CN109195634A - Cd47阻断治疗中的巨噬细胞刺激 - Google Patents

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Abstract

阻断CD47/SIRPa途径消耗癌细胞。当巨噬细胞刺激剂与CD47阻断药物组合使用时，这种抗癌活性得到增强。当CD47阻断药物是SIRPaFc时，这种抗癌联合疗法特别有效。

Description

CD47阻断治疗中的巨噬细胞刺激
本申请要求2016年4月15提交的美国临时申请62/322,934在35USC 119(e)款下的权益，在此通过引用将其并入。
技术领域
本发明涉及使用阻断CD47/SIRPa相互作用的药物的方法。更具体地，本发明涉及当接受SIRPαFc药物的癌症患者也被治疗以刺激巨噬细胞群体时产生的改善。
背景技术
通过与癌细胞抗原结合的抗体，以及通过Fc受体与该抗体的Fc部分结合的巨噬细胞的募集和活化，靶向癌细胞。癌细胞上的CD47与巨噬细胞上的SIRPa之间的结合传递了“不要吃我”的信号，该信号使许多肿瘤细胞逃脱巨噬细胞的检测和破坏。已经表明抑制CD47/SIRPa相互作用(SIRPαFc)将允许巨噬细胞“看到”并破坏靶CD47+癌细胞。在WO2010/130053中描述了使用基于SIRPα的药剂通过SIRPαFc治疗癌症。(SIRPa和SIRPα在本文中可互换使用，作为SIRPalpha的等同术语。同样，SIRPaFc和SIRPαFc在本文中可互换使用)。
在WO2014/094122中，我们描述了抑制CD47和SIRPa之间相互作用的药物。该SIRPαFc药物是人SIRPa的一种形式，其结合了与特别有用形式的基于IgG1的Fc区连接的细胞外结构域的特定区域。在这种形式中，SIRPaFc药物对存在CD47+表型的癌细胞的存活率显示出显著影响。特别是在急性髓性白血病(AML)细胞和许多其他类型的癌症中可以看到这种效果。在Stanford的WO2013/109752中描述了具有显著改变的一级结构和增强的CD47结合亲和力的可溶形式的SIRP。在Merck GMBH的WO2016/024021中描述了包含肿瘤抗原结合位点的另一种类似形式的SIRPaFc药物。
其他SIRPαFc药物已在文献中描述，这些包括各种CD47抗体(参见例如Stanford的US8562997和InhibRx的WO2014/123580)，每种抗体包含不同的抗原结合位点，但都具有与内源性SIRPa竞争结合CD47的能力，从而允许吞噬作用，并最终增加CD47+癌细胞耗竭的速率。这些药物虽然具有SIRPαFc效应，但在体内显示出与基于SIRPaFc的药物所显示的活性完全不同的活性。例如，后者显示出对红细胞的可忽略的结合，而CD47抗体中的相反特性产生了需要适应施用后药物“下沉”的策略。
还提出了其他试剂用于阻断CD47/SIRPa轴。这些包括CD47Fc蛋白(参见ViralLogic的WO2010/083253)和SIRPa抗体，如UHN的WO2013/056352、Stanford的WO2016/022971、Eberhard的US 6913894和其他地方所述。
这些药物发挥作用的机制尚不完全清楚。据信，直接从CD47信号传导的抑制实现了益处。然而，巨噬细胞也可能以某种方式合作以促进癌细胞耗竭。
CD47阻断方法在癌症治疗方面显示出巨大的希望。提供改善这些药物作用的方法和手段，特别是改善SIRPαFc药物的作用将是有用的。
发明内容
已经确定当接受者与一种或多种作为巨噬细胞刺激剂的药剂组合治疗时，SIRPαFc药物的抗癌作用增强。在实施方案中，如此刺激的内源性巨噬细胞是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。
因此，在一个方面，提供了用于在有此需要的受试者中消耗CD47+疾病细胞的方法，包括向受试者施用(1)SIRPaFc作为CD47阻断药物，和(2)有效激活内源性巨噬细胞的巨噬细胞刺激剂，从而增强SIRPaFc药物的抗癌活性。
在某些方面，巨噬细胞刺激剂是支持或有利于巨噬细胞形成或积累的巨噬细胞刺激剂，在Fc受体类型的情况下巨噬细胞是CD64+。在其他方面，巨噬细胞刺激剂是支持形成具有M1型或M2c型的巨噬细胞的巨噬细胞刺激剂。在其他方面，巨噬细胞刺激剂是使M0、M2a和M2b型巨噬细胞极化成M1和/或M2c巨噬细胞的巨噬细胞刺激剂。
在相关方面，提供了SIRPαFc药物与巨噬细胞刺激剂组合的用途，所述巨噬细胞刺激剂有效调节内源性巨噬细胞(包括TAMS)的活性和/或表型，从而消耗有此需要的受试者中的CD47+疾病细胞。
另一方面，提供了用于在有此需要的受试者中消耗CD47+疾病细胞的药物组合，该组合包含SIRPαFc药物与巨噬细胞刺激剂的组合。在实施方案中，所述组合作为离散和单独配制的化合物的物理组合提供(例如试剂盒)，并提供教导其在本文所述的治疗方法中使用的说明书。
在实施方案中，巨噬细胞刺激剂选自干扰素-γ(IFNγ)，干扰素α如干扰素-α2a(IFNα-2a)脂多糖(LPS)和白细胞介素如白细胞介素1β，白细胞介素4和白细胞介素10(IL-10)，集落刺激因子如M-CSF和GM-CSF，转化生长因子β(TGFβ)，Toll样受体(TLR)配体，热聚集的人γ球蛋白(HAGG)，以及其任何两种或多种的混合物。
现在参考附图更详细地描述本发明的这些和其他方面，其中：
附图说明
图1显示SIRPaFc(SEQ ID NO：3，TTI-621)通过体外人PBMC产生的6种不同巨噬细胞亚群增加肿瘤细胞的吞噬作用；
图2A显示了在体外由人PBMC产生的6种不同巨噬细胞亚群中FcγRs(CD16、CD32、CD64)的相对表达。图2B显示6种不同巨噬细胞亚群的CD64水平与SIRPaFc的吞噬活性之间的相关性；
图3A-3C显示M0、M2a和M2b巨噬细胞对SIRPaFc(SEQ ID NO：3)的吞噬反应通过细胞因子和Toll样受体激动剂的再极化进一步增加；
图4显示了用细胞因子和Toll样受体激动剂再极化后M0、M2a和M2b巨噬细胞的FcγR表达的变化。最值得注意的是CD64表达的变化；和
图5A-5C显示用SIRPaFc(SEQ ID NO：3)与干扰素γ组合治疗的小鼠中的肿瘤生长。
具体实施方式
本发明提供了一种用于治疗具有癌细胞和具有CD47+表型的肿瘤的受试者的改进方法。在该方法中，受试者接受SIRPaFc和巨噬细胞刺激剂的组合。结合起来，该组合的抗癌作用优于单独任一种药剂的作用。特别是当药物是具有SEQ ID NO：3的SIRPaFc药物时，认为导致该改善。
因此，在本发明中，治疗方法结合了SIRPaFc药物和巨噬细胞刺激剂。具有SIRPαFc活性的药物是当CD47与巨噬细胞呈递的SIRPa相互作用时干扰信号传递的药剂。该性质存在于各种形式的SIRPaFc药物中。
SIRPαFc药物基于人SIRPa的细胞外区域。它们至少包含足以赋予有效的CD47结合亲和力和特异性的细胞外区域的区域。一些SIRPaFc药物在文献中有描述，包括Novartis的WO2010/070047和Stanford的WO2013/109752中提到的那些，以及延龄草疗法公司(Trillium Therapeutics)的WO2014/094122，它们全部通过引用整体并入本文。
在SIRPaFc药物中，SIRPa的CD47结合区与抗体恒定结构域(Fc)偶联，以形成SIRPaFc融合体。更具体地，药物合适地包含人SIRPα蛋白的细胞外部分，其形式为直接或间接与抗体或Fc(可结晶的片段)恒定区融合。除非另有说明，否则如本文所用的术语“人SIRPα”是指野生型、内源性、成熟形式的人SIRPα。在人类中，SIRPα蛋白以两种主要形式存在。一种形式，变体1或V1形式，具有NCBI RefSeq NP_542970.1(SEQ ID NO：13)所示的氨基酸序列(残基27-504构成成熟形式)。另一种形式，变体2或V2形式，相差13个氨基酸，并且具有在GenBank中列出的氨基酸序列，如CAA71403.1(SEQ ID NO：14)(残基30-504构成成熟形式)。这两种形式的SIRPα构成人类中存在的SIRPα形式的约80％，并且在本文中术语“人SIRPα”包括这两种形式。术语“人SIRPα”也包括其对人类是内源的次要形式，并且具有与CD47结合后触发信号转导的相同特性。本发明最特别涉及包含变体2形式或V2的药物组合。
在本发明的药物组合中，有用的SIRPαFc融合蛋白包含位于人SIRPα细胞外区域内的三个所谓的免疫球蛋白(Ig)结构域之一。更具体地，本发明的SIRPαFc蛋白掺入人SIRPα(106聚体)的残基32-137，其根据目前的命名法构成并限定V2形式的IgV结构域。如下所示，该SIRPα序列在本文中称为SEQ ID NO：1。
在实施方案中，SIRPαFc融合蛋白掺入如SEQ ID NO：1所定义的IgV结构域，以及在SIRPα序列内邻接的另外的侧翼残基。这种形式的IgV结构域，由人SIRPα的V2形式的残基31-148表示，是具有SEQ ID NO：5的118聚体，如下所示：
作为SIRPαFc药物，SIRPα融合蛋白也可以掺入具有效应子功能的Fc区。Fc是指“可结晶的片段”并且代表主要包含重链恒定区和铰链区内组分的抗体的恒定区。因此合适的Fc组分是具有效应子功能的Fc组分。“具有效应子功能”的Fc组分是具有至少一些效应子功能的Fc组分，例如至少一些对抗体依赖性细胞毒性的贡献或某些固定补体的能力。而且，Fc将至少与Fc受体结合。可以使用为此目的建立的测定，揭示这些性质。功能测定包括检测靶细胞裂解的标准铬释放测定。通过该定义，野生型IgG1或IgG4的Fc区具有效应子功能，而人IgG4的Fc区突变以消除效应子功能，例如通过掺入包括Pro233、Va1234、Ala235的改变系列和删除Gly236(EU)，被认为不具有效应子功能。在优选的实施方案中，Fc基于IgG1同种型的人抗体。这些抗体的Fc区对于本领域技术人员来说是容易识别的。在实施方案中，Fc区包括下部铰链-CH2-CH3结构域。
在一个具体实施方案中，Fc区基于人IgG1的氨基酸序列，其在UniProtKB/Swiss-Prot中列为P01857(SEQ ID NO：15)，残基104-330，并且具有如下所示的并在本文中称为SEQ ID NO：2的氨基酸序列：
因此，Fc区具有IgG1恒定区的野生型或共有序列。或者，掺入融合蛋白中的Fc区衍生自具有典型效应子-活性恒定区的任何IgG1抗体。此类Fc区的序列可以对应于例如以下任何IgG1序列的Fc区(均来自GenBank)，例如：BAG65283(SEQ ID NO：16)(残基242-473)，BAC04226.1(SEQ ID NO：17)(残基247-478)，BAC05014.1(SEQ ID NO：18)(残基240-471)，CAC20454.1(SEQ ID NO：19)(残基99-320)，BAC05016.1(SEQ ID NO：20)(残基238-469)，BAC85350.1(SEQ ID NO：21)(残基243-474)，BAC85529.1(SEQ ID NO：22)(残基244-475)，和BAC85429.1(SEQ ID NO：23)(残基(238-469)。
或者，Fc区可以是IgG2或IgG3序列的野生型或共有序列，其实例如下所示：
人IgG2，例如：
包括在UniProtKB/SWISS-PROT数据库的P01859(SEQ IDNO：24)中；
人IgG3，例如：
包括在UniProtKB/SWISS-PROT数据库的P01860(SEQID NO：25)中；
在其他实施方案中，Fc区具有野生型人IgG4恒定区的序列。在替代实施方案中，掺入融合蛋白中的Fc区衍生自具有恒定区的任何IgG4抗体，所述恒定区具有效应子活性，但是天然地，其效力明显低于IgG1 Fc区。此类Fc区的序列可以对应于例如以下任何IgG4序列的Fc区：来自UniProtKB/Swiss-Prot的P01861(SEQ ID NO：26)(残基99-327)和来自GenBank的CAC20457.1(SEQ ID：27)(残基99-327)。
在一个具体实施方案中，Fc区基于人IgG4的氨基酸序列，其在UniProtKB/Swiss-Prot中列为P01861(SEQ ID NO：26)，残基99-327，并且具有如下所示的并在本文中称为SEQID NO：6的氨基酸序列：
Fc区可以掺入一个或多个改变，通常不超过约5个这样的改变，包括影响某些Fc特性的氨基酸取代。在一个具体和优选的实施方案中，Fc区在位置228(EU编号)掺入改变，其中该位置的丝氨酸被脯氨酸(S228p)取代，从而稳定Fc二聚体内的二硫键。Fc区内的其他改变可包括改变糖基化的取代，例如甘氨酸或丙氨酸取代Asn297；半衰期增强改变，例如T252L、T253S和T256F，以及许多其他改变，例如残基409改变。特别有用的是增强Fc特性同时在构象方面保持沉默的那些改变，例如保留Fc受体结合。
在一个具体实施方案中，并且在Fc组分是IgG4Fc的情况下，Fc至少掺入S228P突变，并且具有下文列出的并在本文中称为SEQ ID NO：7的氨基酸序列：
可用于组合的SIRPαFc融合蛋白是抑制人SIRPα和人CD47之间结合的融合蛋白，从而抑制或减少通过SIRPα结合的CD47介导的信号传递，该融合蛋白包含人SIRPα组分并与之融合，Fc组分，其中SIRPα组分包含人SIRPαV2的单个IgV结构域或由其组成，并且Fc组分是具有效应子功能的人IgG的恒定区。
在一个实施方案中，融合蛋白包含SIRPα组分，其包含至少V2形式的野生型人SIRPα的残基32-137，即SEQ ID NO：1，或由其组成。在优选的实施方案中，SIRPα组分由人SIPα的V2形式的残基31-148组成，即SEQ ID NO：5。在另一个实施方案中，Fc组分是人IgG1的Fc组分，命名为P01857(SEQ ID NO：15)，并且在一个具体实施方案中具有包含其下铰链-CH2-CH3区的氨基酸序列，即SEQ ID NO：2。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供SIRPαFc融合蛋白，作为表达的单链多肽和/或作为其分泌的二聚体融合体，其中融合蛋白掺入具有SEQ ID NO：1且优选SEQ IDNO：5的SIRPα组分，以及与其融合的具有效应子功能且具有SEQ ID NO：2的Fc区。当SIRPα组分是SEQ ID NO：1时，该融合蛋白包含SEQ ID NO：28，如下所示：
当SIRPα是SEQ ID NO：5时，该融合蛋白包含SEQ ID NO：3，如下所下：
在替代实施方案中，融合蛋白的Fc组分基于IgG4，优选结合S228P突变的IgG4。在融合蛋白掺入SEQ ID NO：5的优选SIRPαIgV结构域的情况下，所得的基于IgG4的SIRPα-Fc蛋白包含SEQ ID NO：8，如下所示：
在优选的实施方案中，融合蛋白包含作为融合蛋白的SIRPαIgV结构域的序列，其为SEQ ID NO：5。优选的SIRPαFc是SEQ ID NO：3。在另一个实施方案中，SIRPαFc是SEQ IDNO：8。
如文献中所述，可以改变SIRPαFc药物中掺入的SIRPa序列。也就是说，SIRPa内有用的取代包括以下的一种或多种：L4V/I、V6I/L、A21V、V27I/L、131T/S/F、E47V/L、K53R、E54Q、H56p/R、S66T/G、K68R、V92I、F94V/L、V63I和/或F103V，其中氨基酸位置编号参照本文的SEQ IDNO：5；另见国际专利公开号WO2016/023040(Alexo)，通过引用以其全部并入本文。
在SIRPαFc融合蛋白中，SIRPα组分和Fc组分直接或间接融合，以提供单链多肽，其最终产生为二聚体，其中单链多肽通过Fc内形成的链内二硫键偶联。融合区域的性质并不重要。融合可以在两种组分之间直接进行，其中SIRP组分构成融合的N末端，Fc组分构成C末端。或者，融合可以是间接的，通过由一个或多个氨基酸组成的接头，理想地是遗传编码的氨基酸，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸，或5至100个氨基酸之间的任何数目氨基酸，例如5至50、5至30或5至20个氨基酸。接头可包含由构成限制性位点例如BamHI、ClaI、EcoRI、HindIII、PstI、SalI和XhoI位点等的DNA编码的肽。
接头氨基酸通常并且理想地将提供一些灵活性以允许Fc和SIRP组分采用它们的活性构象。允许这种灵活性的残基通常是Gly、Asn和Ser，因此实际上接头内这些残基(特别是Gly和Ser)的任何组合都可能提供所需的连接效应。在一个示例中，这样的接头是基于所谓的G4S序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，SEQ ID NO：11)，其可以重复为(G4S)n其中n是1、2、3或更多，或基于(Gly)n，(Ser)n、(Ser-Gly)n或(Gly-Ser)n等。在另一个实施方案中，接头是GTELSVRAKPS(SEQ ID NO：4)。该序列构成C末端侧翼IgV结构域的SIRPα序列(应当理解，当与上述IgV最小序列偶联时，该侧翼序列可以被认为是IgV结构域的接头或不同形式)。仅需要熔融区域或连接体允许组分采用它们的活性构象，并且这可以通过本领域中有用的任何形式的连接体来实现。
SIRPαFc融合可用于抑制SIRPα和CD47之间的相互作用，从而阻断跨该轴的信号传导。已知CD47对巨噬细胞上的SIRPα的刺激通过使肌球蛋白-II失活以及将靶标拉入巨噬细胞所涉及的收缩细胞骨架活性来抑制巨噬细胞介导的吞噬作用。因此，该级联的激活对于CD47+疾病细胞的存活是重要的，并且阻断该途径使得巨噬细胞能够根除CD47+疾病细胞群。
术语“CD47+”用于指SIRPαFc药物结合靶向的细胞的表型。可以使用CD47抗体作为亲和配体，通过流式细胞术鉴定CD47+细胞。适当标记的CD47抗体可商购获得用于此用途(例如，克隆B6H12可从Santa Cruz Biotechnology获得)。检查CD47表型的细胞可以包括标准肿瘤活检样品，特别是包括取自怀疑携带内源性CD47+癌细胞的受试者的血液样品。特别感兴趣作为本融合蛋白的治疗目标的CD47病细胞是那些“过度表达”CD47。这些CD47+细胞通常是疾病细胞，并且在其表面上以一定密度存在CD47，其超过给定类型细胞的正常CD47密度。CD47过表达在不同细胞类型中会有所不同，但在本文中是指任何CD47水平，例如通过本文示例的流式细胞术或通过免疫染色或通过基因表达分析等确定，其大于在具有对于该细胞类型是正常的CD47表型的对应细胞上可测量的水平。
本药物组合包含优选SEQ ID NO：3的SIRPαFc药物和巨噬细胞刺激剂。这些巨噬细胞刺激剂包括多种刺激巨噬细胞活性并影响巨噬细胞极性的试剂。在实施方案中，巨噬细胞刺激剂是TLR激动剂、生长因子或趋化因子。
众所周知，巨噬细胞以不同的类型存在，即M0、M1和M2，并且M2类型具有四种不同的亚型，称为M2a、M2b、M2c和M2d。M1和M2巨噬细胞具有不同的趋化因子和趋化因子受体谱，M1分泌Th1细胞，吸引趋化因子CXCL9和CXCL10，M2分泌CCL17、CCL22和CCL24。最近已经在体外证明，巨噬细胞能够从M2到M1完全复极化，并且可以根据其环境逆转它们的极化。极化的变化是快速的并且涉及在转录和翻译水平上重新连接信号传导网络。
M1表型由细胞内病原体、细菌细胞壁成分、脂蛋白和细胞因子如干扰素γ(IFNg或IFNγ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的活化产生。M1巨噬细胞的特征在于炎性细胞因子分泌和一氧化氮(NO)的产生，导致炎症。通常，M1巨噬细胞与癌症环境中的良好预后相关。M2活化由真菌细胞、寄生虫、免疫复合物、补体、凋亡细胞、白细胞介素-4(IL-4)、IL-13、IL-10、肿瘤生长因子β(TGFβ)诱导。已经证明M2巨噬细胞产生细胞外基质(ECM)成分、血管生成和趋化因子以及IL-10。M2巨噬细胞可以减轻炎症反应，促进伤口愈合。它们在目前的文献中被广泛称为抗炎、促分裂、伤口愈合、组织修复和营养或调节巨噬细胞，并且被认为是M1活化的巨噬细胞的良性对立面。
此外，根据目前巨噬细胞激活命名法的框架，而不是体外产生的巨噬细胞的传统命名法(M0、M1、M2a、M2b、M2c)，巨噬细胞群可以根据诱导的药剂命名它们如下：M1为M(IFN-γ)、M1+LPS为M(IFNγ+LPS)、M2a为M(IL-4)、M2b为M(HAGG+IL-1β)和M2c为M(IL-10+TGFβ)亚群。未极化的M0巨噬细胞可表示为M(-)。
如本文提供的实施例中所证明的，发现当刺激例如激活巨噬细胞群时，SIRPαFc药物具有改善的效果。因此，在实施方案中，接受SIRPαFc药物的受试者也用巨噬细胞刺激剂治疗，所述巨噬细胞刺激剂将导致巨噬细胞改变表型，并采用活性状态。优选地，这表现为CD64过表达，或采用M1或M2c类型，或更简单地作为用已知巨噬细胞刺激剂治疗的结果。
理想地，该治疗利用巨噬细胞刺激剂，其促使或促进表达CD64(FcγRI)的巨噬细胞的形成或积累。更具体地，术语“促进形成”旨在简单地表示某些巨噬细胞数量的升高是施用该药剂的结果或后果。因此，促进CD64+巨噬细胞形成或促进CD64+巨噬细胞的试剂是相对于CD16+或CD32+巨噬细胞引起CD64+巨噬细胞数量和流行增加的试剂。
CD64，也称为FcγRI，作为结合任何蛋白质、特别是抗体的Fc区的受体作用于各种免疫细胞。它负责清除这些蛋白质。在其人形式中，CD64是具有已知氨基酸序列的75kDa I型跨膜蛋白。它是IgG的高亲和力受体，参与吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和细胞因子的产生。单核细胞和巨噬细胞组成型表达CD64。成熟的粒细胞和淋巴细胞是阴性的，但用IFNγ和G-CSF等细胞因子处理多形核白细胞也可以诱导这些细胞上的CD64表达。
因此，在实施方案中，巨噬细胞刺激剂是促进CD64+巨噬细胞的刺激剂。这些巨噬细胞的存在增强了SIRPαFc药物的活性。例如，图3揭示了一些巨噬细胞刺激剂，其相对于其他Fcγ受体CD16和CD32并且相对于对照引起CD64升高(比较直方图移位与非极化对照)。这对于IFN-α和IL-10最为惊人。这些可与SIRPαFc一起单独使用或组合使用。还可以使用本文描述的实验方法鉴定促成CD64巨噬细胞的其他试剂
其他巨噬细胞刺激剂在本领域中是众所周知的。这些是导致巨噬细胞变得活跃并且对侮辱有反应的药剂。具有该性质的试剂包括许多不同的微生物病原体组分。这些被称为toll样受体(TLR)的不同巨噬细胞受体识别。
在实施方案中，SIRPaFc药物与至少一种选自以下的药剂一起用于抗癌组合：
1)选自干扰素-γ(IFN-γ，)和干扰素-α(如干扰素-α2a(IFNα-2a，))的干扰素；
2)脂多糖(LPS)，单独或与以上1)的药剂一起使用；
3)白细胞介素1β、白细胞介素4和白细胞介素10等白介素，
4)蛋白质，如集落刺激因子，如M-CSF和GM-CSF，转化生长因子β(TGFβ)，肿瘤坏死因子α(TNFα)和热聚集的人γ球蛋白(HAGG)，
5)Toll样受体(TLR)配体，例如TLR3、TLR4、TLR7或TLR8配体，及其任何两种或更多种的混合物。
在实施方案中，与SIRPαFc药物组合使用的巨噬细胞刺激剂是TLR激动剂，即结合并刺激这些受体之一的试剂。如上所述，Toll样受体(TLRs)是巨噬细胞(和其他细胞)用于识别微生物结构的模式识别受体(TLR3识别双链RNA，TLR4识别LPS，TLR 7/8识别单链RNA，TLR9识别未甲基化的CpG基序)。通常，TLR的触发导致巨噬细胞“活化”，即细胞因子产生增加，以及其他化合物。TLR刺激还促进M1巨噬细胞表型的极化。
因此，在一个实施方案中，本方法利用TLR激动剂的巨噬细胞激活和极化效应。这些包括任何一种或多种TLR的激动剂，包括TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8和/或TLR-9。
对于TLR1，药剂可包括细菌和分枝杆菌三酰化脂肽，包括合成配体，例如三棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸(Pam3Cys)。
对于TLR2，有用的配体包括革兰氏阳性细菌肽聚糖、细菌脂蛋白、脂质胆酸、某些LPS、来自克氏锥虫的GPI-锚蛋白、血凝素(MV)、磷脂甘露聚糖(念珠菌)和LAM(分枝杆菌)和奈瑟氏球菌孔蛋白。还已知的是合成配体，包括完全弗氏佐剂(CFA)、巨噬细胞活化脂肽2(MALP2)、Hib-OMPC、S-(2，3-双棕榈酰氧基丙基)CGDPKHPKSF(FSL-1)(SEQ ID NO：12)和二棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酸(Pam2Cys)。
TLR3是核苷酸感应TLR，其在复制期间的某些点处结合由大多数病毒产生的双链RNA。这些病毒包括西尼罗河病毒和双链RNA病毒，如RSV和MCMV。可用于本发明方法的合成配体包括聚肌苷-聚胞苷酸(聚I：C)和聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚A：U)。在优选的实施方案中，TLR激动剂是poly(I：C)，dsRNA的长合成类似物。它可以由与聚(C)链退火的聚(I)支架组成，平均尺寸为1.5-8kb。
对于TLR4，有用的病原体携带配体包括LPS(革兰氏阴性细菌)；F蛋白(RSV)；甘露聚糖(念珠菌)；葡萄糖肌醇磷脂(锥虫)；包膜蛋白(RSV和MMTV)。还存在结合TLR4的内源性配体，其包括Hsp60、Hsp70、纤连蛋白结构域A以及透明质酸、表面活性蛋白A和高迁移率族蛋白1(HMGB-1)。合成的TLR4配体也是已知的，包括α-1酸性糖蛋白(AGP)、单磷酰脂质A(MPLA)、命名为RC-529的脂质A模拟物、鼠β防御素-2(MDF2β)和CFA。
对于TLR5，细菌鞭毛蛋白用作本发明方法中有用的致病和合成配体。
对于TLR6，有用的病原体相关配体是来自Staph的酚溶性调节蛋白。表皮葡萄球菌、酵母聚糖(酵母)、LTA(链球菌)和来自支原体的二酰化多肽。内源配体是未知的，但有用的合成配体包括MALP-2、Pam2Cys和FSL-1。
对于TLR7，有用的合成配体包括鸟苷类似物、洛索立宾、雷西莫特(Resiquimod)、R848、艾达乐咪唑喹啉和咪喹莫特，而内源配体是人RNA，致病配体是病毒单链RNA，特别是来自流感、VSV、HIV和HCV的病毒单链RNA。
对于TLR8，来自RNA病毒的单链RNA是病原体衍生的配体，而内源配体是人RNA，并且与TLR7类似，有用的合成配体包括咪唑喹啉、洛索立宾、ss-poly-U和3M-012。
对于TLR9，病原体衍生的配体包括双链DNA病毒(HSV、MCMV)、来自疟原虫的疟原虫色素(hemozoin)和来自细菌和病毒的未甲基化的CpG DNA。内源配体包括人DNA/染色质和LL37-DNA。有用的合成配体包括基于CpG的寡核苷酸。
因此，在实施方案中，提供了通过用包含SIRPαFc药物和有效激活内源性巨噬细胞的TLR激动剂的药物组合治疗有此需要的受试者来消耗CD47+疾病细胞的方法。在具体的实施方案中，TLR激动剂是物理上可耐受的试剂，其选自刚刚描述的任何TLR激动剂，即细菌和分枝杆菌三酰化脂肽，Pam3Cys，革兰氏阳性细菌肽聚糖，细菌脂蛋白，脂质胆酸，LPS，来自克氏锥虫的GPI-锚蛋白，血凝素(MV)，磷脂甘露聚糖(念珠菌)和LAM(分枝杆菌)，奈瑟氏球菌，完整弗氏佐剂(CFA)，巨噬细胞活化脂肽2(MALP2)，Hib-OMPC，S-(2，3-双棕榈酰氧基丙基)CGDPKHPKSF(FSL-1)，二棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸，单链RNA病毒，双链RNA病毒，如RSV和MCMV poly I：C和poly A：U LPS(革兰氏阴性菌)；F蛋白(RSV)；甘露聚糖(念珠菌)；葡萄糖肌醇磷脂(锥虫)；包膜蛋白(RSV和MMTV)。Hsp60，Hsp70，纤连蛋白结构域A，透明质酸，表面活性蛋白A，高迁移率族蛋白(HMGB-1)，α-1酸性糖蛋白(AGP)，单磷酰脂质A(MPLA)，命名为RC-529的脂质A模拟物，鼠β防御素-2(MDF2β)，细菌鞭毛蛋白，来自Staph的酚溶性调节素。表皮葡萄球菌，酵母聚糖(酵母)，来自支原体的双酰化多肽，MALP-2，Pam2Cys和FSL-1，鸟苷类似物，洛索立宾，雷西莫特R848，艾达乐咪唑喹啉和咪喹莫特，人RNA，病毒单链RNA，单多链-U，3M-012，双链DNA病毒，来自疟原虫的疟原虫色素(hemozoin)，未甲基化的CpG DNA，人DNA/染色质，LL37-DNA和基于CpG的寡核苷酸。在其他实施方案中，激动剂不是基于CpG的寡核苷酸。
在具体的实施方案中，优选的TLR激动剂是TLR3、TLR4、TLR7和TLR8之一的激动剂。在优选的实施方案中，TLR激动剂选自脂多糖(LPS)、R848(也称为)和聚(I：C)。
在一些实施方案中，巨噬细胞刺激剂不是TLR激动剂。
巨噬细胞刺激剂也可以是在体外驱动巨噬细胞以极化或重新极化成所需巨噬细胞类型的任何试剂。这可以使用刚刚描述的TLR刺激剂之一来实现。替代地或补充地，刺激剂可以是细胞因子或生长因子，例如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及转化生长因子β(TGFβ)。
在一个实施方案中，所述药剂是干扰素。干扰素可以是干扰素γ(IFN-γ)，例如特别是IFNγ-1b或干扰素α，如干扰素α-2a(IFNα-2a)，或IFN-α1、IFN-α8、IFN-α10、IFN-α14和IFN-α21之一。
在另一个实施方案中，所述药剂是白细胞介素。白细胞介素可以是白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-4(IL-4)或白细胞介素1β。
还有其他药剂是有用的，只要它们能够在体外激活巨噬细胞朝向M1或M2c的表型。一种这样的试剂是热聚集的人γ球蛋白(HAGG)。
可用于本文的其他巨噬细胞刺激剂是促进CD64+巨噬细胞积聚的那些，即引起CD64+巨噬细胞的流行增加的那些。显示这些巨噬细胞增强SIRPαFc药物的活性，特别是包含SEQ ID NO：3的基于SIRPa的药物的活性。特别有用的也能促进CD64+巨噬细胞的巨噬细胞刺激剂是干扰素γ1b和白细胞介素-10。本文举例说明了用于鉴定这种类型的巨噬细胞刺激剂的试验。
巨噬细胞刺激剂可以与SIRPαFc药物一起使用，其可以是IFN-γ和LPS；IL-10和TGF-β；以及HAGG和TGFβ。
通常，SIRPαFc药物也可以与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)一起使用，以刺激和激活内源性巨噬细胞。
组合中包含的每种药物可以单独配制以组合使用。当一种药物的作用用于增强另一种药物在两种药物的接受者中的作用时，称为这些药物“组合”使用。理想地，治疗方法需要首先给予巨噬细胞刺激剂，然后在用该药剂刺激巨噬细胞时给予SIRPaFc药物。
在该方法中，每种药物以包含药学上可接受的载体的单位剂型提供，并且以治疗有效量提供。如本文所用，“药学上可接受的载体”是指在蛋白质/抗体制剂领域中生理上相容且有用的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在许多情况下，组合物中将优选包括等渗剂，例如糖，多醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，其增强药剂的保质期或有效性。使用配制治疗剂领域的实践标准配制SIRPαFc融合体和巨噬细胞刺激剂。适合静脉内给药例如通过注射或输注的溶液是特别有用的。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与上述成分中的一种或组合(如果需要)一起掺入适当的溶剂中，然后进行灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散液，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其它成分。在无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何附加期望成分。
如本文所用，“有效量”是指在必要的剂量和特定时间段内有效实现所需治疗结果的量。组合中每种药物的治疗有效量可根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重等因素以及药物在接受者中引发所需反应的能力而变化。治疗有效量也是其中药剂的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。
本组合中每种药物的有效量将导致许多消耗的癌细胞超过单独或独立给药任一种预期的数量。
可以与载体材料组合以产生单位剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和具体的给药方式而变化。产生单一单位剂型所需的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，在百分之百中，该量为约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，例如约1％至约30％的活性成分，与药学上可接受的载体组合。
对于一些巨噬细胞刺激剂，在本组合中有用的量可以是已经批准用于人类的剂量。例如，干扰素γ可以使用类似于治疗慢性肉芽肿病或骨硬化病应用所需的方案给药。对于白细胞介素1β，可以使用已经批准用于治疗复发性黑素瘤的剂量。当巨噬细胞刺激剂是已经批准的药物时，应该考虑以低于批准剂量的剂量给药，因为给药的终点是用于巨噬细胞刺激，而不是用于治疗疾病本身。
SIRPαFc药物和巨噬细胞刺激剂可以依次给药，或者基本上同时给药。也就是说，可以在给药之前或之后给予巨噬细胞剂。期望首先施用巨噬细胞刺激剂，以便在施用SIRPαFc药物时刺激巨噬细胞。
组合中的每种药物可以使用本领域已知的一种或多种方法，通过一种或多种独立选择的给药途径分开给药。如本领域技术人员所理解的，给药途径和/或方式将根据所需结果而变化。本发明组合中蛋白质的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。短语“肠胃外给药”包括注射，例如静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、气管内、皮下、皮内、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一个实施方案中，SIRPaFc药物通过肿瘤内给药。
或者，组合中的药物可以通过非肠胃外途径给药，例如通过滴注或通过局部，表皮或粘膜给药途径给药，例如，鼻内、口服、阴道、直肠或舌下给药。
调整给药方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注的每种药物，或者可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以按照治疗情况的指示按比例减少或增加剂量。将肠胃外组合物配制成单位剂型以便于给药和剂量均匀是特别有利的。如本文所用的“单位剂型”是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的说明书由(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果和(b)复合这种活性化合物用于治疗个体敏感性的领域中固有的局限性决定并且直接取决于其。
药物可以组合配制，以便可以在一次给药中将组合物引入接受者，例如一次注射或一次输注袋。
对于药物组合的给药，每种药物的剂量将在宿主体重的约0.0001至100mg几g，更通常0.01至5mg/kg的范围内。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重，1mg/kb体重，3mg/kg体重，5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。在单位剂量形式中，SIRPαFc药物将包含1-500mg药物/剂，例如1、2、3、4、5、10、25、50、100、200、250和500mg/剂。这两种药物可以大致等摩尔量(+/10％)给药。示例性治疗方案需要每周施用一次，每两周施用一次，每三周施用一次，每四周施用一次，每月施用一次，每3个月施用一次或每三至六个月施用一次。本发明药物组合的优选给药方案包括通过静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，每种药物使用以下给药方案之一同时给药；(i)每四周一次，共六剂，然后每三个月一次；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，然后每三周1mg/kg体重。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆融合蛋白浓度，并且在一些方法中约25-300μg/ml。
SIRPaFc药物与红细胞的结合可忽略不计。因此，当使用其中使用其他SIRPαFc药物的药物组合时，不需要考虑RBC“沉(sink)”。相对于由RBC结合的其他SIRPαFc药物，估计本发明的SIRPaFc融合物可以在小于成为RBC结合的药物(例如CD47抗体)所需剂量的一半的剂量下有效。此外，SIRPα-Fc融合蛋白是SIRPα介导的信号的专用拮抗剂，因为当与其结合时其显示可忽略的CD47激动作用。因此，当建立医学上有用的单位给药方案时，不需要考虑药物诱导的任何刺激。
组合中的每种药物也可以作为持续释放制剂给药，在这种情况下需要较低频率的给药。剂量和频率取决于患者中融合蛋白的半衰期。给药的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，相对较低的剂量在较长时间内以相对不频繁的间隔施用。一些患者在余生中继续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量直至疾病进展减少或终止，并且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以使用预防方案治疗患者。
该药物组合可用于“治疗”各种CD47+疾病细胞。治疗可导致靶向疾病细胞的消耗，即，例如通过肿瘤大小或分布的减少所揭示的那些细胞数量的减少，更直接地，数量减少的循环或实体肿瘤细胞。术语“CD47+”用于指目前的多肽结合靶向的细胞的表型。可以使用CD47抗体作为亲和配体，通过流式细胞术鉴定CD47+细胞。适当标记的CD47抗体可商购获得用于此用途(例如，克隆B6H12可从Santa Cruz Biotechnology获得)。检查CD47表型的细胞可以包括标准肿瘤活检样品，特别是包括取自怀疑携带内源性CD47+癌细胞的受试者的血液样品。特别感兴趣作为治疗目标的CD47病细胞是那些“过度表达”CD47。这些CD47+细胞通常是疾病细胞，并且在其表面上以一定密度存在CD47，其超过给定类型细胞的正常CD47密度。CD47过表达在不同细胞类型中会有所不同，但在本文中是指任何CD47水平，例如通过本文示例的流式细胞术或通过免疫染色或通过基因表达分析等确定，其大于在具有对于该细胞类型是正常的CD47表型的对应细胞上可测量的水平。
过量产生CD47的细胞尤其包括CD47+癌细胞，包括液体和实体肿瘤。可以用本发明的药物组合治疗实体瘤，以减小其大小、数量或生长速率并控制癌症干细胞的生长。此类实体肿瘤包括膀胱、脑、乳腺、肺、结肠、卵巢、前列腺、肝脏和其他组织中的CD47+肿瘤。在一个实施方案中，药物组合用于抑制血液癌症的生长或增殖。如本文所用，“血液癌症”是指血液的癌症，并且包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等。“白血病”是指血液中的癌症，其中过多的白细胞对抗感染是无效的，因此挤出构成血液的其他部分，例如血小板和红细胞。据了解，白血病病例分为急性或慢性病例。举例来说，某些形式的白血病可以是急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；慢性粒细胞白血病(CML)；骨髓增生性疾病/肿瘤(MPDS)；和骨髓增生异常综合征。“淋巴瘤”可以指霍奇金淋巴瘤，其中包括惰性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)等。骨髓瘤可以指多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻链或Bence-Jones骨髓瘤。
在一些实施方案中，用药物组合治疗的血液癌症是CD47+白血病，优选选自急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病和骨髓增生异常综合征，优选人急性髓性白血病。
在其他实施方案中，用SIRPαFc蛋白治疗的血液学癌症是选自以下的CD47+淋巴瘤或骨髓瘤：霍奇金淋巴瘤、惰性和侵袭性两种非霍奇金淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)、多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤，轻链或Bence-Jones骨髓瘤以及平滑肌肉瘤(leimyosarcoma)。
在一个实施方案中，癌症是蕈样真菌病。
包含SIRPαFc和巨噬细胞极化的组合疗法也可以与用于治疗靶向适应症的任何其他药剂或方式一起利用，例如辅助治疗中的手术，或者如新辅助疗法中的其他化学疗法或放射疗法。
实施例
延龄草疗法公司(Trillium Therapeutics，Inc.)提供预先配制的SIRPαFc药物和对照，作为可溶性SIRPa的形式，指定为(1)对照Fc[人IgG1区域(铰链-CH2-CH3)]，和(2)包含人SIRPa变体2的V区的人SIRPaFc，该区与野生型人IgG1 Fc区(铰链CH2-CH3)融合，如SEQID NO：3所示，将其储存在-80℃直至使用。
实施例1
从正常健康人类供体(Biological Specialty Corporation)获得肝素化全血，并从所有供体获得知情同意书。通过Ficoll-Paque Plus密度梯度(GE Healthcare)分离外周血单核细胞(PBMC)，并使用CD14抗体包被的MicroBead分离(Miltenyi Biotec)通过阳性选择从PBMC分离CD14+单核细胞。通过在补充有20ng/mL M-CSF(PeproTech)的X-Vivo-15培养基(Lonza)中培养至少10天，将单核细胞分化成巨噬细胞。在吞噬作用测定前一天，单核细胞衍生的巨噬细胞在M-CSF培养基中未处理(M0)或用20ng/mL M-CSF和300ng/mL干扰素-γ(IFN-γ)(PeproTech)处理过夜)，作为M1，50ng/mL的IFN-γ和50ng/mL的LPS(MDBiosciences)中为M1+LPS，20ng//mL的IL-4(PeproTech)中为M2a，20ng/mL的IL-1(PeproTech)和50ug/mL的热聚集人IgG(HAGG)中为M2b，或20ne/mL的IL-10(PeproTech)和20ng/mL的TGF(PeproTech)中为M2c。第二天，使用无酶细胞解离缓冲液(ThermoFisher)收获巨噬细胞。将人B细胞淋巴瘤细胞系Toledo用Violet Proliferation Dye 450(BDBiosciences)和这6个巨噬细胞亚群在圆底非组织培养物处理的96孔板中以1∶5效应子：靶比例标记。在SIRPaFc或对照Fc蛋白的存在下，将巨噬细胞和肿瘤细胞在37℃、5％CO2中共培养2小时。随后用人Fc受体结合抑制剂(ebioscience)阻断细胞，然后用Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain(Invitrogen)、APC缀合的抗人CD14(61D3，eBioscience)和PE缀合的抗-人CD11b(ICRF44，eBioscience)染色。将它们洗涤并重悬于StabilizingFixative(BD Biosciences)中。在FACSVerse流式细胞仪上获得细胞，并使用FlowJo软件(Treestar Inc.)分析数据。巨噬细胞被鉴定为活的单一CD14+CD11b+细胞。SSC-W和SSC-H区分排除了双峰。％吞噬作用被评估为VPD450+的巨噬细胞％。使用GraphPad Prism软件通过非配对t-检验与同种型对照计算统计学显著性，其中p***＜0.001。
结果如图1所示。如图所示，使用1μMSIRPaFc对肿瘤细胞上的CD47进行阻断增加所有6个巨噬细胞亚群对DLBCL Toledo细胞系的吞噬作用，与M0、M2a和M2b亚群相比，M1(+/-LPS)和M2c MDM在SIRPαFc诱导的吞噬作用方面优越。
实施例2
为了进一步了解驱动极化MDM的吞噬能力的原因，我们分析了6个明显极化的巨噬细胞上的FcγR表达。
如实施例1中所教导制备巨噬细胞。然后，首先用人Fc受体结合抑制剂(ebioscience)阻断巨噬细胞，然后用近红外LIVE/DEAD可固定死细胞染色(Invitrogen)、FITC缀合的抗CD16(克隆CB16)、FITC缀合的抗-CD32(克隆FL18.26)和V450缀合的抗-CD64(克隆10.1)在三个独立的混合物中染色。洗涤细胞并重悬于稳定化固定剂(BDBiosciences)中，并在FACSVerse流式细胞仪上获得数据，并使用FlowJo软件(TreestarInc.)分析数据。巨噬细胞被鉴定为活的单一细胞。SSC-W和SSC-H区分排除了双峰。如图1中所述分析1μMSIRPαFc处理后巨噬细胞吞噬作用的百分比，并相对于CD64的中值荧光强度作图。
结果总结在图2A中。发现M2c表达最高水平的CD16和CD32，而M2b表达最低水平的CD32。更有趣的是，发现CD64水平高度可变，其中M1表达最高水平的CD64，接着是M1(+LPS)和M2c，这是与对SIRPαFc的反应性相关的模式。当针对跨越10个独立供体的各种巨噬细胞亚型的CD64表达绘制％吞噬作用时，我们观察到高亲和力FcγRI(CD64)的MDM表达与SIRPαFc处理后的吞噬活性之间的正相关，r2＝0.53(图2B)而在％吞噬作用和CD32或CD16表达之间未发现显著相关性。
实施例3
从正常健康人类供体(Biological Specialty Corporation)获得肝素化全血，并从所有供体获得知情同意书。通过Ficoll-Paque Plus密度梯度(GE Healthcare)分离外周血单核细胞(PBMC)，并使用CD14抗体包被的MicroBead分离(Miltenyi Biotec)通过阳性选择从PBMC分离CD14+单核细胞。通过在补充有20ng/mL M-CSF(PeproTech)的X-Vivo-15培养基(Lonza)中培养至少10天，将单核细胞分化成巨噬细胞。洗涤巨噬细胞并将其通过用20ng/mL M-CSF、20ng/mL IL-4(PeproTech)或50ug/mL热聚集的人γ球蛋白(HAGG)和20ng/mL IL-1β(PeproTech)分别培养一天极化成M0、M2a和M2b。极化后一天，洗去极化介质，用20ng/mL IFN-γ(PeproTech)、1000U/mLIFNα2a(PBL测定科学)、20ng/mL IL-10(PeproTech)、10ug/mL聚(I：C)(InvivoGen)、1ug/mL LPS(MDBiosciences)、1ug/mL R848(InvivoGen)或10ug/mL ODN2395CpG(InvivoGen)处理细胞过夜。第二天，使用无酶细胞解离缓冲液(ThermoFisher)收获巨噬细胞，用于流式噬菌作用分析。将人B细胞淋巴瘤细胞系Toledo用Violet Proliferation Dye 450(BD Biosciences)和加入到复极化的巨噬细胞中在圆底非组织培养物处理的96孔板中以1∶5效应子：靶比例标记。在SIRPaFc或TTI-402(对照Fc蛋白)存在下，将巨噬细胞和肿瘤细胞在37℃，5％CO2下共培养2小，随后用人Fc受体结合抑制剂(ebioscience)阻断，并用Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain(Invitrogen)、APC缀合的抗人CD14(61D3，eBioscience)和PE缀合的抗人CD11b(ICRF44，eBioscience)染色，洗涤并重悬于稳定化固定剂(BD Biosciences)中。在FACSVerse流式细胞仪上获得细胞，并使用FlowJo软件(Treestar Inc.)分析数据。巨噬细胞被鉴定为活的单一CD14+CD11b+细胞。SSC-W和SSC-H区分排除了双峰。吞噬作用被评估为VPD450+的巨噬细胞％。使用GraphPad Prism软件通过非配对t-检验与同种型对照计算统计学显著性。
结果如图3A-3C所示。(统计显著性用星号表示：*p≤0.05，**p≤0.01，***p＜ 0.001。)证明(图1)M0、M2a和M2b MDM对于响应于SIRPaFc与M1(+/-LPS)和M2c相比表现出更低的吞噬能力。因此，使用各种细胞因子和Toll样受体(TLR)激动剂试图将这3个巨噬细胞亚群重新极化成高度吞噬性的MDM。发现M0、M2a和M2b本质上是非常可塑的。使用包括IFN、IFNα、IL-10和Toll样受体激动剂(包括Poly(I：C)、LPS、R848，但不包括CpG)的细胞因子进行复极刺激后，它们对SIRPaFc的反应性可以增加。
实施例4
从正常健康人类供体(Biological Specialty Corporation)获得肝素化全血，并从所有供体获得知情同意书。通过Ficoll-Paque Plus密度梯度(GE Healthcare)分离外周血单核细胞(PBMC)，并使用CD14抗体包被的MicroBead分离(Miltenyi Biotec)通过阳性选择从PBMC分离CD14+单核细胞。通过在补充有20ng/mL M-CSF(PeproTech)的X-Vivo-15培养基(Lonza)中培养至少10天，将单核细胞分化成巨噬细胞。洗涤巨噬细胞并将其通过用20ng/mL M-CSF、20ng/mL IL-4(PeproTech)或50ug/mL热聚集的人γ球蛋白(HAGG)和20ng/mL IL-1β(PeproTech)分别培养一天极化成M0、M2a和M2b。极化后一天，洗去极化介质，用20ng/mL IFN-γ(PeproTech)、1000U/mLIFNα2a(PBL测定科学)、20ng/mL IL-10(PeproTech)、10ug/mL聚(I：C)(InvivoGen)、1ug/mL LPS(MDBiosciences)、1ug/mL R848(InvivoGen)或10ug/mL ODN2395CpG(InvivoGen)处理细胞过夜。第二天，使用无酶细胞解离缓冲液(ThermoFisher)收获巨噬细胞，用于分析CD16、CD32和CD64表达。然后，用人Fc受体结合抑制剂(ebioscience)阻断巨噬细胞，并用近红外LIVE/DEAD可固定死细胞染色(Invitrogen)、FITC缀合的抗CD16(克隆CB16)、FITC缀合的抗-CD32(克隆FL18.26)和V450缀合的抗-CD64(克隆10.1)在三个独立的混合物中染色。洗涤细胞并重悬于稳定化固定剂(BD Biosciences)中，并在FACSVerse流式细胞仪上获得数据，并使用FlowJo软件(Treestar Inc.)分析数据。巨噬细胞被鉴定为活的单一细胞。SSC-W和SSC-H区分排除了双峰。
代表性结果如图4所示。证明(图1)M0、M2a和M2b MDM对于响应于SIRPaFc与MI(+/-LPS)和M2c相比表现出稍低的吞噬能力。因此，使用各种细胞因子和Toll样受体(TLR)激动剂将这3个巨噬细胞亚群重新极化成高度吞噬性的MDM。发现M0、M2a和M2b本质上是非常可塑的。它们的CD64表达可以在过夜刺激和用包括IFNα、IFNγ、IL-10和Toll样受体激动剂(包括Poly(I：C)，但不是LPS，R848和CpG)的细胞因子复极化时增加。
如图5A-5C中所示，SIRPaFc(SEQ ID NO：3)和IFN-γ的影响进行检查如下：在第0天，将1×107个托莱多细胞在基质胶中皮下植入SHrN NOD.SCID小鼠的右侧腹(每组n＝9只小鼠)。当平均肿瘤大小约为260mm3时，小鼠随机化，并接受瘤内(IT)注射SIRPaFc 1mg/kg或IFNg 0.25mg/kg或两者的组合或载体。在联合治疗中，在SIRPaFc前一天给予IFNg。在前两次剂量期间每周进行IFNg和/或SIRPaFc或载体给药，并且在第二次给药后频率增加至每周两次。在肿瘤接种后第44天(在所有载体处理的小鼠达到终点后2天)终止研究。在图5A中，显示了每个治疗组的具有标准平均偏差的平均肿瘤体积。当每组超过25％的小鼠被处死时，曲线终止。给药方案表示为倒三角形。图5B显示了携带肿瘤的小鼠的存活率。使用对数秩检验进行存活曲线的统计分析，其中指示*.*p≤0.05，**p≤0.01。图5C显示了每个治疗组的个体肿瘤生长蜘蛛图。
尽管这里已经描述了本发明的优选实施例，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下，可以对其进行改变。本文公开的所有文献均通过引用并入。
序列表
<110> 延龄草疗法有限公司
<120> CD47阻断治疗中的巨噬细胞刺激
<130> 5949-P53028PC00
<150> US 62/322,934
<151> 2016-04-15
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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130 135 140
Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成连接子
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成配体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是2,3-双棕榈酰氧丙基
<400> 12
Ser Xaa Cys Gly Asp Pro Lys His Pro Lys Ser Phe
1 5 10
<210> 13
<211> 504
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
355 360 365
Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val
370 375 380
Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys
385 390 395 400
Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn
405 410 415
Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn
435 440 445
Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser
450 455 460
Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg
465 470 475 480
Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr
485 490 495
Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500
<210> 14
<211> 503
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser
85 90 95
Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr
145 150 155 160
Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro
165 170 175
Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp
180 185 190
Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile
195 200 205
His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln
210 215 220
Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg
225 230 235 240
Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu
245 250 255
Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr Cys
260 265 270
Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu Glu
275 280 285
Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu Asn
290 295 300
Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val Ser
305 310 315 320
Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp Gly
325 330 335
Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn Glu
355 360 365
Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val Ala
370 375 380
Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys Ala
385 390 395 400
Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala
405 410 415
Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn
420 425 430
Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn Asn
435 440 445
His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser Glu
450 455 460
Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg Thr
465 470 475 480
Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala
485 490 495
Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500
<210> 15
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 16
<211> 473
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Gln Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Asn Ser Tyr Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Ala Gly Arg Gly Asn Thr Lys Asn Ser
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Leu Thr Ser Ser Ser Ser Phe Leu Gly
115 120 125
Tyr Phe His His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Leu Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 17
<211> 471
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ile Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gln Ser Gln Val Pro Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Pro Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Thr Phe Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Ile Arg Asn Pro Ser Ser Gly Arg Ser Ser Val Ser
65 70 75 80
Gln Lys Phe Glu Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Thr
85 90 95
Thr Ala His Met Glu Leu Arg Asn Leu Thr Ser Asp Asp Thr Gly Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Thr Thr Arg Trp Lys Trp Val Val Arg Gly Glu Asp
115 120 125
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 18
<211> 471
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ile Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gln Ser Gln Val Pro Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Pro Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Thr Phe Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Ile Arg Asn Pro Ser Ser Gly Arg Ser Ser Val Ser
65 70 75 80
Gln Lys Phe Glu Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Thr
85 90 95
Thr Ala His Met Glu Leu Arg Asn Leu Thr Ser Asp Asp Thr Gly Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Thr Thr Arg Trp Lys Trp Val Val Arg Gly Glu Asp
115 120 125
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 19
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Ala Ser Phe Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 20
<211> 469
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Ile Ala Thr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Ala Arg Cys Gln Val Arg Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Gln Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Gly Gly His Ser Met Ser Trp Val Arg His Ala Ala Gly Lys Gly Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Val Phe Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Gln Ala Gly Tyr Ser Tyr Gly Val Asp Gly
115 120 125
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Leu Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr Arg Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 21
<211> 474
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Ala Thr Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Asp Val Lys Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile
35 40 45
Asn Asn Ala Trp Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Thr Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Gly Lys Thr Glu Thr Gly Thr Thr Asp
65 70 75 80
Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser
85 90 95
Arg Thr Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ile Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Gly Val Thr Ala Glu Ala Tyr Tyr Phe
115 120 125
Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 22
<211> 475
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Leu Phe Val Val Ala Ala Ser Thr Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Met Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Ala Ser Phe
35 40 45
Ala Ser Tyr Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Val Phe Arg Thr Pro Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Asp Ser Thr Gly
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Tyr Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Ala Cys Gly Asp Asp Cys Ser Phe Leu Tyr
115 120 125
His Tyr Tyr Met Ala Ala Trp Gly Arg Gly Thr Ala Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
145 150 155 160
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
195 200 205
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
210 215 220
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
225 230 235 240
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
325 330 335
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
340 345 350
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
355 360 365
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
370 375 380
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
420 425 430
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr
450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 23
<211> 469
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ile Phe
35 40 45
Lys Asn Tyr Thr Ile Ser Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Ser Ile Ser Ile Tyr Gly Thr Gly Lys Ser Ala
65 70 75 80
Gln Gln Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Gly Asp Glu Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Met Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Val Gly Ala Pro Gly Ala Phe Asp Ile
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Gly Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 24
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 25
<211> 377
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 26
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 27
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Ala Ser Phe Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Val Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Cys Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Arg Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asp Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 28
<211> 344
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val
20 25 30
Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu
50 55 60
Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile
65 70 75 80
Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly
85 90 95
Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
115 120 125
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
130 135 140
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145 150 155 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
165 170 175
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
180 185 190
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
195 200 205
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
210 215 220
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
245 250 255
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
260 265 270
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
275 280 285
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
290 295 300
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
305 310 315 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
325 330 335
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340

Claims (30)

1.一种用于在有需要的受试者中消耗CD47+疾病细胞的方法，包括给所述受试者施用SIRPαFc药物和巨噬细胞刺激剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述巨噬细胞刺激剂促进形成是M1或M2c的巨噬细胞的形成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述巨噬细胞刺激剂是TLR激动剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述TLR激动剂选自脂多糖(LPS)、雷西莫特和poly(I：C)。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述TLR激动剂是poly(I：C)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述巨噬细胞刺激剂包括选自巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、热聚合γ球蛋白(HAGG)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和转化生长因子β(TGFβ)的至少一种蛋白质。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述巨噬细胞刺激剂包括选自干扰素γ和干扰素α的干扰素。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述巨噬细胞刺激剂包括选自IL-1β、IL-4和IL-10以及它们的混合物的白细胞介素。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在施用所述SIRPαFc药物之前施用所述巨噬细胞刺激剂，从而当暴露于所述SIRPαFc药物时使内源性巨噬细胞激活或极化。
10.根据权利要求1-9所述的方法，其中所述SIRPαFc药物包括基于IgG1的Fc。
11.根据权利要求1-9所述的方法，其中所述SIRPαFc药物包括基于IgG4的Fc。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述SIRPαFc药物包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述SIRPαFc药物包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-9所述的方法，其中所述SIRPαFc药物包括SIRPα的CD47结合区，其包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：L4V/I、V6I/L、A21V、V27I/L、131T/S/F、E47V/L、K53R、E54Q、H56P/R、S66T/G、K68R、V92I、F94V/L、V63I、和F103V。
15.在组合中，有效用于消耗CD47+疾病细胞的SIRPαFc药物，和有效增强CD47+疾病细胞的所述消耗的巨噬细胞刺激剂，以及教导根据权利要求1-14中任一项所述的治疗方法的说明书。
16.根据权利要求15所述的组合用于治疗具有CD47+疾病细胞的受试者的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述CD47+疾病细胞是CD47+癌细胞。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述CD47+疾病细胞是CD47+血液癌症。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述CD47+癌细胞是选自急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；慢性粒细胞白血病(CML)；骨髓增生性疾病/肿瘤(MPDS)；蕈样真菌病；和骨髓增生异常综合征的癌症细胞。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症是选自霍奇金氏淋巴瘤、惰性和侵袭性两种非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤的淋巴瘤。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述癌症是选自多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞性骨髓瘤、重链骨髓瘤以及轻链或Bence-Jones骨髓瘤的骨髓瘤。
22.SIRPaFc与选自干扰素γ1b、干扰素α2a、白细胞介素1β、白细胞介素4、白细胞介素-10、巨噬细胞集落刺激因子和转化生长因子β的药剂组合用于治疗CD47+癌症的用途。
23.SIRPaFc与选自脂多糖(LPS)、雷西莫特和poly(I：C)的toll样受体激动剂组合用于治疗CD47+癌症的用途。
24.根据权利要求16-23中任一项所述的用途，其中所述SIRPαFc药物包括SEQ ID NO：3。
25.根据权利要求15所述的组合，其中所述SIRPαFc药物包括SEQ ID NO：3。
26.根据权利要求16-23中任一项所述的用途，其中所述SIRPαFc药物包括SEQ ID NO：8。
27.根据权利要求15所述的组合，其中所述SIRPαFc药物包括SEQ ID NO：8。
28.巨噬细胞刺激剂治疗正在接受SIRPαFc药物治疗的受试者的CD47+癌症的用途。
29.SIRPαFc药物治疗正在接受巨噬细胞刺激剂治疗的受试者的CD47+癌症的用途。
30.增强SIRPαFc药物的抗癌作用的方法，所述方法包括给接收所述SIRPαFc药物的受试者施用巨噬细胞刺激剂。
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