KR20210111770A - 조작된 플라겔린-유래 조성물 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개선된 약리학적으로 최적화되고 탈면역화된 플라겔린 변이체, 및 TLR5 신호전달을 활성화하는 능력을 여전히 보유하면서 감소된 면역원성 및 감소된 인플라마솜 반응을 나타내는 사용 방법을 제공한다.

Description

조작된 플라겔린-유래 조성물 및 용도
우선권
본 출원은 2018년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원 제62/776,507호의 혜택 및 우선권을 주장하며, 이 기초출원의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
발명의 분야
본 발명은 조작된 플라겔린 변이체(engineered flagellin variant), 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 포맷 사본(파일명: GPI-020PC_ST25.txt; 기록 일자: 2019년 12월 6일; 파일 크기: 90,275 바이트).
"인플라마솜(inflamasome)"으로 알려진, 염증성 신호전달 복합체의 과활성(hyperactivity)은 다양한 염증성 질환과 관련이 있다. 인플라마솜 패러다임은 트리거(예를 들어, 사이토졸 플라겔린), 센서(NAIP), 핵형성인자(NLRC4), 어댑터(adaptor)(ASC) 및 이펙터(effector)(CASP1)를 포함하는, NLRC4 인플라마솜에 의해 가장 포괄적으로 예시된다. 예를 들어, 세포외 플라겔린은 플라겔린-TLR5 복합체의 내재화로 인해 세포질 NLRC4 인플라마솜을 활성화시킬 수 있다. 어셈블링된 직후에, 인플라마솜은 카스파제-1 활성화를 수반하는 전염증성 케스케이드를 개시하고, 후속하여, IL-1β 및 IL-18의 비활성 전구체를 생체활성, 전염증성 사이토카인으로 절단시킨다.
톨-유사 수용체(toll-like receptor: TLR)는 선천 면역에서 중요한 수용체인 I형 막 당단백질이다. 인간에게 알려진 10가지 TLR은 상이한 미생물 항원을 인식하고, 리간드 결합에 의해 활성화될 때, 사이토카인 및 케모카인의 빠른 생산을 매개한다. 숙주 방어에서의 이의 역할 이외에, TLR은 암 진행 및 발달 및 세포 보호에 역할을 한다. 이러한 하나의 예는 TLR5에 대한 플라겔린의 결합으로서, 이는 전염증성 분자의 케스케이드를 개시한다.
플라겔린으로부터 유래된 TLR5 효능제는 다양한 질환에 대한 치료제로서 개발되었다. 그러나, 이러한 분자는 예를 들어, 만족스럽지 못한 결합 및 신호전달, 및 인플라마솜 경로를 통한 염증성 사이토카인의 활성화를 포함하는 특정 제한을 겪을 수 있고, 이에 따라, 치료 효과를 제한할 수 있다. 본질적으로 면역원성 플라겔린 변이체는 불리한 인플라마솜 활성화, 항원성 및 면역원성을 지니고, 이에 따라 개선이 필요할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 면역원성 및 인플라마솜 활성화와 관련된 것과 같은 이러한 생물학적 제제의 군 중에서 관찰되는 한계를 극복하는, 개선된 플라겔린 변이체 및 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 부분적으로, 플라겔린의 돌연변이된 변이체가 TLR5 신호전달을 활성화시키는 능력을 여전히 보유하면서, 감소된 면역원성 및 감소된 인플라마솜 반응을 나타낼 수 있다는 발견을 기초로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 TLR5 신호전달을 활성화시키는 능력을 보유하는 플라겔린 변이체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-κB 프로모터를 유도한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드(entolimod) 또는 다른 플라겔린 유도체에 의해 나타나는 NF-κB 신호전달 활성에 비해 유사하거나 더 높은 NF-κB 신호전달 활성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 방사선 보호 및/또는 방사선 완화 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 유도체에 의해 나타나는 방사선 보호 및/또는 방사선 완화 활성에 비해 유사하거나 더 양호한 방사선 보호 및/또는 방사선 완화 활성을 나타낸다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드와 비교하여, 작제물의 인플라마솜 활성화를 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 상세하게는, 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 유도체에 의해 나타나는 인플라마솜 활성화에 비해 낮은 인플라마솜 활성화를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드와 비교하여, 작제물의 T 세포 면역원성을 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드와 비교하여, B 세포 중화 항체에 대한 감소된 감수성을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드와 비교하여, 중화 B 세포 항에 대한 개선된 내성(예를 들어, 중화 항체가 실질적으로 존재하지 않음)을 보여준다. 또 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드의 수준과 동일하거나 유사한 수준에서 TLR5 신호전달을 활성화시킨다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드와 비교하여 동일하거나 유사하거나 개선된 약동학 프로파일을 보여준다. 또 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드의 보유와 비교하여 숙주에서 증가되거나 유사한 보유를 보여준다. 실시형태에서, 대상체에 본 발명의 플라겔린 변이체의 투여는 플라겔린 변이체의 생체이용률의 실질적으로 증가된 기간을 야기시킨다.
일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드/CBLB502(서열번호 3)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 하나 이상의 에피토프에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 하나 이상의 에피토프에 적어도 하나의 결실을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3 중 하나 이상에 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (i) I18, F22, T23, S24 및 K27 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이, 및 (ii) I215, L216, Q217, T221 및 V223 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이를 포함하는 프라겔린 변이체를 고려하며, 여기서, 치환된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이며, 여기서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221 및 V223에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이, 및 I215, L216, Q217, T221 및 V223에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된, 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18A, F22A, Q217D 및 V223T를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 491TEMX(서열번호 2, 선택적으로, 말단 히스티딘 태그, 예를 들어, 서열번호 5 없음)이다.
일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 서열번호 1과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 491TEMX(서열번호 2, 선택적으로 말단 히스티딘 태그, 예를 들어, 서열번호 5가 없음)이다.
일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 태그를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 태그는 플라겔린 변이체의 N-말단에 부착된다. 또 다른 실시형태에서, 태그는 플라겔린 변이체의 C-말단에 부착된다.
본 발명은 NF-κB 프로모터를 유도할 수 있는 플라겔린 변이체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 사이토카인 중 하나 이상의 발현을 유도한다. 추가 실시형태에서, 사이토카인은 G-CSF, IL-6, IL-12, 케라티노사이트 화학유인제(KC), IL-10, MCP-1, TNF-α, MIG 및 MIP-2로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 플라겔린 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 플라겔린 변이체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 TLR5 신호전달을 자극하는 방법으로서, 본 발명의 플라겔린 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 갖는다. 추가 실시형태에서, 종양은 TLR5를 발현시킨다. 추가 실시형태에서, 종양은 TLR5를 발현시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암, 폐암, 결장암, 신장암, 간암, 난소암, 전립선암, 고환암, 비뇨생식관암, 림프계암, 직장암, 췌장암, 식도암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 피부암, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 털세포 백혈병, 조직구 림프종, 및 버켓 림프종, 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병, 전골수성 백혈병, 성상 세포종, 신경모세포종, 신경교종, 신경초종, 섬유육종, 횡문근종육종, 골육종, 색소성 건피증, 각질극 세포종, 정상피종, 소낭 갑상선암, 기형암종, 및 위장관 또는 복부 골반강의 암으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 방사선-유도 손상을 앓고 있다. 추가 실시형태에서, 대상체는 치사량의 방사선을 받았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 방사선 치료를 받고 있다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 방사선에 노출 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 방사선에 노출 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 방사선에 노출 후 투여된다.
다양한 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 다른 치료제 및/또는 치료와 함께 투여된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 화학요법과 함께 투여된다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 방사선 치료와 함께 투여된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 항산화제와 함께 투여된다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 아미포스틴 및/또는 비타민 E와 함께 투여된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 하나 이상의 관문 저해제와 함께 투여된다. 추가 실시형태에서, 하나 이상의 관문 저해제는 예정 세포사 단백질-1(PD-1), 예정사-리간드 1(PD-L1), 예정사-리간드 2(PD-L2), 유도성 T-세포 공동 자극인자(ICOS), 유도성 T-세포 공동 자극인자 리간드(ICOSL), 및 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4) 중 하나 이상을 조절하는 제제로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 다른 치료제 및/또는 치료의 투여 전에 투여된다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 다른 치료제 및/또는 치료와 동시에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 다른 치료제 및/또는 치료의 투여 후 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5) 없이, 서열번호 2와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 플라겔린 변이체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 선택적으로, 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5) 없이, 서열번호 2인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 플라겔린 변이체를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 2와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조작된 플라겔린 변이체를 제공하며, 여기서, 서열번호 2의 아미노산 서열은 말단 히스티딘 태그 서열을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 2인 아미노산 서열을 포함하는 조작된 플라겔린 변이체를 제공하며, 여기서, 서열번호 2의 아미노산 서열은 말단 히스티딘 태그 서열을 포함하지 않는다. 추가 실시형태에서, 말단 히스티딘 태그의 아미노산 서열은 서열번호 5이다.
일 양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 플라겔린 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 방사선-유도 손상을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 플라겔린 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세부사항은 하기 첨부된 설명에 기술되어 있다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 물질이 이제 기술된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다. 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수형은 문맥 상 달리 명백히 지시하지 않는 한 복수형도 포함한다. 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
도 1은 서열번호 2인 491TEMX(SE-2/GP532로도 알려짐)의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 2는 유럽/북미 및 세계 인구로의 연구 코호트(n=50)에서 발현된 공여자 동정이형의 빈도의 비교를 도시한 것이다. 각 히스토그램 세트와 관련하여, 좌측에서 우측으로, 첫 번째 막대는 CBL01 공여자를 나타내며, 두 번째 막대는 유럽 및 북미 공여자를 나타내며, 세 번째 및 마지막 막대는 세계 인구 공여자를 나타낸다.
도 3은 50명의 공여자로부터의 PBMC에 대해 시험된 펩타이드를 사용한 CD4+ T 세포 에피토프 맵을 도시한 것이다. 80개의 시험 펩타이드 및 대조군 C3, C32 및 KLH에 대한 비-조정된 및 조정된 증식 검정 데이터. 백그라운드 반응 임계값(적색 점선으로 표시됨) 이상의 빈도에서 양성(SI≥2.00, p<0.05) T 세포 증식 반응을 유도하는 펩타이드는 T 세포 에피토프를 함유한다. KLH는 비-조정된 및 조정된 데이터 세트 둘 모두에서 공여자의 92%에서 양성 반응(SI≥2.00, p<0.05)을 유도하였다. 각 히스토그램 세트와 관련하여, 좌측 막대는 비-조정된 증식 검정 데이터를 나타내며, 우측 막대는 조정된 증식 검정 데이터를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 샘플 및 참조 항체의 환원 SDS-PAGE를 도시한 것이다. 샘플 및 참조 항체는 NuPage 4-12% Bis-Tris 겔(ThermoFisher Scientific) 상에 (도 4a) 0.1㎍ 및 (도 4b) 1㎍로 로딩되고, 30분 동안 200 V에서 진행되었다. 크기 마커는 PageRuler 광범위한 비염색된 단백질 래더(ThermoFisher Scientific)이다. 겔은 Pierce Silver Stain Kit(ThermoFisher Scientific)로 염색되었다.
도 5는 샘플 1, 엔톨리모드/CBLB502, 및 샘플 2, 491TEMX(SE-2 및 GP532로도 알려짐)에 대한 건강한 공여자 T 세포 증식 및 IL-2 ELISpot 반응의 요약을 도시한 것이다. 증식에 대한 양성 T 세포 반응(SI≥1.90, p<0.05)("P"), 및 7일 배양 후 IL-2(SI≥1.90, p<0.05) ELISpot("E")이 도시되어 있다. 증식 및 IL-2 ELISpot 검정에 대한 양성 반응의 빈도는 칼럼의 하부에서의 백분율로서 나타난다. 상관 관계는 IL-2 ELISpot 검정에서도 양성인 증식 반응의 백분율로서 표현된다.
도 6a 내지 도 6c는 도 6a, 샘플 1(엔톨리모드, CBLB502로도 알려짐); 도 6b, 샘플 2(491TEMX, SE-2 및 GP532로도 알려짐); 및 도 6c, KLH(대조군)에 대한 건강한 공여자 T 세포 증식 반응을 도시한 것이다. CD4+ T 세포는 샘플에 로딩된 자가 성숙 DC와 함께 인큐베이션되었고, 7일 인큐베이션 후에 증식에 대해 평가되었다. 쌍을 이루어지 않는, 2개의 샘플 스튜던트 t-검정을 이용하여 유의미한(p<0.05) SI≥1.90을 갖는 T 세포 반응(적색 점선으로 표시됨)은 양성으로 간주되었다.
도 7a 내지 도 7c는 도 7a, 샘플 1(엔톨리모드, CBLB502로도 알려짐); 도 7b, 샘플 2(491TEMX, SE-2 및 GP532로도 알려짐); 및 도 7c, KLH(대조군)에 대한 건강한 공여자 T 세포 IL-2 분비 반응을 도시한 것이다. CD4+ T 세포는 샘플이 로딩된 자가 성숙 DC와 함께 인큐베이션되었고, 7일 인큐베이션 후 IL-2 분비에 대해 평가되었다. 쌍을 이루어지 않는, 2개의 샘플 스튜던트 t-검정을 이용하여 유의미한(p<0.05) SI≥1.90을 갖는 T 세포 반응(적색 점선으로 표시됨)은 양성으로 간주되었다.
도 8은 변이체 플라겔린 변이체, 즉, 33MX, 33TX2(SE-1로도 알려짐), 및 491TEMX(SE-2 및 GP532로도 알려짐)에 의해 293-hTLR5-LacZ 리포터 세포에서 유도된 NF-κB 신호전달을 도시한 것이다.
도 9는 변이체 플라겔린 변이체에 의해 THP1-NLRC4 세포(예를 들어, IL-1β 생산)에서 유도된 인플라마솜 활성을 도시한 것으로, 여기서 IL-1β는 인플라마솜 마커를 나타낸다. 도시된 플라겔린 변이체는 CBLB502(엔톨리모드로도 알려짐), 33MX, 33TX2(SE-1로도 알려짐), 및 491TEMX(SE-2 및 GP532로도 알려짐)이다.
도 10은 각각이 마우스에 주사된 후에 플라겔린 변이체 SE-1(33TX2로도 알려짐), SE-2(491TEMX 및 GP532로도 알려짐), 및 엔톨리모드(CBLB502로도 알려짐)의 약동학 프로파일을 도시한 것이다. 24시간의 과정에 걸친 ng/㎖ 단위의 얻어진 농도의 측정이 도시되어 있으며, 이는 SE-2가 엔톨리모드보다 더욱 양호하거나 동일하게 수행됨을 보여준다.
도 11은 SE-1(33TX2로도 알려짐), SE-2(491TEMX 및 GP532로도 알려짐), 및 엔톨리모드(CBLB502로도 알려짐)의 주사 후 24시간의 과정에 걸쳐 마커 사이토카인 G-CSF의 약동학의 측정을 도시한 것이다.
도 12는 SE-1(33TX2로도 알려짐), SE-2(491TEMX 및 GP532로도 알려짐), 및 엔톨리모드(CBLB502로도 알려짐)의 주사 후 24시간의 과정에 걸쳐 마커 사이토카인 IL-6의 약동학의 측정을 도시한 것이다.
도 13은 SE-1(33TX2로도 알려짐), SE-2(491TEMX 및 GP532로도 알려짐), 및 엔톨리모드(CBLB502로도 알려짐)의 주사 후 24시간의 과정에 걸쳐 인플라마솜 마커 IL-18의 측정을 도시한 것이다.
도 14는 SE-1(33TX2로도 알려짐), SE-2(491TEMX 및 GP532로도 알려짐), 및 엔톨리모드(CBLB502로도 알려짐)의 주사 후 24일의 과정에 걸쳐 산화질소의 측정을 도시한 것이다.
도 15는 엔톨리모드(CBLB502로도 알려짐) 및 SE-2(491TEMX 및 GP532로도 알려짐) 각각의 용량 연구를 도시한 것이며, 여기서, 용량은 4 ㎍/㎏, 6 ㎍/㎏, 8 ㎍/㎏, 16 ㎍/㎏, 32 ㎍/㎏ 및 64 ㎍/㎏이며, PBS-트윈은 대조군으로서 사용되었다. 방사선 보호성은 27일 연구의 과정에 걸쳐 마우스의 생존율에 의해 측정되었다.
도 16은 전신 조사 후 60일의 과정에 걸쳐 마우스의 생존율에 의해 측정한 경우 방사선 보호성을 도시한 것이다. 전신 조사 전에, 마우스에는 중화 항체 또는 정상 혈청중화 항체 또는 정상 혈청을 함유한 혈청으로 인간 혈청 전달하고, 이후에 엔톨리모드(CBLB502로도 알려짐), SE-2(491TEMX 및 GP532로도 알려짐), 또는 PBS가 주사되었다. 60일 종점에서 측정하였을 때, 위에서 아래로, 최상부 라인은 엔톨리모드 + 정상 혈청을 나타내며; 두 번째 라인은 SE-2 + 정상 혈청을 나타내며; 세 번째 라인은 SE-2 + 중화 혈청을 나타내며; 네 번째 라인은 엔톨리모드 + 중화 혈청을 나타내며; 최하부 라인은 PBS 대조군을 나타낸다.
도 17은 SE-2(491TEMX 및 GP532로도 알려짐) 및 관문 저해제로의 병용 종양 치료를 측정하는 것으로 수행된 연구의 결과를 도시한 것이다. 삼중-음성 유방암의 EMT6 마우스 모델이 사용되었으며, 여기서, 치료는 관문 저해제의 투여로 시작하고, 이후에, 엔톨리모드 또는 SE-2가 투여된다. 상세하게는, 마우스에는 7일에 소정 용량의 α-PD1이 제공되고, 이후에, 9일에 소정 용량의 α-CTLA4가 제공되었다. 10일 및 11일에, 소정 용량의 엔톨리모드 및 SE-2가 투여되었다. 결과는, 관문 저해제의 투여 이후 SE-2의 투여의 조합이 관문 저해제와 함께 엔톨리모드의 투여보다 더 빠른 종양 퇴화를 나타냄을 보여준다. 21일에, 위에서 아래로, 최상부 라인은 아이소형 + 비히클을 나타내며; 두 번째 라인은 아이소형 + 엔톨리모드를 나타내며; 세 번째 라인은 아이소형 + SE-2를 나타내며; 네 번째 라인은 α-CTLA4 + α-PD-1 + 엔톨리모드를 나타내며; 다섯 번째 라인은 α-CTLA4 + α-PD-1 + 비히클을 나타내며; 여섯 번째(즉, 최하부) 라인은 α-CTLA4 + α-PD-1 + SE-2를 나타낸다.
도 18은 마우스 간 간세포의 조직학적 분석을 도시한 것이고, GP532(491TEMX로도 알려짐) 및 엔톨리모드에 의한 NF-κB 활성화를 나타낸 것이다.
도 19는 중화 또는 비-중화(대조군) 인간 혈청의 주입 이후 엔톨리모드 또는 GP532의 피하 주사 시에 NF-κB-루시페라제 리포터 마우스의 신호전달 활성의 생체내 이미징을 도시한 것이다.
도 20은 Balb/c 마우스에 비히클, 엔톨리모드 또는 GP532를 투여하고 이후에 치명적인 전신 조사 후에 60일 기간에 걸쳐 생존율을 평가함으로써 방사선 완화 연구의 결과를 도시한 것이다. 20일 지점에서 측정할 때, 위에서 아래로, 최상부 라인은 엔톨리모드를 나타내며, 두 번째 라인은 GP532를 나타내며, 세 번째 라인은 PBS 비히클 대조군을 나타낸다.
도 21a 내지 도 21g는 비히클, 엔톨리모드 또는 GP532를 투여하고 이후에 전신 조사한 후에 마우스 영역-피부(도 21a), 구각(도 21b), 입(도 21c), 림프절(도 21d), 턱밑(도 21e), 슬링 점액(도 21f), 및 귀밑샘(도 21g)의 조직학 스코어를 도시한 것이다.
본 발명은 부분적으로, 이러한 생물학적 제제 및 관련된 제제의 약리학적으로 관련된 특성을 개선시키는 플라겔린의 특정 돌연변이의 발견을 기초로 한 것이다. 이러한 돌연변이는 비제한적인 예로서, 돌연변이 없는 것에 비해, 감소된 면역원성 및 감소된 인플라마솜 활성을 갖는 다양한 플라겔린 변이체를 산출한다. 플라겔린 변이체는 엔톨리모드 및 다른 플라겔린 변이체와 동일하거나 유사한 수준으로 이의 TLR5 신호전달 능력 및 방사선 보호 및/또는 방사선 완화 능력을 보유한다.
플라겔린 변이체
본 발명은 부분적으로 돌연변이된 플라겔린 변이체가 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체와 동일하거나 유사한 수준으로 TLR5 신호전달을 활성화시키는 능력을 여전히 보유하면서 감소된 면역원성 및 감소된 인플라마솜 활성화를 나타낼 수 있다는 발견을 기초로 한 것이다. 감소된 면역원성은 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체와 비교하여 플라겔린 변이체가 숙주에서 더 오랫 동안 지속할 수 있게 하고, 중화 항체의 감소된 유도(예를 들어, 중화 항체가 실질적으로 존재하지 않음)로 인해 다용도 단백질을 제공하며, 감소된 인플라마솜 활성화는 본 발명의 돌연변이된 플라겔린 변이체의 더욱 바람직한 치료 적용을 가능하게 한다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 플라겔린 변이체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 (1) 예를 들어, 매우 다양한 질환 상태 및 환자 타입에서 사용할 수 있는 감소된 항원성, 면역원성, 및 인플라마솜 활성화를 포함하는 개선된 약리학적 특성 및/또는 (2) 예를 들어, 개선된 의학적 효과를 가능하게 하는 개선된 기능적 특성을 갖는 플라겔린 변이체를 제공한다.
본 발명의 플라겔린 변이체는 플라겔린-관련 폴리펩타이드일 수 있다. 플라겔린 변이체는 다양한 그램-양성 및 그램-음성 박테리아 종을 포함하는, 다양한 공급원으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 미국 특허 공개 제2003/0044429호의 도 7에 도시된 박테리아 종으로부터의 임의의 플라겔린으로부터 유래된 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 플라겔린 변이체는 미국 제2003/0044429호의 도 7에 나열된 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 것과 관련된 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있으며, 이러한 문헌은 NCBI Genbank 데이터베이스를 포함하는 소스에서 공개적으로 입수 가능하다.
플라겔린 변이체는 박테리아 편모(flagellum)의 주요 성분일 수 있다. 플라겔린 변이체는 다양한 펩타이드 영역에 대한 양성 T 세포 반응에 의해 특성화되는 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5개의 T 세포 에피토프로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 3개의 T 세포 에피토프로 이루어진다. 추가 실시형태에서, T 세포 에피토프는 낮은 빈도의 양성 T 세포 증식 반응을 포함한다. 다양한 실시형태에서, T 세포 에피토프 강도는 낮음, 또는 중간, 또는 강함이다.
플라겔린 변이체는 박테리아 편모의 주요 성분일 수 있다. 플라겔린 변이체는 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7개의 도메인 또는 이의 단편으로 이루어질 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제8,324,163호의 도 10 참조, 이러한 문헌의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함됨). 도메인은 ND0, ND1, ND2, D3, CD2, CD1, 및 CD0로부터 선택될 수 있다. 도메인 0(D0), 1(D1), 및 2(D2)는 불연속적일 수 있고, 아미노 말단 및 카복시 말단에서의 잔기가 헤어핀 구조의 형성에 의헤 병치될 때 형성될 수 있다. D1 및 D2 도메인을 포함하는 아미노 및 카복시 말단은 대부분 보존될 수 있는 반면, 중간 초가변 도메인(D3)은 고도로 가변적일 수 있다. 비-보존된 D3 도메인은 편모 필라멘트의 표면 상에 존재할 수 있고, 주요 항원 에피토프를 함유할 수 있다. 플라겔린의 강력한 전염증성 활성은 고도로 보존된 ND1, ND2, CD1, 및 CD2 영역에 있을 수 있다.
플라겔린 변이체는 살모넬라(Salmonella)의 종으로부터 유래될 수 있으며, 이의 대표적인 예에는 S. 티피무륨(S. typhimurium) 및 S. 더블린(S. dublin)이 있다(GenBank 수탁 번호 M84972로 인코딩됨). 플라겔린 변이체는 야생형 플라겔린(서열번호 4)의 단편, 변이체, 유사체, 상동체, 또는 유도체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 플라겔린의 단편, 변이체, 유사체, 상동체, 또는 유도체는 플라겔린의 도메인 구조 및 TLR5에 의해 인식된 보존된 구조를 기초로 한 합리적-기반 설계에 의해 얻어질 수 있다.
플라겔린 변이체는 미국 특허 공개 제2003/000044429호(이러한 문헌의 내용은 본 명세서에 포함됨)에 개시된 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 그램-양성 또는 그램-음성 박테리아 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드, 및 미국 특허 공개 제2003/000044429호의 도 7(패널 A 내지 F)에 도시된 BLAST 결과에 나열된 수탁 번호에 해당하는 플라겔린 펩타이드, 또는 이의 변이체에 관한 것일 수 있다.
플라겔린 및 전술된 변이체는 본질적으로 면역원성 박테리아 단백질(예를 들어, 플라겔린 또는 "FliC")이기 때문에, 이론에 얽매이지 않고 높은 항원성 및 대부분의 면역원성을 겪는다. 기존 플라겔린 작제물의 실질적인 한계는 많은 대상체가 이러한 작제물의 TLR5-자극 활성을 중화시킬 수 있는 기존 항체의 높은 역가를 갖는다는 것이다. 이러한 개체는 때때로, 심지어 단일-주사의 경에도, 및 이론에 얽매이지 않고 더욱 가능하게 반복 치료 시에, 플라겔린-유래 치료에 대해 무감각(또는 완전히 내성)일 것이다. 또한, 이러한 기존 항체의 역가는, 초기에 더 낮은 수준으로 존재하더라도, 단일 플라겔린-유래 주사에 의해 빠르게 상승될 수 있으며, 이에 의해, 의학적 적용에 대해 예상되는 다중-투여 요법의 목적을 위해 심지어 더 큰 개체군도 손상시킨다. 집단에서 항-FliC 항체(중화 Ab를 포함함)의 광범위한 존재는 인체를 집락화(및 감염시키는) 편모 엔테로박테리아(예를 들어, 살모넬라 종, E. 콜라이)의 다수의 종에 대한 인류의 평생 노출을 반영할 가능성이 높다. 일부 실시형태에서,본 발명에 기술된 플라겔린 변이체는 플라겔린 활성을 중화시키는 다양한 항체에 대한 에피토프의 변경을 포함한다.
또한, 플라겔린 및 전술된 변이체는 인플라마솜 활성화를 겪는다. 어떠한 하나의 이론에 얽매이지 않고, 세포외 플라겔린이 플라겔린-TLR5 복합체의 내재화로 인해 세포질 NLRC4 인플라마솜을 활성화시킬 수 있다고 생각된다. NLRC4 인플라마솜은 미생물 독립체에 의한 이의 패턴 인식 수용체(PRR) 성분의 활성화 후에 어셈블링되는 다수의 세포질 다중-분자 복합체 중 하나이다. NLRC4의 경우에, 세포질 Nod-유사 수용체(NLR)는 박테리아 플라겔린에 의해 활성화되는데, 이는 또한, 세포막에 있는 톨-유사 수용체 5(TLR5)의 효능제이다. 세포외 플라겔린이 플라겔린-TLR5 복합체의 내재화로 인해 세포질 NLRC4 인플라마솜을 활성화시킬 수 있다고 가정한다. 어셈블링 직후에, 인플라마솜은 카스파제-1 활성화 및 후속하여 전-IL-1β의 주요 전염증성 사이토카인인 성숙한 IL-1β로의 처리를 수반하는 전염증성 케스케이드를 개시한다. 이러한 인플라마솜 활성화의 결과로서, 대상체는 치료 적용을 더욱 어렵게 만드는 바람직하지 않은 부작용을 경험할 수 있다.
일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 중화 항-CBLB502 항체에 의해 인식된 에피토프에서 돌연변이를 포함한다. 플라겔린 변이체는 조성물을 중화시키는 항체의 능력을 저해하거나 폐기하는 중화 항-CBLB502 항체에 의해 인식된 에피토프에서 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 중화 항체가 실질적으로 존재하지 않는 대상체에서 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 인플라마솜 활성화를 저해하는 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 하나 이상의 에피토프에서 절단 및 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어, 이미 약칭된 엔톨리모드/"CBLB502" 분자에 비해 잔기를 결실하는, 플라겔린의 최소 기능적 코어의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 엔톨리모드/CBLB502에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드/CBLB502(서열번호 3)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 서열번호 3과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 하나 이상의 에피토프에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 하나 이상의 에피토프에서 적어도 하나의 결실을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 에피토프 1, 에피토프 2, 및 에피토프 3 중 하나 이상에서 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어, 이미 약칭된 "33MX" 비해 잔기를 결실하는, 플라겔린의 최소 기능적 코어의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 하나 이상의 에피토프에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 하나 이상의 에피토프에서 적어도 하나의 결실을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 에피토프 1, 에피토프 2, 및 에피토프 3 중 하나 이상에서 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이, 및 I215, L216, Q217, T221 및 V223에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18A, F22A, Q217D 및 V223T를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 491TEMX(서열번호 2, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 (i) I18, F22, T23, S24 및 K27 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이, 및 (ii) I215, L216, Q217, T221 및 V223 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이를 포함하는 플라겔린 변이체를 고려하며, 여기서, 치환된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이며, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로, 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 F22A 및 T23D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-AD(서열번호 7, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 F22S 및 T23D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-SD(서열번호 8, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로, 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미놋나 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 F22T 및 T23D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-TD(서열번호 9, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 T23D 및 S24D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-DD(서열번호 10, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18A를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-49A(서열번호 11, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 F22A를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-53A(서열번호 12, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 T23D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-54D(서열번호 13, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18E를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-49E(서열번호 14, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18T를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-49T(서열번호 15, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 K27E를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-58E(서열번호 16, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 전기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215A를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM2-480A(서열번호 23, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 L216A를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM2-481A(서열번호 24, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 V223T를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM2-488T(서열번호 25, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 Q217D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM2-482D(서열번호 28, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 33MX(서열번호 1, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 T221D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM2-486D(서열번호 29, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이, 및 I215, L216, Q217, T221 및 V223에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18A, F22A, Q217D 및 V223T를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 491TEMX(서열번호 2, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 F22A 및 T23D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-AD(서열번호 7, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 F22S 및 T23D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-SD(서열번호 8, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 F22T 및 T23D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-TD(서열번호 9, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 T23D 및 S24D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-DD(서열번호 10, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18A를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-49A(서열번호 11, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 F22A를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-53A(서열번호 12, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 T23D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-54D(서열번호 13, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18E를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-49E(서열번호 14, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18T를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-49T(서열번호 15, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24 및 K27에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 K27E를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM1-58E(서열번호 16, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215A를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM2-480A(서열번호 23, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5) 없이, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 L216A를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM2-481A(서열번호 24, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로, 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그가 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5) 없이, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 V223T를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM2-488T(서열번호 25, 선택적으로 말단 히스티딘 태그가 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 플라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실(서열번호 6, 선택적으로 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그 없음)을 추가로 포함하는 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 Q217D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM2-482D(서열번호 28, 선택적으로 말단 히스티딘 태그가 없음)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개선된 활성을 제공하는, 결실, 추가 및 치환을 포함하는, 33MX와 같은, 엔톨리모드 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 변경된 아미노산 동일성을 갖는 팔라겔린 변이체의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 결실을 추가로 포함하는(서열번호 6, 선택적으로 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그) 33MX로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 선택적으로 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)가 없는, 서열번호 6과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I18, F22, T23, S24, K27, I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 I215, L216, Q217, T221, V223, A227, N228, Q229, V230, P231, Q232, N233, V234, L235, S236 및 L237에 해당하는 아미노산 잔기 위치(들)로부터 선택된 적어도 하나의 치환 또는 결실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이다. 추가 실시형태에서, 치환되거나 결실된 아미노산 잔기는 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기이다. 일부 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된, 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기이다. 추가 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기이다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 T221D를 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TEM2-486D(서열번호 29, 선택적으로 말단 히스티딘 태그 없음)이다.
일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 하나 이상의 에피토프에서 절단을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 N-말단 도메인에서 결실을 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 C-말단 도메인에서 결실을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 에피토프 1, 에피토프 2, 또는 에피토프 3에서 결실을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 서열번호 1과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 227-237의 결실을 추가로 포함한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 서열번호 1과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 선택적으로, 서열번호 1은 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)를 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 서열번호 6과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 선택적으로, 서열번호 6은 말단 히스티딘 태그(예를 들어, 서열번호 5)를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체는 예를 들어, 개선된 의학적 효과를 가능하게 하는, 개선된 기능적 및 약리학적 특성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체는 엔톨리모드/CBLB502 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 유사하거나 개선된 면역원성 감소 및/또는 인플라마솜 활성화 감소를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체는 엔톨리모드/CBLB502 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 유사하거나 개선된 NF-kB 활성화 및 방사선 보호 및/또는 방사선 완화를 갖는다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드/CBLB502 또는 다른 플라겔린 변이체에 비해 비례적으로 더 강한 약력학적 반응(예를 들어, 사이토카인 검정에 의해 검출됨)을 유도하는 유사하거나 개선된 약동학을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체는 엔톨리모드와 비교하여 동일하거나 유사하거나 개선된 약동학 프로파일을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드의 체류 기간에 비해 숙주에서 증가되거나 유사한 체류 기간을 나타낸다. 실시형태에서, 대상체에 본 발명의 플라겔린 변이체의 투여는 플라겔린 변이체의 생체이용률의 실질적인 지속기간 증가를 야기시킨다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체는 항원성 감소, 면역원성 감소, 및 인플라마솜 활성화 감소를 포함하는 개선된 약리학적 특성을 가지며, 이는 예를 들어, 매우 다양한 질환 상태 및 환자 타입에서 사용할 수 있다. 감소된 항원성, 면역원성, 및 인플라마솜 활성화는 예를 들어, 재발 투여가 필요한 의학적 적용을 포함하는, 본 발명의 플라겔린 변이체가 사용될 수 있는 의학적 적용을 확장한다. 일부 실시형태에서, 감소된 항원성은 기존 인간 항체(예를 들어, 항-플라겔린)의 중화 작용에 대한 개선된 내성뿐만 아니라 엔톨리모드/CBLB502 주사에 대한 반응으로 유발된 것으로 해석된다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 생체내에서 더 긴 체류 시간을 갖는다. 더 긴 체류 시간은 더 적은 용량 또는 더 멀리 떨어진 용량으로 조성물이 효과적일 수 있게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체 및 방법은 급성 부작용, 장기 부작용을 포함하는, 방사선 요법 및/또는 방사선 노출의 부작용, 또는 누적 부작용을 감소시키거나 제거한다. 다양한 실시형태에서, 본 방법은 방사선 요법 및/또는 방사선 노출의 국소 또는 전신 부작용을 감소시키거나 제거한다. 다양한 실시형태에서, 방사선 요법 및/또는 방사선 노출의 부작용은 피로, 메스꺼움 및 구토, 상피 표면에 대한 손상(예를 들어, 비제한적으로, 습성 박리), 입, 목 및 위 염증, 장 불편함(예를 들어, 비제한적으로, 쓰라림, 설사 및 메스꺼움), 부기, 불임, 섬유증, 탈모, 건조(예를 들어, 비제한적으로, 구강 건조(구강건조증) 및 안구 건조(안구건조증), 및 겨드랑이 및 질 점막의 건조, 림프 부종, 심장병, 인지기능 저하, 방사선 장질환, 예를 들어, 비제한적으로, 위축증, 섬유증 및 혈관 변화 중 하나 이상이며, 이는 흡수 장애, 설사, 지방변 및 담즙산 설사를 갖는 출혈 및 회장 침범으로 인해 흔히 발견되는 비타민 B12 흡수장애를 형성시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 태그를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 태그는 플라겔린 변이체의 N-말단에 부착된다. 또 다른 실시형태에서, 태그는 플라겔린 변이체의 C-말단에 부착된다.
일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 표 1에 나열된 단백질 플라겔린 변이체 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 서열번호 2 및 7 내지 40 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 추가 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 2 및 7 내지 40 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진 플라겔린 변이체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 서열번호 2의 폴리펩타이드(491TEMX/SE-2/GP532로도 알려짐)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 서열번호 2 및 7 내지 40의 서열 중 어느 하나와 적어도 30 내지 99% 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 6의 서열 중 어느 하나와 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체는 서열번호 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 23, 24, 25, 28 및 29의 서열 중 어느 하나와 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
플라겔린 변이체의 사용
일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 톨-유사 수용체 활성(예를 들어, TLR5)을 자극시킨다. TLR 패밀리는 적어도 10개의 구성원으로 이루어지고, 병원체에 대한 선천 면역 방어에 필수적이다. 선천 면역계는 보존된 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)을 인식한다. TLR은 아미노산 함량의 변화에 어느 정도 허용되는 큰 잔기 그룹으로 이루어질 수 있는 박테리아 플라겔린에 대해 특이적인 보존된 구조를 인식할 수 있다. 문헌[Smith et al., Nat. Immunol. 4:1247-53 (2003)]에서는 플라겔린에서, TLR5에 의해 인식되는 보존된 구조의 일부인 13개의 보존된 아미노산을 동정하였다.
일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TLR5 신호전달을 활성화한다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 TLR5를, 엔톨리모드/CBLB502 및/또는 다른 플라겔린 변이체와 동일한 수준 또는 유사한 수준으로 활성화한다. TLR5의 활성화는 NF-κB-의존성 프로모터를 유도하며, 이는 또한, 여러 염증-관련 사이토카인을 활성화한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 전염증성 사이토카인의 발현을 유도한다. 추가 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 항-염증성 분자의 발현을 유도한다. 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 항-아폽토시스성 분자의 발현을 유도한다. 또 다른 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 항-박테리아 분자의 발현을 유도한다. NF-κB의 표적은 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-18, G-CSF, TNFSF13B, 케라티노사이트 화학유인제(KC), BLIMP1/PRDM1, CCL5, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL22, CCL23, CXCL1,CCL28, CXCL11, CXCL10, CXCL3, CXCL1, GRO-베타, GRO-감마, CXCL1, ICOS, IFNG, IL-1A, IL-1B, IL1RN, IL-2, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12B, IL-12A, IL-13, IL-15, IL-17, IL-23A, IL-27, EBI3, IFNB1, CXCL5, KC, IiGp1, CXCL5, CXCL6, LTA, LTB, CCL2, CXCL9, MCP-1/JE, CCL3, CCL4, CXCL3, CCL20, CXCL10, CXCL5, CCL5, CCL1, TNF베타, TNFSF10, TFF3, TNFSF15, CD86, 보체 성분 8a, CCL27, 데펜신-β3, MIG, MIP-2 및/또는 NOD2/CARD15를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, TLR5 신호전달의 활성화는 조절 T-세포(Treg)의 생성을 증가시키고/시키거나 LPS-유도 ERK1/2 활성화를 감소시키고/시키거나 자연 살해(NK) T-세포를 활성화시킴으로써 CD4+ T-세포 면역 기능을 조절할 수 있다.
질환 및 치료/예방 방법
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제) 및 방법은 다양한 질환 상태에 적용 가능하다. 일 양태에서, 본 발명은 TLR5 신호전달을 자극하는 방법으로서, 본 발명의 플라겔린 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. TLR5 신호전달의 활성화는 암 치료, 방사선-유도 또는 관류-유도 손상으로부터의 보호, 백신에서 애주번트로서 작용, 또는 세포독성 화합물로부터 세포의 보호를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 광범위한 치료 적용을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체, 또는 이의 단편은 바이러스 백신에 애주번트로서 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 플라겔린 변이체 또는 이의 단편은 인플루엔자 항원에 대해 더 큰 숙주 면역 반응을 유도하기 위해 인플루엔자 백신 또는 항원과 함께 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체, 또는 이의 단편은 기생충에 대한 백신의 애주번트로서 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 플라겔린 변이체 또는 이의 단편은 플라스모듐(Plasmodium) 항원에 대해 더 큰 숙주 면역 반응을 유도하기 위해 플라스모듐 백신 또는 항원과 함께 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체는 독성 조건으로부터 세포를 보호하기 위해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 Fas-매개 손상으로부터 간 세포를 보호할 수 있다. 본 발명의 플라겔린 변이체는 말초 혈액 및 카스파제 활성화에서 간 효소의 감소를 야기시킬 수 있다.
플라겔린 및 전술된 변이체는 인플라마솜 활성화를 겪는다. 어떠한 하나의 이론에 얽매이지 않고 세포외 플라겔린이 플라겔린-TLR5 복합체의 내재화로 인해 세포질 NLRC4 인플라마솜을 활성화시킬 수 있다고 생각된다. NLRC4 인플라마솜은 미생물 독립체에 의한 이의 패턴 인식 수용체(PRR) 성분의 활성화 후에 어셈블링되는 다수의 세포질 다중-분자 복합체 중 하나이다. NLRC4의 경우, 세포질 Nod-유사 수용체(NLR)는 박테리아 플라겔린에 의해 활성화되며, 이는 또한, 세포막 상의 톨-유사 수용체 5(TLR5)의 효능제이다. 세포외 플라겔린이 플라겔린-TLR5 복합체의 내재화로 인해 세포질 NLRC4 인플라마솜을 활성화시킬 수 있다고 가정된다. 어셈블링 직후에, 인플라마솜은 카스파제-1 활성화 및, 후속하여, 전 -IL-1β의, 주요 전염증성 사이토카인인 성숙한 IL-1β로의 처리를 수반하는 전염증성 케스케이드를 개시한다. 이러한 인플라마솜 활성화의 결과로서, 대상체는 치료 적용을 더욱 어렵게 만드는 바람직하지 않은 부작용을 경험할 수 있다.
암
다양한 실시형태에서, 본 발명은 암 및/또는 종양; 예를 들어, 암 및/또는 종양의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "암" 또는 "종양"은 신체 장기 및 시스템의 정상적인 기능화를 방해하는, 세포의 통제되지 않은 성장 및/또는 비정상적인 세포 생존의 증가 및/또는 아폽토시스의 저해를 지칭한다. 양성 및 악성 암, 폴립, 과다형성뿐만 아니라 휴면기 종양 또는 미세전이가 포함된다. 또한, 면역계에 의해 방해받지 않은 비정상적인 증식을 갖는 세포(예를 들어, 바이러스 감염된 세포)가 포함된다. 암 또는 종양을 갖는 대상체는 대상체의 신체에 존재하는 객관적으로 측정 가능한 암 세포를 갖는 대상체이다. 이의 본래 위치에서 이동하고 중요한 장기에서 시딩하는 암은 결국 영향을 받은 장기의 기능 저하를 통해 대상체의 사망으로 이어질 수 있다. 백혈병과 같은 조혈 암은 대상체에서 정상 조혈 구획을 능가하여, 조혈 부전(빈혈, 혈소판 감소증 및 호중구 감소증 형태)을 초래하고, 궁극적으로 사망을 초래할 수 있다.
암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다. 원발성 암은 임상적으로 검출 가능한 발생 부위에서의 암 세포의 영역일 수 있고, 원발성 종양일 수 있다. 대조적으로, 전이성 암은 하나의 장기 또는 일부에서 비-인접 장기 또는 부분으로의 질환의 확산일 수 있다. 전이성 암은 국소 전이일 수 있는, 새로운 종양을 형성하는, 국소 영역의 주변 정상 조직에 침투하고 침윤하는 능력을 획득한 암 세포에 의해 야기될 수 있다.
암은 또한, 림프관 및/또는 혈관의 벽을 관통하는 능력을 획득한 암 세포에 의해 유발될 수 있으며, 그 후에, 암 세포는 혈류를 통해(이에 의해 순환 종양 세포임) 다른 부위 및 신체의 조직으로 순환할 수 있다. 암은 림프성 또는 혈종 확산과 같은 과정으로 인한 것일 수 있다. 암은 또한, 다른 부위에 잔류하고, 혈관 또는 벽을 통해 재침투하고, 계속 증식하고, 결국 다른 임상적으로 검출 가능한 종양을 형성하는 종양 세포에 의해 야기될 수 있다. 암은 이러한 새로운 종양일 수 있으며, 이는 전이성(또는 2차) 종양일 수 있다.
암은 2차 또는 전이성 종양일 수 있는, 전이된 종양 세포에 의해 야기될 수 있다. 종양의 세포는 본래 종양에서의 세포와 유사할 수 있다. 일례로서, 유방암 또는 결장암이 간으로 전이하는 경우에, 2차 종양은 간에 존재하는 동안에, 비정상적인 유방 또는 결장 세포로 구성되고, 비정상적인 간 세포로 구성되지 않는다. 간에서의 종양은 이에 따라, 전이성 유방암 또는 전이성 결장암일 수 있고, 간암은 아니다.
암은 임의의 조직으로부터의 기원을 가질 수 있다. 암은, 예를 들어, 흑색종, 결장, 유방, 또는 전립선으로 비롯될 수 있고, 이에 따라, 본래 피부, 결장, 유방, 또는 전립선 각각인 세포로 구성될 수 있다. 암은 또한, 림프종일 수 있는, 혈액학상 악성종양일 수 있다. 암은 간, 폐, 방광 또는 창자와 같은 조직을 침윤할 수 있다. 침윤된 조직은 TLR을 발현할 수 있는 반면, 암은 TLR을 발현하거나 발현하지 않을 수 있다.
또한, 본 명세서에는 암 재발을 감소시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 포유동물에 본 발명의 플라겔린 변이체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 암은 TLR5와 같은 TLR을 발현하거나 발현하지 않는 조직에 존재할 수 있거나 존재한 것일 수 있다. 본 방법은 또한 암 재발을 예방할 수 있다. 암은 종양학적 질환일 수 있다. 암은 휴면기 종양일 수 있으며, 이는 암의 전이로 인한 것일 수 있다. 휴면기 종양은 또한, 종양의 외과적 제거로 인해 잔류할 수 있다. 암 재발은 종양 재성장, 폐 전이, 또는 간 전이일 수 있다.
본 발명의 대표적인 암 및/또는 종양은 TLR5를 발현할 수 있거나 발현하지 않을 수 있고 기저 세포 암종, 담도암; 방광암; 골암; 뇌 및 중추신경계 암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장 및 직장 암; 결합조직 암; 소화기 계통의 암; 자궁내막암; 식도암; 안암; 두경부암; 위암(위장암을 포함함); 교아세포종; 간암종; 간종양; 상피내 신생물; 신장 또는 신암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암, 및 폐의 편평 암종); 흑색종; 골수종; 신경모세포종; 구강암(입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막 모세포종; 횡문근 육종; 직장암; 호흡기 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평상피 세포암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비-호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종(낮은 등급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL); 소림프구(SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 광범위 NHL; 높은 등급 면역모세포 NHL; 높은 등급 림프모구 NHL; 높은 등급 비절단 소세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종을 포함함)을 포함하는 림프종; 및 발텐스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프성 백혈병(CLL); 급성 림프모구 백혈병(ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라 모반증, 부종(예를 들어, 뇌종양과 관련된 것), 및 메이그 증후군과 관련된 비정상적인 혈관 증식을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제) 및 방법은 암 및/또는 종양을 포함하는 전이성 질환에 적용 가능하다. "전이"는 일차 부위에서 신체의 다른 부위로 암의 확산을 지칭한다. 암 세포는 원발성 종양에서 분리되고, 림프관 및 혈관으로 짐투하고, 혈류를 통해 순화하고, 신체의 다른 곳의 정상 조직에서 먼 중심에서 정상(전이)할 수 있다. 전이는 국소 또는 먼 곳일 수 있다. 전이는 원발성 종양에서 떨어져나와 혈류를 통해 이동하고, 먼 부위에서 멈추는 종양 세포에 따르는 순차적 과정이다. 새로운 부위에서, 세포는 혈액 공급을 구축하고, 성장하여 치명적인 매스(mass)를 형성할 수 있다. 종양 세포 내의 자극 및 저해 분자 경로 둘 모두는 이러한 거동을 조절하며, 먼 부위에서 숙주 세포와 종양 세포 간의 상화작용이 또한 중요하다.
전이는 특정 증상의 모니터링 이외에, 자기 공명 영상화(MRI) 스캔, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 혈액 및 혈소판 수, 간 기능 연구, 흉부 X-선 및 뼈 스캔의 단독 또는 조합 사용을 통해 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 구성적 활성 NF-κB 암으로 고통받는 포유동물을 치료하는 방법으로서, 포유동물에 치료학적 유효량의, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 포함하는 NF-κB 활성을 유도하는 제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. NF-κB 활성을 유도하는 제제는 암 치료와 병행하여 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료로부터의 부작용을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암 치료로부터의 부작용은 탈모증, 골수억제, 신장 독성, 체중 감량, 통증, 메스꺼움, 구토, 설사, 변비, 빈혈, 영양실조, 탈모, 마비, 미각 변화, 식욕 상실, 가늘어지거나 취약한 모발, 구내염, 기억 상실, 출혈, 심장 독성, 간 독성, 귀 독성, 및 화학요법 후 인지 장애를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 구성적 활성 NF-κB 암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 암의 치료에 기여할 수 있는 정상 조직에 대한 손상으로 고통받는 포유동물을 치료하는 방법으로서, 포유동물에, 치료학적 유효량의 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
노화 및 스트레스
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 투여하는 단계를 포함하는 세포 노화를 조절하는(예를 들어, 포유류 세포 노화를 억제하고/하거나 감속시키는) 방법을 포함한다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 노화-관련 질환, 예를 들어, 알츠하이머병, 제2형 당뇨병, 황반 변성, 만성 염증-기반 병리(예를 들어, 관절염)를 예방 또는 치료하고/하거나, 노화와 관련된 것으로 알려진 암 타입(예를 들어, 전립선암, 흑색종, 폐암, 결장암 등)의 발명을 예방하고/하거나, 노화 조직(예를 들어, 피부 또는 전립선)의 기능 및 형태를 복원하고/하거나 축적된 노화 세포에 의해 손상된 조직의 형태를 개선시키고(착색된 피부 병소의 미용 치료)/시키거나 방사선 또는 화학요법에 의한 암 치료 결과를 개선시키고/시키거나 휴면기 암 세포의 제거에 의해 암 환자에서 재발 및 전이성 질환을 예방하는 것을 목적으로 한다. 본 개시는 인간 및 비-인간 동물 질환 및 노화 및 연령-관련 장애의 예방 및/또는 치료에 적합하다.
다양한 예에서, 본 개시는 알츠하이머병, 제2형 당뇨병, 황반 변성을 포함하지만, 이로 반드시 제한되는 것은 아닌 노화-관련 질환, 또는 관절염을 포함하지만, 이로 반드시 제한되는 것은 아닌 만성 염증을 포함하는 질환을 갖는 것으로 의심되거나 발병할 위험이 있는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 심혈관 질환 또는 장애, 염증성 질환 또는 장애, 폐 질환 또는 장애, 신경 질환 또는 장애, 대사 질환 또는 장애, 피부 질환 또는 장애, 노화-관련 질환 또는 장애, 조기 노화 질환 또는 장애, 및 수면 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 식별된 환자의 치료를 위한 방법이 기술되어 있다. 조기 노화 질환 및 장애는 휴킨슨-길포드 조로증 또는 베르너 증후군을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어, 노화를 감소, 중지, 또는 지연시킴으로써 노화를 치료 또는 예방하는 것에 관한 것이다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 세포 노화(노화)는 특히 세포 주기가 차단될 때, mTOR 경로와 같은 신호 전달 경로의 과잉자극 및 과활성화에 의해 야기되어, 세포 과잉 활성화 및 기능 과잉으로 이어지는 것으로 간주된다. 또한, 이것은 2차 신호 저항 및 보상 무능(compensatory incompetence)을 야기시킨다. 세포 기능 항진 및 신호-저항 둘 모두는 장기 손상(먼 장기를 포함됨)을 유발하고, 노화(무증상 손상) 및 노화-관련 질환(임상 손상)을 나타내고, 결국 유기체 사망으로 이어진다. 세포 노화 마커의 비제한적인 예는 세포 비대, 증식 잠재력의 영구적 손실, 크고 평평한 세포 모폴로지 및 베타-Gal 염색인 것으로 간주된다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 임의의 세포 노화 마커를 조절하는 것에 관한 것이다.
노화 과정은 모든 주요 생리학적 기능의 결함들의 점진적인 축적, 재생 능력의 감소, 손상된 상처 치유 및 노화-관련 질환, 예를 들어, 암, 제2형 당뇨병, 관절염, 알츠하이머병 및 파킨슨병, 아테롬성 동맥경화증 등의 위험성 증가에 의해 나타난다. 점증적으로, 모든 이러한 사건은 쇠약의 점진적인 증가로서 기술되고 소위 "노화 지표(frailty index)"로 측정될 수 있다. 쇠약의 연령-관련 증가는 화학요법 및 방사선에 의해 암 치료를 받은 사람 또는 동물에서 가속화될 수 있으며, 이는 가속화된 노화로서 해석될 수 있다. 자연 노화뿐만 아니라 암 치료에 의해 가속화된 노화의 진행은 플라겔린으로 명명된 단백질로 구축된 활동적인 이동을 위한 세포 기관인 편모를 갖는 박테리아로의 감염에 대한 반응의 자연적인 선천 면역 메커니즘의 활성화에 의해 크게 느려질 수 있다. 신체에 이러한 박테리아의 존재는 톨-유사 수용체 5(TLR5)로 명명되는 세포 표면 수용체에 의해 인식된다. TLR5에 대한 본 발명의 플라겔린 변이체의 결합은 생리학적 반응을 촉발시켜, 쇠약 획득의 둔화 및 치료된 유기체의 개선된 건강 및 삶의 질으로서 나타나는 유기체에 대한 장기간 효과를 나타내는 다수의 생체활성 인자(사이토카인, 케모카인 등)의 생산을 수반하는 면역계의 전신 동원에 이르게 한다. TLR5의 활성화를 가능하게 하는 본 발명의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)로의 치료는 자연 노화 및 암 치료 및 다른 타입의 중독에 의해 유발된 조기 가속화된 노화를 예방 및 치료하는 방법으로서 예상될 수 있다.
노화는 시감이 지남에 따라 진행하는 포유류 유기체의 점진적인 전신 병리학적 변형이다. 이는 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병, 폐 섬유증, 실명, 치매, 신장 기능장애, 골관절염, 및 낮은 등급 만성 무균 염증을 포함하는 연령-관련 만성 질환뿐만 아니라 본 명세서에서 고려된 다른 노화-관련 질환 및 장애의 발병으로 이어지는, 모든 장기 및 조직의 기능의 다중 결핍의 축적 및 감소된 재생 능력과 관련이 있다. 이러한 상태는 종종 쇠약, 인지 장애 및 부동성을 포함하는 노인 증후군의 점진적인 발달과 일치한다. 노화는 자연스럽고 피할 수 없는 과정이다. 노화의 근본적인 원인은 여전히 논쟁의 여지가 있다. 그러나, 노화의 두 가지 특징은 일반적으로 보편적으로 수용된다: DNA 손상의 증가와 전신성 무균 만성 염증의 발달, 둘 모두는 연령-관련된 병리의 주요 기여인자로 고려됨.
젊은 개체에 유전독성 의학적 치료 또는 환경의 노출은 상기에 나열된 다수의 연령-관련 상태의 조기 발병의 높은 위험과 관련이 있고, 가속화된 노화로서 간주된다.
이러한 타입의 가장 일반적인 의학적 치료들 중 하나는 암 치료이다. 암 치료는 종종 인간 및 동물을 유전독성 스트레스에 노출시켜 손상된 DNA를 갖는 수많은 정상 세포로 이어지고, 노화 세포의 축적 및 만성 전신 염증의 획득을 유발한다. 이러한 상태는 비정상적인 갑상선 기능, 골 무기물 밀도 감소 및 골다공증 증가, 불임, 손상된 조직 재생, 심장 독성, 폐 섬유증 및 만성 무균 염증과 같은 자연 노화와 일반적으로 관련된 다수의 질환의 위험을 증가시킨다. 암 생존자의 노화 가속화는 특히, 유아기에 암에 대해 성공적으로 치료받은 개체에서 잘 기록되어 있다. 실제로, 소아암에 대해 치료받은 성인은 심혈관, 폐, 간, 신장, 및 생식선 기능장애와 같은 만성 건강 상태의 조기 발병 위험이 증가하고, 2차 악성 신생물 및 사망률이 증가한다. 20대의 생존자 중에 만성 질환 비율은 50대의 형제자매의 비율과 유사하다. 인지 기능장애 및 감소된 근력과 같은 다른 연령-관련 상태의 증가율이 또한, 소아암 생존자 사이에서 보고되고, 예상된 것보다 수십 년 더 일찍 나타난다. 이러한 연구 및 다른 연구에서는, 소아암의 일부 생존자가 노인에서 발견되는 것과 일치하는 생리적 쇠약 표현형을 갖는다고 시사하고 있다. 조혈 세포 이식(HCT) 생존자 중 생리학적 쇠약은 또한 가속화된 노화를 시사하고, 조기 사망에 대한 예측인자이다. 쇠약률은 HCT 생존자에서 이의 형제자매보다 8배 더 높았다. 이식 후 적어도 10년에 HCT의 생존자 중에, 중증/생명 위협/치명적 상태의 15년 누적 발생률은 41%였다.
용어 "노화-관련 질환"은 암, 대사 질환, 심혈관 질환, 담배-관련 질환, 또는 피부 주름과 같은 성인의 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 암은 전립선암, 결장암, 폐암, 두경부의 편평상피 세포암, 식도암, 간세포 암종, 위암, 췌장암, 난소암, 또는 유방암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 연령-관련 또는 담배-관련 질환은 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 알츠하이머병, 골관절염, 심장 이완기 기능장애, 양성 전립선 비대, 대동맥류, 또는 기종을 포함한다.
인간 및 동물의 결함의 노화-관련 축적 및 쇠약의 정량적 평가를 위한 수 개의 포괄적인 방법이 존재한다. 개별 유기체는 이의 건강 상태 및 노화율이 이질적이다. 이러한 이질성을 설명하기 위해, 노화 지표(FI)는 연구에서 고려된 결함의 총 수에 대한 개인에 존재하는 결함 비율인 수치 스코어로서 도입되었다. FI의 변화는 개인 노화율을 특성화 한다. 유사한 방법은 실험 동물에 적용되었다. 노화 지표는 "생물학적 연령"의 신뢰성 있고 광범위하게 인정된 척도 및 삶의 질 저하를 나타내는 일반적인 건강 저하 정도로서 간주된다.
현재, 노화의 예방 및 치료를 위한 의학에서 통상적으로 사용되는 약물 또는 치료가 존재하지 않는다. 건강한 삶 및 수명의 연장은 칼로리 제한으로 기록되었다. 유사한 효과는 라파마이신과 같은 mTOR 저해제를 사용하여 도달될 수 있다. 둘 모두는 장기간 적용을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 다양한 라팔로그(rapalog)(예를 들어, 라파마이신 및 이의 유사체)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, mTOR 저해제와 함께 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체를 투여하는 단계를 포함하는 세포 노화를 조절하는 방법을 제공한다. 자연적으로 발생하고 암 치료에 의해 가속화되는, 연령-관련 쇠약의 진행 과정을 늦출 수 있는 약리학적 제제는 절실히 요구된다. 발병하는 경우에, 이것은 인구의 100%에 이르는 병리의 치료에 적용 가능한 제제로서 무제한 시장을 가질 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 투여하는 단계를 포함하는 스트레스의 치료 방법을 포함한다. 본 발명은 또한, 포유동물에 치료학적 유효량의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 스트레스로 인한 정상 조직에 대한 손상을 겪는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 스트레스는 방사선, 상처, 중독, 감염, 및 온도 충격을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 소스에 기인할 수 있다.
일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 노출 전 약 48시간, 약 46시간, 약 44시간, 약 42시간, 약 40시간, 약 38시간, 약 36시간, 약 34시간, 약 32시간, 약 30시간, 약 28시간, 약 26시간, 약 24시간, 약 22시간, 약 20시간, 약 18시간, 약 16시간, 약 14시간, 약 12시간, 약 10시간, 약 8시간, 약 6시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 또는 약 1시간을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 스트레스에 노출 전 임의의 시점에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 노출 후 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 약 26시간, 약 28시간, 약 30시간, 약 32시간, 약 34시간, 약 36시간, 약 38시간, 약 40시간, 약 42시간, 약 44시간, 약 46시간, 또는 약 48시간을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 스트레스에 대한 노출 후 임의의 시점에 투여될 수 있다.
방사선 손상의 완화 및 예방
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 방사선 관련 질환 또는 손상의 치료에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 방사선 관련 질환의 완화 또는 예방 및/또는 이의 보호에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 방사선에 대한 노출의 효과로부터의 세포의 보호에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 투여하는 단계를 포함하는 방사선으로부터 대상체를 보호하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방사선은 전리 방사선이다. 일부 실시형태에서, 전리 방사선은 위장 증후군 또는 조혈 증후군을 유발시키기에 충분하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 방사선 보호제, 예를 들어, 항산화제(예를 들어, 아미포스틴 및 비타민 E), 사이토카인(예를 들어, 줄기세포 인자) 등과 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 방사선 전, 이와 함께, 이후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 성장 인자(예를 들어, 케라티노사이트 성장 인자), 스테로이드(예를 들어, 5-안드로스텐다이올), 암모늄 트라이클로로(다이옥소에틸렌-O,O')텔루레이트, 갑상선 보호제(예를 들어, 요오드화칼륨(KI)), 항-메스꺼움제, 항-설사제, 진통제, 항불안제, 진정제, 사이토카인 요법, 항생제, 항진균제, 및/또는 항바이러스제와 조합하여 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 아폽토시스-매개 조직 손상을 치료 및/또는 완화시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 아폽토시스는 세포 스트레스로 인한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 조직 손상 전, 이와 함께, 이후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포 스트레스는 방사선이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 방사선 보호제(예를 들어, 항산화제(예를 들어, 아미포스틴 및 비타민 E), 사이토카인(예를 들어, 줄기세포 인자) 등과 조합하여 투여된다.
전리 방사선으로부터 정상 세포의 손상 및 사멸은 노출된 세포에 대한 직접 방사선-유도 손상과 방사선-유도 스트레스에 대한 유전적으로 프로그래밍된 활성 세포 반응의 조합으로 자살 사멸 또는 아폽토시스를 유발시킨다. 아폽토시스는 여러 방사선에 민감한 기관(예를 들어, 조혈 및 면역계, 소화관의 상피 등)에서 발생하는 대랴 세포 손실에 중요한 역할을 하며, 이의 부전은 유기체의 일반적인 방사선감수성을 결정한다. 일부 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체에 본 발명의 플라겔린 변이체의 투여는 세포의 아폽토시스를 억제한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체는 방사선 치료의 손상 효과로부터 건강한 세포를 보호하기 위해 암 방사선 요법 치료받은 대상체에 투여된다.
전리 방사선(IR)에 대한 노출은 단기 또는 장기일 수 있고/있거나, 이는 단일 또는 다중 선량으로서 적용될 수 있고/있거나, 이는 전신 또는 국소적으로 적용될 수 있다. 본 발명은, 일부 실시형태에서, 핵 사고 또는 군사 공격에 관한 것으로서, 이는 단일의 고선량의 전신 조사(때때로 방사성 동위원소에 의한 장기 중독이 이어짐)에 대한 노출을 포함할 수 있다. 예를 들어, 공여자 골수를 위한 조혈 기관을 숙주 혈액 전구체로부터 "세정(cleaning)"함으로써 준비해야 할 때 골수 이식을 위한 환자의 전처리에 대해서도 마찬가지이다(적용 선량의 엄격한 제어). 암 치료는 전신 조사로서 적용될 경우 치사량을 크게 초과하는 여러 번의 선량의 국소 조사를 포함할 수 있다. 방사성 동위원소로의 중독 또는 치료는 표적화된 기관(예를 들어, 125I의 흡입의 경우 갑상선)의 방사선의 장기간 국소 노출을 초래한다. 또한, 생물학적 영향의 중증도에서 크기 상이한 전리 방사선의 여러 물리적 형태가 존재한다.
분자 및 세포 수준에서, 방사선 입자는 DNA, 단백질, 세포막 및 다른 거대분자 구조에서 절단 및 가교를 생성시킬 수 있다. 전리 방사선은 또한, 자유 라디칼 및 반응성 산소종(ROS)을 발생시킴으로써 세포 성분에 2차 손상을 유도한다. DNA의 완전성 및 충실성을 복원하는 여러 DNA 복구 경로, 및 자유 라디칼 및 ROS를 스캐빈징하고 산화된 단백질 및 지질을 감소시키는 항산화제 화학물질 및 효소와 같은 다중 복구 시스템이 이러한 손상에 대응한다. 세포 관문 시스템은 DNA 결함을 검출하고, 손상이 복구되거나 세포가 성장 정지를 수용하는 결정 또는 프로그래밍된 세포 사멸(아폽토시스)이 도달될 때까지 세포 주기 진행을 지연시킨다.
방사선은 저선량의 경미한 돌연변이 유발 및 발암 효과에서 고선량에 의한 거의 즉각적인 사멸의 범위에서 포유류 유기체에 대한 손상을 야기시킬 수 있다. 유기체의 전체 방사선 감수성은 조혈계, 생식계 및 세포 회전율이 높은 상이한 상피를 포함하는 여러 민감한 조직에서 발생하는 병리학적 변화에 의해 결정된다.
사멸에 이르는 감마 조사의 급성 병리학적 결과는 상이한 선량에 대해 상이하고, 각 특정 선량에 대한 유기체의 감수성의 임계값을 규정하는 특정 기관의 부전에 의해 결정될 수 있다. 이에 따라, 낮은 선량에서의 치사율은, 예를 들어, 골수 무형성증에서 발생하며, 중간 선량은, 예를 들어, 위장(GI) 증후군을 유도함으로써 더 빨리 사멸한다. 매우 높은 선량의 방사선은 거의 즉각적인 사멸을 초래하여 신경세포 변성을 유발할 수 있다.
방사선의 급성 독성 기간 동안 생존하는 유기체는 방사선-유도 발암 및 조사 후 수 개월 및 수 년에 노출된 장기(예를 들어, 신장, 간 또는 폐)에서 발병하는 섬유증을 포함하는 장기간 드문 결과를 겪을 수 있다.
세포 DNA는 직접 및 간접(예를 들어, 자유 라디칼-기반) 메커니즘에 의해 다양한 타입의 DNA 손상(유전자독성 스트레스)을 유발하는 IR의 주요 표적이다. 모든 유기체는 방사선-손상된 DNA를 효과적으로 복구할 수 있는 DNA 복구 시스템을 유지하며, DNA 복구 과정의 오류는 돌연변이로 이어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체가 경험한 방사선 노출은 암 방사선 요법 치료의 결과이다. 종양은 일반적으로 감마 방사선에 더 민감하고, 정상 조직에 비교적 낮은 손상을 유발하는 다중 국소 선량으로 치료될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 일부 경우에, 정상 조직의 손상은 암 치료를 위한 감마 방사선의 적용에서 제한 인자이다. 통상적인 3-차원 컨포말 또는 더욱 더 포커싱된 BeamCath 전달에 의한 암 치료법 동안 감마-조사의 사용은 또한, 조사의 누적 효과 및 골수 및 위장관(GI)과 같은 빠르게 재생하는 정상 조직의 줄기세포의 손상을 유함으로써 유발된 용량-제한 독성을 갖는다. 본 발명의 플라겔린 변이체의 투여는 종양 세포의 방사선 감수성에 영향을 미치지 않으면서 방사선 손상으로부터 환자의 건강한 세포를 보호할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 치사량의 방사선에 노출되었다. 고용량에서, 방사선-유도 치사율은 소위 조혈 및 위장 방사선 증후군과 관련이 있다. 조혈 증후군은 조혈 세포 및 혈액 및 림프계의 재생을 불가능하게 만드는 이의 전구체의 손실에 의해 특징된다. 사멸은 대개 감염(면역억제의 결과), 출혈 및/또는 빈혈의 결과로서 발생한다. GI 증후군은 장 상피, 주로 소장에서 대량 세포 사멸에 의해 유발되고, 이후에 장벽을 붕괴시키고 균혈증 및 패혈증으로 사망한다. 조혈 증후군은 대개 낮은 선량의 방사선에서 우세하고, GI 증후군에 비해 사망을 더욱 지연시킨다.
과거에, 방사선 보호제는 통상적으로, 합성 및 천연인 항산화제 둘 모두였다. 더 최근에, 사이토카인 및 성장 인자는 방사선 보호제의 리스트에 첨가되었으며, 이의 방사선 보호의 메커니즘은 민감한 조직의 재생에 대한 효과를 촉진한 경과인 것으로 간주된다. 그러나, 방사선 보호제 그룹 둘 모두 사이에 명확한 기능적 차이가 없는데, 왜냐하면, 일부 사이토카인이 망간 수퍼옥사이드 디스뮤타제(MnSOD) 및 메탈로티오네인과 같은 세포 항산화제 단백질의 발현을 유도하기 때문이다.
특정 제제에 대한 보호 조치는 선량 변경 인자(DMF 또는 DRF)로 표현될 수 있다. DMF는 소정 범위의 방사선 선량으로 방사선 보호제 치료된 대상체 및 치료받지 않은 대조군 대상체를 조사하고, 이후에, 생존 또는 일부 다른 종점을 비교함으로써 결정된다. DMF는 통상적으로 30일 생존(LD50/30 비히클-처리로 나누어진 LD50/30 약물-치료)에 대해 계산되고, 조혈계의 보호를 정량화한다. 위장계 보호를 추정하기 위해, LD50 및 DMF는 6일 또는 7일 생존에 대해 계산된다.
본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 세포 수준 및 유기체 전체에서 강력한 생존 활성을 지닌다. 방사선에 대한 초-치사량에 대한 반응으로, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 위장 및 조혈 증후군 둘 모두를 저해할 수 있는데, 이러한 증후군은 급성 방사선 노출로부터의 주요 사망 원인이다. 이러한 특성의 결과로서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 자연 방사선 사건 및 핵 사고의 효과를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 다른 방사선 보호제와 조합하여 사용될 수 있으며, 이에 의해 전리 방사선으로부터의 보호 규모를 크게 증가시킬 수 있다.
기존의 방사선 보호제(예를 들어, 자유 라디칼의 스캐빈저)와는 달리, 항-아폽토시스 제제는 1차 방사선-매개 손상을 감소시킬 수 없고, 1차 손상에 대한 활성 세포 반응과 관련된 2차 사건에 대해 작용할 수 있으며, 이에 따라, 기존 방어선을 보완한다. p53(포유류 세포에서 방사선 반응의 중요한 매개자)의 약리학적 저해제인 피피트린-알파(pifithrin-alpha)는 이러한 새로운 부류의 방사선 보호제의 예이다. 그러나, p53 저해제의 활성은 조혈계의 보호로 제한되고, 소화관(위장 증후군)에서 보호 효과를 갖지 않고, 이에 따라, 이러한 화합물의 치료 가치를 감소시킨다.
본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 인간의 방사선 저항성을 현재 이용 가능한 조치(차폐 및 기존 생물보호제의 적용)에 의해 달성 가능한 수준을 이상으로 증가시킴으로써 허용 가능한 방사선 선량의 범위를 확장하고 예를 들어, 핵 사고 또는 대규모 태양 입자 사건의 경우에, 승무원 생존 기회를 크게 증가시키기 위해 방사선 보호제로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 또한, 예를 들어, 중추신경계 및 생식기에서 저-선량 조사에 의해 야기된 대체 불가능한 세포 손실을 치료하는 데 유용하다. 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 또한, 탈모증, 골수억제, 신장 독성, 체중 감량, 통증, 메스꺼움, 구토, 설사, 변비, 빈혈, 영양실조, 탈모, 마비, 미각 변화, 식욕 상실, 가늘어지거나 취약한 모발, 구내염, 기억 상실, 출혈, 심장 독성, 간 독성, 귀 독성, 및 화학요법 후 인지 장애를 포함하는, 화학요법과 관련된 부작용을 치료하기 위해 암 화학요법 동안 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 포유동물은, 포유동물에 치료학적 유효량의 플라겔린 변이체를 포함하는 조성물에 투여하는 단계를 포함하여, 방사선에 대한 노출에 대해 치료된다. 플라겔린 변이체는 하나 이상의 방사선 보호제와 조합하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 방사선 보호제는 항산화제, 자유 라디칼 스캐빈저 및 사이토카인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 방사선 노출 효과를 치료하는 임의의 제제일 수 있다.
본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 DNA 및 다른 세포 구조의 손상에 대한 반응에서 방사선-유도 프로그래밍된 세포 사멸을 저해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 세포에서 손상을 처리하지 못할 수 있고, 돌연변이를 예방할 수 없다. 자유 라디칼 및 반응성 산소 종(ROS)은 돌연변이 및 다른 세포내 손상의 주요 원인이다. 항산화제 및 자유 라디칼 스캐빈저는 자유 라디칼에 의한 손상을 예방하는 데 효과적이다. 플라겔린 변이체와 항산화제 또는 자유 라디칼 스캐빈저의 조합은 방사선에 노출된 포유동물에 대해 덜 광범위한 손상, 더 높은 생존, 및 개선된 건강을 초래할 수 있다. 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 항산화제 및 자유 라디칼 스캐빈저는 티올, 예를 들어, 시스테인, 시스테아민, 글루타티온 및 빌리루빈; 아미포스틴(WR-2721); 비타민 A; 비타민 C; 비타민 E; 및 플라보노이드, 예를 들어, 인도 홀리 바질(Indian holy basil)(오시멈 산크툼(Ocimum sanctum)), 오리엔틴 및 비세닌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 또한 방사선 민감한 줄기세포 집단을 보충하고/하거나 보호함으로써 방사선 보호를 부여하는 다수의 사이토카인 및 성장 인자와 조합하여 투여될 수 있다. 최소 부작용을 갖는 방사선 보호는 줄기세포 인자(SCF, c-키트 리간드), Flt-3 리간드, 및 인터류킨-1 베타의 사용에 의해 달성될 수 있다. 보호는 줄기세포(모든 언급된 사이토카인)의 증식 유도 및 이의 아폽토시스(SCF)의 예방을 통해 달성될 수 있다. 이러한 치료는 조사 전에 백혈구 및 이의 전구체의 축적을 가능하게 하고, 이에 따라, 조사 후 면역계의 더 빠른 재구성을 가능하게 한다. SCF는 1.3 내지 1.35 범위의 DMF로 치명적으로 조사된 마우스를 효율적으로 구출하고, 또한, 위장 증후군에 대해 효과적이다. Flt-3 리간드는 또한, 마우스 및 토끼에서 강력한 보호를 제공한다.
본질적으로 사이토카인이 아니지만, 여러 인자들은 면역세포의 증식을 자극하고, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 5-AED(5-안드로스텐다이올)는 사이토카인의 발현을 자극하고, 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 내성을 증가시키는 스테로이드이다. 합성 화합물, 예를 들어, 암모늄 트라이-클로로(다이옥소에틸렌-O,O'-) 텔루레이트(AS-101)는 또한, 여러 사이토카인의 분비를 유도하기 위해 및 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체와 조합하여 사용될 수 있다.
성장 인자 및 사이토카인은 또한, 위장 증후군에 대한 보호를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 케라티노사이트 성장 인자(KGF)는 정 점막의 증식 및 분화를 촉진하고, 장자움에서 조사후 세포 생존을 증가시킨다. 조혈 사이토카인 및 방사선 보호제 SCF는 또한 장 줄기세포 생존 및 관련된 단기 유기체 생존을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체는 위장(GI) 및 조혈 증후군 둘 모두에 대한 보호를 제공할 수 있다. 이러한 조성물은 GI 증후군의 하나 이상의 저해제(사이토카인, 예를 들어, SCF 및 KGF를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)와 조합하여 사용될 수 있다.
플라겔린 변이체는 노출 전 약 48시간, 약 46시간, 약 44시간, 약 42시간, 약 40시간, 약 38시간, 약 36시간, 약 34시간, 약 32시간, 약 30시간, 약 28시간, 약 26시간, 약 24시간, 약 22시간, 약 20시간, 약 18시간, 약 16시간, 약 14시간, 약 12시간, 약 10시간, 약 8시간, 약 6시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 또는 약 1시간을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 방사선에 대한 노출 전 임의의 시점에 투여될 수 있다. 플라겔린 변이체는 방사선에 노출 후 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 약 26시간, 약 28시간, 약 30시간, 약 32시간, 약 34시간, 약 36시간, 약 38시간, 약 40시간, 약 42시간, 약 44시간, 약 46시간, 또는 약 48시간을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 방사선에 노출 후 임의의 시점에 투여될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 방법 및 조성물은 ARS에 같은 방사선-관련 장애의 치료 또는 예방을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료는 노출된 인간 환자 집단의 이환율 또는 사망률을 감소시키거나, ARS의 증상으로부터의 회복을 가속화시킨다. ARS는 종종 단계별 증상의 순서로 제시되며, 이는 개개 방사선 감수성, 방사선의 타입, 및 흡수된 방사선 용량에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 이론에 얽매이지 않고, 증상의 정도는 높아지며, 각 단계의 기간은 방사선 용의 증가에 따라 짧아질 것이다. ARS는 3가지 단계로 나눌 수 있다: 전구 증상 단계(N-V-D 단계로도 알려짐), 잠복기 및 명백한 질병. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 이러한 3가지 스테이지 중 어느 하나에서 인간 환자에게 투여될 수 있다(즉, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 전구 증상 단계에서 인간 환자에게 투여될 수 있거나, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 잠복기에서 인간 환자에게 투여될 수 있거나, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 명백한 질병 단계에서 인간 환자에게 투여될 수 있음).
전구 증상 단계에서, 종종 메스꺼움, 구토, 및 불쾌감이 비교적 빠르게 발병한다. 항구토제(예를 들어, 경구 예방 항구토제), 예를 들어, 덱사메타손과 함께, 또는 이의 없이 그라니세트론(KYTRIL), 온단세트론(ZOFRAN), 및 5-HT3 차단제의 사용은 고선량 방사선 노출이 발생하였거나, 가능성이 있거나, 피할 수 없는 상황에서 지시될 수 있다. 이에 따라, 다양한 실시형태에서, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 항구토제를 투여받는 인간 환자에게 투여될 수 있거나, CBLB502는 항구토제와 조합하여 인간 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 또한, 하기 구토방지 요법에도 첨가될 수 있다: 온단세트론: 초기에 0.15 ㎎/kg IV; 연속 IV 용량 옵션은 8㎎, 이후 다음 24시간 동안 1 ㎎/h로 이루어진다. 경구 용량은 필요한 경우에 8시간 마다 8㎎ 또는 그라니세트론((Granisetron)(경구 투약 형태)이며, 용량은 대개 초기에 1㎎이고, 첫 번째 투여 후 12시간 동안 반복된다. 대안적으로, 2㎎이 1회 용량으로 복용될 수 있다. IV 용량은 체중 기반으로서, 통상적으로, 체중 당 10 ㎍/㎏(4.5 ㎍/lb)이다.
잠복기에서, 인간 환자는 상대적으로 증상이 없을 수 있다. 이러한 단계의 길이는 용량에 따라 달라진다. 잠복기는 조혈 증후군의 골수 저해 이전에 가장 길고, 약 2 내지 6주에서 달라질 수 있다. 잠복기는 위장 증구훈 이전에 다소 더 짧고, 수 일 내지 수 주 지속한다. 이는 신경혈관 증후군 이전의 모든 것 중 가장 짧고, 몇 시간만 지속된다. 이러한 시간은 가변적이고, 다른 질환 또는 손상의 존재에 의해 변경될 수 있다. 명백한 질병은 주요 기관계 손상(골수, 장, 신경혈관)과 관련된 임상 증상을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 방사선 노출의 효과의 완화 또는 이로부터 세포의 보호에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 투여하는 단계를 포함하는, 방사선으로부터 인간 환자를 완화시키고/시키거나 보호하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방사선은 전리 방사선이다. 일부 실시형태에서, 전리 방사선은 위장 증후군 또는 조혈 증후군을 유발시키기에 충분하다.
일부 실시형태에서, ARS는 위장 증후군; 조혈 증후군; 신경혈관 증후군; 아폽토시스-매개 조직 손상(아폽토시스는 선택적으로 세포 스트레스로 인함); 및 전리 방사선 유도 아폽토시스 조직 손상 중 하나 이상을 포함한다.
조혈 증후군(골수 증후군으로도 알려져 있음)은 혈액 및 림프계를 재생하는 것이 불가능하게 만드는 조혈 세포 및 이의 전구체의 손실에 의해 특징된다. 이러한 증후군은 종종 혈액 세포 수의 감소, 즉, 재생 불량성 빈혈로 표시된다. 이것은 적은 양의 백혈구로 인한 감염(예를 들어, 기회 감염), 혈소판 부족으로 인한 출혈, 및 순환 중 소량의 적혈구로 인한 빈혈을 유발할 수 있다. 이러한 변화는 전신 급성 용량을 받은 후 혈액 검사로 검출될 수 있다. 폭탄 폭발로 인한 기존의 외상 및 화상은 조혈 증후군으로 인한 상처 치유 불량으로 복잡해져서 사망률이 증가한다. 사망은 감염(면역억제의 결과), 출혈 및/또는 빈형의 결과로서 일어날 수 있다. 조혈 증후군은 대개 낮은 선량의 방사선에서 만연하고, GI 증후군보다 더 지연된 사망으로 이어진다.
위장 증후군은 주로 소장에서 장 상피의 대량 세포 사멸에 의해 유발되고 이어 장벽이 붕괴되고 균혈증 및 패혈증으로 인한 사망으로 이어진다. 이러한 형태의 방사선 손상의 증상은 메스꺼움, 구토, 식욕 상실, 흡수 능력 상실, 탈피 부위의 출혈, 및 복통을 포함한다. 위장 증후군의 예시적인 전신 효과는 영양 실조, 탈수, 신부전, 빈혈, 패혈증 등을 포함한다. 치료(예를 들어, 골수 이식을 포함함)하지 않는 경우에, 일반적으로 사망한다(예를 들어, 장 박테리아로부터의 감염을 통함). 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 골수 이식과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 GI 증후군의 하나 이상의 저해제 및/또는 임의의 본 명세서에 기술된 추가 제제와 조합하여 사용될 수 있다.
신경혈관 증후군은 구토가 없는 상태에서, 수 분 내지 수 시간 내에 발생하는, 현기증, 두통, 또는 의식 수준의 감소와 같은 신경학적 증상을 나타낸다. 추가 증상은 극심한 긴장감 및 혼란; 심한 메스꺼움, 구토, 및 묽은 설사; 의식의 상실; 및 피부의 따는 듯한 감각을 포함한다. 신경혈관 증후군은 일반적으로 치명적이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 조사에 대한 노출 후 사망 위험을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방사선은 잠재적으로 치명적이고, 선택적으로, 방사선 재난의 결과로서 발생한다. 다양한 실시형태에서, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 방사선 노출 후 약 25시간 내에 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 방사선 재난의 결과로서 발생하는 잠재적으로 치명적인 조사에 대한 노출 후 사망 위험을 감소시키는 방법으로서, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 방사선 노출 후 약 25시간 내에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 고선량의 방사선, 즉, 전신 용량에 노출된 환자에게 투여된다. 다양한 실시형태에서, 고선량의 방사선은 균일하지 않을 수 있다. 다양한 실시형태에서, ARS는 고선량의 방사선의 결과이다. 다양한 실시형태에서, 고선량의 방사선은 약 2.0㏉, 또는 약 2.5㏉, 또는 약 3.0㏉, 또는 약 3.5㏉, 또는 약 4.0㏉, 또는 약 4.5㏉, 또는 약 5㏉, 또는 약 10㏉, 또는 약 15㏉, 또는 약 20㏉, 또는 약 25㏉, 또는 약 30㏉이다. 다양한 실시형태에서, 고선량의 방사선은 약 5 내지 약 30㏉, 또는 약 10 내지 25㏉, 또는 약 15 내지 20㏉이다. 일부 실시형태에서, 고선량의 방사선은 물리적 선량계 및/또는 생물학적 선량계(예를 들어, 다중 파라미터 선량 평가), 세포형성(예를 들어, 혈액 샘플에 대한 염색체 분석(비제한적인 예로서, 이동원체 분석을 포함함) 중 하나 이상에 의해 평가된다. 다양한 실시형태에서, 전신 방사선 선량은 치사 이하(<2㏉), 잠재적으로 치사(2 내지 10㏉), 및 치사 이상(>10㏉)으로 나누어질 수 있다.
재관류 손상
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 플라겔린-관련 조성물(및/또는 추가 제제)을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 조직에 대한 재관류의 효과를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 플라겔린-관련 조성물(및/또는 추가 제제)은, 예를 들어, 아미포스틴 및 비타민 E와 같은 항산화제와 조합하여 투여될 수 있다.
재관류는 허혈 또는 저산소증일 수 있는, 손상에 의해 유발될 수 있다. 허혈은, 예를 들어, 빈맥, 경색, 저혈압, 색전증, 혈전증(혈액 응고), 겸상 적혈구병, 사지에 대한 국소적 압력, 및 종양과 같은 병태로부터 발생할 수 있다. 저산소증은 저산소혈 저산소증(일산화탄소 중독; 수면 무호흡, 만성 폐색성 폐 질환, 호흡 정지; 션트(shunt)), 빈혈 저산소증(낮은 O2 함량), 저산소혈증 저산소증, 및 조직독성 저산소증으로부터 선택될 수 있다. 국부적인 압력은 지혈대로 인한 것일 수 있다.
본 명세서에 기술된 플라겔린-관련 조성물(및/또는 추가 제제)은 산소의 유입 전, 이와 함께, 후에 투여될 수 있다. 조직은, 예를 들어, GI관, 폐, 신장, 간, 심혈관계, 혈관 내피, 중추신경계, 말초 신경계, 근육, 뼈, 및 모낭일 수 있다.
재관류는 손상 후 혈액 공급이 신체 구성요소로 돌아올 때 신체를 손상시킬 수 있다. 재관류의 효과는 손상 자체보다 신체 구성요소에 더 많은 손상을 줄 수 있다. 예를 들어, 산소 자유 라디칼, 세포내 칼슘 과적재, 및 내피 기능장애를 포함하는 재관류의 여러 메커니즘 및 매개체가 존재한다. 과도한 양의 반응성 산소 종은, 이전에 손상된 신체 구성요소로 재도입할 때, 순차적으로 감소하여 산소 자유 라디칼을 형성한다. 수퍼옥사이드 음이온, 하이드록실 라디칼, 및 퍼옥시나이트라이트와 같은 강력한 산화제 라디칼은 신체 구성요소로의 재흐름의 최초 수 분 내에 생성될 수 있고, 재관류 손상의 발생에 중요한 역할을 할 수 있다. 산소 자유 라디칼은 분자 산소의 감소 이외에 소스에서 발생될 수 있다. 이러한 소스는 효소, 예를 들어, 잔틴 옥시다제, 사이토크롬 옥시다제, 및 사이클로옥시게나제, 및 카테콜아민의 산화를 포함한다.
재관류는 또한, 호중구 활성화 및 축적을 위한 강력한 자극제로서, 이는 또한, 반응성 산소 종 생산을 위한 강력한 자극제로서 역할을 한다. 상세하게는, 호중구 호흡 폭발의 주요 제품은 과산화수소, 자유 산소 라디칼 및 차아염소산염을 포함하는 강산화제이다. 호중구는 일반적으로, 전체 순환 백혈구의 50 내지 60%를 나타내는 가장 풍부한 타입의 식세포이고, 대개 손상된 신체 구성요소의 부위에 도달하는 첫번째 세포이다. 산소-유래 자유 라디칼은 다중불포화 지방산과 반응시킴으로써 손상을 형성시켜서, 신체 구성요소를 손상시키고 막-결합 효소 시스템의 기능을 손상시키는 지질 퍼옥사이드 및 하이드로퍼옥사이드를 형성한다. 자유 라디칼은 혈소판 활성화 인자 및 케모카인, 예를 들어, 호중구 활성화 인자, 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1, 및 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1의 내피 방출을 자극하며, 이는 더 많은 호중구를 끌어 들이고, 산화제 라디칼의 생성 및 재관류 손상 정도를 증폭시킨다. 반응성 산소 종은 또한, 산화질소를 켄칭시켜, 내피 손상 및 조직 세포 기능장애를 과장한다. 생산 증가 이외에, 또한, 내인성 산화제 스캐빈징 효소가 상대적으로 부족하며, 이는 자유 라디칼-매개 심장 기능장애를 더욱 과장시킨다.
재관류는 또한, 현저한 내피 세포 기능장애를 초래할 수 있다. 내피 기능장애는 재관류의 중요한 매개체인 혈소판 및 호중구 활성화에 의해 특징되는 전혈전성 표현형의 발현을 촉진한다. 호중구가 기능 장애 내피와 접촉된 직후에, 이것은 활성화되며, 일련의 잘 규정된 단계(롤링, 견고한 부착, 및 이동)에서, 이것은 선천 면역 반응의 일부로서 내피 세포 접합을 통해 조직 손상 영역으로 이동한다.
세포내 칼슘 항상성의 변화는 재관류의 발달에 중요한 역할을 한다. 재관류는 세포내 칼슘의 증가와 관련될 수 있다. 이러한 효과는 L-타입 칼슘 채널을 통해 증가된 근형질막 칼슘 진입에 관한 것일 수 있거나, 근소포체 칼슘 순환의 변화에 2차적일 수 있다. 세포내 칼슘 과적재 이외에, 칼슘에 대한 근섬유 감수성의 변화는 재관류와 연관되어 있다. 얻어진 근원섬유의 단백질분해과 함께 칼슘-의존 프로테아제(칼파인 I)의 활성화는 트로포닌의 단백질분해와 마찬가지로, 재관류 손상을 강조함을 시사한다.
손상을 입은 조직 세포의 재관류는 변경된 세포 메커니즘을 가지며, 이는 또한, 기능 회복 지연에 기여할 수 있다. 예를 들어, 손상은 락테이트의 순 생산으로 세포에서 혐기성 대사를 유도할 수 있다. 재관류 동안 락테이트 방출이 지속되는데, 이는 정상 호기성 대사의 회복이 지연됨을 시사한다. 마찬가지로, 미토콘드리아 피루베이트 탈수소효소(PDH)의 활성은 부상 후에 최대 40%까지 저해될 수 있고, 재관류 후 최대 30분까지 떨어뜨린 채로 유지될 수 있다.
재관류 동안 이러한 사건들 각각은 조직 세포에 대한 스트레스 및 프로그래밍된 세포 사멸(아폽토시스) 및 조직 세포의 괴사로 이어질 수 있다. 아폽토시스는 일반적으로, 부상당하고 유전적으로 손상된 세포로부터 조직을 "청소(clean)"하는 기능을 하며, 사이토카인은 병원체에 대한 유기체의 방어 시스템을 동원하는 역할을 한다. 그러나, 심한 부상의 조건 하에서, 두 가지 스트레스 반응 메커니즘 모두는 그 자체로 사망의 원인으로 작용할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 재관류의 효과는 신체에 대한 부상에 의해 유발될 수 있다. 부상은 허혈, 저산소증, 경색, 또는 색전증으로 인한 것일 수 있다. 부상을 치료하면 재관류가 발생할 수 있고, 신체 구성요소가 더 손상될 수 있다.
허혈은 신체 구성요소로의 혈액 공급의 절대적 또는 상대적 부족일 수 있다. 상대적 부족은 신체 구성요소에 대한 혈액 공급(산소 전달) 대 적절한 산소공급을 위해 신체 구성요소에 필요한 혈액의 미스매치일 수 있고, 작을 수 있다. 허혈은 또한, 혈액을 공급하는 혈관의 수축 또는 막힘으로 인해 신체 일부로의 혈액 흐름이 부적절할 수 있고, 신체의 모든 신체 구성요소에 영향을 미칠 수 있다. 혈액 공급이 충분하지 않으면 신체 구성요소가 저산소 상태가되거나, 산소가 전혀 공급되지 않는 경우에, 무산소 상태가 된다. 이는 괴사를 유발할 수 있다. 허혈 메커니즘은 매우 다양할 수 있다. 예를 들어, 임의의 신체 구성요소에 대한 허혈은 빈맥(비정상적으로 빠른 심장 박동), 아테롬성 동맥경화증(동맥 내강을 막는 지질-함유 플라크), 저혈압(패혈성 쇼크 시에 낮은 혈압, 심부전), 혈전 색전증(혈액 응고), 혈관의 외부 압박(종양), 색전증(순환계에 이물질, 예를 들어, 양수 색전증), 겸상 적혈구병(비정상적인 형상의 헤모글로빈), 경색, 혈류를 제한하고 신체의 사지로 혈액을 가압하는 유도된 g-힘, 동상, 얼음, 적절하지 않은 냉압 요법으로 인한 국소화된 극심한 추위, 및 지혈대와 같은 사지로 혈류를 제한하는 임의의 다른 힘으로 기인할 수 있다. 심한 열상, 절개, 절상(knifing)과 같은 천공, 둔기 외상으로 인한 파손 손상, 및 총상 또는 파편 상처로 인한 탄도 외상으로 인해 혈류를 사지로 제한하는 힘이 필요할 수 있다. 허혈은 심장 질환, 허혈성 대장염, 일시적 허혈 발작, 뇌혈관 사고, 급성 신장 손상, 파열된 동정맥 기형, 및 말초 동맥 폐색 질환의 특징일 수 있다.
저산소증은 산소의 적절한 공급의 부족일 수 있다. 저산소증은 신체 전체(일반화된 저산소증) 또는 신체의 영역(조직 저산소증)이 적절한 산소 공급이 부족한 병리학적 병태일 수 있다. 동맥 산소 수준의 변화는 신체 구성요소에 의한 산소 공급과 수요 간의 미스매칭으로 인한 것일 수 있다. 산소 공급의 완전한 결핍은 무산소증이다. 저산소증은 저산소혈 저산소증, 빈혈 저산소증, 저산소혈 저산소증, 조직독성 저산소증, 조직독성 저산소증, 및 허혈성 저산소증일 수 있다.
저산소혈 저산소증은 동맥혈에서 산소의 낮은 분압으로 인해 신체 선체에 산소가 적절하게 공급되지 않을 수 있다. 저산소혈 저산소증은 높은 고도와 같은 대기 산소의 낮은 분압, 하수도와 같은 개질된 대기의 호흡 혼합물에서 산소의 대체, 아산화질소의 기분전환용 사용에서와 같이 의도적인 산소 대체, 수면 무호흡증 또는 저호흡으로 인한 혈액의 산소 포화도 감소, 만성 폐쇄성 폐 질환 또는 호흡 정지와 같은 부적절한 폐 환기, 폐 순환의 해부학적 또는 기계적 션트 또는 심장 및 폐에서 우측에서 좌측 션트로 인한 것일 수 있다. 션트는 여전히 관류된 폐포 붕괴를 유발하거나 폐 부위에 대한 호흡을 차단할 수 있다. 션트는 혈관이 좌심실 및 기관지에 산소를 공급하는 기관지 순환으로 비워져서 폐 시스템이 호흡되지 않도록 혈액을 공급하고 가스 교환을 방지할 수 있다.
빈혈 저산소증은 전체 산소 함량이 감소되지만, 동맥 산소 압력이 정상인 것일 수 있다. 저산소혈 저산소증은 혈액이 산소를 표적 신체 구성요소로 전달하지 못하는 경우일 수 있다. 저산소혈 저산소증은 헤모글로빈이 그것에 결합된 산소를 방출하는 능력을 저해하는 일산화탄소 중독 또는 혈액에 축적되는 비정상적인 헤모글로빈인 메타헤모글로빈혈증에 의해 유발될 수 있다. 조직독성 저산소증은 산화적 인산화 효소의 비활성으로 인해 산소를 효과적으로 사용할 수 있기 때문일 수 있다.
경색은 허혈을 유발할 수 있는 한 타입의 병리학적 병태이다. 경색은 괴사 조직의 거시적 영역이 폐색으로 인한 적절한 혈액 공급의 손실로 유발할 수 있다. 경색은 혈소판으로 구성된 백색 경색이고, 심장, 비장, 및 신장과 같은 기관 조직의 괴사를 유발할 수 있다. 경색은 폐의 기관 조직에 있는 적혈구 및 섬유소 가닥으로 구성된 적색 경색일 수 있다. 경색과 관련된 질환은 심근 경색, 폐 색전증, 뇌혈관 사건(뇌졸중), 급성 신부전, 말초 동맥 폐색 질환(예는 괴저임), 항인지질 증후군, 패혈증, 거대 세포 관절염, 탈장 및 장염전증을 포함할 수 있다.
색전증은 허혈을 유발할 수 있는 한 타입의 병리학적 병태이다. 색전증은 신체의 한 부분에서 이동하고 신체의 다른 부분에서 혈관을 폐색 또는 차단을 유발시키는 물체일 수 있다. 색전증은 혈전색전증, 지방 색전증, 공기 색전증, 폐혈 색전증, 조직 색전증, 이물질 색전증, 양수 색전증일 수 있다. 혈전색전증은 혈전증 부위에서 완전히 또는 부분적으로 분리된 혈전일 수 있다. 지방 색전증은 혈액 순환으로 빠져나가는 내인성 지방 조직일 수 있다. 뼈의 골절은 파열된 혈관 및 동맥으로 지방 조직의 노출의 일례이다. 공기 색전증은 폐포의 파열, 및 혈관으로 누출되는 흡입 공기일 수 있다. 쇄골하 정맥의 천공 또는 정맥내 요법은 혈관으로 공기의 누출의 예이다. 가스 색전증은 불용성이고 혈액에 작은 버블을 형성하기 때문에, 질소 및 헬륨과 같은 가스일 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 염 및 부형제
본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성하기 위해, 무기산 또는 유기산과 반응할 수 있는 충분한 기본 작용기, 또는 무기 염기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는 카복실기를 지닐 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 산부가염은 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 산으로부터 형성된다. 이러한 염은, 예를 들어, 문헌[Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) 및 The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.), Verlag, Zurich (Switzerland) 2002]에 나열된 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하며, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
약제학적으로 허용 가능한 염은 비제한적인 예로서, 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 나이트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 아이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 펜토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 캄퍼설포네이트, 파모에이트, 페닐아세테이트, 트라이플루오로아세테이트, 아크릴레이트, 클로로벤조에이트, 다이나이트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 메틸벤조에이트, o-아세톡시벤조에이트, 나프탈렌-2-벤조에이트, 아이소부티레이트, 페닐부티레이트, α-하이드록시부티레이트, 부틴-1,4-다이카복실레이트, 헥신-1,4-다이카복실레이트, 카프레이트, 카프릴레이트, 신나메이트, 글리콜레이트, 헵타노에이트, 히푸레이트, 말레이트, 하이드록시말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 니코티네이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 프로피올레이트, 프로피오네이트, 페닐프로피오네이트, 세바케이트, 수베레이트, p-브로모벤젠설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 에틸설포네이트, 2-하이드록시에틸설포네이트, 메틸설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 나프탈렌-1,5-설포네이트, 자일렌설포네이트, 및 타르타레이트 염을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 또한, 카복실산 작용기와 같은 산성 작용기 및 염기를 갖는 본 발명의 조성물의 염을 지칭한다. 적합한 염기는 나트륨, 칼륨, 및 리튬과 같은 알칼리 금속의 하이드록사이드; 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속의 하이드록사이드; 알루미늄 및 아연과 같은 다른 금속의 하이드록사이드; 암모니아, 및 유기 아민, 예를 들어, 비치환되거나 하이드록시-치환된 모노-, 다이- 또는 트라이-알킬아민, 다이사이클로헥실아민; 트라이부틸 아민; 피리딘; N-메틸, N-에틸아민; 다이에틸아민; 트라이에틸아민; 모노-, 비스- 또는 트리스-(2-OH-저급 알킬아민), 예를 들어, 모노-, 비스- 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민, 2-하이드록시-3차-부틸아민, 또는 트리스-(하이드록시메틸)메틸아민, N,N-다이-저급 알킬-N-(하이드록실-저급 알킬)-아민, 예를 들어, N,N-다이메틸-N-(2-하이드록시에틸)아민 또는 트라이-(2-하이드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 및 아미노산, 예를 들어, 아르기닌, 라이신 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태를 갖는다.
또한, 본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 비히클을 포함하는 조성물의 성분으로서 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 선택적으로 포함할 수 있다.
약제학적 부형제는 액체, 예를 들어, 물, 및 석유, 동물성, 식물성, 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 약제학적 부형제는 예를 들어, 염수, 검 아카시아, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 유레아 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 윤활제, 및 착색제가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 대상체에 투여될 때 무균성이다. 물은 본 명세서에 기술된 임의의 제제가 정맥 투여될 때 유용한 부형제이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한, 상세하게는 주사 용액을 위한 액체 부형제로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 또한, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 나트륨 클로라이드, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 본 명세서에 기술된 임의의 제제는 원하는 경우에, 또한, 소량의 습윤제 또는 에멀션화제, 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다.
제형, 투여, 투여, 및 치료 요법
본 발명은 다양한 제형에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 포함한다. 본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 용액, 현탁액, 에멀션, 점액, 정제, 환제, 펠릿, 캡슐, 액체를 함유한 캡슐, 분말, 지속-방출 제형, 좌제, 에멀션, 에어로졸, 스프레이, 현탁액의 형태, 또는 사용하기에 적합한 임의의 다른 형태를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 캡슐 형태를 갖는다(예를 들어, 미국 특허 제5,698,155호 참조). 적합한 약제학적 부형제의 다른 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995)]에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
필요한 경우에, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 또한, 가용화제를 포함할 수 있다. 또한, 제제는 당해 분야에 공지된 적합한 비히클 또는 전달 디바이스로 전달될 수 있다. 본 명세서에 개략된 병용 요법은 단일 전달 비히클 또는 전달 디바이스에서 공동-전달될 수 있다. 투여를 위한 조성물은 선택적으로, 주사 부위에 통증을 감소시키기 위해 국소 마취제, 예를 들어, 리그노카인을 포함할 수 있다.
본 발명의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 포함하는 제형은 통상적으로, 단위 투약 형태로 제시될 수 있고, 약제 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로, 치료제를, 하나 이상의 보조 구성성분을 구성하는 담체와 결합하는 단계를 포함한다. 통상적으로, 제형은 치료제를 액체 담체, 미분된 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 결합시키고, 이후에 필요한 경우에, 제품을 원하는 제형의 투약 형태(예를 들어, 습식 또는 건식 과립화, 분말 블렌드 등, 이후에, 당해 분야에 공지된 통상적인 방법을 이용한 정제화)로 형상화함으로써 제조된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 본 명세서에 기술된 투여 모드를 위해 구성된 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다.
투여 경로는 예를 들어, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 경구, 설하, 비강내, 뇌내, 질내, 경피, 직장, 흡입, 또는 국소로, 특히, 귀, 코, 눈, 또는 피부에 대해 국소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여하는 것은 경구로 또는 비경구 주사에 의해 달성된다. 투여 모드는 의사의 재량에 맡길 수 있고, 의학적 병태의 부위에 따라 부분적으로 달라진다. 대부분의 경우에, 투여는 혈류로 본 명세서에 기술된 임의의 제제의 방출을 초래한다.
임의의 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 경구 투여될 수 있다. 이러한 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 또한, 임의의 통상적인 경로에 의해, 예를 들어, 정맥내 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 내막(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 캡슐 등에 캡슐화가 알려져 있고, 투여하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 부위에서 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
일 실시형태에서, 임의의 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 일상적인 절차에 따라, 인간에 경구 투여하도록 구성된 조성물로서 제형화된다. 경구 전달을 위한 조성물은, 예를 들어, 정제, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 과립, 분말, 에멀션, 캡슐, 시럽, 또는 엘릭시르 형태일 수 있다. 경구 투여된 조성물은 약제학적으로 맛있는 제제를 제공하게 위해, 하나 이상의 제제, 예를 들어, 감미제, 예를 들어, 프룩토스, 아스파르탐 또는 사카린; 착향제, 예를 들어, 페퍼민트, 윈터그린의 오일, 또는 체리; 착색제; 및 보존제를 포함할 수 있다. 또한, 정제 또는 환제 형태인 경우에, 조성물은 위장관에서 붕해 및 흡수를 지연시켜서 연장된 시간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공하기 위해 코팅될 수 있다. 삼투 활성 구동 임의의 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 둘러싸는 선택적 투과성 막은 또한, 경구 투여 조성물을 위해 적합하다. 이러한 후자의 플랫폼에서, 캡슐 주변의 환경으로부터의 유체는 구동 화합물에 의해 흡수되며, 이는 팽윤되어 천공을 통해 제제 또는 제제 조성물을 변위시킨다. 이러한 전달 플랫폼은 속방출 제형의 급증 프로파일(spiked profile)과는 달리 본질적으로 0차 전달 프로파일을 제공할 수 있다. 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 스테아레이트와 같은 시간-지연 물질이 또한 유용할 수 있다. 경구 조성물은 표준 부형제, 예를 들어, 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 및 마그네슘 카보네이트를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 부형제는 약제학적 등급이다. 현탁액은, 활성 화합물 이외에, 현탁화제, 예를 들어, 에톡실화된 아이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가, 트래거캔스 등, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 및 관절내 주사 및 주입)에 적합한 투여 형태는 예를 들어, 용액, 현탁액, 분산액, 에멀션 등을 포함한다. 이것은 또한, 멸균 고체 조성물(예를 들어, 동결건조 조성물) 형태로 제조될 수 있으며, 이는 사용 직전에 멸균 주사 가능한 매질에 용해되거나 현탁될 수 있다. 이는 예를 들어, 당해 분야에 공지된 현탁제 또는 분산제를 함유할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)의 투여량뿐만 아니라 투약 스케쥴은 치료받는 질환, 대상체의 일반적인 건강, 및 투여하는 의사의 재량을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 제제는 이를 필요로 하는 대상체에, 추가 치료제의 투여 전(예를 들어, 약 5분, 약 15분, 약 30분, 약 45분, 약 1시간, 약 2시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 8주, 또는 약 12주 전), 이와 동시에 또는 후속하여(예를 들어, 약 5분, 약 15분, 약 30분, 약 45분, 약 1시간, 약 2시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 8주, 또는 약 12주 후) 투여될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 임의의 제제는 약 1분 각격으로, 약 10분 간격으로, 약 30분 간격으로, 약 1시간 미만의 간격으로, 약 1시간 간격으로, 약 1시간 내지 약 2시간 간격으로, 약 2시간 내지 약 3시간 간격으로, 약 3시간 내지 약 4시간 간격으로, 약 4시간 내지 약 5시간 간격으로, 약 5시간 내지 약 6시간 간격으로, 약 6시간 내지 약 7시간 간격으로, 약 7시간 내지 약 8시간 간격으로, 약 8시간 내지 약 9시간 간격으로, 약 9시간 내지 약 10시간 간격으로, 약 10시간 내지 약 11시간 간격으로, 약 11시간 내지 약 12시간 간격으로, 약 24시간 이하의 간격으로 또는 48시간 이하의 간격으로 투여된다.
단일 투여량을 형성하기 위해 담체 물질과 혼합되는 본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)의 양은 치료받는 대상체 및 특정 투여 모드에 따라 달라질 수 있다. 시험관내 또는 생체내 검정은 최적의 투여량 범위를 식별하는 데 도움을 주기 위해 이용될 수 있다.
일반적으로, 유용한 용량은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 용량은 문헌[Physicians' Desk Reference, 66th Edition, PDR Network; 2012 Edition (December 27, 2011)]에서 결정될 수 있으며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 참조에 의해 포함된다.
본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)의 투여량은 병태의 중증도, 병태가 치료되거나 예방되는 지의 여부, 치료받는 대상체의 연령, 체중, 및 건강을 포함하는 여러 인자에 따라 달라질 수 있다. 추가적으로, 특정 대상체에 대한 약물 유전체학(약역학, 약동학, 또는 치료제의 효능 프로파일에 대한 유전자형의 효과) 정보는 사용되는 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 정확한 개별 투여량은 투여되는 제제들의 특정 조합, 투여 시간, 투여 경로, 제형의 특성, 배설률, 치료되는 특정 질환, 장애의 중증도, 및 장애의 해부학적 위치를 포함하는 다양한 인자에 따라 다소 조정될 수 있다. 투여량의 약간의 변화가 예상될 수 있다.
일반적으로, 포유동물에 경구 투여될 때, 본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)의 투여량은 약 0.001 ㎎/kg/일 내지 약 100 ㎎/kg/일, 약 0.01 ㎎/kg/일 내지 약 50 ㎎/kg/일, 또는 약 0.1 ㎎/kg/일 내지 약 10 ㎎/kg/일일 수 있다. 인간에 경구 투여될 때, 본 명세서에 기술된 임의의 제제의 투여량은 일반적으로, 하루에 약 0.001㎎ 내지 약 1000㎎, 하루에 약 1㎎ 내지 약 600㎎, 또는 하루에 약 5㎎ 내지 약 30㎎이다.
비경구 주사에 의한 본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)의 투여를 위해, 투여량은 대개 하루에 약 0.1㎎ 내지 약 250㎎, 하루에 약 1㎎ 내지 약 20㎎, 또는 하루에 약 3㎎ 내지 약 5㎎이다. 주사는 매일 최대 4회 제공될 수 있다. 일반적으로, 경구로 또는 비경구로 투여될 때, 본 명세서에 기술된 임의의 제제의 투여량은 대개 하루에 약 0.1㎎ 내지 약 1500㎎, 또는 하루에 약 0.5㎎ 내지 약 10㎎, 또는 하루에 약 0.5㎎ 내지 약 5㎎이다. 하루에 최대 약 3000㎎의 투여량이 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 전달은 소포, 특히, 리포솜에서 수행될 수 있다(문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)] 참조).
본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 당업자에게 널리 공지된 제어-방출 또는 지속-방출 수단에 의해 또는 전달 디바이스에 의해 투여될 수 있다. 예는 미국 특허 제3,845,770호; 제3,916,899호; 제3,536,809호; 제3,598,123호; 제4,008,719호; 제5,674,533호; 제5,059,595호; 제5,591,767호; 제5,120,548호; 제5,073,543호; 제5,639,476호; 제5,354,556호; 및 제5,733,556호를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 이러한 문헌 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 이러한 투약 형태는 다양한 비율로 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해 예를 들어, 하이드로프로필메틸 셀룰로스, 다른 폴리머 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투 시스템, 다층 코팅, 마이크로입자, 리포솜, 미소구체, 또는 이들의 조합을 사용한 하나 이상의 활성 성분의 제어- 또는 지속-방출을 제공하는 데 유용할 수 있다. 본 명세서에 기술된 것을 포함하는, 당업자에게 공지된 적합한 제어- 또는 지속-방출 제형은 본 명세서에 기술된 제제의 활성 성분과 함께 사용하기 위해 용이하게 선택될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 경구 투여에 적합한 단일 단위 투약 형태, 예를 들어, 비제한적으로, 제어- 또는 지속-방출을 위해 구성된 정제, 캡슐, 젤캡, 및 카플렛을 제공한다.
활성 성분의 제어- 또는 지속-방출은 pH의 변화, 온도 변화, 적절한 파장의 광에 의한 자극, 효소의 농도 또는 이용률, 물의 농도 또는 이용률, 또는 다른 생리학적 조건 또는 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 다양한 조건에 의해 자극될 수 있다.
다른 실시형태에서, 폴리머 물질이 사용될 수 있다(문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability , Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci . Rev. Macromol . Chem. 23:61; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol . 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조).
다른 실시형태에서, 제어-방출 시스템은 치료할 표적 부위 근처에 배치될 수 있고, 이에 따라, 전신 용량의 일부만을 필요로 한다(예를 들어, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 리뷰(Langer, 1990, Science 249:1527-1533)에서 논의된 다른 제어-방출 시스템이 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)의 투여는 독립적으로, 하루에 1 내지 4회, 또는 매달 1 내지 4회 또는 매년 1 내지 6회, 또는 2, 3, 4, 또는 5년마다 1회일 수 있다. 투여는 약 1일 또는 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년의 기간 동안 수행될 수 있고, 심지어 대상체의 삶 동안 수행될 수 있다. 만성 장기 투여는 여러 경우에 명시될 것이다. 투여량은 단일 용량으로서 투여되거나 다중 용량으로 분할될 수 있다. 일반적으로, 원하는 투여량은 긴 기간 동안, 대개 적어도 수 주 또는 수 개월에 걸쳐 설정된 간격으로 투여되어야 하며, 수 개월 또는 수 년 이상의 더 긴 투여 기간이 필요할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 사용하는 투여 요법은 대상체의 타입, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료되는 병태의 중증도; 투여 경로; 대상체의 신장 또는 간 기능; 개체의 약물유전학적 구성; 및 사용되는 본 발명의 특정 화합물을 포함하는 다양한 인자에 따라 선택될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 단일 일일 용량으로 투여될 수 있거나, 전체 일일 투여량은 매일 2, 3 또는 4회의 분할된 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 투여 요법 전체에 걸쳐 간헐적으로보다는 연속적으로 투여될 수 있다.
병용 요법 및 접합
일부 실시형태에서, 본 발명은 플라겔린 변이체, 및 대상체에 추가 제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 동시-투여 및/또는 공동-제형에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 임의의 조성물은 동시-제형화되고/되거나 동시-투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체는 다른 제제와 동시-투여될 때 상승적으로 작용하고, 이러한 제제가 단일요법으로서 사용될 때 통상적으로 사용되는 용량보다 낮은 용량으로 투여된다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 언급된 임의의 제제는 본 명세서에 기술된 임의의 플라겔린 변이체와 조합하여 사용될 수 있다.
면역 관문 저해제(CPI) 면역요법
본 발명은 부분적으로, 약제 조성물, 제형, 및 플라겔린 변이체 요법과 함께 면역 관문 저해제 면역 요법의 용도를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 본 발명의 돌연변이된 플라겔린 변이체(예를 들어, 491TEMX/SE-2/GP532)이다. 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 엔톨리모드이다.
암 면역요법은 암과 싸우기 위해 면역계를 자극하거나 향상하기 위해 천연 유래 또는 합성으로 생성된 성분의 활용을 포함한다. 면역 관문 저해제 면역요법은 항종양 효과를 생성시키기 위해, 면역계의 프라이밍 및 활성화로 인해 암과 싸우는 데 효과적이며, 이는 종종 고도로 특이적인 표적화를 포함한다. 암 면역요법의 가능성과 함께, 외래 항원의 식별과 박멸 사이의 면역계의 복합체 상쇄 및 제어되지 않은 면역 반응을 억제하는 데 필요한 공정을 유지하는 것이 필요하다. 중요한 임상적 이점에도 불구하고, 관문 저해는 독특한 스펙트럼의 부작용, 또는 피부과, GI, 간, 내분비, 및 다른 덜 흔한 염증 사건을 포함하지만 이로 제한되지 않는 면역-관련 부작용과 관련이 있다. 본 발명의 다양한 실시형태에서, CPI-매개 GI 부작용은 설사 및/또는 대장염이다. 일반적으로, 이러한 중간 정도 또는 중증의 면역 관문 저해제 면역요법-매개 부작용의 치료는 관문 저해제 면역요법의 중단 및 코르티코스테로이드 면역억제의 사용을 필요로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 약제 조성물, 제형, 및 플라겔린 변이체 치료법과 함께 면역 관문 저해제 면역요법의 사용을 고려한다. 이러한 CPI는 예정 세포사 단백질-1(PD-1), 예정사-리간드 1(PD-L1), 예정사-리간드 2(PD-L2), 유도성 T-세포 공동 자극인자(ICOS), 유도성 T-세포 공동 자극인자 리간드(ICOSL), 및 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4) 중 하나 이상을 조절하는 하나 이상의 제제를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 예정 세포사 단백질-1(PD-1), 예정사-리간드 1(PD-L1), 예정사-리간드 2(PD-L2), 유도성 T-세포 공동 자극인자(ICOS), 유도성 T-세포 공동 자극인자 리간드(ICOSL), 및 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4) 중 하나 이상을 조절하는 제제로부터 선택된 면역 관문 저해제 면역요법으로 치료받는다.
다른 양태에서, 본 발명은 PD-1, PD-L1, PD-L2, ICOS, ICOSL 및 CTLA-4 중 하나 이상을 조절하는 제제로부터 선택된 IAP 및 CPI의 조합물을 투여함으로써 CPI-매개 GI 부작용을 예방하는 방법을 고려한다.
일부 실시형태에서, PD-1, PD-L1, PD-L2, ICOS, ICOSL 및 CTLA-4 중 하나 이상을 조절하는 제제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, ICOS, ICOSL 및 CTLA-4 중 하나 이상에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷이다. 다양한 실시형태에서, PD-1, PD-L1, PD-L2, ICOS, ICOSL 및 CTLA-4 중 하나 이상에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷은 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 단쇄 Fv, 이중체, 선형 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 및 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 융합 단백질 중 하나 이상으로부터 선택된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명은 PD-1을 조절하는 제제인 CPI를 제공하며, 여기서, 제제는 PD-1에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷이다. 일부 실시형태에서, PD-1에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷은 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 피딜리주맙으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 PD-L1을 조절하는 제제인 CPI를 제공하며, 여기서, 제제는 PD-L1에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷이다. 일부 실시형태에서, PD-L1에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷은 BMS-936559, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 두르발루맙으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 PD-L2를 조절하는 제제인 CPI를 제공하며, 여기서, 제제는 PD-L2에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 ICOS를 조절하는 제제인 CPI를 제공하며, 여기서, 제제는 ICOS에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷이다. 일부 실시형태에서, ICOS에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷은 JTX-2011을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 ICOSL을 조절하는 제제인 CPI를 제공하며, 여기서, 제제는 ICOSL에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 CTLA-4를 조절하는 제제인 CPI를 제공하며, 여기서, 제제는 CTLA-4에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷이다. 일부 실시형태에서, CTLA-4에 대해 특이적인 항체 또는 항체 포맷은 트레멜리무맙 또는 이필리무맙으로부터 선택된다.
화학치료제
일부 실시형태에서, 본 발명은 추가 제제로서의 화학치료제에 관한 것이다.
화학치료제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 CYTOXAN 사이클로포스파마이드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포라미드, 트라이에틸렌티오포스포라미드 및 트라이메틸올로메탈린을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸멜라민; 아세토게닌(예를 들어, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함함); 브리오스타틴; 칼리 스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 크립토피신(예를 들어, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀로카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB 1-TM1을 포함함); 엘레우테로빈; 판크라스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 나이트로소유레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히, 칼리케아미신 모두 감마 및 칼리케아미신 모두 오메가(예를 들어, 문헌[Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 디네마이신 A를 포함하는 디네마이신; 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라, 네오카지노스타틴 크로모포어 및 관련된 크로모단백질 엔디인 항생제 크로모포어), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모미시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시 독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트릭세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어, 미노글루테티마이드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글락톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 아민의 def; 데메클신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어, 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2"-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센(예를 들어, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, 뉴저지주 프린스턴 소재), ABRAXANE 파클리탁셀의 크레모포어-부재, 알부민-조작된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, 일리노이 샤움베르그 소재) 및 TAXOTERE 독세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니 소재); 클로람부실; GEMZAR 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백굼; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE. 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(Camptosar, CPT-11)(5-FU 및 류코보린과 함께 이리노테칸의 치료 요법을 포함함); 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린(LV); 옥살리플라틴 치료 요법(FOLFOX)을 포함하는 옥살리플라틴; 라파티닙(Tykerb); PKC-α, Raf, H-Ras, EGFR의 저해제(예를 들어, 에를로티닙(Tarceva)) 및 세포 증식을 감소시키는 VEGF-A 및 상기 기술된 것 중 어느 하나의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한, 치료 방법은 방사선의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 치료 방법은 광역학 요법의 사용을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 즉, 공유 결합이 조성물의 활성을 방해하지 않도록 조성물에 대한 임의의 타입의 분자의 공유 결합에 의해 개질된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 그러나, 비제한적으로, 유도체는 특히, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 페그화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 개질된 조성물을 포함한다. 임의의 다수의 화학적 개질은 특정 화학적 절단, 아세틸화, 폼일화, 투리카마아신의 대사 합성 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 비-전통적인 아미노산을 함유할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 예시적인 실시형태에서, 독소, 화학치료제, 방사성 동위원소, 및 아폽토시스 또는 세포 사멸을 야기시키는 제제를 포함하는, 세포독성제를 추가로 포함한다. 이러한 제제는 본 명세서에 기술된 조성물에 접합될 수 있다.
이에 따라, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 이펙터 모이어틸, 예를 들어, 화학적 링커, 검출 가능한 모이어티, 예를 들어, 형광 염료, 효소, 기질, 생물발광 물질, 방사선 물질, 및 화학발광 모이어티, 또는 작용성 모이어티, 예를 들어, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 세포독소, 세포독성제, 및 방사선 물질을 첨가하기 위해 번역후 개질될 수 있다.
예시적인 세포독성제는 메토트렉세이트, 아미노프테린, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진; 알킬화제, 예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU), 미토마이신 C, 로무스틴(CCNU), 1-메틸나이트로소유레아, 사이클로토스파마이드, 메클로레타민, 부설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 시스-다이클로로다이아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴 및 카보플라틴(파라플라틴); 안트라사이클린, 예를 들어, 다우노루비신(종래에 다우노마이신), 독소루비신(아드리아마이신), 데토루비신, 카미노마이신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론 및 비산트렌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 항생제는 닥티노마이신(악티노마이신 D), 블레오마이신, 칼리케아미신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC); 및 유사분열 방지제, 예를 들어, 빈카 알칼로이드, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함한다. 다른 세포독성제는 파클리탁셀(탁솔), 리신(ricin), 슈도모나스 외독소, 겜시타빈, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 에토포사이드, 테노포사이드, 콜키신, 다이하이드록시 안트라신 다이온, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 퓨로마이신, 프로카바진, 하이드록시유레아, 아스파라기나제, 코르티코스테로이드, 미토탄(O,P'-(DDD)), 인터페론, 및 이러한 세포독성제들의 혼합물을 포함한다.
추가 세포독성제는 화학치료제, 예를 들어, 카보플라틴, 시스플라틴, 파클리탁셀, 겜시타빈, 칼리케아미신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 블레오마이신, VEGF 길항제, EGFR 길항제, 플라틴, 탁솔, 이리노테칸, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 류코보린, 스테로이드, 사이클로포스파마이드, 멜팔란, 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 및 비노렐빈), 무스틴, 티로신 키나제 저해제, 방사선 요법, 성 호르몬 길항제, 선택적 안드로겐 수용체 조절제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, PDGF 길항제, TNF 길항제, IL-β1 길항제, 인터류킨(예를 들어, IL-12 또는 IL-2), IL-12R 길항제, 독소 접합된 단일클론 항체, 종양 항원 특이적 단일클론 항체, 에르비툭스, 아바스틴, 페르투주맙, 항-CD20 항체, 리툭산, 오크렐리주맙, 오파투무맙, DXL625, HERCEPTIN®, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 리신, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 독소와 같은 식물 및 박테리아로부터의 독성 효소는 세포-타입-특이적-사멸 시야를 생성하기 위해 치료제(예를 들어, 항체)에 접합될 수 있다(Youle, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
다른 세포독성제는 미국 특허 제6,653,104호(Goldenberg)에 기술된 바와 같은 세포독성 리보뉴클레아제를 포함한다. 본 발명의 실시형태는 또한, 알파 또는 베타 입자를 방출하는 방사성 핵종이 복합체-형성제의 사용과 함께 또는 이의 없이, 항체, 또는 이의 결합 단편에 안정하게 결합되는 방사성 면역접합체에 관한 것이다. 이러한 방사성 핵종은 베타-방출제, 예를 들어, 인-32, 스칸듐-47, 구리-67, 갈륨-67, 이트륨-88, 이트륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 사마륨-153, 루테튬-177, 레늄-186 또는 레늄-188, 및 알파-방출제, 예를 들어, 아스타틴-211, 납-212, 비스무트-212, 비스무트-213 또는 악티늄-225을 포함한다.
예시적은 검출 가능한 모이어티는 호스래디스 퍼옥시다제, 아세틸콜린에스테라제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다제 및 루스페라제를 추가로 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가 예시적인 형광 물질은 로다민, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 움벨리페론, 다이클로로트라이아지닐아민, 피코에리트린 및 단실 클로라이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가 예시적인 화학발광 모이어티는 루미놀을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가 예시적인 생물발광 물질은 루시페린 및 에쿼린을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가 예시적인 방사선 물질은 요오드-125, 탄소-14, 황-35, 트리튬 및 인-32를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다양한 실시형태에서, 본 발명의 추가 제제는 혈액 산물, 집락 자극 인자, 사이토카인 및/또는 성장 인자, 항생제, 희석제 및/또는 차단제, 동원 또는 킬레이트제, 줄기세포 이식, 항산화제 또는 자유 라디칼, 및 방사선 보호제 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, 혈액 산물은 조혈 성장 인자, 예를 들어, 필그라스팀(예를 들어, NEUPOGEN), 선택적으로 페그화될 수 있는 과립구 집락-자극 인자(G-CSF)(예를 들어, NEULASTA); 사르그라모스팀(LEUKINE); 및 과립구-대식 세포 집락-자극 인자(GM-CSF) 및 KSF 중 하나 이상이다.
일부 실시형태에서, 추가 제제는 방사선에 민감한 줄기세포 집단을 보충하고/하거나 보호함으로써 방사선 보호를 부여할 수 있는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 성장 인자이다. 최소 부작용을 갖는 방사선 보호는 줄기세포 인자(SCF, c-키트 리간드), Flt-3 리간드, 및 인터류킨-1 베터의 사용에 의해 달성될 수 있다. 보호는 (예를 들어, 모든 언급된 사이토카인을 통한) 줄기세포의 증식의 유도 및 (예를 들어, SCF를 통한) 이의 아폽토시스의 예방을 통해 달성될 수 있다. 치료는 조사 전에 백혈구 및 이의 전구체의 축적을 가능하게 하고, 이에 따라, 조사 후 면역계의 더 빠른 재구성을 가능하게 한다. SCF는 1.3 내지 1.35 범위의 용량 변형 인자(DMF)로 치명적으로 조사된 마우스를 효율적으로 구출하고, 또한, 위장 증후군에 대해 효과적이다. Flt-3 리간드는 또한, 마우스 및 토끼에서 강한 보호를 제공한다.
특성상 사이토카인이 아니지만, 여러 인자들은 면역세포의 증식을 자극하고, 본 명세서에 기술된 용량 및 요법에서 플라겔린 변이체와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 5-AED(5-안드로스텐다이올)는 사이토카인의 발현을 자극시키고 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 내성을 증가시키는 스테로이드이다. 합성 화합물, 예를 들어, 암모늄 트라이-클로로(다이옥소에틸렌-O,O'-) 텔루레이트(AS-101)는 또한, 여러 사이토카인의 분비를 유도하기 위해 및 플라겔린 변이체와 조합하여 사용될 수 있다. 성장 인자 및 사이토카인은 또한, 위장 증후군에 대한 보호를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 케라티노사이트 성장 인자(KGF)는 장 점막의 증식 및 분화를 촉진하고, 창자움에서 조사후 세포 생존을 증가시킨다. 조혈 사이토카인 및 방사선 보호제 SCF는 또한, 내부 줄기세포 생존 및 관련된 단기 유기체 생존을 증가시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, 플라겔린 변이체는 사이토카인의 요법에 첨가될 수 있다(예를 들어, FILGRASTIM(G-CSF)의 경우 2.5 내지 5 ㎍/㎏/d QD s.c.(100 내지 200 ㎍/m2/d); SARGRAMOSTIM(GM-CSF)의 경우 5 내지 10 ㎍/㎏/d QD s.c.(200 내지 400 ㎍/m2/d); 및/또는 PEGFILGRASTIM(pegG-CSF)의 경우 6㎎ 1회 s.c.).
일부 실시형태에서, 항생제는 항박테리아제(항-그램 양성 및 항-그램 음성 제제), 및/또는 항진균제, 및/또는 항바이러스제 중 하나 이상이다. 비제한적인 예로서, 일부 실시형태에서, 항생제는 퀴놀론, 예를 들어, 시프로플록사신, 레보플록사신, 슈도모날 커버리지(pseudomonal coverage)의 3세대 또는 4세대 세팔로스포린, 예를 들어, 세페핌, 세프타지딤, 또는 아미노글리코사이드, 예를 들어, 겐타마이신, 아미카신, 페니실린 또는 아목시실린, 아시클로버, 바노마이신일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 항생제는 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 표적으로 한다.
일부 실시형태에서, 추가 제제는 희석제 및/또는 차단제이다. 예를 들어, 안정한 아이오다이드 화합물이 사용될 수 있다(예를 들어, 액체(ThyroShield) 및 정제(Iosat) KI(NUKEPILLS), Rad Block, I.A.A.A.M., No-Rad, Life Extension(LEF), KI4U, NukeProtect, ProKI)). 일일 130㎎ 용량의 경구 요오드화칼륨(KI)은 플라겔린 변이체와 함께 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 추가 제제는 동원제 또는 킬레이트제이다. 예시적인 동원제는 프로필티오우라실 및 메티마졸을 포함하며, 이는 방사선 화합물의 갑상선 보유를 감소시킬 수 있다. 추가 플라겔린 변이체는 배설을 촉진하기 위해 인간 환자에게 경구 체액을 증가시키는 것과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 킬레이트제는 수용성이고 소변으로 배출된다. 예시적인 킬레이트제는 DTPA 및 EDTA를 포함한다. 다이메르카프롤은 수은, 납, 비소, 금, 비스무트, 크롬, 및 니켈과 안정한 킬레이트를 형성하고, 이에 따라, 이러한 원소들의 방사성 동위원소로의 내부 오염의 처리를 위해 고려될 수 있다. 페니실라민은 구리, 철, 수은, 납, 금, 및 가능하게, 다른 중금속을 킬레이팅한다.
일부 실시형태에서, 추가 제제는 줄기세포 이식체(예를 들어, 골수 이식체, PBSCT, MSCT)이다. 일부 실시형태에서, 줄기세포 이식체는 CLT-008(Cellerant)의 Remestemcel-L(Osiris)이다.
일부 실시형태에서, 추가 제제에는 항산화제 또는 자유 라디칼이 있다. 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 항산화제 및 자유 라디칼 스캐빈저는 티올, 예를 들어, 시스테인, 시스테아민, 글루타티온 및 빌리루빈; 아미포스틴(WR-2721); 비타민 A; 비타민 C; 비타민 E; 및 플라보노이드, 예를 들어, 인도 홀리 바질(오시멈 산크툼), 오리엔틴 및 비세닌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 추가 제제는 방사선 보호제, 예를 들어, 항산화제(예를 들어, 아미포스틴 및 비타민 E, 감마 토코트라이에놀(비타민-E 모이어티), 및 게니스테인(대두 부산물), 사이토카인(예를 들어, 줄기세포 인자), 성장 인자(예를 들어, 케라티노사이트 성장 인자), 스테로이드(예를 들어, 5-안드로스텐다이올), 암모늄 트라이클로로(다이옥소에틸렌-O,O')텔루레이트, 갑상선 보호제(예를 들어, 요오드화칼륨(KI) 또는 요오드산칼륨(KIO3)(예를 들어, 액체(ThyroShield) 및 정제(Iosat) KI(NUKEPILLS), Rad Block, I.A.A.A.M., No-Rad, Life Extension (LEF), KI4U, NukeProtect, ProKI)), 항-메스꺼움 제제, 항-설사제, 항구토제((예를 들어, 경구 예방 항구토제), 예를 들어, 그라니세트론(KYTRIL), 온단세트론(ZOFRAN), 및 5-HT3 차단제(덱사메타손을 갖거나 갖지 않음), 진통제, 항불안제, 진정제, 사이토카인 요법, 및 항생제일 수 있다.
추가 제제로서 사용될 수 있는 위 세척 및 구토제는 독성 물질을 섭취한 후 후 신속하고 완전히 위를 비우는 데 사용될 수 있다. 추가 제제로서도 사용될 수 있는, 정화제, 완하제, 및 관장제는 결장에서 방사선 물질의 체류 시간을 감소시킬 수 있다. 추가의 추가 제제는 소화되거나 흡입된 방사성 핵종, 페로시아나이드(프러시안 블루) 및 알기네이트의 위장 흡수를 제한할 수 있는 이온 교환 수지를 포함하며, 이는 세슘-137의 대변 배설을 가속시키기 위해 인간에서 사용되는 것이다.
또 다른 실시형태에서, 추가 제제는 방사선-관련 장애를 치료하기 위해 사용되는 제제, 예를 들어, 5-AED(Humanetics), Ex-RAD(Onconova), 베클로메타손 다이프로피오네이트(Soligenix), 해독된 내독소, EA-230(Exponential Biotherapies), ON-01210.Na(Onconova), 소트롬보모둘린 알파(PAION), 레메스템셀-L(Osiris), BIO-100, BIO-200, BIO-300, BIO-400, BIO-500(Humanetics), CLT-008(Cellerant), EDL-2000(RxBio), Homspera(ImmuneRegen), MnDTEIP(Aeolus Pharmaceuticals), RLIP-76(Terapio), 및 RX-100 및 RX 101(RxBio)일 수 있다.
또한, 일부 실시형태에서, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 차폐; 방사선 노출 시간의 감소; 및 신체 노출을 감소시키기 위한 제제의 사용(예를 들어, 장갑, 안면 마스크, 후드, 보호복(예를 들어, 오염방지 슈트, 예를 들어, TYVEK 항-C SUITS 또는 MOPP-4)의 사용)과 조합하여 사용될 수 있다.
치료제를 인코딩하는 바이러스 벡터 및 이를 발현시키는 세포
다양한 실시형태에서, 본 발명의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 바이러스성 벡터 및 형질전환된 세포에 의해 발현된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바이러스성 벡터 및 형질전환된 인간 세포는 본 조성물을 발현시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 치료제를 발현시키는 바이러스성 벡터 또는 인간 세포는 종양에 대해 근위에서 제제를 발현시킬 수 있다. 세포는 생체내에서 변형될 수 있거나, 대안적으로, 생체외에서 변형된 세포는 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포는 종양 세포이다. 생체외 형질전환을 위해, 이러한 종양 세포는 당해 분야에 공지된 바와 같이 세포가 복제하는 능력을 제거하기 위해 조사될 수 있고, 투여 후 치료제의 일시적 발현을 유지할 수 있다. 생체내 형질전환을 위해, 비-통합 발현 벡터가 바람직할 수 있다.
특정 실시형태에서, 종양 세포는 자가 또는 내인성이다. 전자의 경우에, 종양 세포는 환자에게 취하고, 치료제를 인코딩하는 작제물로 트랜스펙션되거나 형질도입되고, 예를 들어, 조사 후에, 환자에게 재도입된다. 후자의 경우에, 종양 세포는 본 명세서에 기술된 적절한 작제물의 국소 투여에 의해 생체내에서 형질전환된다.
대안적인 실시형태에서, 변형된 종양 세포는 동종 이계이다. 이에 따라, 동종 이계 종양 세포는 세포주에서 유지될 수 있다. 이러한 경우에, 종양 세포는 세포주로부터 선택되고, 조사되고, 환자에게 도입될 수 있다.
플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 생성할 수 있는 변형된 인간 세포는 세포를 치료제를 인코딩하는 발현 벡터로 트랜스펙션시키거나 형질도입함으로써 제조될 수 있다. 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)의 발현을 위한 발현 벡터, 또는 치료제의 조합은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 환자에 하나 이상의 핵산 작제물 형태로 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 작제물은 레트로바이러스성 벡터를 포함한다. 레트로바이러스성 벡터는 세포 게놈에 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 인코딩하는 DNA를 영구적으로 통합할 수 있다. 이에 따라, 자가 또는 동종 이계 세포의 세포외 조작의 경우에, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 구성적으로 생성하는 안정한 세포주가 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 환자에 투여 전에 조사된다. 조사된 세포는 제한된 시간 동안 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 생성한다.
일 실시형태에서, 발현 작제물은 SFV 벡터를 포함하며, 이는 포유류 세포에서 높은 수준의 일시적 발현을 보여준다. SFV 벡터는 예를 들어, 문헌[Lundstrom, Expert Opin. Biol. Ther. 3:771-777 (2003)]에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 이에 따라, 환자에서 내인성 세포의 생체내 조작의 경우에, 높은 수준의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)의 일시적인 발현이 달성될 수 있다.
생체내에서 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는 시스템은 당해 분야에 공지되어 있다. 일례로서, 시스템은 문헌[Fang et al., Nature Biotech. 23(5): 584-590 (2005)] 및 미국 특허 공개 제2005/0003506호에 개시된 2A 매개 항체 발현 시스템을 사용할 수 있으며, 이러한 문헌의 개시는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 명확하게 포함된다. 당해 분야에 공지된 다른 시스템이 고려되고, 또한, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 생체내에서 생성하도록 구성될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포를 발현시키는 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제) 또는 본 명세서에 개시된 본 발명의 제제의 투여는 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 인터류킨 3(IL-3), 인터류킨 12(IL-12), 인터페론 등과 같은 항원-제시 세포를 자극시키는 사이토카인, 또는 이러한 사이토카인을 발현시킬 수 있는 세포 백신의 투여와 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포를 발현하는 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 이러한 사이토카인을 발현하도록 더 변형된다. IL-1, IL-2, B7, 항-CD3 및 항-CD28과 같은 T 세포 증식 및 분비를 향상시키는 것으로 알려진 추가 단백질 및/또는 사이토카인은 면역 반응을 증가시키고/시키거나 보조-자극 경로를 자극하고/하거나 이펙터 T 세포의 활성화/증식을 유도하기 위해 본 발명의 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)와 함께 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
벡터 및 형질전환 방법
플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 인코딩하는 발현 벡터는 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있다. 바이러스성 벡터는 생체내에서 사용하는 데 바람직하다. 본 발명의 발현 벡터는 포유류 세포에서 기능하는, 발현 제어 영역, 또는 이의 보체에 작동 가능하게 연결된, 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 보체를 포함한다. 발현 제어 영역은 차단제 및/또는 자극제가 발현 벡터로 형질전환된 인간 세포에서 생성되도록 핵산을 인코딩하는 작동 가능하게 연결된 차단제 및/또는 자극제의 발현을 유도할 수 있다.
발현 제어 영역은 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현에 영향을 미치는, 조절 폴리뉴클레오타이드(본 명세서에서 때때로 구성요소로 지칭됨), 예를 들어, 프로모터 및 인핸서이다.
본 발명의 발현 벡터의 발현 제어 영역은 인간 세포에서 작동 가능하게 연결된 인코딩 핵산을 발현시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 종양 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 비-종양 세포이다.
일 실시형태에서, 발현 제어 영역은 작동 가능하게 연결된 핵산에 대한 조절 가능한 발현을 부여한다. 신호(때때로 자극으로 지칭됨)는 이러한 발현 제어 영역에 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 증가하거나 감소할 수 있다. 신호에 대한 반응의 발현을 증가시키는 이러한 발현 제어 영역은 종종 유도성으로 지칭된다. 신호에 대한 반응으로 발현을 감소시키는 이러한 발현 제어 영역은 종종 저해 가능한 것으로 지칭된다. 통상적으로, 이러한 구성요소에 의해 부여된 증가 또는 감소의 양은 존재하는 신호의 양에 비례하며, 신호의 양이 클수록, 발현의 증가 또는 감소가 커진다.
일 실시형태에서, 본 발명은 신호에 대한 반응으로 일시적으로 높은 수준의 발현을 달성할 수 있는 유도성 프로모터의 사용을 고려한다. 종양 세포 근위에 있을 때, 이러한 발현 제어 서열을 포함하는 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)에 대한 발현 벡터로 형질전환된 세포는 형질전환된 세포를 적절한 신호에 노출시킴으로써 높은 수준의 제제를 일시적으로 생성시키기 위해 유도된다. 예시적인 유도성 발현 제어 영역은 소분자 화학 화합물과 같은 신호로 자극되는 유도성 프로모터를 포함하는 것을 포함한다. 특정 예는 예를 들어, 미국 특허 제5,989,910호, 제5,935,934호, 제6,015,709호, 및 제6,004,941호에서 확인될 수 있으며, 이러한 문헌 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
발현 제어 영역은 전장 프로모터 서열, 예를 들어, 고유 프로모터 및 인핸서 요소뿐만 아니라, 전장 또는 비-변이체 기능 전부 또는 일부를 보유하는 하위서열 또는 폴리뉴클레오타이드 변이체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "기능적" 및 이의 문법적 변형은, 핵산 서열, 하위서열 또는 단편과 관련하여 사용될 때, 서열이 고유 핵산 서열(예를 들어, 비-변이체 또는 비변형된 서열)의 하나 이상의 기능을 가짐을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "작동 가능한 연결"은 구성요소가 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 기술된 구성요소의 물리적 병치를 지칭한다. 핵산과 작동 가능한 연결에서 발현 제어 요소의 예에서, 관계는 제어 요소가 핵산의 발현을 조절하게 한다. 통상적으로, 전사를 조절하는 발현 제어 영역은 전사된 핵산의 5' 단부(즉, "업스트림") 부근에 병치된다. 발현 제어 영역은 또한, 전사된 서열의 3' 단부(즉, "다운스트림")에 또는 전사체 내에(예를 들어, 인트론에) 위치될 수 있다. 발현 제어 요소는 전사된 서열로부터 이격된 소정 거리(예를 들어, 핵산으로부터 100 내지 500, 500 내지 1000, 2000 내지 5000, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)에 위치될 수 있다. 발현 제어 요소의 특정 예는 프로모터로서, 이는 대개 전사된 서열의 5'에 위치된다. 발현 제어 요소의 다른 예는 인핸서이며, 이는 전사된 서열의 5' 또는 3'에 또는 전사된 서열 내에 위치될 수 있다.
인간 세포에서 기능성인 발현 시스템은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 바이러스 시스템을 포함한다. 일반적으로, 인간 세포에서 기능성인 프로모터는 포유류 RNA 폴리머라제를 결합하고 mRNA에 B7-H4 리간드 코딩 서열의 다운스트림(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 대개 코딩 서열의 5' 단부에 대해 근위에 배치된 전사 개시 영역, 및 통상적으로 전사 개시 부위의 업스트림의 25 내지 30개 염기쌍이 위치된 TATA 박스를 가질 것이다. TATA 박스는 정확한 부위에서 RNA 합성을 개시하기 위해 RNA 폴리머라제 II를 유도하는 것으로 사료된다. 프로모터는 또한, 통상적으로, TATA 박스의 업스트림의 100 내지 200개의 염기쌍 내에 통상적으로 위치된, 업스트림 프로모터 구성요소(인핸서 구성요소)를 함유할 것이다. 업스트림 프로모터 구성요소는 전사가 개시되고 어느 하나의 배향에서 작용할 수 있는 속도를 결정한다. 프로모터로서 특히 사용하는 것은 포유류 바이러스 유전자로부터의 프로모터인데, 왜냐하면, 바이러스 유전자가 종종 고도로 발현되고 넓은 숙주 범위를 갖기 때문이다. 예는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 헤르페스 단순 바이러스 프로모터, 및 CMV 프로모터를 포함한다.
통상적으로, 포유류 동물에 의해 인지된 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열은 번역 중지 코돈에 대해 3' 위치된 조절 영역이고, 이에 따라, 프로모터 구성요소와 함께, 코딩 서열 측면에 위치되어 있다. 성숙한 mRNA의 3' 말단은 부위-특이적 번역후 절단 및 폴리아데닐화에 의해 형성된다. 전사 종결인자 및 폴리아데닐화 신호의 예는 SV40으로부터 유래된 것을 포함한다. 인트론은 또한, 발현 작제물에 포함될 수 있다.
생존 가능한 세포에 핵산을 도입하기 위해 사용되는 다양한 기술이 존재한다. 시험관내에서 포유류 세포에 핵산의 전달에 적합한 기술은 리포솜의 사용, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, 폴리머-기반 시스템, DEAE-덱스트란, 바이러스 형질도입, 칼슘 포스페이트 침전 방법 등을 포함한다. 생체내 유전자 전달을 위해, 리포솜; 천연 폴리머-기반 전달 비히클, 예를 들어, 키토산 및 젤라틴을 포함하는 다수의 기술 및 시약이 또한 사용될 수 있으며, 바이러스성 벡터가 또한, 생체내 형질도입을 위해 바람직하다. 일부 상황에서, 표적화제, 예를 들어, 종양 세포 표면 막 단백질에 대해 특이적인 항체 또는 리간드를 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용되는 경우에, 엔도시토시스와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은, 예를 들어, 특정 세포 타입에 대해 향성을 갖는 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 사이클링에서 내재화되는 단백질에 대한 항체, 세포내 국소화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 표적으로 하고/하거나 이의 흡수를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 수용체-매개 엔도시토시스의 기술은, 예를 들어, 문헌[Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)]에 기술되어 있다.
적절한 경우에, 유전자 전달제, 예를 들어, 통합 서열이 또한 사용될 수 있다. 여러 통합 서열은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Nunes-Duby et al., Nucleic Acids Res. 26:391-406, 1998; Sadwoski, J. Bacteriol., 165:341-357, 1986; Bestor, Cell, 122(3):322-325, 2005; Plasterk et al., TIG 15:326-332, 1999; Kootstra et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003] 참조). 이것은 리콤비나제 및 트랜스포사제를 포함한다. 예는 Cre(Sternberg and Hamilton, J. Mol. Biol., 150:467-486, 1981), 람다(Nash, Nature, 247, 543-545, 1974), FIp(Broach, et al., Cell, 29:227-234, 1982), R(Matsuzaki, et al., J. Bacteriology, 172:610-618, 1990), cpC31(예를 들어, 문헌[Groth et al., J. Mol. Biol. 335:667-678, 2004]), 슬리핑 뷰티(sleeping beauty), 마리너 패밀리(mariner family)의 트랜스포사제(Plasterk et al., 상기 참조), 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 LTR 서열 및 AAV의 ITR 서열과 같은 바이러스 통합을 제공하는 구성요소를 갖는 AAV, 레트로바이러스, 및 안티바이러스와 같은 바이러스를 통합하기 위한 구성요소(Kootstra et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003)를 포함한다.
바이러스성 벡터
일 양태에서, 본 발명은 바이러스성 벡터인 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)의 발현을 위한 발현 벡터를 제공한다. 유전자 요법을 위해 유용한 다수의 바이러스성 벡터는 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Lundstrom, Trends Biotechnol., 21: 1 17, 122, 2003] 참조).
예시적인 바이러스성 벡터는 안티바이러스(LV), 레트로바이러스(RV), 아데노바이러스(AV), 아데노-관련 바이러스(AAV), 및 알파바이러스로부터 선택된 것을 포함하며, 다른 바이러스성 벡터가 또한 사용될 수 있다. 생체내 사용을 위해, 숙주 게놈에 통합하지 않는 바이러스성 벡터, 예를 들어, α 바이러스 및 아데노바이러스가 바람직하며, α 바이러스가 특히 바람직하다. α 바이러스의 예시적인 타입은 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis; VEE) 바이러스, 및 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus; SFV)를 포함하며, SFV가 특히 바람직하다. 시험관내 사용을 위해, 숙주 게놈에 통합하는 바이러스성 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스, AAV, 및 알파바이러스가 바람직하다.
일 실시형태에서, 바이러스성 벡터는 형질도입된 인간 세포에서 일시적인 고수준 발현을 제공한다.
일 실시형태에서, 바이러스성 벡터는 형질도입된 인간 세포의 게놈에 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제) 인코딩 핵산의 통합을 제공하지 않는다.
다른 실시형태에서, 바이러스성 벡터는 형질도입된 인간 세포의 게놈에 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제) 인코딩 핵산의 통합을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 생체내 고체 종양을 본 발명의 바이러스성 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는, 생체내에서 인간 세포를 형질도입하는 방법을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 생체외에서 인간 세포를 본 발명의 바이러스성 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는, 생체외에서 인간 세포를 형질도입하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 인간 세포는 종양 세포이다. 일 실시형태에서, 인간 세포는 동종 이계이다. 일 실시형태에서, 종양 세포는 환자로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 인간 세포는 비-종양 세포, 예를 들어, 항원 제시 세포(APC), 또는 T 세포이다.
바이러스 입자 코트는 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 특이성을 변경시키고 세포/조직 표적화를 개선시키기 위해 변형될 수 있다. 바이러스성 벡터는 또한, 다른 비히클, 예를 들어, 리포솜으로 전달될 수 있다. 리포솜은 또한, 세포/조직 표적화를 개선시키기 위해 이의 표면에 부착된 표적화 모이어티를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 치료제를 발현시키는 인간 세포를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 인간 세포는 예를 들어, 환자의 종양 세포에 대해 근위에서 제제를 발현시킨다.
진단 및 예측 방법
일부 양태에서, 본 발명은 TLR5 효능제로의 치료에 반응할 수 있는 대상체를 식별하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 환자의 종양이 TLR5를 발현시키는 경우를 결정하는 방법을 제공한다.
TLR5 발현은 환자의 종양 또는 형성이상의 등급 및/또는 진행을 결정하기 위한 예측 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 특정 암의 종양 등급 및/또는 단계를 결정하는 데 유용하다.
종양 등급은 현미경으로 얼마나 비정상적인 것으로 보이는 지 및 종양이 얼마나 빠르게 성장하고 확산할 수 있는 지의 측면에서 암 세포를 분류하기 위해 사용되는 시스템이다. 세포의 구조 및 성장 패턴을 포함하는, 종양 등급을 결정할 때 여러 인자들이 고려된다. 종양 등급을 결정하기 위해 사용되는 특정 인자는 각 타입의 암에 따라 달라질 수 있고, 당해 분야에 공지되어 있다.
분화로도 불리워지는 조직학적 등급은 얼마나 많은 종양 세포가 동일한 조직 타입과 유사한 지를 지칭한다. 핵 등급은 종양 세포에서 핵의 크기 및 형상 및 분열하는 종양 세포의 백분율을 지칭한다.
암 세포의 현미경 외관을 기초로 하여, 병리학자는 통상적으로, 종양 등급을 4개의 중증도로 기술한다: 등급 1, 2, 3 및 4. 등급 1의 종양의 세포는 정상 세포와 유사하고, 천천히 성장하고 번식하는 경향이 있다. 등급 1의 종양은 일반적으로 거동에 있어서 덜 공격적인 것으로 간주된다. 반대로 등급 3 또는 등급 4의 종양의 세포는 동일한 타입의 정상 세포처럼 보이지 않는다. 등급 3 및 4의 종양은 낮은 등급을 갖는 종양보다 빠르게 성장하고 더 빠르게 확산하는 경향이 있다. 미국 암 합동 위원회(American Joint Committee on Cancer)는 종양을 등급화하기 위한 하기 가이드라인을 제안한다: GX-등급은 평가 불가(등급 미정); G1-잘 분화됨(낮은 등급); G2-중간 정도로 분화됨(중간 등급); G3-불량하게 분화됨(높은 등급); 및 G4-미분화됨(높은 등급).
등급화 시스템은 각 타입의 암에 대해 상이하다. 예를 들어, 병리학자는 전립선암 세포의 분화도를 기술하기 위해 글리슨 시스템(Gleason system)을 사용한다. 글리슨 시스템은 등급 2 내지 등급 10 범위의 점수를 사용한다. 낮은 글리슨 점수는 잘 분화되고 덜 공격적인 종양을 기술한다. 더 높은 점수는 불량하게 분화되고 더욱 공격적인 종양을 기술한다. 다른 등급화 시스템은, 예를 들어, 유방암의 경우 Bloom-Richardson 시스템 및 신장암의 경우 Fuhrman 시스템을 포함한다.
암 생존율 또는 생존 통계는 특정 시간의 양 동안 특정 타입의 암에서 생존하는 사람의 백분율을 지칭할 수 있다. 암 통계는 종종 전체 5년 생존율을 사용한다. 예를 들어, 방광암에 대한 전체 5년 생존율은 80%이며, 즉, 방광암으로 진단된 사람 100명 당 80명은 진단 후 5년 동안 생존하였으며, 100명 당 20명은 방광암 진단의 5년 내에 사망하였다. 다른 타입의 생존률, 예를 들어, 무-질환 생존율(차도를 달성한 암을 가진 사람의 수) 및 무진행 생존율(여전히 암을 가지고 있지만 이의 질환이 진행하지 않는 사람의 수)이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 본 명세서에 개시된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)의 투여 전, 동안 및/또는 후에, 및/또는 항암제 또는 요법의 투여 전, 동안 및/또는 후에 생존율, 무질환 생존율 및/또는 무진행 생존율을 예후하는 것을 포함하는, 특정 암의 진단 또는 예후의 목적을 위해 종양 등급을 설정하는 데 유용하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 치료의 선택을 돕고/거나 치료 결과를 예측하기 위해 종양 등급을 점수화하는 방법의 일부로서 사용된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 I 기(예를 들어, 국소적으로 발달하지 않음)로서 환자로부터의 암을 진단하거나 식별하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 덜 공격적인 치료에 대한 필요성을 예측한다. 대안적으로, 본 명세서에 기술된 치료제는 II 기 또는 III 기(예를 들어, 암은 국소적으로 발달될 수 있음)로서 환자로부터의 암을 진단하거나 식별하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 더욱 공격적인 치료에 대한 필요성을 예측한다. 유사하게, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 IV 기로서 환자로부터의 암을 진단하거나 식별하기 위해 사용될 수 있거나, 매우 공격적인 치료의 필요성을 예측하는 전이성이다.
일부 실시형태에서, 암은 비절제 가능하다. 비절제 가능한 암은 전이성 병소의 수로 인해 또는 수술 위험 구역이 존재하기 때문에, 수술로 제거할 수 없은 악성 종양이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료제는 예를 들어, 화학치료제 및/또는 방사선 치료 전에 종양 용적을 감소시키고/시키거나 환자에게 투여된 화학요법 또는 방사선의 용량을 증가시키거나 감소시키는 항암제를 투여하는 단계를 포함하는, 치료의 특성 및/또는 타이밍/투여를 선택하는 데 도움을 주기 위해 종양을 치료하는 방법의 일부로서 사용된다.
일부 실시형태에서, 암은 다중약물 내성이다. 예를 들어, 환자는 실질적인 반응 없이 하나 이상의 사이클의 화학요법을 받을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 종양은 다중약물 내성의 하나 이상의 마커를 갖는다. 이에 따라, 본 명세서에서 사용되는 용어 다중약물 내성은 적어도 하나의 사이클의 병용 화학요법에 대한 비-반응성을 나타내는 암을 의미하거나, 대안적으로, 도세탁셀, 파클리탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 카보플라틴, 시스플라틴, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 옥살리플라틴, 카무스틴, 플루오로우라실, 겜시타빈, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 토포테칸, 에를로티닙, 에포포사이드, 및 미토마이신 중 적어도 2개(와 유사한 제제를 포함함)에 대해 내성적인 (진단적으로) 점수를 갖는 암을 의미한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료제는 종양이 하나 이상의 화학치료제, 방사선 요법 및/또는 다른 항암 요법에 반응하는 지의 여부를 확립하는 데 유용하다.
다른 실시형태에서, 암은 초기 암의 통상적인 화학요법 후 재발성이다. 종종, 재발성 암은 약물 내성이 발달하였고, 이에 따라, 특히 치료하기 어렵고, 종종 생존에 대한 불량한 예후를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 수행 상태를 대신하는 종양 평가 방법의 일부로서 사용된다. 수행 상태는 당해 분야에 공지된 환자의 수행 상태를 점수화하는 임의의 시스템 및 방법을 이용하여 정량화될 수 있다. 이러한 측정은 종종 환자가 화학 요법을 받을 수 있는 지의 여부, 용량 조정을 결정하고/하거나 완화 치료의 강도를 결정하기 위해 사용된다. Karnofsky 점수 및 Zubrod 점수를 포함하는 다양한 점수화 시스템이 존재한다. 병렬 점수화 시스템은 정신과의 진단 및 통계 매뉴얼(DSM)의 다섯 번째 축으로서 통합된 전반적 기능 평가(Global Assessment of Functioning; GAF) 점수를 포함한다.
더 높은 수행 상태(예를 들어, Karnofsky 점수화 시스템을 사용하여 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 70%)는 질환 상태의 진행을 예방하고 화학요법 및/또는 방사선 치료를 수용하는 환자의 능력을 향상시키기 위한 치료를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 치료제가 더 높은 수행 상태를 지시할 때, 환자는 보행이 가능하고 자기 관리가 가능하다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료제가 낮은 수행 상태(예를 들어, Karnofsky 점수화 시스템을 이용하여 약 50% 미만, 약 30% 미만, 또는 약 20% 미만)을 나타낼 때, 환자는 대체로 침대 또는 의자에 국한되고, 자기-관리에 대해서도 장애가 있다.
Karnofsky 점수는 100에서 0까지 진행하며, 여기서, 100은 "완벽한" 건강이며, 0은 사망이다. 점수는 10의 간격으로 사용될 수 있으며, 여기서, 약 100%는 정상이고, 불만도 없고, 질환의 징후가 없으며; 약 90%는 정상 활성을 가능하게 하고, 질환의 증상 또는 징후가 거의 없으며, 약 80%는 정상 활성이고, 약간의 어려움, 약간의 증상 또는 징후가 있으며; 약 70%는 정상 활성이나 일을 할 수 없는 자아를 돌보며; 약 60%는 약간의 도움이 필요하고, 대부분의 개인 요구사항을 처리할 수 있으며; 약 50%는 자주 도움이 필요하고, 빈번한 치료가 필요하며; 약 40%는 장애가 있고, 특별한 주의 및 도움이 필요하며; 약 30%는 중증 장애이고, 병원 입원이 지시되었지만, 사망의 위험을 가지지는 않으며; 약 20%는 매우 아파서, 긴급하게 입원을 필요로 하고, 지원 조치 또는 치료를 필요로 하며; 약 10%는 급격하고 빠르게 진행되는 치명적인 질환 과정이다.
수행 상태에 대한 Zubrod 점수화 시스템은 0, 완전 활성, 제한 없이 모든 사전-질환 성능 을 수행할 수 있음; 1, 신체적으로 몹시 힘든 활성으로 제한되지만, 보행이 가능하고 가렵거나 앉아 있는 성격의 작업을 수행할 수 있음, 예를 들어, 가벼운 집안 작업, 사무실 작업; 2, 보행 가능하고 모든 자가 관리가 가능하지만 어떠한 작업 활동도 수행할 수 없음, 깨어 있는 시간의 약 50% 이상; 3, 깨어 있는 시간의 약 50% 이상이 침대 또는 의자에 한정된 제한된 자기-관리만 가능함; 4, 완전히 장애가 있고, 어떠한 자기-관리도 수행할 수 없으며, 침대 또는 의자에 완전히 국한됨; 5, 사망을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양의 조직학적 샘플은 문헌[Elston & Ellis, Histopathology, 1991, 19:403-10]에 따라 본 명세서에 기술된 치료제를 사용하여 등급화되며, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료제는 특정 암의 진단 또는 예후의 목적을 위해 종양 등급을 확립시키는 데 유용하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제)는 대상체 및/또는 대상체(예를 들어, 암 환자)로부터의 시편을 평가하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 평가는 치료에 대한 진단, 예후, 및/또는 반응 중 하나 이상이다.
진단은, 예를 들어, 암과 같은 가능한 질환 또는 장애를 결정하거나 식별하려고 시도하는 공정을 지칭한다. 예후는 예를 들어, 암과 같은 질환 또는 장애의 가능성 있는 결과를 예측하는 것을 지칭한다. 완전한 예후는 종종, 예상되는 기간, 기능 및 질환 과정의 설명, 예를 들어, 진행성 감소, 간헐적 위기, 또는 갑작스럽고 예측할 수 없는 위기를 포함한다. 치료에 대한 반응은 치료받을 때 환자의 의학적 결과의 예측이다. 치료에 대한 반응은 비제한적인 예로서, 병리학적 완전 반응, 생존, 및 재발 확률일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 진단 및 예측 방법은 단백질의 존재, 부재, 또는 수준을 평가하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 핵산의 존재, 부재, 또는 발현 수준을 평가하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술된 조성물은 이러한 측정을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 종양 또는 종양으로부터 배양된 세포의 시편을 본 명세서에 기술된 치료제와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 생검 또는 수술 시편 샘플을 포함하는, 종양 시편의 측정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생검은 인간 생검이다. 다양한 실시형태에서, 생검은 냉동된 종양 조직 시편, 배양된 세포, 순환하는 종양 세포, 및 포르말린-고정 파라핀-포매된 종양 조직 시편 중 어느 하나이다. 일부 실시형태에서, 종양 시편은 생검 샘플, 예를 들어, 냉동된 종양 조직(냉동 절개) 시편일 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 냉동 절개는 냉동고 내부에 마이크로톰을 포함하는, 저온유지장치를 이용할 수 있다. 수술 시편은 금속 조직 디스크 상에 배치되며, 이는 이후에 척에 고정되고, 약 -20℃ 내지 약 30℃까지 급속 냉동된다. 시편은, 예를 들어, 폴리 에틸렌 글리콜 및 폴리비닐 알코올로 이루어진 겔 유사 매질에 포매된다. 냉동된 조직은 저온 유지 장치의 마이크로톰 부분으로 냉동 절단되며, 섹션은 선택적으로 유리 슬라이드 상에 집어 들고 염색된다. 일부 실시형태에서, 종양 시편은 생검 샘플, 예를 들어, 배양된 세포일 수 있다. 이러한 세포는 당해 분야에 공지된 일반적인 세포 배양 기술을 이용하여 가공될 수 있다. 이러한 세포는 순환하는 종양 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 시편은 생검 샘플, 예를 들어, 포르말린-고정 파라핀-포매된(FFPE) 종양 조직 시편일 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 생검 시편은 이를 보존하기 위해 포르말린(물과 폼알데하이드의 혼합물) 또는 몇몇 다른 유체를 함유한 용기에 배치될 수 있다. 조직 샘플은 고온 파라핀 왁스와 함께 몰드 내에 배치될 수 있다. 왁스는 냉각되어 조직을 보호하는 고체 블록을 형성한다. 조직이 포매된 이러한 파라핀 왁스 블록은 마이크로톰 상에 배치되며, 이는 조직의 매우 얇은 슬라이스로 절단한다. 특정 실시형태에서, 종양 시편은 약 100㎎ 미만의 조직을 함유하거나, 특정 실시형태에서, 약 50㎎ 이하의 조직을 함유한다. 종양 시편(또는 생검)은 약 20㎎ 내지 약 50㎎의 조직, 예를 들어, 약 35㎎의 조직을 함유할 수 있다. 조직은, 예를 들어, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의) 니들 생검으로서(예를 들어, 14-게이지 니들 또는 다른 적합한 크기를 이용하여) 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생검은 의심스러운 분위에 길고 얇은 니들이 삽입되며 분석을 위한 유체 및 세포를 추출하기 위해 시린지가 사용되는 미세-니들 흡인이다. 일부 실시형태에서, 생검은 절단 팁을 구비한 큰 니들이 의심스러운 부위에서 조직의 칼럼을 추출하기 위해 코어 니들 생검 동안 사용되는 코어 니들 생검이다. 일부 실시형태에서, 생검은 흡입 디바이스가 니들을 통해 추출되는 유체 및 세포의 양을 증가시키는 진공-보조 생검이다. 일부 실시형태에서, 생검은 니들 생검이 이미징 절차, 예를 들어, X-선, 컴퓨터 단층촬영법(CT), 자기 공명 이미징(MRI) 또는 초음파와 결합되는 이미지-유도 생검이다. 다른 실시형태에서, 샘플은 유방 생검을 위한 레이저 유도, 진공-보조 생검 시스템인 MAMMOTOME® 생검 시스템과 같은 디바이스를 통해 수득될 수 있다.
일부 실시형태에서, 진단 및 예측 방법 및/또는 평가는 직접 치료(본 명세서에 기술된 치료제로의 치료를 포함함)일 수 있다. 일 실시형태에서, 평가는 절제 후 애주번트 요법의 사용 또는 보류를 지시할 수 있다. 애주번트 치료로서 불리워지는 애주번트 요법은 1차, 주요 또는 초기 치료 이외에 제공되는 치료이다. 비제한적인 예로서, 애주번트 요법은 검출 가능한 모든 질환이 제거되었지만 잠재성 질환으로 인한 통계적 재발 위험이 남아 있는 경우 일반적으로 수술 후 제공되는 추가 치료일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료제는 암 치료에서 애주번트 요법으로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료제는 암 치료에서 단독 애주번트 요법으로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료제는 암의 치료에서 애주번트 요법으로서 보류된다. 예를 들어, 환자가 본 명세서에 기술된 치료제에 반응할 가능성이 없거나 최소 반응을 가질 경우에, 삶을 질을 위해 및 비효과적인 화학요법으로 인한 불필요한 독성을 방지하기 위해 치료가 투여될 수 없다. 이러한 경우에, 완화 치료가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료제는 절제 전에 네오애주번트 요법으로서 투여된다. 특정 실시형태에서, 네오애주번트 요법은 임의의 수술 전에 종양을 수축시키고/시키거나 약화시키기 위한 요법을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 네오애주번트 요법은 수술 전에 암 환자에게 투여되는 화학요법을 의미한다. 일부 실시형태에서, 네오애주번트 요법은 본 명세서에 기술된 치료제가 수술 전에 암 환자에게 투여됨을 의미한다. 네오애주번트 화학요법이 일반적으로 고려되는 암의 타입은, 예를 들어, 유방, 대장, 난소, 자궁경부, 방광, 및 폐를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료제는 암의 치료에서 네오애주번트 요법으로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 사용은 절제 전이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료제는 암 치료에서 네오애주번트 요법으로서 보류된다. 예를 들어, 환자가 본 명세서에 기술된 치료제에 반응할 가능성이 없거나 최소 반응을 가질 경우, 치료는 삶의 질을 위해 그리고, 비효과적인 화학용법으로 인한 불필요한 독성을 방지하기 위해 치료가 투여되지 못할 수 있다. 이러한 경우에, 완화 치료가 사용될 수 있다.
대상체 및/또는 동물
일부 실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 포유동물, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 기니 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 토끼, 양, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이, 침팬지, 또는 개코원숭이이다. 다른 실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 비-포유동물, 예를 들어, 지브라피시이다. 일부 실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 형광-태그된 세포(예를 들어, GFP를 가짐)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 인간은 소아 인간이다. 다른 실시형태에서, 인간은 성인 인간이다. 다른 실시형태에서, 인간은 노인 인간이다. 다른 실시형태에서, 인간은 환자로 지칭될 수 있다.
특정 실시형태에서, 인간은 약 0개월 내지 약 6개월, 약 6 내지 약 12개월, 약 6 내지 약 18개월, 약 18 내지 약 36개월, 약 1 내지 약 5세, 약 5 내지 약 10세, 약 10 내지 약 15세, 약 15 내지 약 20세, 약 20 내지 약 25세, 약 25 내지 약 30세, 약 30 내지 약 35세, 약 35 내지 약 40세, 약 40 내지 약 45세, 약 45 내지 약 50세, 약 50 내지 약 55세, 약 55 내지 약 60세, 약 60 내지 약 65세, 약 65 내지 약 70세, 약 70 내지 약 75세, 약 75 내지 약 80세, 약 80 내지 약 85세, 약 85 내지 약 90세, 약 90 내지 약 95세 또는 약 95 내지 약 100세 범위의 연령을 갖는다.
다른 실시형태에서, 대상체는 비-인간 동물이며, 이에 따라, 본 발명은 수의학 용도에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 가정 애완 동물이다. 다른 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 가축 동물이다.
키트
본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 제제의 투여를 단순화할 수 있는 키트를 제공한다. 본 발명의 예시적인 키트는 단위 투약 형태의 본 명세서에 기술된 임의의 조성물을 포함한다. 일 실시형태에서, 단위 투약 형태는 용기, 예를 들어, 사전-충전된 시린지로서, 이는 무균일 수 있고, 본 명세서에 기술된 임의의 제제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 비히클을 함유한다. 키트는 본 명세서에 기술된 임의의 제제의 사용을 설명하는 라벨 또는 프린팅된 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한, 개검기(lid speculum), 국소 마취제, 및 투여 위치를 위한 세정제를 포함할 수 있다. 키트는 또한, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 추가 제제를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 키트는 유효량의 본 발명의 조성물 및 유효량의 다른 조성물, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 것을 함유한 용기를 포함한다.
정의
하기 정의는 본 명세서에 개시된 본 발명과 관련하여 사용된다. 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
또한, 용어 "약"은 언급된 숫자 표시와 관련하여 사용될 때, 언급된 숫자 표시 ± 언급된 숫자 표시의 최대 10%를 의미한다. 예를 들어, 언어 "약 50"은 45 내지 55의 범위를 포함한다.
의학 용어와 관련하여 사용될 때 "유효량"은 측정 가능한 치료, 예방, 또는 고려되는 질환의 발병률의 감소를 제공하기에 효과적인 양이다.
본 명세서에서 사용되는 활성 및/또는 효과의 판독이 이러한 조절의 부재와 비교하여 제제 또는 자극의 존재 하에서, 상당한 양만큼, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 최대 적어도 약 100%(이를 포함)만큼 줄어드는 경우 "감소"된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 실시형태에서, 활성은 감소되며, 일부 다운스트림 판독값은 감소하지만, 다른 것은 증가할 수 있다.
반대로, 활성은 활성 및/또는 효과의 판독이 이러한 제제 또는 자극의 부재 하에서, 상당한 양, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 그 이상, 최대 적어도 약 100% 이상 및 이를 포함함, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배만큼 증가하는 경우에 "증가"된다.
본 명세서에서 언급된 바와 같이, 모든 조성 백분율은 달리 명시하지 않는 한, 전체 조성물의 중량 기준이다. 본 명세서에서 사용되는 단어 "포함하다" 및 이의 변형은 비제한적인 것으로 의도되며, 이에 따라, 리스트에서 항목의 인용은 이러한 기술의 조성물 및 방법에서 또한 유용할 수 있는 다른 유사한 항목을 배제하지 않는다. 유사하게는, 용어 "...할 수 있다(can, may)" 및 이의 변형은 비제한적인 것으로 의도되어, 실시형태가 특정 구성요소 또는 특징을 포함할 수 있다는 언급이 그러한 구성요소 또는 특징을 함유하지 않는 본 기술의 다른 실시형태를 배제하지 않는다.
포함하는, 함유하는, 또는 갖는과 같은 용어의 동의어로서 개방형 용어 "포함하는"이 본 명세서에서 본 발명을 기술하고 청구하기 위해 사용되지만, 본 발명, 또는 이의 실시형태는 대안적으로, "...로 이루어진" 또는 "...로 본질적으로 이루어진"과 같은 대안적인 용어를 이용하여 기술될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 특정 상황 하에서, 특정 이점을 제공하는 기술의 실시형태를 지칭한다. 그러나, 다른 실시형태는 또한, 동일하거나 다른 환경 하에서 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 실시형태의 언급은 다른 실시형태가 유용하지 않다는 것을 시사하지 않고, 기술의 범위로부터 다른 실시형태를 배제하려는 의도가 아니다.
치료 효과를 달성하는 데 필요한 본 명세서에 기술된 조성물의 양은 특정 목적을 위한 통상적인 절차에 따라 경험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 치료 목적을 위한 치료제(예를 들어, 본 명세서에 기술된 플라겔린 변이체(및/또는 추가 제제))를 투여하기 위해, 치료제는 약리학적 유효 용량으로 제공된다. "약리학적으로 유효량," "약리학적으로 유효 용량," "치료학적 유효량," 또는 "유효량"은 원하는 생리학적 효과를 생성시키기에 충분한 양, 또는 특히 장애 또는 질환을 치료하기 위해 원하는 결과를 달성할 수 있는 양을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 유효량은, 예를 들어, 장애 또는 질환의 증상의 발병을 지연시키고, 장애 또는 질환의 증상 과정을 변경시키고(예를 들어, 질환의 증상의 진행을 늦추고), 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 징후를 감소시키거나 제거하고, 장애 또는 질환의 증상을 역전시키기에 충분한 양을 포함할 것이다. 예를 들어, 암으로 고통받는 환자에 치료제의 투여는 기저 상태가 근절되거나 개선될 때뿐만 아니라 환자가 질환과 관련된 증상의 중증도 또는 기간의 감소, 예를 들어, 종양 부담의 감소, 순환하는 종양 세포의 감소, 무진행 생존의 증가를 보고할 때 치료 이점을 제공한다. 치료 이점은 또한, 개선이 실현되는 지의 여부와는 관계없이 기저 질환 또는 장애의 진행을 중단하거나 늦추는 것을 포함한다.
유효량, 독성, 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 약 50%에서 치사 용량) 및 ED50(집단의 약 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 용량 비율은 치료 지수이고, 비율 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 큰 치료 지수를 나타내는 조성물 및 방법이 바람직하다. 치료학적 유효 용량은 초기에 예를 들어, 세포 배양 검정을 포함하는 시험관내 검정으로부터 추정될 수 있다. 또한, 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 또는 또는 적절한 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 혈장에서 기술된 조성물의 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 임의의 특정 투여량의 효과는 적합한 바이오검정에 의해 모니터링될 수 있다. 투여량은 의사에 의해 결정되고, 필요한 경우에, 관찰된 치료 효과에 맞게 조정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 효과는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 90%의 정량화 가능한 변화를 야기시킬 것이다. 일부 실시형태에서, 효과는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 50%, 약 70%, 또는 심지어 약 90% 이상의 정량화 가능한 변화를 야기시킬 것이다. 치료 이점은 또한, 개선이 실행되는지의 여부에 관계없이 기저 질환 또는 장애의 진행을 중단시키거나 늦추는 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 암을 치료하는 약리학적 유효량은 증상을 통상적으로 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%만큼 조절할 것이다. 예시적인 실시형태에서, 이러한 변형은, 예를 들어, 암성 세포의 수의 통계적으로 유의미하고 정량화 가능한 변화를 초래할 것이다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1: CBLB502 및 33MX에 비해 개선된 플라겔린 변이체의 조작.
a. CD4 + T 세포 에피토프 맵핑 :
각각 길이가 15개의 아미노산인, 플라겔린 유도체로부터 유래된 80개의 펩타이드를 EpiScreen™ T 세포 에피토프 맵핑 기술을 이용하여 CD4+ T 세포 에피토프의 존재에 대해 분석하였다. 펩타이드를 50명의 건강한 인간 공여자의 코호트로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 대해 합성하고 시험하였다. 개개 펩타이드에 대한 CD4+ T 세포 반응을 증식 검정(3[H]-티미딘 도입)을 이용하여 측정하였다. 양성 반응을 인간 백혈구 항원-DR 아이소형(HLA-DR) 제한 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II 결합 모티프를 함유한 5개의 펩타이드에 대해 관찰하였다.
특히, 단백질 서열에 존재하는 선형 T 세포 에피토프를 식별함으로써 T 세포 면역원성의 예측을 제공하기 위해 전임상, 세포외 T 세포 검정을 사용하였다. 단백질 서열에 존재하는 T 세포 에피토프의 정량적 분석, 즉, 에피토프의 위치뿐만 아니라 이의 상대적 효능 둘 모두를 제공하기 위해, MHC 일배체형을 기초로 하여 조심스럽게 선택된 커뮤니티 혈액 공여자(50명의 건강한 공여자)의 코호트에 대해 6중 배양물에서 길이가 15개의 아미노산인 합성 중첩 펩타이드를 개별적으로 시험하였다. 이러한 분석은 생체내에서 면역 반응을 유도할 가능성에 대한 단백질 변이체의 비교를 제공한다.
PBMC가 상업적 공급업체로부터의 동의 하에서 얻어진 건강한 커뮤니티 공여자 연막으로부터(24시간 내에 채혈된 혈액으로부터) 단리되었을 때 공여자 선택을 수행하였다. 세포를 Lymphoprep(Axis-shield, 영국 던디 소재) 밀도 원심분리에 의해 분리하고, CD8+ T 세포를 CD8+ RosetteSep™(StemCell Technologies Inc, 영국 런던 소재)를 이용하여 고갈시켰다. HISTO Spot SSO HLA 타이핑 방법(MC Diagnostics, 영국 세인트아사프 소재)을 이용하여 HLA-DR 일배체형을 식별함으로써 공여자를 특성분석하였다. 대조군 네오항원 단백질(키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet haemocyanin: KLH), Sigma, 영국 풀 소재) 및 인플루엔자 바이러스(IFV)(C32) 및 엡스타인 바 바이러스(EBV)(C3)로부터 유래된 대조군 펩타이드에 대한 T 세포 반응을 또한 결정하였다. 이후에, PBMC를 필요할 때까지 액체 질소에서 냉동시키고 저장하였다. 세계 인구에서 발현되는 HLA-DR 및 DQ 동종이형의 수 및 빈도를 최상으로 나타내기 위해 50명의 공여자의 코호트를 선택하였다. 발현된 동종이형의 분석은, 코호트가 모든 주요 HLA-DR 및 DQ 동종이형을 포함함을 나타내었다. 도 2는 선택된 공여자 코호트에 대한 세계, 유럽 및 북미 인구에서 발현된 MHC 클래스 II 일배체형의 분포 및 빈도의 비교를 도시한 것이다.
이후에, 증식 검정을 수행하였다. 각 공여자로부터의 PBMC를 해동시키고, 카운팅하고, 생존력을 평가하였다. 세포 밀도를 2.5 내지 3.5×106 PBMC/㎖(증식 세포 스톡)으로 조정하기 전에 세포를 실온 AIM V® 배양 배지(Invitrogen, 영국 페이즐리 소재)에서 부활시켰다. 펩타이드를 자유 N-말단 아민 및 C-말단 카복실산으로 1 내지 3㎎ 스케일로 합성하였다. 펩타이드를 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 중에 10 mM의 농도로 용해시키고, 각 웰에서 AIM V® 배양 배지에서 5μM의 최종 농도로 희석함으로써 펩타이드 배양 스톡을 제조하였다. 각 펩타이드 및 각 공여자에 대해, 6중 배양물을 평평한 바닥의 96웰 플레이트에서 확립하였다. 양성 대조군 배양물과 음성 대조군 배양물 둘 모두를 또한, 6회 반복하여 시험하였다. 각 공여자에 대하여, 3개의 대조군(KLH 단백질(최종 검정 농도 0.3μM) 및 IFV 및 EBV로부터 유래된 펩타이드)을 또한 포함하였다. 양성 대조군에 대하여, PHA(Sigma, 영국 풀 소재)를 2.5 ㎍/㎖의 최종 농도로 사용하였다. 각 웰에 0.75 μCi 3[H]-티미딘(Perkin Elmer®, 영국 비콘스필드 소재)을 첨가하기 전 총 6일 동안 배양물을 인큐베이션하였다. TomTec Mach III 세포 수확기를 이용하여 필터 매트 상으로 수확하기 전에 추가 18시간 동안 배양물을 인큐베이션하였다. 파라룩스, 낮은 백그라운드 카운팅 모드에서 마이크로플레이트 베타 카운터(Perkin Elmer®, 영국 비콘스필드 소재) 상에서 Meltilex™(Perkin Elmer®, 영국 비콘스필드 소재) 섬광 카운팅에 의해 각 웰에 대한 분당 카운트(CPM)를 결정하였다.
또한, 모든 펩타이드를 LAL 색원체 내독소 정량화 키트(Pierce (Perbio), 영국 크렘링턴 소재)를 이용하여 내독소 오염에 대해 스크리닝하였다. 각 샘플의 내독소 농도를 결정하기 위해 공식화된 표준 곡선을 이용하였다. 모든 펩타이드는 허용 한계 미만(<5 EU/mg)인 내독소의 수준을 포함하는 것으로 확인되었다.
이후에, 증식 검정을 통계적으로 분석하였으며, 여기서, 양성 T 세포 반응은 PBMC가 임의의 제공된 펩타이드에 대해 SI≥2.00으로 유의미한(p<0.05) 반응을 생성한 공여자에 의해 정의되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 연구에서 모든 펩타이드에 대한 양성 반응의 평균 빈도 플러스 1.5x SD("백그라운드 반응 임계값"으로 지칭됨)를 계산함으로써 T 세포 에피토프를 확인하였다. 도 3은 T 세포 증식 검정에서 각 펩타이드에 대한 양성 공여자 반응의 빈도를 도시한 것이다. 펩타이드는 비조정된 데이터 및 조정된 데이터 세트 둘 모두에서의 3명 이상의 공여자(공여자 코호트의 ≥ 6%)에서 양성 T 세포 증식 반응(SI≥2.00, p<0.05, 경계선 반응 SI≥1.90, p<0.05를 포함함)을 유도한 경우 T 세포 에피토프를 포함한 것으로 간주되었다.
이러한 임계값 이상으로 증식 반응을 유도한 임의의 펩타이드는 T 세포 에피토프를 함유하는 것으로 간주되었다. 총 5개의 펩타이드는 비-조정된 데이터 및 조정된 데이터 세트 둘 모두에서 6% 이상 컷 오프(cut off)로 양성 반응을 유도하였다. 펩타이드에 대한 반응의 크기 및 빈도는 하나의 약한, 하나의 중간, 및 하나의 강한 T 세포 에피토프를 제안하였다.
b. 플라겔린 유도체의 에피토프 변이체의 설계:
플라겔린 유도체의 결합 친화력 및 다른 구조적 특성을 보유하면서 T 세포 에피토프 맵핑에 의해 이전에 식별된 면역원성 영역을 제거하도록, 플라겔린 유도체의 일련의 에피토프 변이체를 설계하였다.
생물리학적 및 생화학적 데이터, 예를 들어, 2차 및 3차 단백질 구조를 고려한 참조 플라겔린 구조의 변형에 대한 제한뿐만 아니라 단백질의 코어 및 수용체, TLR5와 아미노산 측쇄의 잠재적인 상호작용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 다수의 복합체 고려사항 하에서 다양한 에피토프에서 특정 아미노산을 선택함으로써 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 합성 DNA를 사용한 부위-유도 돌연변이 유발을 통한 탈면역화, 및/또는 결실을 결정하였다. 관련된 T 세포 에피토프를 제공하기 위해 어떠한 돌연변이가 MHC 클래스 II 결합을 감소시키거나 제거할 것인지를 결정하기 위해 에피토프 1, 2 및 3의 서열 내의 특정 아미노산 변화 및/또는 결실을 평가하였다.
본 발명자들은, T 세포 에피토프와 관련된 데노보 면역원성을 감소시키거나 제거하기 위한 목적으로 돌연변이 유발 실험이 플라겔린 변이체의 적절한 활성과 균형을 이루어야 한다는 것을 확인하였다. 실제로, 구조적 고려사항을 기반으로 한 예측이 완전히 적합하지 않은 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 감소된 면역원성과 활성의 균형을 갖는 변이체를 제공하기 위해 시행 착오 실험을 계속하였다. 돌연변이 및 에피토프 맵핑의 실험의 간략한 요약은 하기 표 1에 제공된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
에피토프 3의 특정의 11개의 아미노산 C-말단 결실이 플라겔린 변이체 활성(예를 들어, NF-κB 신호전달)을 크게 손상시키지 않으면서 인플라마솜 활성화를 효과적으로 제거하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견은 IL-1β 및 IL-18을 유도하지 않는 플라겔린 변이체의 생산을 가능하게 하고, 이에 따라, 더 적은 염증 독성을 가지며, 이는 더 양호한 치료 활성을 유도한다(예를 들어, 관문 저해제의 조합).
실시예 2: CBLB502 및 33MX에 비해 개선된 탈면역화된 플라겔린 변이체의 시험관내 특성분석.
상기 기술된 바와 같이 얻어진 에피토프 맵핑 데이터(실시예 1 참조)를 탈면역화된 SE-1 및 SE-2 선둑 후보의 최종 설계를 위한 토대를 제공하였다. 이러한 변이체, 즉 33TX2(SE-1로도 알려짐) 및 491TEMX(SE-2 및 GP532로도 알려짐)를 엔톨리모드(a/k/a CBLB502)와 비교하여, 시험관내에서 특성분석하였다.
면역원성
수지상 세포(DC): CD4+ T 세포 반응을 측정함으로써, CBLB502를 비교하여 491TEMX의 면역원성 잠재력을 평가하기 위해 T 세포 검정(EpiScreen™ DC:T 세포 검정)을 이용하였다. 각 샘플의 면역원성 잠재력을 평가하기 위해, T 세포 활성화를 측정하기 위해 EpiScreen™ DC:T 세포 검정에서 2개의 마커(IL-2 생산 및 증식)를 사용하였다. 하기 표 2에서 상세히 설명된 바와 같이, 샘플(샘플 1/엔톨리모드 및 샘플 2/SE-2)을 제공된 설명서에 따라 저장하였다. 4-12% 구배 겔 및 은 염색(Pierce Silver Stain Kit, ThermoFisher Scientific, 영국 러프버러 소재) 상에서 SDS PAGE를 변성시킴으로써 샘플의 순도를 평가하였다. 이러한 분석 결과는 도 4a 및 도 4b에 도시되어 있고, 두 샘플 모두에서 하나의 밴드가 존재함을 나타낸다(비교를 위해 참조 항체를 나타냄). 내독소 수준을 제조업체 설명서에 따라 발색성 역학 LAL 검정 키트(Charles River, 영국 마게이트 소재)를 이용하여 측정하였고, 검정에 대해 허용되는 한계 이내인 것으로 확인되었다(<5.0 EU/mg)(표 2). 샘플을 사용하기 직전에 AIM-V® 배양 배지(ThermoFisher Scientific) 중에서 500 ㎍/㎖까지 희석하였다(최종 검정 농도 50 ㎍/㎖). KLH를 -20℃에서 dH2O 중 10 ㎎/㎖에서 저장하였다. 이러한 연구를 위해, 분취액의 KLH를 AIM-V® 중 1 ㎎/㎖(최종 검정 농도 100 ㎍/㎖)로 희석하기 직전에 해동시켰다. PHA(Sigma)를 ELISpot 검정에서 양성 대조군으로서 사용하였으며, 1 ㎎/㎖ 모액을 AIM-V® 중 10 ㎍/㎖(최종 검정 농도 2.5 ㎍/㎖)의 농도까지 희석하기 전에 -20℃에서 저장하였다.
Figure pct00003
단핵구-유래 수지상 세포(MoDC)를 반-성숙 단계까지 준비하고, 전염증성 사이토카인 TNF-α로의 자극에 의해 전체 DC 성숙이 유도되기 전에 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 자가 CD4+ T 세포를 또한 증식 검정을 위해 준비하였다. 상세하게는, AIM-V® 배양 배지에서 공여자로부터 PBMC를 회수하고 제조업체 설명서에 따라 Miltenyi Pan 단핵구 단리 키트 및 LS 칼럼(Miltenyi Biotech, 영국 옥스포드 소재)을 이용하여 CD14+ 세포(단핵구)를 단리시킴으로써 MoDC를 제조하였다. 단핵구를 DC 배양 배지(1000 IU/㎖ IL-4 및 1000 IU/㎖ GM-CSF가 보충된 AIM-V®(Peprotech, 영국 런던 소재)) 중에 재현탁시키고, 낮은-결합 24 웰 플레이트(2㎖ 최종 배양물 부피)에 플레이팅하였다. 세포를 2일에 절반 부피 DC 배양 배지 교체에 의해 공급하였다. 3일에, 항원(샘플 및 KLH)을 DC 배양 배지 중의 세포에 0.3μM의 최종 농도까지 첨가하였다. 네오항원 KLH를 대조군으로서 포함하였다. 또한, 동일한 부피의 DC 배양 배지를 미처리된 대조군 웰에 첨가하였다. MoDC를 24시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하였으며, 그 후에, 세포를 3회 세척하고, 세포를 성숙시키기 위해 50 ng/㎖ TNF-α(Peprotech)를 함유한 DC 배양 배지 중에 재현탁하였다. 세포에 8일에 수확하기 전에 다시 7일에 50 ng/㎖ TNF-α를 함유한 DC 배양 배지를 절반 부피 배지 교체에 의해 공급하였다. 수확된 MoDC를 카운팅하고, 생존력을 트립판 블루(Sigma) 염료 배제를 이용하여 평가하였다. 이후에, MoDC에 증식 및 ELISpot 검정에서 사용하기 전에 γ-조사(40㏉)하였다. 또한, 8일에, 자가 CD4+ T 세포를 제조업체 설명서에 따라 CD4+ T 세포 단리 키트 및 LS 칼럼(Miltenyi Biotech)을 이용한 PBMC로부터의 음성 선택에 의해 단리하였다.
이후에, 증식 검정을 수행하였다. 세포 생존력을 카운팅 및 평가한 후에, 1×105개의 CD4+ T 세포를 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서 1×104 조사된 MoDC와 함께 공동-배양하였다. 모든 배양물을 6개의 복제 웰에서 셋업하였다. 7일 공동 배양 후에, 세포를 50㎕ AIM-V® 배지 중 1.0 μCi [3H]-티미딘(Perkin Elmer, 영국 버킹햄셔 소재)으로 펄싱하고, TomTec Mach III 세포 수확기를 이용하여 필터 매트 상에 수확하기 전에 추가 6시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에 대한 Cpm을 파라룩스(paralux), 낮은 백그라운드 카운팅에서 마이크로플레이트 베타 카운터 상에서 Meltilex™(Perkin Elmer) 섬광 카운팅에 의해 결정하였다.
ELISpot 검정을 또한 수행하였다. ELISpot 플레이트(Millipore, 영국 왓퍼드 소재)를 사전-습윤화시키고, PBS 중 100 ㎕/웰 IL-2 캡쳐 항체(R&D Systems, 영국 애빙던 소재)로 밤새 코팅하였다. 이후에, 플레이트를 PBS에서 2회 세척하고, 블로킹 완충제(PBS 중 1% BSA) 중에서 밤새 인큐베이션하고, AIM-V® 배지에서 세척하였다. CD4+ T 세포 및 DC를 증식 검정을 위해 각 웰에 첨가하였다(비 10:1). 각 샘플을 6중 배양에서 시험하였으며, 각 공여자에 대하여, 음성 대조군(AIM-V® 배지만), 세포 대조군이 없고 미토겐 양성 대조군(2.5 ㎍/㎖으로 PHA, 즉, ELISpot 기능 및 세포 생존력에 대한 내부 시험으로서 사용됨, Sigma)을 또한 각 플레이트 상에 포함하였다. 7일 인큐베이션 기간 후에, PBS/1% BSA 중 100㎕의 여과된, 바이오틴화된 항체(R&D Systems)를 첨가하기 전에 dH2O 및 PBS(×3)에서 순차적으로 세척함으로써 ELISpot 플레이트를 현상시켰다. 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션한 후에, 플레이트를 PBS(×3)에서 추가로 세척하고, PBS/1% BSA 중 100㎕의 여과된 스트렙타비딘-AP(R&D Systems)를 1.5시간 동안 첨가하였다(실온에서 인큐베이션). 스트렙타비딘-AP를 폐기하고, 플레이트를 PBS(×4)에서 세척하였다. 100㎕ BCIP/NBT 기질(R&D Systems)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰 및 웰의 뒷면을 dH2O로 3회 세척함으로써 스폿 발생을 중지시켰다. 건조된 플레이트를 Immunoscan® Analyser에서 스캔하였으며, 웰당 스폿(spw)을 Immunoscan® Version 5 소프트웨어를 이용하여 결정하였다.
세포 생존력을 8일에 MoDC 수확 후 트립토판 블루 염색 배제를 이용하여 평가하였고, 이를 총 세포수 중 트립판 블루로 염색되지 않은 세포의 백분율로서 표현하였다. 배지만으로 처리된 MoDC의 평균 생존율이 샘플 또는 대조 항원(KLH)으로 처리된 MoDC와 유사하였기 때문에(94% 내지 96%) 샘플이 세포 생존율에 영향을 미치지 않는다는 것으로 밝혀졌다.
증식 및 IL-2 ELISpot 검정에 대하여, 1.90 이상의 SI(SI≥1.90)의 경험적 임계값이 규명되었으며, 이에 의해, 이러한 임계값 이상으로 반응을 유도하는 샘플은 양성인 것으로 간주되었다. 증식(n=6) 및 IL-2 ELISpoT(n=6) 데이터 세트 둘 모두에 대하여, 양성 반응은 통계적 및 경험적 임계값에 의해 정의되었다: (1) 쌍을 이루지 않는 2개의 샘플 스튜던트 t-검정을 이용하여 배지 대조군 웰(cpm>150, spw >3)에 대한 시험 웰의 cpm 또는 spw를 비교함에 의한 반응의 유의성(p<0.05); 및 (2) SI≥1.90, 여기서, SI = 시험 웰의 평균(cpm 또는 spw)/기준선(cpm 또는 spw). 이러한 방식으로 제시된 데이터는 SI≥1.90, p<0.05로서 나타낸다. 또한, 검정내 변이를 복제 배양으로부터의 원시 데이터의 CV 및 SD와 조합하여 Dixons Q 시험을 이용하여 평가하였다. P 값을 Prism 5(GraphPad, La Jolla, USA)에서 쌍을 이루지 않은 2개의 샘플 스튜던트 t-검정을 이용하여 계산하였다.
도 5는 샘플에 대한 반응에서 CD4+ T 세포 증식의 요약을 도시한 것이다. 네오-항원 KLH는 공여자 코호트의 54%에서 양성 반응을 유도하였으며, SI의 평균 크기는 4.07이었다(표 3 참조). 샘플 1/엔톨리모드는 공여자 코호트의 28%에서 양성 반응을 유도하였으며(SI≥1.90(p<0.05)), 샘플 2/SE-2는 공여자 코호트의 8%에서 양성 반응을 유도하였다. 양성 T 세포 증식 반응의 평균 크기는 두 샘플에 대해 낮으며(SI<3.00), 평균 SI는 샘플 1/엔톨리모드 및 샘플 2/SE-2 각각에 대해 2.39 및 2.67이었다(표 3).
Figure pct00004
도 6a 내지 도 6c는 (도 6a) 샘플 1/엔톨리모드, (도 6b) 샘플 2/SE-2 및 (도 6c) KLH(대조군)에 대한 건강한 공여자 T 세포 증식 반응을 도시한 것이다. 쌍을 이루어지 않는, 2개의 샘플 스튜던트 t-검정을 이용하여 유의미한(p<0.05) SI≥1.90(적색 점선으로 표시됨)을 갖는 T 세포 반응은 양성인 것으로 간주되었다.
표 4는 IL-2 ELISpot 검정에서 얻어진 반응의 요약을 나타낸 것으로서, 이러한 검정은 2개의 샘플 및 KLH가 로딩된 DC로 자극 후 CD4+ T 세포에 의한 IL-2 분비를 측정하는 것이다. 증식 검정과 유사하게, 양성 반응을 시험 spw와 백그라운드(미처리된 배지 대조군) 사이에 유의미한(p<0.05) 차이를 가지면서 SI≥1.90을 나타내는 공여자에서 기록하였다. 모든 양성 대조군 PHA 처리된 웰은 스폿의 존재에 대해 양성이었으며, SI 값은 7일 후에 대부분의 웰이 카운팅하기에 너무 많은 스폿을 함유하였기 때문에(데이터 제시 생략) ELISpot 데이터에 대해 준비되지 않았다. KLH는 공여자의 60%에서 양성 반응을 유도하였으며. 평균 크기 SI는 3.82였다. 샘플에 대한 IL-2 ELISpot 검정에서 얻어진 결과는 증식 검정에서 얻어진 결과와 유사하였으며, 샘플 1은 더 높은 반응 속도를 유도하였다. 샘플s 1/엔톨리모드 및 2/SE-2는 각각 20% 및 10%의 IL-2 반응 빈도를 유도하였으며, 이는 쌍을 이루어지 않는, 2개의 샘플 스튜던트 t-검정을 이용하여 모두 유의미(p<0.05)한 것이었다(표 4 참조). 샘플 1/엔톨리모드에 대한 IL-2 ELISpot 검정에서 양성 T 세포 반응의 평균 크기(SI)는 샘플 2/SE-2의 경우 2.92 및 3.12였다(표 4).
Figure pct00005
도 7a 내지 도 7c는 (도 7a) 샘플 1, (도 7b) 샘플 2 및 (도 7c) KLH에 대한 건강한 공여자 T 세포 IL-2 분비 반응을 도시한 것이다. CD4+ T 세포를 샘플이 로딩된 자가 성숙 DC와 함께 인큐베이션하였고, 7일 인큐베이션 후 IL-2 분비에 대해 평가하였다. 쌍을 이루어지 않는, 2개의 샘플 스튜던트 t-검정을 이용하여 유의미한(p<0.05) SI≥1.90(적색 점선으로 표시됨)을 갖는 T 세포 반응은 양성으로 간주되었다.
결과는, 두 샘플 모두가 공여자 코호트의 0 내지 8%에서 조합된 양성 반응 빈도를 유도함을 보인다. 그러나, 시험 샘플에 대한 양성 증식과 IL-2 ELISpot 반응 간의 상관 관계는 낮았다. 개별 검정에서, 샘플 1/엔톨리모드는 높은 빈도의 양성 증식(28% 대 8%) 및 IL-2 ELISpoT(20% 대 10%) 반응으로 인해 샘플 2/SE-2보다 임상 면역원성의 위험이 더 큰 것으로 간주될 것이다. 또한, 샘플 1/엔톨리모드에 대한 증식 반응의 평균 크기는 샘플 2/SE-2에 비해 유의미하게 더 높았으며, 샘플 2/SE-2에 대한 샘플 1/엔톨리모드에 대한 임상 면역원성의 증가된 위험의 결론을 지지하는 추가 증거를 추가한다.
NF - κB 활성
도 8은 293-hTLR5-LacZ 리포터 세포에서 NF-κB 신호전달을 유도하는 능력에 대해 시험된 플라겔린 변이체의 분석을 도시한 것이며, 여기서, 세포를 시험 제제(예를 들어, 플라겔린 변이체)의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 33MX 변이체에 의해 유도된 활성과 비교하여 플라겔린 변이체 33TX2 및 491TEMX에 의해 유도된 NF-κB 활성이 5배 미만 감소한다는 것이 확인되었다. 실제로, 표 5는 CBLB502 및 변이체 33MX와 비교하여 플라겔린 변이체에 의해 나타낸 활성 효능의 요약을 나타낸 것이다. EC50은 기준선과 특정 노출 시간 후에 최대치 사이의 중간으로 반응을 유도하는 제제의 농도로서 정의된다. 예를 들어, 리포터 효소 활성 용량-반응 곡선(표 5)으로부터 계산된 EC50 값은 491TEMX가 33MX 및 엔톨리모드/CBLB502 각각과 비교하여 NF-κB 활성의 5배 미만의 감소를 나타냄을 보인다(EC50는 0.043 및 0.032 ng/㎖와 비교하여 0.114 ng/㎖임).
Figure pct00006
인플라마솜 활성화
NLRC4 인플라마솜은 미생물 개체에 의한 이의 패턴 인식 수용체(PRR) 성분의 활성화 후 어셈블링되는 다수의 세포질 다분자 복합체 중 하나이다. NLRC4의 경우에, 세포질 Nod-유사 수용체(NLR)는 박테리아 플라겔린에 의해 활성화되며, 이는 또한 세포막 상의 톨-유사 수용체 5(TLR5)의 효능제이다. 세포외 플라겔린이 플라겔린-TLR5 복합체의 내재화로 인해 세포질 NLRC4 인플라마솜을 활성화할 수 있다고 가정한다. 어셈블링된 직후에, 인플라마솜은 카스파제-1 활성화를 포함한 전염증성 케스케이드를 시작하고, 이후에, 전-IL-1β를 성숙한 IL-1β로 처리하며, 이는 주요 전염증성 사이토카인이다. 이에 따라, IL-1β 생산의 측정은 인플라마솜 활성의 판독값을 제공한다.
CBLB502 및 다른 플라겔린 변이체와 비교하여 인플라마솜 활성화(예를 들어, 마커로서 IL-1β 및 IL-18 생산)를 결정하기 위해 THP1-NLRC4 세포에서 플라겔린 변이체를 시험하였다. 플라겔린 변이체의 구조-활성 관계(SAR)를 2개의 시험관내 세포-기반 판독, 즉, (i) 인플라마솜 활성화, 및 (ii) NF-κB 신호전달을 이용하여 평가하였다. THP1-NLRC4 세포를 시험 제제(예를 들어, 플라겔린 변이체)의 존재 하에서 배양하였다. 리포터 세포에서 변이체 33TX2 및 491TEMX에 의해 유도된 NF-κB 신호전달은 이전에 도 8에 도시되어 있으며, 여기서, 이는 변이체 33TX2 및 491TEMX에 의해 유도된 NF-κB 활성이 유지되고 33MX 변이체에 의해 유도된 것과 유사함을 보인다. 도 9는 THP1-NLRC4 세포에서 CBLB502 및 변이체 33MX 및 33TX2에 의해 유도된 인플라마솜 활성과 비교하여, THP1-NLRC4 세포에서 변이체 491TEMX에 의해 유도된 낮은-거의 없는-인플라마솜 활성(예를 들어, IL-1β 생산)을 보인다. 결과는 변이체 491TEMX가 CBLB502, 33MX, 및 33TX2에 비해 증가하는 농도에서 최소 인플라마솜 활성화를 유도함을 보인다.
또한, 도 18은 마우스 간 간세포의 조직학적 분석을 도시한 것으로서, 이는 GP532(491TEMX로도 알려짐) 및 엔톨리모드에 의한 NF-κB 활성화를 보인다. 엔톨리모드 및 GP532 치료 둘 모두는 주사 후 30분에 p65의 강력한 핵 전좌를 초래하였다. 엔톨리모드-치료된 마우스에서, 핵 p65의 양은 주사하고 2시간 후에 유의미하게 감소하였으며, 이는 24시간에 완전히 사라졌다. GP532(엔톨리모드가 아님)로 치료된 마우스에서, 주사 후 2시간 동안 강한 핵 염색이 지속되었다. 약물의 주입 후 24시간에 염색이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, GP532가 간 세포에서 NF-κB 신호전달 반응의 개선된 역학(예를 들어, 더 긴 기간)을 제공함을 보여준다.
실시예 3. CBLB502 및 33MX에 비해 개선된 탈면역화된 플라겔린 변이체의 생 체내 특정분석.
플라겔린 변이체의 신호전달 활성의 생체내 시험은 변이체 491TEMX(즉, SE-2)가 엔톨리모드 정도이거나 더 양호하게 수행되었다는 점에서 시험관내 데이터와 일치한 것으로 나타났다. 약동학 프로파일을 리포터 마우스에 1㎍의 플라겔린 변이체, SE-1 및 SE-2, 및 엔톨리모드의 주사 및 24시간의 과정에 걸친 ng/㎖ 단위의 얻어진 농도의 측정에 의해 규명하였다(도 10). 도 10에 도시된 결과는 SE-2가 엔톨리모드보다 우수하거나 동일하게 수행되었음을 결론지었다.
추가적으로, 다양한 다른 마커를 1㎍의 플라겔린 변이체, SE-1 및 SE-2, 및 엔톨리모드가 주사된 마우스에서 24시간의 과정에 걸쳐 측정하였다. 예를 들어, 사이토카인 G-CSF(도 11) 및 IL-6(도 12)을 포함하는 약동학 마커를 24시간의 과정에 걸쳐 측정하였다. 인플라마솜 마커 IL-18을 도 13에 도시된 바와 같이, 측정하였으며, 이러한 결과는, 플라겔린 변이체 SE-1(a/k/a 33TX2) 및 SE-2(491TEMX로도 알려짐)의 제시가 엔톨리모드(CBLB502로도 알려짐)와 비교하여 실질적으로 더 낮은 인플라마솜 활성화를 유도하였다는 시험관내 실험의 확인을 나타낸다. 산화질소 생산을 또한 측정하였으며, 도 14에서의 결과는, 시간에 따라, 변이체 SE-1(a/k/a 33TX2) 및 SE-2(491TEMX로도 알려짐)에 의해 유도된 산화질소의 수준이 엔톨리모드에 의해 유도된 산화질소의 수준과 유사하였음을 보인다.
방사선 보호 활성의 생체내 특성화를 전신 조사 전 20분에 마우스에 다양한 용량의 엔톨리모드 및 SE-2(491TEMX로도 알려짐)를 주사하고 이후에 27일 동안 모니터링하는 것을 포함한 실험에 의해 분석하였다. 엔톨리모드 및 SE-2의 용량은 각각에 대해 4 ㎍/㎏, 6 ㎍/㎏, 8 ㎍/㎏, 16 ㎍/㎏, 32 ㎍/㎏, 및 64 ㎍/㎏이었다. PBS-Tween을 대조군으로서 사용하였다. 도 15에 도시된 결과는 엔톨리모드 또는 SE-2(491TEMX로도 알려짐)가 100% 방사선 보호 활성에 도달하지 않지만, SE-2(491TEMX로도 알려짐)가 엔톨리모드보다 더 나쁘게 수행하지 않음을 보인다. 실제로, 도 15의 결과는 각 엔톨리모드 및 SE-2에 대한 가장 효과적인 용량이 상이함(엔톨리모드의 경우 16 ㎍/㎏ 및 SE-2의 경우 32 ㎍/㎏)을 보인다.
방사선 보호 활성을 수동 혈청 전달 실험을 통해 추가로 평가하였다. 인간 혈청(정상 혈청 및 중화 항체를 함유한 혈청 둘 모두)을 NIH-스위스 마우스에 전달하고, 이후에, 엔톨리모드, SE-2 또는 PBS를 주사하였다. 이후에, 마우스에 전신 조사(8.5㏉ TBI)하였으며, 이후 60일 동안 생존을 모니터링하였다. 도 16에 도시된 결과는, 중화 B 세포 에피토프가 엔톨리모드 치료의 효능에 영향을 미치지만 SE-2(491TEMX로도 알려짐) 치료의 효능에 영향을 미치지 않음을 보인다. 도 19는 중화 또는 비-중화 (대조군) 인간 혈청의 주입 후 엔톨리모드 또는 GP532의 피하 주사 시에 NF-κB-루시페라제 리포터 마우스에서의 신호전달 활성의 생체내 이미징을 도시한 것이다. 이러한 결과는 GP532의 투여가 중화 항체가 수혈된 리포터 마우스에서 중화 항체에 대한 내성을 제공함을 보여준다.
유익한 특성을 확립하기 위해, SE-2(GP532 및 491TEMX로도 알려짐)와 관문 저해제로의 병용 종양 치료의 효과에 대해 연구를 수행하였다. 삼중-음성 유방암의 EMT6 마우스 모델을 사용하였으며, 여기서, 치료는 관문 저해제의 투여로 시작하고, 이후에, 엔톨리모드 또는 SE-2가 투여되었다. 상세하게는, 마우스에 7일에 소정 용량의 α-PD1을 제공하고, 이후에 9일에 소정 용량의 α-CTLA4를 제공하였다. 10일 및 11일에, 소정 용량의 엔톨리모드 및 SE-2를 투여하였다. 도 17에 도시된 결과는, 관문 저해제의 투여 이후에 SE-2의 투여의 조합이 관문 저해제와 함께 엔톨리모드의 투여 또는 관문 저해제 단독 투여보다 더 빠른 종양 퇴화를 나타내었음을 보여준다.
방사선 완화 활성을 비히클(PBS), 엔톨리모드, 또는 GP532가 주사된 BALB/c 마우스에서 평가하였다. 이후에, 마우스에 전신 조사(8.5㏉ TBI)하였으며, 그후 60일 동안 생존을 모니터링하였다. 도 20에 도시된 결과는, GP532가 엔톨리모드와 거의 동일한 수준의 방사선 완화 활성을 제공하였음을 보여준다.
추가 연구에서, 국소 방사선을 받은 두경부암 마우스 모델에 PBST 또는 0.3㎍ GP532를 주사하였다. 국소 방사선 부작용의 완화를 평가하기 위해 마우스의 다양한 부위(예를 들어, 피부, 구각, 입, 림프절, 턱밑, 슬링 점막, 및 귀밑샘)에 조직학 점수를 매겼다. 도 21a 내지 도 21g에 피부(도 21a), 구각(도 21b), 입(도 21c), 림프절(도 21d), 턱밑(도 21e), 슬링 점막(도 21f), 및 귀밑샘(도 21g)에 대한 결과가 도시되어 있으며, 이는 입의 각 부위에 대한 조직학 스코어가 0.3㎍ GP532 주사된 마우스에서 감소되었음을 보인다.
등가물
본 발명이 이의 특정 실시형태와 관련하여 기술되었지만, 추가 변형이 가능하며, 본 발명이 관련된 당해 분야 내에 공지되거나 통상적인 실무 내에 속하고 상기에 기술되고 하기 첨부된 청구범위의 필수 특징에 적용될 수 있기 때문에 본 출원이 일반적으로 본 발명의 원리를 따라고 본 개시로부터 벗어난 것을 포함하는 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 개조를 포함함을 의도하는 것으로 이해될 것이다.
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참고문헌의 포함
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
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Ala Ser Arg Asn Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile 50 55 60 Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser Val Gln Ala Thr Ala 65 70 75 80 Gly Ala Asn Ala Asp Ala Ala Leu Lys Ala Ile Gln Ala Glu Ile Gln 85 90 95 Gln Arg Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Gln Gln Thr Gln Ala Ala 100 105 110 Ala Val Lys Val Leu Ser Gln Asp Asn Ala Met Ala Ile Gln Val Gly 115 120 125 Ala Asn Asp Gly Ala Ala Ile Thr Ile Asp Leu Gln Lys Ile Asp Val 130 135 140 Lys Ser Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn Ser Pro Gly Ser Thr 145 150 155 160 Ala Asn Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser Ala Leu Ser Lys Val Asp Ala 165 170 175 Val Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn Arg Phe Asp Ser Ala Ile 180 185 190 Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Thr Asn Leu Asn Ser Ala Arg Ser Arg 195 200 205 Ile Glu Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Gln Met Ser Lys Ala 210 215 220 Gln Ile Leu Asp Gln Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ala Gln Ala Asn Gln 225 230 235 240 Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg 245 250 <210> 39 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 39 Met His His His His His His Ala Val Pro Arg Gly Ser Gly Leu Arg 1 5 10 15 Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ala Ala Asn Arg 20 25 30 Ala Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile 50 55 60 Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser Val Gln Ala Thr Ala 65 70 75 80 Gly Ala Asn Ala Asp Ala Ala Leu Lys Ala Ile Gln Ala Glu Ile Gln 85 90 95 Gln Arg Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Gln Gln Thr Gln Ala Ala 100 105 110 Ala Val Lys Val Leu Ser Gln Asp Asn Ala Met Ala Ile Gln Val Gly 115 120 125 Ala Asn Asp Gly Ala Ala Ile Thr Ile Asp Leu Gln Lys Ile Asp Val 130 135 140 Lys Ser Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn Ser Pro Gly Ser Thr 145 150 155 160 Ala Asn Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser Ala Leu Ser Lys Val Asp Ala 165 170 175 Val Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn Arg Phe Asp Ser Ala Ile 180 185 190 Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Thr Asn Leu Asn Ser Ala Arg Ser Arg 195 200 205 Ile Glu Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Gln Met Ser Lys Ala 210 215 220 Gln Ile Leu Asp Gln Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ala Gln Ala Asn Gln 225 230 235 240 Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg 245 250 <210> 40 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 40 Met His His His His His His Ala Ala Pro Arg Gly Ser Gly Leu Arg 1 5 10 15 Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ala Ala Asn Arg 20 25 30 Ala Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile 50 55 60 Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser Val Gln Ala Thr Ala 65 70 75 80 Gly Ala Asn Ala Asp Ala Ala Leu Lys Ala Ile Gln Ala Glu Ile Gln 85 90 95 Gln Arg Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Gln Gln Thr Gln Ala Ala 100 105 110 Ala Val Lys Val Leu Ser Gln Asp Asn Ala Met Ala Ile Gln Val Gly 115 120 125 Ala Asn Asp Gly Ala Ala Ile Thr Ile Asp Leu Gln Lys Ile Asp Val 130 135 140 Lys Ser Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn Ser Pro Gly Ser Thr 145 150 155 160 Ala Asn Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser Ala Leu Ser Lys Val Asp Ala 165 170 175 Val Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn Arg Phe Asp Ser Ala Ile 180 185 190 Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Thr Asn Leu Asn Ser Ala Arg Ser Arg 195 200 205 Ile Glu Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Gln Met Ser Lys Ala 210 215 220 Gln Ile Leu Asp Gln Ala Gly Thr Ser Thr Leu Ala Gln Ala Asn Gln 225 230 235 240 Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg 245 250

Claims (103)

  1. 플라겔린 변이체(engineered flagellin variant)로서, 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (i) I18, F22, T23, S24 및 K27 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이, 및 (ii) I215, L216, Q217, T221 및 V223 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이를 포함하되,
    상기 치환된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이며,
    플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유하는, 플라겔린 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 치환된 아미노산 잔기가 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된, 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기가 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  6. 플라겔린 변이체로서, 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (i)
    18번에 해당하는 위치에서의 아이소류신(I) 이외의 소수성 잔기,
    22번에 해당하는 위치에서의 페닐알라닌(F) 이외의 소수성 잔기,
    23번에 해당하는 위치에서의 트레오닌(T) 이외의 친수성 잔기,
    24번에 해당하는 위치에서의 세린(S) 이외의 친수성 잔기, 및
    27번에 해당하는 위치에서의 라이신(K) 이외의 친수성 잔기
    로부터 선택된 치환 돌연변이;
    및 (ii)
    215번에 해당하는 위치에서의 아이소류신(I) 이외의 소수성 잔기,
    216번에 해당하는 위치에서의 류신(L) 이외의 소수성 잔기,
    217번에 해당하는 위치에서의 글루타민(Q) 이외의 친수성 잔기,
    221번에 해당하는 위치에서의 트레오닌(T) 이외의 친수성 잔기, 및
    223번에 해당하는 위치에서의 발린(V) 이외의 친수성 잔기
    로부터 선택된 치환 돌연변이
    를 포함하되,
    상기 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유하는, 플라겔린 변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된, 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기가 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  10. 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성를 갖는 아미노산 서열 및 (i) I18 및 F22 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이 및 (ii) Q217 및 V223 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이를 포함하며, 상기 치환된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이며, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유하는, 플라겔린 변이체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 치환된 아미노산 잔기가 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된, 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기가 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  15. 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및
    (i) 18번에 해당하는 위치에서 아이소류신(I) 이외의 소수성 잔기, 및 22번에 해당하는 위치에서 페닐알라닌(F) 이외의 소수성 잔기로부터 선택된 치환 돌연변이; 및
    (ii) 217번에 해당하는 위치에서 글루타민(Q) 이외의 친수성 잔기, 및 223번에 해당하는 위치에서 발린(V) 이외의 친수성 잔기로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하며,
    플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한, 플라겔린 변이체.
  16. 제15항에 있어서, 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 하기의 치환 돌연변이를 포함하는, 플라겔린 변이체:
    18번에 해당하는 위치에서 아이소류신(I) 이외의 소수성 잔기; 및
    22번에 해당하는 위치에서 페닐알라닌(F) 이외의 소수성 잔기;
    217번에 해당하는 위치에서 글루타민(Q) 이외의 친수성 잔기; 및
    223번에 해당하는 위치에서 발린(V) 이외의 친수성 잔기.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된, 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기가 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 18번에 해당하는 위치에서의 아이소류신(I) 이외의 상기 소수성 잔기가 알라닌(A)인, 플라겔린 변이체.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 22번에 해당하는 위치에서의 페닐알라닌(F) 이외의 상기 소수성 잔기가 알라닌(A)인, 플라겔린 변이체.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 217번에 해당하는 위치에서의 글루타민(Q) 이외의 상기 친수성 잔기가 아스파르테이트(D)인, 플라겔린 변이체.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 223번에 해당하는 위치에서의 발린(V) 이외의 상기 친수성 잔기가 트레오닌(T)인, 플라겔린 변이체.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, I18A, F22A, Q217D 및 V223T를 포함하는, 플라겔린 변이체.
  25. 플라겔린 변이체로서, 서열번호 6과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (i) I18, F22, T23, S24 및 K27 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이, 및 (ii) I215, L216, Q217, T221 및 V223 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이를 포함하되,
    상기 치환된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이며,
    플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유하는, 플라겔린 변이체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 치환된 아미노산 잔기가 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된, 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기가 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  30. 플라겔린 변이체로서, 서열번호 6과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (i)
    18번에 해당하는 위치에서의 아이소류신(I) 이외의 소수성 잔기,
    22번에 해당하는 위치에서의 페닐알라닌(F) 이외의 소수성 잔기,
    23번에 해당하는 위치에서의 트레오닌(T) 이외의 친수성 잔기,
    24번에 해당하는 위치에서의 세린(S) 이외의 친수성 잔기, 및
    27번에 해당하는 위치에서의 라이신(K) 이외의 친수성 잔기
    로부터 선택된 치환 돌연변이; 및 (ii)
    215번에 해당하는 위치에서의 아이소류신(I) 이외의 소수성 잔기,
    216번에 해당하는 위치에서의 류신(L) 이외의 소수성 잔기,
    217번에 해당하는 위치에서의 글루타민(Q) 이외의 친수성 잔기,
    221번에 해당하는 위치에서의 트레오닌(T) 이외의 친수성 잔기, 및
    223번에 해당하는 위치에서의 발린(V) 이외의 친수성 잔기
    로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하되,
    상기 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유한, 플라겔린 변이체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기, 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된 플라겔린 변이체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된, 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기가 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  34. 플라겔린 변이체로서, 서열번호 6과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (i) I18 및 F22 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이, 및 (ii) Q217 및 V223 중 하나 이상번에 해당하는 위치에서의 치환 돌연변이를 포함하되, 상기 치환된 아미노산 잔기는 임의의 천연 아미노산이며, 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유하는, 플라겔린 변이체.
  35. 제25항에 있어서, 상기 치환된 아미노산 잔기가 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된, 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기가 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  39. 플라겔린 변이체로서, 서열번호 6과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (i)
    18번에 해당하는 위치에서의 아이소류신(I) 이외의 소수성 잔기, 및 22번에 해당하는 위치에서의 페닐알라닌(F) 이외의 소수성 잔기로부터 선택된 치환 돌연변이;
    및 (ii)
    217번에 해당하는 위치에서의 글루타민(Q) 이외의 친수성 잔기, 및 223번에 해당하는 위치에서의 발린(V) 이외의 친수성 잔기로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하되, 상기 플라겔린 변이체는 NF-kB 신호전달 활성을 보유하는, 플라겔린 변이체.
  40. 제39항에 있어서, 서열번호 6과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 하기의 치환 돌연변이를 포함하는, 플라겔린 변이체:
    18번에 해당하는 위치에서의 아이소류신(I) 이외의 소수성 잔기;
    22번에 해당하는 위치에서의 페닐알라닌(F) 이외의 소수성 잔기;
    217번에 해당하는 위치에서의 글루타민(Q) 이외의 친수성 잔기; 및
    223번에 해당하는 위치에서의 발린(V) 이외의 친수성 잔기.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P) 및 시스테인(C)으로부터 선택된, 극성 및 중성 전하의 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기가 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E)로부터 선택된, 극성 및 음으로 하전된 친수성 잔기인, 플라겔린 변이체.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기가 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 메티오닌(M) 및 발린(V)으로부터 선택된 소수성, 지방족 아미노산 잔기, 또는 페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)으로부터 선택된 소수성, 방향족 아미노산 잔기인, 플라겔린 변이체.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 18번에 해당하는 위치에서의 아이소류신(I) 이외의 상기 소수성 잔기가 알라닌(A)인, 플라겔린 변이체.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 22번에 해당하는 위치에서의 페닐알라닌(F) 이외의 상기 친수성 잔기가 알라닌(A)인, 플라겔린 변이체.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 217번에 해당하는 위치에서의 글루타민(Q) 이외의 상기 친수성 잔기가 아스파르테이트(D)인, 플라겔린 변이체.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 223번에 해당하는 위치에서의 발린(V) 이외의 상기 친수성 잔기가 트레오닌(T)인, 플라겔린 변이체.
  48. 제39항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, I18A, F22A, Q217D 및 V223T를 포함하는, 플라겔린 변이체.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 상기 플라겔린 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  50. 제49항의 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 숙주 세포.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 낮은 인플라마솜 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 플라겔린 변이체.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 서열번호 1, 서열번호 3 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 플라겔린 유도체에 의해 나타내는 인플라마솜 활성에 비해 더 낮은 인플라마솜 활성을 나타내는, 플라겔린 변이체.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 감소된 T 세포 면역원성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 플라겔린 변이체.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 서열번호 1, 서열번호 3 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 플라겔린 유도체에 의해 나타내는 T 세포 면역원성에 비해 감소된 T 세포 면역원성을 나타내는, 플라겔린 변이체.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 NF-kβ 신호전달 활성을 보유하는, 플라겔린 변이체.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 서열번호 1, 서열번호 3 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 플라겔린 유도체에 의해 나타내는 NF-kβ 신호전달 활성에 비해 유사하거나 더 높은 NF-kB 신호전달 활성을 나타내는, 플라겔린 변이체.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 방사선 보호 또는 방사선 완화 활성을 보유하는, 플라겔린 변이체.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 서열번호 1, 서열번호 3 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 플라겔린 유도체에 의해 나타내는 방사선 보호 또는 방사선 완화 활성에 비해 유사하거나 더 양호한 방사선 보호 또는 방사선 완화 활성을 나타내는, 플라겔린 변이체.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 중화 B 세포 에피토프에 대한 개선된 내성을 나타내는, 플라겔린 변이체.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 서열번호 1, 서열번호 3 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 플라겔린 유도체의 중화 B 세포 에피토프에 대한 내성에 비해 개선된 중화 B 세포 에피토프에 대한 내성을 나타내는, 플라겔린 변이체.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 사이토카인 중 하나 이상의 발현을 유도하는, 플라겔린 변이체.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 G-CSF, IL-6, IL-12, 케라티노사이트 화학유인제(KC), IL-10, MCP-1, TNF-α, MIG 및 MIP-2로부터 선택된 사이토카인 중 하나 이상의 발현을 유도하는, 플라겔린 변이체.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 플라겔린 변이체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제 조성물.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 플라겔린 변이체를 투여하는 단계를 포함하는, TLR5 신호전달을 자극하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 대상체가 암을 앓고 있는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 종양이 TLR5를 발현시키거나, 상기 종양이 TLR5을 발현시키지 않는, 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 암이 유방암, 폐암, 결장암, 신장암, 간암, 난소암, 전립선암, 고환암, 비뇨생식관암, 림프계암, 직장암, 췌장암, 식도암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 피부암, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 털세포 백혈병, 조직구 림프종, 및 버켓 림프종, 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병, 전골수성 백혈병, 성상 세포종, 신경모세포종, 신경교종, 신경초종, 섬유육종, 횡문근종육종, 골육종, 색소성 건피증, 각질극 세포종, 정상피종, 소낭 갑상선암, 기형암종, 및 위장관 또는 복부 골반강의 암으로부터 선택되는, 방법.
  68. 제64항에 있어서, 상기 대상체가 방사선-유도 손상을 앓고 있는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 대상체가 치사량의 방사선을 받은, 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 대상체가 방사선 치료를 받고 있는, 방법.
  71. 제68항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 방사선에 대한 노출 전에 투여되는, 방법.
  72. 제68항에 있어서, 상기 플로겔린 변이체가 방사선에 대한 노출 동안 투여되는, 방법.
  73. 제68항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 방사선의 노출 후 투여되는, 방법.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 다른 치료제 및/또는 치료와 함께 투여되는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 화학요법과 함께 투여되는, 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 방사선 치료와 함께 투여되는, 방법.
  77. 제74항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 항산화제와 함께 투여되는, 방법.
  78. 제74항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 하나 이상의 관문 저해제와 함께 투여되는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 하나 이상의 관문 저해제가 예정 세포사 단백질-1(PD-1), 예정사-리간드 1(PD-L1), 예정사-리간드 2(PD-L2), 유도성 T-세포 공동 자극인자(ICOS), 유도성 T-세포 공동 자극인자 리간드(ICOSL), 및 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4) 중 하나 이상을 조절하는 제제로부터 선택되는, 방법.
  80. 제74항에 있어서, 상기 플라겐린 변이체가 다른 치료제 및/또는 치료의 투여 전에 투여되는, 방법.
  81. 제74항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 다른 치료제 및/또는 치료와 동시에 투여되는, 방법.
  82. 제74항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 다른 치료제 및/또는 치료의 투여 후에 투여되는, 방법.
  83. 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항의 플라겔린 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  84. 방사선-유도 손상을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항의 플라겔린 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  85. 노화 또는 연령-관련 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항의 플라겔린 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 연령-관련 장애가 알츠하이머병, 제2형 당뇨병, 황반 변성, 만성 염증-기반 병리(예를 들어, 관절염), 아테롬성 동맥경화증, 노화와 관련된 것으로 알려진 암 타입(예를 들어, 전립선암, 흑색종, 폐암, 결장암), 휴킨슨-길포드 조로증 및 베르너 증후군으로부터 선택되는, 방법.
  87. 제64항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 서열번호 2와 약 95%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  88. 제64항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  89. 서열번호 2와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 플라겔린 변이체.
  90. 서열번호 2와 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 플라겔린 변이체.
  91. 서열번호 2와 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 플라겔린 변이체.
  92. 서열번호 2와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 플라겔린 변이체.
  93. 서열번호 2와 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 플라겔린 변이체.
  94. 서열번호 2와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 플라겔린 변이체.
  95. 서열번호 2와 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 플라겔린 변이체.
  96. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 플라겔린 변이체.
  97. 제87항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열이 상기 서열번호 5의 말단 히스티딘 태그 서열을 포함하지 않는, 플라겔린 변이체.
  98. 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 관문 저해제와 함께 플라겔린 변이체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 엔톨리모드(entolimod)(서열번호 3), 33MX(서열번호 1), 및 SE-2(서열번호 2)로부터 선택되는, 방법.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 관문 저해제가 예정 세포사 단백질-1(PD-1), 예정사-리간드 1(PD-L1), 예정사-리간드 2(PD-L2), 유도성 T-세포 공동 자극인자(ICOS), 유도성 T-세포 공동 자극인자 리간드(ICOSL), 및 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4) 중 하나 이상을 조절하는 제제로부터 선택되는, 방법.
  101. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 상기 관문 저해제의 투여 이전에 투여되는, 방법.
  102. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 상기 관문 저해제의 투여와 동시에 투여되는, 방법.
  103. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 변이체가 상기 관문 저해제의 투여 후에 투여되는, 방법.
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