CN106999557A - 包含色氨酸2,3‑双加氧酶或其片段的疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及癌症的预防和治疗。尤其，提供了能够激发抗癌免疫应答的蛋白质色氨酸2,3‑双加氧酶(TDO)或其肽片段。具体而言，本发明涉及使用TDO或其衍生的肽或TDO特异性T细胞用于治疗癌症。本发明因此涉及任选地可以与其他免疫疗法组合使用的抗癌疫苗并且涉及过继转移或通过作为癌症疗法的接种在体内诱导的TDO特异性T细胞。本发明的一个方面是本文中提供的药物可以与癌症化疗治疗组合使用。又一个方面涉及通过如上文所述的相同手段预防和治疗感染。

Description

包含色氨酸2,3-双加氧酶或其片段的疫苗组合物

发明领域

本发明涉及癌症预防和治疗领域。尤其，提供能够激发抗癌免疫应答的蛋白质色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)或其肽片段。具体而言，本发明涉及TDO或其衍生的肽或TDO特异性T细胞用于治疗癌症的用途。本发明因此涉及任选地可以与其他免疫疗法组合使用的抗癌疫苗并且涉及过继转移或通过作为癌症疗法接种在体内诱导的TDO特异性T细胞。本发明的一个方面是本文中提供的药物可以与癌症化疗治疗组合使用。又一个方面涉及通过如上文所述的相同手段预防和治疗感染。

还提供TDO和其免疫原性肽片段在癌症和感染治疗、诊断和预后中的用途。

发明背景

免疫系统严密受控以避免应答于各种病原体时出现自身免疫性。这种允许同时摧毁感染细胞或转化细胞及自我耐受性的功能稳态(enantiostasis)，受到几种反馈机制保障。不幸地，预防自身免疫性的一些机制被癌劫持以实现免疫逃逸。这种免疫摧毁规避作用基于几种机制，包括耗尽必需养分以及蓄积免疫抑制性代谢物。因此，肿瘤微环境内部的代谢变化有助于规避抗原特异性免疫应答。在这个方面，已经在各种癌症中描述了必需氨基酸L-色氨酸代谢的畸变。值得注意地，控制色氨酸水平是宿主对入侵性病原体防御的重要组成部分，因为微生物需要高浓度的可用色氨酸用于最佳生长。

L-(和D-)色氨酸至N-甲酰基犬尿氨酸的降解受血红素双加氧酶色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)催化。TDO和IDO不具有序列同源性。虽然借助不同机制，但TDO和IDO均催化色氨酸氧化的第一且限速步骤，产生犬尿氨酸。另外，由于IDO受炎性细胞因子如I型和II干扰素上调，它被认为是控制不相称免疫应答的重要反向调节酶。

明确确立了色氨酸代谢对免疫应答的影响。T细胞通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶GCN2感知低水平色氨酸，所述蛋白激酶随后触发增殖停滞。另外，色氨酸降解产物犬尿氨酸结合芳基烃受体(AHR)；AHR信号传导的激活诱导了调节性T细胞形成。

关于TDO在癌症中的功能知之甚少。在生理条件下，TDO是几乎专有地在肝脏中以高量表达并且在脑中以较低水平表达。最近，描述了不同来源的肿瘤表达TDO，尤其黑素瘤、膀胱癌、肝细胞癌和胶质母细胞瘤(Pilotte等人,2012)。在一系列各种组织学类型的104个人肿瘤细胞系中，20种肿瘤仅表达TDO，17种仅表达IDO并且16种表达两种酶(Pilotte等人,2012)。另外，在临床前模型中，肿瘤表达TDO阻止免疫接种的小鼠排斥它们(Pilotte等人,2012)。

发明简述

TDO的表达和TDO引起的潜在癌症免疫抑制给癌症治疗带来问题。

癌症免疫抑制问题由提供TDO作为新T细胞靶的本发明解决。作为抑制TDO功能的替代，本发明提供了能够活化识别表达TDO的细胞的TDO特异性T细胞的肽和组合物。

因此，本发明提供用于通过直接靶向表达TDO的癌细胞和通过杀死表达TDO的癌细胞治疗癌疾病的物质和方法。这通过使T细胞能够识别表达TDO的细胞而实现。有趣地，本发明公开了，即便表达TDO的细胞可以拮抗其他免疫治疗方案的所需作用，仍可以产生针对表达TDO的细胞的细胞毒免疫应答。

同样，本发明提供了用于治疗正常情况下可以激发免疫应答(例如感染)的其他疾病的物质和方法。在本发明的方法中，使T细胞能够杀伤表达TDO的APC/DC。

因此，本发明利用了癌细胞中免疫抑制性酶TDO的表达并且靶向表达TDO的这些细胞。

有趣地，本发明表明，特异性识别TDO的T细胞可见于健康个体中(参见下文实施例1)。这提示对自身蛋白TDO的耐受性丧失。本发明利用这种对TDO的耐受性丧失，并且因此本发明的一个方面是提供可以令人惊讶地针对自身蛋白TDO产生免疫应答的疫苗组合物。

本发明提供疫苗组合物，其包含

a)以下一者或多者：

(i)SEQ ID NO:1的色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)；

(ii)TDO的免疫原活性肽片段，包含SEQ ID NO:1的TDO的连续氨基酸序列；

(iii)TDO的免疫原活性肽片段，其是MHC I类限制型肽片段或MHC II类限制型肽片段；

(iv)根据(i)、(ii)或(iii)的多肽的功能同源物，其中所述功能同源物与SEQ IDNO:1共有至少70％序列同一性和/或所述功能同源物是由与SEQ ID NO:1的连续氨基酸序列相同的序列组成的免疫原活性多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸；

(v)多肽，包含根据(i)、(ii)、(iii)或(iv)的任何多肽；

(vi)编码根据1)、2)、3)和4)的任一多肽的核酸；和

b)佐剂

这些疫苗组合物可以用作药物，并且可以例如用于治疗其中表达TDO的癌疾病或用于在APC中引起TDO表达的感染。

本发明也提供包含疫苗组合物和第二活性成分的组分套装。

本发明也提供用于患有临床病症的个体中离体或原位诊断PBL中或肿瘤组织中与TDO反应的T细胞存在的组合物，所述组合物包含TDO肽片段，例如在下文“TDO的免疫原活性肽片段”、“TDO或其片段的多肽”和“MHC”部分中描述的任何TDO的肽片段。

本发明也提供用于患有临床病症的个体中离体或原位诊断PBL中或肿瘤组织中与TDO反应的T细胞存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包含TDO的肽片段，例如在下文“TDO的免疫原活性肽片段”、“包含TDO或其片段的多肽”和“MHC”部分中描述的任何TDO肽片段。

本发明还描述了TDO的肽片段和HLA I类或HLA II类分子或这种分子之片段的复合物。所述肽片段可以例如是在下文“TDO的免疫原活性肽片段”、“包含TDO或其片段的多肽”和“MHC”部分中描述的任何TDO的肽片段。

本发明进一步公开了在患有临床病症的个体中检测TDO反应性T细胞存在方法，所述方法包括使肿瘤组织或血液样品与包含上述TDO的肽片段的复合物接触并且检测复合物与组织或血细胞的结合。

本发明还公开了能够与TDO的肽片段(例如在下文“TDO的免疫原活性肽片段”、“包含TDO或其片段的多肽”和“MHC”部分中描述的任何TDO的肽片段)特异性结合的分子。

本发明也提供了治疗以表达TDO为特征的临床病症的方法，所述方法包括向患有所述临床病症的个体施用有效量的本发明疫苗组合物、本发明组分套装、本发明组合物和/或TDO的免疫原活性肽片段，例如如在下文“TDO的免疫原活性肽片段”、“包含TDO或其片段的多肽”和“MHC”部分中描述的任何TDO的肽片段。

本发明也提供本发明疫苗组合物在制造用于治疗或预防临床病症(例如癌症和/或炎症)的药物中的用途。

本发明也提供监测免疫接种的方法，所述方法包括步骤

c)提供来自个体的血液样品

d)提供SEQ ID NO:1的TDO，或者与其具有至少70％同一性的功能同源物，或者包含所述TDO或其所述功能同源物的连续序列的免疫原活性肽片段，或者编码所述TDO或所述肽片段的核酸

e)确定所述血液样品是否包含与该蛋白质或肽特异性结合的抗体或包含与该蛋白质或肽特异性结合的T细胞受体的T细胞

f)因而确定在所述个体中是否已经生成针对所述蛋白质或肽的免疫应答。

另外，本发明提供了免疫原活性TDO肽片段，所述TDO肽片段包含SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的连续序列，所述功能同源物是具有相同序列的多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，或编码所述TDO肽片段的核酸，用于治疗或预防与表达TDO相关的临床病症如癌症和/或感染。

附图简述

图1显示针对TDO的天然T细胞反应。(A)为了检测TDO特异性CD8⁺T细胞反应，合成15个预测的HLA-A2限制型T细胞表位以检查来自六位HLA-A2⁺癌症患者的外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC样品在体外用肽和IL-2刺激一次，1周之后在IFNγELISPOT测定法中在具有或没有相关TDO肽的情况下按5x10⁵个细胞/孔一式三份铺种。每5x 10⁵个PBMC，计算释放IFNγ的TDO特异性细胞的平均数目。在14位癌症患者和14位健康供体中检查针对TDO_123-132(KLLVQQFSIL)的IFNγELISPOT反应。将T细胞用肽刺激一次，之后在IFNγELISPOT测定法中随同TDO_123-132(B)、TDO_200-208(D)、TDO_309-317(F)、TDO_364-372(H)或阴性对照肽(HIV_pol476-484(ILKEPVHGV))一起按3x10⁵个细胞/孔一式三份铺种。点图代表扣减背景的三个阳性复孔的平均点计数。来自不同癌症患者或健康供体的PBMC中对TDO_123-132(C)、TDO_200-208(E)、TDO_309-317(G)、TDO_364-372(I)和HIV_pol476-484的ELISPOT实验的例子。

图2显示TDO特异性CD8⁺T细胞的扩充。TDO特异性T细胞的四聚体分析；使用四聚体HLA-A2/TDO_123-132-PE、HLA-A2/TDO_123-132-APC，通过流式细胞术染色可视化的乳腺癌患者(BC1)PBMC中TDO_123-132特异性(A)或TDO_309-317特异性(B)CD8⁺T细胞的例子。直接离体(左侧)、在肽刺激后体外(中部)和在依据FACS分选及扩充四聚体阳性细胞后(右侧)进行染色。

图3显示TDO-特异性T细胞的溶胞能力。(A)通过⁵¹Cr-释放测定法检测的，TDO_123-132特异性T细胞培养物对用相关TDO_123-132肽(点)或无关TDO肽TDO_309-317(方块)脉冲标记的T2-细胞的裂解。X-轴表示效应子:靶比率。(B)通过⁵¹Cr-释放所分析的，TDO_123-132特异性T细胞在不同的效应子对靶比率时对HLA-A2⁺黑色素瘤细胞系FM-55M1和FM-86、乳腺癌细胞系MDA-MB231和AML细胞系UK-1的溶解。此外，将黑色素瘤细胞系A2058(HLA-A2阴性)作为阴性对照检查。(C)通过⁵¹Cr-释放测定法检测的，TDO_309-317特异性T细胞培养物对相关TDO_309-317肽(方块)或无关TDO肽TDO_123-132(点)脉冲标记的T2-细胞的裂解。(D)通过⁵¹Cr-释放所分析的，TDO_309-317特异性T细胞在不同的效应子对靶比率时对HLA-A2⁺黑色素瘤细胞系FM-55M1和FM-86、乳腺癌细胞系MDA-MB231和AML细胞系UK-1的裂解。此外，将黑色素瘤细胞系A2058(HLA-A2阴性)作为阴性对照检查。

图4显示A对TDO mRNA转染或模拟转染的自体树状细胞以及仅添加肽TDO_123-132或TDO_309-317的对照孔的ELISPOT反应。B TDO_123-132特异性IL2扩充的T细胞培养物对分别载有TDO_123-132、TDO_309-317或相应长肽TDO_118-137和TDO_303-322的T2细胞的细胞毒性。短肽紧邻测定法之前添加并且较长肽前一晚添加。X-轴表示效应子:靶比率。

图5显示健康个体和癌症患者中针对TDO的天然CD4⁺T细胞反应。通过IFNγ(A、B),TNFα(C、D)、IL-17(E、F)或IL-10(G、H)ELISPOT，测量针对TDO_118-137(A、C、E、G)或TDO_303-322(B、D、F、H)的T细胞反应。对于每位患者，每5x10⁵个PBMC计算来自三次重复实验的TDO特异性细胞的平均数目(扣减背景后)。分析来自19位健康个体(HD)、21位癌症患者(Pt)(20位MM患者和1位BC患者)的PBMC。仅揭示依据Mann-Whitney检验的p-值(p<0.05)。

图6显示所检查的黑素瘤患者的临床病程。(A)针对具有释放IL-17的TDO_303-322-特异性T细胞的黑素瘤患者(点线)和无TDO_303-322特异性IL-17T细胞的黑素瘤患者(实线)，定义为血液采样日期至死亡日期的OS的Kaplan Meier评估。(B)针对具有释放IL-10的TDO_303-322-特异性T细胞的黑素瘤患者(点线)和无TDO_303-322特异性IL-10T细胞的黑素瘤患者(实线)，定义为血液采样日期至死亡日期的OS的Kaplan Meier评估。(C)针对具有释放IL-17的TDO_303-322-特异性T细胞、没有释放IL-10的细胞的黑素瘤患者(点线)和具有TDO_303-322特异性IL-10T细胞、没有释放IL-17的细胞的黑素瘤患者(实线)，定义为血液采样日期至死亡日期的OS的Kaplan Meier评估。

图7显示由ELISPOT所示的统计显著性TDO反应的例子。非参数分布不拘再抽样(DFR)方法允许统计比较抗原刺激孔和阴性对照。标度代表在具有对照肽((HIVpol_468-476)(白色)或TDO衍生肽(黑色)的孔内(A)TDO_123-132、(B)TDO_200-208、(C)TDO_309-317、(D)TDO_364-372(黑色)的平均点计数。误差线代表标准偏差。细胞数目是3*10⁵个细胞/孔。

图8显示可直接离体检测对TDO-衍生肽的反应。来自不同癌症患者的PBMC中响应于TDO_123-132(黑色)、TDO_200-208(深灰色)和TDO_309-317(浅灰色)的离体IFNγELISPOT。全部实验均一式三份进行。细胞数目是9*10⁵个细胞/孔。

发明详述

本发明的一个主要目的是以提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)或其免疫活性多肽片段、包含前者的多肽或编码前者的核酸，作为药物用于任何增生性病症(如癌症)的预防、降低风险或治疗。

定义

佐剂：任何物质，其与施用的免疫原性决定簇/抗原/核酸构建体的混合物增加或否则调节了针对所述决定簇的免疫应答。

抗原：可以与克隆分布的免疫受体(T细胞受体或B细胞受体)结合的任何物质。通常，肽、多肽或多聚多肽。抗原优选地能够激发免疫应答。

APC：抗原呈递细胞。APC是将与MHC复合的外来抗原呈递至表面上的细胞。T-细胞可以使用它们的T-细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC分成两类：专业型(其存在三个类型：树状细胞、巨噬细胞和B细胞)或非专业型(不以组成型方式表达与原初T细胞相互作用所要求的主要组织相容性复合物蛋白；这些蛋白质仅在通过某些细胞因子如IFN-γ刺激非专业型APC时才表达)。

加强：通过加强接种或给药强化是指在起始剂量后的施加时间，施用额外剂量的免疫接种剂如疫苗，以维持由先前剂量的相同药剂激发的免疫应答。

载体：与抗原连接以辅助诱导免疫应答的实体或化合物。

嵌合蛋白：由核苷酸序列编码的基因修饰蛋白，通过将两个或更多个完整或部分基因或一系列(非)随机核酸剪接在一起产生所述核苷酸序列。

临床病症：需要就医的病症，本文中尤其与TDO表达相关的病症。这类病症的例子包括：增殖性病症如癌症和感染。

补体：一系列其作用是“补足”抗体职能的复杂血液蛋白。补体摧毁细菌、产生炎症并调节免疫应答。

CTL：细胞毒T淋巴细胞。表达CD8连同T细胞受体并因此能够响应于由I类分子呈递的抗原的T细胞亚组。

递送载具：可以借以将核苷酸序列或多肽或二者从至少一种介质运输至另一种介质的实体。

DC：树状细胞。(DC)是免疫细胞并且组成哺乳动物免疫系统的一部分。它们的主要功能是加工抗原物质并在表面上将它呈递给免疫系统的其他细胞，因此作为抗原呈递细胞(APC)发挥作用。

片段：用来指核酸或多肽的非全长部分。因而，片段本身分别是核酸或多肽。

功能同源物：功能同源物可以是与野生形式多肽显示至少某种序列同一性并且尚保留原始功能性的至少一个方面的任何多肽。这里，TDO的功能同源物可以是这样的多肽，所述多肽与TDO具有至少某种序列同一性并且有能力诱导针对表达TDO的细胞的免疫应答。TDO的免疫原活性肽片段的功能同源物可以是这样的多肽，所述多肽与TDO的肽片段具有至少某种序列同一性并且有能力诱导针对表达TDO的细胞的免疫应答。

免疫原活性肽：能够在施用于至少一位个体后在所述个体中激发免疫应答的肽。

个体：通常，任何鸟类、哺乳动物、鱼类、两栖类或爬行类的物种或亚种，优选地是哺乳动物，最优选地是人类。

感染：本文中，术语“感染”指涉及致病因子侵入宿主生物的任何种类的临床病症。特别地，感染是指涉及病原体侵入个体的临床病症。

分离：与本文中公开的核酸、多肽和抗体联系使用时，‘分离’指这些实体已经被鉴定并分离和/或从其天然环境(一般是细胞环境)的组分回收。本发明的核酸、多肽和抗体优选地是分离的，并且本发明的疫苗和其他组合物优选地包含分离的核酸、多肽或分离的抗体。

MHC：主要组织相容性复合物，存在两个主要亚类MHC I类和II类。

核酸：传输遗传信息的核苷酸链或序列。就本发明而言，核酸通常是脱氧核糖核酸(DNA)。

核酸构建体：基因修饰的核酸。一般包含几种元件，如基因或其片段、cDNA、启动子、增强子、终止子、聚腺苷酸尾、接头、多接头、可操作性接头、多克隆位点(MCS)、标记、终止密码子、其他调节元件、内部核糖体进入位点(IRES)或其他。

可操作接头：使核酸构建体或(嵌合)多肽的两个部分以确保核酸或多肽生物学加工的方式结合在一起的一串核苷酸或氨基酸残基。

病原体：疾病的特定致病因子，尤其是可以对其宿主造成疾病的生物因子如病毒、细菌、朊病毒或寄生虫，也称作传染因子。

PBL：外周血细胞是血液的细胞组分，由红细胞、白细胞和血小板组成，其存在血液循环汇集物内部并且在淋巴系统、脾、肝或骨髓内部未隔绝。

PBMC：外周血单核细胞细胞(PBMC)是具有圆形胞核的血细胞，如淋巴细胞或单核细胞。这些血细胞是抗击感染并适应于入侵者的免疫系统关键组分。淋巴细胞群体由T细胞(CD4和CD8阳性约75％)、B细胞和NK细胞(合并约25％)组成。

多肽：确定某个序列并由酰胺键连接的多个共价连接的氨基酸残基。本术语类似地用于寡肽和肽。如本领域已知，术语多肽还包括通过化学反应或酶催化反应引入的翻译后修饰。本术语可以指多肽的变体或片段。

药用载体：还称作赋形剂或稳定剂，对以使用剂量和浓度对其暴露的细胞或个体无毒。药用载体经常是pH缓冲的水溶液。药用载体的例子包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；络合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。

多个：至少两个。

增生性病症：本文中，任何良性或恶性的前赘生性疾病或赘生性疾病，其中“赘生性”指细胞异常增殖。增殖性病症的非限制性例子是癌症。

启动子：DNA链中与RNA聚合酶结合以启动附近一个或多个结构基因的信使RNA转录的结合位点。

信号肽：决定蛋白质在细胞中最终位置的氨基酸短序列，也称作分选肽。

表面活性剂：表面活性剂，能够降低其中溶解它的液体的表面张力。表面活性剂是含有亲水极性基团和疏水非极性基团并且经常由脂肪链组成的化合物。

TDO：色氨酸2,3-双加氧酶。野生型人TDO在本文中标识为SEQ ID NO:1。

TDO_xxx-yyy：如本文所用，这种命名法指由SEQ ID NO:1的氨基酸xxx-yyy组成的TDO的多肽片段。

Treg：调节性T细胞/T淋巴细胞

治疗：本文所用的术语“治疗”可以指治愈性治疗和/或至缓解性治疗和/或至减少疾病症状的治疗和/或延迟病情进展的治疗。

疫苗：能够在个体中且尤其在哺乳动物中、优选地在人类中诱导免疫应答的物质或组合物。在本文中也称作免疫原性组合物。针对某因子的免疫应答是在生物中诱导记忆的体液、抗体和/或细胞应答，从而导致所述物质遭遇继发应答而非初次反应，因此减少其对宿主生物的影响。所述因子可以是病原体。在本发明的上下文中，因子优选地是癌细胞。本发明的疫苗可以作为预防措施给予，以降低遭遇临床病症的风险，和/或作为治疗药物给予以治疗临床病症。组合物可以包含以下一者或多者：抗原、编码一种或多种抗原的核酸构建体、载体，佐剂和药用载体。

变体：给定参考核酸或多肽的‘变体’指与所述参考核酸或多肽显示某种程度的序列同源性/同一性但是与所述参考核酸或多肽不相同的核酸或多肽。

疫苗组合物

本发明的一个方面是提供一种疫苗组合物，其包含以下一者或多者：

1)色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)，其可以在下文“色氨酸2,3-双加氧酶”部分中描述的任何TDO；

2)包含TDO的连续氨基酸序列的TDO的免疫原活性肽片段，其可以是在下文部分“TDO的免疫原活性肽片段”中描述的任何肽。

3)TDO的免疫原活性肽片段，其是MHC I类限制型肽片段或MHC II类限制型肽片段，如“MHC”部分中描述的任何MHC I类限制型肽片段或MHC II类限制型肽片段；

4)1)、2)和3)的多肽的功能同源物；

5)包含1)、2)、3)和4)的任何多肽的多肽，所述多肽可以是在下文“包含TDO或其片段的多肽”部分中描述的任何多肽；

6)编码1)、2)、3)和4)的任何多肽的核酸。

除上文提到的1至4)之外，所述疫苗组合物优选地还包含佐剂，所述佐剂例如可以是在下文“佐剂”部分中描述的任何佐剂。

TDO的肽片段可以包含于例如在下文“TDO的免疫原活性肽片段”和“包含TDO或其片段的多肽”部分中描述的本发明疫苗中。

功能同源物，其可以用于本发明疫苗组合物中，描述在下文“色氨酸2,3-双加氧酶”、“TDO的免疫原活性肽片段”和“功能同源物”和“包含TDO或其片段的多肽”部分中。

色氨酸2,3-双加氧酶

色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)是涉及L-色氨酸降解成N-甲酰基犬尿氨酸的酶。色氨酸的分解代谢造成色氨酸耗尽，这阻抑T细胞反应并在哺乳动物妊娠、肿瘤抗性、慢性感染、自身免疫性和变应性炎症中促进免疫耐受性。

特别地，TDO可以是能够催化以下反应的酶：

L-色氨酸+O₂＝N-甲酰-L-犬尿氨酸

本发明的TDO可以是任何可用的TDO。通常，优选TDO是意在用本发明疫苗组合物治疗的相同物种的TDO。在本发明的优选实施方案中，疫苗组合物旨在施用至人类，并且因此，TDO可以是人TDO。野生型人TDO的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:1提出。

因此，TDO可以优选地是SEQ ID NO:1的TDO或与SEQ ID NO:1的TDO共有至少70％序列同一性的其功能同源物，并且因此，功能同源物优选地与SEQ ID NO:1的人TDO的序列具有至少75％序列同一性，例如至少80％序列同一性，如至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，如至少91％序列同一性，例如至少91％序列同一性，如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，例如99％序列同一性。

TDO的功能同源物和用于确定序列同一性的方法在下文“功能同源物”部分中更详细地描述。

由于TDO可以潜在地具有不想要的活性，因此在本发明的一个实施方案中，疫苗组合物包含突变型TDO，所述突变型TDO不能够催化上文提到的反应，或仅以最多为SEQ IDNO:1的TDO的10％的活性催化上文提到的反应。这类突变型TDO尤其可以是其中氨基酸144、151、328和/或342中一者或多者已经突变成另一种氨基酸或缺失的SEQ ID NO:1的TDO。在本发明的上下文中，TDO的“功能同源物”可以是突变型TDO，所述突变型TDO没有野生型TDO的催化活性，但是有能力诱导针对表达TDO的细胞的免疫应答。

TDO的免疫原活性肽片段

野生型人TDO，即，天然存在的非突变形式的蛋白质，经鉴定为SEQ ID NO:1。本发明涵盖了包含有以下物质的疫苗组合物：TDO、TDO的免疫活性肽片段、TDO的肽片段，其中已经置换最多两个氨基酸；和/或与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的TDO功能同源物。术语“多肽片段”在本文中用来定义任何非全长(与SEQ ID NO:1相比)的一串氨基酸残基，所述氨基酸残基直接衍生自SEQ ID NO:1或经合成与SEQ ID NO:1相同。

功能同源物可以定义为全长TDO或其片段，所述全长TDO或其片段在序列方面不同于野生型TDO，如野生型人TDO，但是仍能够诱导针对表达TDO的细胞如癌细胞和DC的免疫应答。这些细胞中表达的TDO可以是野生型或内源突变(如先天性突变体或在细胞分裂期间或其他情况下诱导的突变)。功能同源物可以是野生型TDO的突变形式或可选的剪接变体。在另一个方面，TDO的功能同源物如下文描述那样定义。功能同源物可以是，但不限于，具有离体引入的一个或多个突变和/或一个或多个序列缺失和/或添加的重组形式的全长TDO或片段化TDO。

因此，在一个具体实施方案中，本发明的免疫原活性肽片段由如SEQ ID NO:1中确定的TDO或其功能同源物的最多400个氨基酸残基，如最多300个氨基酸残基，例如最多200个氨基酸残基，如最多100个氨基酸残基，例如最多50个氨基酸残基，例如最多45个氨基酸残基，如最多40个氨基酸残基，例如最多35个氨基酸残基，如最多30个氨基酸残基，例如最多25个氨基酸残基，如18至25个连续氨基酸组成；功能同源物是具有相同序列的多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸。所述免疫原活性肽片段还可以由如SEQ ID NO:1中确定的TDO的最多400个氨基酸残基，如最多300个氨基酸残基，例如最多200个氨基酸残基，如最多100个氨基酸残基，例如最多50个氨基酸残基，例如最多45个氨基酸残基，如最多40个氨基酸残基，例如最多35个氨基酸残基，如最多30个氨基酸残基，例如最多25个氨基酸残基，如18至25个连续氨基酸组成，其中氨基酸144、151、328和/或342中一者或多者已经突变成另一种氨基酸或缺失。

在本发明的一个优选实施方案中，免疫原活性肽片段由如SEQ ID NO:1中确定的TDO或其功能同源物的18至25个氨基酸、优选地20个连续氨基酸组成；功能同源物是具有相同序列的多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸。

因此，在另一个具体实施方案中，本发明的免疫原活性肽片段由来自SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的最多25个氨基酸残基，如最多24个氨基酸残基，如最多23个氨基酸残基，如最多22个氨基酸残基，如最多21个氨基酸残基，如最多20个氨基酸残基，例如最多19个氨基酸残基，如最多18个氨基酸残基，例如最多17个氨基酸残基，如最多16个氨基酸残基，例如最多15个氨基酸残基，如最多14个氨基酸残基，例如最多13个氨基酸残基，如最多12个氨基酸残基，例如最多11个氨基酸残基，如8至10个连续氨基酸组成；所述功能同源物是具有相同序列的多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸。

在本发明的一个优选实施方案中，免疫原活性肽肽包含来自TDO的最多10个连续氨基酸残基，如来自如SEQ ID NO:1中确定的TDO或其功能同源物的最多9个连续氨基酸残基，如8个连续氨基酸残基，如7个连续氨基酸残基；功能同源物是具有相同序列的多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸。特别地，免疫原活性肽可以由来自SEQ ID NO:1的TDO的10个连续氨基酸残基组成或免疫原活性肽可以由来自SEQ ID NO:1的TDO的9个连续氨基酸残基组成。

在本发明的一些实施方案中，免疫原活性肽可以选自表1中列出的肽或其功能同源物；功能同源物是具有相同序列的多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸。

表1可用的TDO肽

在本发明的一个优选实施方案中，免疫原活性肽选自：

a)SEQ ID NO:3(TDO200-208)；

b)SEQ ID NO:6(TDO123-132)；

c)SEQ ID NO:9(TDO309-317)；

d)SEQ ID NO:13(TDO364-372)；

e)SEQ ID NO:17(TDO118-137)；

f)SEQ ID NO:18(TDO303-322)；和

g)根据a)至f)任一项的多肽的功能同源物；功能同源物是具有相同序列的多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸。

本发明的其他肽包含SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的4至120个连续氨基酸、优选地8至100个连续氨基酸、更优选地10至75个连续氨基酸、然而更优选地12至60个连续氨基酸、甚至更优选地15至40个连续氨基酸，如18至25个连续氨基酸(或更优选地由其组成)，所述功能同源物与SEQ ID NO:1具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、甚至更优选地至少95％、然而更优选地至少98％(例如至少99％)序列同一性。

功能同源物

TDO的功能同源物或其免疫原活性片段，是也具有免疫原活性并且与TDO以及尤其与SEQ ID NO:1的TDO共有至少某种程度的序列同一性的多肽。

对于较短的多肽，如对于短于100个氨基酸，如短于50个氨基酸，例如短于25个氨基酸的多肽，则功能同源物可以是具有相同序列的免疫原活性多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸。

备选地，功能同源物可以是与SEQ ID NO:1的TDO共有至少70％序列同一性的免疫原活性多肽，并且因此，功能同源物优选地与SEQ ID NO:1的人TDO具有至少75％序列同一性，例如至少80％序列同一性，如至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，如至少91％序列同一性，例如至少91％序列同一性，如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，例如99％序列同一性。

可以使用许多熟知算法并采用许多不同空位罚分计算序列同一性。序列同一性相对于全长参考序列例如相对于全长SEQ ID NO:1计算。任何序列比对工具，如但不限于FAS、BLAST或LALIGN，都可以用于检索同源物并且计算序列同一性。另外，当适宜时，任何公知的替代矩阵，如但不限于PAM、BLOSSUM或PSSM矩阵，都可以随检索算法一起应用。例如，PSSM(位置特异性评分矩阵)可以借助PSI-BLAST程序应用。另外，可以使用空位开口和延伸的一系列罚分进行序列比对。例如，可以在空位开口罚分为5-12范围内并且空位延伸罚分为1-2范围内的情况下使用BLAST算法。

功能同源物还可以包含正常情况下在人蛋白质中不出现的化学修饰，如遍在蛋白化，标记(例如，用放射性核素、各种酶等标记)、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)、或插入(或通过化学合成而置换)氨基酸(氨基酸)如鸟氨酸，然而优选功能等同物不含化学修饰。

与SEQ ID NO:1的TDO相比对氨基酸残基序列所做出的任何变化优选地是保守性置换。本领域技术人员将知晓怎样做出并评估‘保守性’氨基酸置换，借助所述保守性氨基酸置换，将一个氨基酸置换为共有一种或多种化学和/或物理特征的另一个氨基酸。保守性氨基酸置换较影响蛋白质功能性的可能性很小。氨基酸可以根据共有特征分组。保守性氨基酸置换是将预定氨基酸组内部的一种氨基酸替换为同一组内的另一种氨基酸，其中预定组内部的氨基酸显示出相似或基本上相似的特征。

因此，在本发明的一个实施方案中，疫苗组合物包含一种多肽，所述多肽由SEQ IDNO:1的TDO的8至50个氨基酸范围内、优选地8至10个或20至25个氨基酸范围内的连续序列组成，其中已经置换最多三个氨基酸，并且其中所述置换优选地是保守的。

包含TDO或其片段的多肽

本发明范围内还涵盖本发明疫苗组合物可以包含含有TDO或其片段的多肽。因此，TDO的免疫原活性肽片段可以例如是包含本文在此部分中描述的TDO片段的任何多肽。

特别地，这类多肽可以包含全长TDO，如在上文“色氨酸2,3-双加氧酶”部分中描述的任何TDO。例如，多肽可以包含SEQ ID NO:1的TDO或与之共有至少70％、如至少80％、例如至少90％、如至少95％序列同一性的其功能同源物。特别地，这类多肽除SEQ ID NO:1的TDO之外可以包含最多100个、如最多50个，例如最多25个、如最多10个氨基酸。

本发明范围内还涵盖疫苗组合物可以包含这样的多肽，所述多肽包含TDO的片段，如上文在“TDO的免疫原活性肽片段”部分中描述的任何片段。所述多肽还可以包含任何TDO的免疫原活性肽片段，所述肽片段是MHC I类限制型肽片段或MHC II类限制型肽片段，如“MHC”部分中描述的任何MHC I类限制型肽片段或MHC II类限制型肽片段。

因此，所述多肽可以是包含SEQ ID NO:1的连续氨基酸序列的最多400个氨基酸，如最多300个氨基酸，例如最多200个氨基酸，如最多100个氨基酸，例如最多50个氨基酸的多肽，其中所述SEQ ID NO:1的连续氨基酸序列由来自SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的最多50个氨基酸残基，例如最多45个氨基酸残基，如最多40个氨基酸残基，例如最多35个氨基酸残基，如最多30个氨基酸残基，例如最多25个氨基酸残基，如18至25个连续氨基酸，如8至10个连续氨基酸组成。

特别地，所述多肽可以是包含SEQ ID NO:1的连续氨基酸序列的最多100个氨基酸，如最多80个氨基酸，例如最多60个氨基酸，如最多40个氨基酸，例如最多30个氨基酸的多肽，其中所述SEQ ID NO:1的连续氨基酸序列由来自SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的18至25个连续氨基酸，如20个连续氨基酸组成。因此，所述多肽可以是包含选自以下的免疫原活性肽的最多100个氨基酸，如最多80个氨基酸，例如最多60个氨基酸，如最多40个氨基酸，例如最多30个氨基酸的多肽：

a)SEQ ID NO:3(TDO200-208)；

b)SEQ ID NO:6(TDO123-132)；

c)SEQ ID NO:9(TDO309-317)；

d)SEQ ID NO:13(TDO364-372)；

e)SEQ ID NO:17(TDO118-137)；

f)SEQ ID NO:18(TDO303-322)；和

g)根据a)至f)任一项的多肽的功能同源物；功能同源物是具有相同序列的多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸。

在一个实施方案中，TDO的免疫原活性肽片段可以是这样的多肽，所述多肽包含来自SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的最多400个氨基酸，如最多300个连续氨基酸，例如最多200个连续氨基酸，如最多100个连续氨基酸，例如最多50个连续氨基酸，例如最多45个连续氨基酸残基，如最多40个连续氨基酸残基，例如最多35个连续氨基酸残基，如最多30个连续氨基酸残基，例如最多25个连续氨基酸残基，如18至25个连续氨基酸范围内，如8至10个连续氨基酸范围内的连续序列或由其组成，其中已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸，并且其中所述TDO的肽片段包含至少一个选自以下的序列：

a)SEQ ID NO:3(TDO200-208)；

b)SEQ ID NO:6(TDO123-132)；

c)SEQ ID NO:9(TDO309-317)；

d)SEQ ID NO:13(TDO364-372)；

e)SEQ ID NO:17(TDO118-137)；

f)SEQ ID NO:18(TDO303-322)；和

g)根据a)至f)任一项的多肽的功能同源物；功能同源物是具有相同序列的多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸。

所述多肽也可以是包含SEQ ID NO:1的连续氨基酸序列的最多100个氨基酸，如最多50个氨基酸，例如最多30个氨基酸，如最多20个氨基酸，例如最多15个氨基酸的多肽，其中所述SEQ ID NO:1的连续氨基酸序列由来自SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的8至10个，如9或10个连续氨基酸组成。因此，所述多肽可以是包含选自以下的免疫原活性肽的最多100个氨基酸，如最多50个氨基酸，例如最多30个氨基酸，如最多20个氨基酸，例如最多15个氨基酸的多肽：

a)SEQ ID NO:3(TDO200-208)；

b)SEQ ID NO:6(TDO123-132)；

c)SEQ ID NO:9(TDO309-317)；

d)SEQ ID NO:13(TDO364-372)；和

e)根据a)至d)任一项的多肽的功能同源物；功能同源物是具有相同序列的多肽，不同之处是已经置换最多三个氨基酸，如已经置换最多两个氨基酸，如已经置换最多一个氨基酸。

MHC

本发明范围内包含，TDO的免疫原活性肽片段可以是MHC I类限制型肽片段或MHCII类限制型肽片段，如这个部分中描述的任何MHC I类限制型肽片段或MHC II类限制型肽片段。

存在两个类型的MHC分子：MHC I类分子和MHC II类分子。MHC I类分子由作为适应性免疫应答的主要效应细胞的CD8T细胞识别。MHC II类分子主要在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达，其中最重要的所述抗原呈递细胞似乎是树状细胞。APC刺激原初T细胞，以及免疫系统中的其他细胞。它们刺激CD8T细胞和CD4T细胞。

在一个实施方案中，本发明提供免疫原活性TDO肽(任选地包含于较大的肽中和/或疫苗组合物中)，其中所述免疫原活性TDO肽是由来自SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的8-10个连续氨基酸组成的MHC I类限制型肽片段，其中已经置换SEQ ID NO:1的最多两个氨基酸，所述肽片段以具有几种特征至少之一为特征，所述几种特征之一是与HLA I类分子结合的能力，其中所述HLA I类分子在通过能够最大半数回收HLA I类分子的肽量(C₅₀值)所测定的亲和力方面限制，通过如本文所述的装配结合测定法测定的所述肽量最多是50μM。这种装配测定法基于加载肽至肽转运蛋白缺陷型细胞系T2后HLA分子的稳定作用。随后，使用构象依赖性抗体免疫沉淀正确折叠的稳定HLA重链并且将肽结合作用定量。这个实施方案的肽包含SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物(其中已经置换SEQ ID NO:1的最多两个氨基酸)的最多200个、优选地最多100个、更优选地最多50个、然而更优选地最多25个、甚至更优选地最多20个、然而甚至更优选地最多15个，如最多10个连续氨基酸，例如8至10个连续氨基酸。

这种测定法提供了就其以上述亲和力与给定HLA等位基因分子结合的能力筛选候选人类肽的简单手段。在优选的实施方案中，本发明的肽片段是这样一种肽片段，其具有最多30μM的C₅₀值，如最多20μM的C50值，包括最多10μM、最多5μM和最多2μM的C₅₀值。

在另一个优选实施方案中，本发明提供SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的新的MHC II类限制型肽片段，其中已经置换SEQ ID NO:1的最多两个氨基酸(在本文中也称作“肽”)，所述肽片段以具有下文描述的几种特征中至少一者为特征。这个实施方案的肽包含SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物(其中已经置换SEQ ID NO:1的最多两个、优选地最多一个氨基酸)的4和120个之间、优选地8和100个之间、更优选地10和75个之间、然而更优选地12和60个之间、甚至更优选地15和40个之间，如18和25个之间的连续氨基酸(或更优选地由其组成)。

因而存在提供的SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的8-10个氨基酸的新MHC I类限制型肽片段或18-25个氨基酸的新MHC II类限制型肽片段，其中已经置换SEQ ID NO:1的最多两个氨基酸，所述肽片段以具有下文描述的几种特征中至少一者为特征，所述几种特征之一是与对其受限制的HLA I类或II类分子结合的能力。

在具体的实施方案中，提供肽片段，其为具有至少一个以下特征的MHC I类限制型肽或MHC II类限制型肽：

(i)通过ELISPOT测定法所测定，能够在至少一位癌症患者的PBL群体中以至少1/10⁴个PBL的频率激发产生INF-γ的细胞，和/或

(ii)能够在肿瘤组织中原位检测到与表位肽反应的CTL。

(iii)能够在体外诱导TDO特异性T细胞生长。

本发明更优选的肽是能够升高特异性T细胞反应的肽，如通过ELISPOT测定法(例如下文实施例1中描述的ELISPOT测定法)所测定。一些肽虽然不以高亲和力结合MHC I类或II类，但仍可能产生T细胞反应。能够以高亲和力结合MHC I类或II类的其他肽也产生T细胞反应，如通过ELISPOT所测定。两种肽均是本发明的优选肽。

因此，本发明的优选肽是能够升高特异性T细胞反应的肽，如通过ELISPOT测定法所测量，其中每10⁸个细胞、更优选地每10⁷个细胞、甚至更优选地每10⁶个细胞、然而更优选地每10⁵个细胞(如每10⁴个细胞)测量到多于50个肽特异性点。

本发明的最优选肽是能够在患有以表达TDO为特征的临床病症的个体中激发细胞免疫应答的肽，所述临床病症优选地是癌症或感染并且最优选地是癌症。

本发明的优选肽能够激发针对表达TDO的细胞的特异性细胞免疫应答。因此，肽优选地可以激活识别表达TDO的TDO特异性T细胞。

如上文描述，HLA系统代表人主要组织相容性(MHC)系统。通常，MHC系统控制一些特征：移植抗原、胸腺依赖性免疫应答、某些补体因子和某些疾病的倾向。更具体地，MHC编码三种不同类型的分子，即I类、II类和III类分子，这些分子决定更一般的MHC特征。这些分子中，类I分子是呈递在大部分有核细胞和血小板表面上的所谓HLA-A、HLA-B和HLA-C分子。

本发明的肽特征是与特定MHC I类HLA分子结合的能力(受其限制)。因此，在一个实施方案中，该肽是受MHC I类HLA-A分子限制的一种肽，所述MHC I类HLA-A分子包括HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-A10、HLA-A11、HLA-Aw19、HLA-A23(9)、HLA-A24(9)、HLA-A25(10)、HLA-A26(10)、HLA-A28、HLA-A29(w19)、HLA-A30(w19)、HLA-A31(w19)、HLA-A32(w19)、HLA-Aw33(w19)、HLA-Aw34(10)、HLA-Aw36、HLA-Aw43、HLA-Aw66(10)、HLA-Aw68(28)、HLA-A69(28)。在本文献各处还是用更简单的名称，其中仅是用主要编号名称，例如HLA-A19或HLA-A24分别替代HLA-Aw19和HLA-A24(49)。在特定的实施方案中，本发明的肽受选自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24的MHC I类HLA种类限制。在特定的实施方案中，本发明的肽受MHC I类HLA种类HLA-A2或HLA-A3限制。

在其他的可用实施方案中，本发明的肽受包括以下任一种的MHC I类HLA-B分子限制：HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-Bw22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-Bw41、HLA-Bw42、HLA-B44、HLA-B45、HLA-Bw46和HLA-Bw47。在本发明的特定实施方案中，本发明肽能够与之结合的MHC I类HLA-B种类选自HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27和HLA-B51。

在其他的可用实施方案中，本发明的肽受包括但不限于以下任一种的MHC I类HLA-C分子限制：HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7和HLA-Cw1。

在其他的可用实施方案中，本发明的肽受包括但不限于以下任一种的MHC II类HLA分子限制：HLA-DPA-1、HLA-DPB-1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB和这些组中的全部等位基因及HLA-DM、HLA-DO。

可以通过比对与给出的特定HLA分子结合的已知序列以便因而揭示肽中特定位置处一些相关氨基酸的优势，选择可能具有与特定HLA分子结合的能力的肽。这种优势氨基酸残基在本文中也称作“锚定残基”或“锚定残基基序”。通过遵循这种基于可能存在于可访问数据库中的已知序列数据的相对简单的程序，可以从TDO衍生可能与特定HLA分子结合的肽。下表中给出这类针对一系列HLA分子分析的代表性例子：

表2

*在一个实施方案中，不存在针对这个位置的特定锚定残基，然而在优选的实施方案中锚定残基是R或A。

因而，作为例子，可能具有与HLA-A3结合的能力的九肽将具有以下序列之一：Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K、Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Y、Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-F或Xaa-V-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K(Xaa表示任何氨基酸残基)。以相似方式，可以设计出可能具有与任何其他HLA分子结合的能力的序列。将可以理解，本领域普通技术人员将能够针对给定HLA分子鉴定其他“锚定残基基序”。

本发明的肽可以具有这样的序列，所述序列是衍生该序列的TDO的天然序列。然而，对任何给定HLA分子具有更高亲和力的肽可以通过置换、缺失或添加至少一个氨基酸残基来修饰该序列，例如基于上述程序，从而从这种天然序列衍生获得，因而相对于给出的HLA分子而言鉴定锚定残基基序。

因而，在可用的实施方案中的，本发明的多肽包括这样的肽，其中对于表中列出的每个特定HLA等位基因，所述肽的序列包含如表中所示的任一个氨基酸残基。

因而，本发明的肽可以是包含来自TDO的连续序列的前文提到的任一肽，其中已经将1至10个、优选地1至5个、更优选地1至3个、甚至更优选地1至2个，然而更优选地1个氨基酸交换为另一种氨基酸，优选地交换方式使得该肽包含上表1中所示的给定HLA-A特异性肽的一个或多个、优选全部锚定残基。

优选HLA种类的例子(对其而言本发明的优选肽受限制)包括选自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24的MHC I类HLA种类，更优选地，该肽受HLA-A3或HLA-A2限制。或者，优选的HLA种类包括选自HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27和HLA-B51的MHC I类HLA-B种类。

鉴定本发明多肽的一个方案包括以下步骤：选择特定HLA分子，例如一种在给定群体中以高比率出现的分子，实施如上文所述的比对分析以鉴定TDO蛋白中的“锚定残基基序”，分离或构建大小合适的肽，所述肽包含一个或多个已鉴定的锚定残基，并且检验所产生的肽在癌症患者的PBL群体中以至少1/10⁴个PBL的频率激发产生INF-γ的细胞的能力，如通过如实施例1中所述的ELISPOT测定法所测定。

在本发明的一个方面，提供长于8至10个氨基酸残基的TDO衍生肽。长于8至10个氨基酸残基的多肽由蛋白酶体加工成较短长度以便与HLA分子结合。因而，当施用长度超过8至10个氨基酸残基的多肽时，TDO的“长”多肽/蛋白质/蛋白质片段/变体可以在体内由蛋白酶体在细胞溶胶中加工成一系列较小的肽。使用可以由蛋白酶体加工成成多种不同较短肽的较长多肽的优点在于，可以用一种肽靶向多个HLA类型，所述肽并非是8至10氨基酸的限于特定HLA类型的肽。

令人惊讶地，本发明的一些肽以足够高以使得置换不必要的亲和力与MHC分子结合且在它们呈递在此时即可用作抗原。优选地，本发明的疫苗组合物包含以下一种或多种：TDO蛋白质(SEQ ID NO:1)，来自其中的多肽片段，全长和部分长度的TDO的类似变体、功能同源物，TDO的连续肽和这些的功能同源物。更优选地，疫苗组合物包含表1中列出的任何序列。非常优选地，疫苗组合物包含肽SEQ ID NO:3(TDO_200-208)；SEQ ID NO:6(TDO_123-132)；SEQID NO:9(TDO_309-317)；SEQ ID NO:13(TDO_364-372)；SEQ ID NO:17(TDO_118-137)；和/或SEQ IDNO:18(TDO_303-322)。

本发明肽的显著特征是其以下能力：识别或激发产生INF-γ的响应T细胞，即特异性识别PBL群体中在患有癌症和/或感染的个体的APC或肿瘤/肿瘤细胞(靶细胞)上的特定肽的细胞毒T细胞(CTL)。通过来自个体的PBL、APC或肿瘤细胞进行ELISPOT测定法，轻易地确定这种活性。在测定之前，可能有利的是通过使待验定的细胞与待测试的肽接触而刺激这些细胞。优选地，肽能够以至少1/10⁴个PBL的频率激发或识别产生INF-γ的T细胞，如通过如本文所用的ELISPOT测定法测定。更优选地，该频率是至少4/10⁴个PBL，最优选地至少10/10⁴个PBL，如至少50或100/10⁴个PBL。

ELISPOT测定法代表了监测TDO肽特异性T细胞应答的强大工具。本文研究结果的一个主要意义在于本发明的肽被表达并且与癌细胞和/或表达TDO的APC上的HLA分子复合。这使得这些癌细胞易遭CTL破坏并且强化了TDO免疫接种对抗癌症和感染的效能。来自黑素瘤患者的PBL中存在针对HLA限制型TDO衍生肽表位的自发性CTL反应显示了TDO免疫原性肽的免疫治疗潜力。

在本发明的一个实施方案中，本发明的肽能够在患有临床病症的个体的PBL群体中激发产生INF-γ的细胞，其中表达了SEQ ID NO:1的TDO或其与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的功能同源物。临床病症优选地是癌症或和感染并且最优选地是癌症。

个体

待用本发明疫苗组合物治疗的个体是患有临床病症的患者。该个体优选地是哺乳动物物种并且最优选地是人类。该个体可以是任何年龄，年轻或年老，并且可以是雄性或雌性。该个体患有的临床病症可以是赘生性疾病如癌症，或是感染如微生物感染或病毒性感染，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)。

本发明的一个实施方案提供疫苗用于治疗癌症、降低癌症风险、稳定或预防癌症。在另一个实施方案中在另一个实施方案中，本发明提供疫苗用于治疗源自感染(如微生物感染或病毒性感染)的疾病、降低该疾病风险、稳定或预防该疾病。

癌症

本本发明的疫苗组合物可以用来预防临床病症、降低因临床病症的风险或治疗该临床病症。优选地，该临床病症与表达TDO相关或以其为特征。TDO可以是如SEQ ID NO:1中所确定的TDO或可以是与其野生型形式的这些蛋白质中任一者共有至少70％同一性的同源物，但不需要功能。因而理解，TDO的表达水平(该表达是hnRNA、mRNA、前体蛋白、充分加工的蛋白质等的表达)与未患有所述临床病症的个体中相同或较之更高。

在本发明的一个实施方案中，临床病症是增殖性病症，如前赘生性病症或赘生性病症。在本发明的一个优选实施方案中，该临床病症是癌症。癌症(恶性赘生物)是一类疾病，其中一组细胞显示失控生长(生长和分裂超出正常限制)、侵入(侵扰并破坏相邻组织)和有时转移(借助淋巴液或血液扩散至体内其他位置)的性状。癌症的这三类恶性特性使其区别于良性肿瘤，后者是自限的、不侵入或不转移。大部分癌症形成肿瘤，但是一些癌症如白血病不形成肿瘤。

作为可以通过施用本发明疫苗进行治疗、管理和/或预防的癌症例子而给出的癌症的非限制性群组包括：结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing's肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌(cystandeocarcinoma)、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilm肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质母细胞瘤、神经瘤、颅咽管瘤(craniopharingioma)、神经鞘瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病和淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病和急性髓系真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和重链病、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、直肠癌症、尿癌症、子宫癌、口腔癌、皮肤癌、胃癌、脑肿瘤、肝癌、喉癌、食管癌、乳腺瘤、儿童无标志急性淋巴样白血病(ALL)、胸腺性ALL、B-细胞ALL、急性髓样白血病、骨髓单细胞样白血病、急性巨核细胞样白血病、Burkitt淋巴瘤、急性髓样白血病、慢性髓样白血病和T细胞白血病、小体积和大体积非小细胞肺癌(small and large non-small cell lung carcinoma)、急性粒细胞白血病、生殖细胞肿瘤、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、慢性淋巴样白血病、多毛细胞白血病和甲状腺癌。

在一个优选实施方案中，本发明的疫苗组合物能够在受试者中激发临床反应，其中所述临床反应可以以病情稳定为特征，在优选的实施方案中，该临床反应可以以部分响应为特征或优选地，该临床反应可以以癌症完全缓解为特征。优选地，癌症选自：黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、血液学癌(如白血病)、结肠癌和肾细胞癌。

在本发明的一个方面，该疫苗组合物能够在个体中激发临床反应。在一个实施方案中，该临床反应可以以稳定的病情(没有进一步加重或进展)为特征，在优选的实施方案中，该临床反应可以以部分响应为特征或优选地，该临床反应可以以癌症或感染的完全缓解为特征。可以如下文所述确定临床反应。

在本发明的另一个方面，疫苗组合物能够在受试者中激发临床反应，其中所述临床反应以最大靶病灶的最长直径的总和减小为特征。可以如下文所述确定该减小。

代表所涉及的全部器官的全部可测量病灶(直至最多每个器官5个病灶和总计10个病灶)应当被鉴定为靶病灶并在基线处记录和测量。

·应当基于靶病灶的大小(具有最长直径的病灶)及它们对精确反复测量(通过成像技术或临床测量)的适用性选择靶病灶。

·计算全部靶病灶的最长直径(LD)的总和并且报道为基线总和LD。将使用基线总和LD作为借以表征目标肿瘤的参考。

·全部其他病灶(或疾病部位)应当被鉴定为非靶病灶并也应当在基线时记录。不要求测量这些病灶，但是在整个随访期间应当指出这些病灶中每种病灶的存在或不存在。

靶病灶的评估

·完全响应(CR)：全部靶病灶消失

·部分响应(PR)：以基线总和LD作为参考，靶病灶的LD总和下降至少30％。

·进行性疾病(Progressive Disease，PD)：自治疗开始以来以所记录的最小总和LD作为参考，靶病灶的LD总和增加至少20％，或出现一种或多种新病灶。

·病情稳定(SD)：以治疗开始以来的最小总和LD作为参考，既没有定性PR的充分缩小，也没有定性PD的充分增加

非靶病灶的评价

·完全响应(CR)：全部非靶病灶的消失和肿瘤标记水平的正常化

·不完全响应/病情稳定(SD)：一种或多种非靶病灶的持续或/和肿瘤标记水平的维持高于正常限。

·进行性疾病(PD)：一个或多个新病灶的出现和/或现有非靶病灶的明确进展

在本发明的一个实施方案中，包含本文中提到的任何蛋白质和/或多肽的疫苗组合物能够在受试者中激发临床反应，其中所述临床反应以最大靶病灶的最长直径之和减小为特征。

本发明还涉及，当施用至患有表达TDO的癌症的个体时，本发明的疫苗组合物能够激发针对癌的免疫应答，所述癌表达SEQ ID NO:1的TDO或其与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的功能同源物。本发明的疫苗组合物能够在接种个体中激发针对癌细胞、表达TDO的APC具有细胞毒效应的效应T细胞产生和/或在受试者中诱导抗原特异性T细胞在肿瘤基质中浸润。

除它们在PBL群体中激发免疫应答的能力之外，还涉及本发明的肽能够原位即在实体瘤组织中激发溶细胞免疫应答。这可以例如通过以下方式展示：提供HLA-肽复合物(例如为多聚化并配有可检测标记物)并使用这类复合物用于免疫组织化学染色以在肿瘤组织中检测与本发明的表位肽反应的CTL。因此，本发明肽的又一个显著特征是它能够在肿瘤组织中原位检测与表位肽反应的CTL。

除它们与HLA分子结合以导致HLA和肽的复合物(所述复合物转而充当溶细胞性T细胞的表位或靶)在细胞表面上呈递的能力之外，还涉及本发明的肽可以激发其他类型的免疫应答，如B-细胞反应，导致针对所述复合物的抗体和/或迟发型超敏反应(DTH)产生。后一类型的免疫应答将定义为在本发明肽的注射部位处发红和可触及硬结。

本发明的一个目的是提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含SEQ ID NO:1的色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)或其与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的功能同源物或包含所述TDO或其所述功能同源物的连续序列的免疫原活性肽片段或编码所述TDO或所述肽片段的核酸；和佐剂，用于预防癌症、降低癌症风险或治疗癌症。

癌症组合疗法

在一些情况下，适宜的是把本发明的治疗方法与其他癌症疗法如化疗、放疗法、用免疫刺激物质治疗、基因治疗、用抗体治疗和使用树状细胞治疗组合。

由于肿瘤细胞中TDO表达升高导致免疫系统抑制，所以如本发明所公开的基于TDO的免疫疗法与细胞毒化疗和或另一种抗癌免疫治疗疗法组合是治疗癌症的有效方案。这些治疗在本文中也称作“第二活性成分”。

对本发明疫苗组合物一起(依次或同时)供施用而言有意义的化疗药的例子包括但不限于：全反视黄酸、辅酶B12(actimide)、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、佐柔比星、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、依立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仓、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、雷利米得(Revlimid)、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星(valrubicin)、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。在一个实施方案中，与本发明药剂组合使用的化疗药本身可以是不同化疗药的组合。合适的组合包括FOLFOX和IFL。FOLFOX是包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸和奥沙利铂的组合。IFL治疗包括依立替康、5-FU和甲酰四氢叶酸。

另一个第二活性成分可以是激酶抑制剂，用于治疗肿瘤时独立、同时或合并使用。合适的激酶抑制剂包括已经显示拥有抗肿瘤活性(如吉非替尼(易瑞沙(Iressa))和厄洛替尼(特罗凯(Tarceva))的那些，并且这些激酶抑制剂可以与所述肽组合使用。受体酪氨酸激酶抑制剂，如已经显示有效治疗肾细胞癌的苹果酸舒尼替尼和索拉替尼，也合适作为第二活性成分使用。

第二活性成分的其他例子是免疫刺激物质例如细胞因子和抗体。如细胞因子可以选自，但不限于：GM-CSF、I型IFN、白介素21、白介素2、白介素12和白介素15。抗体优选地是免疫刺激性抗体如抗-CD40或抗CTLA-4抗体。免疫刺激性物质也可以是能够耗尽免疫抑制性细胞(例如调节性T细胞)或因子的物质，所述物质可以例如是E3泛素连接酶。E3泛素连接酶(HECT、RING和U框蛋白)已经作为免疫细胞功能的关键分子调节物浮现，并且每种酶均可在感染期间通过靶向特定抑制性分子用于蛋白酶解破坏而参与调节免疫应答。几种HECT和RING E3蛋白现在也已经与免疫自我耐受性的诱导和维持关联：c-Cbl、Cbl-b、GRAIL、Itch和Nedd4各自负向调节T细胞生长因子产生和增殖。

在一个实施方案中，将包含TDO衍生多肽的本发明疫苗组合物与第二活性成分如免疫刺激性物质组合施用。免疫刺激性物质优选地是白介素如IL-21或IL-2或化疗药。

本发明疫苗组合物还可以包含除TDO之外的一种或多种额外抗原。所述抗原可以例如是衍生自癌症相关蛋白质的免疫原活性肽。

因此，除TDO和/或其免疫原活性肽片段之外，本发明疫苗组合物可以还包含以下一者或多者：

1)IDO

2)IDO的免疫原活性肽片段

3)1)或2)的功能同源物

4)包含1)，2)或3)的多肽

5)编码1)、2)、3)或4)中任一者的核酸。

所述IDO尤其可以是WO 2009/143843的SEQ ID NO:1的IDO、WO 2009/143843的SEQID NO:13的IDO、WO 2009/143843的SEQ ID NO:14的IDO、WO 2009/143843的SEQ ID NO:15的IDO或WO 2009/143843的SEQ ID NO:16的IDO。WO2009/143843中描述了可以含在本发明疫苗组合物中的IDO的可用免疫原活性肽片段。

除TDO和/或其免疫原活性肽片段之外，本发明疫苗组合物可以还包含以下一者或多者：

1)PD-L1

2)PD-L1的免疫原活性肽片段

3)1)或2)的功能同源物

4)包含1)，2)或3)的多肽

5)编码1)、2)、3)或4)中任一者的核酸。

所述PD-L1尤其可以是WO2013/056716的SEQ ID NO:1的PD-L1。WO2013/056716./143843中描述了可以含在本发明疫苗组合物中的PD-L1的可用免疫原活性肽片段。

感染

在本发明的另一个实施方案中，本文公开的疫苗组合物用于治疗或预防炎性病症。

如本文所用的术语“炎性病症”指产生免疫应答(如炎症)的任何种类的临床病症，并且因此包括传染病、慢性感染、自身免疫病症和变应性炎症。因而，炎性病症，如传染病、慢性感染、自身免疫病症和变应性炎症均是与本发明有关的临床病症，并且转而由其处理。

炎症是血管组织对有害刺激，如病原体、受损细胞或刺激物的复杂生物学反应。它是生物除去有害刺激以及启动组织愈合过程的保护性尝试。炎症可以分为急性或慢性。急性炎症是身体对有害刺激的初始反应并且通过增加血浆和白细胞从血液移动至受伤组织而实现。一连串生物化学事件传播炎症反应并使其成熟，所述炎症反应涉及局部血管系统、免疫系统和受伤组织内部的各种细胞。延长的炎症，称作慢性炎症，导致存在于炎症部位的细胞类型进行性变动并且以同时存在组织破坏和从炎症过程愈合为特征。在任何一种情况下，TDO由免疫系统细胞如APC表达，并且因此感染和炎症是可以通过施用本发明的疫苗组合物进行治疗、预防或可以降低因其所致风险的临床病症。疫苗组合物优选地包含TDO蛋白、衍生自其中的蛋白质片段、多肽或肽或前述任一者的功能同源物。

与本发明有关的炎症相关病症的例子包括但不限于：变应性炎症、哮喘、自身免疫疾病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏性、传染病、炎性肠病、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植排斥和血管炎。

慢性炎症

慢性炎症特别与本发明有关。慢性炎症是以活跃的炎症、组织破坏和修复尝试共存为特征的病理状况。慢性发炎的组织以单核细胞免疫细胞(单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞)浸润、组织破坏和愈合尝试(这包括血管生成和纤维化)为特征。

在急性炎症中，刺激的移除阻止了单核细胞(其在适宜的活化下变成巨噬细胞)召集入发炎的组织，并且现存的巨噬细胞通过淋巴管离开该组织。然而在慢性发炎的组织中，刺激持续存在，并且因此维持单核细胞的召集，现存的巨噬细胞原地滞留，并且巨噬细胞的增殖受到刺激(特别在动脉粥样化斑块中)。

本发明的一个目的是提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含SEQ ID NO:1的色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)或其与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的功能同源物或包含所述TDO或其所述功能同源物的连续序列的免疫原活性肽片段或编码所述TDO或所述肽片段的核酸；和佐剂，用于预防慢性炎症、降低慢性炎症风险或治疗慢性炎症。

传染病

本发明的疫苗组合物可以用来预防临床病症、降低因该临床病症所致的风险或治疗该临床病症。在本发明的一个优选实施方案中，该临床病症是传染病。该传染病可以由能够在患有该传染病的个体中诱导TDO表达增加的任何传染因子如细菌、病毒、寄生体和或真菌引起，优选地，该传染病是慢性疾病或面临变成慢性疾病的风险。如发明背景中所述，增加的TDO表达通过剥夺微生物因子的色氨酸，对表达TDO的生物附近的微生物因子即刻产生影响。然而，这种方案适得其反，因为如果表达TDO的细胞是APC，则增加的TDO表达诱导对Treg细胞活性的抑制。因此，本发明的一个方面是提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含TDO蛋白、蛋白质片段、肽和或前述任一者的变体，用于治疗由传染因子引起的疾病、改善该疾病(减轻其严重程度)、稳定和/或预防该疾病。

传染病可以由病毒引起，并且可以在治疗时针对其施用本发明疫苗组合物的病毒疾病包括但不限于以下病毒疾病：HIV、AIDS、AIDS相关综合征、鸡痘(Varicella)、普通感冒、巨细胞病毒感染、科罗拉多蜱传热、登革热、埃博拉出血热、手足口病、肝炎、单纯疱疹、带状疱疹、HPV(人乳头瘤病毒)、流感(Flu)、拉沙热、麻疹、马堡出血热、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、诺如病毒、脊髓灰质炎、进行性多灶性脑白质病、狂犬病、风疹、SARS、天花(Variola)、病毒性脑炎、病毒胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒肺炎、西尼罗河病和黄热病。优选地，将疫苗组合物施用至患有HIV/AIDS和可能造成癌症的病毒性感染的个体。与人类癌症相关的主要病毒是人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、Epstein-Barr病毒和人T淋巴细胞病毒；因此本发明的一个目的是作为治疗这些病毒性感染的疗法或疗法部分施用。

与本发明有关的细菌性感染的例子包括但不限于：炭疽、细菌性脑膜炎、肉毒杆菌中毒、布氏杆菌病、弯曲杆菌病、猫抓病、霍乱、白喉毒素、流行性斑疹伤寒、淋病、脓疱病、退伍军人病、麻疯病(Hansen病)、钩端螺旋体病、李斯特氏菌病、莱姆病、类鼻疽、风湿热、MRSA感染、诺卡菌病、百日咳(Whooping Cough)、瘟疫(Plague)、肺炎球菌肺炎、鹦鹉热、Q发热、洛矶山斑疹热(RMSF)、沙门氏菌病、猩红热、志贺菌病、梅毒、破伤风、沙眼、结核病、土拉热、伤寒、斑疹伤寒和尿路感染。本发明的一个目的是提供一种用于治疗和/或预防细菌性感染和/或降低因细菌性感染所致风险的疫苗。

本发明的又一个目的是提供一种用于治疗和/或预防以下疾病和/或降低以下疾病的风险的疫苗组合物：寄生虫性传染病如，但不限于非洲锥虫病、阿米巴病、蛔虫病、巴贝斯虫病、南美锥虫病、肝吸虫病、隐孢子虫病、囊尾蚴病、裂头绦虫病、龙线虫病、如棘球蚴病、蛲虫病、肝片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、自由生活阿米巴虫感染、贾第虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢球虫病、黑热病、利什曼病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、蛲虫感染、疥癣、血吸虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病(Trichinellosis)、旋毛虫病(Trichinosis)、鞭虫病、滴虫病和锥虫病；真菌传染病如但不限于曲霉菌病，芽生菌病(Blastomycosis)，念珠菌病，球孢菌病，隐球菌病，组织胞浆菌病，脚癣；朊病毒传染病如但不限于传染性海绵状脑病，牛海绵状脑病，克-雅氏病，库鲁病-致死性家族性失眠症和阿尔珀斯综合征；因此本发明的一个目的是作为治疗这这些寄生虫感染、真菌感染或朊病毒所致感染的疗法或疗法部分施用。

传染病组合疗法

进一步提供，通过施用本发明疫苗组合物对任何传染病的治疗可以连同其他(第二)活性成分一起给予或与其他治疗如抗生素治疗、化疗、用免疫刺激物质治疗、使用树状细胞治疗、抗病毒药、抗寄生虫药等组合给予。

可以与本发明疫苗组合用于治疗传染病的第二活性成分的例子包括并且不限于抗生素。本文中的术语“抗生素”指具有抗细菌、抗真菌、抗病毒和/或抗寄生虫活性的物质；与本发明有关的例子包括但不限于：阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、氯霉素、氟喹诺酮、环丙沙星、加替沙星、吉米沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、司帕沙星、曲伐沙星、糖肽、万古霉素、林肯胺、克林霉素、大环内酯类/酮内酯类、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢地尼、头孢托仑、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、单酰胺菌素、氨曲南、硝基咪唑类、甲硝唑、噁唑烷酮类、利奈唑胺、青霉素、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸盐、氨苄青霉素、舒巴克坦、巴氨西林、羧苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、替卡西林、替卡西林/阿莫西林/克拉维酸盐、链阳菌素类、奎奴普丁、达福普汀、磺酰胺/磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、四环素、地美环素、多西环素、米诺环素、四环素、吡咯抗真菌药类、克霉唑、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑、伏立康唑、两性霉素B、制霉菌素、棘球白素、卡泊芬净、云母真菌精、环吡酮、氟胞嘧啶、灰黄霉素和特比萘芬。其他有关的是抗病毒药如阿糖腺苷、阿昔洛韦、更昔洛韦和万赛维(Valcyte)(缬更昔洛韦)、核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)：AZT(齐多夫定)、ddI(去羟肌苷)、ddC(扎西他滨)、d4T(司他夫定)、3TC(拉米夫定)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)：奈韦拉平、地拉韦啶、蛋白酶抑制剂：沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、利巴韦林、金刚烷胺/金刚乙胺、扎那米韦和达菲、普来可那立、干扰素。

在一个实施方案中，本发明涉及一种与至少一种抗生素组合用于治疗传染病的疫苗组合物，其包含TDO衍生蛋白、多肽和/或其功能同源物。优选地，本发明的疫苗组合物用于治疗慢性感染例如HIV并且因此与前文所列出的任一种抗生素如抗病毒药组合使用。

自身免疫疾病

当生物未能将其自身组成部分(下至亚分子水平)识别为自我，从而导致针对其自身细胞和组织的免疫应答时，自身免疫疾病出现。因这种异常免疫应答所致的任何疾病均称作自身免疫性疾病并且对本发明有意义。其例子包括但不限于：乳糜泻、糖尿病类型1(IDDM)、系统性红斑狼疮(SLE)、综合征、多发性硬化(MS)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、Graves病、特发性血小板减少性紫癜和类风湿性关节炎(RA)。

本发明的一个目的是提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含SEQ ID NO:1的色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)或与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的其功能同源物，或包含所述TDO或其所述功能同源物的连续序列的免疫原活性肽片段，或编码所述TDO或所述肽片段的核酸；和佐剂，用于预防自身免疫性疾病、降低自身免疫性疾病的风险或治疗自身免疫性疾病。

自身免疫性疾病组合疗法

用于自身免疫性疾病的当前治疗通常是免疫抑制药、抗炎药或姑息剂。非免疫疗法，如桥本氏甲状腺炎或糖尿病类型1治疗中的激素替代，导致自身侵入性反应。饮食控制限制乳糜泻的严重性。甾体治疗或NSAID疗法限制许多疾病的炎性症状。免疫球蛋白静脉内制品(IVIG)用于慢性炎性脱髓鞘多发性神经病(CIDP)和Guillain-Barré综合征(GBS)。已经证明更多特异性免疫调节疗法，如TNFα拮抗药依那西普，可用于治疗RA。这些免疫疗法可能与增加的副作用风险(如感染易感性)相关。

已经基于这些观察结果形成了驱虫疗法，该疗法涉及用特定寄生虫性肠道线虫(蠕虫)接种个体。目前存在两个可获得的密切相关的治疗：用美洲钩虫(Necatoramericanus)(通称为钩虫)或猪鞭虫(Trichuris Suis Ova)(通称为猪鞭虫卵)接种。已经存在这样的研究，所述研究显示这种方案高度有效治疗多种自身免疫疾病，包括Crohn病、溃疡性结肠炎、哮喘、变态反应、多发性硬化和慢性炎性疾病

在一个实施方案中，本文中公开的疫苗与第二活性成分如前述提到的任一种药物和针对自身免疫疾病的治疗组合使用。

变应性炎症

过敏是免疫系统的紊乱，经常又称作特异反应性。过敏反应针对称作变应原的环境物质发生；这些反应是获得性的、可预测的和快速的。严格地，过敏是4种形式超敏反应的一种并称作I型(或速发型)超敏反应。它的特征在于某些白细胞(称作肥大细胞和嗜碱性粒细胞)被称作IgE的抗体类型过度活化，导致极端炎症反应。常见的过敏反应包括湿疹、荨麻疹、干草热、哮喘、食物过敏和对叮咬昆虫(如胡蜂和蜜蜂)的毒液的反应。

变应性炎症是几种残疾或医学病症(包括过敏性哮喘，异位性皮炎，过敏性鼻炎和几种眼部过敏性疾病)的重要病理生理特征。

本发明的一个目的是提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含SEQ ID NO:1的色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)或其与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的功能同源物或包含所述TDO或其所述功能同源物的连续序列的免疫原活性肽片段或编码所述TDO或所述肽片段的核酸；和佐剂，用于预防变应性炎症、降低因变应性炎症的风险或治疗变应性炎症。

变应性炎症组合治疗

两个类型的治疗可用于治疗变应性炎症：药物疗法和免疫疗法。

药物疗法是使用拮抗性药物阻断过敏介质的作用，或防止细胞活化和脱粒过程。这些药物包括抗组胺药、可的松、地塞米松、氢化可的松、肾上腺素(epinephrine,adrenaline)、茶碱、色甘酸钠和抗白三烯药类，如孟鲁司特(Singulair)或扎鲁司特(Accolate)；抗胆碱能药类、解充血剂、肥大细胞稳定剂，并且还常使用认为破坏嗜酸性粒细胞趋化的其他化合物。

免疫疗法是其中将个体用渐进增大剂量的所讨论变应原逐渐接种的脱敏或减敏治疗。第二形式的免疫疗法包括静脉内注射单克隆抗IgE抗体。第三类型，舌下免疫疗法，是口服施用疗法，它利用对非致病抗原如食品和宿居细菌的口服免疫耐受性优点。

在一个实施方案中，本文中公开的疫苗与第二活性成分如前述提到的针对变应性炎症的任一种药物和治疗组合使用。

药物组合物

本发明涉及能够在个体中治疗与TDO表达相关的临床病症、降低其风险和/或预防该病症的药物组合物。所述药物组合物尤其可以是疫苗组合物。本发明的疫苗组合物可以是包含抗原如蛋白质多肽和/或核酸分子的“传统”疫苗组合物。它们也可以是包含细胞(如源自个体并稍后加工过的修饰细胞)的组合物形式，或包含复合分子如抗体或TCR的组合物。

通常，疫苗是能够在个体物中诱导免疫应答的物质或组合物。该组合物可以包含以下一者或多者：“活性组分”如抗原(例如蛋白质、多肽、肽、核酸等)、包含一个或多个抗原连同其他元件的核酸构建体、细胞(例如加载的APC、用于过继转移的T细胞)、复合物分子(抗体、TCR和MHC复合物和更多)、载体、佐剂和药用载体。在下文，更详细地公开本发明疫苗组合物的各种组分。

在施用至患有(导致TDO表达的)癌症和/或感染的个体时，本发明的疫苗组合物能够激发针对表达SEQ ID NO:1的TDO或其与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的功能同源物的癌症、DC或APC的免疫应答。在一个优选实施方案中，临床病症是癌症。本发明的疫苗组合物能够在接种个体中激发针对表达TDO的癌细胞、APC和DC具有细胞毒效应的效应T细胞产生和/或在受试者中诱导抗原特异性T细胞在肿瘤基质中浸润。

抗原和其他活性组分

基于蛋白质/多肽的疫苗组合物

本发明的肽以令人惊讶的高亲和力与MHC结合(参见图2)并且在呈递它们时即可用作抗原。优选地，本发明的疫苗组合物包含以下一种或多种：

1)色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)，其可以在下文“色氨酸2,3-双加氧酶”部分中描述的任何TDO；

2)包含TDO的连续氨基酸序列的TDO的免疫原活性肽片段，其可以是在下文部分“TDO的免疫原活性肽片段”中描述的任何肽。

3)TDO的免疫原活性肽片段，其是MHC I类限制型肽片段或MHC II类限制型肽片段，如“MHC”部分中描述的任何MHC I类限制型肽片段或MHC II类限制型肽片段；

4)1)、2)和3)的多肽的功能同源物；

5)包含1)、2)、3)和4)的任何多肽的多肽，所述多肽可以是在下文“包含TDO或其片段的多肽”部分中描述的任何多肽；

6)编码1)、2)、3)和4)的任一多肽的核酸。

本发明的疫苗组合物中抗原的选择将取决于本领域技术人员可确定的参数。如已经提到，本发明的每种不同肽由特定HLA分子呈递在细胞表面上。因而，如果待治疗的受试者就HLA表型进行分型，则选择已知与这种特定HLA分子结合的肽/多种肽。可选地，基于给定群体中各种HLA表型的优势率选择目的抗原。作为例子，HLA-A2是高加索人群中最优势的表型，并且因此，含有与HLA-A2结合的肽的组合物将在大比例的这个群体中有活性。另外，本发明的抗原/肽可以根据表2中提出的锚定残基基序修饰，以增强与特定HLA分子的结合。

本发明的组合物还可以含有两种或更多种TDO的免疫原活性肽片段的组合，例如在“TDO的免疫原活性肽片段”、“包含TDO或其片段的多肽”和“MHC”部分中描述的任何肽。所述TDO的免疫原活性肽片段可以各自与不同HLA分子特异性相互作用，从而覆盖较大比例的目标群体。因此，作为例子，药物组合物可以含有受HLA-A分子限制的肽和受HLA-B分子限制的肽的组合，例如包含与靶群体中HLA表型的优势率对应的那些HLA-A和HLA-B分子，例如HLA-A2和HLA-B35。另外，该组合物可以包含受HLA-C分子限制的肽。

在基于肽的疫苗情况下，表位可以按'MHC即用'形式施用，这使得通过独立于宿主抗原呈递细胞摄入和加工抗原的外源加载来呈递成为可能。本发明的肽包含处于短'MHC-即用'形式和处于较长形式的两种肽，所述较长形式需要由蛋白酶体加工，因此提供可以靶向多种肿瘤抗原的更复杂的疫苗组合物。由疫苗靶向的不同HLA组越多，疫苗在多样性群体中发挥功能的可能性越高。

多表位疫苗组合物

本发明还涉及高度免疫原性的多表位疫苗。优选地，这类疫苗应当如此设计，从而促进同时递送TDO的最适合的免疫原活性肽片段，所述肽片段任选地与其他如本文所述的合适的肽和/或佐剂组合。本发明涵盖包含TDO的免疫原活性肽片段的这类多表位疫苗，所述TDO的免疫原活性肽片段任选地与不属于或不衍生自TDO的其他蛋白质或肽片段和/或如本文所述的佐剂组合。一种促进开发具有更复杂组成的疫苗的重要因素是需要靶向多种肿瘤抗原，例如通过设计包含或编码仔细选择的CTL和T_h细胞表位集合的疫苗。因此，本发明在一个方面涉及包含I类和II类限制型TDO表位的疫苗组合物。

本发明的肽因此包括处于短'MHC即用'形式(I类限制型)和处于需要蛋白酶体加工的较长形式(II类限制型)的肽。因而，可以将本发明的组合物作为包含如本文定义的I类限制型表位和/或II类限制型表位的多表位疫苗提供。

基于核酸的疫苗组合物

本发明的疫苗组合物可以包含编码TDO多肽或其免疫活性肽片段的核酸。所述核酸可以因此编码前述提到的任一种蛋白质和肽片段。核酸可以例如是DNA、RNA、LNA、HNA、PNA，优选地，该核酸是DNA或RNA。

本发明的核酸可以包含于任何合适载体(如表达载体)内部。可以使用多种载体并且技术人员将能够为特定目的选择可用载体。载体可以例如处于质粒、粘粒、病毒颗粒或人工染色体形式。可以将适宜的核酸序列通过多种程序插入载体中，例如，可以使用本领域熟知的技术将DNA插入适宜的限制性核酸内切酶位点中。除本发明的核酸序列之外，载体还可以包含以下一者或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。载体也可以包含额外的序列，如增强子、聚腺苷酸尾、接头、多接头、可操作接头、多克隆位点(MCS)、终止密码子、内部核糖体进入位点(IRES)和用于整合的宿主同源序列或其他限定的元件。用于工程化核酸构建体的方法是本领域熟知的(见，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook等人编著，Cold Spring HarborLaboratory，第2版,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。载体优选地是表达载体，其包含与调节性核酸序列有效连接的核酸，所述调节性核酸序列指导该核酸在合适的细胞中表达。在本发明的范围内，所述调节性核酸序列应当通常能够指导在哺乳动物细胞、优选地人细胞中，更优选地在抗原呈递细胞中的表达。

在一个优选的实施方案中，载体是病毒载体。载体也可以是细菌载体，如减毒细菌载体。可以使用减毒细菌载体，目的是在感染和持续部位处诱导持久的粘膜免疫应答。不同的重组细菌可以用作载体，例如细菌载体可以选自沙门氏菌属(Salmonella)、乳球菌属(Lactococcus)和李斯特氏菌属(Listeria)。通常而言，可以在小鼠中显示针对异源抗原HPV16L1或E7的免疫力的诱导，伴随强烈的CTL诱导和肿瘤消退。载体还可以包含编码T细胞刺激性多肽的核酸。

加载的APC

在可用的实施方案中，通过以下方式激发针对癌疾病的免疫原性反应：施用本发明的肽或者通过加载在来自个体的抗原呈递细胞(APC)上的MHC I类或II类分子；通过从个体分离PBL并将细胞与肽温育，之后将细胞注射回该个体；或通过从个体分离前体APC并使用细胞因子和抗原使细胞分化成专业型APC，之后将细胞注射回该个体。

因此，本发明的一个方面是提供包含抗原呈递细胞的疫苗组合物，所述抗原呈递细胞包含TDO或其免疫活性肽片段或编码所述蛋白质或所述免疫活性肽片段的核酸。抗原呈递细胞可以是能够呈递抗原至T细胞的任何细胞。优选的抗原呈递细胞是树状细胞。可以根据任何合适的方案，例如如下文所述制备树状细胞(DC)并且将其用于治疗性方案中。本领域技术人员将明白可以采用该方案以便对具有不同HLA型和不同疾病的个体使用。

树状细胞(DC)可以用50μg/ml HLA限制型肽(以GMP品质合成)在37℃脉冲标记1小时，并且在第1和14日皮下施用5x 10⁶个细胞和肽，随后在5次接种后每4周进行额外的白细胞去除术。临床用DC的产生和质量控制可以基本上如Nicolette等人(2007)中所述那样进行。

因而，在本发明的一个实施方案中，一种用于治疗患有以TDO表达为特征的临床病症的个体的方法，优选地其中所述临床病症是癌症或感染，是这样一种方法，其中通过以下方式施用所述肽：将该肽离体呈递至该个体的抗原呈递细胞(APC)，随后将如此处理的APC注射回该个体中。存在进行这种操作的至少两个可选方式。一个是从个体分离APC并且将MHC I类分子与肽温育(加载)。加载MHC I类分子意指将APC与肽如此温育，从而带有对该肽特异的MHC I类分子的APC结合该肽并且因此能够将它呈递给T细胞。随后，将APC再注入该个体。另一个方式依赖于树状细胞生物学领域的最新发现。在这种情况下，单核细胞(作为树状细胞前体)从个体分离并且通过使用细胞因子和抗原在体外分化成专业型APC(或树状细胞)。随后，体外产生的DC用该肽脉冲标记并注射至个体中。

过继免疫疗法/过继转移

本发明的重要方面涉及在体外培育TDO特异性T细胞并将这些细胞过继转移至个体。过继转移意指医师直接转移免疫系统的已经能够产生特异性免疫应答的实际组分至个体中。

本发明的一个目标是提供可以例如用于过继转移的TDO特异性T细胞。包含能够与TDO肽/MHC I类复合物或TDO肽/MHC II类复合物特异性结合的T细胞受体的分离T细胞可以过继转移至个体，所述T细胞优选地是已经在体外扩充的T细胞，其中TDO肽可以是上文中提到的任何TDO的免疫原活性肽片段。体外扩充T细胞的方法是技术人员熟知的。本发明还涉及治疗的方法，所述方法包含将包含能够与MHC限制型TDO肽复合物特异性结合的T细胞受体的T细胞施用至个体，如患有癌疾病的人类，其中所述TDO衍生肽可以是上文中提到的任何TDO肽。本发明还涉及包含能够与TDO或其肽片段特异性结合的T细胞受体的T细胞的用途，用于制备治疗癌症或感染的药物。自体T细胞转移可以基本上如Walter等人(1995)中所述进行。

TCR转移

在又一个实施方案中，可以在过继转移之前照射这类T细胞以控制在个体中的增殖。可以通过TCR基因转移将T细胞的特异性遗传工程化(Engels等人,2007)。这允许转移携带TDO肽特异性的T细胞至个体中。通常而言，使用T细胞用于过继免疫疗法是有吸引力的，因为它允许在无肿瘤或无病毒的环境下扩充T细胞和在输注之前分析T细胞功能。与转移T细胞系相比，在过继转移中采用TCR基因修饰的T细胞(如用指导异源TCR表达的表达构建体转化的T细胞)具有几个优点：(i)重定向T细胞的产生通常是适用的。(ii)可以选择或产生高亲和力或极高亲和力的TCR并且用来工程化T细胞。(iii)可以使用密码子优化或鼠化TCR产生高亲合力T细胞，从而允许更好地表面表达稳定的TCR。通过T细胞受体(TCR)基因转移对T细胞特异性的遗传工程化可以基本上如Morgan等人(2006)中所述那样进行。

TCR转染

具有已知抗肿瘤反应性的TCR可以按遗传方式引入人原代T淋巴细胞中。可以将编码来自肿瘤特异性CTL克隆的TCRα链和β链的基因转染至原代T细胞中，并且以这种方式用针对肿瘤抗原的特异性重编程T细胞。通过电穿孔法将TCR RNA转染至PBL中(Schaft等人,2006)。可选地，可以使用逆转录病毒载体，通过TCR基因转移产生具有新特异性的T细胞(Morgan等人,2006)。然而，来自逆转录病毒载体的前病毒可能在转染的细胞的基因组中随机整合并随后扰动细胞生长。用编码TCR的RNA电穿孔T细胞克服了这个缺点，因为RNA仅在转染的细胞中短暂存在并且不能整合在基因组中(Schaft等人,2006)。另外，在实验室中常规地使用细胞的转染。

佐剂和载体

本发明的疫苗组合物优选地包含佐剂和/或载体。下文中给出可用佐剂和载体的例子。因此，TDO多肽、TDO的免疫原活性肽片段或其功能同源物、包含前者的多肽或编码前者的核酸可以在本发明的组合物中与佐剂和/或载体结合。

佐剂是其混入疫苗组合物中增加或否则调节对TDO或对TDO的免疫原活性肽片段的免疫应答的任何物质，参见下文进一步描述。载体是能够与TDO或肽片段结合并且特别辅助呈递本发明肽的支架结构物，例如多肽或多糖。

本发明的许多肽是相对小的分子并且可能因此需要在如本文所述的组合物中使所述肽与多种物质如佐剂和/或载体组合，以产生疫苗、免疫原性组合物等。按广泛定义，佐剂是促进免疫应答的物质。在Goding,Monoclonal Antibodies:Principles&Practice(第2版,1986)中第61-63页提供对佐剂的一般讨论。Goding指出当目的抗原具有低分子量或不良免疫原性时，推荐与免疫原性载体偶联。这类载体分子的例子包括匙孔槭血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白和鸡免疫球蛋白。也已经提出各种皂素提取物可用作免疫原性组合物中的佐剂。已经提出使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(一种熟知的细胞因子)作为佐剂(WO97/28816)。

载体可以独立于佐剂存在。载体的功能可以例如是尤其增加肽片段的分子量，目的是增加它们的活性或免疫原性、赋予稳定性、增加生物学活性或增加血清半寿期。另外，载体可以辅助呈递TDO蛋白、多肽、功能同源物或其肽片段至T细胞。载体可以是本领域技术人员已知的任何合适载体，例如蛋白质或抗原呈递细胞。载体蛋白可以是但不限于、匙孔槭血蓝蛋白、血清蛋白如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白、免疫球蛋白或激素，如胰岛素或棕榈酸。为了免疫接种人，载体必须是安全的且对人而言生理可接受的载体。然而在本发明的一个实施方案中，破伤风类毒素和/或白喉类毒素是合适的载体。可选地，载体可以是葡聚糖，例如琼脂糖凝胶。

因此本发明的一个方面是，组合物中存在的TDO蛋白、衍生自其中的多肽片段、变体或肽与载体如上述蛋白质或抗原呈递细胞如树状细胞(DC)结合。

佐剂可以例如选自：AlK(SO₄)₂、AlNa(SO₄)₂、AlNH₄(SO₄)、二氧化硅、明矾、Al(OH)₃、Ca₃(PO₄)₂、高岭土、碳、氢氧化铝、胞壁酰二肽、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11687，也称作去甲MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(CGP 19835A，也称作MTP-PE)、在2％鲨烯/Tween-80.RTM.乳液中的RIBI(MPL+TDM+CWS)、脂多糖及其各种衍生物，包括脂质A、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂、Merck佐剂65、多核苷酸(例如，聚IC和聚AU酸)、来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的蜡D、存在于短棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)和布氏杆菌属(Brucella)成员中的物质、Titermax、ISCOMS、QuilA、ALUN(见US58767和5,554,372)、脂质A衍生物、霍乱毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基质或GMDP、白介素1、白介素2、Montanide ISA-51和QS-21。待随本发明一起使用的优选佐剂包括基于油/表面活性剂的佐剂如Montanide佐剂(从比利时Seppic可获得)，优选地Montanide ISA-51。其他优选的佐剂是基于细菌DNA的佐剂，如包含CpG寡核苷酸序列的佐剂。然而，其他优选的佐剂是基于病毒dsRNA的佐剂，如聚I:C。咪唑并喹啉(Imidazochinilines)是优选佐剂的又一个例子。最优选的佐剂是适于人使用的佐剂。

Montanide佐剂(均从比利时Seppic可获得)可以选自Montanide ISA-51、Montanide ISA-50、Montanide ISA-70、Montanide ISA-206、Montanide ISA-25、Montanide ISA-720、Montanide ISA-708、Montanide ISA-763A、Montanide ISA-207、Montanide ISA-264、Montanide ISA-27、Montanide ISA-35、Montanide ISA 51F、Montanide ISA 016D和Montanide IMS，优选地选自Montanide ISA-51、Montanide IMS和Montanide ISA-720，更优选地选自Montanide ISA-51。Montanide ISA-51(Seppic，Inc.)是基于油/表面活性剂的佐剂，其中不同的表面活性剂与不可代谢性矿物油、可代谢性油或二者的混合物组合。将它们制备用作随包含TDO或其肽片段的水溶液的乳液。表面活性剂是二缩甘露醇油酸酯。QS-21(Antigenics；Aquila Biopharmaceuticals,Framingham,MA)是作为水溶液操作的高度纯化的水溶性皂素。QS-21和Montanide ISA-51佐剂可以在无菌单次使用的小瓶中提供。

熟知的细胞因子GM-CSF是本发明的另一种优选佐剂。已经使用GM-CSF作为佐剂持续十年并且它可以优选地是如WO97/28816中所述的GM-CSF。

下表中列出能够根据本发明使用的佐剂的期望官能性。

表3：佐剂作用模式

来源：Cox,J.C.和Coulter,A.R.(1997).Vaccine 15,248-56.

本发明的疫苗组合物可以包含多于一种佐剂。另外，本发明涵盖一种治疗性组合物，其进一步包含任何佐剂物质和/或包含前述任一者或其组合的载体。还涉及TDO蛋白、其变体或肽片段和佐剂可以按任何适宜的顺序分别施用。优选地，本发明的疫苗组合物包含Montanide佐剂如Montanide ISA 51或Montanide ISA 720或GM-CSF佐剂。

因此，本发明涵盖一种治疗性组合物，其进一步包含佐剂物质，所述佐剂物质包含前述任一者或其组合。还涉及抗原即本发明肽和佐剂可以同时或按任何适宜的顺序分别施用。

剂量和施用

取决于具体应用，本发明的TDO或TDO的免疫原活性肽片段在疫苗组合物中的量可以变动。然而，肽组合物的单次剂量优选地是在约10μg至约5000μg、更优选地约50μg至约2500μg如约100μg至约1000μg的任何量。特别地，在其中待治疗个体是人类的本发明实施方案中，则单个剂量可以是50μg至500μg的、例如80μg至300μg的，如100μg至250μg的TDO或所述TDO的免疫原活性肽片段。往往，疫苗组合物随时间推移反复地施用。例如，疫苗组合物可以施用至少2次，优选地至少5次，更优选地至少10倍，如在10至20次范围内。疫苗组合物也可以连续地施用。施用可以按任何可用的频率重复。因此，例如，疫苗组合物可以每周一次，如每两周一次，例如每3周一次，如每月一次，例如每两个月一次，如每三个月一次，例如每半年一次，如每年一次施用。特别地，疫苗组合物可以连续地施用。施用的频率可能在所述时间期间改变。在一个实施方案中，连续将疫苗组合物每1个月至3个月施用一次。施用模式包括皮内、皮下和静脉内施用、以时间释放制剂形式植入等。本文中涵盖本领域已知的任何和全部施用形式。还涵盖了本领域已知适合配制可注射用免疫原性肽组合物的任何和全部常规剂型，如冻干形式和溶液剂、混悬剂或乳剂形式，如果需要，所述剂型含有常规的可药用载体、稀释剂、防腐剂、辅助剂、缓冲组分等。

可以使用本领域技术人员已知的任何常规方案制备并施用药物组合物。在实施例3-5中，给出制备本发明疫苗组合物的非限制性例子以及施用如疫苗的非限制性例子。本领域技术人员理解，该方案可以容易地适应于本文所述的任何疫苗组合物。在本发明的又一个实施方案中，本发明的药物组合物可用于治疗患有以TDO表达为特征的临床病症如癌症和感染的个体。

可以使用本领域技术人员已知的几种方法确定本发明组合物的免疫保护作用。也可以通过免疫接种后出现DTH反应和/或检出特异性识别疫苗组合物的肽的抗体，确定成功的免疫应答。

本发明的疫苗组合物可以以治疗有效量施用至个体。有效量可以根据多种因素如个体状况、重量、性别和年龄变动。其他因素包括施用模式。

药物组合物可以通过多种途径如皮下、局部、口服和肌内途径向个体提供。药物组合物的施用经口或经肠胃外方式实现。肠胃外递送方法包括局部、动脉内(直接至组织)、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内施用。本发明还具有以下目的：提供合适的局部、口服、全身性和肠胃外药物制剂，用于利用疫苗组合物预防和治疗中。

例如，疫苗组合物可以在这类口服剂型如片剂、胶囊剂(各自包括定时释放和持续释放制剂)、丸剂、散剂、颗粒、酏剂、酊剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和乳剂中或通过注射施用。同样地，它们也可以按静脉内(大丸剂和输注)、腹膜内、皮下、在具有或不具有闭塞的情况下局部用或肌内形式施用，全部使用制药领域普通技术人员熟知的形成。可以使用有效但无毒量的包含本文中所述的任何化合物的疫苗作为预防药或治疗药。还涵盖了本领域已知适合配制可注射用免疫原性肽组合物的任何和全部常规剂型，如冻干形式和溶液剂、混悬剂或乳剂形式，如果需要，所述剂型含有常规的可药用载体、稀释剂、防腐剂、辅助剂、缓冲组分等。

本发明疫苗组合物的优选施用模式包括但不限于全身性施用，如静脉内或皮下施用、皮内施用、肌内施用、鼻内施用、口服施用、直肠施用、阴道施用、肺施用和总体上任何形式的粘膜施用。另外，处于本发明范围内的是，本发明包括用于本文中提到的任何施用形式的方法或手段。

本发明的疫苗可以施用一次，或任何次数，如两次、三次、四次或五次。施用疫苗多于一次具有加强所产生免疫应答的作用。疫苗还可以通过在与先前施用不同的形式或身体部分中施用来强化。加强接种是同源或异源加强接种。同源加强接种是这样的情况，其中第一和后续接种包含相同的构建体并且更具体地相同的递送载具，特别是相同的病毒载体。异源加强接种是这样的情况，其中相同的构建体包含于不同的病毒载体内。

第二活性成分

本发明的一个方面是本文中提供的疫苗组合物与第二活性成分组合使用。疫苗组合物和第二活性成分的施用可以是依次或合并的。上文给出用于癌症和感染的第二活性成分的例子。又一个方面是疫苗组合物可以与和待治疗的给定临床病症有关的其他疗法组合使用。这类治疗可以包括手术、化疗或基因治疗、免疫刺激物质或抗体；本领域技术人员能够针对给定的情况确定适宜的组合治疗。

在一些情况下，适宜的是将本发明的治疗方法与其他医学治疗如化疗、放疗法、用免疫刺激物质治疗、基因治疗、用抗体和/或抗生素治疗和使用树状细胞治疗组合。

诊断及预后工具

本发明的肽为开发在癌疾病和感染方面广泛适用的诊断和预后提供了基础。因而，在其他的可用实施方案中，本发明的组合物是用于离体或原位诊断个体中存在表达TDO的细胞的组合物。诊断方法基于在PBL当中或在肿瘤组织中检测TDO反应性T细胞。

因此，提供一种用于离体或原位诊断个体内PBL当中或肿瘤组织中存在TDO反应性T细胞的诊断试剂盒，所述试剂盒包含本发明的一种或多种肽，和一种检测个体中这类反应性T细胞存在的方法，所述方法包括使肿瘤组织或血液样品与本发明肽和HLA I类或II类分子或这种分子的片段的复合物接触，并检测该复合物与组织或血细胞的结合。在一个方面，本发明提供本发明肽和HLA I类或II类分子或这种分子的片段的复合物，所述复合物可用作诊断试剂，如本文所述。这种复合物可以是单聚或多聚的。

另一种有用的诊断或预后方法基于在异源动物物种中产生抗体，例如针对本发明的TDO的人免疫原活性肽片段的鼠抗体，所述抗体随后可以例如用来诊断呈递该肽的癌细胞的存在。出于这类免疫接种目的，肽的量可以比体内治疗(如上文所提到)过程中所用的量小。通常而言，优选的剂量可以是约1μg至约750μg肽。还可能基于用本发明肽免疫接种，产生单克隆抗体。因此，本发明还涉及能够与本发明肽特异性结合的分子，尤其包括其片段在内的单克隆或多克隆抗体，并涉及能够阻断这种结合的分子，例如针对抗本发明肽的单克隆或多克隆抗体所产生的抗体。本发明还涉及能够与本发明肽或蛋白质特异性结合的分离的T细胞受体以及涉及编码所述受体的分离核酸。这类T细胞受体可以例如使用技术人员熟知的标准技术从蛋白质或肽特异性T细胞克隆。

在一个方面，本发明还涉及分离的T细胞，所述T细胞包含能够与本文所述的TDO和/或其肽片段特异性结合的T细胞受体。分离的T细胞可以是CD8T细胞或CD4T细胞。分离的T细胞优选地是已经在体外扩充的T细胞。体外扩充T细胞的方法是技术人员熟知的。这类T细胞可以特别用于通过过继转移或自体细胞转移治疗癌症。因而，本发明还涉及包含T细胞的药物组合物以及治疗方法，所述治疗方法包括向有需求的个体如患有癌症和/或感染的个体施用T细胞，所述T细胞包含能够与TDO或其肽片段特异性结合的T细胞受体。自体细胞转移可以基本上如Walter等人(1995)中所述进行。

本发明提供了用于治疗、预防、减轻或治愈以表达TDO为特征的临床病症如癌症和感染、优选地癌症的手段，所述手段包括向患有该疾病的个体施用有效量的如本文定义的组合物、能够与肽片段特异性结合的分子，所述分子可以例如是抗体或T细胞受体，或者本文所述的组分套装。因此，本发明的又一个方面是提供一种治疗与表达SEQ ID NO:1的TDO相关的临床病症的方法。所述临床病症可以例如是癌症或炎性病症。

监测免疫接种

在优选的实施方案中，本发明的药物组合物是疫苗组合物。因此本发明的意义和一个方面是在对其施用本发明疫苗组合物的个体中监测免疫接种。药物组合物可以因此是能够激发针对癌症和/或感染的免疫应答的免疫原性组合物或疫苗。如本文所用，表述“免疫原性组合物或疫苗”指激发针对表达TDO的细胞如癌细胞、APC或DC的至少一种类型免疫应答的组合物。因而，这种免疫应答可以是以下任一种：CTL反应，其中产生了能够识别在细胞表面上呈递的HLA/肽复合物的CTL，导致细胞溶解，即疫苗在接种的受试者中激发产生具有针对癌细胞的细胞毒效应的效应T细胞；导致抗癌抗体产生的B-细胞反应；和/或DTH型免疫应答。本发明的一个目的是通过监测在施用本发明的组合物至所述个体后的前述任一种反应，监测该个体的免疫接种。

在一个方面，本发明涉及监测免疫接种的方法，所述方法包括步骤

i)提供来自个体的血液样品

ii)提供TDO或其肽片段，其中所述蛋白质或肽可以是本文所述的任何蛋白质或肽

iii)确定所述血液样品是否包含与该蛋白质或肽特异性结合的抗体或包含与该蛋白质或肽特异性结合的T细胞受体的T细胞，

iv)因而确定在所述个体中是否已经生成针对所述蛋白质或肽的免疫应答。

个体优选地是人类，例如已经用TDO或TDO的免疫原活性肽片段或编码所述蛋白质或肽的核酸免疫接种的人类。

组分套装

本发明还涉及一种组分套装，其包含；

·本文所述的任何疫苗组合物和/或

·TDO蛋白或其功能同源物和/或

·如本文所述的TDO的免疫原活性肽片段、其功能同源物和/或衍生自其中的肽中的任一者，和/或

·编码以上两个项目点中的蛋白质的任何核酸

和关于如何使用组分套装的说明书。

本发明还涉及一种组分套装，其包含；

·本文所述的任何疫苗组合物和/或

·TDO蛋白或其功能同源物和/或

·如本文所述的TDO的免疫原活性肽片段、其功能同源物和/或衍生自其中的肽中的任一者，和/或

·编码以上两个两个项目点中的蛋白质的任何核酸

和第二活性成分。

优选地，根据待治疗的临床病症如此选择第二活性成分选，从而在待治疗癌症的情况下，第二活性成分例如选自如上文所列的化疗药。同样地，如果治疗微生物感染/病毒性感染，第二活性成分优选地是抗生素和/或抗病毒药。

组分套装的组分优选地包含于单独的组合物中，然而处于本发明的范围内的是：组分套装的组分均全包含于相同组合物内部。组分套装的组分因此可以同时施用或以任何顺序依次地施用。

序列表

实施例

本发明由以下实施例进一步说明，然而这些实施例不应当解释为限制本发明。

实施例1

在这个实施例中，公开了产生T细胞反应性的不同TDO衍生表位。另外，还描述了健康供体和癌症患者中CD8+和CD4+T细胞介导对TDO的自发反应性。然而有意义地，TDO特异性T细胞的表型在健康个体和恶性疾病患者之间变动。

物质和方法

患者

从黑素瘤(MM)患者、乳腺癌(BC)患者和健康供体(HD)采集外周血单核细胞(PBMC)。对于癌症患者，在抽血和任何种类的抗癌治疗之间存在至少4周间隔时间。使用Lymphoprep分离法分离PBMC、进行HLA-分型(丹麦哥本哈根大学医院临床免疫学部)并在含有10％二甲基亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich，丹麦)的胎牛血清(FCS)(Gibco，Naerum，丹麦)中冷冻。在这些测量的任一者之前，从患者获得书面知情同意书。方案由丹麦首都区科学伦理委员会批准并根据赫尔辛基宣言条款实施。HD PBMC从州医院血库获得。

肿瘤细胞系

细胞系FM-55M1和FM-86由EST-DAB提供(http://www.medizin.uni-tuebingen.de/estdab/)，A2058和MDA-MB231从ATCC(www.ATCC.org)获得，UK-1(Zeeberg等人,2013)是来自W.Fiedler(Eppedorf大学医院，汉堡，德国)的友好馈赠。全部细胞系均在供应10％FCS(Gibco)的RPMI 1640(Gibco)中维持。

肽

通过使用公开获得的数据库SYFPEITHI筛选TDO氨基酸序列的受限于HLA-A2的可能表位。选出并由TAG Copenhagen(哥本哈根，丹麦)合成15种肽。根据制造商的推荐，一旦冻干的肽溶解于水或DMSO(Sigma-Aldrich)中，则将它们按等分试样贮存在-20℃，避免冻融循环。肽是TDO40-48(LIYGNYLHL)(SEQ ID NO:5)、TDO65-74(KIHDEHLFII)(SEQ ID NO:7))、TDO72-81(FIITHQAYEL)(SEQ ID NO:4)、TDO85-93(QILWELDSV)(SEQ ID NO:10)、TDO123-132(KLLVQQFSIL)(SEQ ID NO:6)、TDO130-138(SILETMTAL)(SEQ ID NO:11)、TDO159-168(RLLENKIGVL)(SEQ ID NO:2)、TDO192-201(LLKSEQEKTL)(SEQ ID NO:8)、TDO200-208(TLLELVEAWL)(SEQ ID NO:3)、TDO225-234(KLEKNITRGL)(SEQ ID NO:14)、TDO276-284(LLSKGERRL)(SEQ ID NO:12)、TDO309-317(QLLTSLMDI)(SEQ ID NO:9)、TDO364-372(DLFNLSTYL)(SEQ ID NO:13)、TDO372-381(LIPRHWIPKM)(SEQ ID NO:15)和TDO380-389(KMNPTIHKFL)(SEQ ID NO:16)。对于阴性对照和阳性对照，分别使用HIV衍生肽HIVpol_468-476(ILKEPVHGV)(SEQ ID NO:19)和CMV pp65_495-503(NLVPMVATV)(SEQ ID NO:20)。另外，分别合成包含TDO_123-132和TDO_309-317的较长肽(20个氨基酸)。这些肽命名为TDO_118-137(VSVILKLLVQQFSILETMTA)(SEQ ID NO:17)和TDO_303-322(RFQVPFQLLTSLMDIDSLMT)(SEQ IDNO:18)并且均包括几个潜在的II类限制性表位，如预测算法SYFPEITHI建议那样。

HLA肽交换技术和MHC ELISA

通过如先前所描述的UV交换方法联合夹心ELISA测量HLA-肽亲和力(Toebes等人,2006)。简而言之，将HLA-A2轻链和重链在大肠杆菌中产生并且与UV-敏感配体一起再折叠。这种条件性配体在1小时紫外线暴露时遭剪切并以目的肽置换。在添加HLA-A2-肽复合物至ELISA后，以吸光度测量复合物的亲和力。使用对HLA-A2具有明确描述的高亲和力的两种肽(HIVpol_468-476和CMV pp65_495-503)作为阳性对照肽，而使用无肽置换的样品作为阴性对照。一式四份产生阳性对照并且一式三份产生TDO肽。

ELISPOT测定法

在本研究中，ELISPOT根据CIP提供的指南进行(http://cimt.eu/cimt/files/dl/cip_guidelines.pdf)。如先前所描述那样，将ELISPOT测定法用来量化释放细胞因子(IFNγ、TNFα、IL-17A或IL-10)的肽表位特异性效应细胞(等人,2012)。在一些实验中，将PBMC在分析之前在体外用肽刺激一次。在一些实验中，添加10⁴个自体DC至各孔作为抗原呈递细胞。使用ImmunoSpot系列2.0分析仪(C.T.L.-Europe，波恩，德国)计数点。在一些实验中，遵循制造商的说明通过EasySep人CD4⁺T细胞富集试剂盒(Stem Celltechnologies，Grenoble，法国)，分离CD4⁺细胞。这产生了高纯度的培养物(>97％CD4⁺)，这通过用如下文描述的用于胞内细胞因子染色(ICS)和流式细胞术(FCM)的表面抗体染色证实。

ELISPOT响应的定义是实证性方案或统计方案。实证性方案基于“信噪比”并且表明定义响应的阈值应当定义为>6个特异性点/10⁵个PBMC。在图6中，我们已经将这个阈值增加至>40个特异性点/5x10⁵个PBMC。非参数分布不拘再抽样(DFR)方法允许统计比较抗原刺激孔和阴性对照孔，如图8中示例。在患者组和健康供体组之间通过Mann-Whitney检验，比较响应于TDO_118-137或TDO_303-322的给定细胞因子的释放。P值<0.05视为显著。

TDO特异性T细胞系的产生

通过使PBMC在RPMI 1640(Gibco)中贴附于孔的塑料表面1小时，然后移除非贴壁细胞产生DC。将贴壁细胞在补充有5％人AB血清(Sigma-Aldrich)的X-vivo15(Lonza，哥本哈根，丹麦)中用1000U/ml GM-CSF(PeproTech,伦敦,UK)和250U/ml IL-4(Peprotech)在37℃、5％CO₂和增湿环境下处理。在第6日，添加由各为1000U/ml的TNFα、IL-1β和IL-6以及1μg/ml PGE2(Peprotech)组成的成熟混合物添加至细胞。在第8日，将成熟DC收获，在培养箱中用X-vivo15(Lonza)中的100μM TDO肽加载4小时。在洗涤后，加载肽的DC与自体PBL在补充有5％人AB血清(Sigma-Aldrich)的X-vivo15(Lonza)中混合。次日，分别添加IL-12和IL-7(Peprotech)至终浓度20U/ml和40U/ml。以这种方式刺激培养物2次，间隔7天。另外，使用经照射(25Gy)的加载100μM TDO肽的自体PBL进行刺激。在用PBL刺激后当日，向培养物补充IL-2(PROLEUKIN；Novartis，哥本哈根，丹麦)至终浓度40U/ml。

FCM和细胞分选

将加载肽的MHC四聚体用2.5μl每种藻红蛋白(PE)染色。将不多于2x10⁶个T细胞染色，并且使用加载TDO肽或HIVpol_468-476肽(作为阴性对照)的别藻蓝蛋白(APC)缀合的四聚体。染色在培养箱中于补充有2％FCS(Gibco)的50μl PBS(Lonza)中进行15分钟。随后，直接添加由αCD3-AmCyan、αCD4-Fitc(BD Bioscience，Albertslund，丹麦)、αCD8-Pacific Blue(DAKO，Glostrup，丹麦)和近IR死细胞染色试剂盒(Life technologies，Naerum，丹麦)组成的抗体混合物，并且将细胞置于4℃黑暗下持续30分钟。在补充有2％FCS(Gibco)的PBS(Lonza)中洗涤后，通过FACS Aria(BD Biosciences)分选四聚体阳性CD8+细胞。

将TDO特异性CD4⁺T细胞用X-vivo15培养基(Lonza)中的5μM TDO_303-322刺激，并且使用MACSIFN分泌分析-检测试剂盒(PE)(Miltenyi Biotec，Lund，瑞典)检测分泌IFNγ的细胞。随后通过FACS Aria(BD Biosciences)，将PE阳性细胞分选成10⁴个照射(30Gy)的自体PBMC。

快速扩充方案(REP)

分选的特异性T细胞的快速扩充如下进行：将细胞在补充有5％人血清(Sigma-Aldrich)和6000U/ml IL-2(proleukin；Novartis)的X-vivo15(Lonza)中在37℃、5％CO₂静置过夜。次日，制备饲养细胞：将源自三位健康供体的总计20*10⁶个PBL照射(25Gy)、洗涤并且按比率1:1:1在含有5％人血清(Sigma-Aldrich)的2ml X-vivo15(Lonza)中混合。在两小时后，在20ml培养基中将样品细胞与饲养细胞混合并添加IL-2(Novartis)至终浓度6000U/ml，同时添加αCD3ab OKT3(ebioscience，法兰克福，德国)至终浓度30ng/ml。每3-4天，调节细胞数目至最大值5*10⁵个细胞/ml并且添加新鲜IL-2(Novartis)至6000U/ml。

胞内细胞因子染色(ICS)

在培养箱中在GolgiPlug(1:1000稀释，BD Biosciences)存在下，将PBMC用5μM相关肽或对照肽刺激5小时。随后，将细胞在补充有2％FCS(Gibco)的PBS(Lonza)中洗涤2次并且用如细胞分选所述的表面抗体染色。在含2％FCS(Gibco)的PBS(Lonza)中洗涤细胞后，将细胞用固定/透化缓冲液(ebioscience)固定并透化至少30分钟，洗涤2次并且随后用对IFN-PE(BD Biosciences)和TNFα-APC(ebioscience)特异的抗体染色。在FACS Canto II流式细胞仪上记录至少50,000个CD4+T细胞，并且用Diva软件包(BD Biosciences)分析数据。

细胞毒性测定

使用常规的铬释放测定法如所述那样，评价所产生T细胞系的细胞毒能力的评估结果。简而言之，将靶肿瘤细胞系用补充有10％FCS(Gibco)的100μl RPMI 1640(Gibco)中的100μCi ⁵¹Cr(Perkin Elmer，Skovlunde，丹麦)在37℃标记1小时。在洗涤靶细胞后，将它们与效应细胞按不同的效应子:靶(E:T)比率在培养箱中温育4小时。随后，使用γ细胞计数器(Perkin Elmer Wallac Wizard 1470自动γ计数器)，测量上清液中放射性活度的量。

结果

健康供体和癌症患者的外周血中TDO反应性CD8+T细胞的存在

基于明确限定的HLA-结合基序，鉴定出衍生自TDO氨基酸序列的HLA-A2限制型潜在T细胞表位(Rammensee等人,1999)。合成具有最高预测结合亲和力的15种9聚至10聚肽并且它们随后用来借助ELISPOT测定法筛选来自六位癌症患者的PBMC中自发型T细胞反应的存在。这项分析揭示，在一轮体外刺激后存在响应于肽TDO_123-132(KLLVQQFSIL)(SEQ ID NO:6)、TDO_200-208(TLLELVEAWL)(SEQ ID NO:3)、TDO_309-317(QLLTSLMDI)(SEQ ID NO:9)和TDO_364-372(DLFNLSTYL)(SEQ ID NO:13)的产生IFNγ的T细胞(参见图1A)。值得注意地，对于这些肽中的几种，在多于一位患者中检测到T细胞反应。受到这些令人鼓舞的观察结果鼓励，我们使用四种TDO衍生的HLA-A2-限制型T细胞表位分析从14为额外癌症患者获得的PBMC以及从14位健康供体的PBMC中TDO-反应性T细胞的存在；在一轮体外刺激后再次进行分析。如图1中所示，在癌症患者中以及健康供体中均检测到针对全部4种肽的T细胞反应。令人惊讶地，两个组中反应的幅度和频率相似。非参数分布不拘再抽样(DFR)方法允许统计比较抗原刺激孔和阴性对照。补充图1中给出明显响应的例子。另外，直接离体检测到TDO反应性T细胞(参见图8)。

产生和功能性表征TDO特异性CD8+T细胞系

通过引入可溶性肽/MHC复合物，变革特异性CD8+T细胞的检测和表征(Rammensee等人,1999)。为了建立TDO特异性CD8+T细胞系，我们用加载TDO肽TDO_123-132或TDO_309-317的自体树状细胞分别5次或4次反复刺激来自癌症患者的PBMC。这些体外刺激大幅度增加TDO特异性CD8+T细胞的频率，如通过双色四聚体染色所测量(参见图2)。为了借助快速扩充方案(REP)进一步扩充，通过荧光激活的细胞分选法富集TDO_123-132反应性T细胞和TDO_309-317反应性T细胞。在应用REP后，通过四聚体染色证实所得T细胞系的特异性，显示纯度为97.1％和99.6％(参见图2)。对这些T细胞系检验其裂解TAP缺陷型肽脉冲标记的T2细胞或HLA-匹配的表达TDO的肿瘤细胞的能力。如图3A和3B中所示，当T2细胞已经用相同的扩充用TDO肽脉冲标记时，TDO特异性T细胞培养物有效地裂解这些细胞，但不裂解用不相关的不同TDO衍生肽脉冲标记的T2细胞。最重要的，TDO特异性T细胞高效裂解不同组织来源的HLA-A2+癌细胞系，但是不裂解HLA-A2-癌细胞(参见图3C和3D)。对表达TDO的癌细胞系的裂解作用不一致。具体而言，乳腺癌细胞系MDA-MB231遭TDO_123-132特异性T细胞系和TDO_309-317特异性T细胞系杀伤；后一T细胞系显示更高效的杀死作用。在另一方面，HLA-A2+白血病细胞系UKE-1由TDO_123-132特异性T细胞非常有效地裂解，但是仅勉强地由TDO_309-317特异性T细胞裂解。TDO_123-132特异性T细胞不裂解HLA-A2+黑色素瘤细胞系FM-55M1和FM-86，这些细胞系由TDO_309-317特异性T细胞高效裂解。最后，任意一种T细胞系都不裂解HLA-A2-TDO+黑色素瘤细胞系A2058。

免疫细胞的TDO依赖性识别

为了检验TDO-特异性T细胞是否能够识别用TDO mRNA转染的自体成熟DC，产生用TDO mRNA转染的自体DC，之后在ELISPOT中分析。这个实验揭示，TDO_309-317特异性T细胞特异性识别用TDO转染的DC(参见图4A)。

先前已经显示TAP缺陷型细胞系T2非常高效地加工并在HLA-A2的表面上呈递长肽。合成两种20个氨基酸肽，所述肽包括两个最小表位(TDO_123-132(KLLVQQFSIL)(SEQ IDNO:6)和TDO_309-317(QLLTSLMDI)(SEQ ID NO:9)。TDO_118-137(VSV ILK LLV QQF SIL ETM TA)(SEQ ID NO:17)包含表位TDO_123-132并且TDO_303-322(RFQ VPF QLL TSL MDI DSL MT)(SEQ IDNO:18)包含表位TDO_309-317。随后分析T2细胞是否可能交叉呈递这两种长肽。在这个方面，T2细胞以TDO118-137或TDO303-322加载过夜，之后将它们用于标准细胞毒性测定中。如图4B中展示，当加载短肽和相应的长肽时，观察到T2细胞的裂解，即TDO_123-132特异性细胞裂解用TDO_123-132或TDO_118-137肽脉冲标记的T2细胞但是用TDO_309-317或TDO_303-322脉冲标记时不裂解。因此，在T2细胞中HLA-A2背景下摄取并且交叉呈递TDO衍生的长肽。

CD4+T细胞识别TDO

为了进一步检查TDO的免疫原性，我们将两个长肽TDO_118-137和TDO_303-322用于IFNγ、TNFα、IL-10和IL-17A的ELISPOT测定法中(图5中显示结果)。癌症患者和健康供体中均存在肽特异性CD4T细胞反应。就产生IFNγ的CD4+T细胞而言，2个队列之间不存在差异。然而，在健康供体中响应于长TDO肽的产生TNFα的细胞更频繁；对于TDO_118-137，这种差异高度显著(p<0.0001)。响应于肽刺激的IL-10和IL-17的产生限于癌症患者。对于TDO_303-322，这些差异是统计显著的(分别是p＝0.0051和p<0.0001)。

仅由获得自癌症患者的PBMC响应于长TDO肽而释放的IL-17和IL-10产生深刻的免疫调节功能并且已经牵涉癌症患者的临床病程。响应于TDO_303-322长肽产生IL-17A和IL-10的CD4+T细胞的频率与临床病程相关，这揭示了存在产生IL-17和IL-10的细胞对总生存期(OS)的明确影响：与非IL-17A响应者相比，以释放IL-17A的CD4+细胞为特征的患者具有OS改善的趋势(参见图6A)；而具有响应于TDO肽的释放IL-10的CD4+T细胞的患者具有受损的OS(参见图6B)。当比较携有产生IL-17+/IL-10-或IL-17-/IL-10+的T细胞的患者时，这些OS差异甚至更明显。存在响应于TDO_303-322肽的产生IL-17+/IL-10-的细胞的患者具有好得多的生存率(参见图6C)。

本发明公开了TDO是天然T细胞反应的靶，而这种T细胞反应在癌症患者以及健康供体中均可轻易检测。值得注意地，TDO特异性CD4和CD8T细胞反应在健康者和患病者中以相同频率存在。因此，健康供体明显地携带针对自身蛋白TDO的强烈免疫应答。然而，有趣地，TDO特异性CD4+T细胞在健康者和癌症患者中功能特征不同。在健康供体中，TDO特异性CD4+T细胞释放TNFα和IFNγ，但是不释放调节性细胞因子IL-17或IL-10。实际上，如与癌症患者相比，在健康供体中产生TNFα的TDO特异性CD4+T细胞显著更多。这表示TDO并不必然地在健康个体中诱导耐受性。

CD8+和CD4+T细胞可以响应于衍生自免疫抑制分子TDO的表位通过释放细胞因子或甚至通过裂解细胞，产生免疫调节功能。因此，TDO特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞均可以通过抑制由表达TDO的细胞诱导的免疫允许状态，在精细调节免疫应答方面发挥作用。然而，在癌症患者中，CD4+TDO反应性T细胞的表型更复杂：除IFNγ和TNFα之外，细胞还响应于TDO表位产生IL-17和IL-10。IL-17的产生限定了涉及诸多病理学情况(包括自身免疫性和癌症)的CD4+T-辅助细胞(Th17细胞)亚群。值得注意地，已经因促进抗肿瘤免疫力而赋予Th17细胞对抗癌症的保护职能。除IL-17之外，浸润肿瘤的Th17细胞表达其他细胞因子如IFNγ、IL-2和TNF。值得注意地，一些TDO特异性Th17细胞显示出相似的效应子T细胞细胞因子谱。另外，携有TDO特异性IL-17反应的癌症患者显示OS改善趋势。

在另一方面，在癌症患者中，观察到IL-10响应于TDO表位释放。IL-10是一种免疫阻抑性细胞因子，其由Treg连同其他细胞产生。Treg对维持免疫稳态和确保自我抗原耐受性重要。因此，TDO特异性Treg可能增强TDO介导的免疫抑制并因而强化免疫癌细胞的免疫逃逸。因此，具有产生IL-10的TDO反应性CD4+T细胞的患者显示OS受损趋势。携带响应于TDO肽的产生IL-17+/IL-10-或IL-17-/IL-10+的T细胞的患者的OS差异明显。

体外扩充的CD8+TDO-反应性T细胞的功能性表征揭示这些细胞杀伤来源不同的HLA匹配型肿瘤细胞。

参考文献

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序列表

<110> Region Hovedstaden

<120> 包含色氨酸2,3-双加氧酶或其片段的疫苗组合物

<130> P3647PC00

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 406

<212> PRT

<213> 人（homo sapiens）

<400> 1

Met Ser Gly Cys Pro Phe Leu Gly Asn Asn Phe Gly Tyr Thr Phe Lys

1 5 10 15

Lys Leu Pro Val Glu Gly Ser Glu Glu Asp Lys Ser Gln Thr Gly Val

20 25 30

Asn Arg Ala Ser Lys Gly Gly Leu Ile Tyr Gly Asn Tyr Leu His Leu

35 40 45

Glu Lys Val Leu Asn Ala Gln Glu Leu Gln Ser Glu Thr Lys Gly Asn

50 55 60

Lys Ile His Asp Glu His Leu Phe Ile Ile Thr His Gln Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Leu Trp Phe Lys Gln Ile Leu Trp Glu Leu Asp Ser Val Arg Glu Ile

85 90 95

Phe Gln Asn Gly His Val Arg Asp Glu Arg Asn Met Leu Lys Val Val

100 105 110

Ser Arg Met His Arg Val Ser Val Ile Leu Lys Leu Leu Val Gln Gln

115 120 125

Phe Ser Ile Leu Glu Thr Met Thr Ala Leu Asp Phe Asn Asp Phe Arg

130 135 140

Glu Tyr Leu Ser Pro Ala Ser Gly Phe Gln Ser Leu Gln Phe Arg Leu

145 150 155 160

Leu Glu Asn Lys Ile Gly Val Leu Gln Asn Met Arg Val Pro Tyr Asn

165 170 175

Arg Arg His Tyr Arg Asp Asn Phe Lys Gly Glu Glu Asn Glu Leu Leu

180 185 190

Leu Lys Ser Glu Gln Glu Lys Thr Leu Leu Glu Leu Val Glu Ala Trp

195 200 205

Leu Glu Arg Thr Pro Gly Leu Glu Pro His Gly Phe Asn Phe Trp Gly

210 215 220

Lys Leu Glu Lys Asn Ile Thr Arg Gly Leu Glu Glu Glu Phe Ile Arg

225 230 235 240

Ile Gln Ala Lys Glu Glu Ser Glu Glu Lys Glu Glu Gln Val Ala Glu

245 250 255

Phe Gln Lys Gln Lys Glu Val Leu Leu Ser Leu Phe Asp Glu Lys Arg

260 265 270

His Glu His Leu Leu Ser Lys Gly Glu Arg Arg Leu Ser Tyr Arg Ala

275 280 285

Leu Gln Gly Ala Leu Met Ile Tyr Phe Tyr Arg Glu Glu Pro Arg Phe

290 295 300

Gln Val Pro Phe Gln Leu Leu Thr Ser Leu Met Asp Ile Asp Ser Leu

305 310 315 320

Met Thr Lys Trp Arg Tyr Asn His Val Cys Met Val His Arg Met Leu

325 330 335

Gly Ser Lys Ala Gly Thr Gly Gly Ser Ser Gly Tyr His Tyr Leu Arg

340 345 350

Ser Thr Val Ser Asp Arg Tyr Lys Val Phe Val Asp Leu Phe Asn Leu

355 360 365

Ser Thr Tyr Leu Ile Pro Arg His Trp Ile Pro Lys Met Asn Pro Thr

370 375 380

Ile His Lys Phe Leu Tyr Thr Ala Glu Tyr Cys Asp Ser Ser Tyr Phe

385 390 395 400

Ser Ser Asp Glu Ser Asp

405

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 2

Arg Leu Leu Glu Asn Lys Ile Gly Val Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 3

Thr Leu Leu Glu Leu Val Glu Ala Trp Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 4

Phe Ile Ile Thr His Gln Ala Tyr Glu Leu

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 5

Leu Ile Tyr Gly Asn Tyr Leu His Leu

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 6

Lys Leu Leu Val Gln Gln Phe Ser Ile Leu

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 7

Lys Ile His Asp Glu His Leu Phe Ile Ile

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 8

Leu Leu Lys Ser Glu Gln Glu Lys Thr Leu

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 9

Gln Leu Leu Thr Ser Leu Met Asp Ile

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 10

Gln Ile Leu Trp Glu Leu Asp Ser Val

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 11

Ser Ile Leu Glu Thr Met Thr Ala Leu

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 12

Leu Leu Ser Lys Gly Glu Arg Arg Leu

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 13

Asp Leu Phe Asn Leu Ser Thr Tyr Leu

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 14

Lys Leu Glu Lys Asn Ile Thr Arg Gly Leu

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 15

Leu Ile Pro Arg His Trp Ile Pro Lys Met

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 16

Lys Met Asn Pro Thr Ile His Lys Phe Leu

1 5 10

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 17

Val Ser Val Ile Leu Lys Leu Leu Val Gln Gln Phe Ser Ile Leu Glu

1 5 10 15

Thr Met Thr Ala

20

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TDO的肽片段

<400> 18

Arg Phe Gln Val Pro Phe Gln Leu Leu Thr Ser Leu Met Asp Ile Asp

1 5 10 15

Ser Leu Met Thr

20

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HIVpol的肽片段

<400> 19

Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CMV pp65的肽片段

<400> 20

Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val

1 5

Claims (81)

1.一种疫苗组合物，其包含

a)以下一者或多者：

(i)SEQ ID NO:1的色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)；

(ii)TDO的免疫原活性肽片段，包含SEQ ID NO:1的TDO的连续氨基酸序列；

(iii)TDO的免疫原活性肽片段，其是MHC I类限制型肽片段或MHC II类限制型肽片段；

(iv)(i)、(ii)或(iii)的多肽的功能同源物，其中所述功能同源物与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性和/或所述功能同源物是由除了已经置换最多三个氨基酸外与SEQ IDNO:1的连续氨基酸序列相同的序列组成的免疫原活性多肽；

(v)多肽，包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)的任意多肽；

(vi)编码1)、2)、3)和4)的任意多肽的核酸；和

b)佐剂

用作药物。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含SEQ ID NO:1的突变型TDO或其免疫原活性肽片段，其中氨基酸144、151、328和/或342中一者或多者已经突变成另一个氨基酸或缺失。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的疫苗组合物，其中所述免疫原活性肽片段由5至50个氨基酸的连续序列组成。

4.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述免疫原活性肽片段是

a)SEQ ID NO:1的8至11个氨基酸的连续序列，和/或

b)SEQ ID NO:1的18至30个氨基酸的连续序列，或

c)a)或b)的功能同源物，其中已经置换最多两个氨基酸。

5.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中当施用至患有以TDO表达为特征的临床病症的个体时，所述疫苗组合物能够激发针对表达SEQ ID NO:1的TDO或与其具有至少70％序列同一性的功能同源物的癌和/或抗原呈递细胞的免疫应答。

6.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在个体中激发细胞免疫应答。

7.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在个体中激发特异性识别表达TDO的细胞的细胞免疫应答。

8.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述药物用于治疗或预防癌症。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的疫苗组合物，其中所述药物用于治疗感染。

10.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，包含具有至少一个以下特征的MHCI类限制型肽：

a)如通过ELISPOT测定法所测定，能够在患有临床病症的个体的PBL群体中以至少1/10⁴个PBL的频率激发产生INF-γ的细胞，和/或

b)能够在肿瘤组织中原位检测与所述表位肽反应的CTL，

c)能够在体外诱导TDO特异性T细胞的生长。

11.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，包含受MHC I类分子限制的肽片段。

12.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，包含受MHC II类分子限制的肽片段。

13.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，包含肽片段，所述肽片段能够在患有临床病症的个体的PBL群体中以至少10/10⁴个PBL的频率激发产生INF-γ的细胞。

14.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，包含肽片段，所述肽片段能够在患有临床病症的个体的PBL群体中激发产生INF-γ的细胞，其中在所述临床病症表达SEQ IDNO:1的TDO或其与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的功能同源物。

15.根据权利要求8和10至14中任一项所述的疫苗组合物，其中所述癌症疾病是形成肿瘤的癌症疾病。

16.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述肽片段由最多50个氨基酸残基，例如最多45个氨基酸残基，如最多40个氨基酸残基，例如最多35个氨基酸残基，如最多30个氨基酸残基，例如最多25个氨基酸残基，如20至25个氨基酸残基组成。

17.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述肽片段由最多20个氨基酸残基，例如最多19个氨基酸残基，如最多18个氨基酸残基，例如最多17个氨基酸残基，如最多16个氨基酸残基，例如最多15个氨基酸残基，如最多14个氨基酸残基，例如最多13个氨基酸残基，如最多12个氨基酸残基，例如最多11个氨基酸残基，如8至10个氨基酸残基组成。

18.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述肽片段选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和前述任一者的功能同源物，所述功能同源物是除了已经置换最多三个氨基酸之外具有相同序列的多肽。

19.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述肽片段是SEQ ID NO:6和/或9。

20.根据权利要求1至17中任一项所述的疫苗组合物，其中所述肽片段是SEQ ID NO:17和/或18。

21.根据权利要求1至15中任一项所述的疫苗组合物，其中所述多肽是包含SEQ ID NO:1的连续氨基酸序列的最多100个氨基酸，如最多80个氨基酸，例如最多60个氨基酸，如最多40个氨基酸，例如最多30个氨基酸的多肽。

22.根据权利要求1至16中任一项所述的疫苗组合物，其中所述多肽是包含SEQ ID NO:1的连续氨基酸序列的最多20个氨基酸，例如最多15个氨基酸的多肽。

23.根据权利要求1至15中任一项所述的疫苗组合物，其中所述多肽是除了可以置换多达三个氨基酸之外SEQ ID NO:1的最多100个连续氨基酸，如最多80个连续氨基酸，例如最多60个连续氨基酸，如最多40个连续氨基酸，例如最多30个连续氨基酸，如最多20个连续氨基酸，例如最多15个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的序列。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的疫苗组合物，其中所述连续氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13和前述任一者的功能同源物，所述功能同源物是除了已经置换最多三个氨基酸之外具有相同序列的多肽。

25.根据权利要求21所述的疫苗组合物，其中所述连续氨基酸序列选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和前述任一者的功能同源物，所述功能同源物是除了已经置换最多三个氨基酸之外具有相同序列的多肽。

26.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗在接种的个体中激发调节性T细胞的产生，所述调节性T细胞具有针对表达TDO的癌细胞和/或表达TDO的抗原呈递细胞的细胞毒效应。

27.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在受试者中激发临床响应，其中所述临床响应以稳定的病情、部分响应或完全缓解为特征。

28.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，还包含选自不是TDO的蛋白质或肽片段中的免疫原活性蛋白质或肽片段。

29.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂和咪唑并喹啉。

30.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是Montanide ISA佐剂。

31.根据权利要求28所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是Montanide ISA 51或Montanide ISA 720。

32.根据权利要求30所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是Montanide ISA 51。

33.根据权利要求1至29中任一项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是GM-CSF。

34.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含所述免疫原活性肽片段或编码所述免疫原活性肽片段的核酸。

35.根据权利要求34所述的疫苗组合物，其中所述抗原呈递细胞是树状细胞。

36.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述核酸编码权利要求2至4和10至25中任一项所限定的肽。

37.根据权利要求1或36中任一项所述的疫苗组合物，其中所述核酸包含于载体内部。

38.根据权利要求37所述的疫苗组合物，其中所述载体选自病毒载体和细菌载体。

39.根据权利要求37或38中任一项所述的疫苗组合物，其中所述载体另外包含编码T细胞刺激性多肽的核酸。

40.根据权利要求1至39中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物用于治疗其中表达TDO的癌症疾病。

41.根据权利要求1至39中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物用于治疗在APC中引起TDO表达的炎症。

42.组分套装，包含根据权利要求1至39中任一项所述的疫苗组合物和第二活性成分。

43.根据权利要求42所述的包含疫苗组合物的组分套装，其中所述第二活性成分是免疫刺激性组合物。

44.根据权利要求42或43中任一项所述的组分套装，其中所述其他免疫刺激性组合物包含一种或多种白介素。

45.根据权利要求42至44中任一项所述的组分套装，其中所述白介素选自IL-2和或IL-21。

46.组分套装，包含根据权利要求1至39中任一项所述的疫苗组合物，其中第二活性成分是抗癌药。

47.根据权利要求46所述的组分套装，其中所述抗癌药是化疗药。

48.根据权利要求46或47中任一项所述的组分套装，其中所述化疗药选自：辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、佐柔比星、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、依立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仓、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、雷利米得、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

49.组分套装，包含根据权利要求1至39中任一项所述的疫苗组合物，其中所述第二活性成分是抗生素。

50.根据权利要求49所述的包含疫苗组合物的组分套装，其中所述抗生素是阿莫西林、青霉素、阿昔洛韦和/或阿糖腺苷。

51.根据权利要求42至50中任一项所述的组分套装，其中同时或依次地施用所提供的组合物。

52.用于患有临床病症的个体中离体或原位诊断PBL中或肿瘤组织中与TDO反应的T细胞存在的组合物，所述组合物包含根据权利要求1至4和10至25中任一项所限定的肽片段。

53.用于患有临床病症的个体中离体或原位诊断PBL中或肿瘤组织中与TDO反应的T细胞存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至4和10至25中任一项所限定的肽片段。

54.根据权利要求1至4和10至25中任一项所限定的肽片段和HLA I类或HLA II类分子或此类分子的片段的复合物。

55.根据权利要求54所述的复合物，其是单聚的。

56.根据权利要求54所述的复合物，其是多聚的。

57.在患有临床病症的个体中检测TDO反应性T细胞存在方法，所述方法包括使肿瘤组织或血液样品与根据权利要求52所述的复合物接触并且检测所述复合物与所述组织或血细胞的结合。

58.能够与权利要求1至4和10至25中任一项所限定的肽片段特异性结合的分子。

59.根据权利要求58所述的分子，其是抗体或其片段。

60.根据权利要求58或59中任一项所述的分子，其中所述分子是T细胞受体。

61.能够阻断权利要求58至60所述的分子的结合作用的分子。

62.治疗以表达TDO为特征的临床病症或降低获得所述临床病症的风险的方法，所述方法包括向患有所述临床病症的个体施用有效量的根据权利要求1至39中任一项所述的组合物、根据权利要求58至61中任一项所述的分子或根据权利要求42至51中任一项所述的组分套装。

63.根据权利要求62所述的方法，其中待治疗的所述临床病症是其中表达TDO的癌症疾病。

64.根据权利要求62所述的方法，其与其他癌症疗法组合。

65.根据权利要求64所述的方法，其中其他疗法选自化疗、放疗、用免疫刺激物质治疗、基因治疗、用抗体治疗和使用树状细胞治疗。

66.根据权利要求62所述的方法，其中待治疗的所述临床病症是在APC中引起TDO表达的感染。

67.根据权利要求66所述的方法，其与对抗所述感染的其他疗法组合。

68.根据权利要求67所述的方法，其中其他疗法选自化疗、用免疫刺激物质治疗、基因治疗、用抗体治疗和使用树状细胞治疗。

69.根据权利要求62至68中任一项所述的方法，其中TDO或TDO的免疫原活性肽片段按每位个体50μg至500μg、例如80μg至300μg、如100μg至250μg的剂量施用，其中所述个体优选地是人。

70.权利要求1至39中任一项所述的疫苗组合物、权利要求42至50中任一项所述的组分套装或权利要求58至61中任一项所述的分子在制造用于治疗或预防临床病症的药物中的用途。

71.根据权利要求70所述的用途，其中待治疗疾病是其中表达TDO的癌症疾病。

72.根据权利要求70或71中任一项所述的用途，其与其他癌症疗法组合。

73.根据权利要求72所述的用途，其中所述其他疗法选自化疗、放疗、用免疫刺激物质治疗、基因治疗、用抗体治疗和使用树状细胞治疗。

74.根据权利要求70所述的用途，其中待治疗的临床病症是在APC中引起TDO表达的感染。

75.根据权利要求74所述的用途，其与对抗所述感染的其他疗法组合。

76.根据权利要求74所述的用途，其中所述其他疗法选自化疗、用免疫刺激物质治疗、基因治疗、用抗体治疗和使用树状细胞治疗。

77.监测免疫接种的方法，所述方法包括步骤

a)提供来自个体的血液样品，

b)提供SEQ ID NO:1的TDO或者与其具有至少70％同一性的功能同源物，或者包含所述TDO或其所述功能同源物的连续序列的免疫原活性肽片段，或者编码所述TDO或所述肽片段的核酸，

c)确定所述血液样品是否包含与所述蛋白质或肽特异性结合的抗体或包含与所述蛋白质或肽特异性结合的T细胞受体的T细胞，

d)因而确定在所述个体中是否已经产生针对所述蛋白质或肽的免疫应答。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述肽片段是如权利要求1至4和10至25中任一项所限定的肽片段。

79.免疫原活性TDO肽片段，或编码所述TDO肽片段的核酸，用于治疗或预防与TDO表达相关的临床病症如癌症和/或炎症，其中，所述免疫原活性TDO肽片段包含SEQ ID NO:1的TDO或其功能同源物的连续序列，所述功能同源物是除了已经置换最多三个氨基酸之外具有相同序列的多肽。

80.根据权利要求79所述的肽片段，其中所述肽片段如权利要求2至4和10至25中任一项所限定。

81.根据权利要求79和80中任一项所述的肽片段，用于治疗或预防癌症。