TW202017943A - Cd226促效劑抗體 - Google Patents

Cd226促效劑抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW202017943A
TW202017943A TW108124450A TW108124450A TW202017943A TW 202017943 A TW202017943 A TW 202017943A TW 108124450 A TW108124450 A TW 108124450A TW 108124450 A TW108124450 A TW 108124450A TW 202017943 A TW202017943 A TW 202017943A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cancer
antibody
seq
human
amino acid
Prior art date
Application number
TW108124450A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI728400B (zh
Inventor
納瑞許 庫瑪
Original Assignee
美商美國禮來大藥廠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商美國禮來大藥廠 filed Critical 美商美國禮來大藥廠
Publication of TW202017943A publication Critical patent/TW202017943A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI728400B publication Critical patent/TWI728400B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明係關於抗人類CD226促效劑抗體，其可用於治療實體腫瘤癌。

Description

CD226促效劑抗體
本發明係處於醫學領域。更特定言之，本發明係關於針對人類CD226 (hCD226)之促效劑抗體、包含此類促效劑抗人類CD226抗體之組合物及使用此類促效劑抗人類CD226抗體治療癌症之方法。
免疫檢查點路徑參與免疫反應之抑制或活化(Isakov N,J. Autoimmune Disorders 2016 ; 2(2): 17)。在自體免疫疾病療法中，可能需要促進(亦即，促效)免疫抑制路徑之作用，從而抑制免疫反應。相反地，在癌症療法中，可能需要促進(亦即，促效)免疫刺激路徑之作用，從而活化或刺激免疫反應。
CD226充當免疫共刺激受體(Dougall WC等人,Immunol. Rev. 2017; 276: 112-120 (2017))。因此，CD226路徑為免疫刺激路徑，亦即其活化/刺激免疫反應(Manaka, I, A,J. Exp. Med. ; 2008; 205(13):  2959-2964；Van Vo, A,Molecular Immunology ; 2016; 69: 70-76；Shengke, H,J Biol Chem. ; 2014; 289(10): 6969-6977)。促進(促效) CD226路徑之免疫刺激作用可為有益的，例如在治療癌症中，且促進CD226路徑之免疫刺激作用的治療分子為CD226路徑促效劑。
CD226表現於自然殺手(Natural killer，NK)細胞、血小板、單核球、CD8+ T細胞及經活化之CD4+ T細胞之表面上(Van Vo, A,Molecular Immunology ; 2016; 69: 70-76)及甲狀腺癌症、肺癌、胃癌、大腸直腸癌、頭頸癌、泌尿道上皮癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌及黑色素瘤中(Protein Atlas, proteinatlas.org/ENSG00000150637-CD226/pathology)。
CD226與在人類及小鼠之許多組織中之造血、上皮及內皮細胞上廣泛表現的CD112 (PVRL2)及CD155 (PVR)相互作用(Van Vo, A,Molecular Immunology ; 2016; 69: 70-76；Shengke, H,The J. of Biol. Chem. , 2014; 289(10): 6969-6977)。CD112 (PVLR2)表現於乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃(stomach/gastric)癌、睪丸癌、甲狀腺癌及泌尿道上皮癌中。(Human Protein Atlas proteinatlas.org/ ENSG00000130202-NECTIN2/pathology)。CD155 (PVR)表現於肺癌、肝癌、胰臟癌、類癌、大腸直腸癌、頭頸癌、胃癌、腎癌、泌尿道上皮癌、睪丸癌、前列腺癌、皮膚癌及黑色素瘤中。(Human Protein Atlas, proteinatlas.org/ENSG00000073008-PVR/pathology)CD155亦表現於軟組織肉瘤中(Atsumi S等人, Oncol. Lett. 2013; 5: 1771-1776)。
NK細胞及T細胞上之CD226與腫瘤細胞及抗原呈現細胞上之CD112及CD155之間的相互作用增強細胞介導之細胞毒性及細胞介素產生(Iguchi-Manaka, A,J. Exp. Med. 2008; 205(13): 2959-2964及本文之參考文獻 )。CD226為CD226/TIGIT路徑之一部分，其中CD226充當免疫刺激受體，TIGIT充當免疫抑制受體，且CD226與TIGIT競爭結合至CD155及CD112 (Dougall WC等人,Immunol. Rev. 2017; 276: 112-120 (2017)；Blake, S,Clin Cancer Res ; 2016; 22(21): 5182-5188)。TIGIT亦抑制CD226均二聚作用，其為CD226/CD155相互作用所必需的(Dougall WC等人,Immunol. Rev. 2017; 276: 112-120 (2017))。
已提出，促效CD226之免疫刺激作用在治療癌症中可為有益的(Pauken, KE及EJ Wherry,Cancer Cell 2014 : 26: 785-787; )。因此，增強抗腫瘤免疫反應可為癌症療法之有效手段。CD226可用於控制NK細胞及T細胞功能，且其已參與NK細胞及CD8+ T細胞介導的針對腫瘤細胞之細胞毒性的黏附共受體刺激、免疫突觸形成、T細胞增殖及分化以及細胞介素分泌。(Guillerey, C,J. Clin. Invest .2015 ; 125(5): 2077-2089)。
在缺乏CD226之小鼠中，已證實CD8+ T細胞在識別由非專業抗原呈現細胞呈現之抗原時需要CD226進行共刺激，且NK細胞需要CD226來消除由於缺乏其他NK細胞活化配位體引起的對NK細胞介導之細胞毒性具有相對抗性的腫瘤細胞(Gilfillan, S,J. Exp. Med.; 2008; 205(13): 2965-2973)。CD226因此擴展可活化CD8+ T細胞及NK細胞之目標細胞的範圍，且因此對於針對逃避其他活化分子或輔助分子識別之腫瘤及/或病毒的免疫監視可為重要的(Gilfillan, S,J. Exp. Med.; 2008; 205(13): 2965-2973)。
已報導某些抗CD226抗體，諸如小鼠IgG1 KRA236 (Bottino, C,Front Immunol. 2014; 5: 56 )，大鼠IgG2a TX25 (Van Vo, A,Molecular Immunology; 2016; 69: 70-76)；大鼠IgG2b 10e5 (Dardalhon, V.J Immunol 2005; 175:1558-1565)；小鼠TX94、TX95、TX96、TX107及TX108 (Okumura, G,Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy, 2017; 36(3): 135-139)，2E6及3B9 (Hou, S,The J. Biol. Chemistry; 2014; 289(10): 6969-6977)，NewE1(Gaud, G等人,Sci. Signal. 2018 ; 11: eaar3083; doi: 10.1126/scisignal.aar3083)，DX11 (Bio-Rad MCA2257)，11A8 (BioLegend 338311)及LeoA1 (Millipore Sigma MABT398)。
然而，尚未報導人類抗人類CD226促效劑抗體，且在治療癌症之臨床開發中不存在抗CD226抗體。因此，需要結合至人類CD226、增強免疫反應且可用於治療癌症之促效劑抗體。
本文所述之抗人類CD226促效劑抗體結合至人類CD226，刺激T細胞衍生之IFNγ產生且作為單一療法抑制鼠類腫瘤模型中之腫瘤生長。在一個實施例中，本發明之抗體展現所需物理及化學穩定性，包括(但不限於)活體內穩定性、熱穩定性、溶解性、低自締合性及藥物動力學特性，且因此可能用於治療癌症。在另一實施例中，本發明之抗人類CD226促效劑抗體為完全人類抗體。在另一實施例中，本發明之抗人類CD226促效劑抗體為人類化抗體。
本發明亦提供一種結合人類CD226 (SEQ ID NO: 13)或其細胞外片段(例如SEQ ID NO: 14)且作為單一療法在癌症之鼠類腫瘤模型中抑制腫瘤生長的人類抗人類CD226 IgG1-零效應(IgG1-EN)抗體，該抗人類CD226抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1之HCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 2之HCDR2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 3之HCDR3、胺基酸序列為SEQ ID NO: 4之LCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 5之LCDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO:6之LCDR3。在另一實施例中，本發明規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之重鏈可變區(HCVR)及胺基酸序列為SEQ ID NO: 8之輕鏈可變區(LCVR)。在另一實施例中，本發明規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之重鏈(HC)及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之輕鏈(LC)。在另一實施例中，本發明規定抗體由胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之兩條重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之兩條輕鏈組成。
本發明亦提供一種能夠表現抗人類CD226抗體之哺乳動物細胞，該抗體包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 1之HCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 2之HCDR2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 3之HCDR3、胺基酸序列為SEQ ID NO: 4之LCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 5之LCDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 6之LCDR3。在另一實施例中，本發明規定抗人類CD226抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之HCVR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 8之LCVR。在另一實施例中，本發明規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之HC及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之LC。在另一實施例中，本發明規定抗體由胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之兩條重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之兩條輕鏈組成。
本發明亦提供用於製備抗人類CD226抗體之方法，其包含培養能夠表現該抗體之哺乳動物細胞及回收該抗體，其中該抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1之HCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 2之HCDR2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 3之HCDR3、胺基酸序列為SEQ ID NO: 4之LCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 5之LCDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO:6之LCDR3。在另一實施例中，本發明規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之HCVR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 8之LCVR。在另一實施例中，本發明規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之HC及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之LC。在另一實施例中，本發明規定抗體由胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之兩條重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之兩條輕鏈組成。本發明亦提供藉由該方法製備之抗人類CD226抗體。本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含藉由該方法製備之抗人類CD226抗體及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
本發明亦提供一種DNA分子，其包含序列為SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 11及12之多核苷酸。本發明亦提供一種哺乳動物細胞，其包含有包含序列為SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 11及12之多核苷酸的DNA分子。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含抗人類CD226抗體，該抗體包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 1之HCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 2之HCDR2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 3之HCDR3、胺基酸序列為SEQ ID NO: 4之LCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 5之LCDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 6之LCDR3；及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在另一實施例中，本發明規定抗人類CD226抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之HCVR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 8之LCVR。在一些實施例中，抗人類CD226抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之HC及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之LC。在一些實施例中，抗人類CD226抗體由胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之兩條重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之兩條輕鏈組成。
本發明提供治療方法及使用方法。已研究CD226在免疫系統中作為共刺激受體之作用。舉例而言，相較於野生型(WT)細胞，缺乏CD226之小鼠活體外對表現CD226配位體之腫瘤顯示處明顯更少的細胞毒活性(Iguchi-Manaka, A,J. Exp. Med . 2008; 205(13): 2959-2964)。因此，當CD226路徑活化時，免疫系統活性增加，其可用於藉由刺激(促效) CD226路徑治療癌症，且促效劑抗人類CD226抗體可藉由活化NK細胞及/或T細胞活性來提供針對癌症之治療效果。
CD112及/或CD155表現已牽涉於多種人類實體腫瘤癌，包括大腸直腸癌(Masson, D.,Gut, 2001; 49: 236-240；Tahara-Hanaoka , S.Blood, 2006; 107: 1491-1496)；胃癌(Tahara-Hanaoka, S.,Blood , 2006; 107: 1491-1496)；卵巢癌(Carlsten, M.,Cancer Res., 2007: 67: 1317-1325)；胰臟癌；(Nishiwada,Anticancer Research ; 2015; 35 : 2287-2298)；及前列腺癌、腎細胞癌、胰臟癌、結腸癌、非小細胞肺癌、卵巢癌及乳癌(Sloan, K.,BMC Cancer 2004 ; 4: 73)。
CD155在肺腺癌中之過度表現明顯與淋巴結癌轉移、腫瘤之細支氣管肺泡癌比率相關，具有陽性CD155過度表現之患者的無疾病存活率明顯低於具有陰性CD155過度表現之患者(Nakai, R,Cancer Sci .; 2010; 101(5): 1326-1330)。多變量存活率分析揭示CD155表現為一個會造成不利結果之獨立風險因素(Nakai, R,Cancer Sci .; 2010; 101(5): 1326-1330)。
本發明提供一種治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之抗人類CD226抗體，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1之HCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 2之HCDR2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 3之HCDR3、胺基酸序列為SEQ ID NO: 4之LCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 5之LCDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO:6之LCDR3。在另一實施例中，本發明亦規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之HCVR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 8之LCVR。在另一實施例中，本發明亦規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之HC及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之LC。在另一實施例中，本發明亦規定抗體由胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之兩條重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之兩條輕鏈組成。
在一些實施例中，本發明亦規定癌症為實體腫瘤癌。在另一實施例中，本發明亦規定實體腫瘤癌為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、軟組織肉瘤、胃(stomach/gastric)癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或泌尿道上皮癌。在一較佳實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，乳癌為三陰性乳癌。
本發明提供結合至人類CD226 (SEQ ID NO: 13)或其細胞外片段(例如SEQ ID NO: 14)之抗人類CD226抗體，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1之HCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 2之HCDR2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 3之HCDR3、胺基酸序列為SEQ ID NO: 4之LCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 5之LCDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO:6之LCDR3，以用於療法。在另一實施例中，本發明規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之HCVR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 8之LCVR。在另一實施例中，本發明規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之HC及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之LC。在另一實施例中，本發明規定抗體由胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之兩條重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之兩條輕鏈組成。
在一個實施例中，本發明規定療法為癌症之治療。在另一實施例中，本發明規定癌症為實體腫瘤癌。在另一實施例中，本發明規定實體腫瘤癌為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、軟組織肉瘤、胃(stomach/gastric)癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或泌尿道上皮癌。在一較佳實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，乳癌為三陰性乳癌。
本發明亦提供結合至人類CD226 (SEQ ID NO: 13)或其細胞外片段(例如SEQ ID NO: 14)之抗人類CD226抗體之用途， 該抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1之HCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 2之HCDR2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 3之HCDR3、胺基酸序列為SEQ ID NO: 4之LCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 5之LCDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 6之LCDR3，以製造用於治療癌症之藥物。在另一實施例中，本發明規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之HCVR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 8之LCVR。在另一實施例中，本發明規定抗體包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之HC及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之LC。在另一實施例中，本發明規定抗體由胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之兩條重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之兩條輕鏈組成。
在一個實施例中，本發明亦規定癌症為實體腫瘤癌。在另一實施例中，本發明亦規定實體腫瘤癌為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃(stomach/gastric)癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或泌尿道上皮癌。在一較佳實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，乳癌為三陰性乳癌。
本發明亦提供一種人類抗人類CD226促效劑抗體。在一個實施例中，人類抗人類抗體在活體內投與時具有抗腫瘤作用。本發明提供一種能夠表現人類抗人類抗體之哺乳動物細胞。本發明亦提供一種用於製備人類抗人類CD226抗體之方法，其包含：培養能夠表現該抗體之哺乳動物細胞及回收該抗體。
本發明亦提供用於療法之人類抗人類CD226抗體。在一個實施例中，人類抗人類CD226抗體為促效劑抗體。在另一實施例中，人類抗人類CD226抗體刺激免疫反應。在另一實施例中，人類抗人類CD226抗體在活體內投與時具有抗腫瘤活性。
本發明亦提供人類抗人類CD226抗體，其用於治療癌症。在一個實施例中，本發明提供用於治療實體腫瘤癌之人類抗人類CD226促效劑抗體。在另一實施例中，抗體刺激免疫反應。在另一實施例中，抗體在活體內投與時具有抗腫瘤活性。
在一個實施例中，本發明提供人類抗人類CD226抗體，其用於治療實體腫瘤癌。在另一實施例中，本發明規定實體腫瘤癌為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、軟組織肉瘤、胃(stomach/gastric)癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或泌尿道上皮癌。在一較佳實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，乳癌為三陰性乳癌。
本發明提供人類抗人類CD226促效劑抗體之用途，其用於製造用於治療癌症之藥物。在一個實施例中，本發明規定癌症為實體腫瘤癌。在另一實施例中，本發明規定實體腫瘤癌為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、軟組織肉瘤、胃(stomach/gastric)癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或泌尿道上皮癌。在一較佳實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，乳癌為三陰性乳癌。
在一個實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含與一或多種抗腫瘤劑同時、分別或依序組合投與有效量之本文所揭示之抗體。抗腫瘤劑之非限制性實例包括雷莫蘆單抗(ramucirumab)、奈昔木單抗(necitumumab)、奧拉妥單抗(olaratumab)、吉西他濱(gemcitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、加盧色替(galunisertib)、阿貝西利(abemaciclib)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、脂質體小紅莓(liposomal doxorubicin)、多西他賽(docetaxel)、環磷醯胺(cyclophosphamide)及小紅莓、維瑞濱(navelbine)、艾立布林(eribulin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、用於可注射之懸浮液的太平洋紫杉醇蛋白結合粒子、伊沙匹隆(ixabepilone)、卡培他濱(capecitabine)、FOLFOX (甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及奧沙利鉑)、FOLFIRI (甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及伊立替康)、西妥昔單抗(cetuximab)、EGFR抑制劑、a Raf抑制劑、B-Raf抑制劑、CDK4/6抑制劑、CDK7抑制劑、吲哚胺2,3-雙加氧酶抑制劑、TGFβ抑制劑、TGFβ受體抑制劑、IL-10及聚乙二醇化IL-10 (例如派羅地金(pegilodecakin))。
在另一實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含與一或多種免疫腫瘤學藥劑同時、分別或依序組合投與有效量之本文所揭示之抗體的化合物。免疫腫瘤學藥劑之非限制性實例包括尼伏人單抗(nivolumab)、伊匹木單抗(ipilimumab)、匹利組單抗(pidilizumab)、匹博利組單抗(pembrolizumab)、曲美木單抗(tremelimumab)、烏瑞蘆單抗(urelumab)、利瑞人單抗(lirilumab)、阿替利組單抗(atezolizumab)、度伐人單抗(durvalumab)、抗Tim3抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L1抗體LY3300054 (其重鏈及輕鏈序列分別於WO 2017/034916及US 2017/0058033中闡述為SEQ ID NO: 10及11)。在另一較佳實施例中，免疫腫瘤學藥劑為抗PD-1抗體。在另一較佳實施例中，抗PD-1抗體為匹博利組單抗。
在另一實施例中，CD226抗體包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之HCVR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 8之LCVR。在另一實施例中，本發明提供一種能夠表現抗體之哺乳動物細胞；用於製備抗體之方法，其包含培養該哺乳動物細胞及回收抗體；藉由該方法製備之抗體；及包含該抗體及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。
在另一實施例中，CD226抗體包含：胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之HC及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之LC。在另一實施例中，本發明提供一種能夠表現抗體之哺乳動物細胞；用於製備抗體之方法，其包含培養該哺乳動物細胞及回收抗體；藉由該方法製備之抗體；及包含該抗體及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。
在另一實施例中，CD226抗體由以下各者組成：胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之兩條重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之兩條輕鏈。在另一實施例中，本發明亦提供一種能夠表現抗體之哺乳動物細胞；用於製備抗體之方法，其包含培養該哺乳動物細胞及回收抗體；藉由該方法製備之抗體；及包含該抗體及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。
本發明亦提供一種DNA分子，其包含具有以下之多核苷酸：SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 11及12；一種包含該DNA分子之哺乳動物細胞。
本發明亦提供一種治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之抗體。
本發明亦提供本發明之抗體，以用於療法。在一個實施例中，本發明亦規定用途為治療癌症。
本發明亦提供一種本發明之抗體，其用於製造用於治療癌症之藥物。
在一個實施例中，本發明亦規定癌症為實體腫瘤癌。在另一實施例中，實體腫瘤癌為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、軟組織肉瘤、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或泌尿道上皮癌。在一較佳實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，乳癌為三陰性乳癌。
在一個較佳實施例中，本發明提供一種抗人類CD226抗體，其結合至人類CD226且阻斷CD226與CD112結合，但不阻斷與CD155結合。
在另一較佳實施例中，本發明亦提供抗人類CD226抗體，其表現出促效劑功能，亦即在活體外暴露於抗人類CD226抗體之CD226+ T細胞中刺激T細胞活性，例如相對於不暴露於抗人類CD226抗體之CD226+ T細胞活體外的干擾素γ分泌水準，增加活體外的干擾素γ之分泌。在一個實施例中，可使用本文所揭示之方法分析干擾素γ之分泌。
在另一較佳實施例中，本發明亦提供抗人類CD226抗體，其表現出促效劑功能，亦即相對於活體外不暴露於抗人類CD226抗體之人類胎腎(HEK)細胞，例如如本文所揭示，在HEK細胞中誘導NF-KB活化報導基因，如本文所揭示。
在另一較佳實施例中，本發明提供不活化血小板之抗人類CD226抗體。在一個實施例中，使用流動式細胞測量術進行分析以測定血小板表面上之p選擇素(CD62P)之表現以確定血小板之活化狀態。
如本文所使用之術語「抗體」係指具有兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)以使得重鏈及輕鏈藉由二硫鍵互連之多肽複合物；其中該抗體係IgG子類抗體。各HC係由N端HCVR及重鏈恆定區(「HCCR」)構成。各LC係由N端LCVR及輕鏈恆定區(「LCCR」)構成。當在某些生物系統中表現時，具有天然人類Fc序列之抗體於Fc區中糖基化。通常，在抗體之Fc區中，在高度保守性N-糖基化位點發生糖基化。N-聚糖通常連接至天冬醯胺。抗體亦可在其他位置發生糖基化。
本發明之抗體為非天然存在之多肽複合物。本發明之DNA分子為包含非天然存在之多核苷酸序列的DNA分子，其編碼具有本發明抗體中之至少一種多肽的胺基酸序列之多肽。
HCVR及LCVR區可進一步再分成高變區(稱為互補決定區(「CDR」))，其間穿插有更保守的區(稱為構架區(「FR」))。每一HCVR及LCVR由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，HC之三個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」且LC之三個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。CDR含有大部分與抗原形成特異性相互作用的殘基。
經分離之編碼HCVR區之DNA可藉由將編碼HCVR之DNA可操作地連接至另一編碼HCCR之DNA分子來轉化成全長HC基因。人類以及其他哺乳動物HCCR基因之序列為此項技術中已知的。包含此等區之DNA片段可藉由例如標準PCR擴增來獲得。
經分離之編碼LCVR區之DNA可藉由將編碼LCVR之DNA可操作地連接至另一編碼LC恆定區之DNA分子來轉化成全長LC基因。人類以及其他哺乳動物LCCR基因之序列為此項技術中已知的。包含此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。LCCR可為κ或λ恆定區。較佳地，對於本發明之抗體，LCCR為κ恆定區。
在已將序列可操作地連接至表現控制序列之後，本發明之多核苷酸可在宿主細胞中表現。表現載體通常可作為游離基因體或宿主染色體DNA之組成部分在宿主生物體中複製。通常，表現載體將含有選擇標記(例如四環素、新黴素及二氫葉酸還原酶)以准許偵測用所需DNA序列轉型之彼等細胞。
本發明抗體可易於在哺乳動物細胞中製備，其非限制性實例包括CHO、NS0、HEK 293或COS細胞。可使用此項技術中熟知的技術培養宿主細胞。
含有所關注之多核苷酸序列(例如編碼抗體多肽之多核苷酸及表現控制序列)之載體可藉由熟知方法轉移至宿主細胞中，該等方法視細胞宿主類型而變化。
可採用不同的蛋白純化方法且此類方法為本領域中已知的且描述於例如Deutscher,Method in Enzymology 182: 83-89 (1990)及Scopes,Protein Purification: Principles and Practice , 第3版, Springer, NY (1994)中。
在本發明之其他實施例中，抗體(或其編碼核酸)係以分離形式提供。如本文所使用，術語「分離」係指不含或實質上不含發現於細胞環境中之任何其他大分子物質的蛋白質、肽或核酸。如本文所使用，「實質上不含」意謂所關注之蛋白質、肽或核酸佔所存在之大分子物種的超過80% (以莫耳濃度計)、較佳超過90%且更佳超過95%。
本發明之抗體或包含其之醫藥組合物可藉由非經腸途徑投與，其非限制性實例為皮下投與及靜脈內投與。本發明之抗體可利用醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑以單個或多個劑量單獨向患者投與。本發明之醫藥組合物可藉由此項技術中熟知之方法製備(例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 第22版(2012), A. Loyd等人, Pharmaceutical Press)，且包含如本文所揭示的抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
本申請案依據35 U.S.C. §119(e)主張分別於2018年7月26日及2019年1月23日申請之美國臨時申請案序列號62/703,522及62/795,744之權益；其揭示內容以引用之方式併入本文中。
如本文所使用，「CD226」係指具有SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列的受體；uniprot.org/uniprot/Q15762。CD226細胞外域-His標籤構築體之實例見於rndsystems.com，產品編號Q154762。
「CD226」之同義詞為DNAX輔助分子1、DNAM-1、DNAM1、PTA1及TLiSA1。
如本文所使用，「抗人類CD226促效劑抗體」係指如下抗體，該抗體(a)結合至人類CD226 (SEQ ID NO: 13)或其細胞外片段(例如SEQ ID NO: 14)，(b)在活體外刺激免疫反應，例如在如本文所揭示之T細胞介素(例如IFN-γ)釋放分析中所分析，或活體內刺激免疫反應，例如藉由T細胞介素(例如IFN-γ)在個體之血液及血清中之釋放所分析，及(c)當向個體活體內投與時，產生抗腫瘤活性。
在單株治療抗體之情形下，術語「人類」、「人類化」及「完全人類」為一般熟悉此項技術者所熟知的(Weiner LJ,J. Immunother. 2006 ; 29: 1-9；Mallbris L等人,J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2016 ; 9: 13-15)。
「CD155」之同義詞為脊髓灰白質炎病毒受體、PVR、Necl-5、NECL5、Tage4、HVED及PVS。
「CD112」之同義詞為Nectin細胞黏著分子2、nectin-2、NECTIN2、PRR-2、PVRL2、PVRR2及HVEB。
舉例而言，CD226路徑之免疫刺激作用可藉由與細胞表面上之LFA-1締合來介導，從而增強活化信號。LFA-1參與導致CD226R細胞質域之Fyn激酶介導之磷酸化(Marcus, A,Adv Immunol . 2014; 122: 91-128)。在另一實例中，CD226亦可介導對其增強NK細胞之細胞毒性及細胞介素產生能力至關重要的活性生物化學信號；此等信號係藉由保守性ITT或ITT樣基元(pYxNx)引起，該基元藉由Src家族激酶進行磷酸化且募集接附子Grb2。轉而，Grb2活化Vav-1、PI3'K及PLC-γ1，使得Erk、Akt及鈣通量活化。此類路徑促進肌動蛋白聚合及顆粒極化，從而增強細胞毒性。由於CD226表現於包括CD8+ T細胞之其他免疫細胞中，故推測CD226介導此等細胞中之類似信號及作用係合理的。(Zhang, Z,JEM , 2015; 212(12): 2165)。
活體外分析CD226活性之方法為一般熟悉此項技術者已知，例如在Gaud, G,等人,Sci. Signal. 2018 ; 11: eaar3083; doi: 10.1126/scisignal.aar3083中。
實體腫瘤之活體內鼠類模型為一般熟悉此項技術者所熟知，如本文所示，且如例如以下各者中所揭示：Sanmamed MF等人,Ann. Oncol. 2016 ; 27: 1190-1198；Manning HC等人,J. Nucl. Med 2016 ; 57(增刊1): 60S-68S；Teich BA. Cancer Ther. 2006 ; 5: 2435；Rongvaux A等人,Ann. Rev. Immunol. 2013 ; 31: 635-74；Stylli SS等人,J. Clin. Neurosci 2015 ; 619-26；Oh T等人,J. Transl. Med. 2014 ; 12: 107-117；Newcomb, EW等人,Radiation Res. 2010 ; 173: 426-432；Song Y等人,Proc Natl. Acad. Sci. USA 2013 ; 110: 17933-8；及Rutter EM等人,Scientific Reports 2017 ; 7: DOI:10.1038/s41598-017-02462-0。
如本文所使用，關於實體腫瘤，術語「抗癌活性」係指腫瘤尺寸之縮小；相對於未用抗CD226促效劑抗體治療之患者，在用抗CD226促效劑抗體治療之患者中，患者之癌症自一個階段至另一階段之進展減緩；或相對於未用抗CD226促效劑抗體治療之患者，用抗CD226促效劑抗體治療之患者的轉移癌發生率降低。
在臨床實體腫瘤癌治療之情形下，CD226路徑之免疫刺激作用的活化(促效)可藉由使用一般熟悉此項技術者所熟知之技術檢查腫瘤消退來評估，例如使用X射線成像、磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層攝影術、超音波成像、組織活體檢查、腫瘤活體檢查、手術獲取及視覺檢查、病理學分析、免疫組織化學、體液或組織生物標記分析，體檢及觸診中之一或多者。
可調整劑量方案以提供最佳所需反應(例如治療效果)。可滴定治療劑量以使安全性及功效最佳化。靜脈內(i.v. )或非靜脈內投與、局部或全身性投與或其組合之給藥時程將通常在單次藥團式給藥或連續輸注至每日多次投與(例如每4-6小時)的範圍內，或按治療醫師及患者之病狀所指示。給藥量及頻率將由治療患者之醫師確定。
術語「治療(treating/treat/treatment)」係指減緩、中斷、遏制、緩解、中止、減少或逆轉現有症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重程度。
「有效量」意謂研究者、醫生或其他臨床醫師正尋求之本發明抗體或包含本發明抗體之醫藥組合物的量，其將引發對組織、系統、動物、哺乳動物或人類之生物學或醫學反應或期望的治療效果。抗體之有效量可根據諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重以及抗體在個體中引發期望的反應之能力的因素而變化。有效量亦為治療上有益的作用超過抗體之任何毒性或有害作用之量。
有效量可易於由熟習此項技術者藉由使用已知技術且藉由觀測在類似情形下獲得之結果來確定。在確定用於患者之有效量時，主治診斷醫師考慮多個因素，包括(但不限於)：患者之體型、年齡及一般健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；疾病或病症之程度或受累程度或嚴重程度；個別患者之反應；所投與之特定化合物；投與模式；所投與之製劑之生物可用性特徵；所選擇之劑量方案；伴隨藥療之使用；及其他相關情況。
如本文所使用，術語患者之「有效反應」或患者對治療之「反應性」係指在投與本發明之抗體後賦予患者之臨床或治療益處。此類益處包括以下中之任一或多種：延長存活期(包括總存活期及無進展存活期)；產生目標反應(包括完全反應或部分反應)；穩定之疾病；或改善癌症之病徵或症狀等。
本文所揭示之方法之潛在優勢為在具有可接受安全概況(包括可接受耐受性、毒性及/或不良事件)之患者中可能產生顯著及/或延長的抗腫瘤活性，以使得患者總體受益於治療方法。本發明之治療之功效可藉由通常用於評估癌症治療之各種端點量測，該等端點包括(但不限於)腫瘤消退、腫瘤重量或尺寸縮小、進展時間、總存活期、無進展存活期、總體反應率、反應持續時間及生活品質。
如本文所使用，術語「實體腫瘤」係指非血液、淋巴管或骨髓之組織中之腫瘤。
如本文所使用，術語「完全反應(CR)」係指所有目標病灶消失。任何病理性淋巴結(無論目標或非目標)之短軸必須減小至＜10 mm。腫瘤標記物結果必須已標準化。
如本文所使用，術語「部分反應(PR)」意謂目標病灶之直徑總和至少減少30%，其採用基線總和直徑作為參考。
如本文所使用，術語「進行性疾病(PD)」意謂目標病灶之直徑總和至少增加20%，其採用研究之最小總和(包括最小的基線總和)作為參考。除20%之相對增加以外，總和亦必須展現至少5 mm之絕對增加。1或多個新病灶之出現亦視為進展。對於進展之模棱兩可的發現(例如，極小且不明確之新病灶；現有病灶中之囊性變化或壞死)，可繼續治療直至下一次計劃評估。若在下一次計劃評估時確認進展，則進展之日期應為懷疑進展時之更早日期。
如本文所使用，術語「無進展存活期(PFS)」定義為自任何研究藥物之首次劑量之日期直至放射照相記錄之PD或由任何原因引起死亡(以較早者為準)之日期為止的時間。
如本文所使用，術語「總存活期(OS)」定義為自任何研究藥物之研究首次劑量之日期至任何原因之死亡日期的時間。
如本文所使用，「抗體1」係指HCDR1胺基酸序列為SEQ ID NO: 1、HCDR2胺基酸序列為SEQ ID NO: 2、HCDR3胺基酸序列為SEQ ID NO: 3、LCDR1胺基酸序列為SEQ ID NO: 4、LCDR2胺基酸序列為SEQ ID NO: 5、LCDR3胺基酸序列為SEQ ID NO: 6、HCVR胺基酸序列為SEQ ID NO: 7、LCVR胺基酸序列為SEQ ID NO: 8、HC胺基酸序列為SEQ ID NO: 9、LC胺基酸序列為SEQ ID NO: 10、HC DNA序列為SEQ ID NO: 11及LC DNA序列為SEQ ID NO: 12之抗體。
本文示出序列之各抗體中之構架及CDR序列使用與North等人J. Mol. Biol. 2011 : 406: 228-256之方法一致的標註法則來標註。
本文所使用之序列標識符列於表1中。
Figure 108124450-A0304-0001
抗體表徵、產生、表現及純化 使用SEQ ID NO: 11中展示之HC多核苷酸序列及SEQ ID NO: 12中展示之LC多核苷酸序列在哺乳動物細胞中進行抗體製備，致使產生具有SEQ ID NO: 9中展示之HC胺基酸序列及SEQ ID NO: 10之LC胺基酸序列的全長抗體(下文稱為「抗體1」)。
本發明之抗體可藉由使用已知方法生成，該等方法包括(但不限於)噬菌體呈現。另外，如上文所描述衍生之抗體可使用本文所述之分析進一步篩選。
HC及LC之可變區之多肽及抗體1之完整HC及LC胺基酸序列及編碼其之核苷酸序列列於名為「胺基酸及核苷酸序列」之部分中。
人類CD226之序列闡述於SEQ ID NO: 13中，且人類CD226細胞外域(ECD)-Fc融合物之序列闡述於SEQ ID NO: 14中。
可例如基本上如下製備及純化本發明之抗體，包括(但不限於)抗體1。可採使用最佳預定HC:LC載體比率或編碼HC及LC兩者之單一載體系統分泌抗體之表現系統，短暫或穩定地轉染適當宿主細胞(例如HEK 293或CHO)。其中已分泌有抗體之澄清培養基可使用多種常用技術中之任一者純化。舉例而言，培養基可方便地施加至MabSelect管柱(GE Healthcare)或KappaSelect管柱(GE Healthcare)，該管柱已利用相容性緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4))平衡。可洗滌管柱以移除非特異性結合組分。可例如藉由pH梯度(諸如20 mM Tris緩衝液pH 7至10 mM檸檬酸鈉緩衝液pH 3.0，或磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.4至100 mM甘胺酸緩衝液pH 3.0)溶離結合之抗體。抗體溶離份可諸如藉由UV吸光度或SDS-PAGE偵測，且隨後可合併。視預期用途而定，進一步純化可視情況選用。可使用常見技術濃縮及/或無菌過濾抗體。可藉由常見技術(包括尺寸排阻、疏水性相互作用、離子交換、多峰或羥基磷灰石層析)有效移除可溶性聚集物及多聚物。產物可立即在-70℃下冷凍或可凍乾。
抗體 1 與人類 CD226 結合 可藉由ELISA量測本文所揭示之抗體結合人類CD226之能力。為量測與人類CD226之結合，在4℃下用人類CD226-Fc (R&D Systems) 塗佈96孔盤(Immulon 2HB)隔夜。用阻斷緩衝液(含有1%牛血清白蛋白之PBS)阻斷各孔2小時。用含有0.1% Tween-20之PBS洗滌各孔三次。隨後以不同濃度添加抗體1或對照IgG (100 µL)且在室溫下培育1小時。洗滌之後，在室溫下將盤與100 µL山羊抗人類IgG F(ab')2-HRP結合物(Jackson Immuno Research Laboratories)一起培育45分鐘。洗滌盤且隨後與100 µL 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺一起培育。在SpectraMax®微量培養盤讀取器上讀取450 nm下之吸光度。使用GraphPad Prism 7軟體計算半最大有效濃度(EC50)。
在基本上如上所述進行的實驗中，抗體1以0.1 nM之EC50與人類CD226結合。
抗體 1 與食蟹獼猴 CD226 結合 可使用流動式細胞量測分析量測本文所揭示之抗體與細胞表面食蟹獼猴CD226結合之能力。根據製造商之方案藉由使用Fugene-6試劑(Promega)將Cyno-CD226質體DNA轉染至人類HEK 293細胞(ATCC)中來產生表現食蟹獼猴CD226之穩定細胞。在含有10%胎牛血清及1% GlutaMAX™之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecoo's Modified Eagle's Medium)中使用0.5 µg/mL嘌呤黴素選擇穩定細胞。對於流動式細胞測量術，使用Gibco®細胞解離緩衝液(Life Technologies)分離匯合之黏附細胞，用完整培養基洗滌，隨後再懸浮於FACS緩衝液(含有2.5%胎牛血清+1 mM EDTA之磷酸鹽緩衝鹽水)中，且隨後以5×104 個細胞/孔之密度轉移至96孔V底盤中。在室溫下將細胞用抗體1或對照人類IgG1 (於FACS緩衝液中以100 µg/mL開始製備且用FACS緩衝液以1:3連續稀釋，總計7種濃度)染色30分鐘。
在FACS緩衝液中洗滌之後，以1:200稀釋度添加二級抗體別藻藍蛋白(APC)結合之山羊抗人類IgG, F(ab')2片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)且在室溫下培育細胞30分鐘。洗滌細胞且再懸浮於FACS緩衝液中。在BD LSRFortessa X-20細胞分析儀上在處理樣品之前立即向各樣品中添加7-胺基-放線菌素D (7-AAD)活力染色溶液(BD Biosciences)。使用FlowJo®軟體分析流動式細胞測量術資料。中值螢光強度(MFI)比率以(實驗抗體之MFI)/(對照IgG之MFI)計算。
在基本上如上文所述進行的實驗中，在0.14 µg/mL之濃度下的抗體1顯示2917.5 (11495/3.94)之較高MFI比率。
抗體 1 與細胞表面上之人類 CD226 結合 可使用流動式細胞量測分析量測本文所揭示之抗體與細胞表面之人類CD226結合的能力。根據製造商之方案藉由使用Fugene-6試劑(Promega)將人類CD226質體DNA轉染至人類HEK 293細胞(ATCC)中來產生表現人類CD226之穩定細胞。在含有10%胎牛血清及1% GlutaMAX™之達爾伯克改良伊格爾培養基中使用0.5 µg/mL嘌呤黴素選擇穩定細胞。對於流動式細胞測量術，使用Gibco®細胞解離緩衝液(Life Technologies)分離匯合之黏附細胞，用完整培養基洗滌，隨後再懸浮於FACS緩衝液(含有2.5%胎牛血清+1 mM EDTA之磷酸鹽緩衝鹽水)中，且隨後以5×104 個細胞/孔之密度轉移至96孔V底盤中。在室溫下將細胞用抗體1或對照人類IgG1 (於FACS緩衝液中以100 µg/mL開始製備且用FACS緩衝液以1:3連續稀釋，總計10種濃度)染色30分鐘。
在FACS緩衝液中洗滌之後，以1:200稀釋度添加二級抗體別藻藍蛋白(APC)結合之山羊抗人類IgG, F(ab')2片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)且在室溫下培育細胞30分鐘。洗滌細胞且再懸浮於FACS緩衝液中。在BD LSRFortessa X-20細胞分析儀上在處理樣品之前立即向各樣品中添加7-胺基-放線菌素D (7-AAD)活力染色溶液(BD Biosciences)。使用FlowJo®軟體分析流動式細胞測量術資料。中值螢光強度(MFI)比率以(實驗抗體之MFI)/(對照IgG之MFI)計算。
在基本上如上文所述進行的實驗中，在0.14 µg/mL之濃度下的抗體1顯示850.78 (7640/8.98)之較高MFI比率。
抗體 1 之動力學 / 親和力結果 Biacore T200儀器可用於量測固定之人類CD226-Fc結合至抗體1之動力學。重組型人類CD226-Fc融合蛋白(R&D Systems)經由胺偶合(GE Healthcare)共價固定至CM5感測器晶片。在HBS-EP+緩衝液中以100 µL/min之流動速率進行CD226抗體測試。在各種濃度下注入樣品且在25℃下獲得量測值。在每次樣品注入後，以10 µL/min之流動速率注入10 mM甘胺酸-HCl pH 2.1使表面再生30秒且隨後用緩衝液穩定10秒。使用Biacore T200軟體評估濃度在1.95 nM至1000 nM範圍內之感測器圖譜。由穩態擬合計算平衡解離常數(KD)或結合親和力常數。在基本上如上文所述進行的實驗中，抗體1以表2中所說明之親和力常數結合至人類CD226。 表2
Figure 108124450-A0304-0002
抗體 1 之 NF-κB 螢光素酶報導基因分析活性 可如下量測本文所揭示之抗體活化NF-κB的能力。在含有10%胎牛血清及1% GlutaMAX™之達爾伯克改良伊格爾培養基中根據製造商之方案使用Lipofectamine™ 2000試劑(Life Technologies)藉由質體DNA將NF-κB螢光素酶報導基因及pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]質體之雙重短暫轉染至HEK 293細胞中。在37℃下培養細胞隔夜且第二天將細胞分至96孔盤中。抗體1或對照人類IgG1在培養基10點3倍稀釋液中稀釋且以200 nM開始添加至培養盤中。隨後將細胞與抗體一起在37℃下在5% CO2 中培育18小時，且隨後使用ONE-Glo™螢光素酶分析系統(Promega™)處理。使用SpectraMax®微量培養盤讀取器量測發光。使用GraphPad Prism 7軟體計算半最大有效濃度(EC50)。
在基本上如上文所述進行的實驗中，抗體1以4.11 nM之EC50誘導人類CD226介導之NF-kB報導基因。
抗體 1 促進 T 細胞 衍生之干擾素 γ 產生 可如下量測本文所揭示之抗體促進T細胞衍生之干擾素γ (IFN-γ)產生之能力。藉由Ficoll密度梯度離心(Ficoll® Paque PLUS; GE Healthcare)自全血或白血球分離人類外周血液單核細胞(PBMC)。根據製造商之說明書使用CD8 T細胞分離套組(Miltenyi)自PBMC分離CD8 T細胞且以每毫升75萬個之濃度再懸浮於X Vivo-15培養基(Lonza)中。藉由在X Vivo-15培養基(Lonza)中以200 µg/mL稀釋來製備抗體1或對照人類IgG1。將抗人類CD3抗體純系Hit3A (BD Biosciences)及抗人類CD28抗體純系CD28.2 (BioLegend)分別以10 µg/mL及2 µg/mL之濃度添加至CD8 T細胞懸浮液中。將細胞以每孔100 µL接種在96孔u底盤中，隨後以相同體積接種抗體且在5% CO2 含濕氣培育箱中在37℃下培育96小時。收集上清液且使用R&D Systems®人類IFN-γ Quantikine® ELISA套組量測人類IFN-γ含量。簡言之，將樣品上清液及IFN-γ標準品稀釋於分析緩衝液中且添加至預塗佈有IFN-γ捕捉抗體之盤中且在室溫下培育2小時。洗滌之後，添加200 µL IFN-γ偵測抗體且在室溫下培育2小時。在洗滌之後，藉由添加200 µL受質溶液10分鐘，隨後添加50 µL停止溶液來使各盤顯影，且用SpectraMax®微量培養盤讀取器在450 nM下量測信號。使用SoftMax Pro軟體及GraphPad Prism (GraphPad Software)進行資料分析。
在基本上如上文所述進行的實驗中，如藉由IFN-γ細胞介素產生所量測，抗體1藉由CD3/CD28共刺激來增強人類PBMC之次佳活化。就此而言，用抗體1在100 µg/mL下處理使得IFN-γ產量相對於對照IgG處理呈1.6倍增加。
抗體 1 在已建立的腫瘤模型中之抗腫瘤功效 將HCC827人類非小細胞肺癌(ATCC)腫瘤細胞株維持在其相應培養基中且收集用於植入。將腫瘤細胞(每隻小鼠1×107 個細胞)皮下注射至7週齡雌性NOD/SCID Gamma (NSG)小鼠(Jackson Laboratories)之右側腹中。當腫瘤尺寸達到約250 mm3 至350 mm3 時，將小鼠隨機分為5至8組。人類擴增T細胞藉由用Dynabeads®人類T擴增器CD3/CD28珠粒(Thermo Fisher Scientific)刺激初始人類PBMC 9至10天而產生且進行儲備。人類PBMC (NY Blood Center)藉由在SepMate管(STEMCELL Technologies)中經Ficoll® Paque PLUS離心來製備且進行儲備。將擴增之T細胞解凍且將2.5×106 個細胞注入小鼠中。作為對照，在一些小鼠中僅植入腫瘤細胞而無T細胞。治療在第0天或第1天開始。治療組包括對照IgG及抗體1。動物經由腹膜內注射以10 mg/kg抗體給藥，每週一次，持續4週。一週記錄體重(BW)兩次且使用下式計算BW之變化%：(觀測日之BW-初始日之BW)/初始日之BW×100%。使用電子測徑規每週量測腫瘤體積兩次。使用下式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm3 )=π/6*長度*寬度2 。若幾何平均值之ΔT＞0，則使用式100×ΔT/ΔC計算%T/C。ΔT=藥物處理組在研究觀測日之平均腫瘤體積-藥物處理組在初始給藥日之平均腫瘤體積；ΔC=對照組在研究觀測日之平均腫瘤體積-對照組在初始給藥日之平均腫瘤體積。使用SAS軟體(版本9.2)中之MIXED程序藉由時間及處理之雙因子重複量測變異數分析進行腫瘤體積資料之統計分析。
在基本上如上文所描述進行的實驗中，用抗體1處理之小鼠展現顯著腫瘤生長抑制作用(T/C% =56.7；P ＜.01)。
胺基酸及核苷酸序列 SEQ ID NO: 1        (抗體1 HCDR1) AASGFTFSSYAMS SEQ ID NO: 2        (抗體1 HCDR2) AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 3        (抗體1 HCDR3) ARDRWELHDAFDI SEQ ID NO: 4        (抗體1 LCDR1) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 5        (抗體1 LCDR2) YRASTLQS SEQ ID NO: 6        (抗體1 LCDR3) QQSYSTPDT SEQ ID NO: 7        (抗體1 HCVR)
Figure 02_image001
SEQ ID NO: 8        (抗體1 LCVR)
Figure 02_image003
SEQ ID NO: 9        (抗體1 HC)
Figure 02_image005
SEQ ID NO: 10 (抗體1 LC)
Figure 02_image007
SEQ ID NO: 11 (抗體1 HC DNA)
Figure 02_image009
Figure 02_image011
SEQ ID NO: 12 (抗體1 LC DNA)
Figure 02_image013
SEQ ID NO: 13 (人類CD226)
Figure 02_image015
SEQ ID NO: 14              (人類CD226-細胞外域-Fc)
Figure 02_image017
Figure 02_image019
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014

Claims (20)

  1. 一種抗人類CD226抗體，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 1之HCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 2之HCDR2、胺基酸序列為SEQ ID NO: 3之HCDR3、胺基酸序列為SEQ ID NO: 4之LCDR1、胺基酸序列為SEQ ID NO: 5之LCDR2及胺基酸序列為SEQ ID NO: 6之LCDR3。
  2. 如請求項1之抗人類CD226抗體，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之HCVR及胺基酸序列為SEQ ID NO: 8之LCVR。
  3. 如請求項1之抗人類CD226抗體，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之HC及胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之LC。
  4. 如請求項1之抗人類CD226抗體，其由兩個胺基酸序列為SEQ ID NO: 9之HC及兩個胺基酸序列為SEQ ID NO: 10之LC組成。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗人類CD226抗體，其中該抗體為促效劑抗體。
  6. 一種哺乳動物細胞，其能夠表現如請求項1至5中任一項之抗人類CD226抗體。
  7. 一種用於製備抗人類CD226抗體之方法，其包含培養如請求項6之哺乳動物細胞及回收該抗體。
  8. 一種抗人類CD226抗體，其係藉由如請求項7之方法製備。
  9. 一種DNA分子，其包含序列為SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 11及12之多核苷酸。
  10. 一種哺乳動物細胞，其包含如請求項9之DNA分子。
  11. 一種用於製備抗人類CD226抗體之方法，其包含培養如請求項10之哺乳動物細胞及回收該抗體。
  12. 一種抗人類CD226抗體，其係藉由如請求項11之方法製備。
  13. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5、8及12中任一項之抗人類CD226抗體及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  14. 一種如請求項1至5、8及12中任一項之抗人類CD226抗體之用途，其用於製造用以治療實體腫瘤癌之藥物，其中該實體腫瘤癌為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、軟組織肉瘤、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或泌尿道上皮癌。
  15. 一種抗人類CD226促效劑抗體。
  16. 一種哺乳動物細胞，其能夠表現如請求項15之抗人類CD226抗體。
  17. 一種用於製備抗人類CD226抗體之方法，其包含：培養能夠表現如請求項15之抗體的哺乳動物細胞及回收該抗體。
  18. 一種如請求項15之抗人類CD226促效劑抗體之用途，其用於製造治療癌症之藥物。
  19. 如請求項18之用途，其中該癌症為實體腫瘤癌。
  20. 如請求項19之用途，其中該實體腫瘤癌為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、軟組織肉瘤、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或泌尿道上皮癌。
TW108124450A 2018-07-26 2019-07-11 Cd226促效劑抗體 TWI728400B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862703522P 2018-07-26 2018-07-26
US62/703,522 2018-07-26
US201962795744P 2019-01-23 2019-01-23
US62/795,744 2019-01-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202017943A true TW202017943A (zh) 2020-05-16
TWI728400B TWI728400B (zh) 2021-05-21

Family

ID=67515192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108124450A TWI728400B (zh) 2018-07-26 2019-07-11 Cd226促效劑抗體

Country Status (12)

Country Link
US (1) US11440959B2 (zh)
EP (1) EP3827018A1 (zh)
JP (1) JP7144595B2 (zh)
KR (1) KR20210025071A (zh)
CN (1) CN112513086A (zh)
AU (1) AU2019309786A1 (zh)
BR (1) BR112020027087A2 (zh)
CA (1) CA3107773A1 (zh)
IL (1) IL280367A (zh)
MX (1) MX2021000797A (zh)
TW (1) TWI728400B (zh)
WO (1) WO2020023312A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020368369A1 (en) 2019-10-15 2022-05-12 Eli Lilly And Company Recombinantly engineered, lipase/esterase-deficient mammalian cell lines
CN111363042B (zh) * 2020-03-30 2022-02-11 中国人民解放军第四军医大学 一种高特异性抗小鼠cd226单克隆抗体及其应用
EP4363450A1 (en) 2021-07-01 2024-05-08 Compugen Ltd. Anti-tigit and anti-pvrig in monotherapy and combination treatments
GB202301945D0 (en) 2023-02-10 2023-03-29 Mount Natalie Novel immunoconjugates

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013193995A (ja) 2012-03-21 2013-09-30 Tokyo Medical & Dental Univ 特発性炎症性筋疾患の予防又は治療剤
CN102994449A (zh) 2012-12-13 2013-03-27 上海柯莱逊生物技术有限公司 一种体外扩增nk细胞的方法
CN103520705B (zh) * 2013-09-22 2015-05-27 中国科学技术大学 Cd226胞外段蛋白抑制肿瘤细胞增殖的用途
WO2015095392A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
AR105654A1 (es) 2015-08-24 2017-10-25 Lilly Co Eli Anticuerpos pd-l1 (ligando 1 de muerte celular programada)
US11059888B2 (en) * 2016-04-20 2021-07-13 University Of Tsukuba Regulatory T cell activator and use thereof
US20190175755A1 (en) * 2016-08-23 2019-06-13 The Johns Hopkins University Immunoswitch nanoparticles for reprogrammed t cell responses
CN110662552A (zh) 2016-11-30 2020-01-07 昂科梅德制药有限公司 包含tigit结合剂的癌症治疗方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019309786A1 (en) 2021-02-18
CN112513086A (zh) 2021-03-16
BR112020027087A2 (pt) 2021-03-30
US11440959B2 (en) 2022-09-13
JP7144595B2 (ja) 2022-09-29
IL280367A (en) 2021-03-01
CA3107773A1 (en) 2020-01-30
EP3827018A1 (en) 2021-06-02
KR20210025071A (ko) 2021-03-08
MX2021000797A (es) 2021-04-12
WO2020023312A1 (en) 2020-01-30
TWI728400B (zh) 2021-05-21
JP2021531766A (ja) 2021-11-25
US20210363241A1 (en) 2021-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12083112B2 (en) Combination of a PD-1 antagonist and a VEGFR/FGFR/RET tyrosine kinase inhibitor for treating cancer
US11274160B2 (en) Antibodies having specificity to Nectin-4 and uses thereof
JP6518005B2 (ja) Ｐｄ−ｌ１抗体
CN105451770B (zh) 使用PD-1拮抗剂和dinaciclib的组合治疗癌症
EP4043492A1 (en) Antibodies specific to human poliovirus receptor (pvr)
TWI728400B (zh) Cd226促效劑抗體
JP7241207B2 (ja) Ｔｉｇｉｔおよびｐｄ－１／ｔｉｇｉｔ結合分子
KR20170004006A (ko) 암을 치료하기 위한 항-ｃｃｒ4 항체 및 4-1ｂｂ 효능제의 조합
KR20080099290A (ko) 암 치료용 ｉｌ-17 길항 항체
JP2016534090A (ja) Ｃｄ３８アゴニストの医学的使用
WO2021139682A1 (en) Anti-galectin-9 antibody and uses thereof
JP2023502023A (ja) Ｃｄ２００受容体アンタゴニスト結合分子
WO2022121846A1 (zh) Pd-l1抗体及其应用
US20230040928A1 (en) Antibodies having specificity to her4 and uses thereof
WO2020081783A2 (en) Anti-ox40, anti-pd-l1 and anti-ctla-4 antibodies for treating tumors

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees