」とは、ＩＬ−２と、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１に関連して提示されるＭＡＲＴ−１ペプチド（アミノ酸２７〜３５）に結合することができるＴＣＲドメインとの融合物を意味する。シグナル配列を含む、ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の例示的なアミノ酸配列は以下のとおりである；

Ｍｅｔｄｔｌｌｌｗｖｌｌｌｗｖｐｇｓｔｇｑｋｅｖｅｑｎｓｇｐｌｓｖｐｅｇａｉａｓｌｎｃｔｙｓｄｒｇｓｑｓ ｆｆｗｙｒｑｙｓｇｋｓｐｅｌｉｍｆｉｙｓｎｇｄｋｅｄｇｒｆｔａｑｌｎｋａｓｑｙｖｓｌｌｉｒｄｓｑｐｓｄｓ ａｔｙｌｃａｖｎｆｇｇｇｋｌｉｆｇｑｇｔｅｌｓ ｋｐｄｔｓｇｇｇｇｓｇｇｇａｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｓｓｉ ａｇｉｔｑａｐｔｓｑｉｌａａｇｒｒｍｔｌｒｃｔｑｄｍｒｈｎａｍｙｗｙｒｑｄｌｇｌｇｌｒｌｉｈｙｓｎｔａｇ ｔｔｇｋｇｅｖｐｄｇｙｓｖｓｒａｎｔｄｄｆｐｌｔｌａｓａｖｐｓｑｔｓｖｙｆｃａｓｓｌｓｆｇｔｅａｆｆｇｑ ｇｔｒｌｔｖｖｅｄｌｎｋｖｆｐｐｅｖａｖｆｅｐｓｅａｅｉｓｈｔｑｋａｔｌｖｃｌａｔｇｆｆｐｄｈｖｅｌｓｗ ｗｖｎｇｋｅｖｈｓｇｖｓｔｄｐｑｐｌｋｅｑｐａｌｎｄｓｒｙｃｌｓｓｒｌｒｖｓａｔｆｗｑｎｐｒｎｈｆｒｃｑ ｖｑｆｙｇｌｓｅｎｄｅｗｔｑｄｒａｋｐｖｔｑｉｖｓａｅａｗｇｒａｄｖｎａｋｔｔａｐｓｖｙｐｌａｐｖｓｇａ ｐｔｓｓｓｔｋｋｔｑｌｑｌｅｈｌｌｌｄｌｑｍｉｌｎｇｉｎｎｙｋｎｐｋｌｔｒｍｌｔｆｋｆｙｍｐｋｋａｔｅｌ ｋｈｌｑｃｌｅｅｅｌｋｐｌｅｅｖｌｎｌａｑｓｋｎｆｈｌｒｐｒｄｌｉｓｎｉｎｖｉｖｌｅｌｋｇｓｅｔｔｆｍｃ ｅｙａｄｅｔａｔｉｖｅｆｌｎｒｗｉｔｆｃｑｓｉｉｓｔｌｔ。

シグナル配列を含まない、成熟ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の例示的なアミノ酸配列は以下のとおりである：

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ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２をコードする例示的な核酸配列は以下のとおりである：

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「作用物質」とは、任意の低分子化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、またはそれらのフラグメントを意味する。

「治療薬」とは、癌の治療において使用される任意の化学療法剤または生物療法剤を意味する。治療薬の非限定的な説明例には、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットが含まれる。

「化学療法抵抗性」とは、１つまたは複数の治療薬に対して抵抗性となった癌または癌細胞を意味する。

「改善する」とは、疾患の発症または進行を低減する、抑制する、減弱させる、軽減する、停止させるまたは安定化することを意味する。

「腫瘍に対する持続的な免疫記憶応答を誘導する」とは、治療が誘導する、その後の抗原投与または腫瘍の再増殖または癌性増殖に対する抵抗性を意味する。

「変化」とは、本明細書で述べるような標準的な当分野で公知の方法によって検出される遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（上昇または低下）を意味する。本明細書で使用する場合、変化は、発現レベルの１０％の変化、好ましくは２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、最も好ましくは５０％またはそれ以上の発現レベルの変化を包含する。

「類似体」とは、同一ではないが、類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、天然のポリペプチドに比べて類似体の機能を増強する特定の生化学的修飾を有するが、対応する天然のポリペプチドの生物学的活性を保持する。そのような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変化させることなく、類似体のプロテアーゼ抵抗性、膜透過性または半減期を増大させ得る。類似体は、非天然アミノ酸を包含し得る。

本開示では、「含む」、「含むこと」、「含有すること」および「有すること」等は、米国特許法においてそれらに帰せられる意味を有することができ、「包含する」、「包含すること」等を意味し得る；「基本的に〜から成る」は、同様に米国特許法において帰せられる意味を有し、この用語は非制限的であり、列挙されるものの基本的または新規特性が、列挙されるものを上回るものの存在によって変化しない限り、列挙されるものを上回るものの存在を許容するが、先行技術の実施形態を除外する。

「検出する」は、検出すべき分析物の存在、不在または量を同定することを指す。

「検出可能標識」とは、関心対象の分子に連結された場合、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段を介して、関心対象の分子を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンが含まれる。

「疾患」とは、細胞、組織または器官の正常な機能を損なうまたは妨げる何らかの状態または障害を意味する。疾患の例には癌が含まれる。

「有効量」または「治療量」とは、未処置の患者と比較して疾患の症状を治療する、予防するまたは改善するのに必要な量を意味する。疾患の治療処置のために本発明を実施するのに使用される活性化合物の有効量は、投与の方法、被験者の年齢、体重および全般的健康状態に依存して異なる。最終的には、主治医または担当獣医が適切な量および投薬レジメンを決定する。そのような量を「有効」量と称する。

「フラグメント」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を含む。フラグメントは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。

「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸塩基の間の水素結合を意味し、これは、ワトソン‐クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であり得る。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成を介して対合する相補的核酸塩基である。

「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然のゲノムにおいて、対象遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（例えばＤＮＡ）を意味する。この用語は、それゆえ、例えばベクター、自律複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、または他の配列とは独立した別個の分子（例えばＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるｃＤＮＡまたはゲノムもしくはｃＤＮＡフラグメント）として存在する、組換えＤＮＡを包含する。加えて、この用語は、ＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子、ならびに付加的なポリペプチド配列をコードする雑種遺伝子の一部である組換えＤＮＡを包含する。

「単離されたポリペプチド」とは、天然に付随する成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に結合しているタンパク質および天然有機分子を少なくとも６０重量％含まない場合、単離されている。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば天然供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質を化学合成することによって得られ得る。純度は、任意の適切な方法によって、例えばカラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。

「マーカー」とは、疾患または障害に関連する発現レベルまたは活性の変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。

本明細書で使用する場合、「作用物質を得ること」におけるような「得ること」は、作用物質を合成すること、購入すること、またはさもなければ取得することを包含する。

「プライマーセット」は、例えばＰＣＲのために使用し得るオリゴヌクレオチドのセットを意味する。プライマーセットは、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００またはそれ以上のプライマーから成る。

本明細書で使用する場合、「組換え」は、対象ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを発現する細胞を使用して生成されたポリペプチドへの言及を包含する。細胞は、適切な単離された核酸配列の導入によって遺伝的に変化しているため、組換えポリペプチドを産生する。この用語はまた、異種核酸の導入もしくは天然核酸の、その細胞にとって天然ではない形態への変化によって改変されている、または対象細胞が、そのように改変された細胞に由来する、細胞または核酸またはベクターへの言及も包含する。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内では見出されない遺伝子を発現する、天然形態の細胞内で見出される遺伝子の突然変異体を発現する、または、さもなければ異常に発現される、過少発現されるもしくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。

「低減する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または１００％の負の変化を意味する。

「参照」とは、標準条件または対照条件を意味する。

「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、指定配列のサブセットまたは全体、例えば、完全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドに関しては、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、さらに一層好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸または約１００アミノ酸である。核酸については、参照核酸配列の長さは、一般に少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、さらに一層好ましくは約１００ヌクレオチドまたは約３００ヌクレオチドまたはそのあたりもしくはその間の任意の整数である。

「特異的に結合する」とは、特定のマーカーを発現する癌細胞を認識し、これに結合するが、試料中の他の細胞は実質的に認識せず、これには実質的に結合しない融合タンパク質を意味する。

「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば本明細書で述べるアミノ酸配列のいずれか１つ）または参照核酸配列（例えば本明細書で述べる核酸配列のいずれか１つ）に少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列とアミノ酸レベルまたは核酸レベルで少なくとも６０％、より好ましくは８０％または８５％、より好ましくは９０％、９５％またはさらに９９％同一である。

配列同一性は、典型的には配列解析ソフトウェア（例えば、ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰまたはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失および／または他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換には、典型的には以下の群の中での置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する１つの例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用でき、ｅ^−３〜ｅ^−１００の確率スコアは密接に関係する配列を指示する。

「被験者」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジもしくはネコなどを含むがこれらに限定されない、哺乳動物を意味する。

本明細書で使用する「腫瘍」は、悪性であるか良性であるかに関わらず、すべての新生物細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性細胞および組織を指す。

本明細書で与えられる範囲は、その範囲内のすべての値についての省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０から成る群からの任意の数、数の組合せまたは部分的範囲を包含すると理解される。

本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」等の用語は、障害および／またはそれに関連する症状を低減するまたは改善することを指す。不可能ではないが、障害または疾患を治療することは、障害、疾患またはそれに関連する症状が完全に排除されることを必要としないことが認識される。

明確に記載されない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、「または」という用語は包括的であると理解される。明確に記載されない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、「１つ」および「その」という用語は単数または複数であると理解される。

明確に記載されない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、「約」という用語は、当分野における通常の許容差の範囲内、例えば平均値の２標準偏差内と理解される。「約」は、記載される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％内と理解され得る。文脈から明らかでない限り、本明細書で与えられるすべての数値は約という用語によって修飾される。

本明細書中の変数の定義における化学基のリストの記載は、任意の単一基またはリストされる基の組合せとしてのその変数の定義を包含する。本明細書中の変数または態様についての実施形態の記載は、任意の単一実施形態としてまたは任意の他の実施形態もしくはその部分との組合せとしてのその実施形態を包含する。

本明細書で提供される任意の組成物または方法は、本明細書で提供されるその他の組成物および方法のいずれかの１つまたは複数と組み合わせることができる。

図１は、ゲムシタビン＋シスプラチン；ＡＬＴ−８０１；またはゲムシタビン＋シスプラチン＋ＡＬＴ−８０１の２回の処置サイクルで４０日間にわたるヌードマウスでの皮下ヒトＵＭＵＣ−１４膀胱腫瘍異種移植片の平均腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図２は、ゲムシタビン＋シスプラチン；ゲムシタビン＋ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２；ＡＬＴ−８０１；またはゲムシタビン＋ＡＬＴ−８０１の、１１日間の休止期間によって分けた２回の処置サイクルで４８日間にわたるヌードマウスでの皮下ヒトＵＭＵＣ−１４膀胱腫瘍異種移植片の平均腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図３は、ヌードマウスにおける皮下ヒト膀胱ＵＭＵＣ−１４異種移植片の増殖への、化学療法レジメンと組み合わせたＡＬＴ−８０１およびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の作用を示すグラフである。 図４は、マウスの体重への、化学療法レジメンと組み合わせたＡＬＴ−８０１およびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の作用を示すグラフである。 図５は、ヌードマウスにおける皮下ヒト膀胱ＫＵ７Ｐ異種移植片の増殖への、化学療法レジメンと組み合わせたＡＬＴ−８０１およびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の作用を示すグラフである。 図６は、マウスの体重への、化学療法レジメンと組み合わせたＡＬＴ−８０１およびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の作用を示すグラフである。 図７は、ヌードマウスにおける皮下ヒト膀胱ＫＵ７Ｐ異種移植片の増殖へのゲムシタビン、ＡＬＴ−８０１およびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の作用を示すグラフである。 図８は、ＡＬＴ−８０１またはＰＢＳ（対照）のいずれかで処置した、正所性ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を保持するアルビノＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率を示すグラフである。 図９Ａは、ＡＬＴ−８０１またはＰＢＳ（対照）のいずれかで処置した、正所性ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を保持するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率を示すグラフである。図９Ｂは、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＡＬＴ−８０１で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける正所性ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍の生物発光を示す画像である。 図１０は、ＡＬＴ−８０１またはＰＢＳ（対照）のいずれかで処置した、正所性ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を保持するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率を示すグラフである。 図１１は、ＡＬＴ−８０１で処置した、ＭＢ４９ｌｕｃ表在性膀胱腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率を示すグラフである。 図１２Ａおよび図１２Ｂは、４週間にわたって週１回（「１×４」）（図１２Ａ）又は週２回（「２×４」）（図１２Ｂ）ＡＬＴ−８０１で処置した、ＭＢ４９ｌｕｃ表在性膀胱腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率を示すグラフである。 図１３は、ＰＢＳまたはＡＬＴ−８０１での処置後の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスからのＨ＆Ｅ染色した膀胱組織切片の画像である。 図１４Ａおよび図１４Ｂは、ＰＢＳまたはＡＬＴ−８０１での処置後の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスからのＰＢＭＣ（図１４Ａ）および脾臓（図１４Ｂ）における免疫細胞集団を示すグラフである。 図１５は、ＰＢＳまたはＡＬＴ−８０１での処置後第１０試験日の、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスからの膀胱組織切片における染色したマクロファージを示す画像である。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＰＢＳまたはＡＬＴ−８０１での処置後の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの膀胱（図１６Ａ）およびＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウス（図１６Ｂ）におけるマクロファージレベルの変化を示すグラフである。 図１７Ａおよび図１７Ｂは、ＰＢＳまたはＡＬＴ−８０１での処置後の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける尿中ＩＦＮγ（図１７Ａ）およびＴＮＦα（図１７Ｂ）の変化を示すグラフである。 図１８は、ＡＬＴ−８０１での処置は正所性ＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍を担持するマウスの生存期間を延長させたが、ＩＬ−２での処置はマウスの生存期間を延長させなかったことを示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０〜１１週齢）に、膀胱のポリリシン前処理後、第０試験日にＭＢ４９ｌｕｃ細胞（３×１０^４細胞／膀胱）を膀胱内注入した。ＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）、ｒＩＬ２（０．４２ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）またはＰＢＳ（１００μＬ、ｎ＝８）を、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞注入後７、１０、１４および１７日目に静脈内投与した。試験群を比較するカプラン‐マイヤー生存率曲線を示す。 図１９Ａ〜１９Ｄは、マウスＭＢ４９ｌｕｃ正所性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＬＴ−８０１の効果へのマクロファージ、ＮＫ、ＣＤ４およびＣＤ８細胞除去の影響を示す。図１９Ａは、ＰＢＳを投与したマウスと比較してＡＬＴ−８０１を投与したマウスの生存率を示すグラフである。図１９Ｂは、ＰＢＳを投与したマウスと比較して、第２、３、６、９、１３および１６試験日にＡＬＴ−８０１を投与し、抗ＮＫ抗体（Ａｂ）（クローンＰＫ１３６、１００μＬ中２５０μｇ）の腹腔内注射によるＮＫ細胞除去に供したマウスの生存率を示すグラフである。図１９Ｃは、ＰＢＳを投与したマウスと比較して、第６、９、１３および１６試験日にＡＬＴ−８０１を投与し、Ｃｌｏｐｈｏｓｏｍｅ（１５０μＬ／投与）の腹腔内注射によるマクロファージ細胞除去に供したマウスの生存率を示すグラフである。図１９Ｄは、ＰＢＳを投与したマウスと比較して、第２、３、６、９、１３および１６試験日にＡＬＴ−８０１を投与し、抗ＣＤ４ Ａｂ（クローンＧＫ１．５、１００μＬ中２５０μｇ）および抗ＣＤ８ Ａｂ（クローン５３−６．７２、１００μＬ中２５０μｇ）の腹腔内注射によるＣＤ４およびＣＤ８細胞除去に供したマウスの生存率を示すグラフである。カプラン‐マイヤー生存率プロットを提示する。Ｐ値≦０．０５を有意とみなす。 図２０は、マウスＭＢ４９ｌｕｃ正所性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血中ＭＤＳＣレベルの変化を示すグラフである。バーは平均±ＳＥＭを表す。対照と比較して^＊Ｐ≦０．０５。 図２１は、ＭＢ４９ｌｕｃ正所性膀胱腫瘍を担持するマウスの膀胱におけるマクロファージの免疫組織化学染色の画像である。第０試験日に、マウスにＭＢ４９ｌｕｃを注入し、１１日後にＰＢＳまたはＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）の静脈内処置を行った。処置の２４時間後にマウスを犠死させ、染色のために膀胱を採取した。膀胱切片を抗ｉＮＯＳ Ａｂ（Ｍ１マクロファージマーカー）および抗ＭＭＰ−９ Ａｂ（Ｍ２マクロファージマーカー）および抗Ｆ４／８０ Ａｂ（汎マクロファージマーカー）で染色した。代表的な組織切片を示す。倍率２００×。 図２２は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの血清ＩＦＮ−γレベルのＡＬＴ−８０１媒介性誘導における免疫細胞サブセットの役割を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウスに抗ＣＤ４ Ａｂ（ＧＫ１．５）、抗ＣＤ８ Ａｂ（５３−６．７２）および／または抗ＮＫ１．１ Ａｂ（ＰＫ１３６）を腹腔内注入し、免疫細胞サブセットを除去した。次にマウスに１．２ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１を静脈内注射し、血清ＩＦＮ−γレベルを２４時間後にＥＬＩＳＡによって測定した。バーは平均±標準誤差を表す（ｎ＝５／群）。 図２３は、インビトロでのＭＢ４９ｌｕｃ細胞増殖へのＩＦＮ−γの作用を示すグラフである。ＭＢ４９ｌｕｃ細胞（２×１０^５／ウェル）を１ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを含むＲＰＭＩ−１０中で２日間培養した。アポトーシスＭＢ４９ｌｕｃ細胞を、アネキシンＶ染色後にフローサイトメトリによって測定した。 図２４は、ＡＬＴ−８０１がＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞に対するＬＡＫ細胞の細胞傷害作用を誘導したことを示すグラフである。リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を、２０ｎＭ ＡＬＴ−８０１によって３日間インビトロで活性化した後、マウス脾細胞から調製した。ＬＡＫ細胞（４×１０^６／ウェル）を、０〜５０ｎＭ ＡＬＴ−８０１を含むＲＰＭＩ−１０中でＰＫＨ６７標識ＭＢ４９ｌｕｃ（４×１０^５／ウェル）と共に培養した。培養した細胞を２４時間後に採取し、０．００１ｍｇ／ｍＬ ＰＩで標識した。死滅したＰＩ^＋ ＭＢ４９ｌｕｃ細胞の割合をフローサイトメトリによって測定した。 図２５は、ゲムシタビンがＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスにおける脾細胞のＭＤＳＣレベルを低下させたことを示すグラフである。雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＢ４９ｌｕｃ細胞（１×１０^６／マウス）を静脈内注射した。１０日後、１つの群のマウスを４０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンで静脈内処置した。マウスを３日後に犠死させ、脾細胞を単離した。脾Ｇｒ１^＋ＣＤ１１ｂ^＋ＭＤＳＣの割合をフローサイトメトリによって測定した。 図２６は、磁気選別後のＭＤＳＣ純度のフローサイトメトリ分析を示す。ＭＡＣＳカラムによって陽性選択した細胞を抗ＣＤ１１ｂ−ＰＥ抗体および抗Ｇｒ１−ＦＩＴＣ抗体で染色した。その後養子移入に供したＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^＋細胞は、９６％の純度を有していた。 図２７は、ＡＬＴ−８０１がＭＤＳＣ養子移入後に免疫細胞による腫瘍細胞の死滅を誘導したことを示すグラフである。ＭＤＳＣレシピエントマウス（黒色）またはビヒクル対照マウス（白色）からの脾細胞を採取し、５０ｎＭ ＡＬＴ−８０１と共にインキュベートすることによってＬＡＫ細胞に活性化させた。次にＬＡＫエフェクター細胞をＭＢ４９ｌｕｃ標的細胞と混合して、これらの細胞溶解活性を評価した。ＡＬＴ−８０１活性化を行わなかった新鮮脾細胞からのデータ、ならびに死滅期の間にＡＬＴ−８０１を添加した後で評価した細胞溶解活性もプロットしている。^＊＊＊：Ｐ＜０．００１。ｎ＝２。 図２８は、尿路上皮癌においてゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせて投与したＡＬＴ−８０１の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験についての試験デザインおよび治療スキームを示す。 図２９は、尿路上皮癌においてゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせて投与したＡＬＴ−８０１の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験についての試験デザインおよび治療スキームを示す。 図３０は、尿路上皮癌においてゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせて投与したＡＬＴ−８０１の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の患者基本情報および疾患状態を示す。 図３１は、尿路上皮癌においてゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせて投与したＡＬＴ−８０１の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験における腫瘍評価を示す。 図３２は、尿路上皮癌においてゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせて投与したＡＬＴ−８０１の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験でのＡＬＴ−８０１投与患者における客観的反応を示す。 図３３は、尿路上皮癌においてゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせて投与したＡＬＴ−８０１の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験でのＡＬＴ−８０１投与患者における無増悪生存期間を示す。 図３４は、ＡＬＴ−８０１を投与した患者における血清ＩＦＮ−γレベルの上昇を示すグラフである（左のパネル：０．０４ｍｇ／ｋｇ ＡＬＴ−８０１；右のパネル：０．０６ｍｇ／ｋｇ ＡＬＴ−８０１）。

本発明は、ＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を含有する医薬組成物の治療有効量を被験者（例えばヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む、癌またはその症状を治療する方法を提供する。したがって、１つの実施形態は、癌またはその症状に罹患しているまたは罹患しやすい被験者を治療する方法である。この方法は、癌またはその症状を治療するのに十分な治療量のＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を、癌が治療される条件下で哺乳動物に投与する段階を含む。本発明はまた、治療有効量のＩＬ−２融合タンパク質を単独で被験者（例えばヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む、癌またはその症状を治療する方法も提供する。

本発明は、少なくとも一部には、膀胱癌（本明細書では尿路上皮癌とも称する）を有する被験者への、１つまたは複数の治療薬と組み合わせたＩＬ−２融合タンパク質の投与が、１）癌を改善した、２）腫瘍負荷を低減した、３）被験者の生存期間を延長させた、および４）癌に対する持続的な免疫記憶応答を誘導したという発見に基づく。加えて、１つまたは複数の治療薬と組み合わせたＩＬ−２融合タンパク質は、化学療法抵抗性膀胱癌を治療するのに有効であることが認められた。さらに、癌細胞または組織を特異的に標的としないＩＬ−２融合タンパク質が、膀胱癌を治療するうえで癌細胞を特異的に標的とするＩＬ−２融合タンパク質と同程度に有効であることが認められた。特定の実施形態では、ＩＬ−２融合タンパク質単独療法は、化学療法抵抗性癌を含む、膀胱癌を治療するのに有効であることが認められた。

ＩＬ−２を含む免疫療法が、特定のタイプの癌に対する抗腫瘍免疫を増強するための有効なアプローチであることは広く確立されている。ＩＬ−２は、ＴおよびＢ細胞、単球、マクロファージ、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）およびＮＫ細胞を含む多くの免疫細胞型に刺激作用を及ぼす（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：５９５−６０１，２００６）。持続的な治癒的抗腫瘍応答を与えるその能力に基づき、組換えヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））の全身投与は、転移性黒色腫または腎細胞癌を有する患者を治療するために認可されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ，２１０：４７４−４８４；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ４８４−４７５，１９８９；Ｆｙｆｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１３：６８８−６９６，１９９５；およびＡｔｋｉｎｓ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１７：２１０５−２１１６，１９９９）。残念ながら、この治療に関連するかなりの毒性が、腫瘍の部位で有効用量を達成することを困難にし、治療できる個体群を制限している。例えば、耐用量のＩＬ−２による全身治療は、実質的にすべての治療患者においてリンパ球の活性化を誘導するが、抗腫瘍応答はこれらの個体の少数においてしか認められない（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ，２１０：４７４−４８４；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ４８４−４７５，１９８９）。結果として、高用量のＩＬ−２の使用は、経験豊かな人員による特殊なプログラムに限られ、一般に、応答性であり、極めて良好な器官機能を有する患者に提供される（Ｔａｒｈｉｎｉ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ，６：１２３４−１２３９，２００５）。より低用量のＩＬ−２治療は、毒性がより低く、使いやすいが、応答率はより低く、転移性腫瘍を治療するのには無効であると思われる（Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２１：３１２７−３１３２，２００３）。ＩＬ−２による表在性膀胱癌患者の局所治療（膀胱内）は、多くの臨床試験において腫瘍の後退と長期的な無後退期間をもたらすことが示されている（Ｄｅｎ Ｏｔｔｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｕｒｏｌ，１５９：１１８３−１１８６，１９９８；およびＤｅｎ Ｏｔｔｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５７：９３１−９５０，２００８）。第２相試験では、シスプラチン不応性の進行／転移性尿路上皮癌（このうち６５％が膀胱癌であった）を有する患者への全身ＩＬ−２投与は、単剤または併用サルベージ化学療法を用いて認められた６〜７か月の平均生存期間と比較して、１０か月以上の平均生存期間をもたらし、ＩＬ−２療法に対する膀胱癌感受性のさらなる証拠を示唆した（Ｋｉｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ，２１：２１−２６，２００３；およびＧａｌｌａｇｈｅｒ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，１１３：１２８４−１２９３，２００８）。しかし、これらの患者においてＩＬ−２が誘導する毒性は重大であり、治療レジメンを制限した（Ｋｉｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ，２１：２１−２６，２００３）。したがって、ＩＬ−２の治癒効果を増強し、臨床的恩恵を損なうことなくその毒性を低減し、現在承認されている適応症を越えてその有用性を拡大する革新的な方法が緊急に必要である。

悪性腫瘍を特異的に標的とする治療方法も有効であることが示されている。しかし、膀胱癌についての分子および遺伝子マーカーは十分に特徴づけられているにもかかわらず、膀胱癌に対する分子標的薬を使用した臨床試験はほとんど実施されていない。ＨＥＲ−２／ｎｅｕもしくはＶＥＧＦに対する治療用抗体（Ａｂ）または経口ＥＧＦＲアンタゴニストを使用した進行／転移性膀胱癌を有する患者での最近の臨床試験は、標準的な化学療法と比較して改善された効果／毒性プロフィールを示さず（Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２５：２１６２−２１６３，２００７；Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２５：２２１８−２２２４，２００７；１ Ｈａｈｎ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２７：５０１８，２００９；およびＰｈｉｌｉｐｓ，Ｇ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ＢＪＵ Ｉｎｔ，１０１：２０−２５，２００８）、これらの標的が膀胱癌に関しては適切でないことを示した。興味深いことに、遺伝学的研究は、膀胱癌腫瘍の病因が主として２つの異なる、しかし重複する経路から成ることを示す（Ｗｕ，Ｘ．Ｒ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，５：７１３−７２５，２００５）。非筋層浸潤性膀胱腫瘍は、単純性および結節性過形成から生じると考えられ、線維芽細胞増殖因子受容体３、Ｈａ−ＲａｓおよびＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における高頻度の突然変異を保持する。筋層浸潤性膀胱癌腫瘍は、扁平上皮内癌、重篤な異形成またはデノボから生じると考えられる。これらの腫瘍の少なくとも５０％は、腫瘍サプレッサーｐ５３または網膜芽細胞腫遺伝子に欠損を含有する（Ｒｏｓｓｅｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，１：５３１−５３９，２００１）。この所見と一致して、腫瘍のｐ５３過剰発現の上昇は膀胱癌患者における転移性疾患の進行と相関する（ｖａｎ Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：１９１１−１９１４，２００４）。これは、膀胱癌のトランスジェニックマウスモデルによっても裏付けられる。尿路上皮においてＳＶ４０ラージＴ抗原（ｐ５３タンパク質に結合して、これを不活性化する）を発現するマウスは、上皮内癌および確率的筋層浸潤性癌を発症するが、Ｈａ−ｒａｓを過剰発現するマウスは過形成および表在性疾患を発症する（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０：１９７３−１９８０，２００１；およびＺｈａｎｇ，Ｚ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５９：３５１２−３５１７，１９９９）。

出願人は、腫瘍細胞中のｐ５３タンパク質を治療介入のための標的として同定した。ｐ５３遺伝子におけるミスセンス突然変異の非常に高頻度の発生およびその後の腫瘍細胞でのｐ５３タンパク質の過剰発現は、ｐ５３を、進行したまたは転移性膀胱癌を有する患者における腫瘍抗原として標的とする可能性を生み出す。ｐ５３は、細胞の増殖を停止させるように働く細胞内腫瘍サプレッサータンパク質である（Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５１：４５３−４５６，１９９１；およびＶｏｕｓｄｅｎ，Ｋ．Ｈ．ａｎｄ Ｐｒｉｖｅｓ，Ｃ，Ｃｅｌｌ，１２０：７−１０，２００５）。変異した場合、ｐ５３は異常増殖を抑制するその能力を喪失し、腫瘍細胞中に蓄積する（Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５１：４５３−４５６，１９９１；およびＶｏｕｓｄｅｎ，Ｋ．Ｈ．ａｎｄ Ｐｒｉｖｅｓ，Ｃ，Ｃｅｌｌ，１２０：７−１０，２００５）。結果として、ｐ５３突然変異／過剰発現は腫瘍凝集および再発と相関し、膀胱癌を含む様々な癌型においてより低い全体的生存率および化学療法介入に対する抵抗性に結びつく（ｖａｎ Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：１９１１−１９１４，２００４；Ｓｔｒａｎｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６：２２１２−２２１９，２００７；およびＧｏｅｂｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ，２８：３７７−３８８，２０１０）。３，４００名以上の膀胱癌患者についての最近の解析は、腫瘍標本における検出可能なｐ５３過剰発現と腫瘍悪性度および腫瘍病期との間の極めて有意の相関を明らかにした（Ｇｏｅｂｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ，２８：３７７−３８８，２０１０）。腫瘍におけるｐ５３の過剰発現はまた、腫瘍の進行および進行した膀胱癌患者の生存率不良とも有意に相関した。正常組織では低い量の天然ｐ５３だけが検出可能であるので、腫瘍組織と正常組織でのｐ５３の区別的な発現は、このタンパク質を治療上の標的とする可能性を創造する。しかし、ｐ５３は細胞内タンパク質であり、細胞表面には発現せず、したがって抗体に基づく薬剤はアクセスできない。他の細胞内タンパク質と同様に、ｐ５３はプロセシングされ、ｐ５３ペプチドがＨＬＡ分子に関連して細胞表面に提示される。出願人は、種々のヒト腫瘍細胞および組織の表面に高レベルで発現する、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１によって提示されるｐ５３のペプチドエピトープ（アミノ酸２６４〜２７２）を同定したが、正常組織はこの複合体の検出可能なレベルを示さない。このエピトープは、まれにしか変異しないｐ５３の領域内にあるので、その細胞表面提示は、ｐ５３を過剰発現する腫瘍についての幅広い標的として役立つ。出願人が特許請求する方法は、一部には、ヒト腫瘍細胞表面でのｐ５３ペプチドエピトープの提示に基づく。

本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」、「療法」等の用語は、障害および／またはそれに関連する症状を低減するまたは改善することを指す。不可能ではないが、障害または疾患を治療することは、障害、疾患またはそれに関連する症状が完全に排除されることを必要としないことが認識される。

本明細書で使用する場合、「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」等の用語は、障害または疾患を有していないが、障害または疾患を発症する危険性があるまたは発症しやすい被験者において障害または疾患を発症する確率を低下させることを指す。

本明細書で使用する場合、「有効な」、「効果」、「効果的な」等の用語は、疾患、障害および／またはそれに関連する症状を治療する、予防するまたは改善する能力を指す。

一般に本発明の治療方法（予防的処置を含む）は、１つまたは複数の治療薬と組み合わせた治療有効量のＩＬ−２融合タンパク質の、哺乳動物、特にヒトを含む、それを必要とする被験者（例えば動物、ヒト）への投与を含む。そのような治療は、癌、特に膀胱（または尿路上皮）癌に罹患している、有している、罹患しやすい、または危険性がある被験者、特にヒトに適切に投与される。「危険性がある」被験者の決定は、診断検査または被験者もしくは医療提供者の意見（例えば遺伝子検査、酵素もしくはタンパク質マーカー、「マーカー」（本明細書で定義される）、家族歴等）による客観的または主観的決定によって行われ得る。

１つの実施形態では、本発明は、治療の経過を観測する方法を提供する。この方法は、疾患またはその症状を治療するのに十分な治療量の本明細書の化合物を投与された、癌、特に膀胱癌に関連する障害またはその症状に罹患しているまたは罹患しやすい被験者において、診断マーカー（「マーカー」）（例えばタンパク質もしくはそのインジケータ等）または診断測定（例えばスクリーニング、アッセイ、腫瘍サイズ評価のためのスキャン、外科的に切除された組織／生検での組織病理学的評価等）のレベルを決定する段階を含む。この方法で決定された「マーカー」または測定のレベルを、健常対照または他の罹患患者における「マーカー」または測定の既知のレベルと比較して、被験者の疾患状態を確立することができる。好ましい実施形態では、被験者における「マーカー」または測定の２番目のレベルを最初のレベルの決定より後の時点で決定し、疾患の経過または治療の効果を観測するために２つのレベルを比較する。特定の好ましい実施形態では、本発明による治療を開始する前に被験者における「マーカー」または測定の治療前レベルを決定する；次にこの「マーカー」または測定の治療前レベルを、治療を開始した後の被験者における「マーカー」または測定のレベルと比較して、治療の効果を判定することができる。特定の好ましい実施形態では、治療効果の観測は、固形癌委員会の治療効果判定のためのガイドライン（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＲＥＣＩＳＴ）１．１によって提案された新しい国際基準を用いて評価した癌の客観的応答に基づいて行われる。他の実施形態では、治療効果は、被験者の全体的生存率または無増悪生存期間もしくは生存率に基づいて評価される。

医薬組成物

本明細書で述べる方法は、単独でまたは１つもしくは複数の治療薬と共にＩＬ−２融合タンパク質を投与することに基づく。本発明のＩＬ−２融合タンパク質は、第二のポリペプチドに融合した成熟ＩＬ−２ポリペプチド全体またはその生物学的に活性なフラグメントのいずれかを含む。特定の実施形態では、第二のポリペプチドは、エピトープ、ペプチド、リガンドまたは癌細胞上の特徴に特異的に結合するという標的化機能を有する。したがって、標的化ポリペプチドの非限定的な例には、抗体およびその抗原結合フラグメント、Ｔ細胞受容体およびそのペプチド結合フラグメント、ならびに受容体およびそのリガンド結合フラグメントが含まれる。癌細胞に特異的に結合することができるポリペプチドは、標的化ＩＬ−２融合タンパク質における第二ポリペプチドとして役立ち得る。

驚くべきことに、本発明は、非標的化ＩＬ−２融合タンパク質が前述した方法において標的化ＩＬ−２融合タンパク質と同程度に有効であることを提供する。非標的化ＩＬ−２融合タンパク質の第二ポリペプチドには、抗体およびその抗原結合フラグメント、Ｔ細胞受容体およびそのペプチド結合フラグメント、ならびに受容体およびそのリガンド結合フラグメントが含まれる。しかし、これらの場合、第二ポリペプチドは治療される癌細胞には特異的に結合しない。好ましい実施形態では、第二ポリペプチドはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、最も好ましくは一本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）である。第二ポリペプチドに適するＴＣＲ分子の例は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４５６，２６３号；米国特許第６，５３４，６３３号；米国特許出願公開第２００３／０１４４４７４号；および米国特許出願公開第２０１１／００７０１９１号に記載されている。

特に、治療用分子として有意に高い有用性を備える、ＴＣＲ融合およびコンジュゲート複合体が作製されている。具体的には、増大した細胞表面滞留時間および改善された薬物動態プロフィールを有する新しいクラスの融合分子が創製されており、例えばこれらの分子はより長い血漿半減期を有する。本発明はまた、生物学的に活性なポリペプチドまたは分子に共有結合したＴＣＲ分子を含むそのような複合体をコードする発現ベクター、ならびにそのような融合およびコンジュゲート複合体および発現ベクターおよびコンジュゲート複合体の作製および使用のための方法も提供する。

Ｔ細胞は、細胞表面で発現されるＴ細胞受容体によってこれらの細胞の表面に提示される抗原を認識する。ＴＣＲは、大部分がα鎖およびβ鎖糖タンパク質から成る、ジスルフィド結合ヘテロ二量体である。Ｔ細胞は、Ｂ細胞において機能する抗体多様性を生じさせるための機構に類似した、その受容体分子の多様性を生み出す機構を利用する（Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９７）。免疫グロブリン遺伝子に類似して、ＴＣＲ遺伝子はＴ細胞の発生の間に再構成するセグメントから成る。ＴＣＲポリペプチドは、アミノ末端可変領域およびカルボキシ末端定常領域から成る。カルボキシ末端領域は膜貫通アンカーとして機能し、受容体が占有された場合細胞内シグナル伝達に関与するが、可変領域は抗原認識の役割を担う。ＴＣＲのα鎖は、ＶセグメントとＤセグメントだけによってコードされる可変領域を含み、一方β鎖は付加的な接合（Ｊ）セグメントを含む。これらのセグメントの再構成および可変領域の突然変異と成熟が、異なるＴＣＲ分子に関連して提示される信じられないほど多数の異なる抗原を認識することができるＴＣＲの多様なレパートリーを生じさせる。

特定の抗原を認識する高度に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を生成する技術はこれまでに開発されている。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、係属中の米国特許出願第０８／８１３，７８１号および米国特許第６，５３４６３３号；ならびに国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４号および同第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４６４５号、ならびにその中で論じられている参考文献は、特異的なＴＣＲを調製し、使用する方法を開示する。加えて、特定の特異的ＴＣＲは、組換え法により可溶性の一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）として作製されている。ｓｃＴＣＲの作製および使用のための方法は開示されており、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０２６３号に記載されている。そのようなＴＣＲおよびｓｃＴＣＲは、生じるＴＣＲおよびｓｃＴＣＲを治療薬として有用なものにする融合物またはコンジュゲートを創製するように改変することができる。本発明のＴＣＲ複合体は、組換え生産したＴＣＲまたはｓｃＴＣＲコード領域を、生物学的に活性なポリペプチドまたは分子をコードする遺伝子に遺伝的に融合して、ＴＣＲ融合複合体を生じさせることによって作製できる。あるいは、ＴＣＲまたはｓｃＴＣＲを生物学的に活性な分子と化学的に結合して、ＴＣＲコンジュゲート複合体を作製することもできる。

本明細書で使用する「融合分子」という用語は、組換え法、化学的方法または他の適切な方法によって共有結合（すなわち融合）した、ＩＬ−２と第二ポリペプチド、例えばＴＣＲドメインなどを意味する。所望する場合は、融合分子を、ペプチドリンカー配列を介して１つまたはいくつかの部位で融合することができる。あるいは、融合分子の構築を助けるためにペプチドリンカーを使用してもよい。本発明の融合分子は、それらをより良好な治療用分子にする改善された特徴を示す。

本明細書で使用する「増大した細胞表面滞留時間」という用語は、特許請求する融合分子が、融合分子のいずれかの成分単独の場合よりも長い時間、細胞の表面でタンパク質と会合することを示すことが意図されている。特定の実施形態では、細胞表面滞留時間は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上増大する。

本明細書で使用する「血清半減期」または「血漿半減期」という用語は、本発明の融合分子の濃度または量が、体内で所与の濃度または量の正確に２分の１に低減する場合に必要とされる時間量を示すことが意図されている。本発明の融合分子は、融合分子ではない場合のＩＬ−２よりも有意に長い半減期を示す。例えば、開示される分子の血清半減期は、融合タンパク質の部分ではない場合の特許請求分子の成分の血清半減期よりも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％、１２５０％、１５００％、１７５０％、２０００％またはそれ以上増大し得る。

「ポリペプチド」は、好ましくは、その大きさに関わらず基本的に２０個の天然アミノ酸のいずれかから成る任意のポリマーを指す。「タンパク質」という用語はしばしば比較的大きなタンパク質に関して使用され、「ペプチド」はしばしば小さなポリペプチドに関して使用されるが、当分野におけるこれらの用語の使用はしばしば重複する。「ポリペプチド」という用語は、特に記載がない限り一般にタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを指す。一般に本発明に従って有用なペプチドは、遠心分離またはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの標準的な分子サイジング技術によって評価した場合、一般に約０．１〜１００ＫＤまたは最大約１０００ＫＤまで、好ましくは約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０から５０ＫＤの間である。

加えて、ＩＬ−２融合タンパク質は、蛍光標識、例えば緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン、サイコームもしくはテキサスレッド；または放射性核種、例えばヨウ素１３１、イットリウム９０、レニウム１８８もしくはビスマス２１２などの診断または画像試験に適する検出可能に標識された分子であり得る。エフェクターまたはタグを含むタンパク質を作製し、使用することに関する開示については、例えばＭｏｓｋａｕｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１５７０９（１９８９）；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４７，６４１，１９８６；Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｏｘｉｎｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，３３１，（１９９２）；「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｔｏｘｉｎｓ」Ｏｌｓｎｅｓ ａｎｄ Ｐｈｉｌ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，２５，３５５（１９８２）；国際公開第９４／２９３５０号；国際公開第９４／０４６８９号；および米国特許第５，６２０，９３９号参照。

ＩＬ−２融合タンパク質の具体的な例は以下のとおりである：ＩＬ−２に融合したｃ２６４ｓｃ−ＴＣＲ（ＡＬＴ−８０１）などのｓｃ−ＴＣＲは、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることによって作製できる。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２タンパク質融合複合体は、ヒトＨＬＡ抗原；ＨＬＡ−２．１に関連して提示されるヒト野生型ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質からのプロセシングされたペプチドフラグメントを認識する。ｃ２６４ｓｃＴＣＲおよびそのペプチドリガンドは、Ｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００４）５３：３４５，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１２１：２９およびＷｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００８）５７：１７８１に記述されている。ｃ２６４ｓｃＴＣＲによって認識されるヒトｐ５３（アミノ酸２６４〜アミノ酸２７２）ペプチド配列（本明細書では２６４ペプチドまたはｐ２６４と称する）は、ＬＬＧＲＮＳＦＥＶである。腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３の発現は悪性細胞上で上方調節される。本発明の特定の実施形態では、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２タンパク質融合物による、自らの表面にｐ５３（アミノ酸２６４〜アミノ酸２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体を提示する腫瘍細胞の認識は、腫瘍細胞に対する免疫活性を促進し、これにより抗癌治療活性を提供する。この標的認識は、膀胱腫瘍を含む、ｐ５３を過剰発現する腫瘍を有する治療被験者において有益であり得る。

本発明の他の融合分子には、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ、ＨＩＶ、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎、ＣＭＶ、ＡＡＶ、ＬＣＭＶ、ＪＣＶ、インフルエンザ、ＨＴＬＶおよび他のウイルスに由来するものを含む、腫瘍関連抗原またはウイルスペプチド抗原に特異的な他のｓｃＴＣＲに融合したＩＬ−２が含まれ、ここでｓｃＴＣＲは、直接またはリンカーを介してＩＬ−２に結合している。

加えて、ＩＬ−２融合タンパク質は付加的なポリペプチドタグをさらに含み得る。例えば、１つのタグは、生理的ｐＨで電荷を担持するポリペプチド、例えば６×ＨＩＳなどである。この場合、ＴＣＲ融合またはコンジュゲート複合体は、市販の金属−セファロースマトリックス、例えば約ｐＨ６〜９で６×ＨＩＳタグに特異的に結合することができるＮｉ−セファロースによって精製することができる。ＥＥエピトープおよびｍｙｃエピトープは適切なタンパク質タグのさらなる例であり、これらのエピトープは、１つまたは複数の市販のモノクローナル抗体によって特異的に結合され得る。

上述したように、本明細書で開示する融合タンパク質の成分、例えばＩＬ−２と第二ポリペプチドは、ＩＬ−２融合タンパク質がその意図される機能を有することを条件として、ほぼどのような方法ででも構造化され得る。特に、融合タンパク質の各々の成分を、所望する場合は少なくとも１つの適切なペプチドリンカー配列によって別の成分から距離をあけて配置することができる。さらに、成分を、ＩＬ−２がその受容体に結合して、最適の免疫刺激活性を提供することができるように、および／または第二ペプチドがその受容体／リガンドに結合して、その活性を媒介することができるように、リンカーによって位置づけてもよい。加えて、融合タンパク質は、例えば融合タンパク質の同定および／または精製を容易にするための、タグを含み得る。

本発明のＩＬ−２融合タンパク質は、ＩＬ−２の血漿半減期を延長させる（ＩＬ−２単独の血漿半減期を上回って）、または細胞表面タンパク質、例えば細胞表面受容体に結合する融合分子の表面滞留時間を増大する（ＩＬ−２単独の表面滞留時間を上回って）、驚くべき能力を備える。本発明のＩＬ−２融合タンパク質は、分子の血漿半減期を延長させ、分子の表面滞留時間を増大して、それにより特許請求分子の効果の有意の増大を導く能力を有し得る。

一般に、本発明のＩＬ−２融合タンパク質の調製は、本明細書で開示する手順によって、および組換えＤＮＡ技術、例えばポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切断、オリゴヌクレオチドの調製、ＤＮＡの連結、ｍＲＮＡの単離、適切な細胞へのＤＮＡの導入、宿主の形質転換またはトランスフェクション、宿主の培養を含む組換えＤＮＡ技術によって達成することができる。加えて、融合分子は、カオトロピック試薬ならびに周知の電気泳動、遠心分離およびクロマトグラフィ法を用いて単離し、精製することができる。一般に、これらの方法に関する開示については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）参照。

本発明はさらに、核酸配列、特に本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、ＤＮＡ配列は、染色体外複製に適したベクター、例えばファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣまたはエピソームなどによって運搬される。特に、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターは、本明細書で述べる調製方法を容易にし、有意量の融合タンパク質を得るために使用できる。ＤＮＡ配列を適切な発現ベクター、すなわち挿入するタンパク質コード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクターに挿入することができる。様々な宿主−ベクター系を、タンパク質コード配列を発現するために利用し得る。これらには、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母などの微生物、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が含まれる。利用する宿主−ベクター系に依存して、多数の適切な転写および翻訳エレメントの任意の１つを使用し得る。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．前出およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．前出参照。

一般に、本発明による好ましいＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、ＩＬ−２をコードする配列に作動可能に連結した、ＴＣＲ鎖をコードする第一ヌクレオチド配列の導入のための第一クローニング部位を含む、ホスホジエステル結合によって連結したヌクレオチド配列を含む。

ほとんどの場合、ＤＮＡベクターによってコードされる融合タンパク質成分の各々は、「カセット」形式で提供されることが好ましい。「カセット」という用語は、各成分を標準的な組換え法によって容易に別の成分に置き換え得ることを意味する。

ＴＣＲ融合複合体をコードするベクターを作製するため、ＴＣＲ分子をコードする配列を、適切なリガーゼを用いてＩＬ−２をコードする配列に連結する。提示するペプチドをコードするＤＮＡは、適切な細胞株などの天然供給源からＤＮＡを単離することによって、または公知の合成法、例えばリン酸トリエステル法によって得ることができる。例えばＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）参照。合成オリゴヌクレオチドはまた、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製してもよい。ひとたび単離されると、ＴＣＲ分子をコードする遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当分野で公知の他の手段によって増幅することができる。ＴＣＲペプチド遺伝子を増幅するための適切なＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物に制限部位を付加し得る。ＰＣＲ産物は、好ましくはＩＬ−２ポリペプチドについてのスプライス部位ならびにＴＣＲ−ＩＬ−２融合複合体の適切な発現および分泌のために必要なリーダー配列を含む。ＰＣＲ産物はまた、好ましくはリンカー配列をコードする配列、またはそのような配列の連結のための制限酵素部位も含む。

本明細書で述べる融合タンパク質は、好ましくは標準的な組換えＤＮＡ技術によって作製される。例えば、ＴＣＲタンパク質をコードするＤＮＡ分子が単離されれば、ＩＬ−２ポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子に配列を連結することができる。ＴＣＲ分子をコードするヌクレオチド配列は、ＩＬ−２ペプチドをコードするＤＮＡ配列に直接結合し得るか、またはより典型的には、本明細書で論じるリンカー配列をコードするＤＮＡ配列を、ＴＣＲ分子をコードする配列とＩＬ−２ペプチドをコードする配列との間に置き、適切なリガーゼを用いて結合し得る。生じる雑種ＤＮＡ分子を適切な宿主細胞において発現させ、ＩＬ−２融合タンパク質を生産することができる。ＤＮＡ分子を、連結後にコードされるポリペプチドの翻訳フレームが変化しないように５’から３’方向に相互に連結する（すなわちＤＮＡ分子を相互にインフレームに連結する）。生じるＤＮＡ分子はインフレームの融合タンパク質をコードする。

他のヌクレオチド配列も遺伝子構築物中に含めることができる。例えば、ＩＬ−２ペプチドに融合したＴＣＲペプチドをコードする配列の発現を制御するプロモーター配列、またはＩＬ−２融合タンパク質を細胞表面または培地に向かわせるリーダー配列を、構築物中に含めるまたは構築物を挿入する発現ベクター中に存在させることができる。免疫グロブリンまたはＣＭＶプロモーターが特に好ましい。

融合タンパク質の成分は、各々がその意図される機能を果たすことができることを条件として、ほぼいかなる順序でも構造化することができる。例えば、１つの実施形態では、ＴＣＲはＩＬ−２分子のＣ末端またはＮ末端に位置する。

上述したように、本発明に従う融合分子またはコンジュゲート分子は、いくつかの方法で構造化することができる。例示的な立体配置では、ＴＣＲのＣ末端をＩＬ−２分子のＮ末端に作動可能に連結する。この連結は、所望する場合は組換え法によって達成できる。しかし、別の立体配置では、ＴＣＲのＮ末端をＩＬ−２分子のＣ末端に連結する。

好ましくは、リンカー配列は約１〜２０個のアミノ酸、より好ましくは約１〜１６個のアミノ酸を含む。リンカー配列は、好ましくは、ＩＬ−２を単一の望ましくない立体配座で保持しないために柔軟である。リンカー配列は、例えば認識部位を融合分子から離れて配置するために使用できる。具体的には、例えばＴＣＲ鎖とＩＬ−２ペプチドを化学的に架橋するためおよび分子の柔軟性を与えるために、ペプチドリンカー配列をＴＣＲ鎖とＩＬ−２ペプチドの間に位置づけることができる。リンカーは、好ましくは、柔軟性を与えるために主として小さな側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アラニンおよびセリンを含む。好ましくは、約８０または９０％またはそれ以上のリンカー配列がグリシン、アラニンまたはセリン残基、特にグリシンおよびセリン残基を含む。ヘテロ二量体ＴＣＲを含むＩＬ−２融合タンパク質に関しては、リンカー配列をＴＣＲ分子のβ鎖に適切に連結するが、リンカー配列はＴＣＲ分子のα鎖に結合することもできる。あるいは、リンカー配列は、一本鎖分子を作製するためにＴＣＲ分子のα鎖とβ鎖の両方に連結してもよい。適切なリンカー配列は、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧ（すなわちＳｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ）、ＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳおよびＶＮＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＳＱである。抗体可変領域を一緒に結合するために成功裏に使用されてきた多くの柔軟なリンカーデザインのいずれかを含む、種々のリンカー配列を使用することができ、Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７−１０５参照。適切なリンカー配列は経験的に容易に同定することができる。加えて、リンカー配列の適切な大きさおよび配列も、ＴＣＲ分子の予測サイズおよび形状に基づき従来のコンピュータモデリング技術によって決定することができる。

本発明のＩＬ−２融合タンパク質を発現するために多くの方法を用いることができる。例えば、上述したＩＬ−２遺伝子融合構築物を公知の手段によって、例えば構築物の挿入のためにベクター中に切れ目を作る制限酵素の使用とそれに続く連結によって、適切なベクターに組み込むことができる。次に、遺伝子構築物を含むベクターをＩＬ−２融合ペプチドの発現のために適切な宿主に導入する。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．前出参照。適切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関する因子に基づき経験的に行うことができる。例えば、ベクターは、使用されている宿主と適合性であり、適正なレプリコンを有するべきである。さらにベクターは、発現させようとするＩＬ−２融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を収容することができなければならない。適切な宿主細胞には、真核および原核細胞、好ましくは容易に形質転換することができ、培地で迅速な増殖を示すことができる細胞が含まれる。特に好ましい宿主細胞には原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）等、ならびに真核生物、例えば動物細胞および酵母株、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。哺乳動物細胞、特にＪ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−ＯまたはＣＨＯが一般に好ましい。他の適切な宿主には、例えばＳｆ９などの昆虫細胞が含まれる。従来の培養条件を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出参照。その後、安定な形質転換またはトランスフェクト細胞株を選択することができる。本発明のＴＣＲ融合複合体を発現する細胞は、公知の手順によって決定することができる。例えば、免疫グロブリンに連結したＴＣＲ融合複合体の発現は、連結した免疫グロブリンに特異的なＥＬＩＳＡによっておよび／または免疫ブロット法によって決定することができる。

上記で一般的に言及したように、宿主細胞は、所望の融合タンパク質をコードする核酸を増殖させる調製目的で使用することができる。したがって宿主細胞は、融合タンパク質の産生を明確に意図されている原核または真核細胞を包含し得る。したがって宿主細胞には、特に、融合物をコードする核酸を増殖させることができる酵母、ハエ、蠕虫、植物、カエル、哺乳動物細胞および器官が含まれる。使用できる哺乳動物細胞株の非限定的な例には、ＣＨＯ ｄｈｆｒ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，３６：５９（１９７７））またはＳＰ２もしくはＮＳＯのような骨髄腫細胞（Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３（Ｂ）：３（１９８１））が含まれる。

所望の融合タンパク質をコードする核酸を増殖させることができる宿主細胞は、昆虫（例えばヨトウガ（Ｓｐ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）；Ｆｌｅｅｒ Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（５）：４８６４９６（１９９２）によって一般的に総説されている）、真菌および植物細胞を含む、非哺乳動物真核細胞も包含する。大腸菌およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの特定の原核生物も企図される。

所望の融合タンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトするための標準的な技術によって宿主細胞に導入することができる。「トランスフェクトすること」または「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、ウイルス形質導入および／または組込みを含む、宿主細胞に核酸を導入するためのすべての従来技術を包含することが意図されている。宿主細胞をトランスフェクトするために適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．前出および他の実験指導書に見出すことができる。

本発明はさらに、関心対象のＩＬ−２融合タンパク質を単離するための生産工程を提供する。この工程では、調節配列に作動可能に連結した関心対象のタンパク質をコードする核酸が導入されている宿主細胞（例えば酵母、真菌、昆虫、細菌または動物細胞）を、関心対象の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激する融合タンパク質の存在下で培地において生産スケールで増殖させる。その後、関心対象のタンパク質を回収した宿主細胞からまたは培地から単離する。標準的なタンパク質精製技術を用いて、培地からまたは回収した細胞から関心対象のタンパク質を単離することができる。特に、精製技術を用いて、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクターまたは発酵槽を含む様々な実施装置から大規模に（すなわち少なくともミリグラム量で）所望の融合タンパク質を発現し、精製することができる。

発現されたＩＬ−２融合タンパク質は、公知の方法によって単離し、精製することができる。典型的には、培地を遠心分離し、次に上清をアフィニティクロマトグラフィまたは免疫アフィニティクロマトグラフィによって、例えばプロテインＡもしくはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィまたは発現された融合複合体、例えば連結されたＴＣＲもしくはその免疫グロブリン領域に結合するモノクローナル抗体の使用を含む免疫アフィニティプロトコルによって精製する。本発明の融合タンパク質は、公知の技術の適切な組合せによって分離し、精製することができる。これらの方法には、例えば、塩析沈殿および溶媒沈殿などの溶解度を利用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の違いを利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィなどの電荷の違いを利用する方法、アフィニティクロマトグラフィなどの特異的な親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィなどの疎水性の違いを利用する方法、ならびに等電点電気泳動などの等電点の違いを利用する方法、Ｎｉ−ＮＴＡなどの金属アフィニティカラムが含まれる。これらの方法に関する開示については、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．前出参照。

本発明のＩＬ−２融合タンパク質は実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質は、好ましくは少なくとも８０％または９０％〜９５％の均質度（ｗ／ｗ）で存在するように、天然でそれに付随する細胞置換成分から単離されている。多くの医薬、臨床および研究適用に関しては、少なくとも９８〜９９％の均質度（ｗ／ｗ）を有する融合タンパク質が最も好ましい。実質的に精製されれば、融合タンパク質は、治療適用のために実質的に夾雑物を含まないはずである。部分的にまたは実質的な純度に精製されれば、可溶性融合タンパク質は治療に用いることができ、または本明細書で開示するインビトロまたはインビボアッセイを実施する場合に使用できる。実質的な純度は、クロマトグラフィおよびゲル電気泳動などの様々な標準的技術によって決定することができる。

本発明の末端切断型ＩＬ−２融合タンパク質は、十分に末端切断されたＴＣＲ分子を含み、そのためＴＣＲ融合複合体は発現後に培地中に分泌され得る。したがって、末端切断型ＩＬ−２融合タンパク質は、疎水性残基に富む領域、典型的にはＴＣＲ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含まない。したがって、例えば本発明の好ましい末端切断型ＴＣＲ分子に関しては、好ましくはＴＣＲ分子のβ鎖の残基約１９９〜２３７およびα鎖の残基約１９３〜２３０が末端切断型ＴＣＲ融合複合体には含まれない。

融合タンパク質に関する場合、「ミスフォールドした」という用語は、部分的にまたは完全には折りたたまれていない（すなわち変性した）タンパク質を意味する。融合タンパク質は、以下で論じる１つまたは複数のカオトロピック試薬との接触によって部分的にまたは完全にミスフォールドし得る。より一般的には、本明細書で開示するミスフォールドした融合タンパク質は、対応する天然タンパク質の高ギブズ自由エネルギー（ΔＧ）形態を表す。通常は正しく折りたたまれ、水溶液に完全に可溶性であり、比較的低いΔＧを有する天然融合タンパク質が好ましい。したがって、その天然融合タンパク質はほとんどの場合安定である。

従来の方法の１つまたは組合せによって融合タンパク質のミスフォールディングを検出することが可能である。例えば、ミスフォールディングは、天然（対照）分子とミスフォールドした分子を用いた旋光度測定を含む、様々な従来の生物物理学的技術によって検出することができる。

「可溶性」という用語または類似の用語は、水性緩衝液、例えば細胞培地から、低重力加速度遠心分離（例えば標準的な遠心分離機で毎分約３０，０００回転未満）下で容易に沈降しない融合分子、特に融合タンパク質を意味する。さらに、融合分子は、低濃度の陰イオン性もしくは非イオン性界面活性剤が存在するかまたは存在せず、約５〜３７℃よりも高い温度でおよび中性またはそれに近いｐＨで、水溶液中に維持される場合、可溶性である。これらの条件下で、可溶性タンパク質はしばしば低い沈降値、例えば約１０〜５０未満のスベドベリ単位を有する。

本明細書で言及する水溶液は、典型的には、典型的には約５〜９の範囲内のｐＨ、および約２ｍＭから５００ｍＭの範囲のイオン強度を確立するために緩衝化合物を有する。時としてプロテアーゼ阻害剤または弱い非イオン性界面活性剤が添加される。加えて、所望する場合はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質を数ｍｇ／ｍｌまで添加してもよい。例示的な水性緩衝液には、標準的なリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝食塩水、または他の周知の緩衝液および細胞培地製剤が含まれる。

薬物治療

本発明は、新生物の治療のために有用なＩＬ−２融合タンパク質を含む。１つの特定の実施形態では、本発明のＩＬ−２融合タンパク質は、腫瘍増殖を予防するもしくは低減するためまたは腫瘍細胞が周囲の組織に浸潤するまたはさもなければ転移する傾向を低減するために有用である。治療上の使用については、本明細書で開示するＩＬ−２融合タンパク質を全身的に、例えば生理食塩水などの医薬的に許容される緩衝液中で製剤化して、投与し得る。投与の好ましい経路には、例えば、患者において連続的で持続的なレベルの薬剤を提供する皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮内注射が含まれる。ヒト患者または他の動物の治療は、生理的に許容される担体中、治療有効量の本明細書で同定される治療薬を用いて実施する。適切な担体およびそれらの製剤化は、例えばＥ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。投与すべき治療薬の量は、投与の方法、患者の年齢および体重に依存して、ならびに新生物の臨床症状によって異なる。一般に、量は、新生物に関連する他の疾患の治療で使用される他の作用物質について用いられる量の範囲内であるが、特定の場合には化合物の高い特異性のためにより低い量が必要である。

治療方法

本発明のＩＬ−２融合タンパク質は、腫瘍性疾患を予防するまたは改善するために有用である。１つの治療アプローチでは、本明細書で同定するまたは記述する薬剤を、潜在的なまたは実際の疾患罹患組織の部位に投与するかまたは全身的に投与する。投与する薬剤の用量は、個々の患者の大きさおよび健康を含む多くの因子に依存する。任意の特定の被験者について、具体的な投薬レジメンは、個々の必要性および組成物を投与するまたは投与を監視する人物の専門的判断に従って経時的に調整されるべきである。

医薬組成物の製剤化

新生物の治療のための治療薬の投与は、他の成分と組み合わせて、新生物を改善する、低減するまたは安定化するのに有効な治療薬の濃度を生じさせる任意の適切な手段によって実施し得る。化合物は、任意の適切な担体物質中に任意の適切な量で含有され得、一般に組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は、非経口（例えば皮下、静脈内、筋肉内、膀胱内または腹腔内）投与経路に適する剤形で提供され得る。投与の好都合な方法は静脈内注入である。医薬組成物は従来の製薬慣例に従って製剤化し得る（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。

本発明による医薬組成物は、ＩＬ−２融合タンパク質を実質的に投与後直ちにまたは投与後任意のあらかじめ定められた時点でまたはあらかじめ定められた期間後に放出するように製剤化し得る。後者のタイプの組成物は一般に制御放出製剤として公知であり、これらには、（ｉ）長期間にわたって体内で薬剤の実質的に一定な濃度を生じさせる製剤；（ｉｉ）あらかじめ定められた遅延時間後に長期間にわたって体内で薬剤の実質的に一定な濃度を生じさせる製剤；（ｉｉｉ）活性物質の血漿レベルの変動に関連する望ましくない副作用を最小限に抑えつつ体内で比較的一定な有効レベルを維持することにより、あらかじめ定められた期間中作用を持続する製剤（鋸歯状動態パターン）；（ｉｖ）例えば胸腺に隣接してまたは胸腺と接触して制御放出組成物を空間的に位置づけることにより、作用を局在化する製剤；（ｖ）用量が、例えば１週間に１回または２週間に１回投与されるように、好都合な投薬を可能にする製剤；および（ｖｉ）治療薬を特定の細胞型（例えば腫瘍細胞）に送達する担体または化学的誘導体を使用することにより新生物を標的とする製剤が含まれる。一部の適用に関して、制御放出製剤は、血漿レベルを治療レベルに維持するために一日のうちに頻繁に投薬する必要性を取り除く。

対象とする化合物の放出速度が代謝速度を上回る制御放出を得るために多くの方法のいずれかを実施することができる。一例では、制御放出は、例えば様々なタイプの制御放出組成物および剤皮を含む、様々な製剤化パラメータおよび成分の適切な選択によって得られる。したがって、治療薬は、適切な賦形剤と共に、投与後に制御された方法で治療薬を放出する医薬組成物に製剤化される。例としては、単一または複数単位の錠剤またはカプセル組成物、油性溶液、懸濁液、乳剤、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチおよびリポソームが含まれる。

非経口組成物

医薬組成物は、剤形、製剤中で注射、注入もしくは移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、膀胱内等）によって、または従来の非毒性の医薬的に許容される担体およびアジュバントを含有する適切な送達装置もしくはインプラントを介して、非経口的に投与し得る。そのような組成物の製剤化および調製は、医薬製剤化の当業者に周知である。製剤化は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、前出に見出され得る。

非経口使用のための組成物は、単位剤形（例えば単回用量アンプル）として、または数回分の用量を含み、適切な防腐剤が添加されていてもよい（下記参照）バイアル中で提供され得る。組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、注入装置もしくは移植のための送達装置の形態であり得るか、または使用前に水もしくは別の適切なビヒクルで再構成される乾燥粉末として提供され得る。新生物を低減するまたは改善する活性薬剤とは別に、組成物は適切な非経口的に許容される担体および／または賦形剤を含有し得る。活性治療薬は、制御放出のためにミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム等に組み込まれ得る。さらに、組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定剤、ｐＨ調整剤、張度調整剤および／または分散剤を含有し得る。

上記で示したように、本発明による医薬組成物は無菌注射に適した形態であり得る。そのような組成物を調製するため、適切な治療薬を非経口的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁する。使用し得る許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、適切な量の塩酸の添加により適切なｐＨに調整した水、水酸化ナトリウムまたは適切な緩衝液、１，３−ブタンジオール、リンガー液、ならびに等張塩化ナトリウム溶液およびデキストロース溶液がある。水性製剤は、１つまたは複数の防腐剤（例えばメチル、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート）も含有し得る。化合物の１つがほとんどもしくはわずかしか水に溶けない場合、溶解促進剤もしくは可溶化剤を添加することができるか、または溶媒は１０〜６０重量％のプロピレングリコール等を含有し得る。

制御放出非経口組成物

制御放出非経口組成物は、水性懸濁液、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁気ミクロスフェア、油性溶液、油性懸濁液または乳剤の形態であり得る。あるいは、抗体を生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラントまたは注入装置に組み込んでもよい。

ミクロスフェアおよび／またはマイクロカプセルの調製において使用するための材料は、例えば生分解性／生体侵食性ポリマー、例えばポリガラクチン、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）およびポリ乳酸である。制御放出非経口製剤を製剤化する場合に使用し得る生体適合性担体は、炭水化物（例えばデキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン）、リポタンパク質または抗体である。インプラントにおける使用のための材料は、非生分解性（例えばポリジメチルシロキサン）または生分解性（例えばポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸もしくはポリオルトエステルもしくはそれらの組合せ）であり得る。

経口使用のための固体剤形

経口使用のための製剤には、非毒性の医薬的に許容される賦形剤との混合物中に有効成分を含有する錠剤が含まれる。そのような製剤は当業者に公知である。賦形剤は、例えば不活性希釈剤または充填剤（例えばスクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム）；造粒剤および崩壊剤（例えば微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギネートまたはアルギン酸）；結合剤（例えばスクロース、グルコース、ソルビトール、アカシアゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール）；ならびに潤滑剤、流動促進剤および付着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油または滑石）であり得る。他の医薬的に許容される賦形剤は、着色剤、着香剤、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤等であり得る。

錠剤は、被覆されていなくてもよく、または、場合により胃腸管での崩壊および吸収を遅延させ、それによってより長期間にわたる持続的作用を提供するために、公知の技術によって被覆されていてもよい。剤皮は、あらかじめ定められたパターンで活性薬剤を放出するように適合させ得るか（例えば持続放出製剤を達成するため）、または胃の通過後まで活性薬剤を放出しないように適合させ得る（腸溶剤皮）。剤皮は、糖衣、フィルムコーティング（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコールおよび／もしくはポリビニルピロリドンに基づく）または腸溶剤皮（例えばメタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、シェラックおよび／もしくはエチルセルロースに基づく）であり得る。さらに、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用してもよい。

固体錠剤組成物は、組成物を望ましくない化学変化（例えばキメラ抗体の放出前の化学分解）から保護するように適合させた剤皮を含有し得る。剤皮は、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、前出に記載されているのと同様の方法で固体剤形に適用し得る。

経口使用のための製剤はまた、チュアブル錠として、または有効成分が不活性固体希釈剤（例えばジャガイモデンプン、ラクトース、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリン）と混合されている硬ゼラチンカプセルとして、または有効成分が水もしくは油性媒質、例えば落花生油、流動パラフィンもしくはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルとしても提供され得る。散剤および顆粒剤は、錠剤およびカプセルに関して上記で挙げて成分を使用して、例えば混合機、流動床装置または噴霧乾燥装置を用いて従来の方法で調製し得る。

制御放出経口剤形

経口使用のための制御放出組成物は、例えば活性物質の溶解および／または拡散を制御することによってキメラ抗体治療薬を放出するように構築し得る。溶解または拡散制御放出は、化合物の錠剤、カプセル、ペレットもしくは顆粒製剤の適切な被覆によって、または化合物を適切なマトリックスに組み込むことによって達成できる。制御放出剤皮には、上記で挙げたコーティング物質ならびに／または、例えばシェラック、蜜ろう、グリコワックス、カスターワックス、カルナウバろう、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセロール、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレートおよび／もしくはポリエチレングリコールの１つまたは複数が含まれ得る。制御放出マトリックス製剤において、マトリックス材料には、例えば水和メチルセルロース、カルナウバろうおよびステアリルアルコール、カルボポール９３４、シリコーン、トリステアリン酸グリセリル、メチルアクリレート−メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンおよび／またはハロゲン化フルオロカーボンも含まれ得る。

１つまたは複数の治療化合物を含有する制御放出組成物はまた、浮遊錠剤またはカプセル（すなわち経口投与後、一定期間胃内容物の上に浮遊する錠剤またはカプセル）の形態であってもよい。１つまたは複数の化合物の浮遊錠剤製剤は、１つまたは複数の化合物と賦形剤および２０〜７５重量％の親水コロイド、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースとの混合物を粒状化することによって調製できる。次に、得られた顆粒を錠剤に圧縮することができる。胃液と接触すると、錠剤はその表面の周りに実質的に水不透過性のゲルバリヤを形成する。このゲルバリヤは、１未満の密度を維持することに関与し、それにより錠剤が胃液中で浮遊したままであることを可能にする。

併用療法

本発明は、ＩＬ−２融合タンパク質と１つまたは複数の治療薬の併用投与を提供する。ＩＬ−２融合タンパク質は、治療薬の投与前、治療薬の投与と同時に、または治療薬の投与後に投与し得る。さらに、２つ以上の治療薬を使用する場合は、これらの薬剤を同時にまたは別々に投与し得る。加えて、ＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬の投与は様々な投薬スケジュールで実施し得る。特定の実施形態では、ＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を、１回または複数回の休止期間によって分けてもよい反復投薬スケジュールで投与する。

患者の病期に依存して、追加療法もしくは手術の前のネオアジュバント療法の状況での、または第一選択、第二選択もしくはそれ以降の選択療法としての、本発明のＩＬ−２融合タンパク質と１つまたは複数の治療薬の併用。好ましい実施形態では、併用療法は膀胱切除術の前に膀胱癌の被験者に与えられる。そのような療法は、微小転移巣を根絶させ、腫瘍のダウンステージをもたらし、術後の循環腫瘍細胞の着床を低減し、生存率を改善し得る。他の実施形態では、本発明の併用療法は、進行したまたは転移性膀胱癌を有する被験者に第一選択または第二選択療法として与えられる。そのような治療は、標準的な療法に対して不応性または不適応な被験者に提供し得る。単独療法としてのＩＬ−２融合タンパク質の使用も、これらの治療背景において有効に利用し得る。

本発明のＩＬ−２融合タンパク質と１つまたは複数の治療薬の併用は、個々の薬剤での治療よりも有効な療法を提供するのに好都合であり得る。特定の好ましい実施形態では、併用療法は、ＡＬＴ−８０１をＩＬ−２融合タンパク質としてならびにシスプラチンおよび／またはゲムシタビンを治療薬として含む。加えて、本発明の実施形態は、膀胱（または尿路上皮）癌を有する被験者に治療を含み、前記癌は、移行上皮癌、上皮内癌（もしくは腫瘍）、非筋層浸潤性、筋層浸潤性、局所進行性、転移性、Ｉ期からＩＶ期、または低悪性度もしくは高悪性度であり得る。

好ましい実施形態では、ＩＬ−２融合タンパク質と１つまたは複数の治療薬の併用投与は、被験者において癌を治療するまたは予防するうえでこれらの治療薬単独での治療よりも有効である。ＩＬ−２融合タンパク質と１つまたは複数の治療薬を用いた併用治療の有効性を、類似の試験群の歴史的効果測定を用いてまたはクロスオーバー試験において、前向きまたは後向きベースで治療薬単独での治療と比較することができる。効果の測定は癌治療に関して十分に確立されており、全体的腫瘍応答（すなわちＲＥＣＩＳＴ、ＷＨＯまたは他の基準に基づく進行性疾患、安定な疾患、部分応答または完全応答の割合）、無増悪生存期間、進行までの時間、全体的生存期間または生存率、ハザード比、再発率または再発時期、腫瘍バイオマーカー分析、生活の質の測定、付加的な治療の割合または付加的な治療までの時間等を含み得る。治療薬単独での治療と比較してＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を用いた併用治療のより良好な効果は、典型的には効果測定における統計的に有意の改善（すなわちＰ値＜０．１０もしくは、好ましくは＜０．０５）と定義されるか、または事象測定までの時間の数週間、数か月もしくは数年間の増大または１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％、１２５０％、１５００％、１７５０％、２０００％もしくはそれ以上の改善率測定と定義され得る。非限定的な例では、本発明のＡＬＴ−８０１およびゲムシタビン＋シスプラチンの併用投与を用いた進行または転移性膀胱癌を有する被験者の治療は、ゲムシタビン＋シスプラチンまたは他のシスプラチンベースの化学療法レジメンで治療された進行／転移性膀胱癌被験者について以前に報告されたものよりも良好な抗腫瘍効果を提供した。具体的には、ｖｏｎ ｄｅｒ Ｍａａｓｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０００）１７：３０６８）は、進行したまたは転移性膀胱癌を有する被験者の第ＩＩＩ相臨床試験において、ゲムシタビン＋シスプラチンでの治療が、独立した放射線検査により、４９．４％（評価した１８２名の患者のうち８１名）の全体的腫瘍応答率および１２．２％の完全応答率をもたらしたことを報告した。この試験はまた、メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシンおよびシスプラチンで治療された患者における同様の全体的応答率（４５．７％、評価した１８１名の患者のうち６９名）および完全応答率（１１．９％）も報告した。この患者集団における他の化学療法レジメン（すなわち単剤、２剤併用、３剤併用）のその後の試験は、類似かまたはより低い応答率を報告した（Ｙａｆｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１１）１８：ｅ２５により総説された）。驚くべきことに、進行／転移性膀胱（尿路上皮）癌を有する患者への本発明のＡＬＴ−８０１およびゲムシタビン＋シスプラチンの併用投与は、ｖｏｎ ｄｅｒ Ｍａａｓｅ ｅｔ ａｌ．または他の研究者によってゲムシタビン＋シスプラチンまたは他のシスプラチンベースの化学療法レジメンに関して報告されたものよりもはるかに良好な全体的応答率および完全応答率を提供した。

加えて、ＩＬ−２融合タンパク質と１つまたは複数の治療薬の併用投与は、化学療法に対して抵抗性である被験者において癌を治療するまたは予防するのに有効である。特定の実施形態では、本発明の併用治療は、癌がそれに対して抵抗性である１つまたは複数の治療薬を含む。他の実施形態では、本発明の併用治療は、癌がそれに対して抵抗性であるものとは異なる１つまたは複数の治療薬を含む。非限定的な例では、以前のゲムシタビン＋シスプラチン治療後に進行した膀胱癌を有する患者において完全な応答（ＣＲ）を提供するのに有効であった。この結果は、白金を含むレジメン後に進行した進行尿路上皮癌を有する３７０名の患者の第ＩＩＩ相試験においてＣＲが報告されなかったという事実を考慮すると極めて予想外である（Ｂｅｌｌｍｕｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００９）２７：４４５４）。

本発明のＩＬ−２融合タンパク質と１つまたは複数の治療薬の併用は、様々な機構を介してより有効な治療を提供し得る。ＩＬ−２融合タンパク質と細胞傷害性治療薬レジメンは、これらの薬剤の癌に対する直接作用の組合せを通して効果を提供することができる。一部の状況では、これらの作用のタイミングが改善された結果を提供し得る。例えば、大きな病変に対する細胞傷害性治療薬の迅速な活性を、残存する疾患に対するＩＬ−２融合タンパク質の持続的な長期活性と組み合わせると、いずれかの薬剤単独よりも良好な効果を提供し得る。あるいは、治療薬は、腫瘍細胞に直接の細胞傷害作用を及ぼすだけでなく、いわゆるオフターゲット効果により免疫系も増強して、本発明のＩＬ−２融合タンパク質と組み合わせて効率的な抗癌免疫を達成し得る（Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，１１：２１５−２３３）。例えば、治療薬での処置は癌細胞表面の抗原性標的の発現を増大させることができ、それによりＩＬ−２融合タンパク質によって誘導されるより有効な抗腫瘍免疫応答を可能にする。一部の実施形態では、抗原性標的はＩＬ−２融合タンパク質の成分によって認識され、免疫応答はＩＬ−２融合タンパク質相互作用を介して腫瘍細胞へと向かう。一例では、治療薬は、腫瘍細胞表面のＨＬＡまたはＨＬＡ／ペプチド複合体レベルを上昇させ、ＴＣＲ−ＩＬ−２融合タンパク質による認識を促進する。他の特定の例では、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンを含む白金系化合物は、ＨＬＡクラスＩの発現を誘導するだけでなく、ヒト腫瘍細胞でのＴ細胞阻害性分子ＰＤ−Ｌ２の発現を著しく低減する（Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２１：３１００−３１０８）。ＰＤ−Ｌ２の下方調節は、ＩＬ−２融合タンパク質によって刺激されるＴ細胞の抗腫瘍作用の増強をもたらし得る。シスプラチン、パクリタキセルおよびドキソルビシンを含む様々な治療薬が、グランザイムへの腫瘍細胞の透過性を高めることによって腫瘍細胞を細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対して感作する能力を有し、それにより、腫瘍細胞がＣＴＬによって認識される抗原を発現しない場合でも、腫瘍細胞がＣＴＬ媒介性溶解を受けやすいようにする（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２０：１１１１−１１２４）。本発明の他の実施形態では、ゲムシタビンとＩＬ−２融合タンパク質の組合せは、腫瘍細胞でのＨＬＡクラスＩの発現を高め、ＩＬ−２融合タンパク質によって活性化されるＣＤ８^＋ Ｔ細胞への腫瘍抗原の交差提示を促進するゲムシタビンの活性に起因してより有効な治療をもたらすことができる（Ｌｉｕ，Ｗ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１０２：１１５−１２３；Ｎｏｗａｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７０：４９０５−４９１３，２００３；およびＮｏｗａｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６３：４４９０−４４９６，２００３）。本発明の併用療法において、ゲムシタビンの使用はまた、抗原特異的Ｔ細胞応答を抑制することに関与する骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）も選択的に死滅させることができ（Ｍｕｎｄｙ−Ｂｏｓｓｅ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７１：５１０１−５１１０；Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７０：３０５２−３０６１；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１１：６７１３−６７２１，２００５；およびＫｏ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６７：７４７７−７４８６，２００７）、それによりＩＬ−２融合タンパク質媒介性抗腫瘍免疫活性のためにより良好な環境を提供する。化学療法はまた、抗腫瘍免疫応答を誘引し、刺激することができるアデノシン５’−三リン酸の放出を導く、腫瘍の自家融解も誘導し得る（Ｍｉｃｈａｕｄ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３４：１５７３−１５７７）。全体として本発明の併用治療についての抗腫瘍作用機構は、治療薬の直接の細胞傷害作用に基づくのではないと考えられる。それゆえ、併用治療は、腫瘍が治療薬成分に対して不応性である被験者において有効であり得る。

キット

本発明は、新生物の治療または予防のためのキットを提供する。１つの実施形態では、キットは、単位剤形の治療有効量のＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を含有する治療用または予防用組成物を含む。好ましい実施形態では、ＩＬ−２融合タンパク質はＡＬＴ−８０１であり、１つまたは複数の治療薬はシスプラチンおよび／またはゲムシタビンである。一部の実施形態では、キットは、治療用または予防用細胞組成物が入った滅菌容器を含む；そのような容器は、箱、アンプル、ビン、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパックまたは当分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔または薬剤を保持するのに適した他の材料で作ることができる。

所望する場合、本発明のＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬は、癌（例えば膀胱癌）を有するまたは発症する危険性がある被験者にＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬投与するための指示書と共に提供される。指示書は、一般に新生物の治療または予防のための組成物の使用についての情報を含む。他の実施形態では、指示書は以下の少なくとも１つを含む：治療薬の説明；虚血またはその症状の治療または予防のための投薬スケジュールおよび投与；事前注意；警告；適応症；禁忌；過量投与情報；有害反応；動物薬理学；臨床試験；および／または参考資料。指示書は、容器（存在する場合）上に直接、または容器に貼付されるラベルとして、または容器内でもしくは容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カードもしくはフォルダーとして印刷され得る。

組換えポリペプチド発現

本発明の実施は、特に指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用し、これらの技術は十分に当業者の範囲内である。そのような技術は文献において、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（３１）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗｅｉｒ，１９９６）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）において十分に説明されている。これらの技術は本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製に適用でき、それら自体、本発明を行うおよび実践する際に考慮され得る。特定の実施形態のための特に有用な技術を以下の章で論じる。

以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法をどのようにして実施し、使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示するものであり、発明者が自らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図されない。

新規ＩＬ−２融合タンパク質ＡＬＴ−８０１の静脈内投与はマウスモデルにおいて膀胱癌を阻害する

ＡＬＴ−８０１は、インターロイキン２と、ヒトｐ５３ペプチド（アミノ酸２６４〜２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１複合体を提示する腫瘍を認識することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインとの融合タンパク質である。ＡＬＴ−８０１の静脈内投与は、ＰＢＳ処置と比較して、ＭＢ４９ｌｕｃ正所性筋層浸潤性および表在性膀胱癌を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存期間を有意に延長させた。ＡＬＴ−８０１処置マウスは、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞での再誘発後も生存し、長期間持続する免疫応答と長期記憶を示した。加えて、ＡＬＴ−８０１は、ヌードマウスにおいてヒト膀胱癌ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋／ｐ５３^＋ ＵＭＵＣ−１４およびＨＬＡ−Ａ^＊０２０１陰性／ｐ５３^＋ ＫＵ７異種移植片に対する強力な抗腫瘍活性を示し、これは、ＡＬＴ−８０１のＴＣＲドメイン標的化活性が効果のために必要ではないことを明らかにする。ゲムシタビンと組み合わせたＡＬＴ−８０１は、ＵＭＵＣ−１４およびＫＵ７異種移植モデルにおいて、ゲムシタビン＋シスプラチン（ＧＣ）化学療法と比べて、これらの腫瘍細胞のＧＣに対する感受性が異なるにもかかわらず、より良好な抗腫瘍作用およびより低い毒性を示した。

ヌードマウスにおけるヒト膀胱癌ＵＭＵＣ−１４の原発腫瘍増殖への、ゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせたＡＬＴ−８０１の作用

単独またはゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせたｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ２（ＡＬＴ−８０１）の反復投与の抗腫瘍効果を、ヒト膀胱ＵＭＵＣ−１４およびＫＵ７Ｐ細胞を担持する無胸腺ヌードマウスにおける原発腫瘍増殖に関して評価した。ゲムシタビンおよびシスプラチンレジメンでの処置は転移性膀胱癌を有する患者のための標準治療である。これらの化学療法剤のヒト膀胱癌細胞へのインビトロ作用を評価するため、ＨＬＡ−Ａ２^＋ｐ５３^＋ ＵＭＵＣ−１４細胞を、ゲムシタビンおよびシスプラチンにより単独でおよび併用して処置した。２４時間のインキュベーション後、ゲムシタビン、シスプラチンおよびゲムシタビン＋シスプラチンは、Ｇ０／Ｇ１細胞周期停止によりＵＭＵＣ−１４細胞増殖の用量依存的な低下を生じさせた。これらの結果は、増殖中の細胞に対するこれらの薬剤の作用機構と一致する。ゲムシタビン＋シスプラチンの組合せとのインビトロでのインキュベーションは、ＵＭＵＣ−１４腫瘍細胞の表面でのｐ５３ペプチド（アミノ酸２６４〜２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１複合体の提示も誘導し、ＡＬＴ−８０１についての抗原性標的がこの処置によって上昇することを示した。

ゲムシタビンおよびシスプラチンに対するヒト膀胱腫瘍細胞株の感受性を、細胞増殖アッセイを用いてさらに評価した。ＵＭＵＣ−１４およびＫＵ７Ｐ細胞を、様々な量のゲムシタビンおよびシスプラチンを含有する培地にプレートし、２４時間後にＷＳＴ−１試薬を用いて細胞増殖を測定した。ゲムシタビンは、ＵＭＵＣ−１４細胞の増殖を２０３０μΜのＩＣ_５０で阻害し、ＫＵ７Ｐ細胞の増殖を０．０５μΜのＩＣ_５０で阻害することが認められた。シスプラチンも、ＵＭＵＣ−１４細胞（ＩＣ_５０、９．２μΜ）に比べてＫＵ７Ｐ細胞（ＩＣ_５０、１．４μΜ）にはるかに大きな阻害を示した。全体としてこれらの結果は、化学療法剤に対してＵＭＵＣ−１４細胞増殖が比較的抵抗性であり、ＫＵ７Ｐ細胞増殖が感受性であることを示す。

次に、ゲムシタビン、シスプラチンおよびＡＬＴ−８０１治療の抗腫瘍作用を、皮下ＵＭＵＣ−１４ヒト膀胱腫瘍を担持するヌードマウスで評価した。この試験では、ＵＭＵＣ−１４腫瘍担持マウスの４つの群（５匹のマウス／群）に、２サイクルの試験薬治療を行い、各サイクルは３週間にわたった。ゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせたＡＬＴ−８０１（Ｇｅｍ＋Ｃｉｓ＋ＡＬＴ−８０１）に関しては、シスプラチン（Ｃｉｓ）（３ｍｇ／ｋｇ）を第１試験日（ＳＤ１）およびＳＤ２２に静脈内投与し、ゲムシタビン（Ｇｅｍ）（４０ｍｇ／ｋｇ）をＳＤ１、ＳＤ８、ＳＤ２２およびＳＤ２９に静脈内投与し、ＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）をＳＤ３、ＳＤ５、ＳＤ８、ＳＤ１０、ＳＤ２４、ＳＤ２６、ＳＤ２９およびＳＤ３１に静脈内投与した（図１）。他の試験処置群には、ＡＬＴ−８０１単独療法、Ｇｅｍ＋Ｃｉｓ併用療法、または適切なスケジュールで与えたＰＢＳが含まれた。試験した３つの治療レジメンの各々（Ｇｅｍ＋Ｃｉｓ＋ＡＬＴ−８０１；ＡＬＴ−８０１；Ｇｅｍ＋Ｃｉｓ）は、ＰＢＳ処置マウスで認められたものと比較して皮下ＵＭＵＣ−１４ヒト膀胱腫瘍の増殖の統計的に有意の低下を生じさせた（図１）。３つの処置群の中で、Ｇｅｍ＋Ｃｉｓ＋ＡＬＴ−８０１が、（ＰＢＳ処置マウスにおける腫瘍と比較して）８７％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）で最良の効果を示し、次いでＡＬＴ−８０１（７７％ＴＧＩ）およびＧｅｍ＋Ｃｉｓ（５２％ＴＧＩ）であった。Ｇｅｍ＋Ｃｉｓ処置で見られた腫瘍体積の減少は、２回目のサイクルの処置の間にのみ認められ、一部には、直接の抗腫瘍活性よりはむしろ大きな腫瘍の破壊または壊死に起因したと考えられる。ゲムシタビンおよびシスプラチン治療と組み合わせたＡＬＴ−８０１は、マウス体重を有意に減少させず、観察された死亡または治療後の毒性の徴候はなく、治療レジメンが安全であることを示唆した。

ヌードマウスにおけるＵＭＵＣ−１４ヒト膀胱癌の原発腫瘍増殖への、ゲムシタビンと組み合わせたＡＬＴ−８０１またはＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の作用

この試験は、ヒト膀胱ＵＭＵＣ−１４細胞を担持する無胸腺ヌードマウスにおける原発腫瘍増殖への、ＡＬＴ−８０１（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ２）＋ゲムシタビンおよび非標的化ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質（ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２）＋ゲムシタビンの反復投与の抗腫瘍効果を評価するためのフォローアップとして実施した。ＡＬＴ−８０１（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２）は、ｐ５３（アミノ酸２６４〜２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１複合体を示す腫瘍細胞を認識し、無胸腺ヌードマウスにおいてＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋／ｐ５３^＋皮下腫瘍の増殖を阻害することが明らかにされている（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ｅｔ ａｌ．２００６ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１：２９，Ｗｅｎ，ｅｔ ａｌ．２００８ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５７：１７８１）。異なるｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質であるＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２は、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１に関連して提示されるＭＡＲＴ−１（アミノ酸２７〜３５）ペプチドを認識するが、ｐ５３（アミノ酸２６４〜２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１は認識しない。このタンパク質を、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋／ｐ５３^＋皮下腫瘍に関する試験で非標的化対照試薬として使用した。ＡＬＴ−８０１とＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２は、細胞表面のＩＬ−２受容体に結合し、ＮＫ細胞応答を刺激する同等の能力を示した。しかし、ＡＬＴ−８０１は、マウスモデルにおける皮下ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋／ｐ５３^＋ Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍に対してＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２よりもはるかに良好な抗腫瘍活性を示した（Ｗｅｎ，ｅｔ ａｌ．２００８ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５７：１７８１）。この作用は、ＡＬＴ−８０１タンパク質による腫瘍特異的認識に起因する可能性が高い。

ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の抗腫瘍活性への腫瘍標的化の寄与を測定するため、ゲムシタビンと組み合わせたＡＬＴ−８０１およびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の効果を評価した。ゲムシタビン＋シスプラチンを摂取した腫瘍担持マウスをこの試験のための対照群として使用した。

皮下ＵＭＵＣ−１４腫瘍（平均体積８０ｍｍ^３）を担持する無胸腺ヌードマウス（４匹の動物／群）を、２サイクルの処置のために与えた、ゲムシタビン（４０ｍｇ／ｋｇ）（Ｇｅｍ）＋シスプラチン（３ｍｇ／ｋｇ）（Ｃｉｓ）、ＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）＋Ｇｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）またはＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２（２．４ｍｇ／ｋｇ、ＡＬＴ−８０１の同等活性投与）＋Ｇｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）で静脈内処置した。１回目の処置サイクルは、１回目のサイクルの第１試験日（ＳＤ１）に１回のＣｉｓ注射、ＳＤ１およびＳＤ８に２回のＧｅｍ注射、ならびにＳＤ３、ＳＤ５、ＳＤ８およびＳＤ１０にＡＬＴ−８０１またはＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の４回の注射から成った。１１日の休止期間（ＳＤ１５〜ＳＤ２１）後、２回目のサイクルの処置を１回目のサイクルと同じレジメンを用いてこの試験のために実施し、次いで６日間のフォローアップ期間（ＳＤ４２〜ＳＤ４７）を置いた。

ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍまたはＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍを用いた治療は、Ｇｅｍ＋Ｃｉｓ処置マウスで認められたものと比較して、皮下ＵＭＵＣ−１４ヒト膀胱腫瘍の増殖の統計的に有意の低下を生じさせた（図２）。全体としてＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ処置とＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ処置の間で抗腫瘍活性の有意差は認められなかったが、ＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍは、治療経過の間、より良好な抗腫瘍効果の傾向を示した。これらの結果は、このモデルにおけるＡＬＴ−８０１治療レジメンの強力な抗腫瘍活性を明らかにする以前の結果を確認する。加えて、非標的化ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の観察された効果は、ＵＭＵＣ−１４ヒト膀胱異種移植片がＩＬ−２に基づく治療に対しても高度に感受性であることを示す。それゆえ、このデータは、ＡＬＴ−８０１のｃ２６４ｓｃＴＣＲ成分の標的化活性がＵＭＵＣ−１４膀胱腫瘍細胞に対するその強力な効果のために必要ではないことを明らかにする。実施例２と合わせて考慮すると、これらの結果は、化学療法（ゲムシタビン＋シスプラチンまたはゲムシタビンのいずれか）とＩＬ−２融合タンパク質の併用が、化学療法剤に抵抗性の腫瘍細胞を含む、ヒト膀胱腫瘍に対して有効な治療をもたらしたことを明らかに示す。

治療レジメンの間に観察された死亡または治療後の毒性の徴候はなかった。治療経過の間のいくつかの時点で、Ｇｅｍ＋Ｃｉｓで処置した動物と比較して、ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍおよびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ処置群において有意の体重減少が認められた。しかし、ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍおよびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ処置群のどちらについても、平均マウス体重は１１日の休止期間および１週間のフォローアップ期間の間に速やかに回復した。これらの所見は、ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍおよびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ処置レジメンが、このモデルにおいて一過性の毒性で良好に耐容されることを明らかにする。

ヌードマウスにおけるＵＭＵＣ−１４およびＫＵ７ヒト膀胱癌の原発腫瘍増殖への、ゲムシタビンと組み合わせたＡＬＴ−８０１またはＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の作用

これらの試験は、ヒト膀胱ＵＭＵＣ−１４またはＫＵ７Ｐ細胞を担持する無胸腺ヌードマウスにおける原発腫瘍増殖への、ゲムシタビンまたはゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせたＡＬＴ−８０１（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ２）、ならびにゲムシタビンと組み合わせた非標的化ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質（ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２）の反復投与の抗腫瘍効果を評価するために実施した。ＰＢＳまたはＧｅｍ＋Ｃｉｓを摂取した腫瘍担持マウスをこの試験のための対照群として使用した。ＧｅｍおよびＣｉｓは、転移性膀胱癌を有する患者のための標準治療の化学療法である。

皮下ＵＭＵＣ−１４腫瘍（平均体積８４ｍｍ^３）を担持する無胸腺ヌードマウス（５匹の動物／群）を、２サイクルの処置のために与えた、ＰＢＳ、Ｇｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｃｉｓ（３ｍｇ／ｋｇ）、ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２（２．１９ｍｇ／ｋｇ、ＡＬＴ−８０１の同等活性投与）＋Ｇｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）＋Ｇｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）、またはＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）＋Ｇｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｃｉｓ（３ｍｇ／ｋｇ）で処置した。１回目の処置サイクルは、１回目のサイクルの第９試験日（ＳＤ９）に１回のＣｉｓ注射、ＳＤ９およびＳＤ１６に２回のＧｅｍ注射、ならびにＳＤ１１、ＳＤ１３、ＳＤ１６およびＳＤ１８にＡＬＴ−８０１またはＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の４回の注射から成った。１１日の休止期間（ＳＤ１９〜ＳＤ３０）後、２回目のサイクルの処置を１回目のサイクルと同じレジメンを用いてこの試験のために実施し、次いで１０日間のフォローアップ期間（ＳＤ４０〜ＳＤ４９）を置いた。

ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ、ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍまたはＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ＋Ｃｉｓを用いた治療は、ＰＢＳ処置マウスで認められたものと比較して、皮下ＵＭＵＣ−１４ヒト膀胱腫瘍の増殖の統計的に有意の低下を生じさせた（図３）。増殖のこの統計的に有意の低下は、腫瘍の一部の表面に亀裂があった場合でも認められた、この亀裂はＰＢＳ（ＳＤ３８に開始）およびＧｅｍ＋Ｃｉｓ（ＳＤ２９に開始）の両群において腫瘍体積測定の精度に著しい影響を及ぼした。治療群であるＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ、ＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ、およびＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ＋Ｃｉｓの間で抗腫瘍活性に有意差は認められなかったが、ＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ＋Ｃｉｓは、現在の試験の治療経過においてより良好な抗腫瘍効果の傾向を示した。これらの結果は、この動物モデルにおけるＡＬＴ−８０１治療レジメンの強力な抗腫瘍活性を明らかにする以前の結果を確認する。加えて、非標的化ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の観察された効果は、ＵＭＵＣ−１４ヒト膀胱異種移植片がＩＬ−２に基づく治療に対しても高度に感受性であることを示す。それゆえ、このデータは、ＡＬＴ−８０１の２６４ｓｃＴＣＲ成分の標的化活性がＵＭＵＣ−１４膀胱腫瘍細胞に対するその強力な効果のために必要ではないことをさらに明らかにする。

治療レジメンの間に死亡は観察されなかった。しかし、治療経過の間のいくつかの時点で、Ｃｉｓで処置しなかった動物と比較して、Ｇｅｍ＋ＣｉｓおよびＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ＋Ｃｉｓ処置群において有意の体重減少が認められた（図４）。Ｃｉｓを使用することにより抗腫瘍活性に有意差は認められず、体重減少からの回復は緩慢で、このモデルにおけるＣｉｓのより高い毒性を示した。これらの結果は、Ｃｉｓがこの処置において治療上の恩恵を与えないことを示す。体重減少は、ＰＢＳ群と比較した場合ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍおよびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍの両治療群においても認められたが、ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍおよびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ治療群のどちらについても、平均マウス体重は１１日の休止期間および１３日のフォローアップ期間の間に速やかに回復した。これらの所見は、ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍおよびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ治療レジメンが、このモデルにおいて一過性の毒性で良好に耐容されることを明らかにする。

フォローアップとして、異なるヒト膀胱腫瘍細胞株、ＫＵ７Ｐを使用して、ＧｅｍまたはＧｅｍ＋Ｃｉｓと組み合わせた、ＡＬＴ−８０１およびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の効果をさらに評価した。この細胞株は、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１陰性で、ｐ５３を過剰発現する細胞株であり、ＡＬＴ−８０１分子またはＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２分子のいずれかによって認識される抗原を提示しない。したがって、このモデルの結果は、Ｇｅｍと組み合わせたｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合物の「非標的化」抗腫瘍活性がヌードマウスにおける原発ヒト膀胱腫瘍異種移植片に対して有効であることのさらなる証拠を提供し得る。ＰＢＳまたはＧｅｍ＋Ｃｉｓを摂取した腫瘍担持マウスをこの試験のための対照群として使用した。皮下ＫＵ７Ｐ腫瘍（ＰＢＳ群［〜７０ｍｍ^３］を除き、平均体積８１ｍｍ^３）を担持する無胸腺ヌードマウス（５匹の動物／群）を、２サイクルの処置のために与えた、ＰＢＳ、Ｇｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｃｉｓ（３ｍｇ／ｋｇ）、ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２（２．１９ｍｇ／ｋｇ、ＡＬＴ−８０１の同等活性投与）＋Ｇｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）＋Ｇｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）、またはＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）＋Ｇｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｃｉｓ（３ｍｇ／ｋｇ）で処置した。１回目の処置サイクルは、１回目のサイクルの第７試験日（ＳＤ７）に１回のＣｉｓ注射、ＳＤ７およびＳＤ１４に２回のＧｅｍ注射、ならびにＳＤ９、ＳＤ１１、ＳＤ１４およびＳＤ１６にＡＬＴ−８０１またはＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の４回の注射から成った。１１日の休止期間（ＳＤ１７〜ＳＤ２７）後、２回目のサイクルの処置を１回目のサイクルと同じレジメンを用いてこの試験のために実施し、次いで１０日間のフォローアップ期間（ＳＤ３７〜ＳＤ４５）を置いた。

Ｇｅｍ＋Ｃｉｓ、ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ、ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍまたはＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ＋Ｃｉｓを用いた治療は、ＰＢＳ処置マウスで認められたものと比較して皮下ＫＵ７Ｐヒト膀胱腫瘍の増殖の統計的に有意の低下を生じさせた（図５）。全体として、治療群であるＧｅｍ＋Ｃｉｓ、ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ、ＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ、およびＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ＋Ｃｉｓの間で抗腫瘍活性の統計的に有意の差は認められなかったが、ＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ＋Ｃｉｓは、治療経過の間、より良好な抗腫瘍効果（すなわちＧｅｍ＋Ｃｉｓと比較して）の傾向を示した。これらの結果は、ＵＭＵＣ−１４膀胱腫瘍異種移植モデルにおけるＡＬＴ−８０１およびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２治療レジメンの強力な抗腫瘍活性を明らかにする、上記で言及した試験結果と一致する。加えて、ヌードマウスにおけるＨＬＡ−Ａ^＊０２０１陰性／ｐ５３過剰発現ＫＵ７Ｐヒト膀胱腫瘍への、Ｇｅｍと組み合わせたＡＬＴ−８０１およびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の観察された非標的化効果は、ＫＵ７Ｐヒト膀胱異種移植片がＧｅｍ＋ＩＬ−２ベースの治療に対して高度に感受性であることを示す。それゆえ、このデータは、ＡＬＴ−８０１の２６４ｓｃＴＣＲ成分の標的化活性が、ＫＵ７Ｐ膀胱腫瘍細胞に対するＧｅｍとの組合せでの強力な効果のために必要ではないことをさらに明らかにする。この試験の結果はまた、Ｇｅｍ＋Ｃｉｓレジメンが、ＵＭＵＣ−１４膀胱腫瘍モデルにおける場合よりもＫＵ７Ｐ膀胱腫瘍の増殖を阻害するうえでより有効であり、ＡＬＴ−８０１がＧｅｍ＋Ｃｉｓレジメンに対する感受性に関わりなくこれらの膀胱癌細胞に対して有効であることも示す。これらの結果は、上記で述べたゲムシタビンおよびシスプラチンに対するＫＵ７Ｐ細胞のインビトロ感受性およびＵＭＵＣ−１４細胞の抵抗性と一致する。ＩＬ−２融合タンパク質ＡＬＴ−８０１またはＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２による単独またはＧｅｍ＋Ｃｉｓと組み合わせた治療は、化学療法感受性および抵抗性の両方の膀胱腫瘍に対して有効であることが認められた。

治療レジメンの間に死亡は観察されなかった。しかし、上記で言及した試験と一致して、Ｃｉｓで処置しなかった動物と比較して、Ｇｅｍ＋ＣｉｓおよびＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍ＋Ｃｉｓ処置群において有意の体重減少が認められた（図６）。上記で示したように、ＫＵ７Ｐ膀胱腫瘍はＣｉｓに感受性であり、ＡＬＴ−８０１＋Ｇｅｍとの組合せを投与した場合わずかに良好な抗腫瘍活性を示す。しかし、Ｃｉｓ処置群における体重減少からの回復は緩慢で、このモデルにおけるＣｉｓのより高い毒性および、それゆえ、好ましくない治療指数を示した。体重減少は、特に２回目の処置サイクルにおいて、ＰＢＳ群と比較した場合ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍおよびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍの両処置群でも認められたが、ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍおよびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ処置群のどちらについても、平均マウス体重は１１日の休止期間および８日のフォローアップ期間の間に速やかに回復した。これらの所見は、ＡＬＴ−８０１＋ＧｅｍおよびＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２＋Ｇｅｍ治療レジメンが、このモデルにおいて一過性の毒性で良好に耐容されることを示唆する。

同様の試験を、上述したのと同じ治療スケジュールを用いてＧｅｍ（４０ｍｇ／ｋｇ）、ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２（２．１９ｍｇ／ｋｇ、ＡＬＴ−８０１の同等活性投与）、またはＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）での単独療法の抗腫瘍作用を検討するために皮下ＫＵ７Ｐ膀胱腫瘍異種移植モデルにおいて実施した。図７に示すように、Ｇｅｍ、ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２またはＡＬＴ−８０１での治療は、ＰＢＳ処置マウスで認められたものと比較して皮下ＫＵ７Ｐヒト膀胱腫瘍の増殖の統計的に有意の低下を生じさせた。この作用は、Ｇｅｍ＋ＭＡＲＴ−１ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２およびＧｅｍ＋ＡＬＴ−８０１の組合せで認められた作用ほど持続的ではないと思われ、前記２つの組合せでは連続的な処置後にほとんどまたは全く腫瘍の再増殖が見られなかった（図３および５）。したがって、ＩＬ−２融合タンパク質と化学療法（この場合はゲムシタビン）での併用治療は、ヒト膀胱腫瘍に対して最も有効な抗腫瘍活性を提供すると思われた。

ＭＢ４９ｌｕｃ正所性筋層浸潤性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスおよびアルビノＣ５７ＢＬ／６マウスの生存へのＡＬＴ−８０１の作用。ＡＬＴ−８０１のＴＣＲドメインの標的化活性は抗腫瘍活性のために必要ではない

同系ＭＢ４９ｌｕｃ正所性筋層浸潤性膀胱腫瘍を担持する免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６およびアルビノＣ５７ＢＬ／６マウスの生存へのＡＬＴ−８０１（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ２）の反復投与の作用を評価した。これらの腫瘍はＡＬＴ−８０１によって認識されるｐ５３（アミノ酸２６４〜２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１複合体を欠くので、この試験は、膀胱癌に対するＡＬＴ−８０１の「非標的化」抗腫瘍活性を評価するように設計されている。

ＡＬＴ−８０１の効果を評価するために免疫応答性アルビノＣ５７ＢＬ／６マウスにおける適切で再現可能なマウス膀胱癌モデル（マウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９ｌｕｃ）を使用した。ＭＢ４９ｌｕｃ細胞株は、生物発光アッセイを用いたその検出を可能にするルシフェラーゼを発現する。膀胱をトリプシン−ＥＤＴＡで前処理した後、ＭＢ４９ｌｕｃ（１×１０^６細胞／膀胱）を第０試験日にアルビノＣ５７ＢＬ／６マウス（１７週齢）の膀胱内に注入した。ＰＢＳ（ｎ＝５）またはＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝４）をＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞注入の９、１６、２３および３０日後に静脈内投与した。効果のエンドポイントとして腫瘍注入後に処置群間で生存率を評価するためにマウスを維持した。ＡＬＴ−８０１は、ＰＢＳと比較してＭＢ４９ｌｕｃ担持マウスの生存期間を有意に延長させた（Ｐ＝０．０１７１）（図８）。ＡＬＴ−８０１処置群の生存動物を初回注入の８４日後にＭＢ４９ｌｕｃ細胞（１×１０^６細胞／マウス）の膀胱内注入で再誘発した。加えて、同じ日にナイーブＣ５７ＢＬ／６対照マウスに腫瘍細胞を注入し、対照として使用した。次に、ＭＢ４９ｌｕｃ細胞を検出するためのルシフェラーゼに基づく画像化を、ＭＢ４９ｌｕｃ細胞での再誘発の１６日後に実施した。先にＡＬＴ−８０１で処置した群の腫瘍細胞再誘発マウスは生物発光腫瘍シグナルを示さなかったが、ＭＢ４９ｌｕｃを注入したナイーブマウスは腫瘍細胞シグナルの証拠を示し、先にＡＬＴ−８０１で処置した群のマウスがＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞の再着床に対して抵抗性であったことを明らかにした。カプラン‐マイヤー生存率曲線は、先にＡＬＴ−８０１で処置した群の再誘発マウスがナイーブＭＢ４９ｌｕｃ注入マウスよりも有意に長く生存したことを示した（Ｐ＝０．０２４６）。

同様に、別の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（９〜１０週齢）に、膀胱のポリリシンでの前処理後、第０試験日にＭＢ４９ｌｕｃ（０．０７５×１０^６細胞／膀胱）を膀胱内注入した。ＰＢＳ（ｎ＝６）またはＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６）をＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞注入の７、１４、２１および２８日後に静脈内投与した。効果のエンドポイントとして処置群間で生存率を評価するためにマウスを維持した。ＡＬＴ−８０１は、ＰＢＳと比較してＭＢ４９ｌｕｃ担持マウスの生存期間を有意に延長させた（Ｐ＝０．００７）（図９Ａ）。ＡＬＴ−８０１処置の生存動物を初回注入の６２日後にＭＢ４９ｌｕｃ細胞（０．０７５×１０^６細胞／マウス）の膀胱内注入で再誘発した。加えて、同じ日にナイーブＣ５７ＢＬ／６対照マウス（ｎ＝２）に腫瘍細胞を注入し、対照として使用した。次に、ＭＢ４９ｌｕｃ細胞での再誘発の１６日後に画像化を実施した。先にＡＬＴ−８０１で処置した群の腫瘍細胞再誘発マウスは生物発光腫瘍シグナルを示さなかったが、ＭＢ４９ｌｕｃを注入したナイーブマウスは腫瘍細胞シグナルの証拠を示し、先にＡＬＴ−８０１で処置した群のマウスがＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞の再着床に対して抵抗性であったことを示唆した（図９Ｂ）。先にＡＬＴ−８０１で処置した群のマウスは、再誘発後ナイーブマウスより長く生存したが、カプラン‐マイヤー分析は、群当たりに使用したマウスの数が少ないため、２つの群の間で生存期間の統計的な有意性を示さなかった（Ｐ＝０．０８９６）。

付加的な試験において、ＡＬＴ−８０１の静脈内投与の効果を、免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの正所性ＭＢ４９ｌｕｃ筋層浸潤性膀胱癌モデルにおいてさらに評価した。膀胱のポリリシン前処理後、ＭＢ４９ｌｕｃ（１００μＬ中０．０７５×１０^６細胞／膀胱）を第０試験日にＣ５７ＢＬ／６マウス（１０〜１１週齢）の膀胱内に注入した。ＰＢＳ（ｎ＝１０）またはＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）をＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞注入の７、１４、２１および２８日後に静脈内投与した。効果のエンドポイントとして腫瘍注入後に処置群間で生存率を評価するためにマウスを維持した。ＡＬＴ−８０１は、ＰＢＳと比較してＭＢ４９ｌｕｃ担持マウスの生存期間を有意に延長させた（Ｐ＝０．０２０１）（図１０）。このモデルにおける先の試験と一致して、正所性ＭＢ４９ｌｕｃ筋層浸潤性膀胱腫瘍に対するＡＬＴ−８０１の観察された抗腫瘍作用は、ＡＬＴ−８０１融合タンパク質の抗原標的化活性とは無関係である。

要約すると、これらの結果は、ＡＬＴ−８０１の静脈内処置が、同系ＭＢ４９ｌｕｃ正所性筋層浸潤性膀胱腫瘍を担持する免疫応答マウスの生存期間を延長させるのに有効であることを明らかにした。ＡＬＴ−８０１治療はまた、以前に暴露された腫瘍に対して持続的な免疫記憶応答も提供する。これらの作用はＡＬＴ−８０１融合タンパク質の標的化活性とは無関係である。

ＡＬＴ−８０１の静脈内投与はＭＢ４９ｌｕｃ正所性表在性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存期間を延長させた。

この試験は、マウスＭＢ４９ｌｕｃ正所性表在性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存への、反復投与レジメンで静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって投与した場合のＡＬＴ−８０１の作用を評価するために実施した。この試験は、前の実施例で述べた免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける適切で再現可能なマウスＭＢ４９ｌｕｃ膀胱癌モデルを用いた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの膀胱へのＭＢ４９ｌｕｃ細胞の膀胱内注入は、注入の１〜２日後に表在型の膀胱癌を生じさせることが明らかにされている。腫瘍は注入後７〜９日目までに筋層浸潤型へと進行し、腫瘍媒介性死亡が２〜３週間後に観察された。本試験では、ＡＬＴ−８０１の静脈内投与の生存への恩恵を、ＭＢ４９ｌｕｃ細胞に由来するマウス正所性表在性膀胱癌を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて検討した。これらの腫瘍はＡＬＴ−８０１によって認識されるヒトｐ５３（アミノ酸２６４〜２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１複合体を欠くので、この試験は、マウス正所性表在性膀胱癌に対するＡＬＴ−８０１の「非標的化」抗腫瘍活性を評価するように設計されている。

ＭＢ４９ｌｕｃ（１００μＬ中０．０７５×１０^６細胞／膀胱）を、膀胱のポリリシン前処理後第０試験日にＣ５７ＢＬ／６マウス（９〜１１週齢）の膀胱内に注入した。ＰＢＳ（ｎ＝８）またはＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２０）を腫瘍細胞注入の１、８、１５、２０、２３および２７日後に静脈内投与した。ＡＬＴ−８０１の静脈内投与は、ＰＢＳ対照と比較した場合マウスの生存期間を有意に延長させた（Ｐ＝０．０４９７）（図１１）。

別の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（９〜１１週齢）に、膀胱のポリリシン前処理後、第０試験日にＭＢ４９ｌｕｃ細胞（０．０７５×１０^６細胞／膀胱）を膀胱内注入した。１つの群のマウス（ＡＬＴ−８０１「１×４」、ｎ＝９）は、週１回ずつ４回、ＳＤ１、ＳＤ８、ＳＤ１５、ＳＤ２２に１．６ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１注射で側尾静脈を介して静脈内処理し、２番目の群のマウス（ＡＬＴ−８０１「２×４」、ｎ＝９）は、ＳＤ１、ＳＤ４、ＳＤ８、ＳＤ１２、ＳＤ１５、ＳＤ１９、ＳＤ２２およびＳＤ２６に８回の１．６ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１注射（４週間にわたって週２回）で処置し、ならびに対照群（ｎ＝８）は、腫瘍注入後ＳＤ１、ＳＤ４、ＳＤ８、ＳＤ１２、ＳＤ１５、ＳＤ１９、ＳＤ２２およびＳＤ２６にＰＢＳ（１００μＬ）で処置した。１．６ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１での「１×４」および「２×４」治療レジメンはどちらも、ＰＢＳ対照群と比較した場合マウスの生存期間を有意に延長させた（それぞれＰ＝０．０４１３およびＰ＝０．００１０）。ＰＢＳ、ＡＬＴ−８０１「１×４」（図１２Ａ）およびＡＬＴ−８０１「２×４」（図１２Ｂ）群の平均生存期間は、それぞれ１５．５、１９および２２日であった。結果は、ＡＬＴ−８０１の週２回投与がマウスＭＢ４９ｌｕｃ正所性表在性膀胱癌に対する最良の抗腫瘍活性を提供することを示唆する。試験物質の観察された抗腫瘍作用は、ＡＬＴ−８０１融合タンパク質の抗原標的化活性とは無関係である。

ＭＢ４９ｌｕｃ正所性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスのＡＬＴ−８０１治療によって誘導される免疫細胞。

この試験は、マウスＭＢ４９ｌｕｃ正所性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてＡＬＴ−８０１治療の免疫細胞に基づく作用機構を評価するために実施した。上述したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、膀胱のポリリシン前処理後、第０試験日（ＳＤ０）にＭＢ４９ｌｕｃ細胞（０．０７５×１０^６細胞／膀胱）を膀胱内注入した。腫瘍注入を行わなかったマウスを対照として使用した。次にマウス（６匹／群）を、ＳＤ７、１０、１４および１７にＰＢＳまたはＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）で静脈内処置した。各々の処置の３日後（すなわちＳＤ１０、１３、１７、２０）に、マウスの群を犠死させ、膀胱を腫瘍進行に関して検査し（血尿、膀胱の大きさ、外観、血管新生および形態）、血液、脾臓および膀胱を免疫細胞分析のために採取した。ＰＢＭＣを血液から調製し、脾細胞懸濁液を脾臓から調製して、免疫組織化学染色のために膀胱を固定し、切片化した。ＰＭＢＣ中の免疫細胞（ＣＤ３、ＮＫおよびＣＤ８陽性細胞）ならびに脾細胞をモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリによって分析した。免疫細胞（マクロファージ、ＮＫおよびＣＤ３陽性細胞）を膀胱切片においてＩＨＣによって評価し、腫瘍細胞をＨ＆Ｅ染色によって検査した。加えて、試験全体を通じて、動物から尿を採取し、尿中サイトカインレベル（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）をＥＬＩＳＡによって評価した。

先の試験と同様に、ＭＢ４９ｌｕｃ細胞の膀胱内注入は、７〜２０日以内に膀胱における正所性腫瘍の確立およびこれらの腫瘍の筋層への速やかな進行を生じさせた（図１３）。これらの変化は、血尿の増加、膀胱の血管新生および腫瘍の大きさの増大ならびに他の外観の変化に反映された。先の試験におけるように、ＡＬＴ−８０１での処置はこれらの変化を逆転させ、ＳＤ２０までに正常な外観の膀胱をもたらした（図１３）。しかし、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスまたは正常マウスのいずれかのＡＬＴ−８０１処置が膀胱への免疫細胞浸潤の増加を生じさせたことは注目すべきである。これらの変化はＰＢＭＣおよび脾臓においても反映され、ＡＬＴ−８０１処置は、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスまたは正常マウスの両方でＣＤ３、ＣＤ８およびＮＫ細胞の増加を生じさせた（図１４Ａおよび１４Ｂ）。ＡＬＴ−８０１処置の継続と共に、誘導された免疫細胞（ＰＢＭＣ ＣＤ８細胞を除く）はＳＤ２０までに正常レベルにもどった。膀胱では、マクロファージレベルが、特に腫瘍担持動物においてＳＤ１０に、ＡＬＴ−８０１処置によって最も明白に影響を受けた（図１５）。膀胱切片における染色マクロファージのレベルを定量し、グラフにしたデータを図１６に示す。結果は、正常マウス（図１６Ａ）およびＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウス（図１６Ｂ）の両方において、ＡＬＴ−８０１処置が膀胱マクロファージレベルの有意の上昇を生じさせたことを示す。腫瘍担持マウスにおいて、誘導されたマクロファージレベルは、膀胱の形態が正常にもどると共に、ＳＤ２０までに正常レベル近くにもどった。ＮＫおよびＣＤ３陽性細胞における類似であるがより有意でない変化もＡＬＴ−８０１処置マウスで見られた。これらの結果は、膀胱におけるＡＬＴ−８０１のマクロファージおよび他の免疫細胞サブタイプの誘導がこのモデルで認められる抗膀胱腫瘍作用に関与することを示唆する。

尿中のサイトカインレベルの分析も、ＡＬＴ−８０１処置が免疫応答の刺激をもたらすことを示した。ＡＬＴ−８０１の各投与後、ＩＦＮγレベルの上昇がＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスからの尿中で検出された（図１７Ａ）。ＡＬＴ−８０１処置はこれらの動物の尿中のＴＮＦαレベルを誘導しなかった（図１７Ｂ）。しかし、ＰＢＳ処置した腫瘍担持マウスではＴＮＦαレベルが経時的に上昇し、腫瘍増殖と尿中ＴＮＦαレベルとの因果関係を示唆した。血清ＩＦＮγのＡＬＴ−８０１媒介性誘導および血清ＴＮＦαレベルへの治療効果の欠如が癌患者において認められ（Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：７７６５）、これがＡＬＴ−８０１治療に対する一般的な免疫応答であることを示した。合わせて考慮するとこれらの所見は、ＡＬＴ−８０１処置後に認められる抗腫瘍活性におけるＩＦＮγ産生免疫細胞、おそらくマクロファージの役割を裏付ける。

ＡＬＴ−８０１は多発性骨髄腫のマウスモデルにおいてマウスの生存を増大させた。

融合タンパク質、ＡＬＴ−８０１（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ２）の効果および作用機構を検討するため、多発性骨髄腫の免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて反復投与レジメンとして投与した。ヒト多発性骨髄腫の再現可能なマウスモデルを、５Ｔ３３骨髄腫細胞株の誘導体である５Ｔ３３Ｐ細胞を用いて開発した。ＡＬＴ−８０１は、ＰＢＳと比較して５Ｔ３３Ｐ骨髄腫担持マウスの生存期間を有意に延長させ、ＡＬＴ−８０１群の再誘発したマウスは、ナイーブ５Ｔ３３Ｐ注入マウスよりも有意に長く生存した。これらの作用はＡＬＴ−８０１融合タンパク質の標的化活性とは無関係であり、ＡＬＴ−８０１が、以前に暴露された腫瘍に対する持続的な免疫記憶応答をマウスに提供することを示す。

上記に示したように、様々な試験は、ＡＬＴ−８０１が、Ｔ細胞を欠く免疫無防備状態マウスでの異種移植モデルにおいてＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋／ｐ５３過剰発現（ｐ５３^＋）ヒト骨髄腫、乳腺腺癌、膀胱癌および膵癌に対して強力な活性を示すことを明らかにしている。ＣＤ８エフェクターＴ細胞はＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性に寄与し得るので、ＡＬＴ−８０１の効果をさらに評価するため、免疫応答性マウスにおける付加的な同系腫瘍モデルを開発した。これらの腫瘍は、ｐ５３ペプチド（アミノ酸２６４〜２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１複合体の発現を欠く。したがって、これらのモデルで検討したＡＬＴ−８０１の作用はｓｃＴＣＲ標的化とは無関係である。多発性骨髄腫への免疫調節分子の公知の抗癌作用に基づき、免疫応答性マウスにおけるマウス骨髄腫モデルを開発し、ＡＬＴ−８０１の効果および作用機構を評価するために使用した。

Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスで自然発生する一連の移植可能なマウス骨髄腫の１つである、マウス５Ｔ３３骨髄腫細胞は、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスにおいて高度に腫瘍形成性であり、わずか５００細胞が腫瘍移植後わずか３６日で麻痺および死亡を誘導する。５Ｔ３３由来細胞株、５Ｔ３３Ｐを、あらかじめ１×１０^７の親５Ｔ３３細胞株を注入しておいた、麻痺を生じたＣ５７ＢＬ／６マウスのＢＭから単離した。このモデルでは、約１００％の摂取率でＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて麻痺を引き起こすのに少なくとも１×１０^７の５Ｔ３３Ｐ細胞の投与が必要である。一般に、１×１０^７ ５Ｔ３３Ｐ細胞を注入されたマウスは、腫瘍接種後ＳＤ２０からＳＤ３０の間に後脚に麻痺の徴候を示す。麻痺のほかに、ＢＭ細胞による５Ｔ３３産生ＩｇＧ２ｂパラプロテインの発現も、このモデルにおいて腫瘍発生状態を評価するために使用できる。

初期試験では、５Ｔ３３Ｐ細胞増殖へのＡＬＴ−８０１の直接作用をインビトロで評価した。アポトーシス分析は、５００ｎＭのＡＬＴ−８０１が５Ｔ３３Ｐ細胞増殖に影響を及ぼさず、細胞アポトーシスを誘導しないことを示した。以前の非臨床試験に基づくと、このレベルのＡＬＴ−８０１は治療範囲内であると予想される。したがって、ＡＬＴ−８０１は５Ｔ３３Ｐ細胞に直接の細胞傷害作用を及ぼさないと思われる。

次に、ＡＬＴ−８０１のインビボ抗骨髄腫活性を、マウス５Ｔ３３Ｐ骨髄腫を担持する免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスで検討した。雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５匹のマウス／群）に、第０試験日（ＳＤ０）に側尾静脈を介して５Ｔ３３Ｐ腫瘍細胞（１×１０^７／マウス）を静脈内注射した。次に、反復投与ＡＬＴ−８０１治療を腫瘍細胞注射の１日後（ＡＬＴ−８０１−ＳＤ１処置群）または４日後（ＡＬＴ−８０１−ＳＤ４処置群）に開始した。ＡＬＴ−８０１−ＳＤ１処置群については、ＡＬＴ−８０１をＳＤ１、ＳＤ４、ＳＤ８およびＳＤ１１に（すなわち４回の投与）１．６ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。同じ試験日にＰＢＳ（同等容量投与）を摂取した５Ｔ３３Ｐ腫瘍担持マウスを対照として使用した。ＡＬＴ−８０１−ＳＤ４処置群については、ＡＬＴ−８０１をＳＤ４、ＳＤ８、ＳＤ１１およびＳＤ１５に１．６ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。マウスを麻痺または腫瘍増殖の臨床徴候および生存に関して観測した。後脚麻痺を示したマウスを瀕死とみなした。ＰＢＳ群のすべてのマウスがＳＤ２２からＳＤ３４の間に麻痺の徴候を示し、この群は、腫瘍細胞投与後２９日の平均生存期間を有していた。これに対し、ＡＬＴ−８０１−ＳＤ１およびＡＬＴ−８０１−ＳＤ４群のすべてのマウスは、ＳＤ７３（ＡＬＴ−８０１−ＳＤ１群についての観察期間の終了日）を越えて生存し、これらのマウスが５Ｔ３３Ｐ腫瘍から治癒したことを示した。したがって、ＳＤ１またはＳＤ４のいずれかに開始した反復投与ＡＬＴ−８０１治療は、ＰＢＳ対照群と比較した場合、５Ｔ３３Ｐ骨髄腫担持マウスの生存期間を有意に延長させることが認められた（ＡＬＴ−８０１−ＳＤ１対ＰＢＳ、Ｐ＜０．００２；ＡＬＴ−８０１−ＳＤ４対ＰＢＳ、Ｐ＜０．００２）。ＡＬＴ−８０１−ＳＤ４群とＡＬＴ−８０１−ＳＤ１群の間で著明な差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。これらの結果は、ＡＬＴ−８０１治療がこの免疫応答性マウスモデルにおいて５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞に対して極めて有効であることを示す。

ＡＬＴ−８０１治療が長期的な抗腫瘍作用を与えるかどうかを評価するため、５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞を、先の骨髄腫細胞での誘発後も生存したＡＬＴ−８０１処置マウスに再投与した。ＡＬＴ−８０１−ＳＤ１群（ｎ＝５）のマウスをＳＤ７３（初回腫瘍細胞誘発後）に１×１０^７ ５Ｔ３３Ｐ細胞で再誘発し、ＡＬＴ−８０１−ＳＤ４群（ｎ＝５）のマウスをＳＤ１０６に１×１０^７ ５Ｔ３３Ｐ細胞で再誘発した。各々の場合に、５匹の治療ナイーブマウスにも、腫瘍発生についての対照として１×１０^７ ５Ｔ３３Ｐ細胞を注射した。試験群のいずれに対してもさらなるＡＬＴ−８０１試験薬治療は行わなかった。腫瘍細胞での再誘発後、５匹のＡＬＴ−８０１−ＳＤ１マウスすべてがＳＤ１９２の実験終了まで生存し、一方ＳＤ７３に５Ｔ３３Ｐ細胞を摂取したナイーブマウスの５匹全部がＳＤ８９からＳＤ１０７の間に麻痺を示し、腫瘍細胞投与後の平均生存期間は１６日であった。同様に、５匹のＡＬＴ−８０１−ＳＤ４マウスすべてがＳＤ１９２まで生存し、一方ＳＤ１０６に５Ｔ３３Ｐ細胞を摂取した５匹のナイーブマウスのうち４匹がＳＤ１２４からＳＤ１３８の間に麻痺を示し、腫瘍細胞投与後の平均生存期間は３２日であった。全体として、５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞での再誘発前に１００日間にわたって与えたＡＬＴ−８０１治療は、マウスを麻痺および死亡から有意に保護した。合わせて考慮すると、これらの結果は、５Ｔ３３Ｐ骨髄腫に対するＡＬＴ−８０１の効力だけでなく、長期間持続する免疫記憶を誘導するその能力も明らかにする。上記データはまた、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞サブセットの活性化エフェクターおよび記憶細胞が、５Ｔ３３Ｐ腫瘍細胞に対するＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性に必須の役割を果たし得ること、ならびにこれらの免疫細胞が、おそらくＣ５７ＢＬ／６マウスを腫瘍再誘発から保護するのに少なくとも３か月間機能し得ることを示す。

治療レジメンの間に死亡は観察されなかった。ほとんどの場合、ＰＢＳおよびナイーブ処置群において、マウスがこのモデルにおける典型的な徴候である後脚麻痺を示す直前に、継続的に有意の体重減少が認められた。ＡＬＴ−８０１処置群では有意の体重減少は認められず、これはＡＬＴ−８０１を使用した他の同系マウスモデルにおける観察と一致する。これらの所見は、ＡＬＴ−８０１治療レジメンがこのモデルにおいて一過性の毒性で良好に耐容されることを示す。多発性骨髄腫におけるＡＬＴ−８０１治療の臨床評価は、患者のＨＬＡ−Ａ^＊０２０１遺伝的背景に関わりなく患者において考慮されるべきである。

単回投与のＡＬＴ−８０１治療は、ＰＢＳと比較して５Ｔ３３Ｐ担持マウスの生存期間を有意に延長させた。これらの作用は、インビトロパラプロテイン産生アッセイにおいて評価した、骨髄中の骨髄腫細胞を低減させる試験薬の能力と相関した。ＡＬＴ−８０１の１回または２回投与による５Ｔ３３Ｐ腫瘍担持マウスの治療は、ＰＢＳ群と比較して血液中のＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数および／または割合の有意の増加を生じさせた。免疫細胞除去試験は、ＡＬＴ−８０１の抗骨髄腫活性が主としてＣＤ８^＋ Ｔ細胞によるものであり、部分的にＮＫ細胞に起因することを明らかにした。他の免疫細胞も、ＡＬＴ−８０１媒介性抗骨髄腫作用において役割を果たし得る。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるマウス５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞の増殖へのＡＬＴ−８０１の作用および機能的機構をさらに評価した。この試験の最初の部分では、単回投与のＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性をこのモデルで評価した。雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５匹のマウス／群）に５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞を静脈内注射した。４日後、５Ｔ３３Ｐ腫瘍担持マウスにＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（同等容量投与）のいずれかを単回静脈内注射で投与した。マウスの生存を試験のエンドポイントとして観測し、後脚麻痺を示したマウスを瀕死とみなした。腫瘍細胞注入後３５日目までにＰＢＳ群の５匹のマウスすべてで死亡が認められ、平均生存期間は２４日であった。これに対し、ＡＬＴ−８０１処置マウスの死亡は有意に遅く、平均生存期間は４９日であった（ＰＢＳ群に対して、Ｐ＝０．０１３）。ＡＬＴ−８０１群の５匹のマウスのうち１匹は、１２０日の観察期間を通じて生存したままであった。

試験の２番目の部分では、骨髄中の骨髄腫細胞への単回投与ＡＬＴ−８０１の短期作用を５Ｔ３３Ｐモデルで評価した。腫瘍担持マウスをＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで処置し、骨髄細胞を処置の１、４および８日後に採取した。次に細胞をインビトロで６日間培養し、培養上清を５Ｔ３３Ｐ細胞が産生したパラプロテイン（マウスＩｇＧ２ｂ）に関してＥＬＩＳＡによって分析した。インビボでのＡＬＴ−８０１処置は、ＰＢＳ群と比較した場合、その後の骨髄培養物中のパラプロテインの有意に低いレベルを生じさせた（Ｐ＜０．０５）。パラプロテインレベルの最大３０倍までの低下がＡＬＴ−８０１処置群からの培養物で見られた。この作用は、試験薬処置後の骨髄採取の３つの時点すべてで認められた。したがって、骨髄の５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞を低減する単回投与のＡＬＴ−８０１の能力は（パラプロテイン産生によって測定した場合）、このモデルにおける生存期間延長へのＡＬＴ−８０１の作用と一致した。

免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのマウス５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞に対するＡＬＴ−８０１の抗骨髄腫作用におけるエフェクター免疫細胞の役割を検討するため、さらなる試験を設計した。他の非臨床および臨床試験における以前の結果と一致して、１．２ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１の１回または２回投与による５Ｔ３３Ｐ腫瘍担持マウスの治療は、ＰＢＳ対照群で認められたものと比較して血液中のＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数および／または割合の有意の増加を生じさせた。ＡＬＴ−８０１治療はまた、血中ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋ Ｔｒｅｇ細胞の割合も増加させた。しかし、この変化は、エフェクターＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞サブセットで見られた変化を有意に下回り、これがＡＬＴ−８０１治療の主要な作用ではないことを示した。

１．２ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１での１回または２回投与治療はまた、５Ｔ３３Ｐ由来のパラプロテインを検出する骨髄細胞培養アッセイを用いて評価した場合、処置の４日後の骨髄中の５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞の数を低減するのにも有効であった。免疫細胞除去試験は、ＡＬＴ−８０１の抗骨髄腫活性が主としてＣＤ８^＋ Ｔ細胞に起因し、部分的にＮＫ細胞によるものであることを明らかにした。ＣＤ８^＋およびＮＫ細胞除去はＣ５７ＢＬ／６マウスにおける５Ｔ３３Ｐ腫瘍細胞への抗腫瘍作用を完全に排除することはできないので、他の免疫細胞もＡＬＴ−８０１媒介性抗骨髄腫作用に役割を果たし得る。これらの試験の結果は、ＡＬＴ−８０１治療が骨髄腫担持免疫応答性マウスの生存期間を延長させるのに極めて有効であることを明らかにした以前の試験と一致した。

ＡＬＴ−８０１はＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスの生存期間を有意に延長させた。

ＡＬＴ−８０１の静脈内投与の効果を、免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの正所性ＭＢ４９ｌｕｃ筋層浸潤性膀胱癌モデルにおいてＩＬ−２の効果と比較した。前臨床動物試験は、ＡＬＴ−８０１が、ヌードマウスにおいて皮下ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋ｐ５３過剰発現（ｐ５３^＋）ＵＭＵＣ−１４およびＨＬＡ−Ａ^＊０２０１陰性ｐ５３過剰発現（ｐ５３^＋）ＫＵ７ヒト膀胱腫瘍異種移植片に対して同様の抗腫瘍活性を示すことを指示し、腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ^＊０２０１／ｐ５３ペプチド複合体の標的化はＡＬＴ−８０１の治療効力に必須ではないと思われることを示した。免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるマウスＭＢ４９ｌｕｃ正所性筋層浸潤性膀胱腫瘍に対するＡＬＴ−８０１の作用についてのさらなる検討も、ＡＬＴ−８０１の「非標的化」抗腫瘍活性を示唆した。マウスＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞が、ＡＬＴ−８０１によって認識されるヒトＨＬＡ−Ａ^＊０２０１／ｐ５３ペプチド複合体を欠くことは公知である。臨床試験は、膀胱癌がＩＬ−２に基づく療法に対して控え目な感受性を示すことを明らかにした。ＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性を理解するため、膀胱腫瘍モデルにおいてＩＬ−２とＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性を比較するのは興味深いことであった。

ＡＬＴ−８０１およびＩＬ−２静脈内処置の抗腫瘍作用を免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるマウス膀胱正所性モデルで評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０〜１１週齢）に、膀胱のポリリシン前処理後第０日目にＭＢ４９ｌｕｃ細胞（１００μＬ中３×１０^４細胞／膀胱）を膀胱内注入した。ＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）、ＩＬ２（０．４２ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）またはＰＢＳ（１００μＬ、ｎ＝８）を、腫瘍細胞注入後７、１０、１４および１７日目に静脈内投与した。ＡＬＴ−８０１の４回の静脈内投与は、ＩＬ−２およびＰＢＳ対照と比較した場合、マウスの生存期間を有意に延長させた（Ｐ≦０．０００２）（図１８）。ＩＬ−２とＰＢＳ対照群の間で統計的に有意の差は認められず（Ｐ＝０．８４）、ＩＬ−２が抗腫瘍作用を有さないことを示した。これらの結果は、週２回のＡＬＴ−８０１治療がＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍に対して組換えヒトＩＬ−２よりもはるかに大きな効力を示すことを示した。反復試験からも同様の結果を得た。

ＡＬＴ−８０１はマクロファージ、ＮＫまたはＣＤ４およびＣＤ８細胞除去後のＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスの生存率を増大させた。

上述したように、ＡＬＴ−８０１治療はＭＢ４９ｌｕｃ担持マウスの脾臓および血液中のＣＤ３^＋ Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合を増大させた。実際に、血中ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は４回のＡＬＴ−８０１治療経過を通じて有意に高いままであった。膀胱におけるＣＤ３^＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の浸潤増大も、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスでのＡＬＴ−８０１の反復投与後に認められた。これに対し、膀胱マクロファージレベルは、ＡＬＴ−８０１治療に関わりなく正所性ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍の進行と共に上昇した。これらの結果は、これらの免疫細胞サブセットの１つまたは複数がこのモデルにおけるＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性に役割を果たすことを示した。

ＡＬＴ−８０１静脈内注射の抗腫瘍作用を、マウスＭＢ４９ｌｕｃ正所性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてマクロファージ、ＮＫまたはＣＤ４およびＣＤ８細胞の除去後に評価した。マウスはＳＤ０にＭＢ４９ｌｕｃ注入を受け、次にＳＤ７、１０、１４および１７に静脈内ＰＢＳまたはＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）処置を受けた。ＡＬＴ−８０１またはＰＢＳ処置の前に、マウスの群をＳＤ６、９、１３および１６にＣｌｏｐｈｏｓｏｍｅ（１５０μＬ／投与）の腹腔内注射によるマクロファージ除去；ＳＤ２、３、６、９、１３および１６に抗ＮＫ Ａｂ（クローンＰＫ１３６、１００μＬ中２５０μｇ）の腹腔内注射によるＮＫ細胞除去；またはＳＤ２、３、６、９、１３および１６に抗ＣＤ４ Ａｂ（クローンＧＫ１．５、１００μＬ中２５０μｇ）および抗ＣＤ８ Ａｂ（クローン５３−６．７２、１００μＬ中２５０μｇ）の腹腔内注射によるＣＤ４およびＣＤ８細胞除去のいずれかに供した。効果のエンドポイントとして試験群間で生存率を評価するためにマウスを維持した。

静脈内投与したＡＬＴ−８０１は、ＰＢＳ対照マウスと比較してマウスの生存期間を有意に延長させた（Ｐ＝０．００１４）（図１９Ａ）。ＰＢＳ対照マウスと比較した場合、ＮＫ細胞を除去しておいたＡＬＴ−８０１処置マウスにおいても同様の結果を得た（Ｐ＝０．００６８）（図１９Ｂ）。ＡＬＴ−８０１処置後に認められた生存への抗腫瘍作用は、マクロファージの除去（Ｐ＝０．１４３５）（図１９Ｃ）またはＣＤ４／ＣＤ８の除去（Ｐ＝０．５９９３）（図１９Ｄ）後には消失した。

結果は、マクロファージおよび／またはＣＤ４／ＣＤ８細胞がマウスＭＢ４９ｌｕｃ正所性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＬＴ−８０１の抗腫瘍作用に重要な役割を果たすことを示す。ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスでのＮＫ細胞の除去はＡＬＴ−８０１の効果に影響を及ぼさないと思われ、ＮＫ細胞が必要ではないまたは他の細胞型がＡＬＴ−８０１媒介性抗腫瘍応答におけるＮＫ細胞活性を代償することを示唆した。

骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）が多種多様な腫瘍モデルで増殖拡大することを示す数多くの文献が存在する。ＭＤＳＣは様々な機構を介してＮＫおよびＴ細胞を抑制するように働く。特定の理論に拘束されるものではないが、正所性ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスにおけるＭＤＳＣの存在は、腫瘍発生を導く免疫抑制機構の証拠を提供し得る。

このモデルにおけるＭＤＳＣレベルを評価するため、上述したようにＣ５７ＢＬ／６マウスにＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞（０．０３×１０^６細胞／マウス）を膀胱内注入した。対照マウスは腫瘍細胞を摂取しなかった。腫瘍細胞注入の３、５、７、１０および１３日後に対照および腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５匹／群）から血液を採取した。血液中のＧＲ−１^＋／ＣＤ１１ｂ^＋ ＭＤＳＣのレベルをフローサイトメトリによって評価した。血中ＭＤＳＣレベルは、腫瘍担持マウスにおいて腫瘍細胞注入の３日後に早くも上昇し、これらの動物では時間の経過と共にさらに上昇した（図２０）。腫瘍担持マウスにおける血中ＭＤＳＣレベルは、ＭＢ４９ｌｕｃ細胞注入の１３日後に対照マウスと比較して有意に高かった。

これらの所見は、ＭＤＳＣが正所性ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍モデルにおいて免疫系を抑制し、腫瘍増殖を促進するのに役割を果たし得ることを示唆する。この試験は、ＭＢ４９ｌｕｃ正所性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて腫瘍進行に対する種々の免疫細胞型の役割およびＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性を評価するために実施した。

ＡＬＴ−８０１の静脈内投与はＭＢ４９ｌｕｃ正所性膀胱腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスの膀胱においてＭ１型マクロファージを増加させた。

先の前臨床動物試験において、ＡＬＴ−８０１の静脈内投与はＭＢ４９ｌｕｃ正所性マウス膀胱癌を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存期間を延長させた。ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスからの膀胱のＩＨＣ染色は、ＡＬＴ−８０１の反復投与後に、ＰＢＳ対照処置マウスの膀胱で見られたよりも高いレベルのＣＤ３およびＮＫ細胞浸潤を示した。Ｆ４／８０汎マクロファージマーカーによるマクロファージの検出は、処置に関わりなく腫瘍成長が進行すると共により多くのマクロファージが膀胱内に浸潤することを示した。この試験は、ＭＢ４９ｌｕｃ担持マウスの膀胱における機能的表現型のマクロファージへのＡＬＴ−８０１媒介性作用を特徴づけるために実施した。

マクロファージは、それらの存在度、可塑性および多様性のゆえに固形腫瘍において重要な役割を果たす。マクロファージの２つの異なる活性化状態が認識されている：古典的活性化（Ｍ１）表現型および選択的活性化（Ｍ２）表現型。各々の型のマクロファージは同定のためのそれ自身のマーカーを有する。Ｍ１マクロファージの特徴には、ｉＮＯＳ、ＲＯＳの発現およびＩＬ−１２の産生が含まれる。Ｍ２マクロファージはＩＬ−１０、ＩＬ−１ｂ、ＶＥＧＦおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の高い産生に関連する。

２つの処置群、ＰＢＳおよびＡＬＴ−８０１（３匹のマウス／群）がこの試験に含まれた。第０試験日（ＳＤ０）に、ＭＢ４９ｌｕｃ細胞（０．０６×１０^６細胞／マウス）をポリリシン前処理の１０分後に膀胱内注入した。ＳＤ１１に、１００μＬのＡＬＴ−８０１（１．６ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを、尾静脈を介して静脈内注射した。マウスを処置の２４時間以内に犠死させ、マウスの膀胱を、液体窒素を用いてＯＣＴ中で瞬間凍結した。膀胱におけるマクロファージの活性化状態を調べるためＩＨＣ染色を実施した。ｉＮＯＳおよびＭＭＰ−９を使用して、それぞれＭ１およびＭ２マクロファージを同定する。

ＩＨＣの結果は、ＡＬＴ−８０１の静脈内注射が、ＰＢＳ処置した腫瘍担持マウスの膀胱と比較して、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスの膀胱においてＭ１型マクロファージを増加させたことを示した（図２１）。ＭＭＰ−９陽性細胞は、ＡＬＴ−８０１群の１匹のマウスを除き、ＰＢＳおよびＡＬＴ−８０１の両群のすべてのマウスで検出可能であった。この１匹の特定のマウスは、ＡＬＴ−８０１処置後に膀胱内に腫瘍が存在しなかったと思われ、Ｆ４／８０汎マーカーは検出可能であったがｉＮＯＳまたはＭＭＰ−９のいずれでも陽性染色を示さなかった。これらの結果は、ｉＮＯＳおよびＭＭＰ−９がマクロファージ活性化マーカーであることから、腫瘍のない環境ではマクロファージが活性化されないことを示した。Ｆ４／８０抗体染色は、腫瘍を担持しないマウスと比較してＭＢ４９ｌｕｃ正所性腫瘍担持マウスの膀胱では実質的な数のマクロファージを示した。膀胱マクロファージのＦ４／８０抗体染色のレベルに関してはＰＢＳとＡＬＴ−８０１処置群の間で有意差はなかった。結論として、ＭＢ４９ｌｕｃ担持マウスの静脈内ＡＬＴ−８０１処置後の膀胱ではより高い割合のマクロファージがＭ１表現型に再分極した。ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスでのＡＬＴ−８０１効果がマクロファージに依存するという所見と合わせると、これらの結果は、再分極したＭ１マクロファージがＡＬＴ−８０１によって及ぼされる抗腫瘍作用に寄与し得ることを示唆する。

ＡＬＴ−８０１はＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてＩＦＮ−γ産生細胞を誘導した。

以前の試験は、免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける正所性ＭＢ４９ｌｕｃ筋層浸潤性膀胱癌モデルでの静脈内ＡＬＴ−８０１投与の抗腫瘍活性を明らかにした。マウスＭＢ４９ｌｕｃ細胞は、ＡＬＴ−８０１によって認識されるヒトｐ５３（アミノ酸２６４〜２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１複合体を発現しない。それゆえ、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍に対するＡＬＴ−８０１の「非標的化」抗腫瘍活性が仮定された。マウスＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍細胞に対するＡＬＴ−８０１の作用機構を評価した。

ＡＬＴ−８０１治療は、動物モデルおよび癌患者においてＩＦＮ−γの血清レベルを上昇させることが以前に示された（Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１７：７７６５−７７７５，２０１１；Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５７：１７８１−１７９４，２００８）。ＩＦＮ−γは、様々な腫瘍細胞の成長を阻害し、腫瘍細胞でのＭＨＣ分子の発現を上方調節して、様々な免疫細胞および抗血管新生を活性化することにより、抗腫瘍免疫において重要な役割を果たす。ＩＦＮ−γは、免疫細胞の複数のサブセット、例えばＣＤ４^＋ Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞および活性化後のＮＫ細胞によって産生され得る。この報告では、１．６ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１の静脈内投与の２４時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスからの血液中でＩＦＮ−γレベルを評価した。ＩＦＮ−γは、対照マウス（ｎ＝５）の血清中では検出可能でなかったが、ＡＬＴ−８０１投与後に１９６（±４４）ｐｇ／ｍＬ（ｎ＝５）の濃度に達した（図２２）。いずれの細胞型がＡＬＴ−８０１処置後の主要なＩＦＮ−γ産生細胞であるかを調べるため、マウスＣＤ４、ＣＤ８およびＮＫ細胞に対するモノクローナル抗体をＣ５７ＢＬ／６雌性マウスに腹腔内注射し、対応する免疫細胞サブセットを除去した。免疫細胞除去マウスにおける血清ＩＦＮ−γレベルをＡＬＴ−８０１注射の２４時間後に測定した。結果は、ＣＤ４、ＮＫ細胞除去マウスならびにＣＤ４、ＣＤ８およびＮＫ細胞の三重除去マウス（ｎ＝５／群）の血清中のＩＦＮ−γ濃度が、ＡＬＴ−８０１投与後にそれぞれ７５（±５８）ｐｇ／ｍＬ、７４（±２５）ｐｇ／ｍＬおよび８２（±５２）ｐｇ／ｍＬに達したことを示した（図２２）。これに対し、ＣＤ８ Ｔ細胞除去マウス（ｎ＝５）の血清ＩＦＮ−γレベルは２５７（±６０）ｐｇ／ｍＬに達した。結果は、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞はＡＬＴ−８０１誘導性ＩＦＮ−γの主要産生細胞であるが、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞はそうではないことを示した。血清ＩＦＮ−γの有意の誘導は、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞を三重除去したマウスのＡＬＴ−８０１処置後もまだ検出することができた。この所見は、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞以外の他の細胞型もＡＬＴ−８０１処置マウスにおけるＩＦＮ−γ産生に寄与したことを示した。

この試験の２番目の部分では、ＭＢ４９ｌｕｃ細胞増殖へのＩＦＮ−γの作用を検討した。ＭＢ４９ｌｕｃ細胞（２×１０^５／ウェル）を、１または１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γと共にＲＰＭＩ−１０で培養した。ＩＦＮ−γ処置したＭＢ４９ｌｕｃ細胞を回収し、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶで染色した。アネキシンＶ陽性ＭＢ４９ｌｕｃ細胞をフローサイトメトリによって測定した。ＩＦＮ−γ処置は、直接にはＭＢ４９ｌｕｃ細胞に対する検出可能な細胞傷害性をもたらさない（図２３）。

マウス脾細胞を２０ｎＭ ＡＬＴ−８０１と共にＲＰＭＩ−１０中で３日間培養し、その後細胞傷害性アッセイにおいてＰＫＨ６７標識ＭＢ４９ｌｕｃ標的細胞に対するエフェクターＬＡＫ細胞として使用した。エフェクター細胞（４×１０^６／ウェル）および標的細胞（４×１０^５／ウェル）を、０〜５０ｎＭ ＡＬＴ−８０１を含有するＲＰＭＩ−１０において３７℃で２４時間インキュベートした。ＭＢ４９ｌｕｃ細胞に対するＬＡＫ細胞の細胞傷害性をヨウ化プロピジウムでの染色に基づきフローサイトメトリによって評価した。ＡＬＴ−８０１活性化脾細胞は、細胞傷害性アッセイの間に存在するＡＬＴ−８０１の濃度に依存してＭＢ４９ｌｕｃ細胞を有効に溶解した（図２４）。

ゲムシタビンは、筋層浸潤性膀胱癌のための標準併用化学療法における薬剤の１つである。ゲムシタビンは腫瘍担持マウスにおいて骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を低減させることが報告されている。本報告では、マウスにおいてＭＢ４９ｌｕｃ細胞によって誘導されるＭＤＳＣへのゲムシタビンの作用を検討した。ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスを４０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンで静脈内処置した。ゲムシタビン処置の３日後、脾細胞を単離し、Ｇｒ１^＋ＣＤ１１ｂ^＋ ＭＤＳＣの割合をフローサイトメトリによって測定した。ＭＤＳＣは、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を有さない正常対照マウスでは脾細胞の１．１９（±０．２５）パーセントを占めた。これらのＭＤＳＣは、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスでは脾細胞の４．２９（±１．３２）パーセントに増加した。これに対し、ゲムシタビンでの腫瘍担持マウスの処置は、脾ＭＤＳＣの１．８３（±０．９２）パーセントへの低減を生じさせた（図２５）。これらの結果は、ゲムシタビンがＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスの脾臓においてＭＤＳＣのレベルを有意に低下させることを明らかにした。

ＡＬＴ−８０１は、インビトロでヒトＴ細胞およびＮＫ細胞を刺激するＩＬ−２と同じ活性を有することが以前に示された。様々な腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示すＩＬ−２活性化免疫細胞をＬＡＫ（リンホカイン活性化キラー）細胞と称する。ＬＡＫ細胞活性を、ＡＬＴ−８０１予備活性化マウス脾細胞をエフェクター細胞として、およびＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞を標的として用いて検討した。この試験の結果は、ＡＬＴ−８０１活性化脾細胞が、死滅期の間のＡＬＴ−８０１濃度に依存する形でＭＢ４９ｌｕｃ細胞を有効に溶解したことを示した。この所見は、ＡＬＴ−８０１がエフェクター免疫細胞を活性化し、膀胱腫瘍細胞に対するそれらの細胞傷害活性を増大させることができることを示す。加えて、ゲムシタビン処置はＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持マウスの脾臓におけるＭＤＳＣのレベルを有意に低下させた。

ＡＬＴ−８０１はＭＤＳＣ養子移入後に免疫細胞による腫瘍細胞死滅を誘導した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍細胞の静脈内または皮下注射後の腫瘍の確立は、血液中および脾臓においてＭＤＳＣのレベルの有意の上昇を生じさせた。ＭＤＳＣは、骨髄前駆細胞、未熟マクロファージ、未熟樹状細胞および未熟顆粒球から成る未熟骨髄系細胞の不均一な集団である。ＭＤＳＣが多様な腫瘍モデルで増殖拡大することを示す数多くの文献が存在する。ＭＤＳＣは、直接細胞接触、サイトカイン、および代謝経路の副産物を介してＮＫおよびＴ細胞を抑制し、Ｔｒｅｇの増殖と活性化を制御して、腫瘍細胞の血管新生および転移拡大を支持するように働く。マウスでは、ＭＤＳＣはＣＤ１１ｂおよびＧｒ１の細胞表面発現によって定義される。正常マウスは小さな割合（２〜４％）のＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^＋の脾細胞を有するだけであるが、一部のマウス腫瘍モデルではこの表現型を有する細胞は２０〜４０％に達し得る。これらの細胞の活性を調べるため、皮下ＭＢ４９Ｇ腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を採取し、抗Ｇｒ１および抗Ｌｙ６Ｇ Ａｂビーズを用いた磁気選別によってＭＢＳＣを単離した。この手順を通して、９６％の純度の１×１０^７ ＭＤＳＣを各動物から採取した（図２６）。

次に、精製ＭＤＳＣを同系正常マウスに移入し、正常免疫エフェクター細胞へのそれらの免疫抑制活性を評価した。養子移入の４０時間後、レシピエントマウスの脾細胞を採取し、５０ｎＭ ＡＬＴ−８０１と共に２日間培養することによって活性化した。生じたＬＡＫエフェクター細胞をＰＫＨ６７標識ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞標的と一晩共培養し、腫瘍細胞の死滅を評価した。ＡＬＴ−８０１の抗腫瘍細胞に関する以前の非臨床試験と一致して、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＡＬＴ−８０１活性化ＬＡＫ細胞がＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞を有効に死滅させることが認められたが、ＡＬＴ−８０１活性化していない新鮮脾細胞はほとんど細胞溶解活性を示さなかった（図２７）。より重要な点として、ＭＤＳＣ移入後にマウスから単離した脾細胞は、ＡＬＴ−８０１でのインビトロ刺激後、抗腫瘍細胞溶解活性を有するＬＡＫ細胞として有意に低い潜在能を示した。特定の理論に拘束されるものではないが、これらの所見は、インビボでの腫瘍誘導性ＭＤＳＣの存在はその後のＡＬＴ−８０１活性化に応答する脾エフェクター細胞の能力を低下させることを示す。したがって、この試験の結果は、膀胱腫瘍誘導性ＭＤＳＣの活性がＡＬＴ−８０１の抗腫瘍作用に有害であるという仮説を裏付ける。

様々な免疫細胞機能の強力なサプレッサーとして、ＭＤＳＣは抗癌治療のための潜在的な治療標的である。例えば、広く使用されている化学療法剤、ゲムシタビンは、腫瘍担持マウスにおいてＭＤＳＣを選択的に除去し、腫瘍抑制免疫活性を増強することができる（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１１：６７１３−６７２１，２００５）。マウス膀胱腫瘍モデルでの非臨床試験において、ゲムシタビンとＡＬＴ−８０１の併用療法は、単独療法としてのどちらの薬剤よりも有効であることが認められた。例えば、ゲムシタビン（４０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＡＬＴ−８０１（０．８ｍｇ／ｋｇ、最適以下用量）による、ゲムシタビン抵抗性皮下ＭＢ４９Ｇ腫瘍を担持するマウスの治療は、ＰＢＳ処置マウスと比較して有意に緩慢な腫瘍成長を生じさせたが、ＡＬＴ−８０１（０．８ｍｇ／ｋｇ）およびゲムシタビン（４０ｍｇ／ｋｇ）単独で治療したマウスでの腫瘍進行はＰＢＳ群と有意に異ならなかった。これらの結果は、ゲムシタビン治療が、腫瘍成長に直接作用するよりもむしろ、ＭＤＳＣの免疫抑制活性を低減させて、ＡＬＴ−８０１が抗腫瘍免疫応答をより有効に活性化することを可能にすることを示唆する。

ＡＬＴ−８０１の抗腫瘍作用機構のモデル

様々な動物モデル、免疫除去試験、免疫組織化学、サイトカインアッセイ、ノックアウトマウス、細胞媒介性死滅法、およびフローサイトメトリ分析を用いて癌に対するＡＬＴ−８０１の作用機構を明らかにすることに広範な努力が費やされてきた。特定の理論に拘束されるものではないが、これらの研究活動の結果は以下の所見と一致する：
・ＡＬＴ−８０１はＣＤ４^＋およびＮＫ細胞を活性化してＩＦＮ−γを分泌させる。
・ＩＦＮ−γはマクロファージを活性化し、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を腫瘍促進Ｍ２から腫瘍破壊Ｍ１期に再分極して、腫瘍細胞に対するＴ_Ｈ１免疫応答を誘導する。
・ＡＬＴ−８０１は単独で記憶ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を刺激して、増殖させ、自然型キラー受容体を上方調節する。
・これらの活性化ＣＤ８^＋記憶細胞は、腫瘍に対して強力であるが抗原非特異的な細胞死滅免疫応答を開始させる。
・ＩＦＮ−γ依存性経路および非特異的ＣＤ８^＋記憶細胞の両方がインビボでのＡＬＴ−８０１の抗腫瘍効果のために必須である。

ＩＦＮ−γおよび腫瘍関連マクロファージの再分極

ＡＬＴ−８０１治療は、正常および腫瘍担持マウスにおける注入後にＩＦＮ−γの分泌を誘導した。ＩＦＮ−γは、ＡＬＴ−８０１の静脈内注入の約４〜６時間後に血清および尿中の両方で高レベルであった（Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１１．１７：７７６５）。ＣＤ４^＋およびＮＫ細胞は、免疫除去試験に基づき血清ＩＦＮ−γの主要な供給源であり、免疫除去試験は、マウスにおいてＡＬＴ−８０１投与によって誘導されるＩＦＮ−γの血清レベルがＣＤ４^＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の排除によって実質的に低下することを示した（実施例１２）。ＩＦＮ−γは膀胱癌細胞増殖を阻害せず、膀胱癌細胞におけるアポトーシスも誘導しなかった。しかし、ＩＦＮ−γノックアウト（ＫＯ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、ＡＬＴ−８０１は、膀胱内移植したＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍に対するその抗膀胱癌活性を喪失した。特定の理論に拘束されるものではないが、免疫組織化学染色の結果は、これが、Ｍ２ ＴＡＭをＭ１ ＴＡＭに再分極するのにＩＦＮ−γを必要とするためであると考えられることを示唆した（実施例１１）。これらのＭ１ ＴＡＭは、腫瘍に対して迅速で強力な抗腫瘍応答を開始させる。

ＩＦＮ−γは単球およびマクロファージの最も強力な刺激因子である（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ，２００４．７５：１６３）。ＡＬＴ−８０１媒介性抗腫瘍活性における単球／マクロファージの極めて重要な役割は、リポソームを用いた単球の除去が正所性ＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍に対するＡＬＴ−８０１の効果を排除したことを示す試験の結果によって明らかにされた（実施例１０）。したがって、ＩＦＮ−γ（ＡＬＴ−８０１活性化ＣＤ４^＋およびＮＫ細胞由来）は、循環単球およびマクロファージ（肝臓におけるクッパー細胞など）を活性化して、腫瘍の細胞媒介性死滅のために腫瘍病巣に浸潤させる潜在能を有する（Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１１，２０１１：８６８３４５）。ＴＡＭの再分極ならびに単球およびマクロファージの活性化に加えて、多面発現性サイトカインであるＩＮＦ−γは、様々な抗腫瘍機能も示すことが公知である（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ，２００４，７５：１６３；Ｚａｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１１，１７：６１１８）。ＡＬＴ−８０１活性化ＣＤ４^＋およびＮＫ細胞から分泌されたＩＮＦ−γが、多数の二次応答遺伝子の活性化によって腫瘍成長に直接影響を及ぼすことも考えられる（Ｂｏｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７，１５：７４９）。

ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の除去はＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＢ４９ｌｕｃに対するＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性も排除するが、ＮＫ細胞除去はＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性を排除しないことが認められた。ＡＬＴ−８０１はまた、Ｔ細胞を欠くＳＣＩＤマウスではその抗ＭＢ４９ｌｕｃ活性を喪失した。特定の理論に拘束されるものではないが、ＡＬＴ−８０１活性化ＣＤ４^＋ Ｔ細胞は、腫瘍に浸潤し、腫瘍微小環境でＩＦＮ−γを分泌して、腫瘍破壊のためにＴＡＭを有効に再分極することができる。ＩＨＣ試験（実施例１１）のデータはこの理論と一致する。

新規機構を介した記憶ＣＤ８^＋細胞媒介性抗腫瘍活性

免疫除去試験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの正所性ＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍モデルにおいて、ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋細胞の除去はＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性を排除することができたが、ＮＫ細胞単独ではＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性を排除できなかった。したがって、ＡＬＴ−８０１活性化ＣＤ８^＋細胞はＡＬＴ−８０１の抗膀胱癌活性にとって重要である。

サイトカイン媒介性刺激は、独特の表現型を有する記憶ＣＤ８^＋細胞の抗原非特異的増殖拡大を促進し得ることが最近示された。ＰＤ−１およびＣＤ２５を上方調節する抗原依存性増殖拡大から生じる記憶ＣＤ８^＋ Ｔ細胞とは異なり、これらの試験でサイトカインを介して増殖した記憶ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、グランザイムＢを発現し、広範な溶解能力を有し、癌免疫療法の劇的な抗腫瘍作用に関与することが示唆されている（Ｔｉｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１２，１１９：３０７３）。特定の理論に拘束されるものではないが、このタイプの記憶ＣＤ８^＋ Ｔ細胞のＡＬＴ−８０１活性化は、マウスにおける抗ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍活性に重要な役割を果たす。この可能性を評価するため、最初に、単独のＡＬＴ−８０１がインビトロで記憶ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖拡大を誘導し得るかどうかを検討した。ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉｇｈ Ｔ細胞の表現型をＡＬＴ−８０１または抗ＣＤ３抗体（ＴＣＲ依存性結合）での活性化後に比較した。ＡＬＴ−８０１または抗ＣＤ３抗体へのＣＤ８^＋ Ｔ細胞の暴露は、著しく異なる表現型を有するＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉｇｈ Ｔ細胞を生じた。ＡＬＴ−８０１刺激はＮＫＧ２Ｄの上方調節を導いたが、より高いレベルのＣＤ２５およびＰＤ−１発現をもたらさず、一方抗ＣＤ３刺激はより高いレベルのＣＤ２５およびＰＤ−１発現を導いたが、ＮＫＧ２Ｄの上方調節は生じさせなかった。同様の現象がインビボでも起こるかどうかを検討するため、非腫瘍担持マウスに１．６ｍｇ／ｋｇ（１００μＬ中）のＡＬＴ−８０１またはＰＢＳ（１００μＬ）を２回（７２時間の間隔を置いて）静脈内注射し、ＰＢＭＣおよび脾細胞の表現型を２回目のＰＢＳまたはＡＬＴ−８０１処置の１日後に分析した。ＮＫＧ２Ｄを発現するＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉｇｈ記憶Ｔ細胞のレベルは、ＩＬ−２またはＰＢＳ処置マウスで見られたレベルと比較してＡＬＴ−８０１処置後に増大した。これに対し、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉｇｈ記憶Ｔ細胞集団で認められたＡＬＴ−８０１によるＰＤ−１またはＣＤ２５の上方調節は存在しなかった。

同様の結果がＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉｇｈ記憶Ｔ細胞養子移入実験でも認められた。この試験では、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ標識脾細胞（０．５×１０^６）をナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスからナイーブ同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスに養子移入し、次に、養子細胞移入の１日後にマウスをＡＬＴ−８０１またはＰＢＳで静脈内処置した。次に、レシピエントマウスの脾臓からのＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｌｇｈ Ｔ細胞の表現型を２回目のＡＬＴ−８０１またはＰＢＳ処置の１日後に分析した。ＡＬＴ−８０１はＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｌｇｈ Ｔ細胞の増殖を誘導したが、ＩＬ−２またはＰＢＳは誘導しなかった。加えて、ＡＬＴ−８０１で処置したレシピエントマウスでは、養子移入して増殖させた記憶ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉｇｈ Ｔ細胞の中でＮＫＧ２Ｄ陽性細胞集団が増加したが、ＰＢＳ処置したレシピエントマウスではこの細胞集団は増加しなかった。やはり、ＡＬＴ−８０１処置後に認められたこれらの細胞の表面でのＣＤ２５またはＰＤ−１の上方調節は存在しなかった。したがって、これらのデータは、ＡＬＴ−８０１が、見かけ上、独特の表現型を有するＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉｇｈ記憶Ｔ細胞を抗原非依存的に活性化できることを明らかにした。

ＮＫＧ２Ｄを発現するＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｌｇｈ Ｔ細胞の高い割合が、ＮＫＧ２Ｄ^＋記憶ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の既存集団の増殖拡大よりはむしろＮＫＧ２Ｄの新たな調節によるものであることをさらに明らかにするため、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスからのＮＫＧ２Ｄ⁻／ＣＤ２５⁻／ＣＤ８^＋／ＣＤ４４^ｈｉｇｈ Ｔ細胞を選別した。選別したＮＫＧ２Ｄ⁻／ＣＤ２５⁻／ＣＤ８^＋／ＣＤ４４^ｈｉｇｈ Ｔ細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔトレーサで標識し、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに養子移入した（０．４×１０^６細胞／レシピエントマウス）。移入の１日後、マウスをＰＢＳまたはＡＬＴ−８０１の２回投与で処置し、２回目の処置の１日後に脾細胞を採取して、ＮＫＧ２Ｄ表現型を分析した。ＮＫＧ２Ｄは、ＡＬＴ−８０１処置マウスからのＣｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ標識ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉｇｈ Ｔ細胞において増殖し、上方調節されたが、ＰＢＳ対照ではこれは起こらなかった。インビトロで、ＡＬＴ−８０１活性化ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉｇｈ Ｔ細胞は膀胱癌細胞に対して抗原非依存性の強力な抗腫瘍活性を示した。

特定の理論に拘束されるものではないが、結果は、ＡＬＴ−８０１が記憶ＣＤ８^＋細胞を活性化して、先天性の表面受容体を抗原非依存的に増殖させ、上方調節することのモデルと一致する。これらの活性化記憶Ｔ細胞は、膀胱癌細胞に対して、有効であるが抗原非依存的な死滅を開始させる。この先天性の抗原非依存的応答は、抗腫瘍活性がｐ５３ペプチド／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１抗原の標的化に依存しないことの理由である可能性がある。

この新規作用機構は、固形腫瘍のための、抗ＣＴＬＡおよび抗ＰＤ−１抗体などの他のＴ細胞ベースの免疫療法とは異なっており、これらの結論を裏付けるこれらの試験の有効性を増強し得る。

ＡＬＴ−８０１との最適併用療法の設計

癌を有する患者、特に進行した疾患を有する患者は、免疫無防備状態であることが公知である。これは、腫瘍細胞が抗原提示細胞およびエフェクター細胞の機能障害を活発に誘導し、調節免疫細胞の増殖拡大を促進して、そのことが抗腫瘍免疫を下方調節し、腫瘍細胞が免疫応答を免れることを可能にするためである（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０，１２５：Ｓ２７２；Ｐｏｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１１，６０：１１６１；Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ，２０１１，２１：１３１）。２つの最もよく特徴づけられた免疫抑制細胞サブセットは、ＦｏｘＰ３^＋調節細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である（Ｑｉｎ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，６：３；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，９：１６２；Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１０，５９：１５９３）。ＭＤＳＣは、骨髄前駆細胞、未熟マクロファージ、未熟樹状細胞および未熟顆粒球から成る未熟骨髄系細胞の不均一な集団である（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，９：１６２）。ＭＤＳＣが多種多様な移植可能で自発性の腫瘍モデルにおいて増殖拡大することを示す数多くの文献が存在する。血液、脾臓、骨髄および腫瘍部位におけるＭＤＳＣの蓄積は、おそらく腫瘍由来因子、例えば顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびＴＮＦ−αなどの分泌を介した骨髄から腫瘍部位への細胞の増殖拡大と動員に起因する、腫瘍進行における早期事象である可能性が高い（Ｂａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０１２，２１：８２２；Ｐｙｌａｙｅｖａ−Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０１２，２１：８３６；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１２，１２２：４０９４）。ＭＤＳＣは、直接細胞接触、サイトカイン、および代謝経路の副産物を介してＮＫおよびＴ細胞を抑制し、Ｔｒｅｇの増殖と活性化、Ｔｒｅｇの腫瘍への浸潤の促進を制御して、腫瘍細胞の血管新生および転移の広がりを支持するように働く（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，９：１６２；Ｐｅｒａｎｚｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０，２２：２３８；Ｍａｒｉｇｏ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，２００８，２２２：１６２；Ｃｈｉｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ，２０１１，３０：２７；Ｓｃｈｌｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２，１８９：５６０２）。

ＭＤＳＣは腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に密接に関連すると思われ、ＴＡＭは、通常はＭ２分極を示し、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼ、ＶＥＧＦおよび血小板由来増殖因子などのプロ血管新生因子を産生することによって腫瘍進行および免疫抑制に寄与し得る（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，７０：３２５）。マウスモデルからの最近の証拠は、ＭＤＳＣが、腫瘍の低酸素環境に達するとＴＡＭに分化することができ、その後異なる表現型および機能特徴を示し得ることを示唆する（Ｃｏｒｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０１０，２０７：２４３９）。

膀胱癌を有する患者における骨髄由来サプレッサー細胞：ＭＤＳＣの最初の同定以来、その後のいくつかの公表文献は、様々なヒト固形腫瘍を有する患者におけるＭＤＳＣの循環レベル上昇を報告した（Ｍｏｎｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１２，３５：１０７）。非筋層浸潤性および筋層浸潤性膀胱癌を有する患者において、末梢血中のＭＤＳＣの２つの異なる集団の存在が報告された（Ｅｒｕｓｌａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１３０：１１０９）：（ｉ）好中球マーカーＣＤ１１４およびＣＤ１１７の共発現を伴うＣＤ１１ｂ^＋／ＣＤ１５^ｈｉｇｈ／ＣＤ３３^ｌｏｗ；ならびに（ｉｉ）単球−マクロファージマーカーＣＤ１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６およびＣＣＲ２の共発現を伴うＣＤ１１ｂ^＋／ＣＤ１５^ｌｏｗ／ＣＤ３３^ｈｉｇｈ。患者の末梢血試料を健常志願者からの試料と比較した場合、ＣＤ１１ｂ^＋／ＣＤ１５^ｈｉｇｈ／ＣＤ３３^ｌｏｗ細胞だけが膀胱癌患者においてより高いレベルで存在することが認められ、一方ＣＤ１１ｂ^＋／ＣＤ１５^ｌｏｗ／ＣＤ３３^ｈｉｇｈ細胞は健常志願者において有意の量で存在することが認められた。どちらの集団も実質的な量のサイトカインを分泌することが認められたが、ＣＤ１１ｂ^＋／ＣＤ１５^ｈｉｇｈ／ＣＤ３３^ｌｏｗ集団だけが免疫抑制活性を有することが注目された。腫瘍標本において、２つの異なるＭＤＳＣ集団は腫瘍に浸潤することが認められた：これらの細胞の６０％〜７０％はＣＤ１１ｂ^＋／ＨＬＡ−ＤＲ^＋と表現され、残りの３０％〜４０％はＣＤ１１ｂ^＋およびＣＤ１５^＋と表された。これらの細胞の臨床上の重要性は十分には検証されなかった。別の試験では、膀胱の尿路上皮癌を有する患者において、循環免疫抑制性ＣＤ１４^＋／ＨＬＡ−ＤＲ^{−／ｌｏｗ}細胞のレベル上昇と臨床癌病期および病理学的悪性度の間で相関が認められた。したがって、膀胱の尿路上皮癌を有する患者は、進行した疾患と相関する、免疫抑制表現型を含むＭＤＳＣのレベル上昇を示す。

ＭＤＳＣを膀胱癌と関連づける前臨床試験を実施し、以下に要約する：
・Ｃ５６ＢＬ／６マウスでの正所性ＭＢ４９ｌｕｃモデルにおいて、膀胱内移植した腫瘍は、疾患が筋層浸潤段階まで進行した場合、血液中のＭＤＳＣを実質的に上昇させる（実施例１０）。
・このモデルにおいて、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞を皮下的または静脈内に移植した場合、同様の結果が認められた（実施例１２）。
・ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＭＤＳＣを選別し、非腫瘍担持（レシピエント）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに養子移入した。レシピエントマウスまたは野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞を単離し、インビトロでＡＬＴ−８０１によって活性化した。次に、ＡＬＴ−８０１活性化脾細胞の細胞傷害性をＭＢ４９ｌｕｃ細胞に対してインビトロで評価した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞は、ＭＢ４９ｌｕｃ細胞に対してＭＤＳＣレシピエントマウスから単離した脾細胞よりも有意に強い細胞傷害性を示した（実施例１３）。これらのデータは、ＡＬＴ−８０１によって誘導される生物学的活性に対するＭＢ４９ｌｕｃ誘導性ＭＤＳＣの強力な免疫抑制活性を明らかにした。

これらの試験の結果は、膀胱腫瘍細胞によって誘導されるＭＤＳＣがインビボでＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性を妨げ得るまたは阻害し得ることを示唆する。

ゲムシタビンによるＡＬＴ−８０１の抗腫瘍免疫応答の増強：ＭＤＳＣの除去は抗腫瘍応答を有意に改善し、ＡＬＴ−８０１などの癌免疫療法の作用を増強し得ることが提案されてきた。

ヒトにおける転移性膀胱癌のための第一選択化学療法の主要成分であるゲムシタビンは、治療用量で、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたはＢ細胞の数に影響を及ぼすことなく、大きな腫瘍を担持する動物の脾臓においてＭＤＳＣの数を有意に低減することが認められた（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００５，１１：６７１３）。ＭＤＳＣの減少は、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の抗腫瘍活性の増大を伴った。ゲムシタビンで前処置は、大きな中皮腫へのＩＦＮ−βの抗腫瘍作用を有意に増大させた。Ｃ２６マウス腺癌モデルでは、腫瘍担持マウスは対照マウスと比較して脾臓において有意に高いレベルのＭＤＳＣを有しており、ＳＴＡＴ１のリン酸化によって測定した場合ＩＦＮ−αおよびＩＮＦ−γに応答した脾細胞活性化の低下を示した（Ｍｕｎｄｙ−Ｂｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１１，７１：５１０１）。ゲムシタビンまたは抗ＧＲ１抗体でのＣ２６担持マウスの処置は、ＭＤＳＣの除去および脾細胞のＩＦＮ応答性の回復をもたらした。

ゲムシタビンを、膀胱癌細胞によって誘導されるＭＤＳＣの活性の低下と関連づける前臨床試験を実施し、以下に要約する：
・前臨床ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍モデルにおいて、ゲムシタビン治療は腫瘍担持マウスのＭＤＳＣのレベルを有意に低下させた（実施例１２）。これらのデータは、ゲムシタビンが、ＭＤＳＣを除去し、それによりＡＬＴ−８０１刺激性免疫エフェクター細胞が膀胱癌に対する抗腫瘍活性を媒介することを可能にする、有用な化学療法剤であり得ることを示唆する。
・Ｃ５６ＢＬ／６マウスでの正所性ＭＢ４９ｌｕｃモデルにおいて、ゲムシタビンと組み合わせた最適以下レベルのＡＬＴ−８０１は、ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍に対してシスプラチン＋ゲムシタビンと組み合わせた同じレベルのＡＬＴ−８０１と同程度に有効であったが、より低い毒性（すなわち体重減少）を示した。同様に、皮下ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ゲムシタビンと組み合わせたＡＬＴ−８０１は、ＡＬＴ−８０１単独またはゲムシタビン単独よりも有意に高い抗腫瘍活性を生じさせた。
・ゲムシタビン抵抗性ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞を作製し、Ｃ５７ＢＬ／６皮下腫瘍モデルにおいてゲムシタビンと組み合わせたＡＬＴ−８０１の最適以下用量の効果を評価するために使用した。結果は、ゲムシタビンと組み合わせた最適以下用量レベルのＡＬＴ−８０１がＡＬＴ−８０１単独またはゲムシタビン単独よりも有意に高い抗腫瘍活性を示すことを明らかにした。

合わせて考慮すると、これらの結果は、ＡＬＴ−８０１とゲムシタビンの併用は転移性膀胱癌の有効な治療を提供し得るが、シスプラチンは、特に白金抵抗性腫瘍に関して、必要ではないと考えられることを示唆する。したがって、白金ベースの治療に抵抗性である進行した膀胱癌を有する患者においてゲムシタビンと組み合わせたＡＬＴ−８０１の抗腫瘍活性を評価することは興味深い。この効果試験の結果は、シスプラチン＋ゲムシタビンに抵抗性の転移性尿路上皮癌を有する患者を治療するための現在のＡＬＴ−８０１＋ゲムシタビン＋シスプラチンレジメンからシスプラチンを取り除くべきかどうかの情報を与える。非白金ベースのレジメンは、白金ベースのレジメンと同程度に有効と証明された場合、腎不全を有し、シスプラチン含有レジメンを受けるのに不適応な患者にも大きな利益となる。進行膀胱癌の治験においてＡＬＴ−８０１＋ゲムシタビン群に最大１４名までの患者を登録する提案書が米国食品医薬品局に提出されており、２０１２年１２月にこの群のための患者登録が開始した。

ヒト臨床試験プロトコル。

試験デザイン

これは、膀胱、腎盂、尿管および尿道の筋層浸潤性または転移性尿路上皮癌を有する患者におけるシスプラチンおよびゲムシタビンを含む生物化学療法レジメンでの第Ｉｂ／ＩＩ相、オープンラベル、多施設、競合的登録および用量逐次漸増試験である。試験は、医薬品臨床試験の実施基準（ＧＣＰ）に従って実施する。

この試験は、シスプラチンおよびゲムシタビンと組み合わせたＡＬＴ−８０１の最大耐量（ＭＴＤ）を決定する用量漸増期ならびにＭＴＤでの２段階拡大期を含む。この試験における用量漸増は（３＋３）用量漸増デザインを用いて実施し、ＭＴＤでの２段階拡大期は修正サイモン２段階デザインを用いて実施する。この試験の用量漸増期では、２つの漸減用量レベルに加えてＡＬＴ−８０１の５つの用量レベル（０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇおよび０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１０ｍｇ／ｋｇおよび０．１２ｍｇ／ｋｇ）が存在する。シスプラチン（７０ｍｇ／ｍ^２／投与）および（１０００ｍｇ／ｍ^２／投与）の用量はすべてのＡＬＴ−８０１用量レベルにわたって固定する。用量漸増期の間にＭＴＤに達しなかった場合は、主催者、データ安全性モニタリング委員会および治験責任者が会合し、用量漸増期を拡大して追加のＡＬＴ−８０１用量レベルを含むようにプロトコルを修正するかどうかを話し合う。

治療

計画された初期試験治療は３コースにわたる。各コースは、シスプラチン（第１日目）、ゲムシタビン（第１日目）、ＡＬＴ−８０１（第３日目および第５日目）、ゲムシタビン（第８日目）、ＡＬＴ−８０１（第８日目および第１０日目）、ならびに休止期間（第１１〜２１日目）から成る。２番目または３番目のコースを開始する前に、被験者は継続基準に適合する必要がある。試験治療の全３コースの完了時に、登録された各々の患者は、試験薬ＡＬＴ−８０１の合計１２回の投与、シスプラチンの３回の投与、およびゲムシタビンの６回の投与を受けたことになるようスケジュールされている。３コースの初期試験治療を完了した後、少なくとも安定な疾患を有し、他の治療基準に適合する患者は、ＡＬＴ−８０１の４回にわたる付加的な週１回投与で試験治療を反復する。遅延または変更はプロトコルにおいて対処される。これを以下の図式ならびに図２８および２９に示す：

初期試験治療：

反復試験治療：

登録患者は、治療および合併症の適切な管理を提供する適正な診断および治療施設を備えた有資格癌治療機関で試験治療を受ける。ＡＬＴ−８０１、シスプラチンおよびゲムシタビンは、アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））、シスプラチンおよびゲムシタビンを含む抗癌薬の使用経験のある有資格医師の監督下で静脈内注入によって中心静脈または末梢静脈に投与する。以下は、試験の用量漸増期の間の用量レベルについての図式である。初回用量レベルでＤＬＴ事象の場合は、−１および−２用量レベルのＡＬＴ−８０１を含める。

用量漸増

試験のこの段階では、各用量レベルで少なくとも３名の患者を登録する。すべての患者を初回投与から８週間、用量制限毒性（ＤＬＴ）に関して観測する。０／３名の患者が初回投与の８週間後までに試験治療に関連する用量制限毒性を有する場合は、その次のコホートの登録を開始する。１つの用量レベルで１名の患者が薬剤関連ＤＬＴを発現した場合、最大６名までの患者をその用量レベルおよび各々のその後のより高い用量レベルで登録する。６名の患者のコホートで６名の患者のうち０または１名が試験治療関連ＤＬＴの基準に合致する事象を有する場合は、その次のコホートの登録を開始する。用量漸増コホートで３〜６名の患者のうち２名またはそれ以上が薬剤に関連するＤＬＴを有する場合は、その用量レベルを、最大耐量を超えると指定する。このレベルより低い用量レベル中に３名の患者が存在する場合は、追加患者（合計６名まで）をその用量レベルで登録する。６名の患者のうち０または１名がＤＬＴを有する１つの用量レベルが存在し、それが予定された最大用量レベル（レベル５）であるかまたは耐容されなかった用量より低い１つのレベルである場合は、最大耐量である用量が定義されたとみなす。治療計画のさらなる変更は、その時点でプロトコル修正によって検討され得る。

６名の患者のうち３名以上が初回用量レベル（レベル１）でＤＬＴを経験した場合は、主催者、データ安全性モニタリング委員会および治験責任者が会合し、シスプラチン、ゲムシタビンおよび／または試験薬の用量レベルをどのように下方調整するか、または（−１）および（−２）コホートで継続するかを決定し、ならびに試験をどのように進めるかを決定する。

用量制限毒性（ＤＬＴ）は、７２時間以内にグレード１またはそれ以下に軽快しないグレード３の何らかの毒性および試験プロトコルに記載されている例外および詳細に従って治療経過の間に発生したグレード４の何らかの毒性と定義される。ＤＬＴを経験した患者は試験治療を中止しなければならない。試験薬投与の前に経験された有害事象、疾患の進行または試験治療中止事象の発生を伴わない、試験治療から離脱するという患者の決定による試験治療中止は、必ずしもＤＬＴ事象を定義しない。試験治療中止事象はプロトコルにおいて定義される。

用量拡大

ＭＴＤでの２段階拡大期は、修正サイモン２段階デザインを用いて実施する。客観的応答（ＯＲ）（完全応答（ＣＲ）＋部分応答（ＰＲ）と定義される）および臨床上の利益（ＣＢ）（ＣＲ、ＰＲ＋安定な疾患（ＳＤ）と定義される）の両方を評価し、効果の欠如（ＯＲ率（ＯＲＲ）＝４０％；ＣＢ率（ＣＢＲ）＝７８％）および関心対象の効果レベル（ＯＲＲ＝６０％；ＣＢＲ＝９２％）の共通設定閾値を選択する。標本サイズは、各段階についてより大きな標本サイズを有していたパラメータによって決定する。

中断規則

患者の登録は以下のいずれかの発生に基づき一時的に中断され、主催者、データ安全性モニタリング委員会および治験責任者は、会合して試験における以後の患者登録をどのように進めるかを話し合う：
・試験の用量漸増期のいずれかの時点で、３名のコホートのうち２名以上の患者または６名の患者のうち３名以上が何らかのＤＬＴを経験した場合：
・試験の拡大期のいずれかの時点で、３３％を超える患者が何らかの薬剤関連ＤＬＴを経験した場合。

評価

患者を治療の間の臨床的毒性に関して評価する。患者の血液試料を採取し、試験薬の薬物動態プロフィールおよび免疫原性を評価する。抗腫瘍応答を治療の最初のコースの初回投与から最大１８週間まで評価する。試験薬ＡＬＴ−８０１の少なくとも１回の投与を受けたすべての患者を抗腫瘍応答評価に含める。各コホートの間でおよび試験の終了時に、すべての臨床および安全性データを、用量−反応作用に関して試験に登録されたすべての患者について分析する。

母集団

膀胱、腎盂、尿管および尿道の筋層浸潤性または転移性尿路上皮癌の治療のための全身性シスプラチンおよびゲムシタビンの候補である１８歳以上の患者を試験参加の適格性のさらなる評価のために選択し得る。患者はまた、適切な心、肺、肝および腎機能を有し、東部腫瘍学共同研究グループ（ＥＣＯＧ）の０または１の全身状態および少なくとも１２週間の平均余命を有する必要がある。

標本サイズ

合計３０名までの評価可能な患者を試験の初期用量漸増期（第Ｉｂ相）に収集する；推定数は２１名である。さらなる４０名までの評価可能な患者を試験の拡大期（段階１および２）（第ＩＩ相）に登録する。合計約６１名の評価可能な患者が試験に登録され、試験を完了する。２０％が不適格または評価不能の症例と仮定として、合計７２名の患者を試験に収集し得る。

一次エンドポイント

段階Ｉのみについて
（１）筋層浸潤性または転移性尿路上皮癌を有する患者の治療においてシスプラチンおよびゲムシタビンと組み合わせたＡＬＴ−８０１のＭＴＤを定義すること。
段階ＩおよびＩＩについて
（２）治療患者における併用試験治療の安全性を評価すること。
（３）治療患者における客観的応答を評価すること。

二次エンドポイント

（１）治療患者における無増悪生存期間を評価すること。
（２）治療患者における全体的生存率を評価すること。
（３）治療患者におけるＡＬＴ−８０１の免疫原性および薬物動態プロフィールを評価すること。
（４）ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１／ｐ５３アミノ酸２６４〜２７２複合体の腫瘍提示と、試験治療の安全性および臨床上の利益との関係を評価すること。

薬物動態およびバイオマーカー

血液試料を採取し、ＨＬＡ−Ａ２についての型別、免疫細胞レベル、表現型、試験薬ＡＬＴ−８０１の薬物動態、免疫原性、ならびにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの血清レベルを評価する。腫瘍試料を採取し、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１／ｐ５３アミノ酸２６４〜２７２複合体提示を試験する。ＡＬＴ−８０１の薬物動態分析のための血液試料を、試験治療の最初のコース中のＡＬＴ−８０１投与の第１日目に採取する。ＡＬＴ−８０１血清濃度の評価のために０時点（注入の開始前）、０時点から３０分後（注入完了の１５分後）、ならびに１、３および６時間後に静脈血を採取する。非コンパートメント解析およびコンパートメント解析を実施する。加えて、ＰＫ解析のために収集した同じ血液試料を使用して、試験薬ＡＬＴ−８０１の免疫原性ならびにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの血清レベルを評価する。ＨＬＡ−Ａ２型別、免疫細胞レベルおよび表現型試験のための新鮮血液試料を、試験治療の１番目および２番目のコースの開始前に採取する。

モニタリング試験

尿検査用の尿試料、標準化学、ＣＢＣ、分別および凝固のための血液試料を、スクリーニング時、各試験薬注入日、退院日およびフォローアップ来院日に得る。抗ＡＬＴ−８０１抗体およびＩＬ−２中和抗体に関するアッセイを含む、免疫原性試験のための血液試料を、最初のＡＬＴ−８０１注入日の投与前および試験治療の初回投与から９週目に採取する。

抗腫瘍応答の評価

抗腫瘍応答を試験応答の初回投与から最大１８週間まで評価する：不応答者については：９週目と１３週目；早期応答者については：９週目と１４週目；遅延応答者については：９、１３および１８週目。客観的応答は、固形癌の治療効果判定基準作成委員会（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＲＥＣＩＳＴ）１．１によって提案された新しい国際基準を用いて評価する。基線評価は、試験治療を開始する２８日目に実施しなければならない。基線時とフォローアップの間に各々同定および報告された病変を特徴づけるには同じ評価方法および同じ技術を使用しなければならない。画像に基づく評価と臨床検査による評価の両方の方法を治療の抗腫瘍効果を評価するために使用している場合は、画像に基づく評価が臨床検査による評価よりも好ましい。しかし、放射線検査に加えて、この集団では膀胱鏡評価を定期的に使用し得る。

生存率評価

すべての登録患者の無増悪生存期間および全体的生存率を試験治療の開始から６、９、１２、１８、２４、３０および３６か月目に、または試験フォローアップの終了と指定された時点まで評価する。

有害事象

すべての患者を、治療期間中、臨床的毒性に関して観測および評価し、各フォローアップ来院時に有害事象（ＡＥ）について質問する。患者はＡＥに関する情報を自発的に提供し得る。すべての有害事象を、ＮＣＩの有害事象共通用語規準バージョン４．０（ＣＴＣＡＥ ｖ４．０）を使用することによって等級付け、患者の症例報告書に記録する。試験機関は、すべてのＳＡＥおよび患者の試験治療中止を引き起こしたすべての事象を、事象の認知の１日後までに電話、ファックスまたはｅメール（または組合せ）によって主催者に報告しなければならない。主催者は、用量漸増、コホートの拡大および患者登録を管理し、調整するために情報を使用する。次に主催者は、すべての参加臨床施設に現在の用量レベルおよびそのレベルで登録すべき患者の数、または患者登録の中断を、その事象を認知した日のうちに電話、ファックスまたはｅメールによって通知しなければならない。試験機関は、試験プロトコルで規定されたガイドラインに従ってその他の有害事象を主催者に報告しなければならない。深刻でかつ不測のすべての試験薬関連有害事象（ＡＥ）は、２１ ＣＦＲ §３１２．３２に従って速やかにＦＤＡに報告する。

統計計画

各コホートについて、すべてのＡＥを一覧表にして検討し、すべての安全性および薬物動態データを評価する。応答の持続期間の推定のために、カプラン‐マイヤー法を使用する。＜０．０５のＰ値（両側）を、統計的有意性を示すとみなす。

ゲムシタビンおよびシスプラチン（ＧＣ）と組み合わせたＩＬ−２／Ｔ細胞受容体融合タンパク質についての第１／２相試験は、局所的に進行したまたは転移性尿路上皮癌を有する患者において肯定的応答を示した。

ＡＬＴ−８０１は、以前に、進行した悪性腫瘍を有する患者での第１相試験において試験されたＩＬ−２／一本鎖Ｔ細胞受容体融合タンパク質である（Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：７７６５）。様々なマウスモデルにおいて、ＡＬＴ−８０１は同系および異種移植尿路上皮癌に対して強力な活性を明らかにし、ＩＬ−２に基づく免疫療法に対するこの疾患の感受性を示唆した（上記参照）。尿路上皮癌は白金系の化学療法に感受性であるが、ゲムシタビン＋シスプラチンなどの組合せは、わずかに約１５％の完全応答率および応答の限られた持続性にしか結びつかず、再治療の効果も限定されている。

方法：ＧＣ化学療法が考慮された、局所的に進行したまたは転移性尿路上皮癌を有する患者における、３サイクル、２１日スケジュールでのゲムシタビン（１０００ｍｇ／ｍ^２／投与、第１日目と第８日目）、シスプラチン（７０ｍｇ／ｍ^２／投与、第１日目）およびＡＬＴ−８０１（漸増用量、第３、５、８、１０日目）の同時投与の初期効果結果。患者基本情報および疾患状態を図３０に示す。ＡＬＴ−８０１の予定用量は、３＋３漸増デザインで５つの用量コホートにおいて０．０４〜０．１２ｍｇ／ｋｇ／投与である。３つのコース後に少なくとも安定な疾患を有する被験者は、ＡＬＴ−８０１単独の４回にわたる付加的な週１回投与を摂取し得る。

結果：転移性尿路上皮癌を有する患者におけるＡＬＴ−８０１＋シスプラチンおよびゲムシタビンの進行中の治験は良好に集積しつつある。全体として、ＡＬＴ−８０１＋シスプラチンおよびゲムシタビンの組合せは患者によって十分に耐容された。治療レジメンは、化学療法ナイーブ患者および化学療法抵抗性疾患を有する患者の両方で有望な客観的応答率（ＯＲＲ）を有する。標的病変の変化パーセントとして測定した腫瘍評価は、７１％の患者（２１名のうち１５名）で腫瘍縮小を示した（図３１）。患者を化学療法ナイーブ患者と白金経験患者のカテゴリーに分類した場合、化学療法ナイーブ患者の８０％（１０名のうち８名）および白金経験患者の５５％（１１名のうち６名）が肯定的な客観的応答（部分または完全応答）を示した（図３２）。無増悪生存期間を見た場合、全患者および白金経験患者についての平均は５．３か月であった（図３３）。現在、無増悪生存期間は、白金経験患者における約８か月と比較して、一部の患者ではほぼ１３か月まで延長した。加えて、投与後６時間まで血清ＩＦＮ−γレベルが上昇したことからわかるように、ＡＬＴ−８０１の投与後に血漿サイトカイン応答が誘導された（図３４）。０．０４ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１の投与と比較して０．０６ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０１の投与では血清ＩＦＮ−γ応答が持続した。

現在までに、少なくとも３名のＩＶ期尿路上皮癌患者（１Ｆ、２Ｍ；５９〜６３歳；２名の患者は主として結節転移を有し、１名の患者は肝転移を有していた）が０．０４ｍｇ／ｋｇ ＡＬＴ−８０１＋ＧＣでの治療を完了した。２名は以前に根治的膀胱切除術を受けており、その後ＧＣ治療後に再発していた。観察されたグレード３／４の毒性には、好中球減少（２名）、血小板減少（２名）、白血球減少（１名）、リンパ球減少（１名）および貧血（１名）が含まれ、ＧＣおよびＡＬＴ−８０１の知られた薬力学作用と一致する。３名すべてが１３週までに放射線医学的完全応答を有していた。その後根治的膀胱切除術を受けた１名の患者は、腫瘍細胞を有さないことが病理学的に確認された。

ＡＬＴ−８０１＋ＧＣでの治療後の進行／転移性尿路上皮癌を有する治療ナイーブ被験者で認められた応答率（完全応答を含む）は、この患者集団において以前に公表された臨床試験に基づくと極めて予想外である。例えば、ｖｏｎ ｄｅｒ Ｍａａｓｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０００）１７：３０６８）は、進行したまたは転移性膀胱癌を有する患者の第ＩＩＩ相臨床試験において、独立した放射線医学的再検討により、ゲムシタビン＋シスプラチンでの治療が４９．４％（１８２名の評価患者のうち８１名）の全体的腫瘍応答率および１２．２％の完全応答率を生じさせたことを報告した。この試験はまた、メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシンおよびシスプラチンで治療した患者においても同様の全体的応答率（４５．７％、１８１名の評価患者のうち６９名）および完全応答率（１１．９％）を報告した。この患者集団における他の化学療法レジメン（すなわち単剤、２剤併用、３剤併用）のその後の試験は、類似かまたはより低い応答率を報告した（Ｙａｆｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１１）１８：ｅ２５により総説された）。

加えて、化学療法に抵抗性である転移性尿路上皮癌患者におけるＡＬＴ−８０１＋ＧＣ治療の認められた効果（すなわち完全および部分応答）も、文献に基づくと極めて予想外である。例えば、白金を含むレジメン後に進行した進行尿路上皮癌を有する３７０名の患者の第ＩＩＩ相試験では、ＣＲが報告されなかった（Ｂｅｌｌｍｕｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００９）２７：４４５４）。加えて、白金経験患者のための他の第二選択単独療法および併用療法は、控え目な効果と有意の毒性しか提供しなかった（Ｙａｆｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１１）１８：ｅ２５により総説された）。

他の実施形態

前記説明から、本明細書で述べる本発明を様々な用途および条件に適合させるために本発明に変更および修正を施し得ることは明白である。そのような実施形態も以下の特許請求の範囲内である。

本明細書での変数の定義における要素のリストの列挙は、任意の単一要素または列挙される要素の組合せ（またはサブコンビネーション）としてのこの変数の定義を包含する。本明細書での実施形態の列挙は、任意の単一実施形態または任意の他の実施形態もしくはその部分との組合せとしてのこの実施形態を包含する。本明細書で言及されるすべての特許および公表文献は、各々独立した特許および公表文献が参照により本明細書に組み込まれることを具体的におよび個別に示されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７８）に関する。
（１）有効量のＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより癌を改善することを含む、被験者において癌を改善する方法。
（２）前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、前記（１）に記載の方法。
（３）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、前記（１）に記載の方法。
（４）前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、前記（３）に記載の方法。
（５）前記１つまたは複数の治療薬が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される、前記（１）に記載の方法。
（６）前記１つまたは複数の治療薬が、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される、前記（１）に記載の方法。
（７）癌が、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される、前記（１）に記載の方法。
（８）癌が膀胱癌または尿路上皮癌である、前記（１）に記載の方法。
（９）癌が化学療法抵抗性である、前記（１）に記載の方法。
（１０）前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する、前記（１）に記載の方法。
（１１）前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する、前記（１）に記載の方法。
（１２）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、および前記１つまたは複数の治療薬がシスプラチンである、前記（１）に記載の方法。
（１３）前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、前記（１２）に記載の方法。
（１４）前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌細胞を特異的に標的とする、前記（１）に記載の方法。
（１５）前記ＩＬ−２融合タンパク質が、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする、前記（１４）に記載の方法。
（１６）被験者において腫瘍負荷を低減する方法であって、有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより腫瘍体積を低減することを含む方法。
（１７）前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、前記（１６）に記載の方法。
（１８）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、前記（１６）に記載の方法。
（１９）前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、前記（１８）に記載の方法。
（２０）前記１つまたは複数の治療薬が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される、前記（１６）に記載の方法。
（２１）前記１つまたは複数の治療薬が、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される、前記（１６）に記載の方法。
（２２）前記腫瘍負荷が、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される、前記（１６）に記載の方法。
（２３）前記腫瘍負荷が膀胱または尿路上皮癌である、前記（１６）に記載の方法。
（２４）前記腫瘍負荷が化学療法抵抗性である、前記（１６）に記載の方法。
（２５）前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する、前記（１６）に記載の方法。
（２６）前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する、前記（１６）に記載の方法。
（２７）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、ならびに前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンおよびシスプラチンである、前記（１６）に記載の方法。
（２８）前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、前記（２７）に記載の方法。
（２９）前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌細胞を特異的に標的とする、前記（１６）に記載の方法。
（３０）前記ＩＬ−２融合タンパク質が、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする、前記（２９）に記載の方法。
（３１）被験者において化学療法抵抗性癌を治療する方法であって、有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより化学療法抵抗性癌を治療することを含む方法。
（３２）前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、前記（３１）に記載の方法。
（３３）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、前記（３１）に記載の方法。
（３４）前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、前記（３３）に記載の方法。
（３５）前記１つまたは複数の治療薬が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される、前記（３１）に記載の方法。
（３６）前記１つまたは複数の治療薬が、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される、前記（３１）に記載の方法。
（３７）癌が、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される、前記（３１）に記載の方法。
（３８）癌が膀胱癌または尿路上皮癌である、前記（３１）に記載の方法。
（３９）癌が化学療法抵抗性である、前記（３１）に記載の方法。
（４０）前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する、前記（３１）に記載の方法。
（４１）前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する、前記（３１）に記載の方法。
（４２）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、および前記１つまたは複数の治療薬がシスプラチンである、前記（３１）に記載の方法。
（４３）前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、前記（４２）に記載の方法。
（４４）前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌細胞を特異的に標的とする、前記（３１）に記載の方法。
（４５）前記ＩＬ−２融合タンパク質が、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする、前記（４４）に記載の方法。
（４６）被験者において癌に対する持続的な免疫記憶応答を誘導する方法であって、有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより癌に対する持続的な免疫記憶応答を誘導することを含む方法。
（４７）前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、前記（４６）に記載の方法。
（４８）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、前記（４６）に記載の方法。
（４９）前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、前記（４８）に記載の方法。
（５０）前記１つまたは複数の治療薬が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される、前記（４６）に記載の方法。
（５１）前記１つまたは複数の治療薬が、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される、前記（４６）に記載の方法。
（５２）癌が、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される、前記（４６）に記載の方法。
（５３）癌が膀胱癌または尿路上皮癌である、前記（４６）に記載の方法。
（５４）癌が化学療法抵抗性である、前記（４６）に記載の方法。
（５５）前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する、前記（４６）に記載の方法。
（５６）前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する、前記（４６）に記載の方法。
（５７）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、および前記１つまたは複数の治療薬がシスプラチンである、前記（４６）に記載の方法。
（５８）前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、前記（５７）に記載の方法。
（５９）前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌細胞を特異的に標的とする、前記（４６）に記載の方法。
（６０）前記ＩＬ−２融合タンパク質が、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする、前記（５９）に記載の方法。
（６１）癌を有する被験者の生存率を高める方法であって、有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより被験者の生存率を高めることを含む方法。
（６２）前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、前記（６１）に記載の方法。
（６３）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、前記（６１）に記載の方法。
（６４）前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、前記（６３）に記載の方法。
（６５）前記１つまたは複数の治療薬が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される、前記（６１）に記載の方法。
（６６）前記１つまたは複数の治療薬が、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される、前記（６１）に記載の方法。
（６７）癌が、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される、前記（６１）に記載の方法。
（６８）癌が膀胱癌または尿路上皮癌である、前記（６１）に記載の方法。
（６９）癌が化学療法抵抗性である、前記（６１）に記載の方法。
（７０）前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する、前記（６１）に記載の方法。
（７１）前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する、前記（６１）に記載の方法。
（７２）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、および前記１つまたは複数の治療薬がシスプラチンである、前記（６１）に記載の方法。
（７３）前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、前記（７２）に記載の方法。
（７４）前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌細胞を特異的に標的とする、前記（６１）に記載の方法。
（７５）前記ＩＬ−２融合タンパク質が、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする、前記（７４）に記載の方法。
（７６）ＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を含む、膀胱癌の治療のためのキット。
（７７）前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、および前記１つまたは複数の治療薬がシスプラチンである、前記（７６）に記載のキット。
（７８）前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、前記（７７）に記載のキット。
本発明によって定義される組成物および製品は、単離されているかまたはさもなければ以下で提供される実施例に関連して製造された。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。

Claims (78)

1. 有効量のＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより癌を改善すること
   を含む、被験者において癌を改善する方法。
2. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、請求項３に記載の方法。
5. 前記１つまたは複数の治療薬が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記１つまたは複数の治療薬が、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
7. 癌が、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
8. 癌が膀胱癌または尿路上皮癌である、請求項１に記載の方法。
9. 癌が化学療法抵抗性である、請求項１に記載の方法。
10. 前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する、請求項１に記載の方法。
11. 前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する、請求項１に記載の方法。
12. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、および前記１つまたは複数の治療薬がシスプラチンである、請求項１に記載の方法。
13. 前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌細胞を特異的に標的とする、請求項１に記載の方法。
15. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする、請求項１４に記載の方法。
16. 被験者において腫瘍負荷を低減する方法であって、
    有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより腫瘍体積を低減すること
    を含む方法。
17. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、請求項１６に記載の方法。
19. 前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記１つまたは複数の治療薬が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
21. 前記１つまたは複数の治療薬が、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
22. 前記腫瘍負荷が、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
23. 前記腫瘍負荷が膀胱または尿路上皮癌である、請求項１６に記載の方法。
24. 前記腫瘍負荷が化学療法抵抗性である、請求項１６に記載の方法。
25. 前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する、請求項１６に記載の方法。
26. 前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する、請求項１６に記載の方法。
27. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、ならびに前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンおよびシスプラチンである、請求項１６に記載の方法。
28. 前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌細胞を特異的に標的とする、請求項１６に記載の方法。
30. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする、請求項２９に記載の方法。
31. 被験者において化学療法抵抗性癌を治療する方法であって、
    有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより化学療法抵抗性癌を治療すること
    を含む方法。
32. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、請求項３１に記載の方法。
33. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、請求項３１に記載の方法。
34. 前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記１つまたは複数の治療薬が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される、請求項３１に記載の方法。
36. 前記１つまたは複数の治療薬が、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される、請求項３１に記載の方法。
37. 癌が、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される、請求項３１に記載の方法。
38. 癌が膀胱癌または尿路上皮癌である、請求項３１に記載の方法。
39. 癌が化学療法抵抗性である、請求項３１に記載の方法。
40. 前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する、請求項３１に記載の方法。
41. 前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する、請求項３１に記載の方法。
42. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、および前記１つまたは複数の治療薬がシスプラチンである、請求項３１に記載の方法。
43. 前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、請求項４２に記載の方法。
44. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌細胞を特異的に標的とする、請求項３１に記載の方法。
45. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする、請求項４４に記載の方法。
46. 被験者において癌に対する持続的な免疫記憶応答を誘導する方法であって、
    有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより癌に対する持続的な免疫記憶応答を誘導すること
    を含む方法。
47. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、請求項４６に記載の方法。
48. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、請求項４６に記載の方法。
49. 前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、請求項４８に記載の方法。
50. 前記１つまたは複数の治療薬が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される、請求項４６に記載の方法。
51. 前記１つまたは複数の治療薬が、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される、請求項４６に記載の方法。
52. 癌が、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される、請求項４６に記載の方法。
53. 癌が膀胱癌または尿路上皮癌である、請求項４６に記載の方法。
54. 癌が化学療法抵抗性である、請求項４６に記載の方法。
55. 前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する、請求項４６に記載の方法。
56. 前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する、請求項４６に記載の方法。
57. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、および前記１つまたは複数の治療薬がシスプラチンである、請求項４６に記載の方法。
58. 前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、請求項５７に記載の方法。
59. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌細胞を特異的に標的とする、請求項４６に記載の方法。
60. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする、請求項５９に記載の方法。
61. 癌を有する被験者の生存率を高める方法であって、
    有効量のＩＬ−２融合タンパク質および治療薬を、それを必要とする被験者に投与し、これにより被験者の生存率を高めること
    を含む方法。
62. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌を特異的に標的としないまたは癌に結合しない、請求項６１に記載の方法。
63. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインを含む、請求項６１に記載の方法。
64. 前記Ｔ細胞受容体ドメインが一本鎖Ｔ細胞受容体である、請求項６３に記載の方法。
65. 前記１つまたは複数の治療薬が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、アザシチジン、ＡＺＤ８４７７、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドビチニブ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エポチロンＢ、エルロチニブ、エリブリン、エトポシド、エベロリムス、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、インターフェロンα、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラルゴタキセル、ラパチニブ、レナリドミド、リアロゾール、ロナファルニブ、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プララトレキサート、プレドニムスチン、ピリトレキシム、プロカルバジン、ピラゾロアクリジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ロミデプシン、ソラフィニブ、ストラムスチンリン酸塩、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、テモゾロミド、トポテカン、トランスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニンおよびボリノスタットから成る群より選択される、請求項６１に記載の方法。
66. 前記１つまたは複数の治療薬が、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含む白金系化合物から成る群より選択される、請求項６１に記載の方法。
67. 癌が、膀胱癌、尿道、尿管および腎盂の尿路上皮癌、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫、骨肉腫、脂肪肉腫、軟組織肉腫、卵巣癌、黒色腫、肝癌、食道癌、膵癌および胃癌から成る群より選択される、請求項６１に記載の方法。
68. 癌が膀胱癌または尿路上皮癌である、請求項６１に記載の方法。
69. 癌が化学療法抵抗性である、請求項６１に記載の方法。
70. 前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約７〜１４日以内に投与する、請求項６１に記載の方法。
71. 前記ＩＬ−２融合タンパク質と前記１つまたは複数の治療薬を約３〜５日以内に投与するかまたは同時に投与する、請求項６１に記載の方法。
72. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、および前記１つまたは複数の治療薬がシスプラチンである、請求項６１に記載の方法。
73. 前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、請求項７２に記載の方法。
74. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が癌細胞を特異的に標的とする、請求項６１に記載の方法。
75. 前記ＩＬ−２融合タンパク質が、癌細胞の表面のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ複合体を特異的に標的とする、請求項７４に記載の方法。
76. ＩＬ−２融合タンパク質および１つまたは複数の治療薬を含む、膀胱癌の治療のためのキット。
77. 前記ＩＬ−２融合タンパク質がＡＬＴ−８０１であり、および前記１つまたは複数の治療薬がシスプラチンである、請求項７６に記載のキット。
78. 前記１つまたは複数の治療薬がゲムシタビンである、請求項７７に記載のキット。

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