CN109824786A

CN109824786A - hIL-12p35-Fc融合蛋白、编码基因、重组载体、宿主细胞及应用

Info

Publication number: CN109824786A
Application number: CN201910156839.7A
Authority: CN
Inventors: 王仁喜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2019-05-31

Abstract

本发明提供了一种hIL‑12p35‑Fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，属于基因工程和生物医药技术领域。本发明所述编码hIL‑12p35‑Fc融合蛋白包括人成熟hIL‑12p35肽片段和Fc片段。该融合蛋白由人成熟hIL‑12p35肽片段与Fc片段顺序连接获得，能表达得到可溶性的hIL‑12p35‑Fc融合蛋白，且该可溶性融合蛋白具有良好的治疗自身免疫性疾病的生物活性。

Description

hIL-12p35-Fc融合蛋白、编码基因、重组载体、宿主细胞及应用

技术领域

本发明属于基因工程及生物医药技术领域，具体涉及hIL-12p35-Fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

背景技术

自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病如器官特异性自身免疫病。自身免疫性疾病涉及疾病之广，主要有器官特异性的自身免疫性疾病，如多发性脑脊髓硬化症(MS)、慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、急性特发性多神经炎等；还包括系统性的身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、系统性脉管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎等。随着我国社会经济的发展，自身免疫病的发病率日益上升，而且自身免疫病后期对人们生产、生活乃至生命健康造成的危害是非常严重的。加强该领域的基础性研究将会进一步了解自身免疫性疾病的发生、发展、转归，进而提高对它的诊断、治疗和预防。这对保障人类健康生活，促进经济社会的发展均有着重要的理论及现实意义。

IL-12家族成员不仅在感染及炎症过程中起着重要的调节作用，而且与脑脊髓炎、多发性硬化症、克罗恩病、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发病和治疗密切相关。IL-12和IL-23分别是Th1和Th17诱导产生的关键分子，而Th1和Th17是两类自身免疫病中重要的致病因子，因此IL-12和IL-23已被用于自身免疫病的的治疗靶点。而IL-27和IL-35能分别有效地抑制Th17细胞产生和诱导调节性T和B细胞产生，而用于抑制自身免疫疾病如葡萄膜炎和多发性硬化症，目前研究IL-27和IL-35的生物制剂正成为研究热点。然而，目前人们仍然不能有效的获得具有良好生物活性的可溶性hIL-35。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生理活性良好的可溶性hIL-12p35-Fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

本发明提供了一种hIL-12p35-Fc融合蛋白，所述hIL-12p35-Fc融合蛋白包括人成熟hIL-12p35肽片段和Fc片段；所述Fc片段为人免疫球蛋白链恒定区；所述Fc片段包括重链CH1、CH2、CH3、CH4中的两个以上的多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合；所述免疫球蛋白包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。

优选的，所述人成熟hIL-12p35肽片段的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

优选的，所述Fc片段为IgG4 Fc，所述IgG4 Fc包括IgG4铰链区、CH2和CH3；所述IgG4 Fc的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

优选的，所述hIL-12p35-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

本发明提供了编码hIL-12p35-Fc融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明提供了包含上述基因的重组载体。

优选的，所述重组载体的基础载体为昆虫表达载体pMIB。

优选的，所述昆虫表达载体pMIB包含SEQ ID No.3所示核苷酸序列的信号肽编码序列。

本发明提供了包含上述重组载体的重组宿主细胞。

本发明还提供了上述hIL-12p35-Fc融合蛋白、基因、重组载体或重组宿主细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

优选的，所述自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、多发性硬化、葡萄膜炎和牛皮癣中的一种或多种。

本发明提供了一种治疗自身免疫性疾病的药物，所述药物包括上述hIL-12p35-Fc融合蛋白。

优选的，所述药物还包括赋性剂、乳化剂、增溶剂、抗氧化剂、控释剂中的一种或多种。

本发明还提供了上述hIL-12p35-Fc融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养上述重组宿主细胞，得到培养物；

(2)从所述培养物中分离得到hIL-12p35-Fc融合蛋白。

有益效果：本发明提供了一种hIL-12p35-Fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。本发明所述编码hIL-12p35-Fc融合蛋白包括人成熟hIL-12p35肽片段和Fc片段。该融合蛋白由人成熟hIL-12p35肽片段与Fc片段顺序连接获得，能表达得到可溶性的hIL-12p35-Fc融合蛋白，且该可溶性融合蛋白具有良好的治疗自身免疫性疾病的生物活性。

本发明分析编码hIL-12p35碱基表达偏性，结果显示：hIL-12p35碱基本身的信号肽不利于表达。因此，本发明使用Honeybee melittin secretion信号肽(SEQ ID No.3)来表达hIL-12p35。本发明还将hIL-12p35与hIgG4 Fc段连接构成融合蛋白。hIgG4 Fc可减少融合蛋白诱导机体的免疫刺激，hIgG4 Fc段的加入不仅有利于蛋白的表达、纯化；还能有效提高蛋白在体内应用时的半衰期。另外，本发明在优选的方案中使用无血清培养的工程化High Five^TM细胞株，无血清表达有利于融合蛋白表达、纯化。

附图说明

图1为本发明实施例1所述计算机分析IL-12A(hIL-12p35)的密码子偏好性结果图；

图2为本发明实施例1所述纯化的p35-Fc融合蛋白与对照Fc蛋白的电泳结果图；

图3为本发明实施例1所述应用抗p35抗体对纯化的蛋白进行Western blot鉴定的结果图；

图4为本发明实施例1所述应用抗IgG Fc抗体对纯化的蛋白进行Westernblot鉴定的结果图；

图5为本发明实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制MRL/lpr小鼠B细胞增殖的实验结果图；

图6为本发明实施例2所述hIL-12p35-Fc诱导MRL/lpr小鼠产生调节性B细胞而抑制浆细胞产生的实验结果图；

图7为本发明实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制MRL/lpr小鼠自身抗体产生的实验结果图；

图8为本发明实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制EAE小鼠T细胞对自身抗原肽MOG33-55反应的实验结果图；

图9为本发明实施例2所述hIL-12p35-Fc诱导EAE小鼠产生调节性T细胞而抑制Th17产生的实验结果图；

图10为本发明实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制EAE小鼠疾病发生、发展的实验结果图；

图11为本发明实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制EAU小鼠T细胞对自身抗原反应的实验结果图；

图12为本发明实施例2所述hIL-12p35-Fc诱导EAU产生调节性T细胞而抑制Th17产生的实验结果图；

图13为本发明实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制EAU小鼠临床症状的实验结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种hIL-12p35-Fc融合蛋白，所述hIL-12p35-Fc融合蛋白包括人成熟hIL-12p35肽片段和Fc片段。该融合蛋白由人成熟hIL-12p35肽片段与Fc片段顺序连接获得，能表达得到可溶性的hIL-12p35-Fc融合蛋白，且该可溶性融合蛋白具有良好的治疗自身免疫性疾病的生物活性。

在本发明中，所述人成熟hIL-12p35肽片段为hIL-12p35亚基中去除信号肽的部分，其氨基酸序列优选如SEQ ID No.5所示。在本发明中，所述Fc片段为人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。例如，免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4；IgA-1和IgA-2以及不同的基因型。在本发明中，所述Fc片段优选包括至少一个免疫球蛋白绞链区，以及IgG的CH2和CH3区；更优选包括hIgG4 Fc，即IgG4铰链区，恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)组成。在本发明中，所述IgG4 Fc的氨基酸序列优选如SEQ ID No.7所示。所述hIL-12p35-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

本发明提供了编码hIL-12p35-Fc融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID No.8所示。在本发明中，所述编码hIL-12p35-Fc融合蛋白的基因由人成熟hIL-12p35肽的碱基序列与编码人IgG4 Fc铰链区(J)，恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)的碱基序列连接获得，能表达得到可溶性hIL-12p35-Fc融合蛋白，且该可溶性融合蛋白具有良好的治疗自身免疫性疾病的生物活性。Fc可减少融合蛋白诱导机体的免疫刺激，hIgG4 Fc段的加入不仅有利于蛋白的表达、纯化；还能有效提高蛋白在体内应用时的半衰期。

本发明提供了包含上述基因的重组载体。在本发明中，所述重组载体的基础载体优选为昆虫表达载体pMIB。所述昆虫表达载体pMIB优选包含SEQ ID No.3所示核苷酸序列的信号肽编码序列。本发明通过分析编码hIL-12p35碱基的表达偏性，结果显示：hIL-12p35碱基本身的信号肽不利于表达。因此，本发明优选使用包含Honeybee melittin secretion信号肽(SEQ ID No.3)的昆虫表达载体pMIB来表达hIL-12p35，有利于hIL-12p35-Fc融合蛋白的表达。本发明对上述重组载体的具体构建方法不作特别限定，本领域常规方法即可。

本发明提供了包含上述重组载体的重组宿主细胞。在本发明中，所述重组细胞优选为无血清培养的工程化High Five^TM细胞株；所述High Five^TM细胞株优选购买自Invitrogen公司，货号：B855-02。本发明对上述宿主细胞的具体转染方法不作特别限定，本领域常规方法即可。利用无血清表达有利于融合蛋白表达、纯化。

本发明还提供上述hIL-12p35-Fc融合蛋白、基因、重组载体或重组宿主细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。在本发明中，所述自身免疫性疾病优选包括系统性红斑狼疮、多发性硬化、葡萄膜炎和牛皮癣中的一种或多种。本发明实验结果表明：hIL-12p35-Fc融合蛋白能抑制小鼠MRL/lpr小鼠狼疮疾病的发生和发展；能抑制多发性硬化(MS)小鼠模型实验性自身免疫性脑膜炎(EAE)小鼠疾病的发生和发展；能抑制葡萄膜炎小鼠模型实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠疾病的发生和发展。

本发明提供了一种治疗自身免疫性疾病的药物，所述药物包括上述hIL-12p35-Fc融合蛋白。所述hIL-12p35-Fc融合蛋白在所述药物中的质量百分比为0.01～99.99％。优选的，所述药物还包括赋性剂、乳化剂、增溶剂、抗氧化剂、控释剂中的一种或多种。本发明对上述药物的制备方法不作特别限定，本领域常规方法即可。

(1)培养上述重组宿主细胞，得到培养物；

(2)从所述培养物中分离得到hIL-12p35-Fc融合蛋白。

本发明对具体的重组宿主细胞培养方法不作特别限定，本领域常规培养方式均可。在本发明的实施例中，所述培养前优选利用选择性培养基筛选表达量高的重组宿主细胞；所述选择性培养基优选为含有80μg/ml杀稻瘟素的无血清培养基。

培养重组宿主细胞后，得到培养物。本发明从所述培养物中分离得到hIL-12p35-Fc融合蛋白。在本发明中，所述分离方法优选采用如下步骤进行：

①收集样品：收集无血清培养60～85h的培养液上清；

②平衡：用5～10CV的平衡缓冲液平衡层析柱至流出液电导和pH不变；

③进料：样品缓冲液与平衡液一致；固体样品用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液用平衡液透析；高浓度样品溶液用平衡液稀释。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算；

④淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线；

⑤洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集流出液；然后用碱性缓冲液将收集到的蛋白溶液中和至中性。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(一)：hp35-Fc昆虫表达载体构建

表达载体构建过程：

(1)通过Pubmed数据库查询人IL-12A即hIL-12p35亚基含有信号肽的碱基序列(SEQ ID No.1)和氨基酸序列(SEQ ID No.2)；

SEQ ID No.1(hIL-12p35cDNA)：

atgtggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtctgcatccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtccagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggccagaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcctaa；

其中，5’端的碱基序列

“atgtggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtctgcatccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtccagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggcc”为信号肽编码序列；

3’端的碱基“taa”为终止密码子。

SEQ ID No.2(hIL-12p35氨基酸序列)：

MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS；

其中，5’端的氨基酸序列

“MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLA”为信号肽；

其余部分为成熟hIL-12p35。

(2)通过计算机分析IL-12A(hIL-12p35)的密码子偏好性，结果如图1所示。结果显示，信号肽编码区中存在不利于哺乳动物表达的编码(深灰色和浅灰色)。

(3)由于人hIL-12p35自身信号肽不利于哺乳系统表达，本发明使用带有Honeybeemelittin secretion signal信号肽的昆虫表达载体pMIB(pMIB/V5-HisA,B,and CVectorKit，Catalog no.V8030-01，购自Invitrogen公司，碱基序列如SEQ ID No.3所示)；

SEQ ID No.3(Honeybee melittin secretion signal信号肽碱基序列)：

ATGAAATTC TTAGTCAAC GTT GCC CTT GTT TTTATG GTC GTA TACATT TCT TACATCTAT GCC△(Melittin cleavage site)。

(4)在hIL-12p35亚基中去除信号肽和终止密码子的碱基序列后余下的即是编码成熟氨基酸的碱基序列(SEQ ID No.4)和氨基酸序列(SEQ ID No.5)。

SEQ ID No.4(人成熟hIL-12p35碱基编码序列)：

agaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcc；

SEQ ID No.5(人hIL-12p35碱基编码成熟氨基酸序列)：

RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS。

(5)通过Pubmed数据库查询人IgG4 Fc去除恒定区1(CH1)的碱基序列(SEQ IDNo.6)和氨基酸序列(SEQ ID No.7)，即包括铰链区(J)，恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)。

SEQ ID No.6(包括铰链区(J)，恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)，简写：人IgG4 Fc碱基序列)：

cccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaggacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa；

其中，3’端的六个碱基“tgataa”为两个终止密码子。

SEQ ID No.7(人IgG4 Fc氨基酸序列)：

PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVRVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

把编码人成熟hIL-12p35肽的碱基序列与编码人IgG4 Fc铰链区(J)，恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)的碱基序列连接，简写p35-Fc(SEQ ID No.8)。

SEQ ID No.8(hIL-12p35-IgG Fc，简写：p35-Fc碱基序列)：

GCATGCTAagaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttccCccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaggacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataaTCTAGA

其中，

“agaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcc”为编码人成熟hIL-12p35碱基序列；

“cccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaggacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa”为编码人IgG4 Fc铰链区(J)，恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)的碱基序列；

3’端的“tgataa”为两个终止密码子；

5’端的“GCATGC”和3’端的“TCTAGA”分别为SphI和XbaI限制性内切酶位点；

5’端的“TA”是为了确保正确编码p35-Fc氨基酸，防止移码。

编码人IgG4 Fc铰链区(J)，恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)的碱基序列(SEQ IDNo.9)。

SEQ ID No.9(hIgG Fc，简写：Fc碱基序列)：

GCATGCTACccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaggacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataaTCTAGA

其中，

3’端的“tgataa”为两个终止密码子；

5’端的“TA”是为了确保正确编码Fc氨基酸，防止移码。

(7)由通用生物系统(安徽)有限公司，通过基因(即p35-Fc碱基序列即SEQ IDNo.8，和Fc碱基序列即SEQ ID No.9)合成和利用SphI(GCATGC)和XbaI(TCTAGA)位点同源重组的方法将SEQ ID No.8或SEQ ID No.9分别重组到pMIB载体。

(8)由通用生物系统(安徽)有限公司通过基因测序鉴定pMIB/p35-Fc和pMIB/Fc两个表达质粒是正确的。

(二)：利用无血清培养的工程化High FiveTM细胞株表达p35-Fc融合蛋白。

(1)准备pMIB/p35-Fc和pMIB/Fc两个表达质粒

本发明使用PureLink^TM HQ Mini Plasmid分离质粒DNA纯化试剂盒(Invitrogen公司，目录号K2100-01)，从10-15mL培养细菌中分离10～15μg质粒DNA。

(2)准备High Five^TM昆虫细胞

对于每次转染，使用活力大于95％的对数期细胞。

①用无血清培养基Express Five SFM(Invitrogen公司，货号：10486-025)在60mm培养皿中接种2×10⁶个High Five^TM细胞(Invitrogen公司，货号：B855-02)；

②将细胞孵育至少15min而不摇动以允许细胞完全附着在培养皿的底部，形成单层细胞。

③通过倒置检查细胞，确认细胞已附着。

(3)质粒转染到High Five^TM细胞中

将质粒pMIB/p35-Fc或pMIB/Fc和试剂(Invitrogen公司，货号：10362-010)以适当的方式混合在一起，并与新接种的昆虫细胞一起培养。

A.准备每种转染混合物，使用1.5ml微量离心管。添加以下试剂：1mL无血清培养基，1-10μl pMIB/p35-Fc或pMIB/Fc(TE中约1μg/μl，pH＝8)，20μl试剂；

B.轻轻混合转染混合物10s。

C.将转染混合物在室温下孵育15min。当转染混合物孵育时，进行步骤D。

D.小心地从细胞中取出培养基，不要破坏细胞单层。

E.将整个转染混合物逐滴加入60mm培养皿中。

(4)获得稳定细胞株

a.转染后48h，取出转染液，加入新鲜培养基。

b.将细胞1：5(20％汇合)稀释后，在选择性培养基即含有80ug/ml杀稻瘟素Blasticidin S(Invitrogen公司，货号：R210-01)无血清培养基Express Five SFM中培养。

c.每隔3～4d更换一次选择性培养基，直至观察到焦点形成。

d.采用稀释的方法分离克隆细胞。

f.应用ELISA方法检测表达量高的细胞株。

(5)蛋白纯化

收集样品：收集无血清培养72h的pMIB/p35-Fc或pMIB/Fc稳定表达细胞的培养上清。

平衡：用5～10CV的平衡缓冲液(20mM PB+0.15M NaCl，pH 7.0，添加适当浓度的NaCl抑制非特异性吸附)平衡层析柱，至流出液电导和pH不变(与平衡液一致)。

进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤(0.45μm)处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。

淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

洗脱：用洗脱缓冲液(20mM乙酸钠，pH 3.0-4.0或0.1M甘氨酸，pH 3.0)洗脱，收集流出液。洗脱后，立刻用碱性缓冲液(如1M Tris/HCl,pH 9.0)将收集到的蛋白溶液中和到中性。

纯化的p35-Fc融合蛋白与对照Fc蛋白的电泳结果如图2所示。其中，1表示p35-Fc；2为marker；3表示Fc。图2结果表明：本发明获得了高纯化的p35-Fc融合蛋白与对照Fc蛋白。

(6)对蛋白进行westernblot鉴定。

A，应用抗p35抗体(Santa Cruz Biotech公司,货号：sc-9350)进行Western blot鉴定，鉴定结果如图3所示。其中，1表示Fc；2表示p35-Fc。图3结果表明：抗p35抗体能鉴定出p35-Fc。

B，应用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗人IgG4 Fc抗体(SouthernBiotech公司，货号9190-05)进行Westernblot鉴定，鉴定结果如图4所示。其中，1表示Fc；2表示p35-Fc。图4结果表明：抗IgG Fc抗体能鉴定出p35-Fc。

(7)蛋白定量

本发明对纯化后的蛋白进行定量，结果表明：本发明获得了0.9mg/ml的p35-Fc蛋白。

实施例2

对实施例1纯化获得的蛋白进行体外功能实验。

(一)hIL-12p35-Fc抑制系统性红斑狼疮小鼠模型MRL/lpr小鼠狼疮疾病发生、发展。

系统性红斑狼疮是一种以自身免疫性浆细胞产生自身抗体介导的自身免疫性疾病，而调节性B细胞降低是系统性红斑狼疮产生的重要决定性因素，而hIL-12p35-Fc能有效地诱导调节性B细胞产生，并抑制浆细胞产生，从而可能抑制系统性红斑狼疮发生、发展。

MRL/lpr小鼠模型与系统性红斑狼疮发病机制十分相似，是研究系统性红斑狼疮的极好动物模型，它能自发性地产生狼疮疾病。

MRL/lpr小鼠大约6个月时产生明显的狼疮疾病，此时每隔2天注射1次，连续注射两周。每只小鼠200ng对照Fc或hIL-12p35-Fc治疗MRL/lpr小鼠，每组有6只小鼠，在注射后第28d进行下面的实验：

(1)hIL-12p35-Fc抑制MRL/lpr小鼠B细胞增殖

自身抗原刺激淋巴细胞如B细胞增殖是自身免疫病的一个关键事件，为了评价hIL-12p35-Fc对MRL/lpr小鼠B细胞对自身抗原的反应的影响，使用自身抗原dsDNA刺激各种处理的MRL/lpr小鼠B细胞，使用MTS法检测细胞增殖，结果如图5所示。图5结果表明：hIL-12p35-Fc能有效地抑制MRL/lpr小鼠B细胞对自身抗原的反应。

(2)hIL-12p35-Fc诱导MRL/lpr小鼠产生调节性B细胞而抑制浆细胞的产生

调节性B细胞是免疫应答反应的抑制性细胞，而浆细胞是自身抗体的产生细胞。研究显示在系统性红斑狼疮疾病和它动物模型lupus内，调节性B细胞下降，而浆细胞升高。为了评价hIL-12p35-Fc对MRL/lpr小鼠体内调节性B细胞和浆细胞的影响，收集小鼠脾细胞，应用细胞流式技术检测脾细胞中IL-10⁺调节性B细胞和CD138⁺浆细胞的影响。结果如图6所示。图6结果表明：hIL-12p35-Fc能有效地诱导MRL/lpr小鼠产生调节性B细胞而抑制浆细胞的产生。

(3)hIL-12p35-Fc抑制MRL/lpr小鼠自身抗体的产生

自身抗体是系统性红斑狼疮发生、发展的关键致病因子，通过检测针对自身抗原如dsDNA的自身抗体水平，评价hIL-12p35-Fc对MRL/lpr小鼠疾病发生、发展的影响。结果如图7所示。图7结果表明：hIL-12p35-Fc能有效地抑制MRL/lpr小鼠疾病的发生、发展。

(二)hIL-12p35-Fc抑制多发性硬化(MS)小鼠模型实验性自身免疫性脑膜炎(EAE)小鼠疾病发生、发展。

多发性硬化(MS)是一种以Th17介导的自身免疫性疾病，而调节性T细胞降低是EAE产生的重要决定性因素，而hIL-12p35-Fc能有效地诱导调节性T细胞产生，并抑制Th17产生，从而可能抑制MS/EAE发生、发展。

实验性自身免疫性脑膜炎(EAE)小鼠模型与MS发病机制十分相似，是研究MS的极好动物模型。

EAE诱导：9周龄的C57BL/6小鼠接受皮下注射。乳化含有4mg/ml结核分枝杆菌H37Ra的CFA与125mg髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55肽1：1(v/v)；注射乳化物到小鼠尾巴的底部和两侧。同时腹膜内注射百日咳毒素(PBS中300ng百日咳毒素；ListBiological)。

根据以下分级标度对动物进行称重，监测和临床评估：

0＝没有迹象；

1＝远端尾部无力；

1.5＝尾巴虚弱和一些后肢无力；

2＝完全尾巴麻痹；

2.5＝完全尾瘫和部分后肢无力；

3＝后四肢完全无力；

3.5＝前肢无力，不能站立或直立；

4＝安乐死或自发死亡(如果失去了起始体重的20％，就会被安乐死)。

在第0天使用myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)35–55peptide诱导小鼠产生EAE，在第7天使用每只小鼠200ng对照Fc或hIL-12p35-Fc治疗EAE小鼠，每组有6只小鼠，在第21d进行下面的实验：

(1)hIL-12p35-Fc抑制EAE小鼠T细胞对自身抗原肽MOG33-55的反应

自身抗原刺激淋巴细胞如CD4+T细胞增殖是自身免疫病的一个关键事件，为了评价hIL-12p35-Fc对EAE小鼠T细胞对自身抗原的反应的影响，使用MOG33-55刺激各种处理的EAE小鼠CD4+T细胞，使用MTS法检测细胞增殖。结果如图8所示。图8结果表明：hIL-12p35-Fc能有效地抑制EAE小鼠T细胞对自身抗原的反应。

(2)hIL-12p35-Fc诱导EAE小鼠产生调节性T细胞而抑制Th17的产生

调节性T细胞是免疫应答反应的抑制性细胞，而Th17细胞是炎症反应细胞。研究显示在多发性硬化和它动物模型EAE内，调节性T细胞下降，而Th17升高。为了评价hIL-12p35-Fc对EAE小鼠体内调节性T细胞和Th17的影响，收集小鼠脑积液，应用细胞流式技术检测脑积液中Treg，Th17细胞。结果如图9所示。图9结果表明：hIL-12p35-Fc能有效地诱导EAE小鼠产生调节性T细胞而抑制Th17的产生。

(3)hIL-12p35-Fc抑制EAE小鼠疾病发生、发展

通过EAE发病标准判定EAE临床得分，通过EAE临床得分，评价hIL-12p35-Fc对EAE小鼠疾病发生、发展的影响。结果如图10所示。图10结果表明：hIL-12p35-Fc能有效地抑制EAE小鼠疾病的发生、发展。

(三)hIL-12p35-Fc抑制葡萄膜炎小鼠模型实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠疾病发生、发展。

葡萄膜炎(uveitis)是一种以Th17介导的自身免疫性疾病，而调节性T细胞下降是疾病发生、发展重要决定性因素，而hIL-12p35-Fc能有效地诱导调节性T细胞并抑制Th17产生从而抑制uveitis。

实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠模型与uveitis发病机制十分相似，是研究uveitis的极好动物模型。

EAU诱导：在含有150g牛光感受器间维甲酸结合蛋白(IRBP)和300g人IRBP肽(氨基酸残基1-20)的0.2mL溶液与含有结核分枝杆菌菌株H37Ra(2.5mg/ml)的完全弗氏佐剂1：1(v/v)乳化，主动免疫C57BL/6小鼠诱导了EAU。同时接受百日咳博德特氏菌毒素(0.2克/小鼠)。

在第0天使用bovine interphotoreceptor retinoid-binding protein(IRBP)andhuman IRBPpeptide(amino acid residues 1–20)诱导小鼠产生EAU，在第7天使用每只小鼠200ng对照Fc或hIL-12p35-Fc治疗EAU小鼠，每组有6只小鼠，在第21d进行下面的实验：

(1)hIL-12p35-Fc抑制EAU小鼠T细胞对自身抗原的反应

自身抗原刺激淋巴细胞如CD4+T细胞增殖是自身免疫病的一个关键事件，为了评价hIL-12p35-Fc对EAU小鼠T细胞对自身抗原的反应的影响，使用IRBP刺激各种处理的EAE小鼠CD4+T细胞，使用H-TdR掺入法检测细胞增殖。结果如图11所示。图11结果表明：HIL-12p35-Fc能有效地抑制EAU小鼠T细胞对自身抗原的反应。

(2)hIL-12p35-Fc诱导EAU产生调节性T细胞而抑制Th17的产生

调节性T细胞是免疫应答反应的抑制性细胞，而Th17细胞是炎症反应细胞。研究显示在视网膜炎和它动物模型EAU内，调节性T细胞下降，而Th17升高。应用细胞流式技术检测EAU小鼠眼内Th17细胞。结果如图12所示。图12结果表明：hIL-12p35-Fc能有效地EAU产生调节性T细胞而抑制Th17的产生。

(3)hIL-12p35-Fc抑制EAU小鼠临床症状

EAU模型是眼睛视网膜炎的动物模型，因此本发明通过眼底镜检查免疫后21d的小鼠眼睛，结果如图13所示。图13结果表明：hIL-12p35-Fc能有效地抑制EAU小鼠疾病的发展：接受Fc的对照EAU小鼠或EAU小鼠的眼底图像显示出严重的视神经乳头水肿，视网膜血管炎和脉络膜浸润；而p35-Fc显示抑制EAU，相对于对照小鼠，EAU评分显着降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 王仁喜

<120> hIL-12p35-Fc融合蛋白、编码基因、重组载体、宿主细胞及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60

catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120

ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180

gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240

gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300

gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360

ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420

aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480

atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540

atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600

atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660

gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720

gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aa 762

<210> 2

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala

1 5 10 15

Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg

20 25 30

Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val

35 40 45

Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro

50 55 60

Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg

65 70 75 80

Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr

85 90 95

Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys

100 105 110

Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu

115 120 125

Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys

130 135 140

Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser

145 150 155 160

Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn

165 170 175

Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn

180 185 190

Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser

195 200 205

Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys

210 215 220

Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala

225 230 235 240

Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser

245 250

<210> 3

<211> 63

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Thr Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Thr Thr Ala Gly Thr Cys Ala

1 5 10 15

Ala Cys Gly Thr Thr Gly Cys Cys Cys Thr Thr Gly Thr Thr Thr Thr

20 25 30

Thr Ala Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Ala Thr Ala Cys Ala Thr Thr

35 40 45

Thr Cys Thr Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Gly Cys Cys

50 55 60

<210> 4

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaaacctcc ccgtggccac tccagaccca ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa 60

aacctgctga gggccgtcag caacatgctc cagaaggcca gacaaactct agaattttac 120

ccttgcactt ctgaagagat tgatcatgaa gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg 180

gaggcctgtt taccattgga attaaccaag aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc 240

tctttcataa ctaatgggag ttgcctggcc tccagaaaga cctcttttat gatggccctg 300

tgccttagta gtatttatga agacttgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat 360

gcaaagcttc tgatggatcc taagaggcag atctttctag atcaaaacat gctggcagtt 420

attgatgagc tgatgcaggc cctgaatttc aacagtgaga ctgtgccaca aaaatcctcc 480

cttgaagaac cggattttta taaaactaaa atcaagctct gcatacttct tcatgctttc 540

agaattcggg cagtgactat tgatagagtg atgagctatc tgaatgcttc c 591

<210> 5

<211> 197

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu

1 5 10 15

His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys

20 25 30

Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp

35 40 45

His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu

50 55 60

Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr

65 70 75 80

Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe

85 90 95

Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr

100 105 110

Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys

115 120 125

Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu

130 135 140

Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser

145 150 155 160

Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu

165 170 175

Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser

180 185 190

Tyr Leu Asn Ala Ser

195

<210> 6

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccccatgcc catcatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 60

cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 120

gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 180

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 240

agggtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggta aggagtacaa gtgcaaggtc 300

tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 360

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 420

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 480

aatgggcagc cggaggacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 540

ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 600

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 660

tctccgggta aatgataa 678

<210> 7

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

20 25 30

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

35 40 45

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

50 55 60

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

65 70 75 80

Arg Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

85 90 95

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

100 105 110

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

115 120 125

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gln Pro Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

165 170 175

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

180 185 190

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

195 200 205

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 8

<211> 1283

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcatgctaag aaacctcccc gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc 60

actcccaaaa cctgctgagg gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag 120

aattttaccc ttgcacttct gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca 180

gcacagtgga ggcctgttta ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca 240

gagagacctc tttcataact aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga 300

tggccctgtg ccttagtagt atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga 360

ccatgaatgc aaagcttctg atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc 420

tggcagttat tgatgagctg atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa 480

aatcctccct tgaagaaccg gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc 540

atgctttcag aattcgggca gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttccc 600

ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc 660

ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg 720

tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg 780

tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca 840

gggtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag tgcaaggtct 900

ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc 960

gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca 1020

gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 1080

atgggcagcc ggaggacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct 1140

tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct 1200

catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt 1260

ctccgggtaa atgataatct aga 1283

<210> 9

<211> 692

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcatgctacc cccatgccca tcatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct 60

tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt 120

gcgtggtggt ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg 180

gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc 240

gtgtggtcag ggtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggtaag gagtacaagt 300

gcaaggtctc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag 360

ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga 420

accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt 480

gggagagcaa tgggcagccg gaggacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg 540

acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga 600

atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc 660

tctccctgtc tccgggtaaa tgataatcta ga 692

<210> 10

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu

1 5 10 15

His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys

20 25 30

Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp

35 40 45

His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu

50 55 60

Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr

65 70 75 80

Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe

85 90 95

Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr

100 105 110

Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys

115 120 125

Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu

130 135 140

Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser

145 150 155 160

Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu

165 170 175

Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser

180 185 190

Tyr Leu Asn Ala Ser Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

195 200 205

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

210 215 220

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

225 230 235 240

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

245 250 255

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

260 265 270

Thr Tyr Arg Val Val Arg Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

275 280 285

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

290 295 300

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

305 310 315 320

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

325 330 335

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

340 345 350

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr

355 360 365

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

370 375 380

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

385 390 395 400

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

405 410 415

Leu Ser Pro Gly Lys

420

Claims

1.一种hIL-12p35-Fc融合蛋白，其特征在于，所述hIL-12p35-Fc融合蛋白包括人成熟hIL-12p35肽片段和Fc片段；所述Fc片段为人免疫球蛋白链恒定区；所述Fc片段包括重链CH1、CH2、CH3、CH4中的两个以上的多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合；所述免疫球蛋白包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。

2.根据权利要求1所述的hIL-12p35-Fc融合蛋白，其特征在于，所述人成熟hIL-12p35肽片段的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

3.根据权利要求1所述的hIL-12p35-Fc融合蛋白，其特征在于，所述Fc片段为IgG4 Fc，所述IgG4 Fc包括IgG4铰链区、CH2和CH3；所述IgG4 Fc的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

4.根据权利要求1所述的hIL-12p35-Fc融合蛋白，其特征在于，所述hIL-12p35-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

5.编码hIL-12p35-Fc融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示。

6.包含权利要求5所述基因的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的基础载体为昆虫表达载体pMIB。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述昆虫表达载体pMIB包含SEQ IDNo.3所示核苷酸序列的信号肽编码序列。

9.包含权利要求6～8任意一项所述重组载体的重组宿主细胞。

10.权利要求1～4任意一项所述hIL-12p35-Fc融合蛋白、权利要求5所述基因、权利要求6～8任意一项所述重组载体或权利要求9所述重组宿主细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、多发性硬化、葡萄膜炎和牛皮癣中的一种或多种。

12.一种治疗自身免疫性疾病的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求2所述hIL-12p35-Fc融合蛋白。

13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于，所述药物还包括赋性剂、乳化剂、增溶剂、抗氧化剂、控释剂中的一种或多种。

14.权利要求1～4任意一项所述hIL-12p35-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)培养权利要求9所述重组宿主细胞，得到培养物；

(2)从所述培养物中分离得到hIL-12p35-Fc融合蛋白。