SK1842002A3 - A fusion protein, a multi-function protein complex, a multi-function fusion protein, a nucleic acid, a cell, their use, method for preparing a fusion protein and method of targeting cytokines - Google Patents

A fusion protein, a multi-function protein complex, a multi-function fusion protein, a nucleic acid, a cell, their use, method for preparing a fusion protein and method of targeting cytokines Download PDF

Info

Publication number
SK1842002A3
SK1842002A3 SK184-2002A SK1842002A SK1842002A3 SK 1842002 A3 SK1842002 A3 SK 1842002A3 SK 1842002 A SK1842002 A SK 1842002A SK 1842002 A3 SK1842002 A3 SK 1842002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
fusion protein
cytokine
protein
fusion
terminus
Prior art date
Application number
SK184-2002A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen D Gillies
Kin-Ming Lo
Original Assignee
Lexigen Pharm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lexigen Pharm Corp filed Critical Lexigen Pharm Corp
Publication of SK1842002A3 publication Critical patent/SK1842002A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/247—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Fúzny proteín, multifunkčný proteínový komplex, multifunkčný fúzny proteín, nukleová kyselina, bunka, ich použitie, spôsob prípravy fúzneho proteínu a spôsob smerovania cytokínov
Oblasť techniky násobných .povedané, cytokínov k liečbe , 7
Predložený vynález sa týka metód zostavovania a pôsobenia cytokinových proteinov a ich zabýva sa fúznymi a cieľových zložiek chorôb, akými je proteinmi vrátane napríklad zloženia. Presnejšie z rôznych využitia a vírové zloženými metód ich rakovina infekcie.
Doterajší stav techniky
Regulačné mechanizmy riadiace imunitný systém závisia, na molekulách, ktoré sa označujú ako cytokiny a ktoré signalizujú vylučovanému proteínu spustenie a vypínanie funkcií imunitných, buniek a reguláciu ich bujnenia. Tieto'odozvy obecne zahrňujú násobné cytokiny, takže sa vo výsledku dosiahne požadovaného biologického efektu. Určité cytokiny, ako interleukin-2 (IL2), vyvolajú sami bujnenie imunitnej bunky a aktivujú iné funkcie vrátane sekundárnej cytokínovej sekrécie. Iný cytókín, interleukin-12 (IL-12) (Trinchieri (1994(, Blood 84, 40084027) vyvoláva bujnenie určitých imunitných buniek a vyvoláva iný kľúčový imunomodulátor, interferón-γ (IFN-γ). Indukcia IFN-γ je kľúčovou aktivitou IL-12, avšak IL-12 má i iné dôležité aktivity nezávislé na IFN-γ. Vzhľadom na to, že sa IL-12 indukuje v počiatočnom štádiu infekčného ochorenia, predpokladá sa, že spojuje prirodzený a získaný imunitný systém.
Mnoho „in vitro štúdií s myšími a ľudskými imunitnými bunkami ukázalo význam cytokínových kombinácií vo vývoji optimálnych imunitných reakcii. Napríklad, väčšina T-buniek nešpecifikuje receptory IL-12 (IL-12R), pokiaľ sa aktivujú mitogény alebo sa kultivujú vo vysokých koncentráciách IL-12 (Desai et al. (1992), J.Immunol. 148, 1225-3132). Akonáhle sa receptory prejavia, bunky sa stanú omnoho reaktívnejšími voči IL-12. Naviac, IL-12 indukuje transkripciu IFN-γ, ale IFN-γ mRNA sa krátko potom rozkladá. V prítomnosti IL-2 sa mRNA stabilizuje, čo má za následok dramatický nárast množstva- produkovaného IFN-γ (Chán et al. (1192), J. Immunol. 148. 92-98). V iných štúdiách sa objavilo, že cytokínové kombinácie IL-3 a IL-11, a lebo IL-3 a Steelov faktor majú s IL-12 synergický efekt na bujnenie prvotných hematopoetických otcovských buniek (Trinchieri (1194), cit. vyššie). Kombinácie interleukinu-4 a GM-CSF je najmä účinná pri stimulácii dendritických buniek (Palucka et al. (1998), J. Immunol. 160, 4587-4595ň. K stimulácii bunečnej imunitnej odozvy je tiež vhodná kombinácia IL-12 s IL-18,: nedávno' objavený Thl-ktorý podporuje cytokín s niektorými aktivitami doplňujúcimi IL-12 (Hashimoto et al. (1999), J. Immunol. 163, 583-589; Barbulescu et al. (1998), J. Immunol. 160, 3642-3647). Naviac, IL-2 a interferón-γ sú za istých okolností synergické (Palladino, M.A.; US patent č. 5 082 658).
Vo veľa týchto synergických štúdií sa ukázalo, že relatívna hladina každého cytokínu je veľmi dôležitá. Zatiaľ čo pridanie 11-12 v prítomnosti suboptimálnych množstiev IL-12 vedie ku spolupráci pri indukcii bujnenia, cytolytická aktivita a indukcia IFN-γ, kombinácie IL-12 a IL-12 s použitím vysokej dávky cytokínov sa ukázali ako protichodné (Perussia et al. (1992), J. Immunol. 149, 3495-3502);
Mehrotra et al. (1993), J. Immunol. 151, 2444-2452). Obdobné situácie existujú i pri kombináciách IL-12 a IL-7.
Synergické štúdium medzi IL-12 a inými cytokínmi pre generovanie protinádorových reakcií u myší ukázali tiež zmiešané výsledky. V niektorých modeloch sa spolupráca ukázala pri suboptimálnych dávkach každého cytokínu a vyššie dávky viedli ku zvýšeniu toxicity, zatiaľ čo v iných modeloch kombinácia IL-12 a IL-2 preukázali malú álebo nulovú spoluprácu (viď napr. Nastala et al. (1994), J. Immunol. 153, 1697-1706). Tieto výsledky upozorňujú na problémy s kombináciou dvoch potencionálne synergických látok „in vitro, predovšetkým akt je nutné zachovať fixný pomer aktivít oboch zložiek rôznych farmakologických vlastností, ako sú rôzne cirkulačné polčasy a biodistribúcie.
Pri. experimentoch s bunečnými kultúrami „in vitro je prvotné kontrolovať hladinu cytokínov, ale relatívnu distribúciu a lokalizáciu cytokínov (a tiež ich imunosťimulačnú kapacitu) „in vivo ovplyvňuje veľa faktorov. Najdôležitejším z nich je polčas. Cirkulačný polčas IL-2- po injekčnej dávke je asi 10 minút. V^ostrom kontraste s týmito farmakokinetickými vlastnosťami je zaznamenaný cirkulačný polčas IL-12, ktorý je. u myší viac než 3 hodiny (Wysocka et al. (1995), Eur. J. Immunol. 25, 672) a u ľudí od 5 do 10 hodín (Lotze et al. (1996), Ann NY Acad. Sci. 795, 440-454) .
Tento rozdiel sa pričíta relatívne malej veľkosti IL-2 a GM-CSF (15-25 kD oproti 75 kD pre IL-12), ktorá umožňuje vyčistenie IL-2 a GM-CSF ľadvinovou filtráciou. Proteíny s molekulovou hmotnosťou pod 50 kD sa čistí ľadvinovou filtráciou. Skoro všetky cytokíny sú menšie než 50 kD a prekonávajú podobné, rýchle čistenie ľadvinovou filtráciou. Ak sa vyžaduje liečba dvomi takto malými, rýchle čistenými cytokínmi, stačí jednoducho spolupodávanie oboch. Spoločné podávanie však nie je vhodné pre cytokíny s výrazne odlišným polčasom.
Systematické podávanie cytokinov je obtiažne vďaka ich škodlivým vedľajším účinkom. Napríklad vysoké hladiny Interferónu-alfa majú za následok znateľné vedľajšie účinky vrátane kožných, neurologických, imunitných a endokrinných otráv. Predpokladá sa, že fúzia násobných cytokinov môže mať obzvlášť závažné vedľajšie účinky.
Jednou z metód obmedzenia vedľajších účinkov spôsobených systematickým podávaním cytokinov je fúzia cytokínu ku druhej molekule so smerovou schopnosťou. Fúzie, u ktorých sa Fc oblasť umiestni na· N-zakončeniach iného proteínu (nazývané „imunofúzia alebo „Fc-X, kde X je ligand ako napr. Interferón-alfa), majú radu výrazných, priaznivých biologických vlastností (Lo et al., US Patenty č. 5 726 044 a 5 541 087; Lo et al. : Proteín Engineering, 11, 495) . Tieto fúzne proteíny sa predovšetkým viažu k dôležitým Fc receptorom na povrchu buniek.
Ak sa však ligand viaže k receptoru na bunečnom povrchu, orientácia Fc oblasti sa zmení, a sekvencia pôsobiaca bunečnou cytoxicitou závislou na protilátke (ADCC) a následnou fixáciou sa uzavrie. Vo výsledku nie je pôsobenie Fc oblasti v Fc-X molekule z hľadiska ADCC' lebo dodatočnej fixácie účinné. Je dobre známy cytotoxický účinok v dôsledku fúzie Nzakončených cytokinov a C-zakončených Fc oblastí. Napríklad fúziou IL-2 k N-zakončeniu Fc oblasti sa vytvorí molekula schopná viazať bunky nesúce IL-2 receptor, fixný doplnok a vo výsledku bunky rozkladá (Landolfi, N.F., 1993, US patent č. 5 349 053) . Naproti tomu Fc-IL-2 fúzne proteíny nemajú túto vlastnosť. Je možné teda očakávať, že prednosťou Fc-X fúzie je zvýšený sérový polčas a relatívna koncentrácia v pečeni, bez zhubných účinkov ADCC a komplementárnej fixácie.
Preukázalo sa, že mnoho rôznych proteinov s krátkym sérovým polčasom môže fúzovať k Fc oblasti v konfigurácii FcX, pričom výsledné fúzie majú omnoho dlhší sérový polčas. Sérový polčas dvoch rôznych Fc fúzií však nie je obvykle identický. Takže ak sa vyžaduje podávanie dvoch rozdielnych Xčastí, nie je optimálne aplikovať dva rôzne Fc-X proteíny.
Za určitých okolností býva účelnejšie zacieliť pôsobenie cytokínov k antigénu bunečného povrchu jeho fúzie k protilátke (alebo jej časti) majúcej špecifitu a afinitu k tomuto antigénu (Gillies, US patent č. 5 650 150; Gillies et al, .
Proc. Natl·. Acad. Sci., 89, 1428) alebo väzbou proteínového antigénu a stimulátorového cytokínu cez peptidovú väzbu vo forme fúzneho proteínu (Hazama et al., Vaccine 11, 629) . I keď protilátky ako také zvyšujú polčas fúzovaného cytokínu, sú ešte rozdiely medzi rôznymi cytokínovými fúziami s tou istou protilátkou (viď napr. Gillies. et al., 1993, Bioconjugate Chem. 4, 230-235; Gillies et al., J. Immunol. 160, 6195-6203), ktoré môžu spôsobiť problémy pri kolokalizácii na cieľovej pozícii. Ako sa už diskutovalo, môže to viesť k. nevyváženosti cytokínovej aktivity a zníženie požadovaného synergického efektu. Naviac, použitie dvoch., rôznych fúznych proteinov vyžaduje samostatné testovanie. spoľahlivosti a účinnosti každej fúzie a ďalej ich testovanie ako zmesi.
Podstata vynálezu
Súhrn
Predložený vynález sa zabýva komplexmi alebo fúziami medzi dvomi alebo viacerými rozdielnymi cytokínmi, ktoré sú obecne vhodné pre cielenú imunoterapiu. Tieto komplexy alebo fúzie ľubovoľne obsahujú ďalšie proteínové časti. Jedným z rysov takýchto komplexov alebo fúzií je, že zabezpečujú stály stupeň aktivity cytokinových zložiek.
Obecne, vynález sa týka proteínového komplexu obsahujúceho aspoň dva rozdielne cytokíny. Cytokíny ..môžu byť v rovnakom polypeptidovom reťazci alebo sa spája kovalentnou väzbou (ako je disulfidová väzba) alebo vytvárajú väzbu chemickým zoskupením. Alternatívne sa cytokíny môžu viazať stabilnou nekovalentnou väzbou. Preferuje sa, keď proteínový komplex obsahuje cieľovú časť, ako je protilátka alebo fragment protilátky, ktorý smeruje komplex k postihnutému miestu u savca.
Vynález sa predovšetkým týka proteínového komplexu kombinujúceho bioaktivitu dvojreťazcového cytokínu. Cytokíny sa vzájomne viažu kovalentné (napríklad fúzne). Cytokíny sa môžu viazať i prostredníctvom iných častí. Napríklad polypeptidový reťazec obsahujúci druhý cytokín môže zahŕňať väzbovú Časť, ktorá špecificky viaže IL-12, ako protilátku k IL-12 alebo receptor k IL-12. Alternatívne väzbová časť interaguje s druhou časťou, ktorá sa:. viaže s IL-12. Napríklad ak obsahuje polypeptid s druhým, cytokínom môže obsahovať ako cieľovú časť biotín. Je výhodné, keď druhým cytokínom je IL-2.
Vynález sa zaoberá metódami výroby fúznych proteínov IL12, ktoré udržujú aktivitu ako IL-12, tak druhého cytokinu, pričom vykazujú dlhdobejšie samostatné farmakokinetické chovanie, podobne ako u samotného IL-12, ktorý zvyšuje aktívne pôsobenie druhého cytokínu, a udržujú rovnováhu aktivít oboch cytokínov po injekciách do živočíšneho organizmu.
V inom prípade fúzne proteíny obsahujú vhodné pre cielenú imunoterapiu. Tieto komplexy alebo fúzie ľubovoľne obsahujú heterodimerickú formu IL-12, v ktorej P35 a P40 sa viaže disulfidovou väzbou a kovalentne sa viažu k druhému cytokínu buď arnino- alebo karboxyl- zakončením p35 alebo p40 podjednotky IL-12 obecného vzorca IL-12-X alebo X-IL-12, kde X je druhý cytokín.
V ďalšom prípade tohto vynálezu fúzne proteíny obsahujú druhý cytokín kovalentne viazaný amin- alebo karboxylzakončením k jednoreťazcovej (sc) forme IL-12 obsahujúcej dve polypeptidové podjednotky spojené cez flexibilnú peptidovú väzbu obecného vzorca scIL-12-Χ alebo X-scIL-12.
Ešte v inom prípade dva cytokíny ďalej fúzujú k proteínu schopnému na arnino- alebo karboxyl- zakončení príslušného proteínového reťazca formovať dimerickú alebo multimerickú štruktúru. Je výhodné, - keď jedna z foriem fúzneho proteínu IL12 s druhým cytokínom ďalej fúzuj e k časti imunoglobulínového reťazca (Ig), ako je Fc oblasť, ktorá je schopná dimerizácie. Ďalšie prípady zahrňujú fúziu aspoň jedného polypeptidového reťazca IL-12 ktorýmkoľvek zakončením . s časťou··; Ig reťazca a druhého cytokínu zvyšným zakončením.
V inom prípade dva alebo viac cytokínov fúzujú k proteínu so smerovou schopnosťou prostredníctvom väzby na špecifický receptor. Napríklad, Fc oblasť sa môže viazať k Fc receptorom, ktoré sa hojne vyskytujú v pečeni. Fúzia Fc oblasti s viac násobným cytokínom predstavuje výhody dimerizácie i smerovania, ale za určitých okolností je vhodné pripraviť fúzie viac násobných cytokínov, ktoré majú iba multimerizačnú alebo smerovú schopnosť, ale nie obidve naraz.
Ešte v inom prípade sa fúzny proteín obsahujúci viac násobné cytokíny ďalej fúzuje na arnino- alebo karboxylzakončenie k niektorej z molekúl s rozmanitou smerovou schopnosťou, ako je protilátka alebo peptidový aptamér so skeletom alebo bez skeletu (Colas et al. (1998), Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 95, 14272-14277). Zvláštnym prípadom je fúzia viac násobných cytokínov k aspoň časti protilátky schopnej viazať sa na antigén, ako je intaktná protilátka, jednoreťazcová protilátka alebo jednoreťazcová Fc oblasť. Ďalšie prípady zahrňujú fúziu aspoň jedného polypeptidového reťazca IL-12 na jedno zo zakončení prinajmenšom tej časti reťazca protilátky, ktorá sa môže viazať na antigén, pričom druhý cytokín fúzuje k inému zakončeniu.
V súlade s uvedeným popisom sa obecne preferuje zostavenie fúznych proteínov viac násobného cytokínu a fúznych proteínov cytokínových protilátok technikami génového inžinierstva tak, že sa proteínové zložky viažu kovalentnými väzbami, ako sú amidová a disulfidová väzba. K tvorbe proteínových komplexov sa však môže využiť, i vzájomných chemických väzieb. Tieto metódy sú v chémii proteínov dobre zavedené. Alternatívne je niekedy výhodné generovať proteínové komplexy fúzií rozdielnych cytokínov s proteínovými partnermi, ktoré tvoria stabilné nekovalentné komplexy. Napríklad s.a použije nekovalentný heterodimerný podporný proteín;, prvý cytokín fúzuje k jednej podjednotke heterodiméru, druhý cytokín fúzuje k druhej podjednotke heterodiméru a dva fúzne proteíny sa za vhodných podmienok zmiešajú. Napríklad -tak, že nukleové kyseliny kódujúce dva fúzne proteíny cytokínovej podjednotky sa vyskytujú v jednej a tej istej bunke. Touto cestou sa môžu zostavovať proteínové komplexy viac násobných cytokínov, u ktorých cytokínové zložky nie sú kovalentne viazané, priamo alebo nepriamo. K splneniu účelu predloženého vynálezu je nutné, aby takýto komplex bol dostatočne stabilný po dobu aplikácie do živočíšneho organizmu a dosiahlo sa tak biologického efektu.
Vynález sa tiež zaoberá nukleovými kyselinami, ktoré kódujú fúzne proteíny obsahujúce dva alebo viac cytokínov, kde jeden z cytokínov je prednostne IL-12 a fúzny proteín kódovaný nukleovou kyselinou lubovolne obsahuje časti iného proteínu.
Najväčší význam majú nukleové kyseliny kódujúcej fúzie dvoch alebo viac proteínov k dimerizujúcemu proteínu, ako je Fc časť reťazca protilátky. Inou významnou časťou sú nukleové kyseliny kódujúcej fúzie dvoch alebo viac cytokínov k proteínu so
smerovou schopnosťou, ako je protilátka.
Vynález prináša tiež metódy zostavenia fúzií dvoch alebo
cytokínov, rovnako ako metódy pôsobenia týchto fúznych
proteínov.
Vynález tiež uvádza metódy liečby chorôb a ďalšie
medicinálne podmienky, za ktorých liečba umožňuj e výhodnú
kombináciu aktivít dvoch alebo viac proteínov. V jednom
prípade aspoň jeden z proteínov má krátky (t.j. menej než 20 minút) alebo iba stredne dlhý (t. j. menej než 40 minút) sérový polčas. Proteíny sa fúzuj ú metódami génového inžinierstva alebo inými technikami a aplikujú sa do ľudského alebo zvieracieho organizmu. V takomto prípade sú aktivity dvoch proteínov stále v rovnakom pomere a nevyžaduje sa oddeleného podávania rozdielnych dávok oboch proteínov. Naviac, sérový polčas sa obecne viac blíži sérovému polčasu proteínových zložiek s dlhším sérovým polčasom, takže sa predlžuje účinný polčas proteínu alebo proteínov s kratším sérovým polčasom.
Vynález sa špeciálne zaoberá metódami imunoterapeutickej liečby chorôb, ako je rakovina, infekcie alebo iné ochorenie, ktoré ide účinne liečiť dvojreťazcovým cytokínom ako je IL-12, v kombinácii s druhým cytokínom. V inom prípade IL-12 fúzuje k IL-18 a dávkuje sa do ľudského alebo zvieracieho organizmu. Preferuje sa, keď IL-12 fúzuje s IL-2 alebo GM-CSF a dávkujú sa do ľudského alebo zvieracieho organizmu. Pri inom, tiež dôležitom postupe GM-CSF fúzuje k IL-4 a dávkujú sa do ľudského alebo zvieracieho organizmu v ďalšom prípade IL-12 k IL-18 a opäť sa aplikujú do ľudského alebo zvieracieho organizmu. Tieto liečby sa môžu kombinovať s inými liečebnými postupmi.
Vynález ďalej prináša metódy vakcinácie antigénom, ktoré sa môžu použiť rôznych chorôb.
V inom k liečbe proti odlišným alebo prevencii k dimerickej prípade týchto metód proteínovej časti, ako dva rôzne cytokíny fúzuj ú je Fc oblasť protilátky, a podávajú sa zvieratám alebo luďom. Pri týchto metódach sa preferuje, ak IL-12 fúzuje k Fc oblasti spoločne s druhým cytokínom, ktorým je najlepšie 11-2 alebo GM-CSF.
V ešte inom prípade týchto metód dva rôzne cytokíny fúzujú k intaktnej protilátke, a- tak sa podávajú zvieratám alebo ľuďom. V tomto prípade sa preferuje, ak cytokín IL-12 fúzuje k časti protilátky spoločne s druhým cytokínom, ktorým je najvýhodnejší IL-1 alebo GM-SCF. Predložený vynález tiež zahrňuje fúzne proteíny protilátkových cytokínov, ktoré sú vhodné k liečbe chorôb. V jednom prípade sa k liečbe použila zmes fúzneho proteínu protilátkového IL-12 a protilátkového
IL-12. Touto metódou je možné liečiť napríklad rakovinu, vírové infekcie, prípadne bakteriálne infekcie.
Detailný popis vynálezu
Vynález sa zaoberá proteínovými molekulami, v ktorých dva alebo viac rozdielne cytokíny fúzujú alebo komplexujú. Proteínové komplexy alebo fúzne proteíny môžu ľubovoľne zahrňovať ďalšie proteínové časti spolu s časťami schopnými multimerizácie a smerovania, ako sú Fc oblasti protilátky a oblasti protilátky obsahujúcej miesta spojenia s antigénom. Vynález sa tiež týka nukleových kyselín kódujúcich fúzne proteíny viac násobného cytokínu. Vynález sa tiež zaoberá metódami zostavenia nukleových kyselín kódujúcich fúzne proteíny viac násobného cytokínu, metódami výroby fúznych proteínov viac násobného cytokínu a metódami využitia fúznych proteínov viacnásobného cytokínu k liečbe chorôb a liečebným podmienkam.
Použitie slova „cytokín v tomto prípade znamená vylučovaný proteín alebo aktívny fragment jeho mutantu, ktorý formuje aktivitu buniek imunitného systému. Príklady cytokínov zahrňujú interleukiny, interferóny, chemokiny, faktory nádorovej nekrózy, faktory stimulujúce kolónie prekurzorov imunitnej bunky, atd.
Použitie slova „heterodimerický cytokín v tomto prípade znamená cytokín tvorený dvomi rôznymi proteínovými podjenotkami. V súčasnej dobe je IL-12 jediný známy prírodné sa vyskytujúci heterodimerický cytokín. Zostavili sa však umelé cytokíny. Napríklad IL-6 a rozpustný fragment IL-6R sa kombinujú za vzniku heterodimerického cytokínu, ako CNTF a CNTF-R alfa (Trinchieri (1994), Blood 84, 4008).
Použitie výrazu „interleukin-12 (IL-12) tu znamená cytokín s dvomi podjednotkami obsahujúcimi podjednotky p35 a p40, alebo aktívnu, jednoreťazcovú fúziu p35 a p40, prípadne varianty, fragmenty alebo deriváty týchto látok.
Použitie výrazu „interleukin-2 (IL-2) tu znamená akýkoľvek cicavčí IL-2, ako je ľudský IL-2, myší IL-2 alebo ich aktívne látky, alelický variant, fragment, prípadne derivát.
Použitý výraz „GM-CSF tu znamená cicavčí cytokínový proteín Granulocyt/Monocyt-Kolona stimulačný faktor, ako je ľudský GM-CSF, myší GM-CSF alebo aktívne zložky, prípadne ich aktívne látky, alelický variant, fragment, prípadne derivát.
Použitý výraz „imunoglobulínová Fc oblasť znamená karboxylom zakončenú časť konštantnej oblasti imunoglobulínového ťažkého reťazca, prípadne jeho analógu alebo časti. Napríklad imunoglobulínová Fc oblasť IgG môže obsahovať aspoň časť hlavnej oblasti, CH2 doménu a CH3 doménu. Preferuje sa, keď Fc oblasť obsahuje aspoň časť hlavnej oblasti a CH3 doménu. V inom, tiež preferovanom prípade Fc oblasť obsahuje aspoň CH2 doménu, a ešte lepšie, keď obsahuje tiež aspoň časť hlavnej oblasti.
Použitý výraz „peptidové spojenie znamená jeden alebo viacej peptidov použitých ku spojeniu dvoch proteinov dohromady (napr. proteín a nejaká Fc oblasť). Peptidové spojenie je často rada aminokyselín, ako sú predovšetkým glycín a (lebo) sérin. Preferovaným peptidovým spojením je zmesná rada predovšetkým glycínových a sérinových zbytkov, ktorá má dĺžku asi 10 - 15 aminokyselín.
Ďalej používaný výraz „multimetrický označuje stabilné spojenie dvoch alebo viac proteínových podjednotiek kovalentnými alebo nekovaleritnými interakciami, napr. disulfidovou väzbou.
Ďalej používaný výraz „dimerný označuje špecifickú multimernú molekulu, kde sa dve proteínové podjednotky viažu stabilne kovelentnými alebo nekovalentnými interakciami. Stabilný komplex je komplex s rýchlosťou disociácie alebo rozkladu aspoň niekoľko minút (takže komplex by mal byť stabilný po dobu dostačujúcu pre jeho in vivo použitie k dosiahnutiu cieľového tkaniva a k biologickému efektu. Fc fragment sám o sebe typicky formuje dimér fragmentov ťažkého reťazca obsahujúceho časť hlavnej oblasti, CH2 doménu a (lebo) CH3 doménu. Veľa proteínových ligandov je však známych tým, že sa viažu ku svojim receptorom ako diméry. Ak . cytokín X dimérizuje prirodzene, X-časť v molekule Fc-X, potom bude dimérizovať v omnoho väčšej miere, pretože dimérizačný proces je závislý na koncentrácii. Fyzikálna podobnosť dvoch X častí spojených Fc môže vyvolať medzimolekulovú dimerizáciu silno posúvajúcu rovnováhu v prospech diméru a posilujúcu jeho väzbu k receptoru.
Výraz „bacilonosič tu znamená akúkoľvek nukleovú kyselinu obsahujúcu nukleotidové sekvencie schopné inkorporácie do hostiteľskej bunky, rekombinácie a integrácie s génom hostiteľskej bunky, prípadne autonómnej replikácie ako episom. Medzi takéto bacilonosiče patria lineárne nukleové kyseliny, plazmidy, fagemidy, kosmidy, bacilonosiče RNA, vírové bacilonosiče a iné. Neobmedzené množstvo príkladov vírových bacilonosičov poskytujú retrovíry, adenovíry a k nim pridružené víry.
Výraz „výskyt génu alebo „výskyt proteínu znamená v tomto prípade transkripciu sekvencie DNA, transláciu prepisu mRNA, a ďalej buď sekréciu proteínového produktu alebo produkovanie proteínového produktu v izolovanej forme.
Výraz „imunocytokín tu znamená fúzny protein obsahujúci protilátku a cytokín, ako sa popisuje v US patentu č. 5 650 150.
Výraz „hlavná sekvencia tu znamená proteínovú sekvenciu, ktorá sa viaže, najčastejšie N- zakončeniam, k druhej proteínovej sekvencii a riadi vylučovanie druhej proteínovej sekvencie z bunky. Hlavná sekvencia sa obyčajne rozštiepi a oddelí sa od druhej proteínovej sekvencie, ktorá sa stane vyvinutým proteínom. Výraz „hlavná sekvencia sa obecne nahradzuje synonymom „signálna sekvencia.
„EpCAM tu označuje adhéznu molekulu epiteliálnej bunky (Cirulli et al., 1998, 140 1519-1534) a je synonymom ku „KSA, znamenajúcu antigén viazaný monoklonálnou protilátkou. KS-1/4. EpCAM je protein povrchu bunky, ktorý sa hojne vyskytuje na rakovinných bunkách pochádzajúcich z epiteliálnych buniek.
Výraz „KS-1/4 sa používa ďalej k označeniu špecifickej monoklonálnej protilátky, ktorá sa viaže k EpCAM.
„KS-IL2, „KS-IL12 a „KS-IL12-IL2 (a iné) predstavujú fúzne proteíny protilátkového cytokínu obsahujúci KS-1/4 s interleukínom-2, KS-1/4 s interleukínom-12, resp. KS-1/4 s interleukínom-2 i interleukínom-12. Používajú sa tiež iné analogicky pomenované štruktúry fúznych proteínov. Je to preto, že cytokíny môžu fúzovať k niekoľkým miestam na molekule protilátky, takže popis triedu proteínov obsahujúcich ako „KS-IL12-IL2 označuje
KS-1/4 s interleukínom 12 akejkoľvek možnej pozícii, inak.
i interleukínom 2 fúzovaných na pokiaľ nie je explicitne stanovené používaný výraz „14.18 označuje protilátku, antigénu GD2 .
Ďalej monoklonálnu špecifickému
Niektoré názorné ktorá sa viaže špecifickú nádorovo používaných v
Časti molekúl predloženom na obrázkoch 2 príklady vynáleze fúzne proteíny ukázané na obrázkoch akýkolvek fúzny proteín z obrázku 1 môže proteínom. Cytokíny sa znázorňujú konštantnej oblasti protilátok sú a ľahký reťazec premenných oblastí sa vyjadruje oválmi.
proteínových ukazujú obrázky označené 1Ά-ΙΙ, predstavujú a ukazujú, že fúzovať k' iným štvoruholníky, oválne, zatiaľ štruktúr
5.
1A-II ďalej ako čo ťažký označenými
Predložený vynález popisuje proteínové ľubovoľne ďalšie dva rôzne cytokíny Homodimerický cytokín interferón γ, IL-5, viacnásobné podjednotky, heterodimerický cytokín, ktoré sú rozdielne, (napr.
IL-8 je ako i heterodimerická forma
-interferón obsahujúce časti.
komplexy proteínové a, inteferón β,· a iné) , ale i keď obsahuje jednoduchým cytokínom. Podobne IL-2, i keď obsahuje podjednotky/ jednoduchým cytokínom. Dokonca je normálne homodimerického cytokínu, ako heterodimér MCP-l/MCP-2, alebo dvoch aliel normálne homodimerického cytokínu (napr. Zhang J. (1994), J. Biol.
Chem. 269, 15918-15924), je jednoduchým cytokínom. Komplexy uvádzané v predloženom vynáleze obsahujú dva rôzne cytokíny (napr. IL-2 a IL-12; 11-4 a GM-CSF; MCP-1 a eotaxín; atd.), z ktorých každý je schopný modelovať aktivitu bunky imunitného systému.
Obrázok 1A znázorňuje najdôležitejší bod tohto vynálezu: fúzny proteín (10) fúzuje C- zakončením prvého cytokínu (12) k N- zakončeniu druhého cytokínu (14), lubovolne cez spojovaciu oblasť (nie je zobrazené). V niektorých bodoch vynálezu proteínový komplex obsahuje aspoň dva cytokíny s výrazne rozdielnym sérovým polčasom. Napríklad výsledkom použitia malého a veľkého proteínu je často fúzny proteín s cirkulujúcou polčasnou charakteristikou najdlhšieho proteínu. Preto v prípade, že sa požaduje kombinácia účinku
IL-2 a a druhého cytokínu, je výhodné použiť fúzny proteín obecného vzorca: I1-12-X alebo X-IL-12, kde X je druhý cytokín. Tento proces prináša dve špecifické výhody. Po prvé sa predĺži sérový polčas rýchlejšie sa uvoľňujúceho cytokínu, po druhé sa stanú veľmi podobné.
sérové polčasy oboch cytokínov vzájomne
Dvoj reťazcový cytokín ako IL-12 môže fúzovať k inému cytokínu na Ndvojreťazcového alebo cytokínu.
fúzuje buď k Nzakončeniu
IL-12,. p35 alebo p40 (obr.
C- zakončenie každého reťazca
V jednom prípade, druhý alebo k- C- zakončeniu podjednotiek
1B - 1E) . Vo fúznom proteínu (16 ( cytokín na obrázku „zakončeniu
1B, N- zakončenie prvého cytokínu (12) fúzuje k C podjednotky IL-12, p40 (18). Podjednotka p40 (18) sa spojí s podjednotkou IL-12, p35 (20) kovalentnou väzbou (22). Vo fúznom proteínu (24) na obrázku 1C, N- zakončenie podjednotky p40 (18 ( fúzuje k C- zakončeniu prvého cytokínu (12) a viaže sa k podjednotke p35 (20) kovalentnou väzbou (22). Obrázok 1D ukazuje fúzny proteín (26), kde N- zakončenie prvého cytokínu (12) fúzuje k C- zakončeniu podjednotky p35 (20), ktorá sa viaže kovalentnou väzbou (22) k podjednotke p40 (18) .
V druhom prípade podjednotky IL-12 môžu fúzovať za vzniku jednoreťazcového proteínu scIL-12 s podjednotkou buď p35 alebo p40 na N- miesto; druhý cytokin sa môže napojiť na N- alebo C- zakončenie výsledného scIL-12 (obr. 1F - II) . A teda v najlepšom prípade, ktorý ukazuje obrázok 1F, fúzny proteín (30) obsahuje jednoreťazcový IL-12, kde A- zakončenie podjednotky p410 (18) fúzuje k C- zakončeniu podjednotky p35 (20), ľubovoľne cez peptidovú väzbu. V tomto prípade Nzakončenie cytokinu (12) fúzuje k C- zakončeniu podjednotky p40 (18) . V prípade zobrazenom na obrázku IG, N- zakončenie podjednotky p35 (20) fúzuje k C- zakončeniu cytokinu (12), ľubovoľne cez peptidovú väzbu. Obrázky 1 H a I ukazujú fúzne proteíny (34 a 36) obsahujúce inú jednoreťazcovú verziu IL12, kde A- zakončenie podjednotky p35 fúzuje k C- zakončeniu podjednotky p40, ľubovoľne cez peptidovú väzbu. Vo fúznom proteínu (34) ukázanom na obrázku 1H N- zakončenie podjednotky p40 (18) fúzuje k C- zakončeniu cytokinu (12). Vo vysoko preferovanom prípade IL-12 fúzuje k IL-2. ·.·
Výrobu takýchto molekúl znázorňujú príklady uvedené ďalej.
Často je výhodné vyjadriť heteromultimerické molekuly, akými sú IL-12 alebo protilátka, ako jednoreťazcové molekuly, u ktorých sa nerovnaké podjednotky spojujú krátkymi amínokyselinovými väzbami (Huston et al. (1998), Proc. Nat. Acad. Sci. 85, 5879; Lieschke et al. (1997), Nat. Biotechnol. 15, 35; Lieschke G. j: and Muligan R.C., US Patent No. 5 891 680) . Zostaví sa génová fúzia, a potom sa požadovaný proteín objaví v bunkách obsahujúcich stavbu jednoduchej rekombinovanej DNA. tieto jednoreťazcové verzie heteromultimerického cytokinu ďalej fúzuj ú k druhému cytokinu, ktorý ešte umožňuje pôsobenie fúzneho proteínu požadovanej aktivity zo skladby jednoduchej rekombinovanej DNA. Pôsobenie tých molekúl ilustrujú príklady tohto vynálezu.
Vynález tiež popisuje fúzny proteín obsahujúci IL-4 a GMCSF. Táto kombinácia sa obzvlášť hodí pre pôsobenie funkčne stimulovaného antigénu pomocou dendritických buniek. Iná použiteľná fúzia obsahuje IL-12 a IL-18. Obidva tieto cytokíny podporujú odozvu Thl, ale majú rozdielnu doplnkovú aktivitu.
Vynález tiež popisuje fúzne proteíny, v ktorých rozdielne násobné fúzované cytokíny ďalej fúzujú k proteínom schopným tvoriť multiméry, ako sú homodiméry alebo heterodiméry. Výhodou takejto molekuly je, že sa dimerizáciou môže zvýšiť účinnosť jedného alebo viacej cytokinov. ’ V niektorých prípadoch sa zvýšenie účinnosti dimerizáciou prejaví preto, že sa cytokín viaže k jeho receptoru ako dimér. V jednom prípade násobné cytokíny fúzujú k časti molekuly protilátky, ako je Fc oblasť (obr. 2). V inom prípade IL-12 a druhý c fúzujú k homodimérizovanej proteínovej časti. Preferuje sa, keď druhým cytokinom je IL-2 alebo GM-CSF. Fúzne proteíny sa môžu tvoriť rôznymi cestami odrážajúcimi -všetky možnosti usporiadania niekoľkých rozdielnych proteínových častí z Nalebo C- zakončení fúzneho proteínu. Napríklad, ak interleukín-12 a druhý cytokín fúzujú k Fc oblasti, dva cytokíny obidva fúzujú k N- alebo C- zakončení Fc oblasti v ľubovoľnom poradí, alebo jeden cytokín fúzuje k N- zakončení a druhý k C - zakončení.
Niektoré z týchto obmien znázorňuje obrázok 2. Napríklad v prípade ukázanom na obrázku 2A fúzny proteín (44) tohto vynálezu fúzuje k C- zakončení Fc oblasti obsahujúci otočnú oblasť (38), CH3 oblasť (42). Fúzny proteín (44) môže mať rôzne štruktúry vrátane napríklad štruktúry fúznych proteínov 10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34 alebo 36 zobrazených na obr. IA II. Ak má fúzny proteín (44) viacej než jedno N- a Czakončení, ako je tomu u fúznych proteínov 16, 24, 26 a 28, FC oblasť fúzuje k jednému z N- zakončení fúzneho proteinu (44) . Ako ukazuje obrázok 2B, fúzny proteín (44) môže fúzovať k Nzakončeni Fc oblasti. V prípade znázornenom na obrázku 2C, prvý cytokín (12) fúzuje k N- zakončení Fc oblasti a druhý cytokín (14) fúzuje k C- zakončení Fc oblasti.
Štruktúrna úvaha
Je dôležité poznamenať, že cytokíny, ako trieda proteinov, sú podobnej veľkosti a obecnými skladbovými vlastnosťami. Špecifické príklady zahrnuté v tomto vynáleze teda ukazujú, ako zostaviť fúzne proteíny násobného cytokínu pre skupinu cytokínových proteinov. Napríklad mnoho cytokínov spadá do proteínovej skladby nazývanej „štvorhelixový zväzok. Štvorhelixové proteíny obsahujú stimulačný faktor granulocytovej . kolónie ......- (G-CSF) , interleukín (IL-6), leukemický inhibičný faktor (ILF), rastový - hormón, ciliárny neurotrofický faktor (GNTF), leptín, erytropoietín, stimulačný faktor granulocyt-makrofágovej kolónie (M-CSF), IL-2, IL-4, interleukín (IL-3), IL-10, interferón β, interferón a a veľmi podobný interferón τ, a tiež interferón γ (IFN- y).
Mimo IL-5 a IFN- γ sa všetky tieto proteíny skladajú ako monoméry so štyrmi zhruba paralelnými α-helix a dvomi prekríženými väzbami. V každom prípade okrem IL-5 a IFN- y sú N- a C - zakončení na rovnakej strane proteinu. Vzhľadom k tomu, že proteíny štvorhelixového zväzku okrem 11-5 a IFN- y majú rovnaký skladobný, vzorec, je metóda popísaná ďalej pre IL-2, IL-4 a GM-CSF aplikovateľná tiež na iné štvorhelixové proteíny a iné malé cytokínové proteíny, ktoré sa skladajú ako monoméry.
Chemokíny sú špecifickou triedou cytokínov, extracelulárnych dráhy špecifických predpokladá tvorba u ktorej sa gradientov a sprostredkovanie chemickej imunitných
Napríklad MCP-1 makrofágov a aktivovaných chemoatraktantom pre buniek.
je chemoatraktantom buniek;
monocytov, eotaxín je eosinofily a interleukín-8 je chemoatraktantom neutrofilov. Okrem funkcie chemoatraktantov, sú chemokíny rovnako ako iné cytokíny, schopné indukovať pôsobenie špecifických génov v špecifických cieľových bunkách. Napríklad MCP-1 pravdepodobne vyvoláva pôsobenie tkaninového faktoru vo vaskulárnych bunkách hladkého svalstva (Schecter et al., 1997, J.Biol. Chem. 272, 28568-28573).
Vynález zahrňuje fúzie cykotín-cytokin a protilátka cytokín-cytokín, kde . jeden alebo viacej cytokínov sú chemokíny. Vynález tiež zahrňuje proteínové skladby s tromi alebo viacerými cytokínml·;, kde jeden alebo viacej cytokínov sú chemokíny. Napríklad chemokíny IP-10, RANTES, MIP-Ioí, ΜΙΡ-1β, makrofágové chemoaktraktívne proteíny, eotaxín, lymfotaktín, BLC fúzuje k. druhému cytokínu, ktorý obsahuje alebo neobsahuje inú súčasť, ako napríklad protilátku.
Ľudský génom, napríklad, kóduje aspoň 50 chemokínov. Známe chemokíny sa obecne podieľajú na jednoduchej tridimenzionálnej monomernej štruktúre a vzorci proteínovej skladby. V súlade s tým sa obecné typy proteínových štruktúr a ich konštrukčné stratégie zahrnuté v tomto vynáleze môžu aplikovať na rôzne známe alebo doposiaľ neobjavené chemokíny.
Chemokíny majú rôznu skladbu s tromi β-vetvami a jedným ahelix. Chemokíny sa skladajú ako monoméry a niekedy, ale nie vo všetkých prípadoch, potom po naskladaní dimerizujú. Pre všetky chemokíny je skladobný vzorec monomernej podjednotky identický a bežné štruktúry sú extrémne podobné. Napríklad tridimenzionálne štruktúry Inteleukínu-8, Platelet faktoru 4, stimulačnej aktivity melanomatického rastu (MGSA), proteinu zápalového makrofágu MIP, RANTESu (regulovaná pri aktivácii, normálna T-bunka vyjadrená a vylučovaná) , monocytického chemoatraktívneho proteinu-1 (MCP-1,
MCAF) , Eotaxínu, monocyt i ckého chemoatraktívneho proteinu-3 (MCP-3), chemokínovej domény fraktalkínu, peptid-2 aktivujúci neutrolfil (NAP-2), faktoru stromatickej bunky (SDF-1), proteinu zápalového makrofágu-2, chemokínu hcc-2 (proteín zápalového makrofágu-5), Gro β, neutrofilného chemoatraktantu indukujúceho cytokíny a GINC/Gro sa určili RTG kryštalografiou a (lebo) metódami NMR; všetky tieto štruktúry vykazujú rovnakú skladbu a sú si obecne podobné. Pretože chemokiny majú rovnaký skladobný vzorec, metódy popísané ďalej pre lymfoaktin sa tiež aplikujú na iné chemokínové proteíny.
Voľné N- zakončenia chemokínov sú často dôležité pre ich funkciu. Preto je. v niektorých prípadoch výhodné zostaviť fúzie, v ktorých druhý cytokín, protilátka a iná proteínová časť môžu fúzovať k C- zakončeniu chemokínu. Pre zostavenie proteínového komplexu obsahujúceho dva aktívne chemokiny je vhodné napríklad fúzovať dva rôzne cytokíny k N- zakončeniu ťažkého a ľahkého reťazca protilátky. Niektoré chemokiny, ako
IL-8, sú dimerické- za fyziologických podmienok. Pre určité aplikácie j e výhodné spoluvyjadriť fúziu násobného cytokínu a protilátky, ako je fúzia IL-8-protilátka-cytokín, spoločne s nefúzovanou časťou
IL-8 alebo s IL-8 s rozdielnym fúznym partnerom, ktorý neinteraguje s protilátkou. Pri tomto postupe môžu rôzne časti IL-8 heterodimérizovať bez priestorového obmedzenia alebo, pokiaľ všetky časti IL-8 fúzujú k reťazcu protilátky, môže dôjsť k polymerizácii. Požadovaný fúzny proteín násobného cytokínu sa potom oddelí na základe veľkosti alebo podľa väzby s proteínom viazacím protilátku, akým je napríklad Stafylokokus A.
Pre fúzne proteíny násobného cytokínu obsahujúci chemokíny je prvoradé, aby fúzny proteín zahrňoval tiež lokalizované funkcie, ako časti protilátky viazanej na antigén. Bez ohľadu na teóriu sa obecne predpokladá, že rozšírenie chemokínu po tele nemá žiadny účinok alebo vedie k obecnému znecitliveniu buniek voči tomuto chemokínu. Naviac sa predpokladá, že chemoatraktívna funkcia chemokínu sa uplatní iba v prípade koncentračného rozdielu chemokínu.
Významnou látkou je fúzny proteín lymfokín-protilátkainterleukín-2. Inými významnými látkami sú tie, kde ako chemokín, tak druhý cytokín podporujú odozvu Thl. Napríklad fúzny proteín obsahujúci IP-10 a IL-12 je jednou z vysoko preferovaných látok.
Predĺženie polčasu násobných cytokínov s krátkym sérovým polčasom
Predložený vynález tiež popisuje fúzne proteíny obsahujúce dva cytokíny, obidva s krátkym sérovým polčasom, ktoré fúzujú k tretej časti s dlhým sérovým polčasom. Napríklad, ak sa vyžaduje stimulácia dendritických buniek, je výhodné kombinovať aktivity IL-4 a GM-CSF (Thurner (1999), J. Immunol. Methods 223, 1-15; Palucka et al. (1998), J. Immunol. 160, 4587-4595). Pretože IL-4 i GM-CSF sú malé molekuly s krátkym sérovým polčasom, je výhodné zostaviť fúzny proteín obsahujúci FC oblasť, IL-4 a GM-CSF. Výsledná molekula je silným stimulantom rastu a aktivity dendritických buniek. Podobne môžu IL-4 a GM-CSF fúzovať k cieľovému komponentu, ako je protilátka, aby sa kombinovaná aktivita cytokínov doručila k bunkovým miestam nesúcim dopredu daný antigén.
Fc oblasť samotná, alebo ako súčasť intaktnej protilátky, prepožičiava násobnému cytokínu niektoré vlastnosti, ktoré môžu byť výhodné alebo nevýhodné v závislosti na špecifické aplikácie, tieto vlastnosti zahrňujú dimerizáciu, predĺženie sérového polčasu, schopnosť fixovať doplnkovú zložku, schopnosť sprostredkovať bunečnú cytoxicitu závislú na protilátke požiadavkou vlastnosti (ADCC) a viazať predĺženie oblasti :
Fc preferuj e sa použitie variantom alebo sa k Fc receptorom. Ak sérového polčasu sú nedôležité alebo
Fc oblasti, ktorá mutantom, ktorému schádza j e primárnou imunologické zanedbateľné, je prírodným jedna alebo viacej imunologických vlastností.
Napríklad, ak je žiadúce vyrovnať a predĺžiť sérové polčasy dvoch alebo viacej cytokinov s krátkymi sérovými polčasmi, je výhodné zostaviť rozmanitý cykotínový fúzny proteín obsahujúci Fc oblasť z ľudského IgG2 alebo IgG4, ktoré majú redukovanú alebo nulovú afinitu voči Fc receptorom, alebo použiť Fc oblasť nesúcu mutáciu v mieste viazacím Fc receptor. V skutočnosti sa už ukázalo, že ;fúzia niektorých cytokinov k protilátkam zvyšuje afinitu fúzneho proteínu k Fc receptorom, a že to vedie k rýchlejšiemu odstráneniu u živočíchov. Ukázalo sa, že použitie Fc oblasti s redukovanou afinitou k Fc receptorom veľmi zlepšuje sérový polčas týchto molekúl (Gillies et al. (1999), Cancer Res. 59, 2159-2166). Za určitých okolnosti a podľa použitých cytokinov, Fc oblasť, ktorá viaže Fc receptor, má za následok internalizáciu mnohopočetného cytokínového fúzneho proteínu a degradáciu jednej alebo viacej cytokinových časti.
Smerovaní e
Vynález tiež popisuje fúzne proteíny, v ktorých sa dva alebo viacej cytokinov pripojí k proteínu schopnému lokalizovať cytokíny do jednotlivej smerovej molekuly, bunky, alebo ich umiestiť vcelku. Preferovanou molekulou s lokalizačnou schopnosťou je protilátka alebo časť obsahujúca rôzne oblasti protilátky, ktoré viažu antigén. Môžu sa však použiť i iné lokalizačné molekuly alebo ich domény, ako sú špecifické ligandy alebo receptory, prírodné sa vyskytujúce väzobné proteíny, enzýmy viazané k jednotlivým substrátom, umele generované peptidy, ktoré sa delia podlá väzobnej a lokalizačnej schopnosti, peptidy s výraznými fyzikálnochemickými vlastnosťami, ktorých výsledkom je schopnosť smerovanie, proteíny majúce smerové schopnosti vďaka väzbe k inej molekule, ktorá je smerovaná, alebo k inému typu proteínov. V prípade fúzie dvoch cytokínov k smerovej molekule je preferovaným prvým cytokínom IL-12. Keď sa použije IL-12, preferovaným druhým cytokínom je IL-2 alebo GM-CSF.
V prípade protilátok existuje vela ciest, ktorými fúzujú dva alebo viacej cytokínov, pretože je tu niekoľko miest možného pripojenia. Napríklad protilátka IgG sa skladá z dvoch ťažkých a dvoch ľahkých reťazcov. Dva cytokíny môžu fúzovať navzájom, a potom fúzujú k N- a C- -zakončeniu buď ťažkého alebo ľahkého reťazca. Alternatívne sa každý cytokin fúzuje samostatne k jednému z. N- alebo C- zakončeniu molekuly protilátky.
Obrázok 3 znázorňuje u dvoch cytokínov spôsob fúzie na molekulu protilátky. Napríklad podľa obrázku 3A fúzny proteín (44) tohto vynálezu sa fúzuje k C- zakončeniu imunoglobulínového ťažkého reťazca (46), spojeného s imunoglobulínovým ľahkým reťazcom (48). Ako ukazuje obrázok 2, fúzny proteín (44) môže mať radu štruktúr, vrátane napríklad štruktúr fúznych proteínov 10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34 alebo 36 znázornených na obrázkoch 1A až II. Ako ukazuje obrázok 3B, fúzny proteín (44) sa môže fúzovať k N zakončeniu imunoglobulínového ťažkého reťazca (46) spojeného s imunoglobulínovým ľahkým reťazcom (48). V usporiadaniach znázornených na obrázkoch 3C a 3D sa fúzny proteín (44) fúzuje k N- zakončeniu (obr. 3C) alebo C- zakončeniu (obr. 3D) imunoglobulínového ľahkého reťazca (48) spojeného s imunoglobulínovým ťažkým reťazcom (46). Ako ukazujú obrázky 3E a 3F, prvý cytokín (12) môže fúzovať k imunogl obul í novému lahkému reťazcu (48) spojenému s imunoglobulínovým ťažkým reťazcom (46) fúzovaným k druhému cytokínu (14). Cytokíny (12 a 14) môžu fúzovať k N- zakončeniu (obr. 3E) alebo k Czakončeniu (obr. 3F) imunogobulínových reťazcov. Alternatívne prvý cytokín fúzuje k N- zakončeniu imunoglobulínového ľahkého reťazca (48), zatiaľ čo druhý cytokín (14) fúzuje k C zakončeniu imunoglobulínového ťažkého reťazca (46).
Fúzia k jednoreťazcovým protilátkam
Niekedy je výhodné vyjadriť protilátky ako jednoreťazcové molekuly. Vynález sa zaoberá tiež fúznymi proteinmi, v ktorých dva alebo viacej cytokínov . fúzuje k jednoreťazcovej protilátke. Výhodou toho je zníženie počtu použitých DNA štruktúr nesúcich požadovaný fúzny proteín, ktorý je zvlášť potrebný v génovej terapii. .Obzvlášť v prípade, kedy cytokíny sú jednoreťazcové molekuly, .fúzia cytokínov k jednoreťazcovej protilátke umožní pôsobenie jednoproteínového reťazca ako fúzneho proteínu.
Ako ukazujú obrázky 4A-4C, v niektorých prípadoch cytokíny fúzujú k jednoreťazcovej protilátke na ich N- zakončeniach, Czakončeniach alebo oboch zakončeniach. Napríklad, ako ukazuje obrázok 4A, fúzny proteín (44) fúzuje k C- zakončeniu jednoreťazcovej protilátky (50) majúcej variabilný ľahký reťazec (52) a variabilný ťažký reťazec (54). Ako ukazuje obrázok 4B, fúzny proteín (44) tiež fúzuje k N- zakončeniu jednoreťazcovej protilátky (50). V prípade znázornenom na obrázku 4C prvý cytokín (12) fúzuje k N- zakončeniu jednoreťazcovej protilátky (50) a druhý cytokín (14) k jej C zakončeniu.
dôležitým prípadom je fúzia IL-12 a druhého cytokínu k jednoreťazcovej protilátke. Najvýznamnejšie je použitie IL-2 alebo GM-CSF ako druhého cytokínu.
Stále oblasti protilátok majú schopnosť sprostredkovať radu erektorových funkcií. Napríklad
IgGl sprostredkuj e dodatočnú fixáciu,
ADCC a väzbu na Fc receptor.
Miesto, v ktorom cytokín fúzuje, môže zmeniť efektorovú funkciu stálych oblastí protilátky;
efektorové funkcie sú potrebné v prípade, že sa požaduje ich modulácia.
V niektorých prípadoch sa požaduje zostavenie fúzie dvoch alebo viacej cytokínov k časti so smerovou oblasťou protilátky, ale bez stálych oblastí. Taký- fúzny proteín je menší než fúzia kompletnej protilátky k dvom alebo viacej cytokinom, čo môže byť pre určité účely výhodné. Naviac takému fúznemu proteínu môže chýbať jeden alebo- viacej efektorových funkcií intaktnej protilátky, ale zachováva si ich smerovú schopnosť.
Cieľom predloženého vynálezu sú preto fúzne proteíny, v ktorých dva alebo viacej cytokínov fúzuje k jednoreťazcovej oblasti Fv. Ako ukazuje príklad znázornený na obrázkoch 5A-5C, dva cytokíny môžu fúzovať k N- zakončeniu alebo C- zakončeniu Fv oblasti, alebo jeden cytokín ku každému z nich. Napríklad, ako ukazuje obrázok 5A, fúzny proteín (44) tohto vynálezu môže fúzovať k C- zakončeniu jednoreťazcovej Fv oblasti obsahujúcej imunoglobulínový variabilný ľahký reťazec (52) a imunoglobulínový variabilný ťažký reťazec (54). Fúzny proteín (44) môže tiež fúzovať k N- zakončeniu Fv oblasti, ako ukazuje obrázok 5B. Podľa obrázku 5C prvý cytokín (12) môže fúzovať k N- zakončeniu Fv oblasti a druhý cytokín (14) k jej C- zakončeniu.
Protilátky ako heterodimerický nositelia viacnásobných cytokínov
Za určitých okolnosti sa požaduje zostaviť fúziu dvoch alebo viacej cytokínov, kde pre dva z týchto cytokínov je z hladiska aktivity významný rovnaký koniec proteínu. Napríklad, prírodné sa vyskytujúce N- zakončenie dvoch rôznych cytokínov je zásadný pre aktivitu každého z nich. Nie je možné zostaviť fúzny proteín s jednoduchým polypeptidovým reťazcom, kde by obidve cytokínové časti boli aktívne.
Protilátky sú heterodimérické proteíny skladajúce sa z ťažkých a ľahkých reťazcov, ktoré sa kovalentne viažu disulfidovými väzbami. Ak sa požaduje zostaviť viacnásobný cytokínový fúzny proteín s dvomi cytokínovými časťami, ktoré obidve vyžadujú intaktné nefúzne N- zakončenie, je vhodné oddelene fúzovať dva cytokíny k N- zakončeniu ťažkých a ľahkých reťazcov protilátky (obr. 3E). Podobne, ak sa požaduje zostaviť viacnásobný cytokínový fúzny proteín s dvomi cytokínovými časťami, ktoré obe vyžadujú intaktné nefúzne Czakončenie, je vhodné oddelene fúzovať dva cytokíny k Czakončeniu ťažkých a lahkých reťazcov protilátky (obr. 3F) . Ak sa protilátka používa výhradne ako nositeľ k spojeniu dvoch cytokínov týmto spôsobom, je užitočné mutovať alebo vymazať tie časti protilátky, ktoré preukazujú ďalšie vlastnosti týkajúce sa imunitnej funkcie. Napríklad, Fab oblasť sa predovšetkým používa ako nositeľ, pretože si ponecháva heterodimérizačný rys protilátky, ale chýba jej funkcia charakteristická pre Fc oblasť. Tiež sa môže použiť protilátka alebo jej fragment, u ktorých je spojujúce miesto antigénu nefunkčné.
Pri fúzii viacnásobných cytokínov k protilátkam sa kombinuje veľa nových rysov tohto vynálezu. U fúzie viacnásobných cytokínov v protilátkach sa sérový polčas cytokínov vyrovná a rozšíri; aktivita oboch cytokínov sa lokalizuje do cieľového miesta a vyvaruje sa predovšetkým toxickým účinkom vyvolaným systematickým dávkovaním viacnásobných synergicky aktívnych cytokínov; každý cytokín je efektívne dimérizovaný alebo multimérizovaný; a konečne cytokíny nepotrebujú fúzovať priamo, ale môžu fúzovať k rôznym miestam na ťažkých á ľahkých reťazcoch molekuly protilátky.
Pri navrhovaní fúzneho proteínu obsahujúceho viacnásobné cytokíny a protilátku existuje rada možností a konfigurácií významných pre bežné experimentovanie. Je užitočné začleniť tiež štrukturálnu biológiu. Napríklad veľa cytokínov spadá do triedy nazývanej zväzky 4-helix. Tieto štruktúry pozostávajú zo štyroch α-šrúbovíc a majú N- zakončenie a C zakončenie v tej istej oblasti. Obecne, oblasť cytokínu okolo N- a Czakončení sa nepoužíva k väzbe na cytokínový receptor, takže sa k fúzii k protilátke alebo druhému cytokínu používa koniec. Niekedy je však obtiažne priamo fúzovať N- i C- zakončenie 4helix zväzkov cytokínov k rôznym častiam zo sterických dôvodov. Keď sa vyžaduje fúzia dvoch ..rôznych 4-helix zväzkov cytokínov k protilátke, je užitočné fúzovať každý cytokín k inému miestu protilátky, alternatívne, ak je nutné zostaviť polypeptidový reťazec vzorca Ig reťazec-cytokín-cytokín, môže sa použiť jeden alebo viacej flexibilných spojok k prekonaniu sterických problémov.
Miesto protilátky je tiež možné použiť iné sekrétované heterodimérické molekuly ako nositelia viacnásobných cytokínov. Napríklad sa môžu použiť komplex obsahujúci na prostatu špecifický antigén a inhibítor proteázy, s ktorým tvorí komplex, IgA ťažký reťazec a J reťazec, členovia TGF28 beta skupiny a ich väzobní partneri na základe astacínu alebo
IL-12.
Nukleové kyseliny
Vynález tiež charakterizuje nukleové kyseliny vyjadrujúce každý z vyššie uvedených typov proteinov. To zahrňuje nukleové kyseliny kódujúce fúzne proteíny obsahujúce dva alebo viacej cytokínov, fúzie obsahujúce dva alebo viacej cytokínov a dimérizačnú doménu ako je Fc oblasť, fúzie obsahujúce dva alebo viacej cytokínov fúzovaných k protilátke a dva alebo viacej cytokínov fúzovaných k Fv oblasti. Preferovanými formami nukleových kyselín sú DNA bacilonosiče, v ktorých sa fúzne proteíny vyskytujú buď v baktériách alebo cicavčích bunkách. Pre fúzne proteíny obsahujúce viacnásobné polypeptidové reťazce sa použije viacej než jedna kódovaná nukleová kyselina. Alternatívne môže byť užitočné umiestniť dve alebo viacej sekvencií kódujúcich fúzny proteín na jednu molekulu nukleovej, kyseliny. V príkladoch tohto čiastočne znázorňujú formy charakterizovaných kyselín kódujúcich násobné cytokiny.
kyseliny sa v tomto k vyjadreniu fúznych k ich príprave alebo pre syntetizácie účinných rovnako ako skúšky testujúce vynálezu sa nukleových
Nukleové predovšetkým cytokínov, buď
Metódy vynálezu, .vynáleze proteinov účely génovej predmetov ich používajú násobných terapie.
predloženého farmakologickú aktivitu, popisujú príklady.
Predložený vynález prináša tiež farmaceutické zloženie a metódy ich využitia pri liečbe a prevencii širokej škály ochorení vrátane liečby rôznych infekcií a rakoviny (ale nielen ich), ale tiež pri vakcinácii proti rade chorôb. Fúzne proteíny násobných cytokínov sa používajú k liečbe bakteriálnych, parazitických, hubovitých a vírových infekcií alebo rakoviny. Napríklad IL-12 má ochranné účinky u mnoho typov infekcií vrátane infekcií s baktériou Listeria monocytegenes, parazity Toxoplasma gondii, Leishmania major a Schistosoma mansoni; hubami Candida albicans a vírmi choriomeningitídy a cytomegalovíry (ale nielen tieto). Pretože cytokíny obecne pôsobia v kombináciách, je často účinné použiť fúzne proteíny obsahujúce dva alebo viacej cytokínov, o ktorých sa vie, že pôsobia synergicky. Napríklad, pretože IL-2 zosiluje pôsobenie IL-12, je vhodné kombinovať tieto cytokiny pri liečbe bakteriálnych, parazitických, hubovitých a vírových ochoreniach.
Preferovanou metódou liečby infekčných ochorení je použitie fúznych proteínov násobných cytokínov, ktoré ďalej fúzujú k smerovým činidlám, ktoré umiestnia násobný cytokin na miesto infekcie. Rôzne smerové stratégie sa popisujú nižšie.
Farmaceutické zloženie podlá tohto vynálezu sa môže použiť v pevnej, polopevnej alebo kvapalnej dávkovacej forme, teda ako pilulky, kapsle, prášky, kvapky, suspenzie a iné, ale predovšetkým v dávkovacích jednotkách vhodných k aplikácii presných dávok. Zloženie zahrňuje bežný farmaceutický nosič alebo masťový základ, a ďalej môže obsahovať iné medicinálne činidlá, farmaceutické činidlá, nosiči, . adjuvans, apod. Masťový základ môže obsahovať ďalšie proteíny, ako napríklad ludský sérový albumín alebo plazmové proteíny. Aktuálne metódy prípravy týchto dávkovacích foriem sú známe alebo v odborných kruhoch samozrejmé. Zložka alebo preparát k aplikácii musí v každom prípade obsahovať také množstvo aktívnej zložky (zložiek), ktoré sú účinné pre dosiahnutie požadovaného efektu u liečeného subjektu.
Podávanie liekov sa realizuje niektorou z používaných foriem aplikácie účinných zložiek. Patrí sem metóda orálna, parenterálna alebo lokálna aplikácia a iných systémových foriem. Preferuje sa injekčná aplikácia.
Množstvo podávanej účinnej zložky závisí samozrejme na liečenom subjekte, závažnosti ochorenia, spôsobu aplikácie lieku a úsudku ošetrujúceho lekára.
Ako sa popisuje vyššie, cytokíny ako IL-2, IL-12, GM-CSF, IL-4 a iné sú použiteľné k liečbe rakoviny. Za určitých okolností je vhodné k liečbe rakoviny -použiť fúzny proteín násobných cytokínov z dôvodu jednoduchého podávania, zvýšeného .sérového polčasu jednej cytokínovej zložky a (lebo) kvalitnejšiu moduláciu relatívnych aktivít u dvoch cytokínov.
Preferovanou metódou liečby rakoviny je smerovanie cytokínov k príslušnému orgánu alebo tkanív, takže sa účinok cytokínov koncentruje a odstránia sa vedľajšie účinky systémovej distribúcie. Napríklad sa predpokladá, že fúzia viacnásobných cytokínov k Fc oblasti sa sústreďuje v pečeni, takže môžu byť užitočné pri liečbe nádorových ochorení pečene. Uprednostňuje sa metóda, pri ktorej fúzny proteín -viacnásobného cytokínu ďalej fúzuje k smerovému činidlu, ako je protilátka. Predovšetkým protilátky KS-1/4 a 14.18 sú zamerané proti nádorovo špecifickým antigénom (Varki N.M. et al. (1984), Cancer Res. 44, 681-687; Gillies et al. (1989), Journal of Immunological Methods 125, 191; U.S. Patent No. 4 975 369 a 5 650 150). Keď sa použije fúzia násobného cytokínu k protilátke, je často výhodné zistiť- typ nádoru a vybrať protilátku zameranú proti antigénu prítomnému práve v takom type nádoru. Napríklad je vhodné charakterizovať nádor pomocou FACS analýzy, Western blot metódou, skúškou nádorovej DNA alebo jednoducho určením typu nádorovej bunky. Tieto metódy charakterizácie nádoru sú v odborných kruhoch dobre známe, predovšetkým u onkológov a nádorových biológov. Tiež je možné smerovať fúzny proteín viacnásobného cytokínu mnoho inými prostriedkami, ako je fúzia k špecifickým ligandom alebo receptorovým častiam, fúzie k peptidovým aptamérom s dopredu vybranou väzbovou aktivitou, chemická konjugácia k malým molekulám s lokalizovatelnými charakteristikami atd. Tieto smerové metódy sa môžu použiť k liečbe iných ochorení, ako sú infekcie.
Liečba rakoviny a iných bunečných porúch génovou terapiou
Nukleové kyseliny podlá tohto vynálezu ako činidlá génovej terapie pri liečbe rakoviny a iných ochorení, kde je potreba smerovať imunitný systém k špecifickému bunečnému typu. Napríklad rakovinné bunky sa odoberajú z ľudského alebo zvieracieho organizmu, do nich sa prenesie jedno alebo viacej nukleových kyselín kódujúcich fúzny proteín násobného cytokínu a rakovinné bunky sa potom vpravia späť do ľudského alebo zvieracieho organizmu. Alternatívne sa DNA vpraví do rakovinnej bunky na mieste. Ľudský alebo zvierací organizmus potom vytára imunitnú odozvu proti rakovinným bunkám, čo môže vyliečiť alebo znížiť priebeh rakoviny. Génová fúzia násobného cytokínu spoločne s odpovedajúcimi regulačnými prvkami podporujúcimi pôsobenie v cicavčích bunkách sa prenesie do rakovinných buniek raz z mnoho metód vrátane metódy fosforečnanu vápenatého, „génovej strely, adenovirových bacilonosičov, katiónových lipozómov, retrovirálnych bacilonosičov alebo niektoré iné účinné prenosné metódy. Nukleová kyselina môže kódovať fúzny proteín násobného cytokínu, ktorý ďalej fúzuje k iným častiam.
Protirakovinná génová terapia s nukleovou kyselinou nesúci fúziu viacej než jedného fúzneho cytokínu sa môže kombinovať s inou liečbou rakoviny, ako je liečba zvýšeným imunostimulačných vlastností fúzneho cytokínového proteínu. Napríklad nukleová kyselina podľa tohto vynálezu môže niesť i iné proteínové časti, ktoré pomáhajú pri vývoji imunitnej odozvy voči antigénom rakovinných buniek, alebo sa prenášajú spoločne s inými nukleovými kyselinami nesúcimi tieto proteínové časti. Zvlášť nukleové kyseliny nesúce spolustimulačný povrchový proteín B 7 sa spoluprenášajú do rakovinných buniek (Robinson et al. , U.S. Patent No. 5 738 852). Infikácia rakovinných buniek nukleovou kyselinou š fúziou viacnásobného cytokínu môže tiež doprevádzať liečbu s protilátkou alebo imunocytokínom, ktoré sa smerujú k rakovinným bunkám (Lode et al. (1998), Proc. Nat. Acad. Sci. 95, 2475). Infikácie rakovinných buniek nukleovou kyselinou s fúziou viacnásobného Cytokínu môže byť tiež súčasťou liečby pomocou blokácie angiogenézie (Lode et al. (1999)., Proc. Nat. Acad. Sci. 9, 1591).
Terapie používajúce ďalší imunostimulátory alebo blokátory angiogenézie sa môžu kombinovať so systematickou liečbou fúznymi proteínmi násobných cytokinov. Výhodou spoločnej liečby s ďalšími imunostimulátormi alebo blokátormi angiogenézie je to, že tieto liečebné postupy, na rozdiel od činidiel ničiacich DNA a blokujúcich bunečný cyklus, nezabijú imunitné bunky, ktoré sa môžu oddeliť stimuláciou fúznym proteínom násobného cytokínu.
Dôležitým bodom metódy génovej terapie je zaradenie jednej alebo viacej nukleových kyselín kódujúcich IL-12 a. druhého cytokínu do rakovinných buniek a následné zaradenie, týchto buniek do ľudského alebo zvieracieho organizmu. Druhým cytokínom je predovšetkým IL-2 alebo GM-CSF.
Predložený vynález prináša nové zloženie vakcíny a metódy obohatenie vakcín určených k ochrane bunečnej imunitnej odozvy proti určitým patogénom u vakcínovaných cicavčích hostiteľov s použitím dvoch alebo viacej fúzovaných cytokinov ako obohacujúcich adjuvans. Ak sa napríklad vyžaduje Thl imunitná odozva, fúzujú sa Thl podporujúce cytokíny a výsledné fúzne proteíny sa aplikujú do živočíšneho organizmu v kombinácii s antigénom.
Predovšetkým fúzujú a aplikujú sa spoločne s antigénom IL12 a IL-2. Alternatívne IL-12 a IL-2 ďalej fúzujú k vlastnému antigénnemu proteínu a slúži k stimulácii imunitnej odozvy. V tomto prípade sa vynález zameriava na vakcíny spoliehajúce na hostiteľskú bunečnú imunitu, t.j. vybudenie cytotoxických T lymfocitov a aktivovaných fagocytov k ochrane proti infekcii špecifického patogénu.' Je dôležité previesť.vakcináciu fúznymi proteínmi obsahujúcimi IL-12, IL-2 a antigén, pretože táto kombinácia smeruje Thl odozvu proti antigénu. Bežná adjuvans používaná pre ľudský organizmus,, ako je alum, majú sklony vyvolávať Th2 odozvu. Ak sa požaduje Th2 odozva, použije sa fúzna kombinácia cytokínov podporujúcich Th2. Napríklad je vhodné fúzovať IL-4 a IL-10 za vzniku jednoduchej molekuly a vzniknutý fúzny proteín použiť ako adjuvans. Obzvlášť ak je potreba posilniť dendritické bunky u živočíchov, fúzna kombinácia IL-4 a GM-CSF buď ďalej fúzuje s Fc oblasťou, aby napomohla väzbe k antigénovým bunkám, alebo ďalej fúzuje k protilátke schopnej smerovať fúzny cytokín . k cieľovému tkanivu, ako je nádor.
Predložený vynález prináša tiež nové terapeutické zloženie a;metódy obohohatenia vedúce k synergickému účinku s určitými terapeutickými zloženiami, vrátane tzv. „rakovinných vakcín< ktoré môžu obsahovať selektívny antigén vyskytujúci sa na rakovinnej bunke. Napríklad proteín obsahujúci dva alebo viacej fúznych cytokínov sa môže podávať priamo vhodnou cestu spolu s vhodne upravenými rakovinnými bunkami.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Procesy a iné predmety predloženého vynálezu, rovnako ako rada uvedených javov, sú lepšie pochopiteľné z nasledujúcich obrázkov a príslušného popisu. Obrázky sa číslujú tak, že určité číslo zodpovedá určitej štruktúre.
Obr. 1A schematicky znázorňuje fúziu dvoch cytokinov v ich najjednoduchšej forme: jeden cytokín fúzuje k druhému, ľubovoľne prostredníctvom väzby.
Obr. 1B - II ukazuje rôzne cesty, ktorými sa druhý cytokín označený ,cyt') môže pripojiť k heterodimérickému cytokinu IL-12. Presnejšie, druhý cytokín fúzuje k Czakončeniu p40 (obr. 1B), N- zakončenie p40 (obr.
1C), C- zakončenie p35 (obr. 1D), alebo N- zakončenia p35 (obr. 1E) . Obrázok 1 naviac ukazuje, ako druhý cytokín môže fúzovať k jednoduchému reťazcu IL-12. Konkrétne, jednoduchý reťazec molekúl IL-12 môže mať N- zakončenie k p40, s druhým cytokínom na C zakončení (obr. 1F) , alebo N- zakončenia (obr. IG) .
Obr. 2A-2C schematicky znázorňujú, ako fúzia viacnásobných cytokinov (ohraničených), ktoré zachytáva obrázok 1 môžu ďalej fúzovať k Fc oblasti protilátky, ukazované tu ako čap (H) , CH2 doména a CH3 doména (elipsy) .
Presnejšie, ktorákoľvek z ôsmich molekúl na obrázku .1 môže fúzovať buď k C- zakončeniu (obrázok 2A alebo .N zakončenia (obr. 2B) Fc oblasti. Naviac prvý cytokín a druhý cytokín (každý ohraničený) sa nemusí vzájomne viazať priamo, ale môžu sa spojiť cez Fc časť. (obr. 2C).
Obr. 3A-3G schematicky znázorňuje podskupinu ciest, kedy fúzny proteín viacnásobného cytokinu môže ďalej fúzovať k intaktnému imunoglobulínu, ako IgG. V oblasti ťažkého reťazca znázorňuje elipsa označená VH. V oblasti ľahkého reťazca znázorňuje VL a konštantné oblasti sú prázdne elipsy. Viacnásobné cytokínové
fúzie, ako znázorňuje obr. 1, sa môžu umiestniť na C-
zakončeniach ťažkého reťazca (obr. 2A) , N-
zakončeniach ťažkého reťazca (obr. 2B) , N-
zakončeniach ľahkého reťazca ( obr. 2C), alebo C-
zakončeniach ľahkého reťazca (obr. 2D) . Naviac,
existuje rada ciest, kedy prvý a druhý cytokín sa
Obr.
Obr.
Obr.
pripojujú oddelene na N- a C- zakončeniach ľahkých a ťažkých reťazcov; tri z nich ukazujú obrázok 3E-3G.
4A-4C schematicky znázorňujú, ako môžu prvý a druhý cytokín fúzovať k „jednoreťazcovej protilátke, kde sa fúzujú rôzne ľahké a rôzne ťažké reťazce a proteínom je jednoduchý polypeptid, ktorý potom homodimérizuje. Presnejšie, viacnásobná cytokínová fúzia sa môže umiestniť na C- zakončeniach (obr. 4A), alebo na N- zakončeniach (obr. 4B) . Naviac prvý a druhý cytokín sa nemusí viazať priamo, ale môže sa pripojiť cez jednoreťazcovú časť protilátky (obr. 4C) .
5A-5C schematicky znázorňuje, ako prvý cytokín a druhý cytokín môžu fúzovať k jednoreťazcovej Fv oblasti tvorenej fúzovanými rôznymi oblasťami z ťažkého a ľahkého reťazca. Konkrétne, prvá fúzia cytokíncytokín sa môže umiestniť na C- zakončeniach (obr. 5A), alebo na. N- zakončeniach (obr. 5B). Naviac prvý cytokín a druhý cytokín sa nemusí viazať priamo, ale môže sa pripojiť prostredníctvom jednoreťazcovej Fv oblasti (obr. 5C).
6A a 6B ukazujú synergiu medzi IL-12 a IL-2 v indukcii IFN-γ u ľudských periférnych krvných mononukleárnych buniek (PBMC) ako odozvu na jednotlivé cytokíny alebo fúzne proteíny. Na obrázku 6Ά sa bunky liečili ľudským IL-12 pred (štvorčeky), alebo po fytohemaglutinínovej aktivácii (krížiky), alebo fúznym proteínom IL-12-IL-2 pred (kosoštvorčeky), alebo po fytohemaglutinínovej aktivácii (trojuholníky). Obr. 6B znázorňuje experiment, kde sa bunky liečili zmesou IL-12 a IL-2 v normálnom pomere 1:1 (kosoštvorčeky),. ľudským fúznym proteínom Fc-IL12-IL-2 (štvorčeky) s fúznym proteínom ľudskej protilátky IL-12-IL-2 (prázdne trojuholníky). Osa x vyznačuje koncentráciu IL-12 v pg/ml prítomného ako intaktný proteín alebo ako fúzny proteín. Osa y ukazuje koncentráciu IFN-γ (v ng/ml), ktorá sa stanovila metódou ELISA.
Obr. 7 ukazuje typické bioanalýzy IL-12, kde sa oddelene meria aktivita fúzneho proteínu a porovnáva sa s nefúznou molekulou IL-12. To, čo je vyznačené, je stimulácia príjmu ľudským PBMC 3H-tymidínom v dôsledku myších IL-12 (prázdne krúžky), zmesi myších IL-12 a IL-2 v molárnom pomere 1:1 (plné štvorčeky!, myších IL-12 (prázdne trojuholníčky) a.: fúzneho proteínu myšej protilátky IL-12-IL-2 (plné kosoštvorčeky). Osa x vyznačuje koncentráciu monomérického cytokínu (cytokínu) (pM) prítomného ako intaktný proteín alebo ako fúzny proteín; osy y ukazuje cpm vstup tritiového tymidínu.
Obr. 8 ukazuje štandartnú skúšku bioaktivity
IL-2 .
Graf znázorňuje stimuláciu bujnenia myšej
CTLL bunky v dôsledku myšieho IL-2 (kolieska), v dôsledku fúzneho proteínu myšieho protilátkového
IL-12-IL-2 (kosoštvorčeky) a v dôsledku myšieho
IL-12 (štvorčeky).
Osa označuj e koncentráciu monomérického cytokínu (cytokínu) (pM) prítomného ako intaktný proteín alebo ako fúzny proteín. Bunky dozrievali v médiu obsahujúcom rôzne množstvo cytokínu alebo fúzneho proteínu po dobu 48 hodín, potom sa overil počet životaschopných buniek skúškou MTT/MTS. Osa y znázorňuje absorbáciu pri 490 nm jednotkách optickej hustoty (OD).
Obr. 9 znázorňuje stimuláciu príjmu 3H-thymidínu ľudskými PBMC v dôsledku myšieho IL-12 (prázdne kolieska), v dôsledku zmesi myších IL-12 a IL-2 pridávaných v normálnom pomere 1:1 (plné kolieska), v dôsledku myšieho Fc - jednoreťazcového fúzneho proteínu IL-12IL-2 (plné trojuholníčky) a v dôsledku myších jednoreťazcových IL-12 fúzovaných k myším IL-2 (plné kosoštvorčeky). Osa x označuje koncentráciu monomérického cytokínu (cytokínu) (pM) prítomného ako intaktný proteín alebo ako fúzny proteín; osa y ukazuje cpm vstup tritiového tymidínu.
Obr. 10 ukazuje stimuláciu príjmu 3H-thymidínu ľudskými PBMC v dôsledku myšieho IL-12 (prázdne kolieska), V dôsledku zmesi myších IL-12 a GM-CSF pridávaných v normálnom pomere 1:1 (plné kolieska), v dôsledku myšieho GM-CSF (plné trojuholníčky) a v dôsledku myšieho Fc - myšieho GM-CSF fúzneho proteínu (krížiky). Osa x označuje koncentráciu monomérického cytokínu (cytokínu) (pM) prítomného ako intaktný proteín alebo ako fúzny proteín; osa y ukazuje cpm vstup tritiového tymidínu.
Obr. 11 znázorňuje efektívnosť liečby myší Balb/C nesúcich subkutánne nádory z CT26 buniek rakoviny hrubého čreva pomocou protilátkového cytokínu - cytokínu fúzneho proteínu. Rakovinové bunky sa upravili tak, aby niesli ľudský EpCAM, antigén pre KS-1/4. Plné kosoštvorčeky ukazujú priemerné veľkosti nádorov injektovaných s kontrolným PBS v deň 0, 1, 2, 3 a 4. Plné štvorčeky ukazujú priemerné objemy nádorov u myši liečených 3,4 pg KS-IL-2 a 5,3 pg KS-IL-12. Použili sa intratumorálne injekcie. Osa x označuje počet dni nasledujúcich po prvej injekcii; osa y označuje priemerný objem nádor v mm3.
Obr. 12 ukazuje účinnosť protilátkového cytokín-cytokin fúzneho proteínu pri liečbe myší SCID nesúcich subkutánne nádory z CT26 buniek rakoviny hrubého čreva, ktoré sa upravili tak, aby niesli ľudský EpCAM. Kosoštvorčeky predstavujú priemerné objemy nádoru u myší inj ektovaných PBS v dňoch 0, 1, 2, 3 a 4. Troj uholníčky predstavujú priemerné objemy nádoru u myší injektovaných 6 pg KS-IL-12-IL-2. Štvorčeky predstavujú priemerné objemy nádoru u myší injektovaných 3>4 pg KS-IL-2 a 5,3 pg KS-IL-12. Použili sa intratumorálne injekcie. Osa x označuje počet dní nasledujúcich po prvej injekcii; a osa y označuje^ priemerný objem nádoru v mm3.
Obr. 13 porovnáva účinok liečby protilátkovým cytokínom a fúznym proteínom protilátkového cytokín-cytokínu u myší nesúcich subkutánne nádory Lewisových buniek karcinómu pečene (LLC), ktoré sa upravili tak, aby niesli ľudský EpCAM. Kosoštvorčeky predstavujú priemerné objemy nádoru u myší injektovaných intratumorálne PBS v dňoch 0, 1, 2, 3 a 4. Koliečka predstavujú priemerné objemy nádoru u myší injektovaných intratumorálne 20 pg KS-IL-2 v dňoch 0, 1, 2, 3 a 4. Trojuholníčky predstavujú priemerné objemy nádoru u myší injektovaných intratumorálne 20 pg KS-IL-12 v dňoch 0, 1, 2, 3 a 4. Krížiky predstavujú priemerné objemy u myší injektovaných intratumorálne 20 pg KS-IL-12-IL-2 v dňoch 0, 1, 2, 3 a 4. Osa x označuje počet dní nasledujúcich po prvej injekcii; osa y označuje priemerný objem nádoru v mm3.
Obr. 14 ukazuje účinnosť protilátkového cytokín-cytokínu fúzneho proteínu pri liečbe myší nesúcich subkutánne nádory Lewisových buniek karcinómu pečene, ktoré sa upravili tak, aby niesli ľudský EpCAM. Kosoštvorčeky predstavujú . priemerné objemy nádoru u myší injektovaných PBS v dňoch 0, 1, 2, 3 a 4. Trojuholníčky predstavujú priemerné objemy nádoru u myší liečených 20 pg KS-IL-12-IL-2. Štvorčeky predstavujú priemerné objemy nádorov u myší liečených
11,5 pg KS-IL-2. a 18 intratumorálne injekcie, nasledujúcich po prvej priemerný objem nádoru v mm3.
pg KS-IL-12. Použili sa Osa. x označuje počet dní injekcii; osa y označuje
Obr. 15 ukazuje účinnosť protilátkového cytokín-cytokínu fúzneho proteínu pri liečbe myší nesúcich subkutánne nádory Lewisových buniek karcinómu pečene, ktoré buď nesú alebo nenesú ľudský EpCAM. Prázdne štvorčeky ukazujú priemerné objemy nádorov u myší nesúcich nádor LLC/KSA. Plné kosoštvorčeky ukazujú priemerné objemy nádorov u myší nesúcich nádor LLC. Myši sa liečili 20 pg KS-IL-12-IL-2 v dňoch 0, 1, 2, 3 a 4.
Použili sa intratumorálne injekcie. Osa x označuje počet dní nasledujúcich po prvej injekcii. Osa y označuje priemerný objem nádoru v mm3.
Obr. 16 ukazuje účinnosť protilátkového cytokín-cytokínu fúzneho proteínu pri liečbe myší nesúcich subkutánne nádory Lewisových buniek karcinómu pečene. Asi 106 buniek sa injektovalo subkutánne v deň 0. Kosoštvorčeky ukazujú priemerné objemy nádorov u prostých myší. Štvorčeky ukazujú priemerné objemy nádorov u myší, ktoré mali predtým subkutánne nádory Lewisových buniek karcinómu pečene upravených tak, aby niesli ludský EpCAM a u ktorých sa tieto nádory liečili pomocou KS-IL-12-IL-2. Osa x označuje počet dní nasledujúcich po prvej injekcii. Osa y označuje priemerný objem nádoru v mm3.
Obr.
17A a 17B ukazujú účinok sekrécie jednoduchého alebo viacnásobného bunkami na cytokínového proteínu nádorovými schopnosť buniek tvoriť nádory u živočíchov s normálnym imunitným systémom. Na obr.
17A sa porovnávajú štyri skupiny myší: C57BL/6 myši injektované subkutánne 1.10s. nádorovými bunkami LLC (plné kosoštvorčeky); C57BL/6 myši injektované subkutánne 5.106 nádorovými bunkami LLC (prázdne kosoštvorčeky).; C57BL/6 myši injektované subkutánne 1.10s nádorovými bunkami LLC nesúcimi scIL-12 (plné trojuholníčky); C57BL/6 myši injektované subkutánne 5.106 nádorovými bunkami LLC nesúcimi scIL-12 (prázdne trojuholníčky). Obr. 17B porovnáva C57BL/6 myši injektované subkutánne 1.106 nádorovými bunkami LLC (čierne kosoštvorčeky); CP57BL/6 myši injektované subkutánne 5.10s nádorovými bunkami LLC (biele kosoštvorčeky); C57BL/6 myši injektované subkutánne 1.106 nádorovými bunkami LLC nesúcimi SCIL-12-IL-2 (krížiky) a C57BL/6 myši injektované subkutánne 5.106 nádorovými bunkami LLC nesúcimi scIL-12 (prázdne kolieska). Osa x označuje počet dni po vpichnuti nádoru. Osa y označuje priemerný objem nádoru v mm3.
Obr. 18 ukazuje účinok sekrécie jednoduchého alebo viacnásobného cytokínového proteínu nádorovými bunkami na schopnosť buniek tvoriť nádory u imunodeficitných živočíchov.
Tento obrázok porovnáva myši SCID injektované subkutánne 1.1O6 nádorovými bunkami LLC (plné
SCID injektované subkutánne kosoštvorčeky); myši
1.106 nádorovými bunkami LLC nesúcimi scIL-12 (plné trojuholníčky) a myši SCID injektované subkutánne 5.106 nádorovými bunkami LLC nesúcimi scIL-12 (prázdne kolieska). Osa x označuje počet dni po vpichnuti nádoru. Osa y označuje objem nádoru v mm3.
Príklady prevedenia vynálezu
Príklad 1: Stavba génových fúzii schopných vyjadriť fúzne proteínv cvtokín-cvtokín
Pre vytvorenie multifukčných proteinov majúcich pluralitu cytokínov sa syntetizovali génové fúzie medzi IL-12 p40 a IL-2 a medzi IL-12 p40 a GM-CSF. Naviac kódujúca sekvencia dospelých myší p35 (SEQ ID č: 1) sa fúzovala k podpornej a vedúcej sekvencii, ktorá umožní vysokú účinnosť a lepšiu sekréciu. Kódujúca sekvencia myšovitých p40-IL-2 a p40-GM-CSF zobrazujú SEQ ID č.2 a SEQ ID č. 3. Tiež sa zostavila ľudská fúzia p40-IL-2 ) SEQ ID č. 4). Zostavili sa fúzie myšie Fc oblasti IgG2 k myšiemu p35 (SEQ ID č. 5) a ludského p35 k ľudskej Fc oblasti IgG2 (SEQ ID č. 6) pri použití dopredu definovaných plazmidov (Lo et al., 1998, Proteín Engineering 11, 495-500); Lo et al., US Patent č. 5726 087).
Fúzia p35 dospelých myší a ľudského p35 k C- zakončeniu ťažkého reťazca protilátky KS-1/4 popisuje Gillies et al., (1998) , J. Immunology 160, 6195-6203) . Rovnakým spôsobom sa zostavila fúzia p35 dospelých myší a ľudského p35 k Czakončeniu ťažkého reťazca protilátky 14.18 (PCT International Publication WO99/29732).
Tu diskutovaná fúzna stratégia pre fúziu p40 k IL-2 a ku GM-CSF je obecne aplikovateľná na fúzii dvoch alebo viacej cytokínov. Obzvlášť kódujúca sekvencia pre väčšiny Azakončených častí obsahuje signálnu sekvenciu pre sekréciu, zatiaľ čo C- zakončené časti nevyžadujú signálnu sekvenciu. Za určitých okolností je vhodné umiestniť kódujúcu sekvenciu pre krátke peptidové spojenie, predovšetkým z 10 - 15 aminokyselín, bohaté na glycín a sérin, medzi kódujúce sekvencie pre dva cytokíny. Manipulácie s DNA, ku ktorým pri takých fúziách dochádza, sú v odborných kruhoch bežné.
Napríklad skladobné detaily fúzie medzi podjednotkou IL-12 p40 myšovitých a IL-2 myšovitých boli nasledujúce. cDNA podjednotky p40 IL-12 myšovitých plnej dĺžky sa clonovala PCR z buniek myšej sleziny aktivovaných Concavalínom A (5 pg/ml na kultivačnom médiu po dobu .3 dní). Predný primér mal sekvenciu AA GCT AGC ATG TGT CCT CAG AAG CTA ACC (SEQ ID č.: 7), kde NheI miesto GCTAGC (zbytky 3-8 sekvencie SWQ ID č.:7) sa umiestnilo protismerne k translačnému iniciačnému kodónu ATG a reverzný primér mal sekvenciu CTC GAG CTA GGA TCG GAC CCT GCA GGG (SEQ ID č.: 8), kde Xhol miesto CTCGAG (zbytky 1-6 sekvencie SEQ ID č. : 8) sa umiestnilo bezprostredne v smere translačného stop kodónu TAG (antikodón CTA). Po overení sekvencií sa fragment Nhel-Xhol obsahujúci mu-p40 cDNA s jeho prirodzenou hlavnou zložkou naviazal na Xbal-Xhol nesúci bacilonosič pdCs (Lo et al. (1998), Proteín Engineering 11, 495-500). Reštrikčné miesta Nhel a Xbal majú kompatibilné priľnavé konce a Nhel sa používa ku klonovaniu mu-p40, pretože mu-p40 má vnútorné Xbal miesto.
K zostaveniu DNA kódujúci mu-p40-muIL-2 sa použila oligonukleotidová väzba k pripojeniu mu-p40 DNA cez jeho PstI miesto (C TGC AG) k Smal-Xhol fragmentu obsahujúcemu cDNA IL-2 dospelých myšovitých. Sekvencia DNA na spojenie fúzneho proteínu bola C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGT AAA GCA CCC (SEQ ID č.: 9), kde C TGC AG (zbytky 1-6 sekvencií SEQ ID č.: 9) je
PstI miesto, C CCG GG (zbytky 15-20 sekvencií SEQ ID č. : 9) je
Smal miesto, TCC je C - zakončený aminokyselinový zbytok
myšieho p40 a GCA je N - zakončený zbytok IL-2 dospelých
myšovitých.
DNA kódujúca jednoduchý reťazec mu IL12-muGMCSF sa odvodil zo stavby DNA kódujúcej jednoduchý reťazec muIL12-muIL2 predtým výmenou muIL2 cDNA muGMCSF cDNA v mieste Smal. Sekvencia DNA v.spojení jednoduchého reťazce muIL12 a muGMCSF bola C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA AAA GCA (SEQ ID č.: 10), kde C TGC AG (zbytky 1-6 sekvencií SEQ-ID č.: 10) je PstI miesto, C CCG GG (zbytky 17-22 sekvencií SEQ ID č.: 10) je
Smal miesto, TCC je C- zakončený aminokyselinový zbytok myšieho p40 a GCA je N- zakončený zbytok IL-2 dospelých myšovitých.
Príklad 2: Pôsobenie IL-12 fúznvch proteínov
IL-12-IL-2 fúzne proteíny pôsobili následovne: Rôzne kombinácie jednotlivých bacilonosičov kódujúcich fúzie p40 a bacilonosiče kódujúce proteíny obsahujúce p35 sa injektovali do 293 buniek ľudského epidermálneho karcinomu, aby prechodne pôsobili fúzne proteíny. DNA sa prečistila činidlom (Wizard,
Promega Inc.), vyzrážala ethanolom pre sterilizáciu a resuspendovala sa v redestilovanej vode.
K pôsobeniu biologicky aktívnych 11-12 héterodimérov fúznych proteínov sa prechodne použili rôzne kombinácie jednotlivých bacilonosičov kódujúcich fúzne a nefúzne formy podjednotiek spoločnou infikáciou 293 buniek ľudského epidermálneho karcinómu. DNA sa prečistila činidlom (Wizard, Promega Inc.), vyzrážala ethanolom pre sterilizáciu a resuspendovala v redestilovanej vode. Zrazeniny fosforečnanu vápenatého sa pripravili štandartnou metódou s použitím 10 pg DNA na 1 ml (5 pg každej, ak sa spoluinf ikuje dvomi plazmidmi) a pridalo sa 0,5 ml na dosku ku kultivácii rastu 293 na 60 mm doskách pri asi 70% stoku (Molecular Clonning: Laboratórna príručka, 2. vyd., Sambrook, red. Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Po 16 hodinách sa médium obsahujúci zrazeninu odstránilo a nahradilo sa čerstvým médiom. 0 3 dňoch sa odstránil roztok nad zrazeninou a analyzoval sa na infikované gény pomocou ELISA, biologickým stanovením aktivity IL-12 alebo imunitným zrážaním a analýzou rádioizotopicky označených proteínov na SDS gélu. K označeniu sa použilo médium bez methioninu, ktorým sa nahradilo rastové médium v druhom dni kultivácie a pridal sa 35S-methionin (100 pCI/ml). PO ďalších 16 hodinách inkubácie sa médiá zobrali, vyčistili centrifúgou (5 minút pri 13 000 otáčkach v doskovej mikrocentrifúge) a inkubovali sa s kvapkami proteínu A Sefarózy (10 pl objemu kvapky na ml kultivačného roztoku). Po 1 hodine pri laboratórnej teplote sa kvapky premyli opakovanou centrifugáciou a resuspendáciou v PBS pufru obsahujúcim 1 % Nonidet-P40 (NP-40). Nakoniec sa granule resuspendovali v gélovom pufre obsahujúcim SDS a varili sa 2 minúty. Po odstránení guličiek centrifugácie sa roztok rozdelil na dve časti. K jednému vzorku sa pridalo redukčné činidlo (5 % 2-merkaptoethanol) a obidva vzorky sa varili 5 minút pred naložením na SDS polyakrylamidový gél. Po elektroforézii sa gél vystavil RTG filmu (autorádiografia) .
Previedli sa infikácie s použitím nasledujúcich plazmidov; mu.pu35 + mu.p40-IL-2, KS-l/4-mu.p35 + mu.p35 + mu.p40IL-2, 14.18-mu.p35 + mup40-IL-2, hu.Fc-p35 + hu.p40-IL-2, KS-1/4hu.p35 + hu.p40-IL-2 a 14.18-hu.p35 + hu.p40-Il-2, kde „mu označuje myšie proteíny a „hu ľudské.
Ak sa bunky metabolický označia 35S-methioninom a vylučované proteíny sa skúmajú redukciou SDS gélovo elektroforézou a autorádiografiou, ukazuje sa v každom prípade vysoký výskyt. Molekulová hmotnosť redukovaných fúznych proteínov sa predpovedala na základe molekulových hmotností proteínových zložiek, ako sú: p35-IL-12, 35 kD; p40-IL-12, 40 kD; IL-2 16 kD; Fc 32 kD; Ig ťažký reťazec, 55 kD; Ig ľahký reťazec, 28 kD. Našli sa proteíny s molekulovou hmotnosťou približne kolísajúcou okolo predpovedanej hodnoty.
Izolovali sa tiež stabilne infikované bunečné rady nesúce fúzne proteíny viacnásobných cytokínov. V prípade héterodimérických štruktúr fúznych proteínov I-L-12 p4 0-IL-2 alebo IL-12 p40-GM-CSF kódujú bacilonosiče, ako sa popisuje skôr pre samostatnú podjednotku IL-12 p40 (Gillies et al., (11998), J.Immunolog. 160, 6195-6203). Infikované bunečné rady nesúce fúzne proteíny p40 sa infikovali druhý raz bacilonosičom kódujúcim buď IL-12 p35 podjednotku Fc - p35 fúzneho proteínu, alebo bacilonosič nesúci protilátkový p35 fúzny proteín, ako popisuje (Gillies et al., (1998), J. Immunolog. 160, 6195-6203).
Kvapalná fáza stabilne infikovaných buniek nesúcich ľudský Fc - IL-12-IL-2 (t..j. nesúci KS-p35 a p40-IL-2) sa vzala a produkty sa čistili väzbou na proteín A Sefarózu a následnú elúciu z nej podľa metódy doporučenej výrobcom (Repligen, Needham, MA) . Čisté proteíny sa skúšali ELISOU na obsah IL-12 a IL-2. Výsledky ukázali, že obsahy jednotlivých cytokínov sa líšia približne o hmotnosť štvoršrúbovice, čo odpovedá rozdielu molekulových hmotností medzi IL-12 a IL-2. Podobne skúška produktov infikovaných buniek nesúcich ludské KS-IL-12IL pre hladiny IL-12 a IL-2 metódou ELISA dáva podobné hodnoty IL-12 a IL-2. Takže s presnosťou odpovedajúcou ELISA namerané hodnoty ukazujú, že IL-12 a IL-2 sa tvorí približne v pomere 1:1. Tie isté výsledky sa získali s fúznymi proteínmi IL-12GM-CSF pripravenými buď s Fc alebo s celou protilátkou.
Príklad 3: Svnergická aktivita fúznych proteinov v indukčnej skúške IFN-v
Biologická aktivita fúznych proteinov IL-12 a IL-2 sa merala IFN-γ indukčnou skúškou s použitím buď kludových alebo mitogénom aktivovaných periférnych mononukleárnych buniek ľudskej krvi (PBMC) získaných od dobrovoľníkov. (Obr.6)
Ľudské periférne krvné mononukleárne bunky sa odoberali zdravým jedincom a čistili sa odstreďovaním na Ficoll-Hypaque (Pharmacia) (1700 obrátok po dobu~ 20 minút) zrazenina z leukocytov obsahujúca PBMC sa rozpustila v bezsérovom médiu (SF-RPMI) na objem 50 ml a oddelila sa odstredením pri 1500 obrátkach po dobu 5 minút. Po stupňovitom odstredení sa bunky znovu suspendovali v bunečnom kultivačnom; médiu obsahujúcom 10 % sérum z kravského plodu (RPMI-1.0) s fytóhemaglutinínom (PHA; 10 pg/ml) alebo bez neho, pri hustote 5.106 buniek/ml a kultivovali sa 3 dni pri teplote 37°C vo zvlhčovanom C02 inkubátore. Bunky sa oddelili odstredením. 3 x sa premyli rovnakým množstvom SF-RPMI a resuspendovali v čerstvom RPMI-10 (1.106 buniek/ml). Alikvotné podiely (100 μΐ) sa previedli do ciel násobnej dosky o 96 celách tak, aby vzniklo celkovo 105 buniek na jednu celu. Testovacie vzorky z kultivačného média sa opakovane rozpúšťali v čerstvom kultivačnom médiu a pridávali sa do ciel uvedenej dosky. Kontrolné cely obdržali
IL-12 (obrázok 6A) alebo ekvimolárna zmes komerčného IL-2 a IL-12 (obr. 6B; cytokíny zakúpené u R & D Systems) . Dosky dozrievali 48 hodín pri 37°C v C02 inkubátore, odkiaľ sa po určitých časových intervaloch odoberalo vždy 20 pl vzorku na stanovenie koncentrácie IFN-γ metódou ELISA podľa pokynov výrobcu (Endogen, Inc., Woburn, MC USA).
Na obr. 6A sa porovnávajú aktivity ľudského fúzneho proteínu IL-12-IL-2 a samotného IL-12. Výsledky ukazujú, že samotný IL-12 indikuje IFN-γ mierne, zatiaľ fúzne proteíny IL12-IL-12 silno indikujú syntézu IFN-γ. Pretože je známe, že IL-2 tiež nestačí syntéze IFN-γ,. výsledky ukazujú, že IL-12 a časť IL-12 sú funkčné s fúznymi proteínmi a súčasne fungujú synergicky.
Ďalej sa porovnávali aktivity fúzneho proteínu Fc - IL-12IL-12, fúzneho proteínu KS-IL-12IL-12 a zmesi obsahujúcej IL12 a IL-2 v normálnom pomere 1:1 z hľadiska schopnosti indukovať IFN-γ. Výsledky na obr. 6B ukazujú, že fúzne proteíny Fc - IL-12-IL-12 a KS-IL-12-IL-12 vykazujú prakticky rovnakú aktivitu ako ekvimolárna zmes IL-12...a IL-2. Rovnaké výsledky sa získali, keď sa myšie formy IL-2 a,IL-12 zostavené presne podľa popisu uvedeného v príklade 1 pre ľudské formy použili ku stavbe fúznych proteínov.
Príklad 4: IL-2 a IL-12 bioaktivita fúznvch proteínov IL-12 a IL-2
Aktivity IL-2 a IL-12 vo fúznych proteínoch sa porovnávali s voľnými cytokínmi v proliferačných skúškach. Aktivita molekuly myšej protilátky 14.18 - IL-12-IL-2 sa testovala typickou proliferačnou skúškou na IL-12. Ľudské PBMC sa získali od dobrovoľníkov a kultivovali sa s 5 pg/ml fytohemaglutinínom P počas troch dní, premyli sa Hankovým HBSS a rozdelili sa podľa štandartného postupu na mikrotitračné dosky v množstve 105 buniek na celu (Gately M.K., Chizzonite R., presky D.H.: Current Protocols in Molecular Immunology (1995), pp. 6.16.1-6.16.15). Bunky dozrievali v prítomnosti rôznych testovacích proteínoch 48 hodín a 10 hodín - pred stanovením stupňa rádioaktívneho podielu sa pridalo 0,3 mikroCurie 3H-tymidínu. IL-12 a ekvimolárna zmes IL-12 a IL-2 stimulujú vpravenie 3H-tymidínu do buniek s dávkovacím.režimom a fúznym proteínom 14.18 - IL-12-IL-2 bol z hľadiska stimulácie vpravený 3H-tymidínu do buniek prakticky rovnako účinný. IL-2 stimuluje vpravenie 3H-tymidínu do buniek iba pri vyšších koncentráciách, z čoho vyplýva, že pre tieto účely je primárna aktivita IL-12 fúzneho proteínu 14.18 -IL-12-IL-2.
Výsledky ukazuje obrázok 7.
Biologická aktivita IL-2 časti sa naviac testovala v rôznom bunečnom bujnení podľa štandartného postupu (Davis L.S., Lipský P.E., Bottomly K.: Current Protocols in Molecular Immunology (1995), pp. 6.3.1-6.3.7). Bunečná rada CTLL-2 u myší závisí na IL-2 pre bujnenie. Bunečná rada CTLL-2 môže bujnieť v dôsledku IL-4, ale o IL-12 to neplatí... Bunky CTLL-2 v aktívnej fáze rastu sa 2 x premyli v médiu zbavenom IL-2 a rozdelili sa na dosky do mikrotitračných ciel o množstve 1.104 buniek na celu, za prítomnosti rôzneho množstva komerčného myšieho IL-2, myšieho fúzneho pro.teínu 14.18 -IL12-IL-2 alebo komerčného myšieho IL-12 a nechali·· sa rásť 48 hodín. Na konci rastového obdobia sa skúškou MTT/MTS stanovil počet živých buniek. Obrázok 8 ukazuje pokus s rôznymi hladinami IL-2, IL-12 alebo fúzneho proteínu 14.18 - IL-12-IL2. Z výsledkov vyplýva, že myší IL-2 a myší fúzny proteín 14.18 - IL-12-IL-2 sú približne rovnako schopné stimulovať bujnenie, zatiaľ čo zvýšené množstvo myšieho IL-12 neukazuje žiadnu zaznamenateľnú stimuláciu bunečného bujnenia. Z toho je zrejmé, že stimulácia bujnenia buniek CTLL fúznym proteínom
14.18 - IL-12-IL-2 prebieha v dôsledku pôsobenia jeho časti
IL-2 a nie IL-12.
Príklad 5: Stavba a pôsobenie fúznych proteínov IL-12-IL-2 s jednoduchým a násobným reťazcom s protilátkou i bez nej.
Jednoreťazcový myší fúzny proteín IL-12-IL-2 sa zostavil následovne. Fúzia kódujúca sa sekvencia p40-IL-2 sa pripravila metódou analogickou pre zostavenie ľudskej fúzie p40-IL-2 y príklade 1. K pripojeniu DNA kódujúcich p35 a p40 podjednotky IL-12 a generovanie samostatne sa syntetizovala DNA kódujúca väzbu z Xhol koniec sekvencie kódujúcej tak, aby zaviedol zakázané modifikoval naviazal na
3' koniec väzby, modifikoval tak, myší p35 sa a naviazal sa na Xhol väzby. muIL12 a mu-p40-muIL2 popísané pri použití vhodného zakázaného kódujúce sekvencie na 5'konci a BamHI úplný p40-IL-2 sa miesto a potom sa sekvencie kódujúcej aby generoval zakázané miesto cDNA kódujúci jednoreťazcové v príklade 1 sa kombinovali miesta v p40 za vzniku tretej
3' koniec štruktúry DNA kódujúcej jednoreťazcový muIL12-muIL2. Tieto kroky sa prevádzali s použitím rôznych bacilonosičov a izolácie fragmentov DNA podľa potreby. Sekvencie výslednej myšej p35-väzba-p40-IL-2 kódovacej oblasti je SEQ ID č.: 11.
Súčasne sa odpovedajúcimi metódami zostavila jednoreťazcová myšia IL-12 kódovacia sekvencia, ktorá je SEQ ID č.: 12.
Naviac sa zostrojila DNA, ktorá kóduje myší IgG2a Fc oblasť fúzujúcu k N- zakončeniu p35-väzba-p40-IL-2. Kódovacia sekvencia je SEQ ID č.: 13.
293 kultivovaných buniek sa infikovalo pomocou plazmidov kódujúcich myší jednoreťazcové Fc-IL-12-IL-2 a Fc-IL12 proteíny. Výskyt fúznych proteínov sa skúšal podľa popisu v príklade 2. Fc fúzne proteíny sa prečistili naviazaním na proteín A Sefarózy a pozorovala sa vysoká hladina výskytu Fc
IL-12-IL-2 a Fc-IL-2. Proteíny sa syntetizovali intaktne podlá zrejmých molekulových váh z migrácie na SDS géloch: pre Fc-IL12-IL-2 kD a pre Fc-IL-12 107 kD.
Fúzny proteín Fc-scIL12-IL2 popísaný v príklade 1 je tetramér s dvomi rôznymi polypeptidovými reťazcami: KS-1/4 ľahkým reťazcom a kS-1/4 ťažkým reťazcom s scIL12-IL2 častí na C- zakončeniach. Aby sa zistilo, ktoré miesta na molekule protilátky sú vhodné k pripojeniu cytokínových častí, zostavil sa druhý fúzny proteín, u ktorého sa konfigurácia KS-1/4 protilátky, IL-12 a IL-2 častí líšila od KS-IL12-IL2 konfigurácie v príklade 1. Tento druhý proteín bol tetramerický a skladal sa z dvoch rôznych polypeptidov. Jeden z polypeptidov obsahoval ľahký reťazec KS-1/4 protilátky. Druhý polypeptid obsahoval jednoreťazcový muIL12 fúzujúci k úplnému N- zakončeniu ťažkého reťazca KS-1/4 protilátky nasledovaným myším IL-2 na karboxylovom zakončení ťažkého reťazca.
. cDNA kódujúci p35 podjednotku myšieho IL-12 sa klonovala PCR z buniek myšej sleziny aktivovaných Konkanavalínom A (5 pg/ml kultivačného média po 3 dni). Priamy priemer má sekvenciu AAGCTTGCT AGC AGC ATG TGT CAA TCA CGC TAC (SEQ ID č.: .14), kde HindlII pozície AAGCTT (zostatky 1-6 SEQ ID č.: 14) sa umiestni proti translačnému iniciačnému kodónu ATG a opačný priemer má sekvenciu CTCGAG CTT TCA GGC GGA GCT CAG ATA GCC (SEQ ID č.: 15), kde Xhol miesto CTCGAG (zostatky 1-6 SEQ ID č. : 15) sa umiestni v smere translačného stop kodónu TGA (antikodón TCA).
DNA kódujúci jednoreťazcový IL-12 obsahuje mup35 DNA viazaný k oligonukleotidom kódujúcim väzbu bohatú na glycínové a serínové zostatky, nasledovanou mup40 DNA. Výsledná štruktúra má nasledujúce sekvencie pri oligonukleotídovom spoj ení:
Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
G AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGA TCC
Ala (SEQ ID č.: 17)
GCC ATD (SEQ ID č.: 16) kde G AGC TC (zbytky 1-6 SEQ ID č.: 16) je Sací zakázaná pozícia práve proti myšiemu p35 translačnému stop kodónu, GCG 5kóduj e C- zakončenie aminokyselinového zvyšku myšieho p35, GGA TCC (zbytky 50-55 SEQ ID č.: 16) je BamHI zakázaná pozícia ulahčujúca väzbu a ATG kóduje N- zakončený zvyšok úplného mup4 0.
DNA kódujúca jednoreťazcový muIL12-KS ťažký reťazecmuGMCSF má nesledujúcu sekvenciu pri spojení mup40 a úplné Nzakončeni KS ťažkého reťazca:
Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA
Gly Gly Ser Leu Ser (SEQ ID č.: 19)
GGG GGC TCC TTA AGC CAG (SEQ ID č.: 18) kde
C TGC AG (zvyšky 1-6 SEQ ID č.: 18) je Pstl p40 translačnému stop kodónu, aminikyselinový zvyšok myšieho p40 a zvyšok úplného sa skúmalo, proti myšiemu zakončený zakončený
Ďalej vhodné pre generovanie pozícia priamo
TCC kóduje
CAG kóduj e
CNKS ťažkého reťazca.
polypeptidov viacnásobného sa môže
1/4, IL-12 a ktoré konce molekuly fúznych spojení a koľko rozdielnych do fúzneho proteínu proteín obsahujúci KS(ľahký reťazec( z hľadiska aktivity.
a obsahuje tri z myšieho p35 fúzujúceho zakomponovať skúmal sa tretí cytokínu, menovite IL12-KS
IL-2, (ťažký reťazec)-IL2, fúzny proteín je a testoval sa hexametrický polypeptidy. Jeden peptid sa skladá protilátky sú + KS
Tento rôzne k ľahkému reťazci KS1/4 protilátky. Druhý polypeptid obsahuje ťažký reťazec KS1/4 protilátky fúzujúci k ľudskému IL-2 (Gillies et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci, 89, 1428), a tretí polypeptid je myší p40. Z hľadiska štruktúry dva ľahké a dva ťažké reťazce sa viažu disulfidovou väzbou za vzniku tetramerickej cytokínovej štruktúry protilátky. Naviac, p35 na N- zakončení ľahkého reťazca sa tiež viaže disulfidovou väzbou s p40.
DNA kódujúca mup35-KS ľahký reťazec má nasledujúce sekvencie na spojenie:
Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser G AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGA TCC Leu Ser (SEQ ID č.: 21)
TTA AGC GAG (SEQ ID č.: 20) kde G AGC TC (zbytky 1-6 SEQ ID č.: 20) je Sací zakázaná pozícia priamo proti myšiemu p35 translačnému stop kodónu, GCG kóduje C- zakončený aminokyselinový zvyšok vyššieho p35, GGA TCC (zbytky 50-55 SEQ ID č.:20 je BamHI zakázaná pozícia vrazená k uľahčeniu väzby a GAG kóduje N- zakončený aminokyselinový zvyšok ľahkého reťazca.
Pre vyjadrenie tohto hexametrického fúzneho proteínu sa bunky nesúce myší p40 generovali infikáciou s bacilonosičom obsahujúcim gény rezistentné k neomycínu a selekcii G418. Bunky predstavujúce myší p40 sa potom infikovali s bacilonosičom obsahujúcim transkripčné jednotky ľahkého i ťažkého reťazca, a selekčný marker dyhydrofolát reduktázy, ktorý umožňuje selekciu metotrexatom (Gillies et al. (1998),
J. Immunol. 160, 6195)
Príklad 6: Aktivita myších iednoreťazcovych fúznvch proteinov
I1-12IL-2
K testovaniu aktivity prechodne produkovaných myších jednoreťazcových I1-12-IL-2 sa použila rovnaká metóda, ako v príklade 4. Množstvo každého cytokínu v bunečnom kultivačnom kale sa najprv stanovila metódou ELISA a použila sa k zostaveniu kalibračnej krivky. Aktivity úzko súvisia s tým, čo sa našlo s fúznymi proteínmi IL-12-IL-2 Fc a protilátky, a čo sa popisuje vyššie.
Zvlášť aktivita IL-12 myšieho jednoreťázcového IL-12-IL-2 (sc) a molekúl myšieho
Fc-scIL-12-IL-2 sa testovala v proliferačných skúškach ľudskej PBMC bunke popísaných v príklade
IL-12 a ekvimolárna zmes IL-12 a IL-2 stimulovali začlenenie 3H-thymidínu do buniek v dávkovacom režime. Dané molárne množstvá fúznych proteinov scOL-12-IL-2 a Fc-scIL-12-IL-2 sú približne rovnako 3H-thymidínu, stimulovanom začlenení účinné ako IL-12 pri ale v omnoho vyšších molárnych koncentráciách, 3H-thymidínu stimulované čo ukazuj, že pozorované začlenenie fúznymi proteínmi scIL-12-IL-2 je spôsobené primárne ich IL-12 aktivitou.
Naviac sa v bunečných skúškach testovala biologická aktivita IL-2 časti vo fúznych proteínoch scIL-12-IL-2 a ukázalo sa, že molárne je porovnateľná s komerčným IL-2, v rámci presnosti prevedenej skúšky. Biologická aktivita IL-2 časti sa tetovala skúškou bujnenia CTLL-2 bunky, ako sa popisuje v príklade 4. Výsledky ukázali, že myší IL-2, myší scIL-12-IL-2 a myší Fc-scIL-12-IL-2 fúzny proteín sú približne rovnako schopné stimulovať bujnenie. Myší IL-12 nestimuluje bujnenie CTLL-2 bunky. Tieto výsledky dokazujú že stimulačné bujnenie CTLL-2 fúznymi proteínmi scIL-12-IL-2 prebieha vďaka časti IL-2 a nie časti IL-12.
Aktivity IL-12 a IL-2 proteínov Fc-IL12-IL-2, IL12-KS-IL-2 a IL12-KS (ľahký reťazec) + KS (ťažký reťazec)-IL2 popísané v príklade 5 sa tiež testovali v bunečných skúškach. Pri použití skúšky PBMC bunečného bujnenia sa začlenením tritiovaného thymidínu všetky proteíny Fc-IL-12-IL2, IL12-KSIL-2 a IL12-KS (ľahký reťazec( + KS (ťažký reťazec)-IL2 preukázali silnú aktivitu IL-12. Podobne pri použití skúšky CTLL-2 bunečného bujnenia všetky proteíny FC-IL12-IL-2, IL12KS-IL-2 a IL12-KS (ľahký reťazec) + KS (ťažký reťazec)-IL2 preukázali silnú aktivitu IL-2. Naviac v ELISA testu sa obidva proteíny IL12-KS-IL-2 a IL12-KS (ľahký reťazec) + KS (ťažký reťazec(-IL2 pevne viazali k antigénu EpCAM, dokonca i vtedy, keď ťažké a ľahké reťazce V oblasti fúzujú k iným proteínom na ich N- zakončeniach.
Príklad 7: Aktivita myších fúznvch proteínov IL-12-GM-CSF
Aktivita molekuly vyššieho IL-12-GM-CSF sa testovala skúškou .bunečného bujnenia (obr. 10). Ľudské PBMC sa získali od troch dobrovoľníkov a kultivovali sa s 5 μς/πιΐ fytohemaglutínínu P po tri dni, premyli sa Hankovým HBSS a rozdelili sa podľa štandartného postupu na mikrotitračné dosky v množstve 105 buniek na celu (Gately M.K., Chizzonite R., presky D.H.: Current Protocols in Molecular Immunology (1995), pp. ä.16.1-6.16.15). Bunky dozrievali v prítomnosti rôznych testovacích proteínov 48 hodín a 10 hodín pred stanovením stupňa rádioaktívneho podielu sa pridalo 0,3 mikroCurie 3H-thymidínu. IL-12 a ekvimolárna zmes IL-12 a GMCSF stimulovali vpravenie 3H-thymidínu do buniek v dávkovacom režime a fúzny proteín 14.18-IL-12-G7-CSF bol z hľadiska stimulácie vpravenie 3H-thymidínu do buniek prakticky rovnako účinný. GM-CSF nestimuloval začlenenie 3H-thymidínu v testovaných koncentráciách, z čoho vyplýva, že pozorované začlenenie 3H-thymidínu stimulované fúznym proteínom 14.18-IL12-GM-CSF prebehlo vďaka jeho IL-12 aktivite.
Naviac sa v bunečných skúškach testovala biologická aktivita GM-CSF časti rôznych fúznych proteínov IL-12-GM-CSF.
Ukázalo sa, že GM-CSF sú aktívne, s molárnou aktivitou pohybujúce sa v oblasti komerčného
GM-CSF. Napríklad sa biologická aktivita GM-CSF testovala fúznymi skúškami bunečného bujnenia, po ktorých nasleduje v odborných kruhoch známy proces molekulárnej imunológie (Cooper S.
Broxmayer H. E.
(1996), Current
Prototocols in
Molecular
Immunology, p.
6.4.1
Myší bunečná rada
32D (GM) závisí na
GM-CSF k bujneniu;
táto rada sa pripraví z originálnej bunečnej rady
32D popísanej
Cooperom a Broxmayerom tak, aby bola čiastočne senzitívna na GM-CSF (Faas et al.
(1993),
Eur. J. Immunol.
23, 1201-1214) . Bunečná rada 32D (GM) nie je citlivá na
IL-12. 32D (GM) bunky v aktívnej log-fázi rastu sa premyli dvakrát v médiu bez GMCSF a rozdelili sa na mikrotitračné dosky v množstve asi 5.103 buniek na celu v prítomnosti rôzneho množstva komerčného myšieho GM-CSF alebo myšieho fúzneho proteínu IL-12-GM-CSF a rastu 48 hodín. 16 hodín pred stanovením stupňa rádioaktívneho vstupu sa pridalo 0,3 mikroCurie 3H-thymidínu. Dávka vrazeného 3H-thymidinu sa zvyšuje veľmi citlivo so zvyšujúcou sa hladinou fúzneho proteínu IL-12-GM-CSF, čo ukazuje, že časť GM-CSF fúzneho proteínu IL-12-GM-CSF je aktívna. Naviac, molárna biologická aktivita fúzneho proteínu IL-12-GM-CSF je porovnateľná s komerčným myším GM-CSF.
Príklad 8:
Liečba karcinómu hrubého čreva u imunitné silných cicavcov s fúznym proteínom viacnásobných cytokínov
Na testovaniu toho, či fúzny proteín protilátky viacnásobného cytokínu je použiteľný na liečbu karcinómu hrubého čreva u cicavcov s intaktným imunitným systémom, sa previedli nasledujúce experimenty. CT26 je bunka karcinómu hrubého čreva myšej Balb/C. Podlá štandartných postupov génového inžinierstva sa táto bunečná rada konštruuje tak, aby predstavovala molekulu ľudskej epiteliálnej bunečnej adhézie (EpCAM), ktorá je antigénom rozoznaným protilátkou KS-1/4; tieto bunky sa nazývajú CT26/KSA.
Myší Balb/C sa subkutánne očkovali 2.106 buniek CT26/KSA. Keď nádor narastie do objemu asi 100-200 mm3, myší sa rozdelí do troch skupín po 9 pre ďalšie skúmanie. Odo dňa 0 sa myši nesúci nádor liečili PBS, približne 3,4 mg KS-IL2-IL-12 zmiešané sa si 5,3 mg KS-IL12 alebo asi 6 mg KS-IL2-IL12. Tieto dávky sa navrhujú tak, aby sa doručil rovnaký počet molekúl IL-12 a IL-2 do každej skupiny myší. Myši sa injektovali intratumorálne, jedenkrát denne po dobu 5 dní. Veľkosť nádoru sa merala posuvným meradlom.
Výsledky jedného takéhoto experimentu ukazuje obr. 11.
V tomto experimente KS-IL12-IL2 spôsobil silné potlačenie rastu nádoru. Zmes KS-IL12 a KS-IL2 tiež priniesla viditeľné potlačenie nádorového rastu, ale nie tak komplexne ako KSIL12-IL2. V skupine myší liečených KS-IL12-IL2 šesť z deviatich myší sa zjavne vyliečilo od týchto nádorov; týchto šesť myší prežilo do 93 dňa, keď bol pokus ukončený, nádory u týchto myší sa scvrkli a zmizli, takže od 39 do 93 dňa sa u nich nezaznamenal žiadny subkutánny nádor. Ďalšie tri myši mali nádory, ktorých rast sa spomalil, takže objem nádoru dosiahol 4 000 mm3 až po 87 dni.
Z myší liečených zmesou KS-IL12 a KS-IL2 2 sa zjavne vyliečili od subkutánnych nádorov a prežili až do konca experimentu. Nádory u zostávajúcich siedmich myší nezmizli a nakoniec narástli na objem 1 000 mm3 (1 myš) a viac než 4 000 mm3 (6 myší) .
Fakt, že KS-IL12-IL2 je účinnejší než ekvimolárna zmes KSIL12 a KS-IL2, je prekvapujúca. Dávky v tomto experimente predstavujú asi 15 pikomólov fúzneho proteínu na dávku, čo odpovedá množstvu asi 9.1012 molekúl. Na začiatku liečby mal každý nádor objem asi 160- mm3, čo odpovedá asi 160 miliónom buniek. Každá bunka predstavuje asi 106 molekúl EpCAM, takže KS protilátka sa môže viazať asi k 1,6.1014 EpCAM molekulám antigénu. Takže keď je KS-IL12 a KS-IL2 zmesou a injektuje sa do myší nesúcich takýto nádor je nepravdepodobné, že tieto dva imunocytokínové fúzne proteíny vzájomne súperia o väzobné pozície antigénu. Efektívna dávka IL-12 a IL-2 pre nádorové miesto musí byť teda pre zmes KS-IL12 a KS-IL2 aspoň tak vysoká ako .pre KS-IL12-IL2.
Príklad 9: Liečba rakoviny hrubého čreva imunodeficitnvch cicavcov fúznym proteínom viacnásobného cytokínu
Mnoho foriem liečby rakoviny sa zakladá na likvidácii bunečného delenia, vrátane buniek imunitného systému. Výsledkom je, že sa pacienti s rakovinou často stávajú imunosupresívnymi. Aby sa zistilo, či sa fúzne proteíny viacnásobného cytokínu môžu používať’ k liečbe cicavcov s potlačeným imunitným systémom, myší SCID nesúcich nádory CT26/KSA sa liečili KS-IL12-IL2, zmesou KS-IL12 a KS-IL2 alebo
PBS. Myši SCID sú deficitné na B bunky a T bunky a v boji proti infekciám sú závislé na prostriedkoch prirodzeného imunitného systému, ako sú NK bunky.
Myši sa subkutánnymi CT26/KSA nádory sa generovali podľa popisu v príklade 8. Tri skupiny po ôsmich myšiach nesúcich nádory asi 100 až 200 mm3 sa liečili intratumorálnymi injekciami pri rovnakom dávkovaní a režimu ako v príklade 8. Výsledky ukazuje obr. 12. V tomto prípade fúzne proteíny KSIL12-IL2 a zmes KS-IL12 a KS-IL2 boli skoro rovnako účinné: päť z ôsmich myší v každej skupine sa vyliečilo do 25 dňa. Ale u nevyliečených myší päť zo šiestich nádorov začalo rásť rýchlosťou charakteristickou pre nádory neliečených zvierat s účinným oneskorením asi 14 až 21 dní. To je rozdielne v porovnaní s nádormi imunologických zdatných myší v príklade 8: dokonca v prípade, že sa nádor nepodarilo kompletne eliminovať liečbou KS-IL12-IL2, nádor nezačal rásť agresívne do 60 dní od zahájenia experimentu.
Tieto experimenty dokazujú, že fúzne proteíny protilátky násobného cytokínu sa môžu použiť k liečbe rakoviny u imunosupresívnych jedincov.
Príklad 10: Liečba rakoviny pečene intratumorálnou iniektážou fúzneho proteínu viacnásobného cytokínu: porovnanie s liečbou s -jednotlivými imunocvtokínmi.
Aby sa zistila účinnosť fúznych proteínov násobných cytokínov a imunocytokínov nesúcich jednu cytokínovú časť proti rakovinovým bunkám v pečeni, previedol sa nasledujúci experiment.
Lewisov pečeňový karcinóm (LLC) je agresívny nádor myší C57BL/6. Bunečná rada LLC nesúca ľudský proteín EpCAM sa zostavila štandartnými technológiami genetického inžinierstva; bunečná rada sa pomenovala LLC/KSA.
Myší CP57BL/6 sa subkutánnymi LLC/KSA nádormi sa generovala podľa popisu v príklade 8 (bunky s KLM označené #) . Štyri : skupiny po piatich myšiach nesúcich nádory asi 100. až 200 mm3 sa liečili intratumorálnymi injekciami po dobu 5· dní. Myši sa injektovali PBF s asi 20 pg KS-IL12, KS-IL2 alebo KS-IL12-IL2 .
Výsledky ukazuje obr. 13. V tomto prípade fúzny proteín KS-IL12-IL2 bol omnoho účinnejší než KS-IL12 alebo KS-IL2. U všetkých myších liečených fúznym proteínom KS-IL12-IL2 nádor zmizol do 27. dňa. 74. deň sa tieto myši podrobili skúške pečeňových metastáz, ako sa popisuje v príklade 14; pôvodné subkutánne nádory sa už v priebehu sledovaného obdobia alebo v priebehu druhého pokusu znovu neobjavili.
Naproti tomu liečba pomocou KS-IL2 alebo KS-IL mala za následok zjavné scvrknutie nádoru a viditeľné spomalenie jeho rastu, ale nádory v konečnom výsledku rástli. Porovnanie výsledkov tohto experimentu s predchádzajúcimi ukazuje, že pre určité ochorenia a spôsoby aplikácie je liečba zmesou imunocytokínov nesúcich rôzne cytokinové časti lepšia než liečba jedným typom imunocytokínu.
Príklad 11: Liečba rakoviny pečene intratumorálnou injektážou fúzneho proteínu viacnásobného cytokínu: porovnanie s liečbou zmesí imunocytokínov
Aby sa zistila účinnosť fúznych proteinov násobných cytokínov a zmesi imunocytokínov nesúcich rôzne cytokinové časti proti rakovinným bunkám v pečeni, previedol sa nasledujúci experiment.
Myši C57BL/6 sa subkutánnymi LLC/KSA nádory sa generovali podľa popisu v príklade 10. Tri skupiny o 7 myšiach nesúcich nádor asi 100 až 200 mm3 sa liečili intratumorálnou injektážou po dobu piatich dní. Myši sa injektovali PBS a zmesou asi 18 pg KS-IL12 a a si 11,5 pg KS-IL12 alebo asi 20 pg KS-IL12IL2.
Výsledky ukazuje obr. 14. V tomto prípade fúzny proteín KS-IL12-IL2 bol’ omnoho účinnejší než zmes KS-IL12 a KS-IL2. U všetkých myší liečených fúznym proteínom KS-IL12-IL2 nádory zmizli do 27. dňa. Naproti tomu liečba zmesouKS-IL2 alebo KSIL mala za následok zjavné scvrknutie nádoru a viditeľné spomalenie jeho rastu, ale všetky nádory pri tomto spôsobe liečby nakoniec opäť rástli.
Príklad 12: Závislosť protinádorovej aktivity protilátkového fúzneho proteínu násobného cytokínu na antigén
Aby sa zistilo, či účinnosť protilátkového fúzneho proteínu nádorovo násobného cytokínu pri liečbe nádoru závisí na špecifickom antigéne rozoznanom protilátkou, previedol sa nasledujúci experiment.
Skupina siedmich myší C57BL/6 sa subkutánnymi nádormi
LLC/KSA a druhá skupina deviatich myší s nádormi z parenterálnej LLC ..bunečnej rady sa generovali podlá popisu v príklade 10. Tieto dve skupiny myší nesúcich nádor 100 až 200 mm3 sa liečili intratumorálnymi injekciami po dobu piatich dní. Myši sa injektovali asi 20 pg KS-IL12-IL2.
Výsledky ukazuje obr. 15. V tomto prípade sa myši nesúce nádory LLC/KSA kompletne vyliečili. Naproti tomu z myší nesúcich nádor LLC sa vyliečili iba dve; všetky ostatné myši nesúce LLC nádor zaznamenali viditeľné zmenšenie nádorov, ale tie nakoniec vyrástli do veľkých objemov.
Tieto výsledky dokazujú, že rozpoznanie EpCAM povrchového antigénu napomáha prisatiu KS-IL12-IL2 k povrchu nádorových buniek LLC/KSA, čim sa zvýši imunitná odozva. Istý protinádorový efekt sa pozoroval tiež proti LLC nádorom; ani keď by sa uvažovali teoretické väzby, protinádorový efekt KSIL12-IL2 môže byť v tomto prípade vyvolaný tým, že sa fúzny proteín injektuje priamo do nádoru, a teda sa v ňom prechodne lokalizuje.
Príklad 13: Generovanie imunitnej pamäti proti nádorovému bunečnému typu
Vývoj metastáz je hlavným problémom pri liečbe rakoviny. Nasledujúci experiment otestoval, či liečba fúznym proteínom viacnásobného cytokínu vedie k tvorbe dlhodobej imunity proti nádorovým bunkám a bráni tak vývoju metastáz.
Päť myši C57BL/6 z príkladu 11 sa liečilo KS-IL12-IL2 a viditeľne sa vyliečili od ich subkutánneho nádoru. 74. deň od počiatku liečby popisovanej v príklade 13 sa týmto piatim myšiam napichlo 106 buniek LLC/KSA. Pre kontrolu sa ôsmim myšiam C57BĽ/6 tiež napichlo 106 buniek LLC/KSA.
28. deň sa myši usmrtili a ich pečeň sa skúmala z hľadiska metastáz. Pečeň ôsmich kontrolných myší bola zo 70 až 100 % pokrytá metastázami, priemerne teda 85 % povrchu pečene. Priemerná váha pečene týchto myší bola 0,86 g. Naproti tomu na povrchu pečene z piatich dopredu liečených myší sa nenašla žiadna metastáza a priemerná váha týchto pečení bola 0,28 g, čo odpovedá váhe normálnych myších pečení. Tieto výsledky ukazujú, že v dôsledku liečby pôvodného nádoru sa vytvára dlhodobá imunitná pamäť proti nádorovým bunkám; táto pamäť bráni vzniku metastáz tohto typu nádorových buniek.
Tabuľka 10: Ochrana myší od LLC-KSÄ pľúcnych metastáz
Prvotná liečba Stav metastáz Hmotnosť pečene (g)
žiadna 4,4,4,4,4,4,3,3 0,88±0,27
KS-IL12-IL2 0,0,0,0,0 0,27+0,03
Priemerná hmotnosť pečene kontrolnej skupiny bez nádoru bola 0,2 g. Stav metastáz vychádza z percentického pokrytia povrchu pečene fúzujúcimi metastatickými modulmi, kde 0 = žiadne metastázy; 1 = 1-25 % pokrytého povrchu; 2 = 25-50 % pokrytého povrchu; 3 = 50-75 % pokrytého povrchu a 4 = 75-100 % pokrytého povrchu.
K druhému pokusu testujúcemu tvorbu imunitnej pamäti sa použilo šesť zo siedmich myší z príkladu 12, ktorým sa napichli nádorové bunky LLC/KSA, mali vyvinuté subkutánne nádory a tieto nádory im zmizli. 62 dní po zahájení liečby v príklade 12 sa šiestim dopredu liečených myši a desiatim prostým, neliečeným kontrolným myšiam C57BL/6 napichlo 10161 LLC buniek. Tieto bunky neobsahujú ľudský KS antigén, EpCAM.
U prostých myší injektované LLC bunky vytvorili nádory, ktoré rýchle rástli vo všetkých myšiach. Naproti tomu u premedifikovaných myší rástli nádory omnoho pomalšie a u jednej myši sa dokoňca nezaznamenal žiadny subkutánny nádor. Výsledky ukazuje obr. 16. Pretože LLC bunky neobsahujú ľudský KS antigén EpCAM, ..imunitné reakcie na LLC bunky sa zakladali na inom antigéne nesenom týmito bunkami.
Príklad 14 : Fúzne proteínv viacnásobných cytokínov ako vakcíny
Fúzne proteiny viacnásobných cytokínov sa môžu použiť ako vakcíny, keď fúzujú k antigénovému proteínu. Konkrétne poradie častí od N- zakončení k C- zakončeniu, prípadne to, ak fúzny oligomér, plazmidov.
proteín je jednoduchý polypeptidový veľmi závisí na · vhodnej zostave reťazec alebo príslušných cestami, ako
Proteiny sa môžu aplikovať rôznymi intravenózne, subkutánne, intraperitoneálne atd. Je dávka a frekvencia podávania obecne vyžaduje napríklad zrejmé, že empirické stanovenie, čo je bežné pre ľudské vakcíny a je to v odborných kruhoch zaoberajúcich sa vývojom vakcín známe.
Napríklad fúzny proteín formy antigén-IL-12-cytokín sa kde cytokínom vo fúznom proteíne je druhý Kontrolné myši dostali rovnaké antigénu IL-12 alebo behom a (lebo) po proteínu sa vzorky krvi aplikuj e cytokín, množstvo do myš i, rozdielny od IL-12.
antigén cytokínu, samotného antigénu. ant igénového odstredili rôznych časoch fúzneho aplikácii pripravená zameraných protilátky protilátok vytvárajú imunitnej odozvy na antigén je plazma sa analyzovala na antigénu. Ukázalo antigénu. Naviac charakteristická Thl opakovane prítomnosť proti proti sa, že sa podstatou odozva.
Reakcie protilátky je silnejšia a typ produkovanej protilátky je iný než u určitých riadených imunizácií.
Presnejšie, poľudštený fúzny proteín protilátkový myší II12IL-2 v PBS pufre sa vstrekol intravenózne do myší Balb/c (5 pg/deň x · 5) . Kontrolné myši dostali tú istú protilátku v tom istom množstve, ale bez IL-12-IL-2. Žiadny injektovaný roztok neobsahoval akýkoľvek typ adjuvans. Desiaty deň sa vzorky krvi zobrali do mikrocentrifugy k odstredeniu a plazma sa pripravila zavedením krvných vzoriek do plastových trubíc obsahujúcich citrát sodný, následným odstredením pri plnej rýchlosti v Eppendorferovej doskovej mikrocentrifuge. ELISA dosky (96 jamkové) sa potiahnú poľudšteným protilátkovým proteínom, ktorý obsahuje ľudskú konštantnú oblasť a používa sa k zachyteniu každej myšej protilátky vytvorenej ako odozva na imunizáciu. Po odstránení voľného materiálu premytím sa viazané myšie protilátky stanovili pomocou kozej anti-myšej Fc protilátky (Jackson Immuno Research) spojenej s peroxidázou chrenu. Akékoľvek viazané protilátky smerujú buď k ľudskej konštantnej oblasti alebo k premennej oblasti, pričom obe sa podieľajú na oblasti medzi poľudštenou protilátkou a fúznym proteínom. ‘
Poľudštená protilátka bez fúzovaného Oil-1211-2 preukazuje malú alebo žiadnu, reaktivitu. Fúzny proteín na druhej strane vyvoláva silnú odozvu protilátky pri absencii exogenného adjuvans a aj keď, že pre vyvolanie takých reakcií je intravenózny spôsob aplikácie v porovnaní so subkutánnou alebo intraperiterorálnou aplikáciou silne nepriaznivý. Protilátky IgG2 izotypu, ktoré sú typické zvýšenou odozvou IL-12 sa vyskytujú u skupiny injektovanej protilátkovým IL-12IL-2, ale nie u skupiny injektovanej poľudštenou protilátkou.
Imunogenicita fúznych proteínov antigénového IL-12 viacnásobného cytokínu sa testuje injektovaním roztoku fúzneho proteínu (ako sa popisuje vyššie) v PBS alebo inom biokompatibilnom pufre, prípadne známom adjuvans. Jednotlivé alebo násobné subkutánne, intredermálne alebo intraperitoneálne injekcie sa napríklad aplikujú každé dva týždne. Alternatívne sa fúzny proteín aplikuje prvý krát subkutánnou injekciou a následne potom intraperitoneálnou injekciou. Freundovo adjuvans ne je možné použiť v prípade ludí pre podráždenie miesta vpichu. Iná adjuvans, ako zrazeniny hydroxidu hlinitého (Alum) sú pre ľudské využitie vhodné a používajú sa v predloženom vynáleze. Pri injektácii do kože sa môžu použiť tiež nové organické adjuvans na základe skvalenov a lipidov.
Príklad 15: Génová terapia ŕúznymi proteínmi násobného cytokínu
Protirakovinná aktivita fúznych proteínov viacnásobného cytokínu preukázaná metódami génovej terapie sa tiež prejavila pri liečbe rakoviny pľúc. Bunkami Lewisová pľúcneho karcinómu sa stabilne infikovalo. systémom vírového bacilonosiča popísaným vyššie (pLNCX-scIL-12-IL-2 alebo pLNCX-scIL-12 DNA prevedenou na PA317 povrchnou bunečnou radou). Tieto systémy kódujú verziu jednoduchého reťazca IL-12, kde sa podjednotky p35 a p40 spoja cez väzbu. Klony sa oddelia „in vitro s použitím média obsahujúceho G418 a tie klony, ktoré stabilne obsahujú 50-60 ng/ml IL-12, sa stanovia metódou ELISA (R & D systémy).
Asi 1.106 a asi 5.106 buniek LLC obsahujúcich scIL-12 alebo scIL-12-IL-2 sa injektovalo subkutánne do myši C57BL/6 a do SCID myší. LLC bunky tvoria IL-12 formu nádorov, ktoré rastú približne rovnako rýchlo ako nádory buniek LLC, ktoré nenesú žiadne cytokíny. V oboch prípadoch (u myší C57BL/6 i SCID) LLC bunky nesúce scIL-12-IL-2 buď nevytvoria subkutánne nádory alebo vytvoria nádory, ktoré sa následne zmenšia a zmiznú (obr. 17 a 18) .
Príklad 16: Stavba fúznych proteínov násobného cytokínu obsahujúceho IL-4 a GM-CSF
Ak sa cytokíny
IL-4 a GM-CSF použijú v kombinácii, sú s iInými .akt ivátormi dendritických buniek.
Fúzny protein protilátky násobného cytokínu obsahujúci aktivitu IL-4 a GMCSF sa zostavil následovne. Kódujúca sekvencia GM-CSF sa fúzovala „in-fráme k 3'koncu ťažkého reťazca kódujúcej sekvencie protilátky KS-1/4, ktorú predchádzala hlavná sekvencia. Naviac kódujúca sekvencia pre IL-4 vrátane hlavnej sekvencie fúzovala „in-frame s väzbu k 5koncu kódujúcej sekvencie pre ľahký reťazec úplnej KS-1/4 protilátky.
Konkrétne pri stavbe DNA kódujúci fúzny protein myší IL-4 a ľahký reťazec KS-1/4 protilátky sa myšia IL-4 cDNA adaptovala pomocou PCR s použitím predného priméru TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C ; (SEQ ID č.: 22), v ktorom Xbal poloha TCTAGA (zvyšky 1-6 SEQ ID č. : 22) sa umiestnila proti smeru translačného iniciačného kodónu ATG, a s použitím reverzného priméru C GGA TCC-- CGA GTA ATC CAT TTG CAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G (SEQ ID č.: 23), ktorý obsahuje BamHI miesto CCA TTC (zvyšky 2-7 SEQ ID č.: 23) bezprostredne na 3'k TCG kodónu (antikodón CGA), ktorý kóduje C- zakončením aminokyselinového zvyšku myšej IL-4. Po klonovaní. PCR fragmentu a overení sekvencie sa fragment Xbal-BamHI obsahujúci myší IL-4 cDNA viazal k BamHI-AflII oligonukleotidovému duplexu kódujúcemu pohyblivý peptidový linker bohatý na glycín a zvyšky sérinu. AfIII zakončení sa zase viazal k umele umiestnenej AfIII pozícii predchádzajúcej N- zakončenie ľahkého reťazca úplnej KS-1/4. Sekvencia DNA a proteínu na spojenie dvoch ligácií sa uvádzajú ďalej.
DNA: TCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA Proteín: (Ser) Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
GGG GGC TCC TTA AGC GAG (SEQ ID č.: 24)
Gly Gly Ser Leu Ser (Glu) (SEQ ID č.: 25)
V tejto DNA sekvencii GGATCC (zvyšky 4-9 SEQ ID č. : 24) a CTTAAG (Zvyšky 48-53 SEQ ID č.: 24) sú dvomi zakázanými polohami pre BamHI, resp. AfIII, použité k prestavbe; TCG kóduje C- zakončený sérinový zvyšok myšej IL-4+ GAG kóduje úplné N- zakončenie ľahkého reťazca KS-1/4; aminokyselinová sekvencia peptidovej väzby bohatého na glycín a sérin sa ukazuje pod DNA sekvenciou. Pomocné sekvencie pre vysokú účinnosť vrátane silných promotórov sa umiestnili primerane okolo DNA segmentov kódujúcich obidva fúzne polypeptidy metódami popísanými v predchádzajúcich príkladoch a inými štandartnými metódami molekulárnej biológie.
Sekvencia DNA kódujúca IL-4-KS (ľahký reťazec) a KS (ťažký reťazec)-GM-CSF fúzne proteíny sa.:~ preniesli do NS/0 buniek a udržovala sa vysoká hladina odpovedajúcich polypetidov. Pri redukčných podmienkach SDS-PAGE ukazuje difúzny pás okolo 80 kD odpovedajúci ťažkému reťazci- GM-CSF polypeptidu a násobné pásy okolo 50 kD odpovedajúcich fúziu ľahkého reťazca IL-4. Difúzny a násobný pás sa objavili vďaka premenlivej glykosilácii IL-4, resp. GM-CSF. ...
Podjednotky sa zbierajú do tetrametrických proteinov viazaných disufidovou väzbou so štruktúrou odpovedajúcej genetickej štruktúre na obr. 3G. Tento proteín má antigénväzobnú aktivitu KS-í/4, schopnosť viazať proteín Staf A prostredníctvom svojich Fc oblastí a cytokínové aktivity IL4 a GM-CSF. Aktivita IL-4 sa merala pomocou stimulácie začlenenia tritiovaného thymidinu do buniek CTLL-2 v závislosti na IL-4.
Aktivita GM-CSF sa merala pomocou stimulácie začlenenia tritiovaného thymidínu do buniek 32 (D) GM v závislosti na GMCSF. Na základe molarity boli aktivity IL-4 a GM-CSF KS-IL4GMCSF podobné vzhľadom k prečistenému IL-4 a GM-CSF.
Ďalej sa. zostavila fúzia cytokínov IL-4 a GM-CSF bez protilátkových sekvencíi. Myšia IL-4 sa klonovala PCR z RNA z buniek myšej sleziny. Predný primér mal sekvenciu TCTAGAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C (SEQ ID č. : ..26) , v ktorej Xbal pozícia TCTAGAGA (zvyšky 1-6 SEQ ID č.: 26) sa umiestnila protismerne k translačnému iniciačnému kodónu ATG, a reverzný primér mal sekvenciu CGATATCCC GGA CGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GCT CTT TAG.GCT TT.C CAG G (SEQ ID. č. : 27), ktorá umiestnila EcoRV pozíciu GAT ATC (zvyšky 2-7 SEQ ID č.: 27) bezprostredne na 3' TCG kodónu (antikodón CGA) kódujúci C- zakončený aminokyselinový zvyšok myšieho IL-4.. -Po overení sekvencie sa Xbal-EcoRV fragment obsahujúci muIL-4 cDNA s jeho prírodnými znakmi viazal k Smal-Xhol fragmentu obsahujúcemu muGM-CSF CDNA, aby vznikla nasledujúca . sekvencia na spojenie fúzie medzi muIL-4 a muGM-CSF: ATG GAT TAC TCG TCC GGG ATG GGA AAA GCA CCC GCC CGC (SEQ ID č.: 28), kde C- zakončená sekvencia muIL-.4 a N- zakončená sekvencia muGM-CSF sa označí tučné, a G ATG GG (zvyšky 17-22 SEQ ID č..: 28) je sekvencia vychádzajúca z väzby otvoreného konca EcoRV k otvorenému koncu Smal. Výsledná DNA kódujúca muIL-4-muGMCSR sa potom klonovala do nosného bacilonosiča. Prítomný proteín sa analyzoval SDS.PAGE a ukázalo sa, že beží ako difúzny pás s viditeľným rozmedzím molekulovej hmotnosti do 45 do 50 kD. Na základe molarity boli aktivity IL-4 a GM-CSF KS-IL4-GMCSF podobné vzhľadom k prečistenému IL-4 a GM-CSF.
Príklad 17: Stavba DNA kódujúca lymfotaktín-KS-IL-2 a výskyt lvmfotaktínu-KS-IL-2 proteínu
Chemokíny sú samostatnou triedou cytokínov, o ktorej sa predpokladá, že tvorí gradienty a nepriame chemotaxie imunitných buniek. Naviac, rovnako ako ostatné cytokíny i chemokíny môžu indikovať pôsobenie špecifických génov v smerových bunkách. Jedným z charakteristických rysov chemokínov je, že volné N- zakončenie je často žiadané kvôli aktivite, ktorá môže vymedziť cestu pri zostavovaní fúznych proteínov. Fúzny proteín cytokín-protilátka-cytokín sa zostavil tak, že obsahoval cytokínový lyrafotaktín, ktorý je chemokínom, protilátku KS-1/4 a cytokín IL-2.
Tento fúzny proteín bol tetramerický a obsahoval dva rôzne
Jeden z polypeptidov sa skladal z myšieho polypeptidy. lymfotaktínu fúzovaného k N- zakončeniu ťažkého reťazca protilátky KS-1/4, nasledovanému IL-2 na C— zakončení.:: Fúzie KS-1/4 ťažkého reťazca s IL-2 na C- zakončení, „KS-IL-2 ťažký reťazec popísal predovšetkým (Gillies et al. (1992), Proc. Natl. Acad.
Sci USA 89, 142 8) . Druhý polypeptid sa skladal z ľahkého reťazca protilátky KS1/4.
Úplnou kódujúcou sekvenciou. myšieho lymfotaktínu publikuje Kelner a Zlotnik (1998, Science 266, 1395) . Pre stavbu DNA kódujúci fúzny proteín myšieho lymfotaktínu a ťažkého reťazca KS-IL2 sa cDNA myšieho lymfotaktínu upravila
PCR s použitím predného priméru TCTAGAGCCACC ATG AGA CTT CTC CTC CTG AC (SEQ ID č.: 29),kde Xbal pozícia (zvyšky 1-6 SEQ ID č.: 29) sa umiestnila protismerne k translačnému iniciačnému kodónu ATG, a reverzného priméru GGA TCC CCC AGT CAG GGT TAC TGC TG (SEQ ID č.: 30), ktorá umiestnila BamHI pozíciu GGA TCC (zvyšky 1-6 SEQ ID č.: 30) bezprostredne na 3' kodónu GGG (antikodón CCC) kódujúceho C- zakončený aminokyselinový zvyšok myšieho lymfotaktínu. Po klonovaní PCR fragmentu a overení sekvencie, X-bal-BamHI fragment obsahujúci cDNA myšieho lymfotaktínu sa viazal k BamHI-AflII oligonukleotidovému duplexu kódujúcemu pohyblivou peptidovou väzbou bohatou na glycín a sérinové zvyšky. Koniec AfIII sa striedavo pripojil k umelej pozícii AfIII predchádzajúce dokonalé N- zakončenie ťažkého reťazca KS-IL2. Sekvencia DNA na spojenie tých dvoch ligácii sa uvádza nižšie.
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
CCC GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA GGG GGC TCC TTA
Ser (SEQ ID č.: 32)
AGC CAG (SEQ ID č.: 31) kde GGATCC (zvyšky 4-9 SEQ ID č. 31) a CTTAAG (zvyšky 4/8-53
SEQ ID č.:
31) sú dve zakázané pozície BamHI, resp. AfIII použitých pre prestavbu; CCC kóduje Czakončený aminokyselinový zvyšok myšieho lymfotaktínu;
CAG kóduj e vyvinuté A- zakončenie ťažkého reťazca KS-IL; aminokyselinová sekvencia peptidovej väzby bohatej na . glycín:- a sérin sa zobrazuje nad DNA sekvenciou. DNA kódujúci ťažký reťazec myšieho lymfotaktínu-KS-IL sa potom klonovala a do nosného bacilonosiča a potom sa zlúčila s ľahkým reťazcom KS.
Fúzny proteín prítomného lymfotaktínu-KS-IL sa testoval na aktivitu lymfotaktínu migračným testom v Boydenovej komore s použitím T-buniek (Leonard et al., 1999, Current Protocols in Immunology, p. 6.12.3). alternatívne sa použili NK bunky.
Aktivita lymfotaktínu sa môže tiež skúmať štandartnou bunečnou skúškou na tok kalcia v závislosti na aktivácii spojených receptorov G-proteínu (Maghazachi et al. , 1997, FASEB J. 11, 765-774). Naviac sa fúzny proteín lymfotaktínu-KS-IL2 testoval a ukázal sa ako aktívny v schopnosti viazať sa k EpCAM a bol tiež aktívny v skúške aktivity IL-2, ako je skúška prolifarácie CTLL-bunky.
Literárne citácie
Všetky publikácie uvádzané v tomto vynáleze sú začlenené do textu vo forme úplnej citácie.
Ekvivalenty
Vynález sa môže previesť na iné špecifické formy a pritom sa neodchýli od základnej charakteristiky alebo pôvodnej myšlienky. Uvedené príklady sú preto radšej pojímané ilustratívne než obmedzene iba vo vzťahu k popisovanému vynálezu. Možnosti tohto vynálezu je teda skôr vyvodzovať na základe priložených patentových nárokov, než sa riadiť popísanými postupmi, a všetky zmeny prichádzajúce v rámci ekvivalentov patentových nárokov sa považujú za súčasť tohto vynálezu.
Ή
SK
ZOZNAM SEKVENCII <110> Gillies, Stephe.n
Lo, Kin Mir.g <12O> Komplexy násobného cytokínového proteínu <130> LEX-010PC <140>
<141>
<150> 60/147,924 <151> 1999-08-09 <160> 32
Patentová verzia 2.0 <210> i <211> 532 <212 > DNÄ ' <213> Mus musculus <223> Popis umelej sekvencie: sekvencia kódujúca myší p35 pre vyvinutý proteín <400> i agggccattc cagtctctgg acctgccagg.tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa.gacctgttta 180 ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc. tggtggccat cgatgagctg 420 atgcagtčtc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcct ga 582 <210> 2 <211> 1472 <212> DNÄ
<213> Umelá sekvencia
<220> <223> Popis umelej sekvencie: sekvencia kódujúcej myší p40-IL-2 fúzny proteín
<400> 2 atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60 ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120 aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180 aagaagatga catcacccgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240 ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300 gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360 ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420 ccggacggtt cacgtgccca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 4Θ0 agagcagtag cagttcccct gäctctcggg cagtgacatg eggaatggcg tctctgtctg 540 cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagca ttcagtgtcc tgccaggagg 600 atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660
S9agcagaataa acccgcccaa agtaccctga tccagcgcaa tcctcgtaga ctcaggatcg gatccccggg agcagcagca gcaggatgga tgcccaagca tgcggcatgt tcatcagcaa gccaattcga gtcaaagcat atatgagaac gaacttgcag ctcctggagc gaaagaaaag gaagacatct ctattacaat taaagcaccc gcagcagcag gaattacagg ggccacagaa tctggatttg tatcagagta tgatgagtca catctcaaca tacagcacca atgaagcctt actccccatt atgaaggaga accgaagtcc tcctcatgca acttcaagct cacctggagc aacctgaaac ttgaaagatc actcaaagca actgttgtaa gcaactgtgg agccctcaat gcttcttcat tgaagaactc cctacttctc cagaggaggg aatgcaaagg gcaagtgggc ctacagcgga agctgttgat tccccaggat ttcagtgcct aaagctttca aactaaaggg tggactttct aa cagggacatc acaggtggag cctcaagttc gtgtaaccag cgggaatgtc atgtgttccc agcacagcag ggacctacag gctcaccttc agaagacgaa attggaagat ctctgacaac gaggagatgg atcaaaccag gtcagctggg tttgttcgaa aaaggtgcgt tgcgtgcaag tgcagggtcc cagcagcagc gagctcctga aaattttact cttggacctc gctgagaatt acatttgagt atagccttct
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1472 <210> 3 <211> 1409 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: sekvencia kódujúcej myší p40-GM-CSP fúzny proteín <400> 3 atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60 ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120 aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180 aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240 ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300 gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggccca 360 ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420 ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480 agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540 cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600 atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660 agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720 acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 780 agtaccctga ctcctggagc actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa 840 tccagcgcaa gaaagaaaag atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt 900 tcctcgtaga gaagacatct accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag 960 ctcaggatcg ctattacaat tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc 1020 gatccccggg aaaagcaccc gcccgctcac ccataattgt tacccggcct tggaagcatg 1080 tagaggccat caaagaagcc ctaaacctcc tggatgacat gcctgtcacg ttgaatgaag 1140 aggtagaagt cgtctctaac gagttctcct tcaagaagcc aacatgtgtg cagacccgcc 1200 tgaagatatt cgagcagggt ctacggggca atttcaccaa actcaagggc gccttgaaca 1260 tgacagccag ctactaccag acatactgcc ccccaactcc ggaaacggac tgtgaaacac 1320 aagttaccac ctatgcggat ttcatagaca gccttaaaac ctttctgact gatatcccct 1380 ttgaatgcaa aaaaccáagc caaaaatga 1409 <210> 4 <211> 1389 <212 > DNA <213> sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: sekvencia kódujúca ľudský p40-IL-2 <400> 4 atgtgtcacc agcagttggt cacctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60 gtggccatat gcccctggag accttggacc gagtctggag ctcctgctgc aaagaaccca acctgctggt ggctctcctg agaggggaca gctgctgagg gaaaactaca ttgcagctga acctggagta agcaagagag cgcaaaaatg gaatgggcac caactggagc aatcccaaac ctgaaacatc gctcaaagca gttctggaac accattgtag acttgataa gggaaccgaa aaatggtggt agagcagtga atgccggcca ttcacaaaaa aaaataagac ggctgacgac acccccaagg acaaggagta agagtctgcc ccagcagctt agccattaaa ctccacattc aaaagaaaga ccagcattag ccgtgccctg atttactgct tcaccaggat Ctcagtgtct aaaactttca taaagggatc aatttctgaa gaaagatgtt cctcacctgt ggtcttaggc gtacacctgt ggaagatgga ctttctaaga aatcagtact ggtgacgtgc tgagtactca čattgaggtc cttcatcagg gaattctcgg ctacttctcc Cagagtcttc cgtgcgggcc cagtgcacct ggatttacag gctcacattt agaagaagaa cttaagaccc tgaaacaaca cagatggatt tatgtcgtag gacacccctg tctggcaaaa
atttggccca tgcgaggcca gatttaacat ggagctgcta gtggagcgcc atggtggatg gacatcatca caggtggagg ctgacattct acggacaaga caggaccgct acttcaagtt atgattttga aagttttaca ctcaaacctc agggacttaa tCcatgtgtg accttttgtc aactggatcg aagaagatgg ccctgaccat gcgaggttct ctgatatete agaattattc tcagtgtcaa cactctctgc aggaggacag ccgttcacaa aacctgaccc tcagctggga gcgttcaggt cctcagccac actatagctc ctacaaagaa atggaaceaa tgcccaagaa tggaggaagt tcagcaatat aatätcctga aaagcatcat gtatccggat tatcacctgg ccaagtcaaa aagccattcg aaaggaccag tggacgcccc aagcagcaga agagagagtc tgcctgccca gctcaagtat acccaagaac gtaccctgac ccacggcaag ggtcatctgc atcttggagc aacacagcta taattacaag ggccacagaa gctaaattta caacgtaata tgagacagca ctcaacacta
120
180
240'
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
00
1260
1320
1380
1389 t<210> 5 <211> 1278 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: sekvencia kódujúca myší Fc-p35 fúzny proteín <400> 5 gagcccagag ttgggtggac ctgagcccca átcagctggt gattacaaca agtggcaagg accatctcaa gaagaagaga gaagacattt gaaccagtcc aagaactggg caccacacga gccaggtgtc gccagagaaa acacgggacc agttgcctgg aagacgcctt cagacagagt ctagacaagg gagactctgc ctctgcatcc tatctgagct ggcccacaat catccgtctt tagtcacacg ttgtgaacaa gtactctccg agttcaaatg aacccaaagg tgactaagaa acgtggagtg tggactctga tggaaagaaa ctaagagctt ttagccagtc aactgaaaca aaaccagcac ctactagaga tgacgatgac tccaggccat gcacgccggt gccagaaacc tgcttcacgc ccgcctga caagccctgt catcttccct tgtggtggtg cgtggaagta ggtggtcagt caaggtcaac gtcagtaaga acaggccact gaccaacaac tggttcttac tagctactcc ctcccggacc ccgaaacctg ttattcctgc attgaagacc gacttcttcc cctgtgcctt caacgcagca ggccatcgat tcctgtggga cttcagcacc cctccatgca ccaaagatca gatgtgagcg cacacagctc gccctcccca aacaaagacc gctccacagg ctgacctgca gggaaaacag ttcatgtaca tgttcagtgg ccgggtaggg ctgaagacca actgccgaag tgtttaccac acaacaagag ggtagcatct cttcagaatc gagctgatgc gaagcagacc cgcgtcgtga aatgcccacc aggatgcacC aggatgaccc agacacaaac tccagcacca tcccagcgcc tatatgtctt tggtcacaga agctaaacta gcaagctgag tccacgaggg tcattccagt cagatgacat acatcgatca tggaactaca ggagctgccC atgaggaccc acaaccatca agtctctgaa cttacagagt ccatcaacag acctaacctc 60 catgatctcc agacgtccag ccatagagag ggactggatg catcgagaga gcctccacca cttcatgcct caagaacact agtggaaaag tctgcacaat ctctggacct ggtgaagacg tgaagacatc caagaacgag gcccccacag gaagatgtac gcagatcatt tcataatggc gaaaatgaag ggtgatgggc
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1278 <210> 6 <211> 1287 <212> DNA ť2i3> Umelá sekvencia μ* <220>
<223> Popis umelej sekvencie: sekvencia kódujúca ludský Fc-p35 fúzny proteín <400> 6 gagcccaaat gggggaccgt acccctgagg aactggtacg tacaacagca ggcaaggagC atctccaaag gaggagatga gacatcgccg cccgtgctgg aggtggcagc tacacgcaga ccaggaatgt ctccagaagg gaagatatca aagaatgaga gcctccagaa aagatgtacc cagatctttc ttcaacagtg aaaatcaagc gtgacgagct cttgtgacaa cagtcttcct tcacatgcgt tggacggcgt cgtaccgtgt acaagtgcaa ccaaagggca ccaagaacca tggagtggga actccgacgg a9999aac9t agagcctctc tcccatgcct ccagacaaac caaaagataa gttgcctaaa agacctcttt aggtggagtt tagatcaaaa agactgtgcc tctgcatact atctgaatgc aactcacaca cttcccccca ggtggtggac ggaggtgcat ggtcagcgtc ggtctccaac gccccgagaa ggtcagcctg gagcaatggg ctccttcttc cttctcatgc cctgtccccg tcaccactcc tctagaattt aaccagcaca ttccagagag tatgatggcc caagaccatg catgctggca acaaaaatcc tcttcatgct ttcccaa tgcccaccgt aaacccaagg gtgagccacg aatgccaaga ctcaccgtcc aaagccctcc ccacaggtgt acctgcctgg cagccggaga ctctatagca tccgtgatgc ggaagaaacc caaaacctgc tacccttgca gtggaggcct acctctttca ctgtgcctta aatgcaaagc gttattgatg tcccttgaag ttcagaatcc gcccagcacc acaccctcat aagaccctga caaagccgcg tgcaccagga cagcccccat acaccctgcc tcaaaggctt acaactacaa agctcaccgt atgaggctct tccccgtggc tgagggccgt cttctgaaga gtttaccatt taactaatgg gtagtattta ttctgatgga agctgatgca aaccggattt gggcägtgac tgaactcctg gatctcccgg ggtcaagttc ggaggagcag ctggctgaat cgagaaaacc cccatcacgg ctatcccagc gaccacgcct ggacaagagc gcacaaccac cactccagac cagcaacatg gattgatcat ggaattaacc gagttgcctg tgaagacttg tcctaagagg ggccctgaat ttataaaact tattgacaga
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
0
1020 1080 1140 1200 1260 1287 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: predný primár na zostaveniemyšieho p40-IL-2 fúzneho proteínu <220>
<221> misc_ charakter <222> (12)7.(14) <223> ,..... , , .
translacný iniciačný kodoni <400> i aagctagcac catgtgtcct cagaagctaa cc <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: spätný primár na zostavenie myšieho p40-IL-2 fúzneho proteínu <220>
<22i> misc_ charakter <222> doplnok ((7)..(9)) <223> - .
translačný stop kodón <400> θ ctcgagctag gaccggaccc tgcaggg 27 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Umelá sekvencia *22°* Popis umelej sekvencie: sekvencia DNA na spojenie myšieho p40-IL-2 fúzneho proteínu <220>
<221> misc_ charakter <222> (14)..(16) <223> 1 kóduje C-zakončenie aminokyselinového zvyšku myšieho p40 <220>
<221> misc_ charakter <222> (26)..(28) <223> kóduje N-zakončenie aminokyselinového zvyšku dozretého myšieho
IL-2 <400> 9 ctgcagggtc cgatccccgg gtaaagcacc c 31. .
<210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: sekvencia DNA na spojenie jednoreťazcového myšieho IL-12 a GM-CSF <220>
<221> misc_ charakter <222 > (14)..(16) <223> kódu j e C-zakonč.eni aminokyselinového zbytku myšího p40 <220>
<22i> misc_charakter <222> (26)7,(28) <223> kóduje N-zakončenie aminokyselinového zvyšku dozretého myšieho
GM-CSF <400> 10 ctgcagggtc cgatccccgg gaaaagca 28 <210> 11 <211> 2013 <212> DNA <213>Umelá sekvencia <220>
Popis umelej sekvencie: sekvencia kódujúcej myšejp35-liner-p40-IL-2 fúzny proteín
JJ&r <400> 11 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct120 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaá gacctgttta180 ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag360 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg420 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc540 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc600 ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta660 gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct720 gaagaagatg acatcacctg gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag780 accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga840 ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc900 actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac960 tccggacggt tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gttcaacatc1020 aagagcagta gcagttcccc tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtct1080 gcagagaagg tcacactgga ccaaagggac tatgagaagt attcagtgtc ctgccaggag1140 gatgtcacct gcccaactgc cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg 12 0 0 cagcagaata aatatgagaa ctacagcacc agcttcttca tcagggacat catcaaacca1260 gacccgccca agaacttgca gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggtcagctgg1320 gagtaccctg actcctggag cactccccat tcctacttct ccctcaagtt ctttgttcga1380 atccagcgca agaaagaaaa gatgaaggag acagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg144 0 ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa1500 gctcaggatc gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg ’catgtgttcc ctgcagggtc1560 cgatccccgg gtaaagcacc cacttcaagc tctacagcgg aagcacagca gcagcagcag1620 cagcagcagc agcagcagca gcacctggag cagctgttga tggacetaca ggagctcctg168 0 agcaggatgg agaattacag gaacctgaaa ctccccagga tgctcacctt caaattttac174 0 ttgcccaagc aggccacaga attgaaagat cttcagtgcc tagaagatga acttggacct1800 ctgcggcatg ttctggattt gactcaaagc aaaagctttc aattggaaga tgctgagaat 18 6 0 ttcatcagca atatcagagt aactgttgta aaactaaagg gctctgacaa cacatttgag1920 tgccaattcg atgatgagtc agcaactgtg gtggactttc tgaggagatg gatagccttc1980 tgtcaaagca tcatctcaac aagccctcaa caa2013 <210> 12 <211> 1569 <212> DNA <213> Umelá sekvencia : <220> „ _ .
<223> Popis umele] sekvencie: sekvencia kódujúcej myší p35-linker-p40 fúzny proteín <400> 12 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60 accacapatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180 ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc 600 ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660 gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720 gaagaagatg acatcacctg gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag 780 accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga 840
ggcgagactc tgagccactc acacctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc900 actgaaattc CaaaaaaCtĽ caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac960 tccggacggt tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gtecaacaec1020 aagagcagta gcagttcccc tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtcc1080 gcagagaagg tcacactgga ccaaagggac tatgagaagt attcagtgtc ctgccaggag1140 gacgtcacct gcccaactgc cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg1200 cagcagaata aatatgagaa ctacagcacc agcttcttca tcagggacat catzcaaacca1260 gacccgccca agaacttgca gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggccagctgg1320 gagtaccctg actcctggag cactccccat tcctacttct ccctcaagtt cttxgttcga13 80 atccagcgca agaaagaaaa gatgaaggag acagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg1440 ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa1500 gctcaggatc gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggcc1560 cgatcctag1569 <210> 13 <211> 2709 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: sekvencia kódujúcej myší
Fc-p35-linker-p40-IL-2 fúzny proteín <400> 13 gagcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc 60 ttgggtggac catccgtctt catcttccct: ccaaagatca aggatgtact cacgatctcc 120 ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgcgagcg aggatgaccc agatgtccag 180 accagctggt ttgcgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240 gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggactggacg 3 00 agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga 3 60 accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctccacca 420 gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct 4 80 gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact 54 0 gaaccagtcc tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag 600 aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat 660 caccacacga ctaagagctt ctcccggacc ccgggtaggg tcattccagt ctctggacct 720 gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg 780 gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacacc 840 acacgggacc aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag 900 agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag 960 aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac 1020 cagacagagt tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt 1080 ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc 1140 gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag 1200 ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc 1260 'tatctgagct ccgcgtcgag cgggggcagc gggggcggag gcagcggcgg gggcggatcc 1320 gccatgtggg tgctggagaa agacgtttat gttgtagagg tggactggac tcccgatgcc 1380 cctggagaaa cagtgaaccc cacctgtgac acgcctgaag aagatgacat cacccgaacc 1440 tcagaccaga gacatggagt cataggctct ggaaagaccč tgaccatcac tgtcaaagag 1500 tttctagatg ctggccagta cacctgccac aaaggaggcg agactctgag. ccactcacat 1S60 ctgctgctcc acaagaagga aaatggaatt tggtccactg aaattttaaa aaatttcaaa 1620 aacaagactt tcctgaagtg tgaagcacca aattactcčg gacggttcac gcgctcatgg 1680 ctggCgcaaa gaaacaegga cttgaagttc aacatcaaga gcagtagcag ttcccctgac 1740 tctcgggcag tgacatgtgg aatggcgtct ctgtctgcag agaaggtcac actggaccaa 1800 agggactatg agaagtattc agtgtcctgc caggaggatg tcacctgccc aactgccgag 1860 gagaccctgc ccattgaact ggcgttggaa gcacggcagc agaataaata tgagaacCac 1920 agcaccatjct tcttcatcag ggacatcatc aaaccagacc cgcccaagaa cttgcagacg 1980 aagcctttga agaactcaca ggtggaggtc agctgggagt accctgactc ctggagcact 2 04 0 ccccattcct acttctccct caagttcttt gttcgaatcc agcgcaagaa agaaaagatg 2100 aaggagacag aggaggggtg taaccagaaa ggtgcgttcc tcgtagagaa gacatctacc 2160
1Ό5 gaagtccaat gcaaaggcgg gaatgtctgc gcgcaagccc aggatcgcta ttacaattcc 2220 tcatgcagca agtgggcatg tgttccctgc agggtccgat ccccgggtaa agcacccact 2280 tcaagctcta cagcggaagc acagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcac 2340 ctggagcagc tgttgatgga cctacaggag ctcctgagca ggatggagaa ttacaggaac 2400 ctgaaactcc ccaggacgct caccttcaaa ttttacttgc ccaagcaggc cacagaattg 2460 aaagatcttc agtgcctaga agatgaactt ggacctetgc ggcatgttct ggatttgact 2520 caaagcaaaa gctttcaatt ggaagatgct gagaatttca tcagcaatat cagagtaacu 2S80 gttgtaaaac taaagggctc tgacaacaca tttgagtgcc aattcgatga tgagtcagca 2640 actgtggtgg actttctgag gagatggata gccttctgtc aaagcatcat ctcaacaagc 2700 cctcaataa 2709 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> popis umelej sekvencie; predný primér pre PCR zosilnenie myšej p35 podjendotky IL-12 <220>
<22i> tnisc_ charakter <222> (16)..(18) <223> translačný iniciačný kodón <400> 14 .
aagcttgcta gcagcatgtg tcaatcacgc tac 33 <210> 15 <211> 30 . , <212> DNA <213> umeiá sekvencia <220>
<223> popis umelej sekvencie: spätný primér pre PCR zosilnenie myšej p35 podjendotky IL-12' <220>
<221> mise charakter <222> doplnok (10)..(12)) <223> translačný stop kodón' <400> 1S ctegagettt caggcggagc tcagatagcc.30 <210> 16 <211> 61 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: kódujúca sekvencia na spojenie medzi p35 a p40 obshajúci myší jednoreťazcový IL-12. .,...
<220> charakter <221> misc_ <222> (8)..(10) kóduje C-zakončenie aminokyselinového zvyšku myšieho p35 <220>
<22i> misc_charakter <222> (59) .. (61) <223> ·Λ kóduje N- zakončenie aminokyselinového zvyšku dozretého myšieho p40 <400> 16 gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatcčgccac 60
61 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: proteínová sekvencia na spojenie medzi p35 a p40 obsahujúci myší jednoreťazcový IL-12 <400> 17
Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala . 1 5 10 ' 15 <210> 18 <211> 73 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> popis umelej sekvencie: kódujúca sekvencia na spojenie medzi myším p40 a dozretým N-zakončením KS ťažkého reťazca <220>
<221> misc_ charakter <222> (14)'. .(16) <223 > ... -l.
kóduje C-zakončenie aminokyselmoveho zvyšku myšieho p40 <220>
<221> mise, charakter <222> (71)‘..(73) <223>
kóduje zvyšok N-zakončeni dozretého KS ťažkého reťazca <400> 18 ctgcagggtc cgatccccgg gatccggagg ttcagggggc ggaggtagcg gcggaggggg 60 ctccttaagc cag 73 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: poroteínová sekvencia na spojenie medzi myším p40 a dozretým N-zakončením ťažkého reťazca (
i&r <400> 19
Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 ' S 10 15
Leu Ser <210> 20 <211> 64 <212 > DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: kódujúca sekvencia na spojenie medzi myším p35 a KS ľahkým reťazcom <220>
<22i> misc_ charakter <222> (8)..(10) <223> kóduje C-zakončenie aminokyselinového zvyšku myšieho p35 <220>
<221> misc_ charakter <222> (62) . . (64) <223> kóduje N-zakončenie aminokyselinového zvyšku ľahkého reťazca <400> 20 gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccttaag 60 cgag 64 <210> 21 <211> 17 <212 > PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: proteínová sekvencia na spojenie medzi myším p35 a KS lahkým reťazcom <400> 21
Ser Ser Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser. Gly Gly Gly Gly Ser Leu ’ S 10 15
Ser <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> úmelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: predný primér pre PCR zosilnenia myšieho IL-4 <220>
<22ΐ> misc_charakter <222> (9)..(11) <223;* transiagný iniciačný kodón <400> 22 ^ctagaccat gggtctcaac ccccagc 27 <210> 23 <211> 47 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <223> P°pis umelej sekvencie: spätný primer pre PCR zosilnenie „myšieho IL-4 <220>
<22i> mise charakter 22 > doplnok ((0)..(10)) kóduje C-zakončenie aminokyselinového zvyšku myšieho IL-4 <«00> 23 c9gatcccga gtaatccatt tgcatgatgc tccttaggct ttccagg 47 <210> 24 <311> 57 <212> DNA <-13> umelá sekvencia c220>
<223> Popis umelej sekvencie: kódujúca sekvencia na spojenie myšieho IL-4 a dozretého KS-1/4 ľahkého” reťazca <220>
<2Ji> misc_ charakter <2J2> (1) ~(3) <223> kóduje C-zakončenie sérinového zvyšku myšieho IL-4 <220>
<2J1> misc_ charakter <222> (55)..(57)
-*2,*3> kóduje N-zakončenie aminokyselinového zvyšku dozretého
KS-1/4 ľahkého reťazca <400> 24 .
tc99gatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagegag 57 <21o> 25 <211> 19 <212> PRT <2X3> Umelá sekvencia <22o>
<223>Popis umelej sekvencie: proteínová sekvencia na spojenie myšieho IL-4 a dozretého KS-1/4 ľahkého reťazca.
W?
<400> 25
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
5 * 10 15
Leu Ser Glu <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> umelá sekvencia ’ <220>
<223> Popis umelej sekvencie: predný primer pre PCR zosilnenia myšieho IL-4 <220>
<22i> misc_ charakter <222> (9)..(11) <223> translačný iniciačný kodón <400> 26 tctagaccat gggtctcaac ccccagc 27 <2Í0> 27 <211> 52 <212> DNA <213 > Umelá sekvencia <220>
<223>
Popis umelej sekvencie:
spätný primer pre PCR zosilnenia myšieho IL4 <220> <221> <222>
nisc charakter doplnok ((13)..(15)) <223* kóduje C-zakončenie aminokyselinového zvyšku myšieho IL-4 <400> 27 cgatatcccg gacgagtaat ccatttgcat gatgctcttt aggctttcca gg 52 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> ,
Umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: kódujúca sekvencia na spojenie medzi myším IL-4 a myším GM-CSF <220>
<221> misc_charakter <222> (1)..(12) <223> . „ . .
kóduje C-zakončenie sekvencie muIL4 <220>
íi <22i> misc_ charakter <222> (28)..(39) <223> kóduje N-zakončenie sekvencie muGM-CSF <400> 2Θ atggattact cgtccgggat gggaaaagca cccgcccgc 39 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: predný primár pre PCR zosilnenia myšieho lymfotaktínu <220>
<221> misc_ charakter <222> (13) .. (15) <223> translačný iniciačný kodón <400> 29 tctagagcca ccatgagact tctcctcctg ac 32 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: spätný primár pre PCR zosilnenia myšieho lymfotaktínu <220>;, <22i> mise charakter <222 > doplnok (7)..(9)) <223> jeduje C-zakončenie aminokyselinového žbytku myšieho lymfotaktínu·.
<400> 30ggatccccca gtcagggtta ctgctg26 <210> 31<211> 57 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: kódujúca sekvencia na spojenie medzi myším lymfotaktínom a KS-IL2 ťažkým reťazcom <220>
<221> mise charakter <222> (1).7(3) <223 kóduje C-zakončenie aminokyselinového zvyšku myšieho lymfotaktínu <220>
<22i> mise charakter <222> (55)ľ. (57) <223> kóduje N-zakončenie aminokyselinového zvyšku KS-IL2 ťažkého reťazca <400> 31 .
cccggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagccag 57 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: proteínová sekvenciana spojenie medzi myším lýmfotaktínom a KS-IL2 ťažkým reťazcom <400> 32
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
10 15 .
Ser
PP

Claims (48)

  1. >ľ
    PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Multifunkčný fúzny proteín obsahujúci polypeptidový reťazec vyznačujúci sa tým, že definuje imunoglobulinovú oblasť (Ig) , prvý cytokín (Cl) a druhý, odlišný cytokín (C2) .
  2. 2. Fúzny proteín podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že uvedené Ig, Cl a C2 sa usporiadajú v smere Od N- k C- zakončení, aby vznikal fúzny proteín definovaný vzorcom vybraným zo skupiny:
    (i) Ig - - Cl - - C2; (ii) Cl - - Ig - - C2; (iii) Cl - - C2 - - ig.
    kde pomlčka predstavuje polypeptidovú väzbu alebo polypeptidový linker.
  3. 3. Fúzny proteín podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že uvedený Cl alebo C2 obsahujú IL-2, IL-4 alebo GM-CSF.
  4. 4. Fúzny proteín podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že uvedený Cl alebo C2 obsahujú podjednotku héterodimerického cytokínu.
  5. 5. Fúzny proteín podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že uvedený C 1 je chemokín.
  6. 6. Fúzny proteín podľa nároku 4 vyznačujúci sa tým, že uvedená podjednotka obsahuje podjednotku p35 IL-12 alebo podjednotku p40 IL-12.
    sC
  7. 7. fúzny proteín podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že uvedený Cl alebo C2 je ľudský cytokín.
  8. 8. Fúzny proteín podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že uvedená Ig obsahuje variabilnú doménovú oblasť imunoglobulínového ťažkého reťazca (VH) .
  9. 9. Fúzny proteín podľa jedného z nárokov 1 alebo 8 vyznačujúci sa tým, že uvedená Ig obsahuje konštantnú oblasť imunoglobulínového ťažkého reťazca.
    10. Fúzny proteín podľa nároku 9 vyznačujúci sa tým, že uvedená konštantná oblasť obsahuje otočnú doménovú oblasť, CH2 a doménu a CH3 doménu. 11. Fúzny proteín podľa nároku 10 vyznačujúci sa tým, že
    uvedená konštantná oblasť ďalej obsahuje CH1 doménu.
  10. 12. Fúzny proteín podľa nároku 9 vyznačujúci ša tým, že uvedená VH je imunologický reaktívna s nádorovo špecifickým antigénom alebo vírovým antigénom.
  11. 13. Fúzny proteín podľa nároku 1 vyznačujúci ša tým, že uvedené Cl a C2, ak sa spojujú v tomto fúznom proteíne, majú podobný cirkulačný polčas in vivo.
  12. 14. Fúzny proteín podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že uvedené Ig, Cl a C2 sú všetky aktívne pri rovnakých podmienkach.
  13. 15. Multifunkčný proteínový komplex vyznačujúci sa tým, že obsahuje prvý polypeptidový reťazec definujúci &
    Ί2τ druhý cytokín imunoglobulínovú oblasť a prvú časť prvého cytokínu, polypeptidový reťazec definujúci prvého cytokínu.
    a druhý druhú časť
  14. 16. Multifunkčný proteínový vyznačujúci sa tým, že prvý kovalentne viaže k druhému polypeptidovému reťazci.
    komplex podľa polypeptidový nároku reťazec sa
  15. 17. Multifunkčný vyznačujúci sa tým, proteínový komplex podľa že prvý cytokín je dimérický cytokín.
    nároku
  16. 18. Multifunkčný vyznačujúci sa tým, proteínový komplex podľa že prvý cytokín je IL-12.
    nároku
  17. 19. Multifunkčný vyznačujúci sa tým, proteínový komplex podľa že druhý cytokín je IL-2.
    nároku
  18. 20. Multifunkčný proteínový komplex vyznačujúci obsahuje aspoň:
    sa tým, že prvý časti fúzny proteín obsahujúci prvý cytokín fúzovaný. k aspoň' imunoglobulínového ťažkého reťazca fúzny proteín obsahujúci druhý, odlišný cytokín fúzovaný druhý k aspoň časti imunoglobulínového ťažkého reťazca.
  19. 21. Proteínový komplex podľa nároku prvý fúzny proteín sa kovalentne proteinu.
    2 0 vyznačujúci sa viaže k druhému tým, že fúznemu
    21 vyznačujúci sa tým, že
  20. 22. Proteínový komplex podľa nároku časť imunoglobulínového ľahkého reťazca sa viaže disulfidovou έΐ
    ΙΑ väzbou k časti imunoglobulinového ťažkého reťazca.
  21. 23. Proteínový komplex podľa nároku 20 vyznačujúci sa tým, že amino-zakončenie prvého cytokínu fúzuje ku karboxy-zakončeniu imunoglobulinového ľahkého reťazca.
  22. 24. Proteínový komplex podľa nároku 20 vyznačujúci sa tým, že amino-zakončenie druhého cytokínu fúzuje ku karboxy-zakončeniu imunoglobulinového ťažkého reťazca.
  23. 25. Proteínový komplex podľa nároku 20 vyznačujúci sa tým, že prvý cytokín je IL-12.
  24. 26. Proteínový komplex podľa nároku 20 vyznačujúci sa tým, že druhý cytokín je IL-12.
  25. 27. Multifunkčný fúzny proteín obsahujúci polypeptidový reťazec definujúci prvý cytokín (Cl) a druhý, odlišný cytokín (C2) vyznačujúci sa tým, že ak je uvedený C2 voľný, má cirkulačný polčas in vivo väčší, než je dvojnásobok cirkulačného polčasu voľného Cl, ale ak sa Cl viaže k C2 v uvedenom fúznom proteíne, uvedený Cl má cirkulačný polčas in vivo približne rovnaký ako C2 vo fúznom proteíne.
  26. 28. Fúzny proteín podľa nároku 27 vyznačujúci sa tým, že Cl je IL-12 alebo GM-CSF.
  27. 29. Fúzny proteín podľa nároku 27 vyznačujúci sa tým, že Cl je IL-2, 11-12 alebo ich podjednotka.
    Μ
    Vr
  28. 30. Fúzny proteín podlá nároku 27 vyznačujúci sa tým, že Czakončený koniec Cl sa viaže k N- zakončenému konci C2.
  29. 31. Fúzny proteín podľa nároku 27 C- zakončený koniec C2 sa viaže k N- zakončenému konci Cl.
  30. 32. Fúzny proteín podľa jedného z nárokov 30 alebo 31 vyznačujúci sa tým, že C- zakončený koniec sa viaže cez polypeptidový linker k N- zakončenému konci.
  31. 33. Fúzny proteín podľa nároku 32 vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje imunoglobulínovú oblasť (Ig).
  32. 34. Fúzny proteín podľa nároku 33 vyznačujúci sa tým, že uvedená Ig obsahuje oblasť premennej domény imunoglobulínového ťažkého reťazca (VH) .
  33. 35.. Fúzny proteín podľa nároku 33 vyznačujúci sa tým, že uvedená Ig obsahuje konštantnú oblasť imunoglobulínového ťažkého reťazca.
  34. 36. Fúzny proteín podľa nároku 35 vyznačujúci sa tým, že uvedená konštantná oblasť obsahuje otočnú doménovú oblasť, CH2 doménu a CH3 doménu.
    37. Fúzny proteín podľa nároku 36 vyznačujúci sa tým, že uvedená konštantná oblasť ťažkého reťazca ďalej obsahuje CH1 doménu. 38. Fúzny proteín podľa nároku 27 vyzná čuj ú ci sa tým, že
    uvedený voľný C2 má cirkulačný polčas in vivo aspoň o 4 cykly väčšie než Cl.
    Μ
  35. 39. Fúzny proteín podlá nároku 38 vyznačujúci sa tým, že uvedený C2 má cirkulačný polčas asi 8 krát väčší než Cl.
  36. 40. Nukleová kyselina vyznačujúca sa tým, že kóduje fúzny proteín podľa jedného z nárokov 1, 15, 20 alebo 27.
  37. 41. Bunka vyznačujúca sa tým, že obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 40.
  38. 42. Spôsoby prípravy fúzneho proteínu obsahujúceho prvý cytokín (Cl), druhý, rozdielny cytokín (C2) a smerovú časť schopnú smerovať dopredu vybrané miesto u cicavca vyznačujúce sa tým, že obsahuje nasledujúce kroky:
    (a) pôsobenie v nukleovej kyseline hostiteľskej bunky kódujúcej fúzny proteín obsahujúci Cl, C2 a smerovú časť schopnú smerovať uvedený fúzny porteín k dopredu vybranému miestu, ak sa fúzny proteín aplikuje do cicavca; a (b) získavanie uvedeného proteínu.
  39. 43. Spôsob smerovania prvého cytokínu (Cl) a druhého, rozdielneho cytokínu (C2) k dopredu vybranému miestu u cicavca vyznačujúci sa tým, že zahrňuj e:
    aplikáciu multifunkčného fúzneho proteínu obsahujúceho Cl, C2 a imunoglobulínovú oblasť (Ig) schopnú smerovať uvedený fúzny proteín k dopredu vybranému miestu u cicavca.
  40. 44. Spôsob podľa jedného z nárokov 42 alebo 43 vyznačujúci sa tým, že uvedená Ig obsahuje premennú oblasť domény imunoglobulínovéo ťažkého reťazca imunologický reaktívneho s antigénom pripraveným v dopredu vybranom mieste cicavca.
    vyznačujúci sa tým, že antigén je alebo vírový antigén.
    P
  41. 45. Spôsob podľa nároku 44 nádorovo-špecifický antigén
  42. 46. Spôsob podľa jedného z tým, že uvedená Ig ťažkého imunoglobulínového imunoglobulínový mieste cicavca.
    48.
    tým,
    49.
    tým,
    50.
    nárokov 42 alebo 43 vyznačujúci sa obsahuj e
    Fc-receptor reťazca pripravený konštantnú schopnú dopredu oblasť viazať vybranom ' t jedného z nárokov 42 alebo
    Ig, Cl a C2 sú aktívne, ak cicavcovi.
    jedného z nárokov 42
    Spôsob podľa že uvedený cicavec je človek.
    Spôsob podľa jedného z že uvedený Cl je IL-12
    Spôsob podľa nároku 49 sa vyznačujúci sa uvedený fúzny nárokov 42 alebo jeho alebo vyznačujúci sa vyznačujúci podj ednotka.
    alebo· sa vyznačujúci sa tým, že uvedený
    C2 je zo skupiny proteinu obsahujúci IL-2 a GM-CSF.
  43. 51. Fúzny proteín podľa niektorého z nárokov 1 až 14 na použitie ako liečivo.
  44. 52. Multifunkčný proteínový komplex podľa niektorého z nárokov 15 až 26 na použitie ako liečivo.
  45. 53. Multifunkčný fúzny proteín podľa niektorého z nárokov 27 až 39 na použitie ako liečivo.
    .A
    J*
  46. 54. Nukleová kyselina podlá nároku 40 na použitie ako liečivo.
  47. 55. Bunka podlá nároku 41 na použitie ako liečivo.
  48. 56. Použitie fúzneho proteínu podlá nároku 51, multifunkčného proteínového komplexu podlá nároku
    52, multifunkčného fúzneho proteínu podlá nároku
    53, nukleovej kyseliny podlá nároku 54 a/alebo bunky podlá nároku 55 na výrobu liečiva na liečenie rakoviny a vírusových infekcií.
SK184-2002A 1999-08-09 2000-08-09 A fusion protein, a multi-function protein complex, a multi-function fusion protein, a nucleic acid, a cell, their use, method for preparing a fusion protein and method of targeting cytokines SK1842002A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14792499P 1999-08-09 1999-08-09
PCT/US2000/021715 WO2001010912A1 (en) 1999-08-09 2000-08-09 Multiple cytokine-antibody complexes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK1842002A3 true SK1842002A3 (en) 2003-09-11

Family

ID=22523478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK184-2002A SK1842002A3 (en) 1999-08-09 2000-08-09 A fusion protein, a multi-function protein complex, a multi-function fusion protein, a nucleic acid, a cell, their use, method for preparing a fusion protein and method of targeting cytokines

Country Status (20)

Country Link
US (3) US6617135B1 (sk)
EP (1) EP1200479B1 (sk)
JP (2) JP4793971B2 (sk)
KR (1) KR100827757B1 (sk)
CN (1) CN1235911C (sk)
AT (1) ATE316982T1 (sk)
AU (1) AU778611B2 (sk)
BR (1) BR0013231A (sk)
CA (1) CA2380331C (sk)
DE (1) DE60025832T2 (sk)
DK (1) DK1200479T3 (sk)
ES (1) ES2256027T3 (sk)
HU (1) HUP0202442A3 (sk)
MX (1) MXPA02001417A (sk)
NO (1) NO20020641L (sk)
PL (1) PL202058B1 (sk)
RU (1) RU2263118C2 (sk)
SK (1) SK1842002A3 (sk)
WO (1) WO2001010912A1 (sk)
ZA (1) ZA200200789B (sk)

Families Citing this family (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1037927B1 (en) * 1997-12-08 2004-05-19 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
CA2328076C (en) * 1998-04-15 2009-10-06 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
US7666400B2 (en) 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
US7550143B2 (en) 2005-04-06 2009-06-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
DE60035871T2 (de) * 1999-05-19 2008-06-05 Merck Patent Gmbh Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
MXPA02001417A (es) * 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
ES2269366T3 (es) * 2000-02-11 2007-04-01 Merck Patent Gmbh Mejoramiento de la vida media en circulacion de proteinas de fusion basadas en anticuerpos.
DE60129695T2 (de) * 2000-06-29 2008-06-05 Merck Patent Gmbh Steigerung von durch antikörper-zytokin-fusionsproteine mediierten immunantworten durch eine kombinierte behandlung mit mitteln zur erhöhung der immunzytokinaufnahme
US20030049689A1 (en) * 2000-12-14 2003-03-13 Cynthia Edwards Multifunctional polypeptides
CN1330664C (zh) * 2001-03-07 2007-08-08 默克专利有限公司 用于含杂合同种型抗体部分的蛋白质的表达技术
US6992174B2 (en) * 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
CN100503639C (zh) 2001-05-03 2009-06-24 默克专利有限公司 重组肿瘤特异性抗体及其应用
MXPA04005266A (es) * 2001-12-04 2004-10-11 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada.
WO2003068977A2 (de) 2002-02-10 2003-08-21 Apoxis Sa Fusionkonstrukte, enthaltend aktive abschnitte von tnf-liganden
US7736652B2 (en) * 2002-03-21 2010-06-15 The Regents Of The University Of California Antibody fusion proteins: effective adjuvants of protein vaccination
US20070003514A1 (en) * 2002-04-05 2007-01-04 The Regents Of The University Of California Mono-and bi-functional antibody conjugates as effective adjuvants of protein vaccination
PT1531850E (pt) * 2002-06-07 2012-05-07 Zymogenetics Inc Utilização de il-21 e anticorpo monoclonal para tratar cancros sólidos
US7906118B2 (en) * 2005-04-06 2011-03-15 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (DNL) technology
US7169904B2 (en) 2002-12-17 2007-01-30 Emd Lexigen Research Center Corp. Immunocytokine sequences and uses thereof
WO2004069272A2 (en) * 2003-02-05 2004-08-19 Movecare Ltd Adjuvant combination for use in the immunization of a mamal comprising il2 and il12
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005007121A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
WO2005014642A2 (en) 2003-07-21 2005-02-17 Transgene S.A. Novel multifunctional cytokines
DE602004031341D1 (de) 2003-07-21 2011-03-24 Transgene Sa Multifunktionelle cytokine
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
AR046594A1 (es) * 2003-10-16 2005-12-14 Applied Research Systems Usos terapeuticos de variantes de quemoquina
WO2005063820A2 (en) * 2003-12-30 2005-07-14 Merck Patent Gmbh Il-7 fusion proteins
DK1699821T3 (da) * 2003-12-31 2012-07-16 Merck Patent Gmbh Fc-ERYTHROPOIETIN-FUSIONSPROTEIN MED FORBEDREDE FARMAKOKINETIKKER
WO2005070967A2 (en) * 2004-01-22 2005-08-04 Merck Patent Gmbh Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
US8003111B2 (en) * 2005-04-06 2011-08-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dimeric alpha interferon pegylated site-specifically shows enhanced and prolonged efficacy in vivo
US9481878B2 (en) 2004-02-13 2016-11-01 Immunomedics, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
US20110020273A1 (en) * 2005-04-06 2011-01-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific Immunocytokine Dock-and-Lock (DNL) Complexes and Therapeutic Use Thereof
US8551480B2 (en) 2004-02-13 2013-10-08 Immunomedics, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
US20110064754A1 (en) * 2005-03-03 2011-03-17 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates Comprising Poxvirus-Derived Peptides and Antibodies Against Antigen-Presenting Cells for Subunit-Based Poxvirus Vaccines
US8435539B2 (en) * 2004-02-13 2013-05-07 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
US8034352B2 (en) 2005-04-06 2011-10-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
US8652484B2 (en) 2004-02-13 2014-02-18 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
US8491914B2 (en) * 2004-02-13 2013-07-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) complexes for delivery of interference RNA
US7901680B2 (en) * 2005-10-19 2011-03-08 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) vaccines for cancer therapy
US8562988B2 (en) * 2005-10-19 2013-10-22 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Strategies for improved cancer vaccines
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
US7700318B2 (en) * 2004-08-25 2010-04-20 Amprotein Corporation Chimeric polypeptide and use thereof
US7589179B2 (en) * 2004-12-09 2009-09-15 Merck Patent Gmbh IL-7 variants with reduced immunogenicity
US20060188496A1 (en) * 2005-02-23 2006-08-24 Hanne Bentz Intranasal administration of active agents to the central nervous system
US20090136505A1 (en) 2005-02-23 2009-05-28 Johanna Bentz Intranasal Administration of Active Agents to the Central Nervous System
US8475794B2 (en) 2005-04-06 2013-07-02 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with anti-CD74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, Autoimmune disease and other diseases
US8158129B2 (en) 2005-04-06 2012-04-17 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dimeric alpha interferon PEGylated site-specifically shows enhanced and prolonged efficacy in vivo
US8349332B2 (en) 2005-04-06 2013-01-08 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecific and bispecific antibodies for enhanced toxicity to B-cell lymphomas and other diseases
US9623115B2 (en) 2005-04-06 2017-04-18 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-Lock (DNL) Complexes for Disease Therapy
US9931413B2 (en) 2005-04-06 2018-04-03 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
US8481041B2 (en) 2005-04-06 2013-07-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) constructs for human immunodeficiency virus (HIV) therapy
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
PT2270050E (pt) 2005-12-30 2013-09-12 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-cd19 com imunogenicidade reduzida
ES2384055T3 (es) 2005-12-30 2012-06-28 Merck Patent Gmbh Variantes de la interleucina-12p40 con estabilidad mejorada
WO2009126558A1 (en) * 2008-04-10 2009-10-15 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (dnl) technology
CN104524567A (zh) 2007-01-16 2015-04-22 阿布维公司 用于治疗银屑病的方法
EP2109457B1 (en) * 2007-02-12 2016-01-06 CSL Behring GmbH Therapeutic application of kazal-type serine protease inhibitors
WO2009061853A2 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides
KR20100126515A (ko) * 2008-03-18 2010-12-01 아보트 러보러터리즈 건선의 치료방법
CN103656638B (zh) * 2008-05-30 2016-04-27 埃克斯生物科技公司 白细胞介素-1α抗体及使用方法
MX2011008936A (es) * 2009-02-24 2011-09-21 Alexion Pharma Inc Anticuerpos que contienen peptidos terapeuticos mimeticos de tpo/epo.
CA2759333A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
KR102314003B1 (ko) * 2010-08-23 2021-10-19 얀센 바이오테크 인코포레이티드 종양성 질병들에 대한 치료
WO2012088446A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists and antagonists of interleukin-2
CN102221607B (zh) * 2011-03-29 2013-10-02 浙江大学医学院附属第一医院 一种抗体组合物及其应用
EP3626739A1 (en) * 2011-06-24 2020-03-25 Stephen D. Gillies Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
CN108129574A (zh) 2011-11-08 2018-06-08 Umc乌德勒支控股有限公司 包括白细胞介素10和白细胞介素4的融合蛋白
TWI487713B (zh) * 2011-12-06 2015-06-11 Nat Univ Chung Hsing 趨化素－細胞素融合蛋白和其應用
WO2013148337A1 (en) * 2012-03-29 2013-10-03 Altor Bioscience Corporation Methods for treating neoplasia
CA3004695C (en) 2012-04-30 2020-08-04 Biocon Limited Targeted/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same
WO2014066443A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Emory University Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto
CA2893981C (en) * 2012-12-05 2021-11-16 Shiow-Her Chiou Chemokine-cytokine fusion protein and its use
JP2016519111A (ja) * 2013-04-26 2016-06-30 フィロゲン エスピーエー 細胞外マトリックス成分に対する抗体にコンジュゲートしたｉｌ４
KR102322510B1 (ko) * 2013-07-18 2021-11-08 브이아이비 브이지더블유 수용체 결합친화성이 현격히 감소된 사이토카인을 수반하는 푸소카인
KR102305608B1 (ko) * 2013-07-19 2021-09-28 브이아이비 브이지더블유 사이토카인 길항제의 표적화
EP3049445A4 (en) 2013-09-24 2017-10-25 Medicenna Therapeutics, Inc. Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
ES2845924T3 (es) * 2013-10-15 2021-07-28 Scripps Research Inst Interruptores de células T con receptores de antígenos quiméricos peptídicos y usos de los mismos
BR112016011401A2 (pt) 2013-11-20 2017-09-26 Regeneron Pharma moduladores de aplnr e utilizações dos mesmos
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
WO2015164815A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2
DK3186283T3 (da) * 2014-08-29 2020-03-02 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med tumormålrettede IL-2- immuncytokinervarianter og antistoffer mod humant PD-L1
CN105543279A (zh) * 2014-10-30 2016-05-04 常州卡斯比生物科技有限公司 一种防治辐射线损伤、肿瘤治疗的IL-12/Fc融合蛋白的制备方法及其药剂
CN104403004B (zh) 2014-11-24 2017-10-13 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途
US10800828B2 (en) 2015-03-26 2020-10-13 The Scripps Research Institute Switchable non-scFv chimeric receptors, switches, and methods of use thereof to treat cancer
US11091546B2 (en) 2015-04-15 2021-08-17 The Scripps Research Institute Optimized PNE-based chimeric receptor T cell switches and uses thereof
TWI617319B (zh) * 2015-09-01 2018-03-11 免疫功坊股份有限公司 用以治療病理性血栓的融合蛋白
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2018023093A1 (en) * 2016-07-29 2018-02-01 Juno Therapeutics, Inc. Immunomodulatory polypeptides and related compositions and methods
JP7421338B2 (ja) * 2016-09-27 2024-01-24 エピセントアールエックス，インコーポレイテッド 免疫調節融合タンパク質
PE20191034A1 (es) 2016-10-14 2019-08-05 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas biespecificas que contienen proteinas de fusion fc il-15/il-15r y fragmentos de anticuerpo pd-1
US11174306B2 (en) 2016-10-19 2021-11-16 The Scripps Research Institute Chimeric antigen receptor effector cell switches with humanized targeting moieties and/or optimized chimeric antigen receptor interacting domains and uses thereof
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
WO2018144999A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences, Inc. Targeted engineered interferon and uses thereof
CN108623693B (zh) * 2017-03-20 2022-03-25 徐寒梅 一种融合蛋白及其制备方法和其在制备治疗眼科疾病、抗炎、抗肿瘤药物中的应用
CN108686202A (zh) 2017-04-06 2018-10-23 张晋宇 肿瘤免疫疗法
EP3630162A1 (en) * 2017-05-24 2020-04-08 Novartis AG Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
EP3630813A1 (en) 2017-05-24 2020-04-08 Novartis AG Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use in the treatment of cancer
EP3641814A4 (en) 2017-06-19 2021-06-23 Medicenna Therapeutics Inc. USES AND METHODS FOR IL-2 SUPERAGONISTS, AGONISTS, AND FUSIONS THEREOF
EP3675892A4 (en) 2017-07-03 2021-10-06 Torque Therapeutics, Inc. IMMUNOSTIMULATORY FUSION MOLECULES AND THEIR USES
EA202090838A1 (ru) 2017-09-27 2020-08-28 Эписентарикс, Инк. Иммуномодулирующие слитые белки
EP3541941A4 (en) * 2017-11-10 2019-12-25 I-Mab Biopharma US Limited FUSION PROTEINS CONTAINING ANTI-CD47 ANTIBODIES AND CYTOKINES
AU2018390418B2 (en) 2017-12-19 2023-12-21 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
US20210052727A1 (en) * 2018-01-24 2021-02-25 Beijing Percans Oncology Co., Ltd. Cytokine fusion proteins
EP3781598A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
AU2019256539A1 (en) 2018-04-18 2020-11-26 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
CU24554B1 (es) * 2018-05-07 2021-11-04 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por una muteína de interleucina 2 e interferón tipo 1
CA3102097A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Unversity Il-13/il-4 superkines: immune cell targeting constructs and methods of use thereof
AU2019290192A1 (en) 2018-06-21 2021-01-07 Shattuck Labs, Inc. Heterodimeric proteins and uses thereof
EP3831945A4 (en) * 2018-07-30 2022-05-04 Jinyu Zhang PROTEIN HETERODIMER AND ITS USE
AU2019355971A1 (en) 2018-10-03 2021-05-06 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
CN113423734A (zh) 2018-10-12 2021-09-21 Xencor股份有限公司 靶向PD-1的IL-15/IL-15RαFC融合蛋白及其在联合疗法中的应用
WO2020131656A1 (en) * 2018-12-17 2020-06-25 Immune Design Corp. Pathogen-associated molecular pattern molecules and rna immunogenic compositions and methods of using the compositions for treating cancer
EP3897853A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric fc fusion proteins containing il-15/il-15ra and nkg2d antigen binding domains
KR102524247B1 (ko) * 2018-12-21 2023-04-21 가톨릭대학교 산학협력단 p40-EBI3의 복합체 및 이의 용도
CN109824786A (zh) * 2019-03-01 2019-05-31 王仁喜 hIL-12p35-Fc融合蛋白、编码基因、重组载体、宿主细胞及应用
EP3955956A1 (en) 2019-04-19 2022-02-23 Synerkine Pharma B.V. Therapeutic crosslinking of cytokine receptors
CN111848811A (zh) * 2019-04-27 2020-10-30 张晋宇 一种蛋白质异二聚体及其用途
CN111848810A (zh) * 2019-04-28 2020-10-30 张晋宇 一种蛋白质分子及其用途
CN114008082A (zh) * 2019-06-24 2022-02-01 南京金斯瑞生物科技有限公司 单克隆抗体-细胞因子融合蛋白二聚体及其应用
CN112210014B (zh) * 2019-07-12 2022-10-11 北京科诺科服生物科技有限公司 一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物
JP2022542886A (ja) * 2019-07-25 2022-10-07 ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴ プロテアーゼ活性化治療剤を含む組成物および方法
AU2020358979A1 (en) 2019-10-03 2022-04-21 Xencor, Inc. Targeted IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
TW202128757A (zh) 2019-10-11 2021-08-01 美商建南德克公司 具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白
CN111303296B (zh) * 2019-12-16 2021-01-29 启辰生生物科技(珠海)有限公司 双功能融合多肽、细胞和药物组合物及应用
AU2021207652B2 (en) 2020-01-14 2023-08-03 Synthekine, Inc. Biased IL2 muteins methods and compositions
US20230076768A1 (en) 2020-01-14 2023-03-09 Synthekine, Inc. IL2 Orthologs and Methods of Use
US20230043257A1 (en) * 2020-01-21 2023-02-09 Jinyu Zhang Pharmaceutical composition and use thereof
MX2023000948A (es) * 2020-07-20 2023-04-14 Deka Biosciences Inc Proteínas de fusión de citocina doble que comprenden interleucina-10 (il-10).
EP4192852A2 (en) 2020-08-05 2023-06-14 Synthekine, Inc. Il10ra binding molecules and methods of use
WO2022032040A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Il2rb/il2rg synthetic cytokines
WO2022094046A1 (en) * 2020-10-29 2022-05-05 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-12 compositions and methods of use thereof
IL303967A (en) * 2020-12-23 2023-08-01 Immunowake Inc Immunogenic cytokines and their uses
WO2023011575A1 (zh) * 2021-08-04 2023-02-09 清华大学 一种靶向并杀伤病原体和/或肿瘤细胞的多功能融合蛋白药物
US20230210953A1 (en) * 2021-12-16 2023-07-06 Deka Biosciences, Inc. Use of dual cytokine fusion proteins comprising il-10 and adoptive cell therapies or bispecific t-cell engagers to treat cancer

Family Cites Families (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4966843A (en) 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US5082658A (en) 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
EP0158198A1 (en) 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US5643565A (en) 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
JPS63267278A (ja) 1986-03-14 1988-11-04 Toray Ind Inc インタ−フエロン結合体を暗号化する塩基配列
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4894227A (en) 1986-08-01 1990-01-16 Cetus Corporation Composition of immunotoxins with interleukin-2
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5508031A (en) 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US4732683A (en) 1986-12-02 1988-03-22 Biospectrum, Inc. Purification method for alpha interferon
US5019368A (en) 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ES2073394T3 (es) 1987-06-10 1995-08-16 Dana Farber Cancer Inst Inc Constructos de anticuerpos bifuncionales y su utilizacion para destruir selectivamente las poblaciones celulares.
EP0305967B1 (de) 1987-09-02 1993-05-05 Ciba-Geigy Ag Konjugate von Interferon alpha mit Immunglobulinen
ATE108068T1 (de) 1987-09-23 1994-07-15 Bristol Myers Squibb Co Antikörper-heterokonjugate zur töting von hiv- infizierten zellen.
PT88641B (pt) 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
ZA888978B (en) 1987-12-04 1990-07-25 Du Pont Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxylterminal extension
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
US5120525A (en) 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
DE3812605A1 (de) 1988-04-15 1990-06-07 Leskovar Peter Dipl Ing Dr Hab Immunregulative stoffe und stoffgemische zur aktiven beeinflussung des krankheitsverlaufes
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
IL91933A (en) 1988-10-11 1994-12-29 Univ Southern California Their immuno-bracelet and isophiles which are beneficial in increasing vascular permeability or blood supply to tumor or otherwise damaged tissue
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
DE69019609T2 (de) 1989-07-07 1995-11-30 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren Herstellung.
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
DK0493418T3 (da) 1989-09-20 1997-11-03 Abbott Lab Fremgangsmåde til fremstilling af fusionsproteiner
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
DK0790308T3 (da) 1989-12-22 2007-10-08 Hoffmann La Roche Cytoksisk lymfocytmodningsfaktor 35kD-underenhed samt monoklonale antistoffer rettet derimod
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1991013166A1 (en) 1990-03-02 1991-09-05 Abbott Biotech, Inc. Antibody constructs with enhanced binding affinity
WO1991014438A1 (en) 1990-03-20 1991-10-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
WO1992002240A2 (en) 1990-07-27 1992-02-20 Repligen Corporation Novel methods and compositions for treatment of angiogenic diseases
ES2118756T5 (es) * 1990-08-29 2004-01-16 Genetics Institute, Llc Estimuladores de hematopoyesis de multiples dominios.
EP0556328A4 (en) 1990-11-09 1994-06-08 Abbott Lab Bridging antibody fusion constructs
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
JPH09506761A (ja) 1990-11-09 1997-07-08 ステファン ディー．ギリーズ サイトカインの免疫複合体
US5709859A (en) 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
WO1993003157A1 (en) 1991-07-29 1993-02-18 Dana Farber Cancer Institute Plasmids for the rapid preparation of modified proteins
CA2116533A1 (en) 1991-08-30 1993-03-18 George J. Todaro Hybrid cytokines
US20020037558A1 (en) 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US5376367A (en) 1991-11-22 1994-12-27 Immunex Corporation Fusion proteins comprising MGF and IL-3
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
DK0633929T3 (da) 1992-04-01 2004-06-28 Univ Rockefeller Fremgangsmåde til in vitro proliferation af dendritcelleforstadier og deres anvendelse til at producere immunogener
IL105914A0 (en) 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
EP0671926B1 (en) 1992-08-11 2002-11-13 President And Fellows Of Harvard College Immunomodulatory peptides
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
WO1994009820A1 (en) 1992-11-05 1994-05-11 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US5738849A (en) 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5543297A (en) 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
CN1074243A (zh) 1993-02-06 1993-07-14 北京中化生物技术研究所 白介素6-白介素2融合蛋白及其制法和用途
US6096331A (en) 1993-02-22 2000-08-01 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents
US5759551A (en) 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
HUT73876A (en) 1993-04-29 1996-10-28 Abbott Lab Erythropoietin analog compositions and methods
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
CA2125763C (en) 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
GB9316989D0 (en) 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
ATE203274T1 (de) 1994-02-01 2001-08-15 Nasa Fusionierte proteine die antikörper-teile und nicht-antikörper-teile enthalten
WO1995028427A1 (en) 1994-04-15 1995-10-26 Imclone Systems Incorporated Chimeric interleukin-3/mutein interleukin-6 lymphokine
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
EP0758390B1 (en) 1994-04-26 2007-02-28 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin and method of use for inhibition of angiogenesis
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
EP0706799B1 (en) 1994-09-16 2001-11-14 MERCK PATENT GmbH Immunoconjugates II
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) * 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
WO1996028548A1 (en) 1995-03-10 1996-09-19 Genentech, Inc. Receptor activation by gas6
US5719266A (en) 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
CA2225454A1 (en) 1995-06-30 1997-01-23 Thomas Wesley Stephens Methods for treating diabetes
US6406689B1 (en) 1995-10-03 2002-06-18 Frank W. Falkenberg Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6080409A (en) 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
CA2255906A1 (en) * 1996-05-20 1997-11-27 Schering Corporation Human interleukin-1j and antagonists thereof
CN1136197C (zh) 1996-05-30 2004-01-28 霍夫曼-拉罗奇有限公司 新的哒嗪酮衍生物
US5922685A (en) 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
ES2176574T3 (es) 1996-09-03 2002-12-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Utilizacion de anticuerpos bi y triespecificos para la induccion de inmunidad tumoral.
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE69808609T2 (de) 1997-04-11 2003-06-12 Searle & Co Antagonistische anti-avb3 integrin antikörper
EP1037927B1 (en) * 1997-12-08 2004-05-19 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
AU764292B2 (en) * 1998-01-23 2003-08-14 Genetics Institute, Llc Method of using IL-11 to enhance cell mediated immunity for treating various viral and parasitic infections and cancer
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
CA2328076C (en) * 1998-04-15 2009-10-06 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
CA2328081A1 (en) * 1998-04-17 1999-10-28 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor
WO1999054484A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 The Regents Of The University Of California Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof
US6620382B1 (en) 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
DE69942207D1 (de) * 1998-08-25 2010-05-12 Merck Patent Gmbh Expression und export von angiostatin und endostatin als immunofusins
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
BR0007414A (pt) * 1999-01-07 2001-10-16 Lexigen Pharm Corp Expressão e exportação de proteìnas antiobesidade como proteìnas de fusão fc
BR0010322A (pt) 1999-05-06 2002-04-09 Univ Wake Forest Vetor de expressão, vacina e seu método de uso para eliciar uma resposta imune dirigida contra um antìgeno em um mamìfero
US6348192B1 (en) 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
DE60035871T2 (de) * 1999-05-19 2008-06-05 Merck Patent Gmbh Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
MXPA02001417A (es) 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
PT1719528E (pt) * 2000-02-24 2012-01-06 Philogen Spa Composições e métodos para tratamento de angiogénese em lesões patológicas
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
JP2004528001A (ja) * 2000-05-12 2004-09-16 ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド インビトロにおけるフコシル化組換えグリコペプチド
DE60129695T2 (de) * 2000-06-29 2008-06-05 Merck Patent Gmbh Steigerung von durch antikörper-zytokin-fusionsproteine mediierten immunantworten durch eine kombinierte behandlung mit mitteln zur erhöhung der immunzytokinaufnahme
MXPA03006294A (es) * 2001-01-18 2003-09-16 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion disfuncionales con actividad glucocerebrosidasa.
US7189830B2 (en) * 2001-02-19 2007-03-13 Merck Patent Gmbh Anti-KSA/IL-2 fusion proteins with reduced immunogenicity
KR100899970B1 (ko) * 2001-02-19 2009-05-28 메르크 파텐트 게엠베하 Ｔ-세포 에피토프의 동정 방법 및 감소된 면역원성을 갖는분자의 제조를 위한 용도
CN1330664C (zh) * 2001-03-07 2007-08-08 默克专利有限公司 用于含杂合同种型抗体部分的蛋白质的表达技术
US6992174B2 (en) * 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
CN100503639C (zh) * 2001-05-03 2009-06-24 默克专利有限公司 重组肿瘤特异性抗体及其应用
MXPA04005266A (es) * 2001-12-04 2004-10-11 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada.

Also Published As

Publication number Publication date
RU2263118C2 (ru) 2005-10-27
KR100827757B1 (ko) 2008-05-07
ZA200200789B (en) 2003-01-29
US20040072299A1 (en) 2004-04-15
DE60025832T2 (de) 2006-08-31
HUP0202442A3 (en) 2005-01-28
ATE316982T1 (de) 2006-02-15
WO2001010912A1 (en) 2001-02-15
CN1235911C (zh) 2006-01-11
US7141651B2 (en) 2006-11-28
AU6626800A (en) 2001-03-05
JP2003507012A (ja) 2003-02-25
DE60025832D1 (de) 2006-04-13
CN1382158A (zh) 2002-11-27
MXPA02001417A (es) 2002-08-12
JP4793971B2 (ja) 2011-10-12
US6617135B1 (en) 2003-09-09
US20070258944A1 (en) 2007-11-08
CA2380331C (en) 2012-11-20
US7582288B2 (en) 2009-09-01
PL353348A1 (en) 2003-11-17
EP1200479B1 (en) 2006-02-01
BR0013231A (pt) 2002-07-23
DK1200479T3 (da) 2006-05-15
NO20020641D0 (no) 2002-02-08
ES2256027T3 (es) 2006-07-16
JP2011067211A (ja) 2011-04-07
KR20020026368A (ko) 2002-04-09
HUP0202442A2 (hu) 2002-11-28
CA2380331A1 (en) 2001-02-15
AU778611B2 (en) 2004-12-16
PL202058B1 (pl) 2009-05-29
EP1200479A1 (en) 2002-05-02
NO20020641L (no) 2002-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100827757B1 (ko) 복수의 시토킨-항체 복합체
KR102609197B1 (ko) 인터류킨 15 단백질 복합체 및 그의 용도
US20200283498A1 (en) T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
KR100386171B1 (ko) 면역접합체ii
AU2001275246B2 (en) T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
Gillies et al. Biological activity and in vivo clearance of anti-tumor antibody/cytokine fusion proteins
JP3507507B2 (ja) 非免疫原性ペプチドを介して結合されたインターフェロン―αと免疫グロブリンとのハイブリッド
KR20030092015A (ko) 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을위한 발현 기술
JPH07223968A (ja) 免疫抱合体
KR100559918B1 (ko) 강화 백신
EP1731531B1 (en) Multiple cytokine-antibody complexes
US20210008167A1 (en) T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
FC9A Refused patent application