CN105543279A - 一种防治辐射线损伤、肿瘤治疗的IL-12/Fc融合蛋白的制备方法及其药剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种IL-12-Fc融合蛋白(IL-12/Fc)涉及辐射损伤防治、肿瘤治疗领域。本发明通过分别构建pN24-Fc-muIL-12_P35、p64-muIL-12_P40质粒,连接后转化大肠杆菌获得pN24-Fc-muIL12(p35+p40)质粒,然后转染NS0细胞,通过细胞翻译后自然组装表达并纯化muIL-12/Fc融合蛋白,获得的IL-12/Fc具有表达量高、兼具IL-12以及Fc片段高活性且稳定、纯度高等特点。本发明提供的IL-12/Fc具有生物利用度高,诱导IL-12受体表达,促进内源性IL-12及IFN-γ的分泌的特性,能有效改善因辐射线照射引起的骨髓造血功能障碍,促进修复胃肠道结构和功能损伤,调节机体免疫力,并具有显著的抑制肿瘤功效。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种辐射线损伤防治和肿瘤治疗的药物,具体讲涉及一种防治辐射线损伤、治疗肿瘤的IL-12-Fc融合蛋白的制备方法及其药剂。
【背景技术】
辐射给人类健康带来的损伤巨大,易损的机体主要器官有:骨髓、胃肠道、大脑等。众所周知,大于10Gy放射所致的胃肠道与大脑放射综合征多因严重的多器官功能衰竭所致的患者死亡率几近100%,4-10Gy放射所致骨髓放射综合征患者则可通过诸如细胞因子治疗、造血干细胞移植等综合救治挽救生命。研究、探索辐射损伤的防治手段,积极寻找有效抗辐射损伤药物已成为一个迫切需要解决的问题,目前抗辐射损伤药物研究已取得瞩目的成就,但是仍然存在很多问题,如:药物的毒性、药物的稳定性、有效时间、用药途径等,很多药物的化学成分及活性成分的研究还不够深入,药物应用的最佳时机和剂量也需要进一步研究。
白介素是免疫系统分泌的主要起免疫调节作用的蛋白,其大部分生物学作用都与抗肿瘤的调节有关,特别是新命名的几种白介素一开始就展示出诱人的抗癌前景,白介素-12就是其中之一。IL-12又称自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)和细胞毒淋巴细胞成熟因子(CTMF),能促进细胞介导的免疫应答能力,包括增强NK细胞毒活性、扩增CTL细胞、激活巨噬细胞,能够促进Th0细胞向Th1细胞的分化,促进NK细胞成熟,并产生INF-γ、TNF-α等,促进细胞免疫,因而在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。提高体内细胞因子水平的具体途径有多种,主要为外源性细胞因子注入疗法和细胞因子的基因疗法即导入细胞因子基因在体内持续高效的产生细胞因子而发挥抗肿瘤作用。NANNI等用反转录病毒载体将白介素-12的融合基因导入MHC抗原阴性肿瘤细胞作为疫苗,IL-12产量达到每24h(400~2500)pg/106。MEKO用重组疫苗病毒载体在Metha肉瘤细胞中高表达白介素-12达每24h1.5ug/106,并可以持续9d。
细胞因子已广泛应用于辐射损伤的临床救治,成为当今抗辐射药物的研究热点。但对用于辐射损伤防治时的作用机制、用药剂量和用药时机等问题仍处在研究之中。而因IL-12(IL-12)具有造血促进、免疫调节功能,所以在放射损伤防治、肿瘤治疗中一度受到人们的重视。IL-12是由α亚基(P35)和β亚基(P40)组成的异二聚体,主要由抗原递呈细胞、T细胞、B细胞等分泌,其特殊性在于α亚基(P35)和β亚基(P40)必须由同一个细胞通过转录后翻译组装而成的异二聚体才具有生物学活性。不同细胞表达分泌的亚基即使组合成异二聚体仍然无生物学活性。且由于IL-12的半衰期短,从而导致连续用药多次,机体敏感性逐渐下降,药物剂量逐渐增加,受者随之出现发热、感染甚至死亡等明显副作用,而代谢动力学快的缺陷又限制了其进一步的深入研发进程。但其特殊的生物学功能吸引了广大学者致力于其低剂量、单次给药的临床研究。
近年来,不同实验室曾使用不同载体系统构建含人(h)IL-12p40和p35表达元件的载体,将IL-12基因导入成纤维细胞或肿瘤细胞使其分泌IL-12,提高局部IL-12的浓度。另有将延长蛋白血清半衰期的已知Fc片段连接形成的融合蛋白,已有研究采用P40-P35-Fc直接连接形成IL-12/Fc单链融合蛋白的。这些方法不但复杂,且表达量低、单链融合蛋白稳定性差,容易降解或形成多聚体,不合适大规模工业化生产。
【发明内容】
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种具有诱导IL-12受体表达、内源性IL-12分泌、IFN-γ分泌的特性,能有效促进辐射线照射致骨髓造血功能抑制的快速重建,促进损伤后的胃肠道结构和功能的修复,调节机体免疫功能,具有显著肿瘤抑制功能。本发明提供的含有IL-12/Fc蛋白的药物,具有低剂量、高效、副作用小预防、治疗辐射引起的机体损伤以及肿瘤治疗。
上述发明目的采用下述技术方案实现:本发明提供了一种IL-12-Fc融合蛋白的制备方法,融合蛋白由Fc片段与IL-12中的一个亚基(p35或p40)直接融合后再和另一个亚基在同一细胞内共同表达,进而组建成具有生物活性的IL12-Fc融合蛋白。
本发明提供的制备方法中,Fc片段直接与白介12中p35亚基融合形成Fc-p35融合蛋白,其氨基酸序列为SEQ6或SEQ8。
本发明提供的制备方法中,Fc-p35融合蛋白,其核苷酸序列为SEQ5或SEQ7。
本发明提供的制备方法中,Fc片段直接与IL-12中p40亚基融合形成Fc-p40融合蛋白,其氨基酸序列为SEQ10或SEQ12。
本发明提供的制备方法中,Fc-p40融合蛋白,其核苷酸序列为SEQ9或SEQ11。
本发明提供的制备方法中,Fc片段包括人IgGFc片段或其经过修饰的Fc片段。
本发明提供的制备方法中Fc片段为人IgGFc片段。
本发明提供的制备方法中表达载体为真核载体。
本发明提供的制备方法中载体为哺乳细胞表达载体。
本发明提供的制备方法中,含有Fc-(p35+p40)表达载体中p35和p40前均含有启动子;启动子包括CMV启动子。
利用本发明提供的制备方法制得的IL-12/Fc融合蛋白制备含有IL-12-Fc融合蛋白的药剂,用于制备防治辐射线损伤、肿瘤治疗的药物中。
本发明提供了一种IL-12-Fc融合蛋白的制备方法,由Fc片段与IL-12中的一个亚基(p35或p40)再和另一个亚基在同一细胞内共同表达,最终得到具有生物活性的IL-12-Fc融合蛋白。目前已有的构建IL12-Fc的方法是将P40-P35-Fc融合成一条链来表达,主要是表达不理想,单链融合蛋白容易降解。而用本方法制备表达量高,稳定性好,适合产业化。采用Fc片段与p34或p40融合时,不采用连接蛋白,可有效保持表达、纯化后IL-12的生物学结构与功能,利用Fc片段的生物学特性延长体内IL-12的生物半衰期,从而为实现辐射损伤防治、肿瘤治疗的低剂量、单次给药的临床应用奠定理论与实验基础。
本发明提供的制备方法中的Fc片段包括但不限于人或动物的IgG或它们的亚型,Fc片段选自天然型Fc时较优。
本发明提供的制备方法中的表达载体为真核载体,也可根据需要选用哺乳细胞表达载体。
本发明提供的制备方法为分别构建p35-Fc和p40质粒,转化获得含有Fc-(p35+p40)表达载体,转染同一细胞表达;或者分别构建p40-Fc和p35质粒,转化获得含有Fc-(p35+p40)表达载体,转染同一细胞表达。本发明提供的制备方法中含有Fc-(p35+p40)表达载体中p35和p40前均含有启动子,启动子包括但不限于CMV启动子。本发明还提供了一种含有IL-12/Fc药物,并将药物用于制备治疗辐射线损伤、肿瘤防治的药物中。
本发明利用huFc直接与p35或p40融合并不限定其连接端,huFc可以与p35或p40的C端或N端连接,4种连接方式均可以用于实现本发明。本发明为验证Fc与IL-12亚基融合并表达,采用小鼠IL-12/Fc融合蛋白进行具体的模拟实验,以证实本发明提供的技术方案具有的可实施性。
本发明提供了一种具体的制备方法,包括下述步骤:
构建pN24-Fc-muIL-12_P35质粒:
1)扩增小鼠IL-12P35基因引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示:
2)采用Sma1和EcoRI对PCR产物进行双酶切,将获取的片段插入经Sma1和EcoRI双酶切的含CMV启动子和人免疫球蛋白IgG1恒定区的pN24-Fc质粒,链接后的DNA转化大肠杆菌菌株XL-1;
3)氨苄抗性的克隆经PCR和DNA测序筛选、鉴定,选择DNA序列正确的质粒并命名为pN24-Fc-muP35;
构建p64-muIL-12_P40质粒:
1)扩增小鼠IL-12P40基因引物序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示:
2)采用Hind3和EcoRI对PCR产物进行双酶切,将获取的片段插入经Hind3和EcoRI双酶切的含CMV启动子的pN64质粒,链接后的DNA转化大肠杆菌菌株XL-1;
3)氨苄抗性的克隆经PCR和DNA测序筛选、鉴定,选择DNA序列正确的质粒并命名为pN64-muP40;
构建表达载体pN24-Fc-muIL12(p35+p40)质粒:
采用Not1/Sal1酶切pN64-muP40质粒,纯化获取包含CMV启动子和小鼠IL-12p40基因的片段,纯化的片段与经Not1/Sal1酶切pN24-Fc-muP35的纯化片段连接,并转化大肠杆菌菌株XL-1,氨苄抗性的克隆经PCR和DNA测序验证,选取序列正确的质粒并命名为pN24-Fc-muIL12(p35+p40);
转染与表达通过转染同一个小鼠骨髓瘤NS0细胞,获得具有完全生物学活性的IL-12/Fc融合蛋白。具体采用muIL-12/Fc,将质粒pN24-Fc-muIL12(p35+p40)电转小鼠骨髓瘤NS0细胞后4周,用间接酶联免疫检测方法筛选细胞培养上清,高表达muIL12/Fc的克隆采用5%胎牛血清培养基于3升搅拌罐培养扩增;纯化得到的muIL-12/Fc融合蛋白。其中采用蛋白A亲和层析以及离子交换层析纯化得到的IL-12/Fc融合蛋白。
根据本发明的IL-12/Fc的制备理念,但不限于下述具体实施方式,仅通过下述这一种具体的操作方法制备IL-12/Fc并进行试验:
1、pN24-Fc-muIL-12_P35质粒构建:
小鼠IL-12P35基因扩增引物序列如下:
SEQIDNo.15’-CTGTCCCCGGGGAGGGTCATTCCAGTCTCTGGA,
SEQIDNo.25’-ATCAATGAATTCTCAGGCGGAGCTCAGATAGCC。
用限制性内切酶Sma1和EcoRI对PCR产物酶切,获取片段插入经Sma1和EcoRI酶切的含CMV启动子和人免疫球蛋白IgG1恒定区的pN24-Fc质粒。链接后的DNA转化大肠杆菌菌株XL-1,氨苄抗性的克隆经PCR和DNA测序筛选、鉴定。选择DNA序列正确的质粒并命名为pN24-Fc-muP35。
2、p64-muIL-12_P40质粒的构建:
小鼠IL-12P40基因扩增引物如下:
SEQIDNo.35’-GTTAAGCTTGCCGCCACCATGTGTCCTCAGAAGCTAACC
SEQIDNo.45’-CTACGTGAATTCCTAGGATCGGACCCTGCAGGGAAC
用限制性内切酶Hind3和EcoRI对PCR产物进行酶切,获取片段插入经Hind3和EcoRI酶切的含CMV启动子pN64质粒。链接后的DNA转化大肠杆菌菌株XL-1,氨苄抗性的克隆经PCR和DNA测序筛选、鉴定。选择DNA序列正确的质粒并命名为pN64-muP40。
3、表达载体构建:用Not1/Sal1酶切pN64-muP40质粒,纯化获取包含CMV启动子和小鼠IL-12p40基因的片段。纯化的片段与经Not1/Sal1酶切pN24-Fc-muP35连接,并转化大肠杆菌菌株XL-1。氨苄抗性的克隆经PCR和DNA测序验证,选取序列正确的质粒并命名为pN24-Fc-muIL12(p35+p40),质粒DNA纯化后保存于4℃(图1)。
4、muIL12/Fc在NS0细胞的转染与表达
采用小鼠骨髓瘤NS0细胞表达小鼠muIL12/Fc。目标质粒电转NS0细胞后4周,采用间接酶联免疫检测方法筛选细胞培养上清,高表达muIL12/Fc的克隆采用5%胎牛血清培养基中培养扩增。分泌的融合蛋白采取蛋白A亲和层析以及离子交换层析纯化。
5、muIL12/Fc融合蛋白的筛选
移取活性克隆细胞上清后用酶联免疫技术检测蛋白产物:100ul抗Fc单克隆抗体(碳酸盐缓冲液:0.01MNa2CO3,0.035MNaHCO3,pH9.6)加入96孔板,4℃过夜孵育,含0.1%Tween-20的PBS洗涤3次。每孔加入经倍比稀释后上清100ul,室温孵育60分钟,洗涤3次后加入二抗(初次筛选使用100ul经PBS-Tween缓冲液1:5000稀释辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IL-12单克隆抗体),洗涤3次后加入底物(1.0mg/ml的2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐,0.1M、pH4.0柠檬酸盐缓冲液,0.03%过氧化氢)显色15分钟,酶标仪(Bio-Tek)检测450nm吸光度值(OD450),用标准曲线计算蛋白浓度(图2)。
6、WesternBlot分析融合蛋白Fc-IL-12
将融合蛋白muIL12/Fc和人IgG稀释至终浓度20ug/ml,加入上样缓冲液,水浴煮沸5分钟,SDS聚丙烯酰胺凝胶每孔加样5ul(0.1ug),120mV电泳45分钟,凝胶转纤维素膜,加入羊抗鼠IL-12(P35+P40)或者抗人IgG-辣根过氧化物酶4℃过夜,化学发光底物显色。WesternBlot实验结果显示,成功表达muIL12/Fc(图3)。
目前构建含IL-12基因载体的主要困难在于IL-12自身结构的特殊性。天然IL-12具有独特的异源二聚体结构,由p35和p40两个亚基通过二硫键公家连接而成的糖基化肽链。IL-12p35和p40基因定位于不同的染色体,各自受不同的启动子和增强子调节,按需生成有活性的p70或拮抗性p(40)2,及单体p40。活性形成的IL-12p70需要两条亚基共同表达,并以1:1形式进行自然组合。对已报到的IL-12基因载体来说,存在p40和p35不匹配的组合形式。
该具体实施方式中分别构建p35/Fc和p40质粒(或者p40/Fc和p35质粒)并采用两个CMV启动子分别启动p35/Fc、p40亚基(或者p40/Fc、p35亚基)的转录,利用转染同一个NS0细胞的技术方案,实现了同一细胞表达组装具有完全生物学活性的IL-12/Fc融合蛋白。构建融合基因,可使其在启动子的控制下,翻译表达活性蛋白,保证p35和p40以1:1比例形成异二聚体。与天然IL-12相比,本发明提供的IL-12/Fc是将编码p40或p35亚基与片段直接相连,而不采用linker,使得IL-12/Fc融合蛋白具有天然IL-12类似的空间构象,具有与天然IL-12相同的生物学功能。试验证据提示,IL-12/Fc融合蛋白具有显著延长的生物半衰期,且其血清药物浓度水平及峰值显著高于IL-12蛋白,其改良的生物学特性为降低给药剂量、降低毒副作用、维持生物学功能提供了可靠的依据。肿瘤治疗的动物模型试验研究结果亦证实,IL-12/Fc融合蛋白具有更显著的肿瘤抑制作用,推测可能源于其基于生物半衰期长促进的生物学功能:诱导内源性IL-12、IFN-γ分泌水平显著高于IL-12。急性放射骨髓综合征、肠道综合征的救治研究发现,融合蛋白具有缓解外周血细胞计数下降、促进骨髓造血恢复、诱导肠道细胞IL-12Rβ表达水平、改善肠道辐射后损伤、促进损伤后恢复的效果,且显著优于IL-12蛋白处理组。(质粒是有由LonzaBiologics的PEE12和PEE6衍生而来,细胞株来源于ATCC。)
总之,IL-12/Fc融合蛋白利用Fc片段的生物学特性,有效改善了其在血清中生物利用度,既增强了其生物学作用又延长了其半衰期,为其进一步的单次低剂量注射治疗肿瘤、救治急性放射综合征的应用研究提供了有效可靠的依据。
通过小鼠、大鼠实验表明,本发明技术方案的实施具有以下有益效果:
1.本发明制备的IL-12/Fc具有表达量高、兼具IL-12以及Fc片段高活性且稳定、纯度高等特征;
2.本发明制备的IL-12/Fc用于治疗时,具有低剂量、高效、副作用小等优点;
3.本发明提供的IL-12/Fc融合蛋白可显著提高辐射线照射损伤后小鼠存活率;
4.本发明提供的IL-12/Fc融合蛋白可具有调节机体免疫系统功能,诱导内源性IL-12受体、IL-12表达,显著提高IFN-γ的分泌水平;
5.本发明提供的IL-12/Fc融合蛋白可显著抑制实验性肿瘤生长。
通过小鼠实验验证可知,应用于人体或其他动物中,应产生或达到具有相同/相似的技术效果。
【附图说明】
图1为IL-12/Fc融合蛋白载体构建及基因序列结构图,图1pN24-Fc-muIL12(p35+p40);
图2为ELISA分析muIL-12/Fc的Fc活性,酶标仪(Bio-Tek)检测450nm吸光度值(OD450),采用标准曲线计算蛋白浓度图;
图3为WesternBlot分析融合蛋白Fc-IL-12的SDS电泳图片,SDS-PAGE和WB分析muIL-12/Fc融合蛋白A.SDS-PAGE.a1:分子量,a2:纯化的muIL12/Fc,a3:纯化的IgG;BWB(羊抗鼠IL-12抗体),b1:纯化的muIL12/Fc;b2:纯化的IgG;CWB(羊抗人Fc抗体);c1:纯化的muIL12/Fc,c2:纯化的IgG;
图4为IL-12/Fc融合蛋白诱导鼠T细胞活化分泌IFN-γ表达量图,鼠IL-12/Fc融合蛋白诱导鼠T细胞分泌IFN-γ;每个浓度值中3个柱形图从左到右依次为rmIL-12,muIL-12/Fc,chTNF-3;
图5为5Gy辐照后小鼠存活率;
图6为骨髓细胞形态学A小鼠骨髓像;B骨髓造血组织所占面积;C巨核细胞数量/高倍视野;
图7为外周血血常规结果;
图8为muIL-12/Fc治疗后小鼠内源性IL-12、EPO、IFN-γ水平;
图9为大鼠空场肠道组织HE染色(×400),A腹腔大体图;B空肠HE染色图;C空肠IL-12受体免疫组化图;
图10为muIL-12/Fc融合蛋白抑制实验性小鼠肾癌的生长。A,肿瘤生长曲线;B处理后25天肿瘤包块;C处理后25天剥离肿瘤体积。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例,进一步阐述本发明,应理解,下述实施例仅用于说明本发明,而不应理解为对本发明保护范围的限定,本领域技术人员可以根据本发明提供的创造思路而选择具体的表达方式来实现本发明。
一、muIL-12/Fc融合蛋白表达载体构建及其体外活性鉴定
1、pN24-Fc-muIL-12_P35质粒构建:
小鼠IL-12P35基因扩增引物序列如下:
SEQIDNo.15’-CTGTCCCCGGGGAGGGTCATTCCAGTCTCTGGA,
SEQIDNo.25’-ATCAATGAATTCTCAGGCGGAGCTCAGATAGCC。
用限制性内切酶Sma1和EcoRI对PCR产物酶切,获取片段插入经Sma1和EcoRI酶切的含CMV启动子和人免疫球蛋白IgG1恒定区的pN24-Fc质粒。链接后的DNA转化大肠杆菌菌株XL-1,氨苄抗性的克隆经PCR和DNA测序筛选、鉴定。选择DNA序列正确的质粒并命名为pN24-Fc-muP35。
2、p64-muIL-12_P40质粒的构建:
小鼠IL-12P40基因扩增引物如下:
SEQIDNo.35’-GTTAAGCTTGCCGCCACCATGTGTCCTCAGAAGCTAACC
SEQIDNo.45’-CTACGTGAATTCCTAGGATCGGACCCTGCAGGGAAC
用限制性内切酶Hind3和EcoRI对PCR产物进行酶切,获取片段插入经Hind3和EcoRI酶切的含CMV启动子pN64质粒。链接后的DNA转化大肠杆菌菌株XL-1,氨苄抗性的克隆经PCR和DNA测序筛选、鉴定。选择DNA序列正确的质粒并命名为pN64-muP40。
3、表达载体构建:用Not1/Sal1酶切pN64-muP40质粒,纯化获取包含CMV启动子和小鼠IL-12p40基因的片段。纯化的片段与经Not1/Sal1酶切pN24-Fc-muP35连接,并转化大肠杆菌菌株XL-1。氨苄抗性的克隆经PCR和DNA测序验证,选取序列正确的质粒并命名为pN24-Fc-muIL12(p35+p40),质粒DNA纯化后保存于4℃(图1)。
4、muIL12/Fc在NS0细胞的转染与表达
采用小鼠骨髓瘤NS0细胞表达小鼠muIL12/Fc。目标质粒电转NS0细胞后4周,采用间接酶联免疫检测方法筛选细胞培养上清,高表达muIL12/Fc的克隆采用5%胎牛血清培养基3升搅拌罐培养扩增。分泌的融合蛋白采取蛋白A亲和层析以及离子交换层析纯化。
5、muIL12/Fc融合蛋白的筛选
移取活性克隆细胞上清后用酶联免疫技术检测蛋白产物:100ul抗Fc单克隆抗体(碳酸盐缓冲液:0.01MNa2CO3,0.035MNaHCO3,pH9.6)加入96孔板,4℃过夜孵育,含0.1%Tween-20的PBS洗涤3次。每孔加入经倍比稀释后上清100ul,室温孵育60分钟,洗涤3次后加入二抗(初次筛选使用100ul经PBS-Tween缓冲液1:5000稀释辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IL-12单克隆抗体),洗涤3次后加入底物(1.0mg/ml的2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐,0.1M、pH4.0柠檬酸盐缓冲液,0.03%过氧化氢)显色15分钟,酶标仪(Bio-Tek)检测450nm吸光度值(OD450),用标准曲线计算蛋白浓度(图2)。
6、WesternBlot分析融合蛋白Fc-IL-12
将融合蛋白muIL12/Fc和人IgG稀释至终浓度20ug/ml,加入上样缓冲液,水浴煮沸5分钟,SDS聚丙烯酰胺凝胶每孔加样5ul(0.1ug),120mV电泳45分钟,凝胶转纤维素膜,加入羊抗鼠IL-12(P35+P40)或者抗人IgG-辣根过氧化物酶4℃过夜,化学发光底物显色。WesternBlot实验结果显示,成功表达muIL12/Fc(图3)。
7、体外鉴定muIL-12/Fc融合蛋白生物活性
小鼠脾细胞提取与T细胞纯化的体外生物学分析
C57BL/6小鼠处死后分离脾脏,含10%胎牛血清的RPMI1640培养基保存,于培养皿中用27G注射器冲洗细胞,70um过滤器过滤细胞。1.077的Ficoll细胞分离液分离单个核细胞,0.5%牛血清白蛋白的PBS复苏、洗涤细胞2次。
用磁珠T细胞分选试剂盒分选脾细胞中的T细胞,加入生物素-抗体孵育4℃下5分钟。加入抗-生物素微珠4℃下孵育10分钟。磁珠分选系统收集抗体-微珠-脾细胞悬液中的T细胞,新鲜培养基悬浮细胞37℃,5%CO2条件下孵育,流式鉴定分选的T细胞。
抗-CD3抗体活化的鼠T细胞分析鼠IL-12和muIL-12/Fc融合蛋白生物学活性
5ug/ml羊抗鼠CD3抗体(Clone:17A2;eBioscience;SanDiego,CA)4℃过夜包被24孔板,每孔加入纯化的T细胞4×104(400ulRPMI1640培养基,10%胎牛血清),重组鼠IL-12、IL-12/Fc融合蛋白以及重组人TNT-3(经RPMI1740培养基、10%胎牛血清稀释),重复3孔,37℃,5%CO2条件下孵育2天。
PBS稀释的抗鼠IFNγ抗体4℃过夜包被96孔板,PBS,0.5%Tween-20洗3次,酪蛋白阻滞剂封闭2小时。T细胞离心去上清后加入96孔板,重组鼠IFN-γ蛋白经倍比稀释后建立标注曲线,均4℃过夜孵育,加入PBS1%BSA稀释的生物素标记抗IFN-γ抗体孵育1小时,辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(含1%BSA的PBS)孵育30分钟,加入显色底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺,最后加入终止液2N硫酸,490nm检测吸光度值。实验结果显示,IL-12/Fc融合蛋白诱导鼠T细胞活化分泌IFN-γ,IFN-γ水平与IL-12组比较无显著差异,显著高于chTNT3组(图4)。
8、IL-12/Fc融合蛋白载体构建及基因序列
二、所述融合蛋白浓度为3.8mg/ml,采用PBS稀释至0.5μg/ml,1μg/ml,2μg/ml,供动物实验使用。
三、muIL-12/Fc融合蛋白药代动力学
检测原理与方法:为检测muIL-12/Fc融合蛋白在小鼠体内的药物代谢动力学,取4-6周龄体重18-20g的Balb/c小鼠90只,雌性。按如下处理:分为muIL-12与muIL-12/FC融合蛋白组,每组45只,分别皮下注射muIL-12或muIL-12/FC,剂量为20ng/200ul/只。于注射后0.5h,1h,2h,4h,6h,8h,12h,24h,48h摘除眼球,取0.5-1ml血液,注入1.5mlEP管中。4℃静置60min,10000r/min4℃离心5min,分离血清保存于-80℃,用于下一步实验。ELISA法检测血清IL-12水平,采用DAS2.0对muIL-12/Fc在Balb/c体内的代谢情况进行药物代谢动力学分析。
结果:如表一所示:muIL-12/Fc融合蛋白在小鼠体内的半衰期较muIL-12显著延长。
Table1.PlasmaPKcharacteristicsofmuIL-12/FcandmuIL-12inNon-irradiatedmice
四、融合蛋白促辐射线照射动物损伤修复作用
检测原理和方法:
(一)、融合蛋白提高辐照损伤动物生存率
为检测融合蛋白提高辐照动物损伤生存率情况,使用50只18-20克的Balb/c小鼠分成5组每组10只进行以下处理:第1-5组(A、B、C、D、E组)分别接受单次7Gy,60Co-γ射线全身照射,随后在射线照射后1小时内分别对第1-5组进行皮下注射(200ulPBS,A组)、(20ngFc/只,B组)(20ngLHR/Fc/只,C组)、(20ngmuIL-12/只,D组)、(20ngmuIL-12/Fc/只,E组)进行治疗,观察30天小鼠存活情况。这种辐照剂量是特异性针对小鼠设定的,5个分组设计可直接反应IL-12/Fc融合蛋白的促辐照损伤后动物存活效果。
结果:如图5所示:muIL-12/Fc融合蛋白显著提高辐照损伤后小鼠存活率。
(二)、该融合蛋白促进辐照动物骨髓抑制、肠道损伤修复功能
为检测融合蛋白促辐照动物损伤的修复功能,使用25只18-20克的Balb/c小鼠分成5组每组5只进行以下处理:第1组(Blank组)不作辐射线照射,第2-5组(A、B、C、D、E组)分别接受单次5Gy,60Co-γ射线全身照射,随后在射线照射后1小时内分别对第2-5组进行皮下注射(200ulPBS,A组)、(20ngLHR/Fc/只,B组)、(20ngmuIL-12/只,C组)、(20ngmuIL-12/Fc/只,D组)进行治疗。这种辐照剂量是特异性针对小鼠设定的,5个分组设计可直接反应IL-12/Fc融合蛋白的促辐照损伤修复的功能。
1)融合蛋白的促造血障碍恢复作用
检测原理和方法:
骨髓细胞形态学观察在给药之后的第3天从(二)所述5组随机选取小鼠各3只,取其股骨骨髓活检切片,瑞氏-吉姆萨染色观察骨髓象。本发明所述骨髓象为骨髓造血判断的常规方法,为本领域技术人员熟知。
外周血血常规检测分别于辐照后1、3、7、14、21天断尾取血检测外周血血常规。
结果:如图6和图7所示:IL-12/Fc融合蛋白具有明显的促进骨髓造血功能。
2)促进机体免疫调节
检测原理和方法:外周血EPO(Erythropoietin,促红细胞生成素)水平上升是辐射照射损伤的生理反应;IFN-γ(干扰素γ)具有重要的免疫调节功能,尤其是在机体感染起始阶段,在体液免疫和细胞免疫发生作用之前,发挥着重要作用。
在给药后的1h、4h、8h、12h、1d、3d分别从(二)所述5组中随机取小鼠鼠5只,采用乙醚麻醉1-2分钟,摘除眼球取血0.5-1.0毫升,4℃冰箱静置30min后离心4000rpm×5分钟,分离血清储存于-80℃,测定时,采用ELISAkit检测上述血清中IL-12(MouseIL-12p70QuantikineELISAKit,R&DSystems供应商品)、IFN-γ(MouseIFN-gammaQuantikineELISAKit,R&DSystems供应商品)、EPO(MouseErythropoietinQuantikineELISAKit,R&DSystems供应商品)水平。
结果:如图8所示:muIL-12/Fc诱导小鼠内源性IL-12分泌;在采用muIL-12/Fc融合蛋白治疗后的小鼠中EPO水平明显高于辐射线照射诱导产生的EPO水平,muIL-12/Fc促进了辐射线照射引起的由EPO介导的生理反应;muIL-12/Fc融合蛋白治疗组IFN-γ水平明显高于PBS组合Blank组,表明muIL-12/Fc融合蛋白能有效提升辐射线照射小鼠IFN-γ分泌水平。
3)促进肠道功能修复,诱导内源性IL-12受体表达
原理和方法:基于小鼠IL-12与大鼠IL-12同源性高达90%,且9Gy辐射线照射致小鼠死亡率达100%(7天),为有效建立辐射线照射致肠道损伤模型,本实验选择大鼠进行研究。肠道形态结构的完整性是肠道一切功能正常发挥的基础,检测大鼠空肠组织结构来反应肠道功能。
使用25只180-200克的Sprague-Dawly雄性大鼠分成5组,每组5只进行以下处理:第1组(Blank组)不作辐射线照射,第2-5组(A、B、C、D、E组)分别接受单次9Gy,60Co-γ射线全身照射,随后在射线照射后1小时内分别对第2-5组进行尾静脉注射(200ulPBS,A组)、(200ngLHR/Fc/只,B组)、(200ngmuIL-12/只,C组)、(200ngmuIL-12/Fc/只,D组)进行治疗。这种辐照剂量是特异性针对大鼠设定的,5个分组设计可直接反应IL-12/Fc融合蛋白的促辐照肠道损伤修复的功能。
在给药之后的第3天从2所述5组随机选取大鼠各3只,取其空肠,10%甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色观察肠道组织结构。另取空肠,10%甲醛固定,石蜡包埋切片免疫荧光检测IL-12受体表达。一抗:IL-12Rβ2(IL-12受体,为SantaCruzBiotechnology公司供应商品,货号为SC-18652),二抗:辣根酶标记抗山羊IgG(为北京中杉金桥生物技术有限公司供应商品,货号为ZB-2306),染色剂:DABkit(为上海奇康生物科技有限公司供应商品,货号为ZLI9018)。
结果:如图9所示:muIL-12、muIL-12/Fc融合蛋白治疗组(E组)大鼠肠道组织结构明显较PBS、LHR/Fc、Fc组完整。诱导大鼠空肠组织表达IL-12Rβ2水平显著增高。
4)muIL-12/Fc融合蛋白抑制实验性肿瘤生长功能
检测原理与方法为检测muIL-12/Fc融合蛋白抑制实验性肿瘤生长的功能,采用20只Balb/c小鼠(4-6W),雌性,体重约18-20g,RPMI-1640培养基,10%胎牛血清培养小鼠肾癌Renca细胞。60Co-γ辐照小鼠全身3.5Gy,4h内皮下接种Renca细胞5.0×106/200ul/只。每2天测量接种部位肿瘤大小,计算肿瘤体积(V=长径×短径2÷2)mm3。待有小鼠肿瘤体积达到100mm3时,按如下分组处理:皮下注射①muIL-12/Fc(20ng/200ul/只);②muIL-12(20ng/200ul/只);③LHR-Fc(20ng/200ul/只);④PBS(200ul/只)。25天后处死小鼠,剥离肿瘤,计算剥离肿瘤体积。以上设计可直接反应muIL-12/Fc融合蛋白抑制实验性肿瘤生长功能。
结果:如图10所示:muIL-12、muIL-12/Fc均可抑制实验性小鼠肾癌的生长,muIL-12/Fc抑制效果显著强于muIL-12。
尽管本申请结合优选实施例对本发明进行了说明,但本发明并不局限于上述实施例当中,应该理解,在本发明构思的引导下,本领域技术人员可进行各种修改和改进,这些变更和修改均在申请待批的权利要求保护范围之内。
Claims (13)
1.一种IL-12-Fc融合蛋白的制备方法,其特征在于所述融合蛋白由Fc片段与IL-12中的一个亚基(p35或p40)直接融合后再和另一个亚基在同一细胞内共同表达,进而组建成具有生物活性的IL12-Fc融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述Fc片段直接与白介12中p35亚基融合形成Fc-p35融合蛋白,其氨基酸序列为SEQ6或SEQ8。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述Fc-p35融合蛋白,其核苷酸序列为SEQ5或SEQ7。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述Fc片段直接与IL-12中p40亚基融合形成Fc-p40融合蛋白,其氨基酸序列为SEQ10或SEQ12。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述Fc-p40融合蛋白,其核苷酸序列为SEQ9或SEQ11。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述Fc片段包括人IgGFc片段或其经过修饰的Fc片段。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于:所述Fc片段为人IgGFc片段。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述表达载体为真核载体。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于:所述载体为哺乳细胞表达载体。
10.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述含有Fc-(p35+p40)表达载体中p35和p40前均含有启动子。
11.根据权利要求10所述的制备方法,其特征在于所述启动子包括CMV启动子。
12.一种含有IL-12-Fc融合蛋白的药剂,其特征在于所述药物为用权利要求1-11的任一项权利要求所述方法制的IL-12/Fc融合蛋白所制得的。
13.一种如权利要求12所述的含有IL-12/Fc的药剂,其特征在于所述药物用于制备防治辐射线损伤、肿瘤治疗的药物中。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109824786A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-05-31 | 王仁喜 | hIL-12p35-Fc融合蛋白、编码基因、重组载体、宿主细胞及应用 |
CN110396133A (zh) * | 2018-04-25 | 2019-11-01 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种以白介素12为活性成分的融合蛋白型药物前体 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1418184A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | Cell Center Cologne GmbH | Recombinant fusion protein consisting of the p40 and p35 subunits of IL-12 and a ScFv and use thereof |
CN1235911C (zh) * | 1999-08-09 | 2006-01-11 | 利思进药品公司 | 多细胞因子-抗体复合物 |
US20070202103A1 (en) * | 2004-01-05 | 2007-08-30 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Compounds For Targeting |
US7576193B2 (en) * | 1997-12-08 | 2009-08-18 | Merck Patent Gmbh | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
CN103169959A (zh) * | 2005-09-27 | 2013-06-26 | 默克专利有限公司 | 用于治疗呈现存活蛋白抗原的肿瘤的组合物和方法 |
CN103458930A (zh) * | 2011-02-01 | 2013-12-18 | 根马布股份公司 | 针对cd74的人抗体和抗体-药物缀合物 |
CN103555734A (zh) * | 2012-09-17 | 2014-02-05 | 青岛康立泰药业有限公司 | 人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法 |
-
2014
- 2014-10-30 CN CN201410597561.4A patent/CN105543279A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7576193B2 (en) * | 1997-12-08 | 2009-08-18 | Merck Patent Gmbh | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
CN1235911C (zh) * | 1999-08-09 | 2006-01-11 | 利思进药品公司 | 多细胞因子-抗体复合物 |
EP1418184A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | Cell Center Cologne GmbH | Recombinant fusion protein consisting of the p40 and p35 subunits of IL-12 and a ScFv and use thereof |
US20070202103A1 (en) * | 2004-01-05 | 2007-08-30 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Compounds For Targeting |
CN103169959A (zh) * | 2005-09-27 | 2013-06-26 | 默克专利有限公司 | 用于治疗呈现存活蛋白抗原的肿瘤的组合物和方法 |
CN103458930A (zh) * | 2011-02-01 | 2013-12-18 | 根马布股份公司 | 针对cd74的人抗体和抗体-药物缀合物 |
CN103555734A (zh) * | 2012-09-17 | 2014-02-05 | 青岛康立泰药业有限公司 | 人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法 |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
BEYER,J.C. ET AL.: "Capra hircus interleukin 12 p40 subunit (IL-12) mRNA, complete cds", 《NCBI》 * |
KIN-MING LO ET AL.: "High level expression and secretion of Fc-X fusion proteins in mammalian cells", 《PROTEIN ENGINEERING》 * |
LIU,Y. ET AL.: "Homo sapiens interleukin 12 mRNA, complete cds", 《NCBI》 * |
STEPHEN D. GILLIES ET AL.: "High-level expression of chimeric antibodies using adapted cDNA variable region cassettes", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 * |
卢卫红: "《极端环境生物学效应与营养》", 31 January 2013, 哈尔滨工业大学出版社 * |
姜文奇等: "《肿瘤生物治疗学》", 30 April 2006, 广东科技出版社 * |
顾军等: "抗体细胞因子融合蛋白治疗肿瘤的研究进展", 《肿瘤防治杂志》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110396133A (zh) * | 2018-04-25 | 2019-11-01 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种以白介素12为活性成分的融合蛋白型药物前体 |
CN110396133B (zh) * | 2018-04-25 | 2021-07-23 | 免疫靶向有限公司 | 一种以白介素12为活性成分的融合蛋白型药物前体 |
CN109824786A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-05-31 | 王仁喜 | hIL-12p35-Fc融合蛋白、编码基因、重组载体、宿主细胞及应用 |
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