ES2891902T9 - Composiciones de vacuna que comprenden triptófano 2,3-dioxigenasa o fragmentos de la misma - Google Patents

Composiciones de vacuna que comprenden triptófano 2,3-dioxigenasa o fragmentos de la misma Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de vacuna que comprenden triptófano 2,3-dioxigenasa o fragmentos de la misma
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la proteína triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) y, en particular, a fragmentos peptídicos de la misma que son capaces de provocar respuestas inmunitarias contra el cáncer.
Antecedentes de la invención
El sistema inmunitario está estrictamente controlado para evitar la aparición de autoinmunidad al responder a varios patógenos. Esta enantiostasis, que permite al mismo tiempo la destrucción de células infectadas o transformadas y la auto-tolerancia, está protegida por varios mecanismos de retroalimentación. Desafortunadamente, algunos de los mecanismos que evitan la autoinmunidad son secuestrados por los cánceres para lograr un escape inmunitario. Esta evasión de la destrucción inmunitaria se basa en varios mecanismos, incluido el agotamiento de los nutrientes esenciales y la acumulación de metabolitos inmunosupresores. Por lo tanto, los cambios metabólicos dentro del microambiente del tumor ayudan a eludir las respuestas inmunitarias específicas antigénicas. En este sentido, se han descrito anomalías del metabolismo del aminoácido esencial L-triptófano en varios cánceres. Es notable que el control del nivel de triptófano sea una parte importante de la defensa del hospedador contra patógenos invasores, ya que los microbios necesitan elevadas concentraciones de triptófano disponible para un crecimiento óptimo.
La degradación de L-(y D-) triptófano a N-formilquinurenina se cataliza mediante las hemo dioxigenasas triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) e indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO). La TDO y la IDO no comparten homología de secuencia. Aunque por distintos mecanismos, tanto la TDO como la IDO catalizan la primera etapa limitante de la velocidad de la oxidación del triptófano produciendo quinurenina. Además, como la IDO está regulada positivamente por citocinas inflamatorias tales como los interferones de tipo I y II, se cree que es una enzima contrarreguladora importante, que controla respuestas inmunitarias desproporcionadas.
El impacto del metabolismo del triptófano en las respuestas inmunitarias está bien establecido. Los linfocitos T detectan niveles bajos de triptófano a través de la serina/treonina-proteína cinasa GCN2, que, a continuación, desencadena una parada proliferativa. Además, el producto de degradación del triptófano, la quinurenina, se une al receptor de hidrocarburo de arilo (AHR, del inglés "aryl hydrocarbon receptor"); la activación de la señalización del AHR induce la formación de linfocitos T reguladores.
Se sabe poco sobre la función de la TDO en el cáncer. En condiciones fisiológicas, la TDO se expresa casi exclusivamente en grandes cantidades en el hígado y, en niveles más bajos, en el cerebro. Recientemente, se describió que tumores de diferente origen expresan TDO, especialmente el melanoma, el cáncer de vejiga, el carcinoma hepatocelular y el glioblastoma (Pilotte et al., 2012). En una serie de 104 líneas de células tumorales humanas de varios tipos histológicos, 20 tumores expresaron solo TDO, 17 solo IDO y 16 ambas enzimas (Pilotte et al., 2012). Además, en modelos preclínicos, la expresión de TDO por parte de los tumores evitó su rechazo por parte de los ratones inmunizados (Pilotte et al., 2012). Pantouris et al. (2014) describen formulaciones anticáncer contra la TDO.
Sumario de la invención
La expresión de la TDO y la posible inmunosupresión del cáncer inducida por la TDO plantean un problema en el tratamiento del cáncer. Este problema puede resolverse con péptidos y composiciones capaces de activar linfocitos T específicos de la TDO, que reconoce células que expresan la TDO.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona materiales y métodos para el tratamiento de enfermedades cancerosas mediante el direccionamiento a células cancerosas que expresan la TDO y mediante la destrucción de células cancerosas que expresan la TDO. Esto se hace permitiendo que los linfocitos T reconozcan las células que expresan la TDO. Cabe destacar que, la presente invención divulga que se pueden generar respuestas inmunitarias citotóxicas contra las células que expresan la TDO incluso aunque las células que expresan la TDO puedan antagonizar los efectos deseados de otros enfoques inmunoterapéuticos.
De manera análoga, en el presente documento se divulgan materiales y métodos para el tratamiento de otras enfermedades, que normalmente pueden hacer aparecer una respuesta inmunitaria, por ejemplo, infecciones. En los métodos de la divulgación, los linfocitos T están capacitados para destruir las APC/CD que expresan la TDO.
Por lo tanto, la divulgación aprovecha la expresión de la enzima inmunosupresora TDO en células cancerosas y se dirige a estas células que expresan la TDO.
Cabe destacar que, la presente divulgación demuestra que los linfocitos T que reconocen de manera específica la TDO se pueden encontrar en individuos sanos (véase el ejemplo 1 a continuación). Esto indica una pérdida de tolerancia a la autoproteína TDO. La invención aprovecha esta pérdida de tolerancia a la TDO y, por tanto, un aspecto de la invención es proporcionar composiciones de vacuna que, de manera sorprendente, pueden generar una respuesta inmunitaria contra la autoproteína TDO.
La presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que consiste en como máximo 40 aminoácidos consecutivos de la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) de SEQ ID NO: 1, en donde el fragmento peptídico inmunogénicamente activo comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO: 3 (TDO200-208);
b) SEQ ID NO: 6 (TDO123-132);
c) SEQ ID NO: 9 (TDO309-317);
d) SEQ ID NO: 13 (TDO364-372);
e) SEQ ID NO: 17 (TDO118-137);
f) SEQ ID NO: 18 (TDO303-322); y
g) un homólogo funcional del polipéptido de acuerdo con cualquiera de a) a f); siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos;
para su uso como medicamento, y que también puede comprender un adyuvante.
Las composiciones de vacuna se pueden utilizar como un medicamento y, por ejemplo, pueden ser para el tratamiento de una enfermedad cancerosa en la que se expresa la TDO o para el tratamiento de una infección que causa la expresión de la TDO en APC.
La invención también proporciona un kit de piezas que comprende la composición de vacuna y un segundo principio activo.
La invención también proporciona un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que comprende una secuencia consecutiva de la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma, siendo dicho homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, en donde el fragmento peptídico es como se define en la composición de vacuna de la invención anterior. La invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo. La invención también proporciona dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo para su uso en el tratamiento o prevención de afecciones clínicas asociadas con la expresión de la TDO, tales como cáncer y/o inflamación.
También se divulgan composiciones para diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un individuo que padece una afección clínica de linfocitos T en PBL o en tejido tumoral reactivo con la TDO, comprendiendo la composición un fragmento peptídico de la TDO, por ejemplo, cualquiera de los fragmentos peptídicos de la TDO descritos en el presente documento a continuación en las secciones "Fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO", "Polipéptido que comprende la TDO o un fragmento de la misma" y "MHC".
También se divulgan kits de diagnóstico para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un individuo que padece una afección clínica de linfocitos T en PBL o en tejido tumoral reactivo con la TDO, comprendiendo el kit un fragmento peptídico de la TDO, por ejemplo, cualquiera de los fragmentos peptídicos de la TDO descritos en el presente documento a continuación en las secciones "Fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO", "Polipéptido que comprende la TDO o un fragmento de la misma" y "MHC".
También se describen complejos de un fragmento peptídico de la TDO y una molécula de HLA de clase I o HLA de clase II o un fragmento de dicha molécula. Dicho fragmento peptídico puede ser, por ejemplo, cualquiera de los fragmentos de péptido de la TDO descritos en el presente documento a continuación en las secciones "Fragmento peptídico de inmunogénicamente activo la TDO", "Polipéptido que comprende la TDO o un fragmento de la misma" y "MHC".
En el presente documento se divulgan además métodos para detectar en un individuo que padece una afección clínica la presencia de linfocitos T reactivos a la TDO, comprendiendo el método poner en contacto un tejido tumoral o una muestra de sangre con el complejo que comprende fragmentos peptídicos de la TDO descritos anteriormente y detectar la unión del complejo al tejido o las células sanguíneas.
También se divulgan moléculas que son capaces de unirse de manera específica a un fragmento peptídico de la TDO, por ejemplo, cualquiera de los fragmentos de péptido de la TDO descritos en el presente documento a continuación en las secciones "Fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO", "Polipéptido que comprende la TDO o un fragmento de la misma" y "MHC".
También se divulgan métodos para tratar una afección clínica caracterizada por la expresión de la TDO, comprendiendo el método administrar a un individuo que padece dicha afección clínica una cantidad eficaz de las composiciones de vacuna de la invención, de un kit de piezas de la invención, de una composición de la invención y/o de un fragmento peptídico hipnogénicamente activo de la TDO, por ejemplo, cualquiera de los fragmentos peptídicos de la TDO descritos en el presente documento a continuación en las secciones "Fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO", "Polipéptido que comprende la TDO o un fragmento de la misma" y "m Hc ".
También se divulga el uso de las composiciones de vacuna de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una afección clínica, por ejemplo, cáncer y/o inflamaciones.
También se divulgan métodos para controlar la inmunización, comprendiendo dicho método las etapas de
c) proporcionar una muestra de sangre de un individuo
d) proporcionar la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que tiene al menos un 70 % de identidad con la misma o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que comprende una secuencia consecutiva de dicha TDO o dicho homólogo funcional de la misma o un ácido nucleico que codifica dicha TDO o dicho fragmento peptídico.
e) determinar si dicha muestra de sangre comprende anticuerpos o linfocitos T que comprenden receptores de linfocitos T que se unen de manera específica a la proteína o péptido
f) determinar de ese modo si se ha producido una respuesta inmunitaria a dicha proteína o péptido en dicho individuo.
Además, se divulgan fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO que comprenden una secuencia consecutiva de la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma, siendo dicho homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento peptídico de la TDO para su uso en el tratamiento o prevención de afecciones clínicas asociadas con la expresión de la TDO, tales como cáncer y/o infecciones.
Descripción de los dibujos
En la figura 1 se muestran respuestas naturales de los linfocitos T contra la TDO. (A), Para detectar respuestas de los linfocitos T CD8+ específicas de la TDO, se sintetizaron 15 epítopos de linfocitos T restringidos a HLA-A2 previstos para examinar las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de seis pacientes con cáncer HLA-A2+. Las muestras de PBMC se estimularon una vez in vitro con péptido e IL-2 durante una semana antes de colocarlas en placas en un ensayo ELISPOT de IFNy a 5 * 105 células por pocillo por triplicado con o sin un péptido TDO relevante. Se calculó el número medio de células específicas de la TDO que liberan IFNy por 5 * 105 PBMC. Se examinaron las respuestas del ELISPOT de IFNy contra TDO123-132 (KlLVQQFSIL) en 14 pacientes con cáncer y 14 donantes sanos. Los linfocitos T se estimularon una vez con péptido antes de ser colocados en placas en un ensayo ELISPOT de IFNy a 3 * 105 células por pocillo por triplicado con el TDO123-132 (B), TDO200-208 (D), TDO309-317 (F), TDO364-372 (H), o un péptido de control negativo (VIHpo|476-484 (ILKEPVHGV)). Los gráficos de puntos designan el recuento de puntos medio de pocillos positivos por triplicado con la resta del fondo. Ejemplos de experimentos ELISPOT contra TDO123-132 (C), TDO200-208 (E), TDO309-317 (G), TDO364-372 (I), y VIHpol476-484 en PBMC de diferentes pacientes con cáncer o donantes sanos.
En la figura 2 se muestra la expansión de los linfocitos T CD8+ específicos de la TDO. Análisis de tetrámeros de los linfocitos T específicos de la TDO; Ejemplos de linfocitos T CD8+ específicos de TDO123-132-(A) o TDO309-317 (B) entre PBMC de un paciente con cáncer de mama (BC1) visualizadas mediante tinción por citometría de flujo utilizando los tetrámeros HLA-A2/TDO123-132-PE y HLA-A2/TDO123-132-APC. Las tinciones se realizaron directamente ex vivo (izquierda), después de la estimulación de los péptidos in vitro (medio), y después de la clasificación y expansión de células positivas a tetrámero mediante FACS (derecha).
En la figura 3 se muestra la capacidad citolítica de los linfocitos T específicos de la TDO. (A), La lisis de los linfocitos T2 pulsadas con el péptido TDO123-132 relevante (puntos) o un péptido TDO irrelevante TDO309-317 (cuadrícula) mediante el cultivo de linfocitos T específicos de TDO123-132 examinado por un ensayo de liberación de 51Cr. El eje X indica la relación efector:diana. (B), Lisis mediante linfocitos T específicos de TDO123-132 de las líneas celulares de melanoma HLA-A2+ FM-55M1 y FM-86, la línea celular de cáncer de mama MDA-MB 231, y la línea celular de AML UKE-1 en diferentes proporciones de efector a diana según lo analizado mediante liberación de 51Cr. Además, la línea celular de melanoma A2058 (HLA-A2 negativo) se examinó como control negativo. (C)La lisis de los linfocitos T2 pulsadas con el péptido TDO309-317 relevante (cuadrados) o un péptido TDO irrelevante TDO123-132 (puntos) mediante el cultivo de linfocitos T específicos de TDO309-317 examinado por un ensayo de liberación de 51Cr. (D), Lisis mediante linfocitos T específicos de TDO309-317 de las líneas celulares de melanoma HLA-A2+ FM-55M1 y FM-86, la línea celular de cáncer de mama MDA-MB 231, y la línea celular de AML UKE-1 en diferentes proporciones de efector a diana según lo analizado mediante liberación de 51Cr. Además, la línea celular de melanoma A2058 (HLA-A2 negativo) se examinó como control negativo.
En la figura 4 se muestra A respuestas de ELISPOT contra células dendríticas autólogas transfectadas con ARNm de TDO o simulado, así como pocillos de control con la adición de solo péptidos TDO123-132 o TDO309-317. B citotoxicidad de los cultivos de linfocitos T específicos de TDO123-132 expandidos con IL2 contra linfocitos T2 cargados con TDO123-132, TDO309-317 o los péptidos largos correspondientes TDO118-137 y TDO303-322, respectivamente. Los péptidos cortos se añadieron inmediatamente antes del ensayo y los péptidos más largos se añadieron la noche anterior. El eje X indica la relación efector:diana.
En la figura 5 se muestran respuestas naturales de linfocitos T CD4+ contra TDO en pacientes sanos y con cáncer. Se midieron las respuestas de los linfocitos T contra TDO118-137 (A, C, E, G) o TDO303-322 (B, D, F, H) mediante ELISPOT de IFNy (A, B), TNFa (C, D), IL-17 (E, F) o IL-10 (G, H). El número medio de células específicas de TDO de experimentos por triplicado (después de restar el fondo) se calculó por 5 * 105 PBMC para cada paciente. Se analizaron las PBMC de 19 individuos sanos (IS), 21 pacientes con cáncer (Pt) (veinte pacientes con MM y uno con BC). Solo se exponen los valores p (p <0,05) de una prueba de Mann-Whitney. En la figura 6 se muestra el curso clínico de los pacientes con melanoma examinados. (A), la estimación de Kaplan Meier de OS definida como la fecha de la muestra de sangre hasta la fecha de la muerte para pacientes con melanoma con linfocitos T específicos de TDO303-322 que liberan IL-17 (línea de puntos) y para pacientes con melanoma sin linfocitos T específicos de TDO303-322 IL-17 (línea continua). (B), la estimación de Kaplan Meier de OS definida como la fecha de la muestra de sangre hasta la fecha de la muerte para pacientes con melanoma con linfocitos T específicos de TDO303-322 que liberan IL-10 (línea de puntos) y para pacientes con melanoma sin linfocitos T específicos de TDO303-322 IL-10 (línea continua). (C), la estimación de Kaplan Meier de OS definida como la fecha de la muestra de sangre hasta la fecha de la muerte para pacientes con melanoma con linfocitos T específicos de TDO303-322 que liberan IL-17 sin células que liberan IL-10 (línea de puntos) y para pacientes con melanoma con linfocitos T específicos de TDO303-322 IL-10 sin células que liberan IL-17 (línea continua).
En la figura 7 se muestran ejemplos de respuestas de la TDO estadísticamente significativas mostradas mediante ELISPOT. El método de remuestreo sin distribución (DFR, del inglés "distribution free resampling") no paramétrico permitió la comparación estadística de los pocillos estimulados con antígeno y el control negativo. Las barras representan el recuento medio de puntos en los pocillos con péptido de control (VIHpol468-476) (blanco) o un péptido procedente de TDO (negro) para (A) TDO123-132, (B) TDO200-208, (C) TDO309-317, (D) TDO364-372 (negro). Las barras de error representan desviaciones típicas. Los números de células eran 3 * 105 células/pocillo.
En la figura 8 se muestra que las respuestas hacia los péptidos procedentes de la TDO son detectables directamente ex vivo. ELISPOT ex vivo de IFNy en respuesta a TDO123-132 (negro), TDO200-208 (gris oscuro) y TDO309-317 (gris claro) en PBMC de diferentes pacientes con cáncer. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los números de células eran 9 * 105 células/pocillo.
Descripción detallada de la invención
Es un objetivo principal de la presente invención proporcionar una composición de vacuna que comprenda la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) o un fragmento polipeptídico inmunológicamente activo de la misma, polipéptidos que comprenden los mismos ácidos nucleicos o que los codifican para su uso como medicamento en la prevención de, la reducción del riesgo de o el tratamiento de cualquier trastorno proliferativo, tal como un cáncer.
Definiciones
Adyuvante: Cualquier sustancia cuya mezcla con una construcción de determinante/antígeno/ácido nucleico inmunogénico administrado aumenta o modifica de otro modo la respuesta inmunitaria a dicho determinante.
Antígeno: Cualquier sustancia que se pueda unir a un receptor inmunitario distribuido de manera clonal (receptor de linfocitos T o linfocitos B). Por lo general, un péptido, polipéptido o un polipéptido multimérico. Los antígenos son preferentemente capaces de provocar una respuesta inmunitaria.
APC: Célula presentadora de antígenos. Una APC es una célula que muestra un antígeno extraño que forma complejo con MHC en su superficie. Los linfocitos T pueden reconocer este complejo utilizando su receptor de linfocitos T (TCR, del inglés "T-cell receptor"). Las APC se dividen en dos categorías: profesional, (de la cual hay tres tipos: células dendríticas, macrófagos y linfocitos B) o no profesional (no expresa de manera constitutiva las proteínas del complejo principal de histocompatibilidad necesarias para la interacción con linfocitos T indiferenciados; estos se expresan solo tras la estimulación de la APC no profesional mediante determinadas citocinas tales como el IFNy).
Refuerzo: Reforzar con una dosis o una inyección de refuerzo es administrar una dosis adicional de un agente inmunizante, tal como una vacuna, administrado en un momento después de la dosis inicial para mantener la respuesta inmunitaria provocada por la dosis anterior del mismo agente.
Transportador: Entidad o compuesto al que se unen los antígenos para ayudar en la inducción de una respuesta inmunitaria.
Proteína quimérica: Una proteína modificada de manera genética que está codificada por una secuencia de nucleótidos hecha por un empalme de dos o más genes completos o parciales o una serie de ácidos nucleicos aleatorios o no aleatorios.
Afección clínica: Una afección que requiere atención médica, en el presente documento, especialmente las afecciones asociadas con la expresión de la TDO. Los ejemplos de dichas afecciones incluyen: trastornos proliferativos, tales como cánceres e infecciones.
Complemento: Una serie compleja de proteínas sanguíneas cuya acción "complementa" el trabajo de los anticuerpos. El complemento destruye bacterias, produce inflamación y regula las reacciones inmunitarias.
CTL: Linfocito T citotóxico. Un subgrupo de linfocitos T que expresan CD8 junto con el receptor de linfocitos T y, por tanto, capaz de responder a los antígenos presentados por moléculas de clase I.
Vehículos de administración: Una entidad mediante la cual una secuencia de nucleótidos o polipéptido o ambos se pueden transportar desde al menos un medio a otro.
CD: Célula dendrítica. (CD) son células inmunitarias y forman parte del sistema inmunitario de los mamíferos. Su función principal es procesar el material antigénico y presentarlo en la superficie a otras células del sistema inmunitario, funcionando así como células presentadoras de antígeno (APC).
Fragmento: se utiliza para indicar una parte que no es de longitud completa de un ácido nucleico o polipéptido. Por lo tanto, un fragmento es en sí mismo también un ácido nucleico o polipéptido, respectivamente.
Homólogo funcional: Un homólogo funcional puede ser cualquier polipéptido que presente al menos alguna identidad de secuencia con una versión de tipo silvestre de un polipéptido y ha conservado al menos un aspecto de la funcionalidad original. En el presente documento, un homólogo funcional de la TDO es un polipéptido que comparte al menos alguna identidad de secuencia con la TDO y que tiene la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria a las células que expresan la TDO. Un homólogo funcional de un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO es un péptido que comparte al menos alguna identidad de secuencia con un fragmento peptídico de la TDO y que tiene la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria a las células que expresan la TDO.
Péptido inmunogénicamente activo: Péptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria en al menos un individuo después de la administración a dicho individuo.
Individuo: Generalmente cualquier especie o subespecie de ave, mamífero, pez, anfibio o reptil, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano.
Infección: En el presente documento, el término "infección" se refiere a cualquier tipo de afección clínica que implique una invasión del organismo hospedador por agentes que causan una enfermedad. En particular, infección se refiere a una afección clínica que implica la invasión de un individuo por un patógeno.
Aislado: utilizado en conexión con ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos divulgados en el presente documento, "aislados" se refiere a que éstos se han identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural, normalmente celular. Los ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos de la invención se aíslan preferentemente, y las vacunas y otras composiciones de la invención comprenden preferentemente ácidos nucleicos, polipéptidos o anticuerpos aislados.
MHC: Complejo principal de histocompatibilidad, existen dos subclases principales de MHC, la clase I y la clase II. Ácido nucleico: Una cadena o secuencia de nucleótidos que transporta información genética. Con respecto a la presente invención, el ácido nucleico es generalmente un ácido desoxirribonucleico (ADN).
Construcción de ácido nucleico: Un ácido nucleico modificado genéticamente. Por lo general, comprende varios elementos, tales como genes o fragmentos de los mismos, ADNc, promotores, potenciadores, terminadores, colas de poliA, enlazadores, polienlazadores, enlazadores operativos, múltiples sitios de clonación (MCS), marcadores, codones de terminación, otros elementos reguladores, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) u otros.
Enlazador operativo: Una secuencia de nucleótidos o restos de aminoácidos que unen dos partes de una construcción de ácido nucleico o polipéptido (quimérico) de una manera que asegura el procesamiento biológico del ácido nucleico o polipéptido.
Patógeno: un agente causante específico de la enfermedad, especialmente un agente biológico tal como un virus, bacterias, prión o parásito que puede causar enfermedad a su hospedador, también conocido como agente infeccioso.
PBL: Las células sanguíneas periféricas son los componentes celulares de la sangre, que consisten en glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas, que se encuentran dentro del grupo de sangre circulante y no dentro del sistema linfático, bazo, hígado o médula ósea.
PBMC: Una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC, del inglés "Peripheral Blood Mononuclear Cell") es una célula sanguínea que tiene un núcleo redondo, tal como un linfocito o un monocito. Estas células sanguíneas son un componente fundamental del sistema inmunitario para combatir las infecciones y adaptarse a los intrusos. La población de linfocitos consiste en linfocitos T (CD4 y CD8 positivas ~75 %), linfocitos B y células NK (~25 % combinadas).
Polipéptido: Pluralidad de restos de aminoácidos unidos de manera covalente que definen una secuencia y unidos mediante enlaces amida. El término se utiliza de manera análoga con oligopéptido y péptido. El término polipéptido también abarca modificaciones postraduccionales introducidas por reacciones químicas o catalizadas por enzimas, tal como se conocen en la materia. El término se puede referir a una variante o fragmento de un polipéptido.
Vehículos farmacéuticos: también denominados excipientes o estabilizadores no son tóxicos para la célula o el individuo expuesto a los mismos en las dosis y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el vehículo farmacéutico es una solución acuosa a pH tamponado. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como Tween™, polietilenglicol (PEG) y Pluronics™.
Pluralidad: Al menos dos.
Trastorno proliferativo: En el presente documento, cualquier enfermedad preneoplásica o neoplásica, benigna o maligna, donde "neoplásico" se refiere a una proliferación anormal de células. Un ejemplo no limitante de un trastorno proliferativo es el cáncer.
Promotor: Sitio de unión en una cadena de ADN en el que se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción del ARN mensajero mediante uno o más genes estructurales cercanos.
Péptido de señal: Una secuencia corta de aminoácidos que determina la ubicación final de una proteína en la célula, también denominado péptido de clasificación.
Tensioactivo: Un agente activo superficial capaz de reducir la tensión superficial de un líquido en el que se disuelve. Un tensioactivo es un compuesto que contiene un grupo polar que es hidrófilo y un grupo no polar que es hidrófobo y, a menudo, está compuesto por una cadena grasa.
TDO: Triptófano 2,3-dioxigenasa. La TDO humana de tipo silvestre se identifica en el presente documento como la SEQ ID NO: 1.
TDOxxx-yyy: Como se utiliza en el presente documento, esta nomenclatura se refiere a un fragmento polipeptídico de la TDO que consiste en los aminoácidos xxx-yyy de la SEQ ID NO: 1.
Treg: Linfocitos T reguladores/linfocitos T
Tratamiento: El término "tratamiento", como se utiliza en el presente documento, puede referirse a un tratamiento curativo y/o a un tratamiento de mejora y/o a un tratamiento que reduce los síntomas de una enfermedad y/o a un tratamiento que retrasa la progresión de una enfermedad.
Vacuna: Una sustancia o composición capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un individuo y, en particular, en un mamífero, preferentemente en un ser humano. También denominada composición inmunogénica en el presente texto. Una respuesta inmunitaria contra un agente es una respuesta humoral, de anticuerpos y/o celular que induce la memoria en un organismo, lo que da como resultado que dicho agente se encuentre con una respuesta secundaria en lugar de una primaria, reduciendo así su impacto sobre el organismo hospedador. Dicho agente puede ser un patógeno. En el contexto de la presente invención, el agente es preferentemente una célula cancerosa. Se puede administrar una vacuna de la presente invención como profilaxis, con el fin de reducir el riesgo de encontrar una afección clínica y/o como medicamento terapéutico para el tratamiento de una afección clínica. La composición puede comprender uno o más de los siguientes: antígeno(s), construcciones de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos, transportadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticos.
Variante: una "variante" de un ácido nucleico o polipéptido de referencia determinado se refiere a un ácido nucleico o polipéptido que muestra un determinado grado de homología/identidad de secuencia con dicho ácido nucleico o polipéptido de referencia pero no es idéntico a dicho ácido nucleico o polipéptido de referencia.
Composición de vacuna
En el presente documento se divulga una composición de vacuna que comprende uno o más de los siguientes: 1) Triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO), que puede ser cualquiera de las TDO descritas en el presente documento a continuación en la sección "Triptófano 2,3-dioxigenasa";
2) Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO que comprende una secuencia de aminoácidos consecutiva de la TDO, que puede ser cualquiera de los péptidos descritos a continuación en el presente documento en la sección "Fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO".
3) Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO, que es un fragmento peptídico restringido por MHC de clase I o un fragmento peptídico restringido por MHC de clase II, tal como cualquiera de los fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase I o de los fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase II descritos en la sección "MHC";
4) Un homólogo funcional de los polipéptidos de 1), 2) y 3);
5) Un polipéptido que comprende cualquiera de los polipéptidos de 1), 2), 3) y 4), que puede ser cualquiera de los polipéptidos descritos a continuación en el presente documento en la sección "Polipéptidos que comprenden la TDO o un fragmento de la misma";
6) Un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos de 1), 2), 3) y 4).
La invención proporciona una composición de vacuna que comprende un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que consiste en como máximo 40 aminoácidos consecutivos de la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) de SEQ ID NO: 1, en donde el fragmento peptídico inmunogénicamente activo comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO: 3 (TDO200-208);
b) SEQ ID NO: 6 (TDO123-132);
c) SEQ ID NO: 9 (TDO309-317);
d) SEQ ID NO: 13 (TDO364-372);
e) SEQ ID NO: 17 (TDO118-137);
f) SEQ ID NO: 18 (TDO303-322); y
g) un homólogo funcional del polipéptido de acuerdo con cualquiera de a) a f); siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos; para su uso como un medicamento.
Además de los polipéptidos o fragmentos polipeptídicos mencionados anteriormente, dicha composición de vacuna preferentemente también comprende un adyuvante, que, por ejemplo, puede ser cualquiera de los adyuvantes descritos a continuación en el presente documento en la sección "Adyuvante".
Los fragmentos peptídicos de la TDO, que pueden estar comprendidos en las vacunas, se describen, por ejemplo, a continuación en el presente documento en las secciones "Fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO" y "Polipéptidos que comprenden la TDO o un fragmento de la misma".
Los homólogos funcionales, que pueden utilizarse en las composiciones de vacuna de la invención, se describen a continuación en el presente documento en las secciones "Triptófano 2,3-dioxigenasa"; "Fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO" y "Homólogos funcionales" y "Polipéptidos que comprenden la TDO o un fragmento de la misma".
Triptófano 2,3-dioxigenasa
La triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) es una enzima implicada en la degradación del L-triptófano a N-formilquinurenina. El catabolismo del triptófano provoca un agotamiento del triptófano que suprime las respuestas de los linfocitos T y promueve la tolerancia inmunitaria en el embarazo de mamíferos, resistencia a los tumores, infección crónica, autoinmunidad e inflamación alérgica.
En particular, la TDO puede ser una enzima capaz de catalizar la siguiente reacción:
L-triptófano O2 = N-formil-L-quinurenina
La TDO de acuerdo con la presente divulgación puede ser cualquier TDO útil. En general, se prefiere que la TDO sea una TDO de la misma especie que se pretende tratar con las composiciones de vacuna de la divulgación. En realizaciones preferidas de la divulgación, la composición de vacuna está destinada a la administración a un ser humano y, por tanto, la TDO puede ser una TDO humana. La secuencia de aminoácidos de la TDO humana de tipo silvestre se presenta como la SEQ ID NO: 1 en el presente documento.
Por lo tanto, la TDO puede ser preferentemente la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la TDO de SEQ ID NO: 1 y, en consecuencia, los homólogos funcionales preferentemente tienen al menos un 75 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 80 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 85 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 91 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 91 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 92 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 93 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 94 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 95 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 96 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 97 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 98 % de identidad de secuencia, por ejemplo, un 99 % de identidad de secuencia con la TDO humana de SEQ ID NO: 1.
Los homólogos funcionales de la TDO y los métodos para determinar la identidad de secuencia se describen con más detalle en la sección "Homólogos funcionales" a continuación en el presente documento.
Dado que la TDO puede tener actividad no deseada, a continuación, en una realización de la divulgación, la composición de vacuna comprende una TDO mutante, que no es capaz de catalizar la reacción mencionada anteriormente, o que solo cataliza la reacción mencionada anteriormente con una actividad como máximo del 10 % de la TDO de SeQ ID NO: 1. Dicha TDO mutante puede ser en particular la TDO de SEQ ID NO: 1 en donde uno o más de los aminoácidos 144, 151, 328 y/o 342 se han mutado a otro aminoácido o están eliminados. En el contexto de la presente invención, un "homólogo funcional" de la TDO puede ser una TDO mutante, que no tienen la actividad catalítica de la TDO de tipo silvestre, pero que tiene la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria a las células que expresan la TDO
Fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO
La TDO humana de tipo silvestre, es decir, la versión no mutada de origen natural de la proteína, se identifica en la SEQ ID NO: 1. La presente divulgación cubre composiciones de vacunas que comprenden la TDO; fragmentos peptídicos inmunológicamente activos de la TDO; fragmentos peptídicos de la TDO, en donde como máximo se han sustituido dos aminoácidos; y/o homólogos funcionales de la TDO que comprenden una identidad de secuencia de al menos un 70 % con la SEQ ID NO: 1. La expresión fragmento polipeptídico se utiliza en el presente documento para definir cualquier cadena de restos de aminoácidos que no sea de longitud completa (en comparación con la SEQ ID NO: 1) que proceden directamente de o se sintetizan para que sean idénticas a la SEQ ID NO: 1.
Un homólogo funcional se puede definir como una TDO de longitud completa o un fragmento de TDO que difiere en secuencia de la TDO de tipo silvestre, tal como la TDO humana de tipo silvestre, pero todavía es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra las células que expresan la TDO, tales como las células cancerosas y las CD. La TDO expresada en estas células puede ser de tipo silvestre o mutada de manera endógena (tal como un mutante congénito o una mutación inducida durante la división celular u otra). Un homólogo funcional puede ser una versión mutada o una variante de empalme alternativa de la TDO de tipo silvestre. En otro aspecto, los homólogos funcionales de la TDO se definen como se describe a continuación en el presente documento. Un homólogo funcional puede ser, pero sin limitación, una versión recombinante de la TDO de longitud completa o fragmentada con una o más mutaciones y/o una o más eliminaciones de secuencia y/o adiciones introducidas ex vivo.
Por consiguiente, en una realización específica, el fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la invención consiste en como máximo 40 restos de aminoácidos, por ejemplo, como máximo 35 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 30 restos de aminoácidos, por ejemplo, como máximo 25 restos de aminoácidos, tal como de 18 a 25 aminoácidos consecutivos de la TDO como se identifica en la SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma; siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido.
En una realización preferida de la invención, el fragmento peptídico inmunogénicamente activo consiste en de 18 a 25 aminoácidos, preferentemente en 20 aminoácidos consecutivos de la TDO como se identifica en la SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma; siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido.
El fragmento peptídico inmunogénicamente activo puede consistir en como máximo 25 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 24 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 23 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 22 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 21 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 20 restos de aminoácidos, por ejemplo, como máximo 19 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 18 restos de aminoácidos, por ejemplo, como máximo 17 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 16 restos de aminoácidos, por ejemplo, como máximo 15 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 14 restos de aminoácidos, por ejemplo, como máximo 13 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 12 restos de aminoácidos, por ejemplo, como máximo 11 restos de aminoácidos, tal como de 8 a 10 aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma; siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido.
En una realización preferida de la divulgación, el péptido inmunogénicamente activo comprende como máximo 10 restos de aminoácidos consecutivos de la TDO, tal como, como máximo 9 restos de aminoácidos consecutivos, tal como 8 restos de aminoácidos consecutivos, tal como 7 restos de aminoácidos consecutivos de la TDO identificados en la SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma; siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido. En particular, el péptido inmunogénicamente activo puede consistir en 10 restos de aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO: 1 o el péptido inmunogénicamente activo puede consistir en 9 restos de aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones de la divulgación, el péptido inmunogénicamente activo puede seleccionarse del grupo que consiste en los péptidos enumerados en la tabla 1 o un homólogo funcional de los mismos; siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido.
T l 1 P i l TD il
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En una realización preferida de la invención, el péptido inmunogénicamente activo se selecciona del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO: 3 (TDO200-208);
b) SEQ ID NO: 6 (TDO123-132);
c) SEQ ID NO: 9 (TDO309-317);
d) SEQ ID NO: 13 (TDO364-372);
e) SEQ ID NO: 17 (TDO118-137);
f) SEQ ID NO: 18 (TDO303-322); y
g) un homólogo funcional del polipéptido de acuerdo con cualquiera de a) a f); siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido.
También se divulgan otros péptidos que comprenden (o más preferentemente consisten en) entre 4 y 120, preferentemente entre 8 y 100, más preferentemente entre 10 y 75, incluso más preferentemente entre 12 y 60, aún más preferentemente entre 15 y 40, tal como entre 18 y 25 aminoácidos contiguos de la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que tiene al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, incluso más preferentemente al menos un 95 %, aún más preferentemente al menos un 98 %, por ejemplo, al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
Homólogos funcionales
Los homólogos funcionales de la TDO o los fragmentos inmunogénicamente activos del mismo, son polipéptidos, que también son inmunogénicamente activos y que comparten al menos cierto grado de identidad de secuencia con la TDO y, en particular, con la TDO de SEQ ID NO: 1.
Para los polipéptidos más cortos, tales como para polipéptidos de menos de 100 aminoácidos, tal como de menos de 50 aminoácidos, por ejemplo, menos de 25 aminoácidos, entonces los homólogos funcionales pueden ser un polipéptido inmunogénicamente activo de secuencia idéntica, excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido.
Como alternativa, un homólogo funcional puede ser un polipéptido inmunogénicamente activo que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con la TDO de SEQ ID NO: 1 y, en consecuencia, los homólogos funcionales preferentemente tienen al menos un 75 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 80 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 85 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 91 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 91 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 92 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 93 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 94 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 95 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 96 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 97 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 98 % de identidad de secuencia, por ejemplo, un 99 % de identidad de secuencia con la TDO humana de SEQ ID NO: 1.
La identidad de secuencia se puede calcular utilizando una serie de algoritmos bien conocidos y aplicando una serie de penalizaciones por huecos diferentes. La identidad de secuencia se calcula en relación con la secuencia de referencia de longitud completa, por ejemplo, con la SEQ ID NO: 1 de longitud completa. Cualquier herramienta de alineación de secuencia, tal como, pero sin limitación, FASTA, BLAST o LALIGN se puede utilizar para buscar homólogos y calcular la identidad de secuencia. Además, cuando sea adecuado, cualquier matriz de sustitución comúnmente conocida, tal como, pero sin limitación, PAM, BLOSSUM o PSSM se puede utilizar con el algoritmo de búsqueda. Por ejemplo, se puede aplicar una PSSM (matriz de puntuación específica de la posición) mediante el programa PSI-BLAsT.
Además, las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando una variedad de penalizaciones por apertura y extensión de huecos. Por ejemplo, el algoritmo BLAST se puede utilizar con una penalización de apertura de hueco en el intervalo de 5 a 12 y una penalización de extensión de hueco en el intervalo de 1 a 2.
Los homólogos funcionales pueden comprender además modificaciones químicas tales como ubiquitinación, marcado (por ejemplo, con radionucleidos, diversas enzimas, etc.), pegilación (derivatización con polietilenglicol), o mediante inserción (o sustitución por síntesis química) de aminoácidos (aminoácidos) tales como la ornitina, que normalmente no se producen en las proteínas humanas, sin embargo, se prefiere que el equivalente funcional no contenga modificaciones químicas.
Cualquier cambio realizado en la secuencia de restos de aminoácidos en comparación con la de TDO de SEQ ID NO: 1 son preferentemente sustituciones conservativas. Una persona experta en la materia sabrá cómo realizar y evaluar sustituciones de aminoácidos 'conservativas', mediante las cuales un aminoácido se sustituye por otro con una o más características químicas y/o físicas compartidas. Es menos probable que las sustituciones de aminoácidos conservativas afecten la funcionalidad de la proteína. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con características compartidas. Una sustitución de aminoácidos conservativa es una sustitución de un aminoácido dentro de un grupo predeterminado de aminoácidos por otro aminoácido dentro del mismo grupo, en donde los aminoácidos dentro de grupos predeterminados presentan características similares o sustancialmente similares. Por lo tanto, en una realización de la presente divulgación, la composición de vacuna comprende un polipéptido que consiste en una secuencia consecutiva de la TDO de SEQ ID NO: 1 en el intervalo de 8 a 50 aminoácidos, preferentemente en el intervalo de 8 a 10 o de 20 a 25 aminoácidos, en donde como máximo se han sustituido tres aminoácidos, y donde la sustitución es preferentemente conservativa.
Polipéptidos que comprenden la TDO o un fragmento de la misma
También está comprendido en la divulgación que las composiciones de vacuna de la divulgación pueden comprender un polipéptido que comprende la TDO o un fragmento de la misma. Por lo tanto, el fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO puede ser, por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos que comprenden un fragmento de la TDO descrito en el presente documento en esta sección.
En particular, dichos polipéptidos pueden comprender la TDO de longitud completa, tal como cualquiera de las TDO descritas anteriormente en el presente documento en la sección "Triptófano 2,3-dioxigenasa". Por ejemplo, el polipéptido puede comprender la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que comparte al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % de identidad de secuencia con mismo. En particular, dichos polipéptidos pueden comprender como máximo 100, tal como, como máximo 50, por ejemplo, como máximo 25, tal como, como máximo 10 aminoácidos además de la TDO de SEQ ID NO: 1.
También se incluye en la divulgación que las composiciones de vacuna pueden comprender un polipéptido que comprende un fragmento de la TDO, tal como cualquiera de los fragmentos descritos anteriormente en el presente documento en la sección "Fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO". Dicho polipéptido también puede comprender cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO, que es un fragmento peptídico restringido por MHC de clase I o un fragmento peptídico restringido por MHC de clase II, tal como cualquiera de los fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase I o de los fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase II descritos en la sección "MHC".
Por lo tanto, dicho polipéptido puede ser un polipéptido de como máximo 40 restos de aminoácidos, por ejemplo, como máximo 35 restos de aminoácidos, tal como, como máximo 30 restos de aminoácidos, por ejemplo, como máximo 25 restos de aminoácidos, tal como en el intervalo de 18 a 25, tal como en el intervalo de 8 a 10 aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma.
En particular, dicho polipéptido puede ser un polipéptido de como máximo 40 aminoácidos, por ejemplo, como máximo 30 aminoácidos que comprenden una secuencia consecutiva de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia consecutiva de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 consiste en el intervalo de 18 a 25, tal como 20 aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, dicho polipéptido puede ser un polipéptido de como máximo 40 aminoácidos, por ejemplo, como máximo 30 aminoácidos que comprenden un péptido inmunogénicamente activo seleccionado del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO: 3 (TDO200-208);
b) SEQ ID NO: 6 (TDO123-132);
c) SEQ ID NO: 9 (TDO309-317);
d) SEQ ID NO: 13 (TDO364-372);
e) SEQ ID NO: 17 (TDO118-137);
f) SEQ ID NO: 18 (TDO303-322); y
g) un homólogo funcional del polipéptido de acuerdo con cualquiera de a) a f); siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido.
En una realización, el fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO puede ser un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia consecutiva de como máximo 400 aminoácidos, tal como, como máximo 300 aminoácidos consecutivos, por ejemplo, como máximo 200 aminoácidos consecutivos, tal como, como máximo 100 aminoácidos consecutivos, por ejemplo, como máximo 50 aminoácidos consecutivos, por ejemplo, como máximo 45 restos de aminoácidos consecutivos, tal como, como máximo 40 restos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo, como máximo 35 restos de aminoácidos consecutivos, tal como, como máximo 30 restos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo, como máximo 25 restos de aminoácidos consecutivos, tal como en el intervalo de 18 a 25, tal como en el intervalo de 8 a 10 aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma donde como máximo se han sustituido tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como, como máximo se ha sustituido un aminoácido, y en donde dicho fragmento peptídico de la TDO comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO: 3 (TDO200-208);
b) SEQ ID NO: 6 (TDO123-132);
c) SEQ ID NO: 9 (TDO309-317);
d) SEQ ID NO: 13 (TDO364-372);
e) SEQ ID NO: 17 (TDO118-137);
f) SEQ ID NO: 18 (TDO303-322); y
g) un homólogo funcional del polipéptido de acuerdo con cualquiera de a) a f); siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido.
Dicho polipéptido también puede ser un polipéptido de como máximo 100 aminoácidos, tal como, como máximo 50 aminoácidos, por ejemplo, como máximo 30 aminoácidos, tal como, como máximo 20 aminoácidos, por ejemplo, como máximo 15 aminoácidos que comprenden una secuencia consecutiva de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia consecutiva de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 consiste en el intervalo de 8 a 10, tal como 9 o 10 aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma. Por lo tanto, dicho polipéptido puede ser un polipéptido de como máximo 100 aminoácidos, tal como, como máximo 50 aminoácidos, por ejemplo, como máximo 30 aminoácidos, tal como, como máximo 20 aminoácidos, por ejemplo, como máximo 15 aminoácidos que comprenden un péptido inmunogénicamente activo seleccionado del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO: 3 (TDO200-208);
b) SEQ ID NO: 6 (TDO123-132);
c) SEQ ID NO: 9 (TDO309-317);
d) SEQ ID NO: 13 (TDO364-372); y
e) un homólogo funcional del polipéptido de acuerdo con cualquiera de a) a d); siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido.
MHC
Está comprendido en la divulgación que los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO pueden ser un fragmento peptídico restringido por MHC de clase I o un fragmento peptídico restringido por MHC de clase II, tales como cualquiera de los fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase I o los fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase II descritos en esta sección.
Hay dos tipos de moléculas MHC; Moléculas de MHC de clase I y moléculas de MHC de clase II. Las moléculas de MHC de clase I son reconocidas por los linfocitos T CD8, que son las principales células efectoras de la respuesta inmunitaria adaptativa. Las moléculas de MHC de clase II se expresan principalmente en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC), la más importante de las cuales parecen ser las células dendríticas. Las APC estimulan los linfocitos T indiferenciados, así como otras células del sistema inmunitario. Estimulan tanto los linfocitos T CD8 como los linfocitos T CD4.
En una realización, se divulgan péptidos TDO inmunogénicamente activos (opcionalmente comprendidos en péptidos más grandes y/o en composiciones de vacunas), en donde dichos péptidos TDO inmunogénicamente activos son fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase I que consisten en 8 a 10 aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO 1 o un homólogo funcional de la misma, en donde como máximo se han sustituido dos aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, que se caracterizan por tener al menos una de varias características, una de las cuales es la capacidad de unirse a la molécula de HLA de clase I a la que está restringido con una afinidad medida por la cantidad del péptido que es capaz de recuperar la mitad de la recuperación máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C50 ) que es como máximo 50 pM según se determina mediante el ensayo de unión de ensamblaje como se describe en el presente documento. Este ensayo de ensamblaje se basa en la estabilización de la molécula de HLA después de la carga del péptido en la línea celular T2 deficiente en el transportador de péptidos. Posteriormente, las cadenas pesadas de HLA estables plegadas correctamente se inmunoprecipitan con anticuerpos dependientes de la conformación y se cuantifica la unión del péptido. Los péptidos de esta realización comprenden (o más preferentemente consisten en) como máximo 200, preferentemente como máximo 100, más preferentemente como máximo 50, aún más preferentemente como máximo 25, incluso más preferentemente como máximo 20, todavía incluso más preferentemente como máximo 15, tal como, como máximo 10, por ejemplo, en el intervalo de 8 a 10 aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma en donde como máximo se han sustituido dos aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
Este ensayo proporciona un medio sencillo de seleccionar péptidos candidatos por su capacidad para unirse a una molécula de alelo de HLA dada con la afinidad anterior. En realizaciones preferidas, el fragmento peptídico de la invención en uno que tiene un valor C50, que es como máximo 30 pM, tal como un valor C50, que es como máximo 20 pM incluyendo valores C50 de como máximo 10 pM, como máximo 5 pM y como máximo 2 pM.
En otra realización preferida, se proporcionan nuevos fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase II de la TDO de SEQ ID NO 1 o un homólogo funcional de la misma, en donde como máximo se han sustituido dos aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, (también denominado, en el presente documento, "péptidos"), que se caracterizan por tener al menos una de las varias características que se describen a continuación en el presente documento. Los péptidos de esta realización comprenden (o más preferentemente consisten en) entre 4 y 120, preferentemente entre 8 y 100, más preferentemente entre 10 y 75, incluso más preferentemente entre 12 y 60, aún más preferentemente entre 15 y 40, tales como entre 18 y 25 aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO 1 o un homólogo funcional de la misma, donde como máximo dos, preferentemente como máximo se ha sustituido un aminoácido de la SEQ ID NO 1.
Por tanto, se proporcionan nuevos fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase I de 8 a 10 aminoácidos o nuevos fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase II de 18 a 25 aminoácidos de la TDO de SEQ ID NO 1 o un homólogo funcional de la misma, en donde como máximo se han sustituido dos aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, que se caracterizan por tener al menos una de las varias características que se describen a continuación en el presente documento, una de las cuales es la capacidad de unirse a la molécula de HLA de clase I o clase II a la que está restringida.
En realizaciones particulares se proporcionan fragmentos peptídicos, que es un péptido restringido por MHC de clase I o un péptido restringido por MHC de clase II que tiene al menos una de las siguientes características:
(i) es capaz de provocar células productoras de INF-y en una población de PBL de al menos un paciente con cáncer con una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL según lo determinado por un ensayo ELISPOT, y/o (ii) es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el péptido epítopo.
(iii) es capaz de inducir el crecimiento de linfocitos T específicos de la TDO in vitro.
Los péptidos más preferidos de acuerdo con la presente divulgación son péptidos capaces de generar una respuesta específica de linfocitos T según se determina mediante un ensayo ELISPOT, por ejemplo, el ensayo ELISPOT descrito en el ejemplo 1 a continuación. Algunos péptidos, aunque no se unen al MHC de clase I o II con elevada afinidad, todavía puede dar lugar a una respuesta de linfocitos T según lo determinado por ELISPOT. Otros péptidos capaces de unirse al MHC de clase I o clase II con elevada afinidad también dan lugar a una respuesta de linfocitos T determinada por ELISPOT. Ambos tipos de péptidos son péptidos preferidos de acuerdo con la invención.
Por consiguiente, los péptidos preferidos de acuerdo con la presente divulgación son péptidos capaces de generar una respuesta específica de linfocitos T medida por un ensayo ELISPOT, en donde se miden más de 50 puntos específicos de péptidos por 108 células, más preferentemente por 107, incluso más preferentemente por 106, aún más preferentemente por 105 células, tal como por 104 células.
Los péptidos más preferidos de acuerdo con la presente divulgación son péptidos que son capaces de provocar una respuesta inmunitaria celular en un individuo que padece una afección clínica caracterizada por la expresión de la TDO, siendo preferentemente la afección clínica un cáncer o una infección, y lo más preferentemente un cáncer. Los péptidos preferidos de acuerdo con la presente divulgación son capaces de provocar una respuesta inmunitaria celular específica dirigida contra células que expresan la TDO. Por lo tanto, los péptidos preferentemente pueden activar linfocitos T específicos de la TDO que reconocen células que expresan la TDO.
Como se ha descrito anteriormente, el sistema HLA representa el sistema principal de histocompatibilidad (MHC) humana. En general, los sistemas MHC controlan una variedad de características: antígenos de trasplante, respuestas inmunitarias dependientes del timo, determinados factores del complemento y predisposición a determinadas enfermedades. Más específicamente, los códigos MHC para tres tipos diferentes de moléculas, es decir, moléculas de clase I, II y III, que determinan las características más generales del MHC. De estas moléculas, las moléculas de clase I se denominan moléculas HLA-A, HLA-B y HLA-C que se presentan en la superficie de la mayoría de las células nucleadas y trombocitos.
Los péptidos de la presente divulgación se caracterizan por su capacidad para unirse a (estar restringidos por) una molécula HLA de MHC de clase I particular. Por lo tanto, en una realización, el péptido es uno que está restringido por una molécula de MHC de clase I HLA-A que incluye HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A 10, HLA-A11, HLA-Aw19, HLA-A23(9), HLA-A24(9), HLA-A25(10), HLA-A26(10), HLA-A28, HLA-A29(w19), HLA-A30(w19), HLA-A31(w19), HLA-A32(w19), HLA-Aw33(w19), HLA-Aw34(10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66(10), HLA-Aw68(28), HLA-A69(28). También se utilizan designaciones más simples a lo largo de la bibliografía, donde solo se utiliza la designación numérica principal, por ejemplo, HLA-A19 o HLA-A24 en lugar de HLA-Aw19 y HLA-A24(49), respectivamente. En realizaciones específicas, el péptido de la invención está restringido a una especie de MHC de clase I HLA seleccionada del grupo que consiste en HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 y HLA-A24. En una encarnación específica, el péptido de la invención está restringido a una especie de HLA de MHC de clase 1HLA-A2 o HLA-A3.
En otras realizaciones útiles, el péptido de la divulgación es un péptido, que está restringido por una molécula de MHC de clase I HLA-B que incluye cualquiera de las siguientes: HLA-B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-Bw41, HLA-Bw42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 y HLA-Bw47. En realizaciones específicas de la invención, la especie de MHC de clase I HLA-B a la que el péptido de la invención es capaz de unirse se selecciona de HLA-B7, HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 y HLA-B51.
En otras realizaciones útiles, el péptido de la divulgación es un péptido, que está restringido por una molécula de MHC de clase I HLA-C que incluye, pero sin limitación, cualquiera de las siguientes: HLA-Cw1, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLA-Cw7 y HLA-Cw1.
En otras realizaciones útiles, el péptido de la divulgación es un péptido, que está restringido por una molécula de MHC de clase II HLA que incluye, pero sin limitación, cualquiera de las siguientes: HLA-DPA-1, HLA-DPB-1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB y todos los alelos de estos grupos y HLA-DM, HLA-DO.
La selección de péptidos que potencialmente tienen la capacidad de unirse a una molécula HLA particular puede realizarse mediante la alineación de secuencias conocidas que se unen a una molécula HLA particular dada para exponer así el predominio de unos pocos aminoácidos relacionados en posiciones particulares de los péptidos. Dichos restos de aminoácidos predominantes también se denominan en el presente documento "restos de anclaje" o "motivos de restos de anclaje". Siguiendo un procedimiento relativamente simple basado en datos de secuencia conocidos que se pueden encontrar en bases de datos accesibles, los péptidos pueden proceder de la TDO, que probablemente se unan a una molécula de HLA específica. En la siguiente tabla se dan ejemplos representativos de dichos análisis para una variedad de moléculas de HLA:
Tabla 2
Figure imgf000014_0001
(continuación)
Figure imgf000015_0001
(continuación)
Figure imgf000016_0001
Por lo tanto, como un ejemplo, los nonapéptidos que potencialmente tienen la capacidad de unirse a HLA-A3 tendrían una de las siguientes secuencias: Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K, Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Y; Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-F o Xaa-V-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K (Xaa indica cualquier resto de aminoácido). De manera similar, se pueden diseñar secuencias que potencialmente tengan la capacidad de unirse a cualquier otra molécula HLA. Se apreciará que el experto en la materia podrá identificar más "motivos de restos de anclaje" para una molécula HLA determinada.
El péptido divulgado puede tener una secuencia que es una secuencia nativa de la TDO de la que procede. Sin embargo, los péptidos que tienen una mayor afinidad por cualquier molécula HLA dada pueden proceder de dicha secuencia nativa mediante la modificación de la secuencia sustituyendo, eliminado o añadiendo al menos un resto de aminoácido, por ejemplo, sobre la base del procedimiento descrito anteriormente, por lo que se identifican motivos de restos de anclaje con respecto a la molécula HLA dada.
Por lo tanto, en realizaciones útiles, los polipéptidos divulgados incluyen péptidos, cuyas secuencias comprenden, para cada uno de los alelos HLA específicos enumerados en la tabla, cualquiera de los restos de aminoácidos como se indica en la tabla.
Por lo tanto, los péptidos divulgados pueden ser cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente que comprenden secuencias consecutivas de la TDO, en donde en el intervalo de 1 a 10, preferentemente en el intervalo de 1 a 5, más preferentemente en el intervalo de 1 a 3, aún más preferentemente en el intervalo de 1 a 2, incluso más preferentemente se ha intercambiado 1 aminoácido por otro aminoácido, preferentemente de una manera tal que el péptido comprenda uno o más, preferentemente todos los restos de anclaje de un péptido específico de HLA-A dado como se indica en la tabla anterior.
Los ejemplos de especies de HLA preferidos incluyen, a los que se restringen los péptidos preferidos de la presente divulgación: una especie HLA de MHC de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 y HLA-A24, más preferentemente, el péptido está restringido por HLA-A3 o HLA-A2. De manera alternativa, una especie de h La preferida incluye especies de MHC de clase 1HLA-B seleccionadas del grupo que consiste en HLA-B7, HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 y HLA-B51.
Un enfoque para identificar polipéptidos de la divulgación incluye las siguiente etapas: seleccionar una molécula HLA en particular, por ejemplo, una que ocurre a una tasa elevada en una población determinada, llevar a cabo un análisis de alineación como se describió anteriormente para identificar "motivos de restos de anclaje" en la proteína TDO, aislar o construir péptidos de un tamaño adecuado que comprendan uno o más de los restos de anclaje identificados y probar los péptidos resultantes para determinar la capacidad de los péptidos para provocar células productoras de INF-y en una población de PBL de un paciente con cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL determinados por un ensayo ELISPOT como se describe en el ejemplo 1.
En un aspecto de la presente divulgación, se proporcionan péptidos procedentes de la TDO de más de 8 a 10 restos de aminoácidos. Los polipéptidos de más de 8 a 10 aminoácidos son procesados por el proteasoma a una longitud más corta para unirse a moléculas de HLA. Por lo tanto, cuando se administra un polipéptido de más de 8 a 10 restos de aminoácidos, el polipéptido/proteína/fragmento de proteína/variante "largo" de la TDO puede procesarse in vivo en una serie de péptidos más pequeños en el citosol mediante el proteasoma. Una ventaja de utilizar un polipéptido más largo que puede ser procesado mediante el proteasoma en una variedad de péptidos más cortos diferentes es que se pueden dirigir más clases de HLA con un péptido que con un péptido de 8 a 10 aminoácidos que está restringido a una clase de HLA particular.
Sorprendentemente, algunos de los péptidos divulgados se unen a moléculas de MHC con una afinidad lo suficientemente elevada como para hacer innecesarias las sustituciones y están listos para su uso como antígenos tal como se presentan aquí. Preferentemente, la composición de vacuna de la presente divulgación comprende uno o más de los siguientes: proteína TDO (SEQ ID NO: 1), fragmentos polipeptídicos de la misma, igualmente variantes, homólogos funcionales de la TDO de longitud completa y de longitud parcial, péptidos contiguos de la TDO y homólogos funcionales de la misma. Más preferentemente, la composición de vacuna comprende cualquiera de las secuencias enumeradas en la tabla 1. Muy preferentemente, la composición de vacuna comprende los péptidos de SEQ ID NO: 3 (TDO200-208); SEQ ID NO: 6 (TDO123-132); SEQ ID NO: 9 (TDO309-317); SEQ ID NO: 13 (TDO364-372); SEQ ID NO: 17 (TDO118-137); y/o SEQ ID NO: 18 (TDO303-322).
Una característica importante del péptido divulgado es su capacidad para reconocer o provocar linfocitos T respondedores que producen INF-y, es decir, linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen de manera específica el péptido particular en una población de PBL, en una APC o en células tumorales/neoplásicas de un individuo que padece un cáncer y/o una infección (células diana). Esta actividad se determina fácilmente sometiendo PBL, APC o células tumorales de un individuo a un ensayo ELISPOT. Antes del ensayo, puede ser ventajoso estimular las células a ensayar mediante la puesta en contacto de las células con el péptido a probar. Preferentemente, el péptido es capaz de provocar o reconocer los linfocitos T productores de INF-y con una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL determinados por un ensayo ELISPOT como se utiliza en el presente documento. Más preferentemente, la frecuencia es de al menos 5 por 104 PBL, lo más preferentemente al menos 10 por 104 PBL, tal como al menos 50 o 100 por 104 PBL.
El ensayo ELISPOT representa una potente herramienta para controlar las respuestas de los linfocitos T específicos del péptido TDO. Una implicación principal de los hallazgos en el presente documento es que los péptidos desvelados se expresan y forman complejos con moléculas HLA en células cancerosas y/o APC que expresan la TDO. Esto hace que estas células cancerosas sean susceptibles de ser destruidas por los CTL y enfatiza la utilidad de la inmunización con TDO para combatir el cáncer y las infecciones. La presencia de respuestas CTL espontáneas en PBL de pacientes con melanoma a epítopos peptídicos procedentes de TDO restringidos por HLA muestra el potencial inmunoterapéutico de los péptidos inmunogénicos de la TDO.
En una realización de la presente divulgación, el péptido de la invención es capaz de provocar células productoras de INF-y en una población de PBL de un individuo que padece una afección clínica en la que se expresa la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO 1. La afección clínica es preferentemente un cáncer o una infección y lo más preferentemente un cáncer.
Individuo
El individuo que se va a tratar con la composición de vacuna de la presente divulgación es un individuo que padece una afección clínica. El individuo es preferentemente de una especie de mamífero y lo más preferentemente un ser humano. El individuo puede ser de cualquier edad, joven o viejo, y pueden ser hombre o mujer. La afección clínica que padece el individuo puede ser una enfermedad neoplásica, tal como un cáncer, o una infección, tal como una infección microbiana o vírica, por ejemplo, el VIH.
Una realización de la presente divulgación proporciona una vacuna para el tratamiento, reducción del riesgo de, estabilización o prevención de un cáncer. En otra realización, la presente invención proporciona una vacuna para el tratamiento, reducción del riesgo de, estabilización o prevención de una enfermedad derivada de una infección, tal como una infección microbiana o vírica.
Cáncer
La composición de vacuna de la presente divulgación puede utilizarse para prevenir, reducir el riesgo o tratar una afección clínica. Preferentemente, la afección clínica está asociada o caracterizada por la expresión de la TDO. La TDO puede ser la TDO como se identifica en la SEQ ID NO: 1 o puede ser un homólogo que comparte al menos un 70 % de identidad con cualquiera de estas en sus formas de tipo silvestre, pero no necesita ser funcional. Se entiende por la presente que el nivel de expresión de la TDO (siendo la expresión la expresión de ARNhc, ARNm, proteína precursora, proteína completamente procesada, etc.) es igual o mayor que en un individuo que no padece una afección clínica.
En una realización de la divulgación, la afección clínica es un trastorno proliferativo, tal como un trastorno preneoplásico o neoplásico. En una realización preferida de la divulgación, la afección clínica es cáncer. El cáncer (neoplasia maligna) es una clase de enfermedad en la que un grupo de células muestra los rasgos de crecimiento incontrolado (crecimiento y división más allá de los límites normales), invasión (intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y, a veces, metástasis (diseminación a otras ubicaciones del cuerpo a través de la linfa o la sangre). Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los tumores benignos, que son autolimitados, no invaden ni hacen metástasis. La mayoría de los cánceres forman un tumor, pero algunos, como la leucemia, no. Un grupo no limitante de cánceres que se dan como ejemplos de cánceres que pueden tratarse, gestionarse y/o prevenirse mediante la administración de la vacuna de la presente divulgación incluyen: carcinoma de colon, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de próstata, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangeosarcoma, sarcoma de linfangeoendotelia, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma epidermoide, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadeocarcinoma, carcinoma bulbar, carcinoma broncógeno, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello de útero, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioblastomas, neuronomas, craneofaringiomas, schwanoma, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemias y linfomas, leucemia linfocítica aguda y policitemia vera mielocítica aguda, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y enfermedad de cadenas pesadas, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, cáncer de recto, cánceres urinarios, cánceres de útero, cánceres orales, cánceres de piel, cáncer de estómago, tumores cerebrales, cáncer de hígado, cáncer laríngeo, cáncer esofágico, tumores mamarios, leucemia linfoide aguda (LLA) nula en la niñez, LLA tímica, LLA de linfocito B, leucemia mieloide aguda, leucemia mielomonocitoide, leucemia aguda megacariocitoide, linfoma de Burkitt, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica y leucemia de linfocitos T, carcinoma broncopulmonares microcíticos y no mirocíticos, leucemia granulocítica aguda, tumores de células germinales, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, cáncer de la cabeza y el cuello, leucemia linfoide crónica, leucemia de células pilosas y cáncer de tiroides.
En una realización preferida, la composición de vacuna de acuerdo con la divulgación es capaz de provocar una respuesta clínica en el sujeto, en donde la respuesta clínica puede caracterizarse por una enfermedad estable, en una realización preferida, la respuesta clínica puede caracterizarse por una respuesta parcial o, preferentemente, la respuesta clínica puede caracterizarse por la remisión completa de un cáncer. Preferentemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en; melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cánceres hemáticas (tal como leucemias), cánceres de células renales y de colon.
En un aspecto de la divulgación, la composición de vacuna es capaz de provocar una respuesta clínica en un individuo. En una realización, la respuesta clínica puede caracterizarse por una enfermedad estable (sin empeoramiento ni progresión adicional), en una realización preferida, la respuesta clínica puede caracterizarse por una respuesta parcial o, preferentemente, la respuesta clínica puede caracterizarse por la remisión completa de un cáncer o infecciones. La respuesta clínica puede determinarse como se describe a continuación en el presente documento.
En otro aspecto de la divulgación, la composición de vacuna es capaz de provocar una respuesta clínica en el sujeto, en donde la respuesta clínica se caracteriza por una disminución en la suma del diámetro más largo de la lesión diana más grande. La disminución se puede determinar como se describe a continuación en el presente documento.
Todas las lesiones medibles hasta un máximo de cinco lesiones por órgano y 10 lesiones en total, representativas de todos los órganos implicados deben identificarse como lesiones diana y registrarse y medirse al inicio del estudio. • Las lesiones diana deben seleccionarse sobre la base de su tamaño (lesiones con el diámetro más largo) y su idoneidad para mediciones repetidas precisas (ya sea por técnicas de imagen o de manera clínica).
• Se calculará una suma del diámetro más largo (DL) para todas las lesiones diana y se informará como la suma DL inicial. La suma DL inicial se utilizará como referencia para caracterizar el tumor diana.
• Todas las demás lesiones (o sitios de enfermedad) deben identificarse como lesiones no diana y también deben registrarse al inicio del estudio. No se requieren mediciones de estas lesiones, pero se debe anotar la presencia o ausencia de cada uno a lo largo del seguimiento.
Evaluación de las lesiones diana
• Respuesta completa (RC): Desaparición de todas las lesiones diana
• Respuesta parcial (RP): Una disminución de al menos el 30 % en la suma del DL de las lesiones diana, tomando como referencia la suma DL inicial
• Enfermedad progresiva (EP): Una disminución de al menos el 20 % en la suma del DL de la lesiones diana, tomando como referencia la suma DL más pequeña registrada desde el inicio del tratamiento o la presencia de una o más lesiones nuevas
• Enfermedad estable (EE): Ni una contracción suficiente para calificar como RP ni un aumento suficiente para calificar como EP, tomando como referencia la suma DL más pequeña desde el inicio del tratamiento Evaluación de lesiones no diana
• Respuesta completa (RC): Desaparición de todas las lesiones no diana y normalización del nivel de marcadores tumorales
• Respuesta incompleta/enfermedad estable (EE): Persistencia de una o más lesiones no diana y/o mantenimiento del nivel del marcador tumoral por encima de los límites normales
• Enfermedad progresiva (EP): Aparición de una o más lesiones nuevas y/o progresión inequívoca de las lesiones no diana existentes
En una realización de la presente divulgación, la composición de vacuna que comprende cualquiera de las proteínas y/o polipéptidos mencionados en el presente documento es capaz de provocar una respuesta clínica en un sujeto, en donde la respuesta clínica se caracteriza por una disminución en la suma del diámetro más largo de la lesión diana más grande
Se contempla que la composición de vacuna de la divulgación sea capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un cáncer que exprese la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que tenga al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, cuando se administra a un individuo que padece un cáncer que expresa la TDO. La composición de vacuna de la divulgación es capaz de provocar en un individuo vacunado la producción de linfocitos T efectores que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas, las APC que expresan la TDO y/o induce la infiltración de linfocitos T específicos de antígeno en el estroma tumoral en un sujeto.
Además de su capacidad para provocar respuestas inmunitarias en poblaciones de PBL, también se contempla que los péptidos de la invención sean capaces de provocar respuestas inmunitarias citolíticas in situ, es decir, en tejidos tumorales sólidos. Esto puede demostrarse, por ejemplo, proporcionando complejos de HLA y péptido, por ejemplo, estando multimerizado y provisto de un marcador detectable, y utilizando dichos complejos para tinciones inmunohistoquímicas para detectar en un tejido tumoral CTL que son reactivos con el epítopo peptídico de la invención. Por consiguiente, otra característica importante del péptido es que es capaz de detectar in situ en un tejido tumoral CTL que son reactivos con el epítopo peptídico.
También se contempla que los péptidos, además de su capacidad para unirse a moléculas HLA dando como resultado la presentación de complejos de HLA y péptidos en la superficie celular, complejos que a su vez actúan como epítopos o dianas para los linfocitos T citolíticos, pueden provocar otros tipos de respuestas inmunitarias, tales como respuestas de linfocito B que dan como resultado la producción de anticuerpos contra los complejos y/o una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH, del inglés "Delayed Type Hypersensitivity"). El último tipo de respuesta inmunitaria se define como enrojecimiento e induración palpable en el sitio de inyección del péptido de la invención.
Es un objeto de la presente divulgación proporcionar una composición de vacuna que comprende la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que tiene al menos el 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que comprende una secuencia consecutiva de dicha TDO o dicho homólogo funcional de la misma o un ácido nucleico que codifica dicha TDO o dicho fragmento peptídico; y un adyuvante, para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento del cáncer.
Tratamiento combinado contra el cáncer
En algunos casos, será adecuado combinar el método de tratamiento divulgado con un tratamiento adicional contra el cáncer, tal como la quimioterapia, radioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimulantes, genoterapia, tratamiento con anticuerpos y tratamiento con células dendríticas.
Dado que la expresión elevada de la TDO en las células tumorales conduce a la inhibición del sistema inmunitario, la combinación de una inmunoterapia basada en TDO como se divulga con quimioterapia citotóxica u otro tratamiento inmunoterapéutico contra el cáncer es un enfoque eficaz para tratar el cáncer. Estos remedios también se denominan en el presente documento "segundos principios activos".
Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos que son de relevancia con respecto a la administración conjunta (secuencial o simultánea) con la composición de vacuna de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación: ácido retinoico, actimida, azacitidina, azatioprina, bleomicina, carboplatino, capecitabina, cisplatino, ambucil de cloro, ciclofosfamida, citarabina, daunorrubicina, docetaxel, doxifluridina, doxorrubicina, epirrubicina, etopósido, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, irinotecán, lenalidomida, leucovorina, mecloretamina, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, revlimid, temozolomida, tenipósido, tioguanina, valrrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorrelbina. En una realización, un agente quimioterapéutico para usar en la combinación del presente agente puede, en sí mismo, ser una combinación de diferentes agentes quimioterapéuticos. Las combinaciones adecuadas incluyen FOLFOX e IFL. FOLFOX es una combinación que incluye 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina y oxaliplatino. El tratamiento con IFL incluye irinotecán, 5-FU y leucovorina.
Otro segundo principio activo puede ser un inhibidor de cinasa, para uso por separado, simultáneo o combinado en el tratamiento de tumores. Los inhibidores de cinasas adecuados incluyen aquellos que se ha demostrado que poseen actividad antitumoral (tales como gefitinib (Iressa) y erlotinib (Tarceva) y estos podrían utilizarse en combinación con los péptidos. Los inhibidores de la tirosina cinasa del receptor, como el malato de sunitinib y el sorafenib, que han demostrado ser eficaces en el tratamiento del carcinoma de células renales, también son adecuados para su uso como segundos principios activos.
Otros ejemplos de segundos principios activos son sustancias inmunoestimulantes, por ejemplo, citocinas y anticuerpos. Dichas citocinas pueden seleccionarse del grupo que consiste en, pero sin limitación: GM-CSF, IFN de tipo I, interleucina 21, interleucina 2, interleucina 12 e interleucina 15. El anticuerpo es preferentemente un anticuerpo inmunoestimulante tal como anticuerpos anti-CD40 o anti-CTLA-4. La sustancia inmunoestimuladora también puede ser una sustancia capaz de reducir las células inmunitarias inhibidoras (por ejemplo, linfocitos T reguladores) o factores, pudiendo ser dicha sustancia, por ejemplo, ubiquitina ligasas E3. Las ubiquitina ligasas E3 (las proteínas HECT, RING y U-box) han surgido como reguladores moleculares clave de la función de las células inmunitarias, y cada una puede estar implicada en la regulación de las respuestas inmunitarias durante la infección al dirigirse a moléculas inhibidoras específicas para la destrucción proteolítica. Varias proteínas HECT y RING E3 ahora también se han relacionado con la inducción y el mantenimiento de la autotolerancia inmunitaria: c-Cbl, Cbl-b, GRAIL, Itch y Nedd4 regulan negativamente la producción y proliferación del factor de crecimiento de linfocitos T. En una realización, la composición de vacuna de la presente invención, que comprende un polipéptido procedente de la TDO, se administra en combinación con un segundo principio activo, como una sustancia inmunoestimuladora. La sustancia inmunoestimuladora es preferentemente una interleucina tal como IL-21 o IL-2 o un agente quimioterapéutico.
Las composiciones de vacuna de la divulgación también pueden comprender uno o más antígenos adicionales además de la TDO. Dichos antígenos, pueden ser, por ejemplo, péptidos inmunogénicamente activos procedentes de proteínas asociadas al cáncer. Por lo tanto, las composiciones de vacuna de la divulgación también pueden comprender, además de la TDO y/o fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la misma, uno o más de los siguientes:
1) IDO
2) Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de IDO
3) Un homólogo funcional de 1) o 2)
4) Un polipéptido que comprende 1), 2) o 3)
5) Un ácido nucleico que codifica cualquiera de 1), 2), 3) o 4).
Dicho IDO puede ser en particular IDO de SEQ ID NO: 1 del documento WO 2009/143843, IDO de SEQ ID NO: 13 del documento WO 2009/143843, IDO de SEQ ID NO: 14 del documento WO 2009/143843, IDO de SEQ ID NO: 15 del documento WO 2009/143843 o IDO de SEQ ID NO: 16 del documento WO 2009/143843. Los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos útiles de IDO, que pueden estar contenidos en las composiciones de vacuna se describen en el documento WO 2009/143843.
Las composiciones de vacuna de la divulgación también pueden comprender, además de la TDO y/o fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la misma, uno o más de los siguientes:
1) PD-L1
2) Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de PD-L1
3) Un homólogo funcional de 1) o 2)
4) Un polipéptido que comprende 1), 2) o 3)
5) Un ácido nucleico que codifica cualquiera de 1), 2), 3) o 4).
Dicho PD-L1 puede ser en particular PD-L1 de SEQ ID NO: 1 del documento WO2013/056716. Los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos útiles de PD-L1, que pueden estar contenidos en las composiciones de vacuna se describen en el documento WO2013/056716.
En otra realización de la divulgación, las composiciones de vacuna divulgadas en el presente documento son para el tratamiento o la prevención de una afección inflamatoria.
La expresión "afección inflamatoria", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier tipo de afección clínica que dé lugar a una respuesta inmunitaria, tal como una inflamación y, por lo tanto, incluye enfermedades infecciosas, infecciones crónicas, enfermedades autoinmunitarias e inflamaciones alérgicas. Por lo tanto, las afecciones inflamatorias, tales como las enfermedades infecciosas, infecciones crónicas, afecciones autoinmunitarias e inflamaciones alérgicas son todas afecciones clínicas de relevancia para la presente invención y se tratan sucesivamente a continuación.
La inflamación es la respuesta biológica compleja de los tejidos vasculares a los estímulos dañinos, tales como patógenos, células dañadas o irritantes. Es un intento protector del organismo para eliminar los estímulos nocivos e iniciar el proceso de curación del tejido. La inflamación puede clasificarse como aguda o crónica. La inflamación aguda es la respuesta inicial del organismo a un estímulo dañino y se consigue mediante el movimiento aumentado de plasma y leucocitos desde la sangre a los tejidos lesionados. Una cascada de eventos bioquímicos se propaga y madura la respuesta inflamatoria, implicando al sistema vascular local, al sistema inmunitario y a diversas células dentro del tejido lesionado. La inflamación prolongada, conocida como inflamación crónica, da lugar a un cambio progresivo en el tipo de células presentes en el sitio de inflamación y se caracteriza por la destrucción y la curación simultánea del tejido desde el proceso inflamatorio. En cualquier caso, la TDO se expresa en células del sistema inmunitario como las APC y, por lo tanto, las infecciones e inflamaciones son afecciones clínicas que pueden tratarse, evitarse o cuyo riesgo puede reducirse mediante la administración de la composición de vacuna de la presente invención. La composición de vacuna comprende preferentemente la proteína TDO, fragmentos de proteínas, polipéptido o péptidos procedentes de la misma u homólogos funcionales de cualquiera de estos.
Los ejemplos de trastornos asociados con la inflamación que son relevantes para la presente divulgación incluyen, pero sin limitación: inflamaciones alérgicas, asma, enfermedades autoinmunitarias, inflamaciones crónicas, prostatitis crónica, glomerulonefritis, hipersensibilidades, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes y vasculitis.
Inflamaciones crónicas
La inflamación crónica es especialmente relevante con respecto a la presente divulgación. Una inflamación crónica es una afección patológica caracterizada por una inflamación activa simultánea, destrucción de tejidos e intentos de reparación. El tejido inflamado de manera crónica se caracteriza por la infiltración de células inmunitarias mononucleares (monocitos, macrófagos, linfocitos y células plasmáticas), destrucción de tejidos e intentos de curación, que incluyen angiogénesis y fibrosis.
En la inflamación aguda, la eliminación del estímulo detiene el reclutamiento de monocitos (que se convierten en macrófagos con la activación adecuada) en el tejido inflamado y los macrófagos existentes salen del tejido a través del sistema linfático. Sin embargo, en el tejido inflamado de manera crónica, el estímulo es persistente y, por lo tanto, se mantiene el reclutamiento de monocitos, los macrófagos existentes están anclados en su lugar y se estimula la proliferación de macrófagos (especialmente en placas de ateroma).
Es un objeto de la presente divulgación proporcionar una composición de vacuna que comprende la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que tiene al menos el 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que comprende una secuencia consecutiva de dicha TDO o dicho homólogo funcional de la misma o un ácido nucleico que codifica dicha TDO o dicho fragmento peptídico; y un adyuvante, para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de inflamaciones crónicas.
Enfermedades infecciosas
La composición de vacuna de la presente divulgación puede utilizarse para prevenir, reducir el riesgo o tratar una afección clínica. En una realización preferida de la divulgación, la afección clínica es una enfermedad infecciosa. La enfermedad infecciosa puede promoverse por cualquier agente infeccioso tal como bacterias, virus, parásitos y/u hongos que son capaces de inducir un aumento de la expresión de la TDO en el individuo que padece la enfermedad infecciosa, preferentemente, la enfermedad infecciosa es o corre el riesgo de convertirse en una enfermedad crónica. Tal como se describe en los antecedentes, el aumento de la expresión de la TDO tiene un efecto inmediato sobre los agentes microbianos en la vecindad del organismo que expresa la TDO al privarlo de triptófano. Sin embargo, este enfoque es contraproducente, ya que el aumento de la expresión de la TDO induce a inhibir la actividad de los linfocitos Treg, si la célula que expresa la TDO es una APC. Por lo tanto, es un aspecto de la presente divulgación proporcionar una composición de vacuna que comprenda la proteína TDO, fragmentos de proteínas, péptidos y/o una variante de cualquiera de estos para el tratamiento, mejora (disminución de la gravedad), estabilización y/o prevención de una enfermedad causada por un agente infeccioso.
Las enfermedades infecciosas pueden producirse por un virus, y las enfermedades víricas contra las cuales se puede administrar la composición de vacuna de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a las siguientes enfermedades víricas: VIH, SIDA, complejo relacionado con el SIDA, peste cristal (Varicela), resfriado común, infección por citomegalovirus, fiebre por garrapatas de Colorado, fiebre del dengue, fiebre hemorrágica del Ébola, Hand, fiebre aftosa, hepatitis, herpes simple, herpes zóster, VPH (virus del papiloma humano), influenza (gripe), fiebre de Lassa, sarampión, fiebre hemorrágica de Marburgo, mononucleosis infecciosa, paperas, norovirus, poliomielitis, leucoencefalopatía multifocal progresiva, rabia, rubeola, SARS, virus de la viruela (viruela), encefalitis vírica, gastroenteritis vírica, meningitis vírica, neumonía vírica, enfermedad del Nilo Occidental y fiebre Amarilla. Preferentemente, la composición de vacuna se administra a individuos que padecen VIH/SIDA e infecciones víricas que pueden causar cáncer. Los principales virus asociados con los cánceres humanos son el papilomavirus humano, el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C, el virus de Epstein-Barr y el virus linfotrópico T humano; por tanto, es un objeto de la presente divulgación administrarse como tratamiento o como parte del tratamiento de estas infecciones víricas.
Los ejemplos de infecciones bacterianas incluyen, pero sin limitación: ántrax, meningitis bacteriana, botulismo, brucelosis, campilobacteriosis, enfermedad por arañazo de gato, cólera, difteria, tifus epidémico, gonorrea, impétigo, legionelosis, lepra (enfermedad de Hansen), leptospirosis, listeriosis, enfermedad de Lyme, melioidosis, fiebre reumática, infección por MRSA, nocardiosis, pertusis (tosferina), peste, neumonía neumocócica, psitacosis, fiebre Q, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas (FMMR), salmonelosis, escarlatina, shigelosis, sífilis, tétanos, tracoma, tuberculosis, tularemia, fiebre tifoidea, tifus e infecciones del tracto urinario. Es un objeto de la presente divulgación proporcionar una vacuna para el tratamiento y/o prevención y/o reducción del riesgo de una infección bacteriana. Otro aspecto de la presente divulgación es proporcionar una composición de vacuna para el tratamiento y/o prevención y/o reducción del riesgo de: Enfermedades infecciosas parasitarias tales como, pero sin limitación: tripanosomiasis africana, amebiasis, ascariasis, babesiosis, enfermedad de Chagas, clonorquiasis, criptosporidiosis, cisticercosis, difilobotriasis, dracunculiasis, equinococosis, enterobiasis, fascioliasis, fasciolopsiasis, filariasis, infección amebiana de vida libre, giardiasis, gnatostomiasis, himenolepiasis, isoesporiasis, kala-azar, leishmaniasis, malaria, metagonimiasis, miasis, oncocercosis, pediculosis, infección por oxiuros, sarna, esquistosomiasis, teniasis, toxocariasis, toxoplasmosis, triquinosis, triquinosis, tricuriasis, tricomoniasis y tripanosomiasis; Enfermedades infecciosas fúngicas tales como, pero sin limitación: aspergilosis, blastomicosis, candidiasis, coccidioidomicosis, criptococosis, histoplasmosis, Tinea pedis; Enfermedades infecciosas por priones tales como, pero sin limitación: encefalopatía espongiforme transmisible, encefalopatía espongiforme bovina, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, insomnio familiar Kuru-fatal y síndrome de Alpers; por tanto, es un objeto de la presente invención administrarse como tratamiento o como parte del tratamiento de estas infecciones causadas por parásitos, hongos o priones. Tratamiento combinado de enfermedades infecciosas
Se proporciona además que se pueda administrar un tratamiento de cualquier enfermedad infecciosa mediante la administración de la composición de vacuna de acuerdo con la presente divulgación junto con un (segundo) principio activo adicional o en combinación con un tratamiento adicional tal como un tratamiento con antibióticos, quimioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimulantes, tratamiento con células dendríticas, agentes antivíricos, agentes antiparasitarios, etc.
Los ejemplos de un segundo principio activo que puede utilizarse en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en combinación con la vacuna incluyen, pero sin limitación, antibióticos. En el presente documento, el término antibióticos se refiere a sustancias con actividad antibacteriana, antifúngica, antivírica y/o antiparasitaria; los ejemplos incluyen, pero sin limitación: amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, estreptomicina, tobramicina, ertapenem, imipenem, meropenem, cloranfenicol, fluoroquinolonas, ciprofloxacino, gatifloxacino, gemifloxacino, grepafloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, norfloxacino, ofloxacino, esparfloxacino, trovafloxacino, glucopéptidos, vancomicina, lincosamidas, clindamicina, macrólidos/cetólidos, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, cefadroxilo, cefazolina, cefalexina, cefalotina, cefapirina, cefradina, cefaclor, cefamandol, cefonicid, cefotetan, cefoxitina, cefprozilo, cefuroxima, loracarbef, cefdinir, cefditoreno, cefixima, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepima, monobactamos, aztreonam, nitroimidazoles, metronidazol, oxazolidinonas, linezolida, penicilinas, amoxicilina, amoxicilina/clavulanato, ampicilina, sulbactam, bacampicilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, piperacilina/tazobactam, ticarcilina, ticarcilina/clavulanato, estreptograminas, quinupristina, dalfopristina, sulfonamida/sulfametoxazol, trimetoprima, tetraciclinas, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, tetraciclina, antifúngicos azólicos clotrimazol fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol, voriconazol, anfotericina B, nistatina, equinocandina, caspofungina, micafungina, ciclopirox, flucitosina, griseofulvina y terbinafina. De mayor relevancia son los antivíricos tales como vidarabina, aciclovir, gancyclovir y valcyte (valganciclovir), inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos (NRTI): AZT (Zidovudina), ddl (Didanosina), ddC (Zalcitabina), d4T (Estavudina), 3TC (Lamivudina), inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosídicos (NNRTI): nevirapina, delavirdina, inhibidores de proteasas: saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, ribavirina, amantadina/rimantadina, relenza y tamiflu, pleconarilo, interferones.
En una realización, la presente divulgación se refiere a una composición de vacuna que comprende proteínas procedentes de la TDO, polipéptidos y/u homólogos funcionales de esta para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en combinación con al menos un antibiótico. Preferentemente, la composición de vacuna de la presente divulgación se utiliza para el tratamiento de infecciones crónicas, por ejemplo, el VIH y, por lo tanto, se utiliza en combinación con cualquiera de los antibióticos enumerados anteriormente, tales como agentes antivíricos.
Enfermedades autoinmunitarias
Las enfermedades autoinmunitarias surgen cuando un organismo no reconoce sus propias partes constituyentes (hasta los niveles submoleculares) como uno mismo, lo que da como resultado una respuesta inmunitaria contra sus propias células y tejidos. Cualquier enfermedad que resulte de dicha respuesta inmunitaria anómala se denomina enfermedad autoinmunitaria y es relevante para la presente divulgación. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: enfermedad celíaca, diabetes mellitus de tipo 1 (iDDM), lupus eritematoso sistémico (LES), síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple (EM), tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática y artritis reumatoide (AR).
Es un objeto de la presente divulgación proporcionar una composición de vacuna que comprende la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que tiene al menos el 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o un fragmento peptídico hipnogénicamente activo que comprende una secuencia consecutiva de dicha TDO o dicho homólogo funcional de la misma o un ácido nucleico que codifica dicha TDO o dicho fragmento peptídico; y un adyuvante, para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.
Tratamiento combinado de enfermedades autoinmunitarias
Los tratamientos actuales para las enfermedades autoinmunitarias suelen ser inmunosupresores, antiinflamatorios o paliativos. Las terapias no inmunitarias, tales como el reemplazo hormonal en la tiroiditis de Hashimoto o los resultados del tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 1 de la respuesta autoagresiva. La manipulación dietética limita la gravedad de la enfermedad celíaca. El tratamiento con esteroides o AINE limita los síntomas inflamatorios de muchas enfermedades. Las preparaciones intravenosas de inmunoglobulina (IVIG) se utilizan para la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) y el síndrome de Guillain-Barré (GBS). Se ha demostrado que las terapias inmunomoduladoras más específicas, tales como el antagonista de TNFa Etanercept, son útiles en el tratamiento de la AR. Estas inmunoterapias pueden estar asociadas con un mayor riesgo de efectos adversos, tales como la susceptibilidad a las infecciones.
La terapia helmíntica se ha desarrollado basándose en estas observaciones e implica la inoculación del individuo con nematodos intestinales parásitos específicos (helmintos). Actualmente hay disponibles dos tratamientos estrechamente relacionados, la inoculación con Necator americanus, comúnmente conocido como anquilostomas, o con huevos de Trichuris Suis, comúnmente conocido como huevos de látigo de cerdo. Hay investigaciones disponibles que demuestran que este enfoque es muy eficaz en el tratamiento de una variedad de trastornos autoinmunitarios, incluyendo la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, asma, alergias, esclerosis múltiple y trastornos inflamatorios crónicos
En una realización, la vacuna divulgada en el presente documento se utiliza en combinación con un segundo principio activo, tal como cualquiera de los fármacos y tratamientos mencionados anteriormente contra enfermedades autoinmunitarias.
Inflamación alérgica
La alergia es un trastorno del sistema inmunitario que a menudo también se conoce como atopia. Las reacciones alérgicas se producen ante sustancias ambientales conocidas como alérgenos; estas reacciones son adquiridas, predecibles y rápidas. Estrictamente, la alergia es una de las cuatro formas de hipersensibilidad y se denomina hipersensibilidad de tipo I (o inmediata). Se caracteriza por una activación excesiva de determinados glóbulos blancos llamados mastocitos y basófilos por un tipo de anticuerpo, conocido como IgE, que da como resultado una respuesta inflamatoria extrema. Las reacciones alérgicas comunes incluyen eccema, habones, rinitis alérgica estacional, asma, alergias alimentarias y reacciones al veneno de insectos que pican tales como avispas y abejas. La inflamación alérgica es una característica fisiopatológica importante de varias discapacidades o afecciones médicas, incluido el asma alérgica, dermatitis atópica, rinitis alérgica y varias enfermedades alérgicas oculares. Es un objeto de la presente divulgación proporcionar una composición de vacuna que comprende la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que tiene al menos el 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que comprende una secuencia consecutiva de dicha TDO o dicho homólogo funcional de la misma o un ácido nucleico que codifica dicha TDO o dicho fragmento peptídico; y un adyuvante, para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de la inflamación alérgica.
Tratamiento combinado de inflamación alérgica
Hay dos tipos de tratamientos disponibles para el tratamiento de inflamaciones alérgicas, farmacoterapia e inmunoterapia: farmacoterapia e inmunoterapia.
La farmacoterapia es el uso de fármacos antagonistas para bloquear la acción de mediadores alérgicos, o para prevenir la activación de células y de procesos de desgranulación. Estos incluyen antihistamínicos, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, epinefrina (adrenalina), teofilina, cromoglicato sódico y antileucotrienos, tales como montelukast (Singulair) o zafirlukast (Accolate); anticolinérgicos, descongestivos, estabilizadores de mastocitos y otros compuestos que se cree que afectan la quimiotaxis de eosinófilos también se utilizan comúnmente.
La inmunoterapia es el tratamiento de desensibilización o hiposensibilización en el que el individuo se vacuna gradualmente con dosis progresivamente mayores del alérgeno en cuestión. Una segunda forma de inmunoterapia implica la inyección intravenosa de anticuerpos monoclonales anti-IgE. Un tercer tipo, la inmunoterapia sublingual, es una terapia administrada por vía oral que aprovecha la tolerancia inmunitaria oral a antígenos no patógenos tales como alimentos y bacterias residentes.
En una realización, la vacuna divulgada en el presente documento se utiliza en combinación con un segundo principio activo, tal como cualquiera de los fármacos y tratamientos mencionados anteriormente contra inflamaciones alérgicas.
Composiciones farmacéuticas
La presente divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas capaces de tratar, reducir el riesgo y/o prevenir un trastorno clínico asociado con la expresión de la TDO en un individuo. En particular, dicha composición farmacéutica puede ser una composición de vacuna. Las composiciones de vacuna divulgadas en el presente documento pueden ser composiciones de vacuna "tradicionales" que comprenden antígenos tales como proteínas, polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico. También pueden estar en forma de composiciones que comprenden células, tales como células modificadas que se originan en el individuo y después se procesan, o composiciones que comprenden moléculas complejas tales como anticuerpos o TCR.
En general, una vacuna es una sustancia o composición capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un individuo. La composición puede comprender uno o más de los siguientes: un "componente activo" tal como un antígeno(s) (por ejemplo, proteína, polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos y similares), construcciones de ácido nucleico que comprenden uno o más antígenos entre otros elementos, células, (por ejemplo, linfocitos T o APC cargadas para transferencia adoptiva), moléculas complejas (anticuerpos, TCR y complejos MHC y más), transportadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticos. En lo sucesivo, los diversos componentes de una composición de vacuna se divulgan con más detalle.
La composición de vacuna de la divulgación es capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un cáncer, CD o APC que expresan la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo que tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO 1, cuando se administra a un individuo que padece cáncer y/o infección (que conduce a la expresión de la TDO). En una realización preferida, la afección clínica es un cáncer. La composición de vacuna de la divulgación es capaz de provocar en un individuo vacunado la producción de linfocitos T efectores que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas, APC y CD que expresan la TDO y/o inducen la infiltración de los linfocitos T específicos de antígeno en el estroma tumoral en un sujeto.
Antígenos y otros componentes activos
Composiciones de vacuna a base de proteínas/polipéptidos
Los péptidos de la presente divulgación se unen con una afinidad sorprendentemente elevada (véase la figura 2) y están listos para su uso como antígenos tal como se presentan en el presente documento. Preferentemente, la composición de vacuna de la presente divulgación comprende uno o más de los siguientes:
1) Triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO), que puede ser cualquiera de las TDO descritas en el presente documento a continuación en la sección "Triptófano 2,3-dioxigenasa";
2) Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO que comprende una secuencia de aminoácidos consecutiva de la TDO, que puede ser cualquiera de los péptidos descritos a continuación en el presente documento en la sección "Fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO".
3) Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO, que es un fragmento peptídico restringido por MHC de clase I o un fragmento peptídico restringido por MHC de clase II, tal como cualquiera de los fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase I o de los fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase II descritos en la sección "MHC";
4) Un homólogo funcional de los polipéptidos de 1), 2) y 3);
5) Un polipéptido que comprende cualquiera de los polipéptidos de 1), 2), 3) y 4), que puede ser cualquiera de los polipéptidos descritos a continuación en el presente documento en la sección "Polipéptidos que comprenden la TDO o un fragmento de la misma";
6) Un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos de 1), 2), 3) y 4).
La elección del antígeno en la composición de vacuna de la divulgación dependerá de parámetros determinables por el experto en la materia. Como se ha mencionado, cada uno de los diferentes péptidos de la invención se presenta en la superficie celular por una molécula HLA particular. De este modo, si un sujeto a tratar está tipificado con respecto al fenotipo HLA, se selecciona un péptido/péptidos que se sabe que se une/unen a esa molécula HLA particular. Como alternativa, el antígeno de interés se selecciona basándose en la prevalencia de los diversos fenotipos HLA en una población determinada. Como un ejemplo, HLA-A2 es el fenotipo más prevalente en la población caucásica y, por lo tanto, una composición que contiene un péptido que se une a HLA-A2 será activa en una gran proporción de esa población. Además, los antígenos/péptidos divulgados pueden modificarse de acuerdo con los motivos de restos de anclaje presentados en la tabla 2, para mejorar la unión a moléculas HLA particulares. La composición de la divulgación también puede contener una combinación de dos o más fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO, por ejemplo, cualquiera de los péptidos descritos en las secciones "Fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO", "Polipéptidos que comprenden la TDO o un fragmento de la misma" y "MHC". Dichos fragmentos peptídicos hipnogénicamente activos de la TDO pueden interactuar cada uno de manera específica con una molécula HLA diferente para cubrir una proporción mayor de la población diana. Por lo tanto, como ejemplos, la composición farmacéutica puede contener una combinación de un péptido restringido por una molécula HLA-A y un péptido restringido por una molécula HLA-B, por ejemplo, incluyendo aquellas moléculas HLA-A y HLA-B que corresponden a la prevalencia de fenotipos HLA en la población diana, tal como, por ejemplo, HLA-A2 y HLA-B35. Además, la composición puede comprender un péptido restringido por una molécula HLA-C.
En el caso de las vacunas a base de péptidos, los epítopos se pueden administrar en una forma 'lista para MHC', que permite la presentación a través de una carga exógena independientemente de la captación de antígenos y el procesamiento por las células presentadoras de antígenos del hospedador. Los péptidos divulgados comprenden ambos péptidos en una forma corta "lista para MHC" y en una forma más larga que requiere el procesamiento por parte del proteasoma, proporcionando así una composición de vacuna más compleja que puede dirigirse a múltiples antígenos tumorales. Cuantos más grupos HLA diferentes sean el objetivo de una vacuna, mayor probabilidad de que la vacuna funcione en poblaciones diversas.
Composición de vacuna de múltiples epítopos
La divulgación también se refiere a vacunas multiepítopo altamente inmunogénicas. Preferentemente, dichas vacunas deben diseñarse para facilitar una administración simultánea de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO más adecuados, opcionalmente en combinación con otros péptidos y/o adyuvantes adecuados como se describe a continuación en el presente documento. La presente divulgación abarca dichas vacunas de múltiples epítopos que comprenden fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO, opcionalmente en combinación con otras proteínas o fragmentos peptídicos que no pertenecen ni proceden de la TDO y/o adyuvantes como se describe a continuación en el presente documento. Un factor importante que impulsa el desarrollo de vacunas que tienen una composición más compleja es el deseo de dirigirse a múltiples antígenos tumorales, por ejemplo, mediante el diseño de vacunas que comprenden o codifican una colección de epítopos de CTL y linfocitos Th cuidadosamente seleccionados. Por tanto, la divulgación, en un aspecto, se refiere a composiciones de vacuna que comprenden epítopos de la TDO restringidos tanto de clase I como de clase II.
Por tanto, los péptidos divulgados comprenden ambos péptidos en una forma corta "lista para MHC" (restringida en clase I) y en una forma más larga que requiere el procesamiento por parte del proteasoma (restringida en clase II). Por lo tanto, la composición de acuerdo con la presente divulgación puede proporcionarse como una vacuna de múltiples epítopos que comprende un epítopo restringido de clase I y/o epítopos restringidos de clase II como se definió anteriormente en el presente documento.
Composición de vacuna basada en ácido nucleico
La composición de vacuna de acuerdo con la presente divulgación puede comprender un ácido nucleico que codifica un polipéptido TDO o un fragmento peptídico inmunológicamente activo del mismo. Por tanto, dicho ácido nucleico puede codificar cualquiera de las proteínas y fragmentos peptídicos mencionados anteriormente. El ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADN, ARN, LNA, HNA, APN, preferentemente el ácido nucleico es ADN o ARN.
Los ácidos nucleicos divulgados pueden estar comprendidos en cualquier vector adecuado, tal como un vector de expresión. Se encuentran disponibles numerosos vectores y el experto en la materia podrá seleccionar un vector útil para el propósito específico. El vector puede, por ejemplo, estar en forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica o cromosoma artificial. La secuencia de ácido nucleico adecuada puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos, por ejemplo, el ADN puede insertarse en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción adecuados utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Aparte de la secuencia de ácido nucleico divulgada, el vector puede comprender además una o más de una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. El vector también puede comprender secuencias adicionales, tales como potenciadores, colas de poli-A, enlazadores, polienlazadores, enlazadores operativos, múltiples sitios de clonación (MCS), codones de terminación, sitios de entrada ribosómica internos (IRES) y secuencias homólogas del hospedador para la integración u otros elementos definidos. Los métodos para genomanipular construcciones de ácido nucleico son bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 2.a edición, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). El vector es, preferentemente, un vector de expresión, que comprende el ácido nucleico unido operativamente a una secuencia reguladora de ácido nucleico que dirige la expresión del mismo en una célula adecuada. Dentro del alcance de la presente divulgación, dicha secuencia reguladora de ácido nucleico debería ser, en general, capaz de dirigir la expresión en una célula de mamífero, preferentemente una célula humana, más preferentemente en una célula presentadora de antígenos.
En una realización preferida de la divulgación, el vector es un vector vírico. El vector también puede ser un vector bacteriano, tal como un vector bacteriano atenuado. Pueden usarse vectores bacterianos atenuados para inducir respuestas inmunitarias de la mucosa duraderas en los sitios de infección y persistencia. Se pueden utilizar como vectores diferentes bacterias recombinantes, por ejemplo, el vector bacteriano puede seleccionarse del grupo que consiste en Salmonella, Lactococcus y Listeria. En general, se pudo demostrar la inducción de inmunidad al antígeno heterólogo HPV16 L1 o E7, con fuerte inducción de CTL y regresión tumoral en ratones. El vector puede comprender además un ácido nucleico que codifica un polipéptido estimulador de linfocitos T.
APC cargadas
En realizaciones útiles de la divulgación, se provoca una respuesta inmunitaria dirigida contra una enfermedad cancerosa mediante la administración del péptido de la invención, ya sea cargando moléculas de MHC de clase I o de clase II en células presentadoras de antígeno (APC) del individuo, mediante el aislamiento de PBL del individuo y la incubación de las células con el péptido antes de inyectar las células nuevamente en el individuo o mediante el aislamiento de las APC precursoras del individuo y la diferenciación de las células en APC profesionales utilizando citocinas y antígeno antes de inyectar las células nuevamente en el individuo.
Por tanto, un aspecto de la divulgación es proporcionar composiciones de vacuna que comprenden células presentadoras de antígenos que comprenden la TDO o un fragmento peptídico inmunológicamente activo de la misma o un ácido nucleico que codifica dicha proteína o dicho fragmento peptídico inmunológicamente activo. La célula presentadora de antígenos puede ser cualquier célula capaz de presentar un antígeno a un linfocito T. Las células presentadoras de antígenos preferidas son las células dendríticas. Las células dendríticas (CD) pueden prepararse y utilizarse en procedimientos terapéuticos de acuerdo con cualquier protocolo adecuado, por ejemplo, como se describe a continuación en el presente documento. El experto en la materia apreciará que el protocolo puede adoptarse para su uso con individuos con diferentes tipos de HLA y diferentes enfermedades.
Las células dendríticas (CD) pueden pulsarse con 50 pg/ml de péptido restringido por HLA (sintetizado con calidad GMP) durante 1 h a 37 °C y se administran 5 * 106 células por vía subcutánea los días 1 y 14, posteriormente cada 4 semanas y leucocitaféresis adicional después de 5 vacunaciones. La generación de CD para uso clínico y control de calidad se puede realizar esencialmente como se describe en Nicolette et al., (2007).
Por lo tanto, en una realización de la presente divulgación, un método para tratar a un individuo que padece una afección clínica caracterizada por la expresión de TDO, preferentemente en donde la afección clínica es un cáncer o una infección, es uno en donde el péptido se administra presentando el péptido a las células presentadoras de antígenos (APC) del individuo ex vivo seguido de la inyección de las APC así tratadas nuevamente en el individuo. Hay al menos dos formas alternativas de realizar esto. Una alternativa es aislar las APC del individuo e incubar (cargar) las moléculas de MHC de clase I con el péptido. Cargar las moléculas de MHC de clase I significa incubar las APC con el péptido para que las APC con moléculas de MHC de clase I específicas para el péptido se unan al péptido y, por lo tanto, puedan presentarlo a los linfocitos T. Posteriormente, las APC se vuelven a inyectan en el individuo. Otra forma alternativa se basa en los recientes descubrimientos realizados en el campo de la biología de las células dendríticas. En este caso, los monocitos (que son precursores de las células dendríticas) se aíslan del individuo y se diferencian in vitro en APC profesionales (o células dendríticas) mediante el uso de citocinas y antígeno. Posteriormente, las CD generadas in vitro se pulsan con el péptido y se inyectan en el individuo.
Inmunoterapia adoptiva/transferencia adoptiva
Un aspecto importante de la divulgación se refiere al cultivo de linfocitos T específicos de la TDO in vitro y la transferencia adoptiva de estos a los individuos. La transferencia adoptiva significa que el médico transfiere a un individuo directamente los componentes reales del sistema inmunitario que ya son capaces de producir una respuesta inmunitaria específica.
Uno de los objetivos de la presente divulgación es proporcionar linfocitos T específicos de la TDO, que pueden ser útiles, por ejemplo, para la transferencia adoptiva. Los linfocitos T aislados que comprenden receptores de linfocitos T capaces de unirse de manera específica a complejos de péptido TDO y MHC de clase I o complejos de péptido TDO y MHC de clase II pueden transferirse adoptivamente a individuos, siendo dichos linfocitos T preferentemente linfocitos T que se han expandido in vitro, en donde el péptido TDO puede ser cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO mencionados anteriormente en el presente documento. Los métodos de expansión de los linfocitos T in vitro son bien conocidos por el experto en la materia. También se divulgan métodos de tratamiento que comprenden la administración a un individuo de linfocitos T que comprenden receptores de linfocitos T capaces de unirse de manera específica a un complejo de péptido TDO restringido por MHC, tal como un ser humano que padece una enfermedad cancerosa, en donde el péptido procedente de la TDO puede ser cualquiera de los péptidos TDO mencionados anteriormente en el presente documento. La divulgación se refiere además al uso de linfocitos T que comprenden receptores de linfocitos T capaces de unirse de manera específica a la TDO o a fragmentos peptídicos de la misma para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o una infección. La transferencia autóloga de linfocitos T se puede realizar de manera esencial como se describe en Walter et al., (1995).
Transferencia de TCR
En otra realización más, dichos linfocitos T podrían irradiarse antes de la transferencia adoptiva para controlar la proliferación en el individuo. Es posible diseñar genéticamente la especificidad de los linfocitos T mediante la transferencia del gen TCR (Engels et al., 2007). Esto permite la transferencia de linfocitos T que portan la especificidad del péptido TDO a los individuos. En general, el uso de linfocitos T para la inmunoterapia adoptiva es atractivo porque permite la expansión de los linfocitos T en un entorno sin tumores o virus y el análisis de la función de los linfocitos T antes de la infusión. La aplicación de linfocitos T modificados con el gen TCR (tal como linfocitos T transformados con una construcción de expresión que dirige la expresión de un TCR heterólogo) en la transferencia adoptiva tiene varias ventajas en comparación con la transferencia de líneas de linfocitos T: (i) la generación de linfocitos T redirigidos es generalmente aplicable. (ii) los TCR de alta o muy alta afinidad se pueden seleccionar o crear y utilizar para genomanipular linfocitos T. (iii) se pueden generar linfocitos T de alta avidez utilizando TCR optimizados con codones o murinizados que permitan una mejor expresión en la superficie de los TCR estabilizados. La genomanipulación de la especificidad de los linfocitos T mediante la transferencia de genes del receptor de linfocitos T (TCR) se puede realizar esencialmente como se describe en Morgan et al., (2006).
Transfección de TCR
El TCR con reactividad antitumoral conocida se puede introducir genéticamente en linfocitos T humanos primarios. Los genes que codifican las cadenas a y p del t Cr de un clon de CTL específico de un tumor se pueden transfectar en linfocitos T primarios y de esta manera reprogramar los linfocitos T con especificidad contra el antígeno tumoral. El ARN del TCR se transfecta en PBL mediante electroporación (Schaft et al., 2006). Como alternativa, los linfocitos T pueden recibir una nueva especificidad mediante la transferencia del gen TCR utilizando vectores retrovíricos (Morgan et al., 2006). Sin embargo, el provirus del vector retrovírico podría integrarse al azar en el genoma de las células transfectadas y posteriormente alterar el crecimiento celular. La electroporación de linfocitos T con ARN que codifica TCR supera esta desventaja, dado que el ARN solo está presente de manera transitoria en las células transfectadas y no puede integrarse en el genoma (Schaft et al., 2006). Además, la transfección de células se utiliza habitualmente en el laboratorio.
Adyuvantes y transportadores
Las composiciones de vacuna divulgadas en el presente documento pueden comprender preferentemente un adyuvante y/o un transportador. A continuación en el presente documento se dan ejemplos de adyuvantes y transportadores útiles. Por lo tanto, el polipéptido TDO, los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO u homólogos funcionales del mismo, los polipéptidos que comprenden el mismo ácido nucleico o que lo codifican pueden estar asociados en una composición con un adyuvante y/o un transportador.
Los adyuvantes son cualquier sustancia cuya mezcla en la composición de vacuna aumente o modifique de otro modo la respuesta inmunitaria a la TDO o a los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO, véase más abajo. Los transportadores son estructuras de andamios, por ejemplo, un polipéptido o un polisacárido, al que la TDO o fragmento peptídico de la misma es capaz de asociarse y que ayuda en la presentación de especialmente los péptidos divulgados.
Muchos de los péptidos de la divulgación son moléculas relativamente pequeñas y, por lo tanto, puede ser necesario en las composiciones descritas en el presente documento combinar los péptidos con diversos materiales tales como adyuvantes y/o transportadores, para producir vacunas, composiciones inmunogénicas, etc. Los adyuvantes, definidos en términos generales, son sustancias que favorecen la respuesta inmunitaria. Se proporciona una discusión general de los adyuvantes en Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2.a edición, 1986) en la páginas 61 a 63. Goding indica que, cuando el antígeno de interés es de bajo peso molecular o es poco inmunogénico, se recomienda el acoplamiento a un transportador inmunogénico. Ejemplos de dichas moléculas transportadoras incluyen hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina bovina, ovoalbúmina e inmunoglobulina aviar. También se ha sugerido que varios extractos de saponina son útiles como adyuvantes en composiciones inmunogénicas. Se ha propuesto utilizar el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), una citocina bien conocida, como adyuvante (Documento WO 97/28816).
Puede estar presente un transportador independientemente de un adyuvante. La función de un transportador puede ser, por ejemplo, aumentar el peso molecular de, en particular, fragmentos peptídicos para aumentar su actividad o inmunogenia, para conferir estabilidad, para aumentar la actividad biológica o para aumentar la semivida sérica. Además, un transportador puede ayudar a presentar la proteína TDO, polipéptido, homólogo funcional o fragmentos peptídicos de la misma con los linfocitos T. El transportador puede ser cualquier transportador adecuado conocido por un experto en la materia, por ejemplo, una proteína o una célula presentadora de antígenos. Una proteína transportadora podría ser, pero sin limitación, hemocianina de lapa californiana, proteínas séricas como transferrina, seroalbúmina bovina, albúmina de suero humano, tiroglobulina u ovoalbúmina, inmunoglobulinas u hormonas, tales como insulina o ácido palmítico. Para la inmunización de seres humanos, el transportador debe ser un transportador fisiológicamente aceptable para los seres humanos y seguro. Sin embargo, el toxoide tetánico y/o el toxoide diftérico son transportadores adecuados en una realización de la divulgación. Como alternativa, el transportador puede ser un dextrano, por ejemplo, sefarosa.
Por tanto, es un aspecto de la presente divulgación que la proteína TDO, fragmento de polipéptido, variante o péptido procedente de la misma está presente en la composición se asocia con un transportador tal como, por ejemplo, una proteína de las anteriores o una célula presentadora de antígenos tal como, por ejemplo, una célula dendrítica (CD).
Los adyuvantes podrían, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en: AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4 (SO4), silica, alumbre, Al(OH)3, Ca3(PO4)2, caolín, carbono, hidróxido de aluminio, dipéptidos de muramilo, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-nornuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también conocida como nor-MDP), N-acetilmuramiul-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxfosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, también denominada MTP-PE), RIBI (MPL+TDM+CWS) en una emulsión al 2 % de escualeno/Tween-80.RTM, lipopolisacáridos y sus diversos derivados, incluido el lípido A, adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvante incompleto de Freund, adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, poli Ic y poli ácidos AU), cera D de Mycobacterium, tuberculosis, sustancias encontradas en Cornyebacterium parvum, Bordetella pertussis o miembros del género Brucella), TiterMax, ISCOM, Quil A, ALUN (véanse los documentos US 58767 y 5.554.372), derivados del lípido A, derivados de la coleratoxina, derivados de HSP, derivados de LPS, matrices de péptidos sintéticos o GMDP, interleucina 1, interleucina 2, montanida ISA-51 y QS-21. Los adyuvantes preferidos para usar con la invención incluyen adyuvantes basados en aceite/tensioactivo tales como adyuvantes montanida (disponibles en Seppic, Bélgica), preferentemente montanida ISA-51. Otros adyuvantes preferidos son adyuvantes basados en ADN bacteriano, tales como adyuvantes que incluyen secuencias de oligonucleótidos CpG. Aún otros adyuvantes preferidos son los adyuvantes víricos basados en ARNbc, tal como poli I: C. Las imidazoquinilinas son otro ejemplo más de adyuvantes preferidos. Los adyuvantes más preferidos son los adyuvantes adecuados para uso humano.
Los adyuvantes de montanida (todos disponibles en Seppic, Bélgica), puede seleccionarse del grupo que consiste en montanida ISA-51, montanida ISA-50, montanida ISA-70, montanida ISA-206, montanida ISA-25, montanida ISA-720, montanida ISA-708, montanida ISA-763A, montanida ISA-207, montanida ISA-264, montanida ISA-27, montanida ISA-35, montanida ISA 51F, montanida ISA 016D y montanida IMS, preferentemente del grupo que consiste en montanida ISA-51, montanida IMS y montanida ISA-720, más preferentemente del grupo que consiste en montanida ISA-51. La montanida ISA-51 (Seppic, Inc.) es un adyuvante a base de aceite/tensioactivo en el que se combinan diferentes tensioactivos con un aceite mineral no metabolizable, un aceite metabolizable o una mezcla de los dos. Se preparan para su uso como una emulsión con una solución acuosa que comprende la TDO o un fragmento peptídico de la misma. El tensioactivo es oleato de manida. QS-21 (Antigenics; Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA) es un producto altamente purificado, saponina soluble en agua que se maneja como solución acuosa. Los adyuvantes QS-21 y montanida ISA-51 se pueden proporcionar en frascos estériles de un solo uso.
La citocina GM-CSF bien conocida es otro adyuvante preferido de la presente invención. La GM-CSF se ha utilizado como adyuvante durante una década y puede ser preferentemente GM-CSF como se describe en el documento WO 97/28816.
Las funcionalidades deseables de los adyuvantes que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención se enumeran en la siguiente tabla.
________________________________ Tabla 3: Modos de acción adyuvante_______
Acción Tipo de adyuvante Beneficio
1. Inmunomodulación Generalmente moléculas pequeñas o proteínas Aumento de la respuesta inmunitaria.
que modifican la red de citocinas Selección de Th1 o Th2
2. Presentación Generalmente moléculas o complejos anfipáticos Aumento de la respuesta de que interactúan con el inmunógeno en su anticuerpos neutralizantes. Mayor conformación nativa duración de la respuesta
3. Inducción de CTL • Partículas que pueden unirse a un inmunógeno o Procesamiento citosólico de proteína encerrarlo y que pueden fusionarse con las que produce péptidos restringidos de membranas celulares o romperlas clase 1 correctos
• Sin emulsiones para la unión directa del péptido Proceso simple si se conocen péptidos a la superficie celular MHC-1 promiscuos
4. Direccionamiento • Adyuvantes particulados que se unen al Uso eficaz de adyuvantes e inmunógeno. Adyuvantes que saturan las células inmunógenos de Kupffer Como anteriormente. También puede • Adyuvantes de hidratos de carbono que se determinar el tipo de respuesta si el dirigen a los receptores de lectina en macrófagos y direccionamiento es selectivo
CD
5. Generación de • Sin emulsión para microesferas o nanoesferas de Potencial de eficacia de la vacuna de depósito corto plazo a largo plazo dosis única
Fuente: Cox, J.C. y Coulter, A.R. (1997). Vaccine 15, 248-56.
Una composición de vacuna de acuerdo con la presente invención puede comprender más de un adyuvante. Además, la invención abarca una composición terapéutica que comprende además cualquier sustancia adyuvante y/o transportador que incluya cualquiera de los anteriores o combinaciones de los mismos. También se contempla que la proteína t Do , variantes o fragmentos peptídicos de la misma, y el adyuvante se pueden administrar por separado en cualquier secuencia adecuada. Preferentemente, las composiciones de vacuna comprenden un adyuvante de montanida tal como montanida ISA 51 o montanida ISA 720 o el adyuvante de GM-CSF.
Por consiguiente, la invención abarca una composición terapéutica que comprende además una sustancia adyuvante que incluye cualquiera de las anteriores o combinaciones de las mismas. También se contempla que el antígeno, es decir, el péptido de la invención y el adyuvante se pueden administrar de forma simultánea o separada en cualquier secuencia adecuada.
Dosis y administración
La cantidad de TDO o de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO en la composición de vacuna divulgada puede variar, dependiendo de la aplicación particular. Sin embargo, una dosis única de la composición peptídica es preferentemente de aproximadamente 10 |jg a aproximadamente 5000 |jg, más preferentemente de aproximadamente 50 jg a aproximadamente 2500 jg, tal como de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 1000 jg. En particular, en realizaciones en las que el individuo a tratar es un ser humano, entonces una dosis única puede estar en el intervalo de 50 jg a 500 jg, por ejemplo, en el intervalo de 80 jg a 300 jg, tal como en el intervalo de 100 jg a 250 jg de TDO o dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la TDO. Con frecuencia, las composiciones de vacuna se administran repetidamente a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la composición de vacuna se puede administrar al menos 2 veces, preferentemente al menos 5 veces, más preferentemente al menos 10 veces, tal como en el intervalo de 10 a 20 veces. La composición de vacuna también se puede administrar de forma continua. La administración puede repetirse con cualquier frecuencia útil. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones de vacuna se pueden administrar una vez a la semana, tal como una vez cada dos semanas, por ejemplo, una vez cada 3 semanas, tal como una vez al mes, por ejemplo, una vez cada dos meses, tal como una vez cada tres meses, por ejemplo, una vez al medio año, tal como una vez al año. En particular, las composiciones de vacuna se pueden administrar de forma continua. La frecuencia de administración puede alterarse durante dicho tiempo. En una realización, las composiciones de vacuna se administran de manera continua una vez cada 1 a 3 meses. Los modos de administración incluyen administración intradérmica, subcutánea e intravenosa, implantación en forma de formulación de liberación prolongada, etc. Todas y cada una de las formas de administración conocidas en la materia se incluyen en el presente documento. También se incluyen todas y cada una de las formas de dosificación convencionales que se conocen en la materia por ser adecuadas para formular composiciones peptídicas inmunogénicas inyectables, tales como formas y soluciones liofilizadas, suspensiones o formas de emulsión que contienen, si se requiere, vehículos y diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, conservantes, adyuvantes, componentes tampón, etc.
Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar y administrar utilizando cualquier protocolo convencional conocido por un experto en la materia. En los ejemplos 3 a 5 se dan ejemplos no limitantes de la preparación de una composición de vacuna de acuerdo con la invención, así como un ejemplo no limitante de la administración de tal como una vacuna. El experto en la materia apreciará que el protocolo se puede adaptar fácilmente a cualquiera de las composiciones de vacuna descritas en el presente documento. También se divulga una composición farmacéutica útil para tratar a un individuo que padece una afección clínica caracterizada por la expresión de la TDO, tal como un cáncer e infecciones.
El efecto inmunoprotector de la composición divulgada se puede determinar utilizando varios enfoques conocidos por los expertos en la materia. Una respuesta inmunitaria satisfactoria también puede determinarse mediante la aparición de reacciones DTH después de la inmunización y/o la detección de anticuerpos que reconocen de manera específica el péptido o péptidos de la composición de vacuna.
Las composiciones de vacuna divulgadas en el presente documento se pueden administrar a un individuo en cantidades terapéuticamente eficaces. La cantidad eficaz puede variar de acuerdo con una variedad de factores, tales como la condición del individuo, peso, género y edad. Otros factores incluyen el modo de administración.
Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar al individuo mediante una variedad de vías tales como subcutánea, tópica, oral e intramuscular. La administración de composiciones farmacéuticas se realiza por vía oral o parenteral. Los métodos de administración parenteral incluyen la administración tópica, intraarterial (directamente al tejido), intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o intranasal. También se divulgan formulaciones farmacéuticas tópicas, orales, sistémicas y parenterales adecuadas para su uso en los métodos de profilaxis y tratamiento con la composición de vacuna.
Por ejemplo, las composiciones de vacuna se pueden administrar en formas de dosificación oral tales como comprimidos, cápsulas (incluyendo cada una formulaciones de liberación programada y liberación sostenida), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, soluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o mediante inyección.
De manera análoga, también pueden administrarse en forma intravenosa (bolo o infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión o de forma intramuscular, utilizando todas las formas bien conocidas por los expertos en la materia farmacéutica. Una cantidad eficaz pero no tóxica de la vacuna, que comprende cualquiera de los compuestos descritos en el presente documento se puede emplear como agente profiláctico o terapéutico. También se incluyen todas y cada una de las formas de dosificación convencionales que se conocen en la materia por ser adecuadas para formular composiciones peptídicas inmunogénicas inyectables, tales como formas y soluciones liofilizadas, suspensiones o formas de emulsión que contienen, si se requiere, vehículos y diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, conservantes, adyuvantes, componentes tampón, etc.
Los modos de administración preferidos de la composición de vacuna divulgada incluyen, pero sin limitación, administración sistémica, tal como administración intravenosa o subcutánea, administración intradérmica, administración intramuscular, administración intranasal, administración oral, administración rectal, administración vaginal, administración pulmonar y generalmente cualquier forma de administración mucosa. Además, también se divulgan los medios para cualquiera de las formas de administración mencionadas en el presente documento.
Una vacuna de acuerdo con la presente divulgación se puede administrar una vez, o cualquier número de veces, tal como dos, tres, cuatro o cinco veces. La administración de la vacuna más de una vez tiene el efecto de estimular la respuesta inmunitaria resultante. La vacuna se puede reforzar de manera adicional mediante la administración de la vacuna en una forma o parte del cuerpo diferente de la administración anterior. La vacuna de refuerzo es homóloga o heteróloga. Una inyección de refuerzo homóloga es una vacuna en la que la primera vacunación y las posteriores comprenden las mismas construcciones y, más específicamente, el mismo vehículo de administración, especialmente el mismo vector vírico. Una inyección de refuerzo heteróloga es una vacuna en la que las construcciones idénticas están comprendidas dentro de diferentes vectores víricos.
Segundo principio activo
Es un aspecto de la presente invención la composición de vacuna proporcionada en el presente documento se utiliza en combinación con un segundo principio activo. La administración de la composición de vacuna y el segundo principio activo puede ser secuencial o combinada. Los ejemplos de segundos principios activos se presentan anteriormente tanto para cánceres como para infecciones. Otro aspecto es que la composición de vacuna se puede utilizar en combinación con otra terapia de relevancia para la afección clínica que se va a tratar. Dicha terapia puede incluir cirugía, quimioterapia o terapia génica, sustancias inmunoestimulantes o anticuerpos; una persona experta en la materia puede determinar el tratamiento de combinación adecuado para un escenario dado.
En algunos casos, será adecuado combinar el método de tratamiento divulgado con un tratamiento médico adicional, tal como la quimioterapia, radioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimulantes, genoterapia, tratamiento con anticuerpos y/o antibióticos y tratamiento con células dendríticas.
Herramientas de diagnóstico y pronóstico
Los péptidos divulgados proporcionan la base para desarrollar procedimientos de diagnóstico y pronóstico de amplia aplicación con respecto a enfermedades cancerosas e infecciones. Por lo tanto, en otras realizaciones útiles, la composición divulgada es una composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia de células que expresan la TDO en un individuo. El procedimiento de diagnóstico se basa en la detección de linfocitos T reactivos a la TDO en PBL o en tejido tumoral.
Por consiguiente, se proporciona un kit de diagnóstico para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un individuo de linfocitos T reactivos a la TDO en PBL o en tejido tumoral que comprende uno o más péptidos de la invención, y un método para detectar en un individuo la presencia de dichos linfocitos T reactivos, comprendiendo el método poner en contacto un tejido tumoral o una muestra de sangre con un complejo de un péptido divulgado y una molécula HLA de clase I o de clase II o un fragmento de dicha molécula y detectar la unión del complejo al tejido o las células sanguíneas. En un aspecto, la invención proporciona un complejo de un péptido divulgado y una molécula HLA de clase I o de clase II o un fragmento de dicha molécula, que es útil como reactivo de diagnóstico tal como se describe en el presente documento. Dicho complejo puede ser monomérico o multimérico.
Otro enfoque diagnóstico o pronóstico útil se basa en la generación de anticuerpos en una especie animal heteróloga, por ejemplo, anticuerpos murinos dirigidos contra fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO humanos divulgados, que después se pueden utilizar, por ejemplo, para diagnosticar la presencia de células cancerosas que presentan el péptido. Para dichos fines de inmunización, la cantidad de péptido puede ser menor que la utilizada en el curso de una terapia in vivo, tal como la mencionado anteriormente. En general, una dosis preferida puede oscilar entre aproximadamente 1 |jg y aproximadamente 750 |jg de péptido. También es posible producir anticuerpos monoclonales basados en la inmunización con un péptido divulgado. Por consiguiente, la presente divulgación también se refiere a una molécula, en particular, un anticuerpo monoclonal o policlonal que incluye un fragmento del mismo, que sea capaz de unirse de manera específica a un péptido divulgado y a una molécula que sea capaz de bloquear dicha unión, por ejemplo, un anticuerpo producido contra el anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra un péptido divulgado. La invención se refiere además a receptores de linfocitos T aislados capaces de unirse de manera específica a un péptido o una proteína de la invención así como a ácidos nucleicos aislados que los codifican. Dichos receptores de linfocitos T pueden clonarse, por ejemplo, a partir de linfocitos T específicos de proteínas o péptidos utilizando técnicas estándar bien conocidas por los expertos. Un aspecto de la divulgación también se refiere a linfocitos T aislados que comprenden receptores de linfocitos T capaces de unirse de manera específica a la TDO y/o a fragmentos peptídicos de la misma descritos en el presente documento. Los linfocitos T aislados pueden ser linfocitos T CD8 o linfocitos T CD4. Los linfocitos T aislados son preferentemente linfocitos T que se han expandido in vitro. Los métodos de expansión de los linfocitos T in vitro son bien conocidos por el experto en la materia. Dichos linfocitos T pueden ser útiles en particular en el tratamiento del cáncer mediante transferencia adaptativa o transferencia de células autólogas. Por lo tanto, la divulgación también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden linfocitos T así como a métodos de tratamiento que comprenden la administración de linfocitos T que comprenden receptores de linfocitos T capaces de unirse de manera específica a la TDO o a fragmentos peptídicos de la misma, a un individuo que lo necesite, tal como un individuo que padezca cáncer y/o infecciones. La transferencia de células autólogas se puede realizar de manera esencial como se describe en Walter et al., (1995).
También se divulgan los medios para tratar, prevenir, aliviar o curar una afección clínica caracterizada por la expresión de la TDO, tales como cánceres e infecciones, preferentemente un cáncer, que comprende administrar a un individuo que padece la enfermedad una cantidad eficaz de una composición como se define en el presente documento, una molécula que es capaz de unirse de manera específica a un fragmento peptídico, que puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de linfocitos T o el kit de piezas descrito en el presente documento. Por consiguiente, también se divulga un método para tratar una afección clínica asociada con la expresión de la TDO de SEQ ID NO: 1. Dicha afección clínica puede ser, por ejemplo, cáncer o una afección inflamatoria.
Control de la inmunización
En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica divulgada es una composición de vacuna. Por tanto, es de interés controlar la inmunización en un individuo al que se administra la composición de vacuna divulgada. Por tanto, la composición farmacéutica puede ser una composición inmunogénica o una vacuna capaz de provocar una respuesta inmunitaria a un cáncer y/o a una infección. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "composición o vacuna inmunogénica" se refiere a una composición que provoca al menos un tipo de respuesta inmunitaria dirigida contra células que expresan la TDO, tales como células cancerosas, APC o Cd . Por lo tanto, dicha respuesta inmunitaria puede ser cualquiera de las siguientes: Una respuesta de CTL en la que se generan CTL que son capaces de reconocer el complejo HLA/péptido presentado en las superficies celulares, lo que da como resultado la lisis celular, es decir, la vacuna provoca la producción en el sujeto vacunado de linfocitos T efectores que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas; una respuesta de linfocito B que da lugar a la producción de anticuerpos anticáncer; y/o un tipo de respuesta inmunitaria DTH. Un objetivo de la presente divulgación es controlar la inmunización de un individuo mediante el control de cualquiera de las reacciones anteriores después de administrar una composición divulgada a dicho individuo.
También se divulgan métodos para controlar la inmunización, comprendiendo dicho método las etapas de
i) proporcionar una muestra de sangre de un individuo
ii) proporcionar la TDO o un fragmento peptídico la misma, en donde dicha proteína o péptido puede ser cualquiera de las proteínas o péptidos descritos en el presente documento
iii) determinar si dicha muestra de sangre comprende anticuerpos o linfocitos T que comprenden receptores de linfocitos T que se unen de manera específica a la proteína o péptido
iv) determinar de ese modo si se ha producido una respuesta inmunitaria a dicha proteína o péptido en dicho individuo.
El sujeto es preferentemente un ser humano, por ejemplo, un ser humano que ha sido inmunizado con la TDO o los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO o un ácido nucleico que codifica dicha proteína o péptido.
Kit de piezas
La divulgación también se refiere a un kit de piezas que comprende
• cualquiera de las composiciones de vacuna descritas en el presente documento y/o
• una proteína TDO u homólogo funcional de la misma y/o
• cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO, homólogos funcionales de la misma y/o péptidos procedentes de la misma como se describe en el presente documento y/o
• cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de los dos puntos anteriores e instrucciones sobre cómo utilizar el kit de piezas.
También se divulga un kit de piezas que comprende
• cualquiera de las composiciones de vacuna descritas en el presente documento y/o
• una proteína TDO u homólogo funcional de la misma y/o
• cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la TDO, homólogos funcionales de la misma y/o péptidos procedentes de la misma como se describe en el presente documento y/o
• cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de los dos puntos anteriores y un segundo principio activo.
Preferentemente, el segundo principio activo se elige en correspondencia con la afección clínica que se va a tratar, de modo que en el caso de que se trate un cáncer, el segundo principio activo se elige entre, por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos enumerados anteriormente. De manera análoga, si está tratando una infección microbiana/vírica, el segundo principio activo es preferentemente un antibiótico y/o un agente antivírico.
Los componentes del kit de piezas están preferentemente comprendidos en composiciones individuales, sin embargo, está dentro del alcance de la presente divulgación que todos los componentes del kit de piezas estén comprendidos dentro de la misma composición. Por tanto, los componentes del kit de piezas pueden administrarse de manera simultánea o secuencial en cualquier orden.
Listado de secuencias
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Ejemplos
La divulgación se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
En este ejemplo se divulgan diferentes epítopos procedentes de la TDO que dan lugar a la reactividad de los linfocitos T. Además, se describe la reactividad espontánea mediada por linfocitos T CD8+ y CD4+ contra la TDO tanto en donantes sanos como en pacientes con cáncer. Sin embargo, curiosamente, el fenotipo de los linfocitos T específicos de la TDO varió entre individuos sanos y pacientes con una enfermedad maligna.
Materiales y métodos
Pacientes
Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con melanoma (MM), cáncer de mama (BC, del inglés "Breast Cancer") y donantes sanos (HD, del inglés "healthy donors"). Para los pacientes con cáncer, hubo un intervalo de al menos 4 semanas entre la extracción de sangre y cualquier tipo de terapia contra el cáncer. Las PBMC se aislaron utilizando la separación Lymphoprep, con tipificación h La (Departamento de Inmunología Clínica, Hospital Universitario, Copenhague, Dinamarca) y se congelaron en suero de ternera fetal (FCS) (Gibco, Naerum, Dinamarca) con dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 % (Sigma-Aldrich, Br0ndby, Dinamarca). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas. El protocolo fue aprobado por el comité de ética científica de la región capital de Dinamarca y se llevó a cabo de acuerdo con las disposiciones de la declaración de Helsinki. Las PBMC de HD se obtuvieron del banco de sangre de1Hospital Estatal.
Líneas de células tumorales
Las líneas celulares FM-55M1 y FM-86 se obtuvieron de EST-DAB (http://www.medizin.unituebingen.de/estdab/), A2058 y MDA-MB 231 se obtuvieron de ATCC (www.ATCC.org), UKE-1 (Zeeberg et al., 2013) fue un amable regalo de W. Fiedler (Hospital Universitario de Eppedorf, Hamburgo, Alemania). Todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 (Gibco) suministrado con FCS al 10 % (Gibco).
Péptidos
La secuencia de aminoácidos de la TDO se examinó mediante el uso de la base de datos SYFPEITHI disponible públicamente en busca de posibles epítopos restringidos a HLA-A2. Se seleccionaron quince péptidos, sintetizados por TAG Copenhagen (Copenhague, Dinamarca). Una vez que los péptidos liofilizados se disolvieron en agua o DMSO (Sigma-Aldrich) de acuerdo con recomendación del fabricante, se almacenaron a -20 °C en alícuotas evitando ciclos de congelación y descongelación. Los péptidos fueron TDO40-48 (LIYGNYLHL)(SEQ ID NO:5), TDO65-74 (KIHDEHLFII) (SEQ ID NO: 7)), TDO72-81 (FIITHQAYEL) (SEQ ID NO: 4), TDO85-93 (QILWELDSV) (SEQ ID NO: 10), TDO123-132 (KLLVQQFSIL) (SEQ ID NO: 6), TDO130-138 (SILETMTAL) (SEQ ID NO: 11), TDO159-168 (RLLENKIGVL) (SEQ ID NO: 2), TDO192-201 (LLKSEQEKTL) (SEQ ID NO: 8), TDO200-208 (TLLELVEAWL) (SEQ ID NO: 3), TDO225-234 (KLEKNITRGL) (SEQ ID NO: 14), TDO276-284 (LLSKGERRL) (SEQ ID NO: 12), TDO309-317 (QLLTSLMDI) (SEQ ID NO: 9), TDO364-372 (DLFNLSTYL) (SEQ ID NO: 13), TDO372-381 (LIPRHWIPKM) (SEQ ID NO: 15) y TDO380-389 (KMNPTIHKFL) (SEQ ID NO: 16). Para controles negativos y positivos, se utilizaron el péptido VIHpol468-476 (ILKEPVHGV) (SEQ ID NO: 19) procedente del VIH y el CMV pp65495-503 (NLVPMVATV) (SEQ ID NO: 20), respectivamente. Además, se sintetizaron los péptidos más largos (20 aminoácidos) que comprenden TDO123-132 y TDO309-317, respectivos. Estos fueron nombrados TDO118-137 (VSVILKLLVQQFSILEt MtA) (SEQ ID NO: 17) y TDO303-322 (RFQVPFQLLTSLMDIDSLMT) (SEQ ID NO: 18) y ambos incluían varios posibles epítopos restringidos de clase II como sugiere el algoritmo predictivo SYFPEITHI.
Tecnología de intercambio de péptidos HLA y ELISA del MHC
La afinidad del péptido-HLA se midió mediante un método de intercambio UV en combinación con un ELISA de tipo sándwich como se describió anteriormente (Toebes et al. 2006). En resumen, las cadenas ligeras y pesadas de HLA-A2 se produjeron en E. coli y se replegaron con un ligando sensible a los rayos UV. Este ligando condicional se escindió tras 1 hora de exposición a luz UV y se sustituyó con el péptido de interés. Después de añadir el complejo de péptido y HLA-A2 a un ELISA, se midió la afinidad del complejo como la absorbencia. Se utilizaron dos péptidos con alta afinidad bien descrita hacia HLA-A2 (VIHpol468-476 y c Mv pp65495-503) como péptidos de control positivo, mientras que se utilizó una muestra sin péptido de sustitución como control negativo. Se prepararon controles positivos por cuadruplicado y péptidos TDO por triplicado.
Ensayo ELISPOT
En el presente estudio, el ELISPOT se realizó de acuerdo con las pautas proporcionadas por el CIP (http://cimt.eu/cimt/files/dl/cip_guidelines.pdf). El ensayo ELISPOT se utilizó para cuantificar las células efectoras específicas del epítopo peptídico que liberan citocinas (IFNy, TNFa, IL-17A o iL-10) como se describió anteriormente (S0rensen et al., 2012). En algunos experimentos, las PBMC se estimularon una vez in vitro con el péptido antes del análisis. En algunos experimentos, se añadieron 104 CD autólogas a los pocillos como células presentadoras de antígenos. Los puntos se contaron utilizando el analizador ImmunoSpot Series 2.0 (CTL-Europe, Bonn, Alemania). En algunos experimentos, las células CD4+ se aislaron mediante el kit de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ humanos EasySep (Stem Cell technologies, Grenoble, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Esto produjo cultivos altamente puros (>97 % de CD4+), que se confirmó mediante tinción con anticuerpos de superficie como se describe a continuación para tinción de citocinas intracelulares (ICS, del inglés "intracellular cytokine staining") y citometría de flujo (FCM, del inglés "flow cytometry").
La definición de una respuesta ELISPOT fue un enfoque empírico o estadístico. El enfoque empírico se basa en la relación "señal a ruido" y sugiere que el umbral para la definición de respuesta debe definirse como >6 puntos específicos por 105 PBMC. En la figura 6 se ha aumentado esto a >40 puntos específicos por 5 * 105 PBMC. El método de remuestreo sin distribución (DFR) no paramétrico permite la comparación estadística de pocillos estimulados con antígeno y pocillos de control negativo como se ejemplifica en la figura 8. La liberación de una citocina determinada en respuesta a TDO118-137 o TDO303-322 se comparó entre grupos de pacientes y donantes sanos mediante una prueba de Mann-Whitney. Se consideraron significativos valores de p <0,05.
Generación de líneas de linfocitos T específicos de la TDO
Las CD se generaron mediante la adherencia de PBMC a la superficie de plástico de un pocillo durante una hora en RPMI 1640 (Gibco) antes de la eliminación de las células no adherentes. Las células adherentes se trataron con 1000 U/ml de GM-CSF (PeproTech, Londres, Reino Unido) y 250 U/ml de IL-4 (Peprotech) en X-vivo 15 (Lonza, Copenhague, Dinamarca) suministrado con suero AB humano al 5 % (Sigma-Aldrich) y colocado en placas a 37 °C, CO2 al 5 % y ambiente humidificado. En el sexto día, se añadió a las células un cóctel de maduración compuesto por 1000 U/ml de cada uno de TNFa, IL-1 p e IL-6 y 1 pg/ml de PGE2 (Peprotech). En el octavo día, se recogieron CD maduras, cargadas con péptido TDO 100 pM en X-vivo 15 (Lonza) durante cuatro horas en la incubadora. Después del lavado, las CD cargadas con péptidos se mezclaron con PBL autólogas en X-vivo 15 (Lonza) suministrado con suero AB humano al 5 % (Sigma-Aldrich). Al día siguiente, se añadieron IL-12 e IL-7 (Peprotech) a concentraciones finales de 20 y 40 U/ml, respectivamente. Los cultivos se estimularon de esta manera dos veces con siete días de diferencia. Se realizaron más estimulaciones utilizando PBL autólogas irradiadas (25 Gy) cargadas con el péptido TDO 100 pM. El día después de la estimulación con PBL, los cultivos se suministraron con IL-2 (Proleukin; Novartis, Copenhague, Dinamarca) a una concentración final de 40 U/ml.
FCM y clasificación celular
Los tetrámeros de MHC cargados con péptidos se tiñeron con 2,5 pl de ficoeritrina (PE). No más de 2 * 106 linfocitos T se tiñeron y los tetrámeros conjugados con aloficocianina (APC) se cargaron con un péptido TDO o el péptido VIHpol468-476 como control negativo. Las tinciones se realizaron en 50 pl de PBS (Lonza) suministrado con fCs al 2 % (Gibco) durante 15 minutos en la incubadora. A continuación, una mezcla de anticuerpos que consiste en aCD3-AmCyan, aCD4-Fitc (BD Bioscience, Albertslund, Dinamarca), aCD8-Pacific Blue (DAKO, Glostrup, Dinamarca) y el kit de tinción de células muertas de IR cercano (Life technologies, Naerum, Dinamarca) se añadió directamente y las células se colocaron en placas a 4 °C en la oscuridad durante 30 minutos. Después de lavar en PBS (Lonza) suministrado con FCS al 2 % (Gibco), las células CD8+ positivas al tetrámero se clasificaron mediante FACS Aria (BD Biosciences). Los linfocitos T CD4+ específicos de la TDO se estimularon con TDO303-3225 pM en medio X-vivo 15 (Lonza) y las células secretoras de IFNy se detectaron utilizando el kit de detección y ensayo de secreción de IFNy de MACS (PE) (Miltenyi Biotec, Lund, Suecia). Las células positivas para PE se clasificaron posteriormente en 104 PBMC autólogas e irradiadas (30 Gy) mediante un FACS Aria (BD Biosciences).
Protocolo de expansión rápida (REP)
La rápida expansión de los linfocitos T específicos clasificados se realizó de la siguiente manera: Las células se dejaron reposar en X-vivo 15 (Lonza) complementado con suero humano al 5 % (Sigma-Aldrich) y 6000 U/ml de IL-2 (proleucina; Novartis) durante la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Al día siguiente, se prepararon células alimentadoras: se irradiaron (25 Gy) un total de 20 * 106 PBL de tres donantes sanos, se lavaron y se mezclaron en una proporción de 1:1:1 en 2 ml de X-vivo 15 (Lonza) que contenía suero humano al 5 % (Sigma-Aldrich). Después de dos horas, las células de muestra se mezclaron con las células alimentadoras y se añadió IL-2 (Novartis) a una concentración final de 6000 U/ml junto con Ac aCD3 OKT3 (ebioscience, Frankfurt, Alemania) a una concentración final de 30 ng/ml en 20 ml de medio. Cada 3 a 4 días, los números de células se ajustaron a un máximo de 5 * 105 células/ml y se añadió IL-2 nuevo (Novartis) a 6000 U/ml.
Tinción de citocinas intracelulares (ICS)
Las PBMC se estimularon con péptido relevante 5 pM o péptido de control en presencia de GolgiPlug (diluido 1:1000, BD Biosciences) durante cinco horas en la incubadora. A continuación, las células se lavaron dos veces en PBS (Lonza) suministrado con FCS al 2 % (Gibco) y se tiñeron con anticuerpos de superficie como se describe para la clasificación celular. Después de lavar las células en PBS (Lonza) con FCS al 2 % (Gibco), las células se fijaron y se permeabilizaron con tampón de fijación/permebilización (ebioscience) durante al menos 30 minutos, se lavaron dos veces y después se tiñeron con anticuerpos específicos para IFNy-PE (BD Biosciences) y TNFa-APC (ebioscience). Se registraron al menos 50,000 linfocitos T CD4+ en un citómetro de flujo FACS Canto II y los datos se analizaron con el paquete del programa informático Diva (BD Biosciences).
Ensayo de citotoxicidad
La evaluación de la capacidad citotóxica de las líneas de linfocitos T generadas se evaluó utilizando un ensayo de liberación de cromo convencional como se describe. En resumen, las líneas de células tumorales diana se marcaron con 100 pCi 51Cr (Perkin Elmer, Skovlunde, Dinamarca) en 100 pl de RPMI 1640 (Gibco) suministrado con FCS al 10 % (Gibco) durante una hora a 37 °C. Después del lavado de las células diana, se incubaron con células efectoras a diferentes proporciones efector:diana (E:D) durante cuatro horas en la incubadora. Posteriormente, se midió la cantidad de radiactividad en el sobrenadante utilizando un contador de células gamma (contador gamma automático Perkin Elmer Wallac Wizard 1470).
Resultados
Presencia de linfocitos T CD8+ reactivos a la TDO en sangre periférica de donantes sanos y pacientes con cáncer Se identificaron posibles epítopos de linfocitos T restringidos a HLA-A2 procedentes de la secuencia de aminoácidos de la TDO basándose en el motivo de unión a HLA bien definido (Rammensee et al., 1999). Los quince péptidos de 9 a 10 meros con la mayor afinidad de unión prevista se sintetizaron y posteriormente se utilizaron para seleccionar PBMC de seis pacientes con cáncer para detectar la presencia de respuestas espontáneas de linfocitos T mediante el ensayo ELISPOT. Este análisis reveló la presencia de linfocitos T productores de IFNy en respuesta a los péptidos TDOi23 -i32(KLLVQQFSIL) (SEQ ID NO: 6), TDO200-208, (TL-LELVEAWL) (SEQ ID NO: 3), TDO309-317(QLLTSLMDI) (SEQ ID NO: 9) y TDO364-372 (DLFNLSTYL) (SEQ ID NO: 13) después de una ronda de estimulación in vitro (véase la figura 1A). Particularmente, para varios de estos péptidos, se detectaron respuestas de linfocitos T en más de un paciente. Con la motivación por estas alentadoras observaciones, se utilizaron cuatro epítopos de linfocitos T restringidos a HLA-A2 procedentes de la TDO para analizar las PBMC obtenidas de 14 pacientes con cáncer adicionales, así como las PBMC de 14 donantes sanos para detectar la presencia de linfocitos T reactivos a la TDO; de nuevo, los análisis se realizaron después de una ronda de estimulación in vitro. Como se muestra en la figura 1, se detectaron respuestas de linfocitos T contra los cuatro péptidos tanto en pacientes con cáncer como en donantes sanos. Sorprendentemente, la magnitud y frecuencia de las respuestas fueron similares en ambos grupos. El método de remuestreo sin distribución (DFR) no paramétrica permite la comparación estadística de pocillos estimulados con antígenos y de control negativo.
En la figura 1 complementaria se dan ejemplos de respuestas significativas. Además, los linfocitos T reactivos a la TDO se detectaron directamente ex vivo (véase la figura 8).
Generación y caracterización funcional de líneas de linfocitos T CD8+ específicos de la TDO
La detección y caracterización de linfocitos T CD8+ específicos se revolucionó con la introducción de complejos de péptido soluble y MHC (Rammensee et al., 1999). Para establecer las líneas de linfocitos T CD8+ específicos de TDO, se estimularon repetidamente PBMC de un paciente con cáncer con células dendríticas autólogas cargadas con los péptidos TDO TDO123-132 o TDO309-3175 o 4 veces respectivamente. Estas estimulaciones in vitro aumentaron drásticamente la frecuencia de los linfocitos T CD8+ específicos de la TDO según lo medido mediante tinción con tetrámero de dos colores (véase la figura 2). Para una mayor expansión mediante el protocolo de expansión rápida (REP, del inglés "rapid expansion protocol") los linfocitos T reactivos a TDO123-132 y TDO309-317 se enriquecieron mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia. Después de aplicar el REP, la especificidad de las líneas de linfocitos T resultantes se confirmó mediante tinción con tetrámero que demostró una pureza del 97,1 % y del 99,6 % (véase la figura 2). Estas líneas de linfocitos T se probaron para determinar su capacidad para lisar células T2 pulsadas con péptidos deficientes en TAP o células tumorales que expresan la TDO con compatibilidad HLA. Como se muestra en la figura 3A y B, los cultivos de linfocitos T específicos de la TDO lisaron de manera eficaz la células T2 cuando estas habían sido pulsadas con el mismo péptido TDO utilizado para la expansión, pero no las células T2 pulsadas con un péptido procedente de una TDO diferente irrelevante. Lo que es más importante, los linfocitos T específicos de la t Do lisaron de manera eficaz las líneas celulares de cáncer HLA-A2+ de diferente origen tisular, pero no las células cancerosas HLA-A2- (véanse las figuras 3C y D). La lisis de las líneas celulares cancerosas que expresan la TDO no fue uniforme. De manera específica, la línea celular de cáncer de mama MDA-MB 231 fue destruida por las líneas de linfocitos T específicos tanto de TDO123-132 como de TDO309-317; la última línea de linfocitos T demuestra una destrucción más eficaz. Por otro lado, la línea celular de leucemia HLA-A2+ UKE-1 se lisó de manera muy eficaz por los linfocitos T específicos de TDO123-132, pero solo escasamente por los linfocitos T específicos de TDO309-317. Los linfocitos T específicos de TDO123-132 no lisaron las líneas celulares de melanoma HLA-A2+ FM-55M1 y FM-86, que se lisaron de manera eficaz por los linfocitos T específicos de TDO309-317. Finalmente, la línea celular de melanoma el HLA-A2-TDO+ A2058 no se lisó por ninguna línea de linfocitos T.
Reconocimiento de células inmunitarias dependiente de la TDO
Para probar si los linfocitos T específicos de la TDO fueron capaces de reconocer CD autólogas maduras transfectadas con ARNm de TDO, se generaron CD autólogas transfectadas con ARNm de TDO antes del análisis en ELISPOT. Este experimento expuso que los linfocitos T específicos de TDO309-317 reconocieron de manera específica CD transfectadas con la TDO (véase la figura 4A).
Se ha demostrado previamente que la línea celular T2 deficiente en TAP procesa de manera muy eficaz y presenta péptidos largos en la superficie en HLA-A2. Se sintetizaron dos péptidos de 20 aminoácidos, que incluían dos de los epítopos mínimos (TDO123-132 (KLLVQQFSIL) (SEQ ID NO: 6) y TDO309-317(QLLTSLMDI) (SEQ ID NO: 9). TDO118-137 (VSV ILK LLV QQF SIL ETM TA) (SEQ ID NO: 17) incluye el epítopo TDO123-132 y TDO303-322 (RFQ VPF QLL TSL MDI DSL MT) (SEQ ID NO: 18) incluye el epítopo TDO309-317. A continuación, se analizó si las células T2 podían presentar de forma cruzada los dos péptidos largos. En este sentido, la células T2 se cargaron durante la noche con TDO118-137 o TDO303-322 antes de que se utilizaran en un ensayo de citotoxicidad estándar. Como se muestra en la figura 4B, se observó la lisis de las células T2 tanto cuando se cargaban con el péptido corto como con el péptido largo correspondiente, es decir, células T2 lisadas por células específicas de TDO123-132 pulsadas con péptido TDO123-132 o TDO118-137 pero no cuando se pulsaron con TDO309-317 o TDO303-322. Por consiguiente, los péptidos largos procedentes de la TDO se recogen y se presentan de forma cruzada en el contexto de HLA-A2 en células T2. Los linfocitos T CD4+ reconocen la TDO
Para examinar más a fondo la inmunogenia de la TDO, se utilizaron los dos péptidos largos TDO118-137 y TDO303-322 en ensayos ELISPOT para IFNy, TNFa, IL-10 y IL-17A (los resultados se muestran en la figura 5). Las respuestas de los linfocitos T CD4 específicos de péptidos estaban presentes tanto en pacientes con cáncer como en donantes sanos. Con respecto a los linfocitos T CD4+ productores de IFNy, no hubo diferencia entre las 2 cohortes. Sin embargo, las células que producen TNFa en respuesta a péptidos TDO largos fueron más frecuentes en donantes sanos; para TDO118-137 esta diferencia fue muy significativa (p <0,0001). La producción de IL-10 e IL-17 en respuesta a la estimulación de péptidos se restringió a pacientes con cáncer. Para TDO303-322 estas diferencias fueron estadísticamente significativas (p = 0,0051 y p <0,0001, respectivamente). IL-17 y IL-10, que solo fueron liberados en respuesta a péptidos TDO largos por PBMC obtenidas de pacientes con cáncer, ejercen funciones inmunomoduladoras profundas y se han relacionado con el curso clínico de los pacientes con cáncer. Se correlacionaron la frecuencia de los linfocitos T CD4+ que producen IL-17A e IL-10 en respuesta a los péptidos largos TDO303-322 con el curso clínico, lo que reveló un claro impacto de la presencia de células productoras de IL-17 e IL-10 en la supervivencia general (SG): Los pacientes caracterizados por células CD4+ que liberaban IL-17A tenían una tendencia hacia una SG mejorada en comparación con los que no respondían a IL-17A (véase la figura 6A); mientras que los pacientes con linfocitos T CD4+ liberadores de IL-10 en respuesta a los péptidos TDO tienen una SG alterada (véase la figura 6B). Esta diferencia de SG fue incluso más pronunciada cuando se compararon pacientes que albergaban linfocitos T productores de IL-17+/IL-10- o IL-17-/IL-10+. Los pacientes con presencia de células productoras de IL-17+/IL-10- en respuesta a péptidos TDO303-322 tuvieron una supervivencia mucho mejor (véase la figura 6C).
Se divulga que la TDO es una diana para las respuestas naturales de los linfocitos T, que eran fácilmente detectables tanto en pacientes con cáncer como en donantes sanos. Particularmente, Las respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 específicos de la TDO estaban presentes en donantes sanos y en pacientes enfermos con la misma frecuencia. Por lo tanto, los donantes sanos aparentemente albergan fuertes respuestas inmunitarias contra la autoproteína TDO. Cabe destacar que, sin embargo, los linfocitos T CD4+ específicos de la TDO diferían en sus características funcionales en donantes sanos y en pacientes con cáncer. En donantes sanos, los linfocitos T CD4+ específicos de la TDO liberaron TNFa e IFNy, pero no las citocinas reguladoras IL-17 o IL-10. De hecho, los linfocitos T CD4+ específicos de la TDO que producen TNFa fueron significativamente más frecuentes en donantes sanos en comparación con pacientes con cáncer. Esto indica que la TDO no induce necesariamente tolerancia en individuos sanos.
Los linfocitos T CD8+ y CD4+ pueden ejercer funciones inmunoreguladoras mediante la liberación de citocinas, o incluso mediante citólisis, en respuesta a epítopos procedentes de la molécula inmunosupresora TDO. Por consiguiente, tanto los linfocitos T CD8+ como los CD4+ específicos de la TDO pueden desempeñar un papel en el ajuste fino de la respuesta inmunitaria mediante la supresión del estado inmunopermisivo inducido por las células que expresan la TDO. En pacientes con cáncer, sin embargo, el fenotipo de los linfocitos T CD4+ reactivos a la TDO era más complejo: Además de IFNy y TNFa, las células también produjeron IL-17 e IL-10 en respuesta a los epítopos de la TDO. La producción de IL-17 define un subconjunto de linfocitos T auxiliares CD4+ (linfocitos Th17) implicados en muchas situaciones patológicas, incluidas la autoinmunidad y el cáncer. Particularmente, se ha atribuido a los linfocitos Th17 un papel protector contra el cáncer al promover la inmunidad antitumoral. Los linfocitos Th17 que infiltran el tumor expresan otras citocinas además de la iL-17 tal como IFNy, IL-2 y TNF. Particularmente, algunos linfocitos Th17 específicos de la TDO presentan un perfil de citocinas de linfocitos T efectores similar. Además, los pacientes con cáncer que presentaban una respuesta de IL-17 específica de la TDO mostraron una tendencia hacia una SG mejorada.
Por otro lado, en pacientes con cáncer se observó la liberación de IL-10 en respuesta a los epítopos de la TDO. La IL-10 es una citocina inmunosupresora, que se produce entre otras células mediante Tregs. Los Treg son importantes para mantener la homeostasis inmunitaria y asegurar la tolerancia a los autoantígenos. Por lo tanto, los Treg específicos de la TDO podrían mejorar la supresión inmunitaria mediada por la TDO y, por lo tanto, estimular el escape inmunitario de las células cancerosas. Por consiguiente, en pacientes con producción de IL-10, los linfocitos T CD4+ reactivos a la TDO mostraron una tendencia hacia una SG deteriorada. La diferencia de la SG de pacientes que albergan linfocitos T productores de IL-17+/IL-10- o IL-17-/IL-10+ en respuesta a péptidos TDO fue pronunciada. La caracterización funcional de los linfocitos T CD8+ reactivos a la TDO expandidas in vitro reveló que éstas destruían células tumorales con HLA compatible de diferente origen.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de vacuna que comprende un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que consiste en como máximo 40 aminoácidos consecutivos de la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) de SEQ ID NO: 1, en donde el fragmento peptídico inmunogénicamente activo comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO: 3 (TDO200-208);
b) SEQ ID NO: 6 (TDO123-132);
c) SEQ ID NO: 9 (TDO309-317);
d) SEQ ID NO: 13 (TDO364-372);
e) SEQ ID NO: 17 (TDO118-137);
f) SEQ ID NO: 18 (TDO303-322); y
g) un homólogo funcional del polipéptido de acuerdo con cualquiera de a) a f); siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos;
para su uso como un medicamento.
2. Una composición de vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que también comprende un adyuvante.
3. Una composición de vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el fragmento peptídico inmunogénicamente activo se selecciona del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO: 6 (TDO123-132);
b) SEQ ID NO: 9 (TDO309-317);
c) SEQ ID NO: 17 (TDO118-137);
d) SEQ ID NO: 18 (TDO303-322); y
e) un homólogo funcional del polipéptido de acuerdo con cualquiera de a) a d); siendo el homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, tal como se han sustituido como máximo dos aminoácidos, tal como se ha sustituido como máximo un aminoácido.
4. Una composición de vacuna para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el fragmento peptídico inmunogénicamente activo consiste en de 18 a 25 aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO: 1.
5. Una composición de vacuna para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el fragmento peptídico inmunogénicamente activo consiste en 20 aminoácidos consecutivos de la TDO de SEQ ID NO: 1.
6. Una composición de vacuna para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una proteína o fragmento peptídico inmunogénicamente activo seleccionado de una proteína o fragmento peptídico, que no es la TDO.
7. Una composición de vacuna para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en adyuvantes basados en ADN bacteriano, adyuvantes basados en aceite/tensioactivo, adyuvantes basados en ARNbc víricos e imidazoquinolinas,
8. Una composición de vacuna para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde el adyuvante es GM-SF o un adyuvante de montanida ISA, opcionalmente en donde el adyuvante de montanida ISA es montanida ISA 51 o montanida ISA 720, opcionalmente en donde el adyuvante de montanida ISA es montanida ISA 51.
9. Una composición de vacuna para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición de vacuna comprende células presentadoras de antígenos que comprenden el fragmento peptídico inmunogénicamente activo o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo, opcionalmente en donde la célula presentadora de antígenos es una célula dendrítica.
10. Una composición de vacuna para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la composición de vacuna se utiliza en el tratamiento o prevención de una enfermedad cancerosa en la que se expresa la TDO.
11. Una composición de vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el cáncer es un cáncer que forma tumores.
12. Un kit de piezas que comprende una composición de vacuna definida en cualquier reivindicación anterior y un segundo principio activo, en donde el segundo principio activo se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una composición inmunoestimulante, opcionalmente en donde la composición inmunoestimulante comprende una o más interleucinas, opcionalmente en donde una o más interleucinas se seleccionan de IL-2 y/o IL-21; (ii) un agente anticanceroso, opcionalmente en donde el agente anticanceroso es un agente quimioterapéutico, opcionalmente en donde el agente quimioterapéutico se selecciona de: actimida, azacitidina, azatioprina, bleomicina, carboplatino, capecitabina, cisplatino, clorambucilo, ciclofosfamida, citarabina, daunorrubicina, docetaxel, doxifluridina, doxorrubicina, epirrubicina, etopósido, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, irinotecán, lenalidomida, leucovorina, mecloretamina, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, revlimid, temozolomida, tenipósido, tioguanina, valrrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina; o
(iii) un antibiótico, opcionalmente en donde el antibiótico se selecciona de: amoxicilina, penicilina, aciclovir y/o vidarabina.
13. Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que comprende una secuencia consecutiva de la TDO de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma, siendo dicho homólogo funcional un polipéptido de secuencia idéntica excepto que se han sustituido como máximo tres aminoácidos, en donde el fragmento peptídico es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
14. Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento o prevención de afecciones clínicas asociadas con la expresión de la TDO, tales como cáncer y/o inflamación.
15. Un ácido nucleico aislado que codifica un fragmento peptídico inmunogénicamente activo como se define en la reivindicación 13.
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