KR20030092015A - 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을위한 발현 기술 - Google Patents
하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을위한 발현 기술 Download PDFInfo
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Abstract
항체 융합 단백질의 효율적인 발현을 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 본 발명의 항체 융합 단백질은 하나 이상의 형태의 항체 유래의 서열 및/또는 돌연변이 항체의 서열을 포함하는 하이브리드 항체 부분구조를 포함한다. 본 발명의 하이브리드 항체 융합 단백질은 고수준으로 생산될 수 있고, 비-항체 부분구조의 기능 특성과 함께 상이한 항체 형태의 특징적인 기능 특성을 조합시킬 수 있다.
Description
유전학적으로 가공된 세포로부터의 단백질 발현의 효율성은 중요한 상업적 관심 분야이다. 일부 상업적으로 중요한 단백질은, 정확한 폴딩 (folding) 및 글리코실화를 보장하기 위해 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포, 식물 세포 또는 효모 세포로부터 가장 적절하게 만들어지고 있다. 그러나, 진핵 세포의 거대한 배양물을 유지하기 위한 비용은 이러한 방식으로 제조된 단백질을 값비싸게 한다는것을 의미한다. 따라서, 당업계에서는 진핵 세포로부터 단백질의 발현 수준을 최대화하는 요구가 있다.
관련된 쟁점은 진핵 세포로부터 생산된 치료 단백질은 정확한 형상 상태로 발현되어야만 한다는 것이다. 보통, 전사 및 번역 메커니즘은, 유전학적으로 가공된 세포가 단백질을 코딩하는 핵산에 의해 서열이 결정되는 단백질을 생산할 것이라고 보장한다. 그러나, 전사 및 번역 후, 단백질은 적절한 폴딩에 실패하여 분해될 수 있다. 다르게는, 단백질은 응집된 상태로 생산되어 활성이 감소될 수 있다. 응집된 단백질이 활성이더라도, 비(非)응집 단백질과 비교하여 증가된 면역원성으로 인해 약리학적으로 수용가능하지 않을 수 있다. 따라서, 약리적으로 수용가능한 단백질 제제는 일반적으로 응집 단백질이 실질적으로 없어야만 한다.
유전학적으로 가공된 진핵 세포로부터 발현된 단백질의 양은, 코딩하는 유전자의 전사 속도, mRNA 스플라이싱의 효율성과 핵으로부터의 이송, 번역의 효율성과 함수관계를 갖는다. 이러한 사건들이 단백질 발현에 있어 수행하는 역할은 충분히 자명하게 알려져 있으며, 유전공학 및 단백질 발현 분야의 당업자는 일반적으로 효율적인 전사, 스플라이싱, mRNA 전송 및 번역을 갖는 고안된 발현 구축물로 적절한 핵산 서열을 통합시킬 수 있다.
그러나, 진핵 세포로부터 생산된 정확하게 폴딩된 비응집 단백질의 양은 또한, 전사, 스플라이싱, mRNA 이송, 번역, 번역후 변형을 결정하는 핵산서열 뿐만 아니라 단백질의 핵산 서열과도 함수관계를 갖는다. 예를 들어, 세포내에서 합성된 상당한 비율의 단백질이 분해되는 것으로 여겨진다. 분해될지에 대한 여부를 결정하는 단백질의 특징은 현재 집중적인 연구가 수행되고 있지만, 현재 단백질 폴딩, 분해 또는 응집의 효율성을 간단한 단백질의 서열 검사에 의해 예측하는 것은 가능하지 않다. 일부 천연 생성 단백질은 효율적으로 폴딩되고, 단백분해에 저항성을 가지며, 응집되지 않는다. 반대로, 다른 단백질은 비효율적으로 폴딩되고, 빠르게 분해되며, 응집된다.
본원의 항체 융합 단백질 또는 Ig 융합 단백질로 불려지는 항체의 부분을 포함하는 항체 및 인공 단백질은 항체 가변 도메인의 표적 능력 및 각종 다른 단백질에 결합하는 보존 영역의 능력에 관련된 각종 목적에 유용하다. 항체 및 항체 융합 단백질 제제는, 이들이 정확하게 폴딩되어 응집되지 않을 경우 특히 유용하다. 따라서, 당업계에서는 감소된 응집을 갖는 항체 및 항체 융합 단백질 제제의 제조를 위한 방법 및 조성물에 대한 요구가 존재한다.
또한, 항체 및 항체 융합 단백질은, 각종 다른 단백질에 결합할 수 있는 이들의 능력이 예를 들어 특정 작동체 기능을 유인할 수 있기 때문에 유용하다. 일부 예들에서, 특정 작동체 기능이 요구될 수 있지만, 작동체 기능의 소실이 종종 바람직할 수 있다. 융합 단백질의 항체 성분은 변형된 항체를 이용하여 작동체 기능을 감소시키거나 제거하기 위해 변형될 수 있다. 또한, 항체 및 항체 융합 단백질 제제는 이들의 기능성을 변경시키기 위해 변형할 경우 유용하다. 따라서, 당업계에서는 변경된 작동체 기능을 갖는 변형된 항체 및 항체 융합 단백질의 제조를 위한 방법 및 조성물에 대한 요구가 존재한다.
단백질 약물은 프로테아제에 의해서 분해되어, 이들의 전달 및 약동학적 특성을 준최적화(suboptimal)시킬 수 있다. 일부 단백질의 유용한 특성을 갖지만 더욱 개선된 프로테아제 저항성을 갖는 단백질 약물의 개선에 대한 요구가 존재한다.
관련 출원
본 출원은 2001년 3월 7일자로 출원된 U.S.S.N. 60/274,096 에 대한 우선권적 이득을 청구하고, 이의 개시물을 참고문헌으로 본원에 전체적으로 통합한다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 둘 이상의 이소타입으로부터 유도된 부분구조를 갖는 항체에 대한 방법과 조성물, 및 그로부터 유도된 융합 단백질에 관한 것이며, 상기 항체는 작동체 기능이 변형되고, 단백질 발현이 증가되고/거나 올리고머화가 감소된 항체 부분구조를 함유하는 단백질을 포함한다.
발명의 개요
본 발명은, 임의적으로 변형되거나 조합되거나 감소된 Fc 작동체 기능과 함께, 목적 융합 단백질의 발현, 적당한 올리고머화, 정제 및 프로테아제 저항성을 강화시킨 온전한 항체, 면역사이토카인, 면역푸신(immunofusin), 면역리간드 및 기타 항체와 Fc 융합 단백질의 제조를 위한 방법 및 조성물을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명은, 온전한 항체 및 항체 부분구조를 함유하는 융합 단백질로 사용하기 위해, 임의적으로 돌연변이 Ig 성분을 사용하는, 하이브리드 이소타입을 갖는 항체 부분구조를 제공한다.
IgG/IgG 하이브리드 이소타입
바람직한 구현예의 하나의 세트에 의하면, 본 발명은 감소된 작동체 기능 및 개선된 조립성을 갖는 융합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은, 특히 Ig 부분구조가 발현 강화 및 혈청 반감기의 개선을 위해 제공되지만 Ig 부분구조의 면역학적 기능이 요구되지 않을 경우, 특히 유용하다.
이러한 구현예에 있어서, 융합 단백질은 바람직하게는 IgG1 유래의 경첩 영역 (hinge region) 또는 IgG4 유래의 경첩 영역과 조합된 IgG2 또는 IgG4 의 CH1,CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하며, 후자의 경첩 영역은 중쇄에서 유도된 부분구조 사이의 디술피드 결합의 정확한 형성을 강화하기 위한 돌연변이 (Angal S, 등. Mol Immunol 1993 Jan; 30(1): 105-8)를 편향적으로 포함한다. 이 구현예의 융합 단백질은 고수준의 발현을 용이하게 하고, Fc 영역을 함유하는 온전한 항체 및 Ig 융합 단백질의 정확한 조립성을 개선한다.
더욱 바람직한 구현예에 의하면, 본 융합 단백질은 또한 Ig 부분구조에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, Ig 부분구조는 목적하지 않는 임의의 잔존 작동체 기능을 더욱 감소시키기 위해 변이된다. 예를 들어, IgG2 의 CH2 도메인 중의 C1q 결합 부위가 변이된다. 예를 들어 정상적인 IgG4 는 IgG1 (Eu 명명법) 중의 331 위치에서 대응 프롤린 대신에 세린을 포함하기 때문에 보체와 결합하지 않는다 (Tao, MA 등 (1993) J. Exp. Med. 178: 661-667; Brekke, OH 등 (1994) Eur. J. Immunol. 24: 2542-2547); IgG22 중의 유사한 돌연변이는 C1q 결합을 감소시킨다. C1q 결합에 관련된 것으로 알려진 다른 잔기, 예컨대 위치 318, 320, 322 및 297 의 잔기 (Duncan AR (1998) Nature: 332: 738-740) 가 변형되어 , C1q 결합의 감소를 초래할 수 있다.
바람직한 구현예의 또 다른 세트에 의하면, 경첩 영역의 돌연변이가 또한 존재한다. 예를 들면, 항체 경쇄가 또한 존재하는 경우, 정상적인 위치에 정상적인 수의 시스테인 잔기를 갖는 IgG1 경첩 영역의 형태가 바람직하다. 그러나, 항체 경쇄가 뚜렷한 폴리펩티드 사슬로서 존재하지 않는 경우, 첫번째 시스테인이 다른 잔기로 변이된 IgG1 경첩이 바람직하다. 예를 들면, 경쇄 가변영역이 폴리펩티드 연결기에 의해서 중쇄에 부착된 상기 Fc-X 단백질, X-Fc 단백질, 및 단일쇄 항체에서 상기 변이된 경첩 영역을 사용하는 것이 유용하다. IgG1 경첩의 첫번째 시스테인은 본원과 관련하여서는 바람직하게는 세린으로 변이된다.
돌연변이 경첩 영역에 관련된 두번째 계열의 구현예에 의하면, 두 개의 중쇄 사이에 효율적인 디술피드 결합이 가능한 IgG4 경첩의 돌연변이 형태를 사용한다.
돌연변이 경첩 영역에 관련된 세번째 계열의 구현예에 의하면, 처음 두 개의 시스테인이 각각 다른 아미노산으로 변이된 IgG2 경첩의 돌연변이 형태가 하이브리드 이소타입 항체 또는 Ig 융합 단백질로 사용된다. 또한, IgG2 로부터 전체적으로 유도된 항체 또는 Ig 융합 단백질에서 상기 돌연변이 경첩을 사용하는 것이 적당하다. 예를 들어, 서열 ERKSSVECPPCP (서열번호 1) 을 갖는 변형 IgG2 경첩이 항체 또는 Ig 융합 단백질과 관련하여 사용된다. 또 다른 유용한 형태의 경첩은 IgG2 경첩 및 IgG4 경첩 사이의 하이브리드이다 [예컨대, 서열 ESKYG-VECPPCP (서열번호 2) ( - 앞의 5 개의 아미노산은 IgG4 로부터 유도되고, 나머지 아미노산은 IgG2 유래이다]. 이러한 구현예는, 이들 경첩 구현예가 단백질을 정확한 조립을 촉진하기 때문에, 진핵 세포로부터 발현되어 분비되는 항체 및 Ig 융합 단백질과 관련하여 특히 유용하다. 이러한 구현예는 IgG1 경첩에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 항체 경첩에 대한 상기 구현예의 중요 특성은 이들이 단지 두 개의 시스테인 잔기를 가진다는 것이다.
또 다른 계열의 구현예는 Ig 및 비(非)-Ig 부분구조 사이의 접합부(juction)에서 하이브리드 이소타입 Ig 융합 단백질의 Ig 부분구조의 돌연변이를 포함한다.하나의 구현예에 의하면, 융합 단백질의 아미노산 서열의 변경은 Ig 부분구조 및 비-Ig 부분구조의 접합부에 편향적으로 존재하고, 바람직하게는 접합 지점의 10 개의 아미노산내에 존재한다. 더욱 바람직하게는, 아미노산 변화는 항체 부분구조의 C-말단 리신을 소수성 아미노산, 예컨대 알라닌 또는 루신으로 변화시키는 것을 포함한다.
다른 구현예는 융합 단백질의 반감기를 단축시키는 것을 요구하는 환경에서 유용하다. IgG3 는 CH3 도메인에 위치된 FcRn/FcRp 결합 부위의 변형 (H435 에서 R) (Ward, ES. 및 Gheti, V [1995] Therapeutic Immunology 3: 77-94 참조) 으로 인해 다른 IgG 이소타입과 비교하여 단축된 반감기를 갖는다. IgG3 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 융합 단백질은 단축된 기간의 노출이 요구되는 경우에 사용될 수 있다. 이런 구현예에 따르면, IgG1 경첩과 조합된 IgG3 CH3 도메인을 사용하는 것이 유용하고; 이러한 IgG1(경첩)-IgG3(CH3) 융합 단백질은 IgG3 경첩 및 IgG3 CH3 도메인을 함유하는 Ig 융합 단백질과 비교하여 우수한 발현 및 조립 특성을 갖는다.
단축된 혈청 반감기, 감소된 작동체 기능 및 효율적인 조립성을 갖도록 고안된 Ig 융합 단백질의 더욱 바람직한 구현예에 의하면, 경첩 영역이 IgG1 으로부터 유도되고 CH2 도메인이 IgG2 로부터 유도되며 CH3 도메인이 IgG3 로부터 유도된 하이브리드 Ig 영역이 사용된다.
IgG/IgA 하이브리드 이소타입
본 발명의 다른 구현예는 강화된 프로테아제 저항성 및 강화된 혈청 반감기를 갖는 하이브리드 이소타입 Ig 융합 단백질을 제공한다. 이 구현예는, 예를 들어 Ig 융합 단백질 약물의 경구 전달 동안에, Ig 융합 단백질이 프로테아제가 많은 환경, 예컨대 위장 또는 다른 점막 조직에 노출되는 상황에서 특히 유용하다. 이 구현예에 따르면, IgG 및 IgA 보존 영역의 요소를 함유하는 Ig 융합 단백질이 제공된다. 바람직한 구현예에 의하면, IgA1 의 경첩 및 IgG 의 CH2 와 CH3 도메인이 사용된다. 다른 바람직한 구현예에 의하면, IgA 의 Fc 영역 중의 O-연결된 글리코실화 부위를 코딩하는 아미노산의 분획이 IgG 의 Fc 영역으로 접합된다.
IgG/IgM 하이브리드 이소타입
본 발명의 또 다른 구현예는 IgA 또는 IgM 의 올리고머화 특징을 갖지만 IgG 의 작동체 기능 특성을 갖는 하이브리드 이소타입 항체 및 Ig 융합 단백질을 제공한다. 예를 들어, IgM 의 CH3 및 CH4 도메인에 융합된 IgG1 또는 IgG3 의 경첩 영역 및 CH2 도메인을 포함하는 단백질이 제공된다. 더욱 바람직한 구현예에 의하면, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 IgM의 CH3 및 CH4 도메인에 융하된 IgG 경첩 및 CH2 영역을 포함하는 항체가 제공된다. 또 다른 더욱 바람직한 구현예에 의하면, X-Fc 형태의 Ig 융합 단백질 [식중, X 는 바람직하게는 세포 표면 수용체에 대한 리간드이고, Fc 부분구조는 IgM 의 CH3 및 CH4 도메인을 포함한다]이 제공된다. 상기 분자는 IgM 의 높은 분자가를 갖는 IgG 의 ADCC 작동체 기능을 결합한다.
IgM 또는 IgA 의 CH4 도메인을 사용하는 하이브리드 이소타입의 바람직한 구현예에 의하면, CH4 도메인의 C-말단 시스테인은 J 사슬과의 디술피드 결합을 차단하기 위해 변이된다. 이는 Ig 융합 단백질의 위장으로의 분비를 감소시킨다.
바람직한 비-Ig 부분구조
본 발명의 융합 단백질에 있어서 비-Ig 부분구조의 바람직한 형태는 Ig 융합 단백질의 부분이 아닌 경우에 일반적으로 세포외인 단백질 또는 부분구조이다. 예를 들어, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 분비 효소 또는 경막(trans-membrane) 수용체의 세포외 부분.
바라미한 구현예에 의하면, 비(非)-면연글로불린 성분은 항-비만 단백질과 같은 단백질이다. 예를 들어, 비-면역그로불린 성분은 렙틴, CNTF, CLC/CLF-1 또는 Acrp30 의 부분이다.
또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 비-면역글로불린 성분은 에리트로포이에틴 또는 EPO 와 같은 단백질이다.
다른 구현예에 의하면, 융합 단백질의 비-면역글로불린 성분은 호르몬이다. 예를 들어, 비-면역글로불린 성분은 인슐린, 성장 호르몬 또는 글루카곤형 펩티드 1 (GLP-1)일 수 있다.
다른 구현예에 의하면, 융합 단백질의 비-면역글로불린 성분은 사이토카인이다. 용어 "사이토카인"은 이 사토카인에 대한 수용체를 갖는 세포에서 특정 반응을 유인하는 천연 생성 또는 재조합 단백질, 이의 유사체 및 이의 절편을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 바람직하게는, 사이토카인은 세포에 의해 생성되어 분비될 수 있는 단백질이다. 바람직하게는, 사이토카인은, 인터루킨-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 및 IL-18 과 같은 인터루킨, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), G-CSF 및 에리트로포이에틴과 같은 조혈 인자, TNFα 와 같은 종양괴사인자 (TNF), 리포톡신과 같은 림포카인, 렙팁과 같은 물질대사 처리의 조절제, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ 와 같은 인터페론, 및 케모카인을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 Ig-사이토카인 융합 단백질은 사이토카인의 생물학적 활성을 나타낸다.
다른 바람직한 구현예에 의하면, 융합 단백질의 비-면역글로불린 성분은 생물학적 활성을 갖는 리간드 결합 단백질이다. 상기 리간드 결합 단백질은, 예를 들어 (1) 세포 표면에서의 수용체-리간드 상호작용을 차단하거나; 또는 (2) 혈액의 유동상 (fluid phase)에서 분자 (에컨대, 사이토카인)의 생물학적 활성을 중화시켜, 상기 분자가 그의 세포 표적에 도달하는 것을 방지할 수 있다. 바람직한 리간드 결합 단백질은 CD4, CTLA-4, TNF 수용체, 또는 IL-1 및 IL-4 수용체와 같은 인터루킨 수용체를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체-수용체 융합 단백질이 리간드 결합 단백질의 생물학적 활성을 나타낸다. 하나의 매우 바람직한 구현예는, TNFR-경첩-CH2-CH3 또는 경첩-CH2-CH3-TNFR 의 형식 [여기에서, CH2 및 CH3 도메인은 IgG2 또는 IgG4 로부터 유도되고, 이합체 Fc 중의 두 개의 경첩 영역 각각은 3 개 이하, 더욱 바람직하게는 2 개 이하의 시스테인을 갖는다]으로 단백질 약물 엔브렐 (Enbrel) 중에 사용되는 세포외 TNF-수용체 도메인 절편을 포함한다.
또 다른 형태의 바람직한 리간드 결합 단백질은 단백질 보다 작은 분자에 결합할 수 있는 능력을 갖는다. 예를 들어, 아비딘 (avidin) 을 하이브리드 이소타입 Ig 부분구조, 예컨대 항체에 융합시키는 것이 적당하다. 이어서, 하이브리드 이소타입 항체-아비딘 융합물은 마우스 또는 인간과 같은 포유동물에게 투여되고, 항체의 V 영역의 특이성에 의해 결정하였을 때, 신체의 표적 조직에 집중된다. 항체-아비딘 융합 단백질을 신체로부터 충분히 제거한 후, 바이오틴 (biotin) 및 치료 분자의 콘쥬게이트를 투여한다. 상기 바이오틴 콘쥬게이트는 아비틴과의 결합으로 인해 표적 조직에서 농축되어, 비-표적 조직에서의 치료 분자의 농축으로 인해 발생할 수 있는 부작용의 감소를 초래한다. 이런 전략은 다른 리간드/리간드-결합 단백질 쌍과 함께 사용될 수 있다.
또 다른 형태의 바람직한 비-면역글로불린 부분구조는 효소이다. 예를 들어, 뚜렷한 특이성을 갖는 효소는 하이브리드 이소타입 Ig 부분구조, 예컨대 항체에 융합시킬 수 있다. 이어서, 하이브리드 이소타입 항체-효소 융합물을 마우스 또는 인간과 같은 포유동물에게 투여되고, 항체의 V 영역의 특이성에 의해 결정하였을 때, 신체의 표적 부위에 집중된다. 본 발명의 하나의 바람직한 치료 방법에 의하면, 항체-효소 융합 단백질을 신체로부터 충분히 제거한 후, 효소에 의해 활성 형태로 절단될 수 있는 프로드럭이 투여된다. 활성화 약물은 표적 조직에서 농축되어, 비-표적 조직에서의 활성화 약물의 농축으로 인해 발생할 수 있는 부작용의 감소를 초래한다. 이 구현예의 매우 바람직한 형태에 의하면, 활성화 약물은 항암 약물, 예컨대 세포독성 작용제이다. 다른 매우 바람직한 구현예에 의하면, 효소 자체가 치료 활성을 갖는다. 예를 들어, RNase, 예컨대온코나아제 (Onconase) 는 하이브리드 이소타입 항체 융합 단백질에 커플링시켜, 항체 V 영역을 통해 종양을 표적한다.
핵산
본 발명은 또한 하이브리드 이소타입을 갖는 Ig 융합 단백질 및 온전한 항체의 발현 및 분비를 용이하게하는 신규한 핵산 서열, 및 상기 핵산의 구축 방법을 제공한다.
항체 단백질을 코딩하는 게놈 서열의 특히 중요한 특징은, 가변 영역, CH1, 경첩, CH2, CH3 및 CH4 영역이 분리된 엑손에 의해 코딩된다는 것이다. 이런 특징은 '엑손 셔플링 (exon huffling)' (Zuckier 등, Cancer Research [1998] 58: 3905-8; Poon 등, J. Biol. Chem. [1995] 270: 8571-7; Jefferis R, 등, Mol. Immunol. [1990] 27: 1237-40; Chappel MS, Proc Natl Acad Sci U.S.A. [1991] 88: 9036-40; Senior BW 등, Infect Immun. [2000] 68: 463-9) 에 의해 하이브리드 이소타입 Ig 융합 단백질의 가공을 용이하게 한다.
Fc 융합 단백질의 경우, 핵산 분자는 각종 배치로 단백질을 코딩할 수 있다. 바람직한 세트의 구현예에 의하면, 핵산 분자는, 5' 에서 3' 방향으로 순차적으로, (i) 시그널 서열, 면역글로불린 Fc 영역 및 표적 단백질 서열, 또는 (ii) 시그널 서열, 표적 단백질 및 면역글로불린 Fc 영역, 또는 (iii) 시그널 서열, 제 1 표적 단백질, 면역글로불린 Fc 영역 및 제 2 표적 단백질을 코딩한다. 따라서, 초래된 핵산 서열 분자는 Fc-X, X-Fc 또는 X-Fc-Y 구조 [식중, X 및 Y 는 표적 단백질 또는 단백질이다] 를 코딩한다. 예를 들어, X 및 Y 는 그 자체가 융합 단백질일 수 있다. 연결기가 이들 부분구조 사이에 임의적으로 코딩된다.
유사하게, 본 발명에 따르면, 전체 항체 Ig 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 각각의 중쇄 부분구조 및 각각의 경쇄 부분구조의 N-말단에서 시그널 서열을 코딩하도록 고안된다.
본 발명의 핵산 서열은 복제가능한 발현 벡터로 기능적으로 관련하여 통합시킬 수 있고, 이는 이어서 융합 단백질의 제조에 적합한 진핵 숙주 세포로 도입될 수 있다. 생성된 Ig 융합 단백질은 효율적으로 생성되어 진핵 숙주 세포로부터 분비된다. 분비된 Ig 융합 단백질은 진핵 숙주 세포의 용해 없이 배양 배지로부터 수집될 수 있다. 단백질 생성물에 대해 활성을 검사하고/거나 소망하는 바에 따라 통상의 시약을 사용하여 정제하고/거나 융합 파트너로부터 절단하며, 이들 모두는 통상적인 기술을 사용한다. 다르게는, 본 발명의 핵산은 박테리아 세포로 도입될 수 있고, 생성된 Ig 융합 단백질은 표준 기술에 따라 정제된다.
본 발명은 또한 세포에서 생성된 항체 및 Ig 융합 단백질의 수준을 강화하는 방법을 제공한다. 이 방법은 바람직하게는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 제조에 적용된다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 출발 항체 또는 Ig 융합 단백질의 제조는, 다른 항체 이소타입 유래의 도메인을 코딩하는 대응 서열 또는 돌연변이 서열로 Ig 부분구조의 도메인을 코딩하는 핵산서열을 교체하고, 본원에 기재된 변경 단백질의 생산을 검사하는 것에 의해 발현 수준을 비교하면서 가장 높은 수준을 제공하는 특정한 발현 구축물을 선택하여 개선할 수 있다. 상기 공정은 반복하여 사용할 수 있다. 이는 경첩 영역의 교체에 특히 유용하다.
치료
본 발명은 또한 변형된 항체 및 Ig 융합 단백질을 사용하는 치료 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 효율적이고 저렴한 가공법 및 면역원성이 낮은 단백질을 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명, 도면 및 청구범위로부터 더욱 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1A 내지 D 는 본 발명의 일정 양태에 따른 융합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 IgG 하이브리드 이소타입의 모식도로; 굵은선은 시스테인 잔기를 연결하는 디술피드 결합을 나타내고; 항체 도메인은 도 A 에 표시하고; IgG1 도메인은 검은색으로 나타내며; IgG2 도메인은 백색으로 나타내고; 가변 및 경쇄 도메인은 줄무늬로 나타낸다.
도 1A 는 IgG1 이소타입을 나타낸다.
도 1B 는 IgG2 이소타입을 나타낸다.
도 1C 는 첫번째 시스테인의 돌연변이를 갖는 IgG2 및 IgG1 경첩을 가진 이소타입 하이브리드를 나타낸다.
도 1D 는 IgG 하이브리드 γ1(CH1-H) γ(CH2-CH3) 를 나타낸다.
도 2A 내지 C 는 하이브리드 이소타입을 함유하는 Fc 영역을 포함하는 Ig 융합 단백질의 모식도로; "X" 및 "Y" 는 임의의 비-Ig 부분구조일 수 있다.
도 2A 는 하나의 항체 이소타입 유래의 경첩 및 제 2 의 이소타입 유래의 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어진 Fc 부분구조를 포함하는 Fc-X 배치의 Ig 융합 단백질을 나타내며; Fc 부분구조의 C-말단에는 단백질 부분구조 "X" 가 존재한다.
도 2B 는 하나의 항체 이소타입 유래의 경첩 및 제 2 의 이소타입 유래의 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어진 Fc 부분구조를 포함하는 X-Fc 배치의 Ig 융합 단백질을 나타내며; Fc 부분구조의 N-말단에는 단백질 부분구조 "X" 가 존재한다.
도 2C 는 하나의 항체 이소타입 유래의 경첩 및 제 2 의 이소타입 유래의 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어진 Fc 부분구조를 포함하는 X-Fc-Y 배치의 Ig 융합 단백질을 나타내며; Fc 부분구조의 N-말단에는 임의의 단백질일 수 있는 "X" 가 있고, Fc 부분구조의 C-말단에는 단백질 부분구조 "Y" 가 존재한다.
도 3A 내지 D 는 가변 영역을 포함하고 하이브리드 이소타입을 함유하는 Ig 융합 단백질의 모식도이고; "X" 및 "Y" 는 임의의 비-Ig 부분구조일 수 있다.
도 3A 는 하나의 항체 이소타입 유래의 경첩 (검은색), 및 상이한 이소타입 유래의 CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Ig 융합 단백질을 나타내고; 비-Ig 단백질 "X" 는 중쇄의 C-말단에 융합된다.
도 3B 는 하나의 항체 이소타입 유래의 경첩 (검은색), 및 상이한 이소타입 유래의 CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Ig 융합 단백질을 나타내고; 비-Ig 단백질 "X" 는 중쇄의 C-말단에 융합되며; 화살표는 본원에 기재된 항체 부분구조 중의 돌연변이 가능한 부위의 서브세트를 나타낸다.
도 3C 는 하나의 항체 이소타입 유래의 경첩 및 CH1 영역 (검은색), 및 상이한 이소타입 유래의 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Ig 융합 단백질을 나타내고; 비-Ig 단백질 "X" 는 중쇄의 C-말단에 융합되며; 경첩으로부터 나오는 분지형 구조는 글리코실화 부분구조를 나타낸다.
도 3D 는 하나의 항체 이소타입 유래의 경첩 (검은색), 및 상이한 이소타입 유래의 CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Ig 융합 단백질을 나타내고; 비-Ig 단백질 "X" 는 중쇄의 C-말단에 융합되며; 제 2 의 비-Ig 단백질 "Y" 는 경쇄의 N-말단에 융합된다.
도 3E 는 하나의 항체 이소타입 유래의 경첩 (검은색), 및 상이한 이소타입 유래의 CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Ig 융합 단백질을 나타내고; 비-Ig 단백질 "X" 는 중쇄의 C-말단에 융합되며; 제 2 의 Ig 비-Ig 단백질 "Y" 는 중쇄의 N-말단에 융합된다.
도 4 는 가변 영역을 포함하고, 복수의 이소타입을 포함하며, IgG 와 비교하여 증가된 분자가를 갖는 Ig 융합 단백질의 모식도이고; 검은색의 타원은 IgM 유래의 CH3 및 CH4 도메인을 나타내며; 백색 타원은 IgG 유래의 CH1, 경첩 및 CH2 도메인을 나타내고; 줄무늬 타원은 가변 도메인 및 경쇄 보존 도메인을 나타내며; 굵은선은 IgG1 에서 정상적으로 발견되는 디술피드 결합을 나타내고; 's' 로 표지된 얇은 선은 IgM 에서 정상적으로 발견되는 디술피드 결합을 나타낸다.
정의
본 발명에 따르면, 이소타입은 항체의 기능 활성을 결정하는 면역글로불린의 중쇄 보존 (C) 영역의 계열을 의미한다. IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE 를 포함하는 5 가지 주요 계열이 존재한다.
IgA 는 α중쇄를 특징으로 하는 면역글로불린의 계열을 의미한다.
IgD 는 δ중쇄를 특징으로 하는 면역글로불린의 계열을 의미한다.
IgE 는 ε중쇄를 특징으로 하는 면역글로불린의 계열을 의미한다.
IgM 는 μ중쇄를 특징으로 하는 면역글로불린의 계열을 의미한다.
IgG 는 γ중쇄를 특징으로 하는 면역글로불린의 계열을 의미한다.
"감마1" 또는 "γ1" 은 IgG1 으로부터 유래된 중쇄 또는 이의 부분에 관한 것이다. 유사하게, "감마2" 또는 "γ2" 는 IgG2 로부터 유도되고, 그외에도 그러하다.
본 발명에 따르면, 알로타입은 면역글로불린의 동일 중쇄 C 유전자의 대립유전자 다형성을 의미한다. 이러한 결정기(determinant)들은 전부는 아니지만 일부 종류의 군에서 발견된다.
본 발명에 따르면, 이디오타입(idiotype)은 항체의 가변 (V) 영역 상에서 발견되고, 특정한 재배열 VH및 VL유전자에 기인한 항원 결정기를 의미한다.
본 발명에 따르면, FcRp 로도 알려진 FcRn 은 IgG 의 제거를 조절하고 항체의 생체내 순환 반감기에 중요한 베타-2 마이크로글로불린 함유 신생아 장 수송 수용체를 의미한다.
본 발명에 따르면, FcγR 은 FcγRI, RII 및 RIII 를 포함하며, IgG 분자의 Fc 부분에 결합하여 작동체 세포 기능을 유인하는 세포 표면 수용체를 의미한다.FcγR 은 식세포 (phagocyte), B 림프구, NK 세포 및 수상돌기 세포 상에서 발현된다.
본 발명에 따르면, "IgG1" 또는 "IgG2" 또는 다른 Ig 분자는 중쇄 및 경쇄 또는 이의 부분을 포함하는 전체 항체를 의미한다.
본 발명에 따르면, "2가 단량체" 는 정상적인 항체를 형성하는 디술피드 결합의 형성에 의해 일반적으로 이합체화되는 항체, Fc 융합물, 또는 항체 융합물을 의미한다. 상기 디술피드 결합의 형성은, 환원 조건하에서 보여지는 명백한 분자량에 약 두 배인 명백한 분자량을 갖는 단일 밴드로서의 변성 비환원 SDS 겔 상에서의 이동에 대한 Fc 함유 단백질의 능력에 의해 일반적으로 추론된다. 2가 단량체의 존재는 또한 정확한 분자량에 대응시키는 크기 절단(size exclusion) 크로마토그래피에서의 피크의 존재에 의해 또한 추론된다. 다른 단백질 크기 측정법은 또한 2가 단량체의 존재를 동정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, "Ig 융합 단백질" 은, 바람직하게는 비-항체 또는 비-면역글로불린 (비-Ig) 단백질의 전부 또는 부분인 제 2 의 부분구조에 연결된 항체의 전부 또는 부분을 함유하는 융합 단백질을 의미한다. 면역사이토카인, Fc-X 단백질, X-Fc 단백질 및 X-Fc-Y 단백질은 모두 Ig 융합 단백질의 예이다. 유사하게, 비-Ig 부분구조가 두 개의 Ig 부분구조 또는 도메인 사이에 위치된 융합 단백질은 Ig 융합 단백질의 한 형태를 구성한다.
본 발명에 따르면, 단백질의 "조립(assembly)" 은 정확한 다합체 상태로의 단백질의 적당한 폴딩 및 올리고머화를 의미한다. 조립은 당업계에 확립된 수많은 방식으로 모니터링될 수 있다. 실제로, 디술피드 결합에 대한 단백질의 정확한 조립은 비환원 및 환원 SDS 겔 상에서의 이동을 비교함으로써 적당하게 모니터링될 수 있다: 소정의 단백질 종류가 비환원 겔 상에서 다중 밴드를 형성하지만, 환원 SDS 겔 상에서 단일 밴드를 형성한다면, 비환원 SDS 겔 상에서 기껏해야 하나의 밴드만이 정확하게 조립된 종이라는 것을 추론할 수 있다. 다르게는, 형성될 수 있는 고차원의 올리고머 유래의 단위 단백질 및 응집체를 정확하지 않은 디술피드 결합 또는 비-공유 상호작용으로부터 구별하기 위해서 크기 절단 크로마토그래피가 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 항체 부분구조의 "도메인"은 인간의 항체 유전자 중의 개별적인 엑손에 의해 코딩된 아미노산 분획에 대응하는 구조 도메인을 의미한다. 예를 들어, IgG 의 보존 도메인에는 CH1, 경첩, CH2 및 CH3 도메인이 있다. 일부 경우에, 경첩 및 CH2 도메인은 동일한 엑손에 의해 코딩된다. 상기한 경우에, 경첩 및 CH2 도메인의 접합부는 다른 경첩/CH2 접합부와의 배열에 의해 정의된다 (Paul, op cit., p. 46-49 참조).
본 발명에 따르면, 도메인, 단백질, 영역 또는 분자는 전체 도메인, 단백질, 영역 또는 부분, 또는 이의 부분, 돌연변이 또는 가공된 형태, 또는 이로부터 주로 유도되는 형태를 의미한다. 부분, 돌연변이 또는 가공된 형태는 바람직하게는 전체 도메인, 단백질, 영역 또는 분자의 특징적인 기능 특성을 갖는다. 본 발명에 따르면, "주로 유도되는" 은 천연 생성 단백질 또는 도메인의 특정 서열로부터 유도된 아미노산 중 95% 이상을 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, 인간 IgG2CH2 도메인으로부터 주로 유도되는 서열은 아미노산 배열에서 인간 IgG2 CH2 도메인과 95% 이상이 동일하다.
본 발명에 따르면, "변형된 IgG1 경첩" 은 시스테인, 바람직하게는 첫번째 시스테인이 다른 아미노산으로 변이된 IgG1 유래의 경첩 영역을 의미한다. 상기 시스테인은 일반적으로 항체 경쇄와 디술피드 결합을 형성한다. 변형된 IgG1 경첩은 경쇄가 결여되거나 경쇄에 결합할 수 있는 다른 시스테인을 갖고 있는 단백질에 특히 유용하다.
본 발명에 따르면, "에리트로포이에틴 분자" 는 임의적으로 돌연변이를 포함하는 척추동물의 에리트로포이에틴과 일반적으로 동일한 구조 및 유사한 아미노산 서열을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들어, 실시예 18 은 돌연변이가 없는 인간 에리트로포이에틴 및 4 개의 돌연변이를 갖는 형태의 인간 에리트로포이에틴의 사용을 설명한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 면역글로불린 융합 단백질의 생체내 및 실험관내 제조를 개선하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 면역글로불린 융합 단백질의 발현, 응집 및/또는 폴딩 특성을 개선하기 위한 유용한 방법을 제공한다. 본 발명은, 야생형 면역글로불린 대신에 하이브리드 면역글로불린이 융합 파트너로서 사용되는 경우에, 면역글로불린 융합 단백질이 고수준으로 발현되면서도, 응집 및/또는 폴딩 문제점이 거의 없다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초한다. IgG1 및 IgG2 와 같은 야생형 면역글로불린은 생체내 및 실험관내에서 효율적으로 발현되는 잘 폴딩된 단백질이라고 여겨지기 때문에, 하이브리드 면역글로불린에 관련된 개선된 융합 단백질 제조 특성은 예상치 못한 것이다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태는 하이브리드 면역글로불린 (또는 하이브리드 Ig) 부분구조를 포함하는 면역글로불린 융합 단백질의 발현에 유용한 방법 및 조성물을 포함한다. 바람직한 하이브리드 면역글로불린은 IgG1 경첩 및 IgG2 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 다른 바람직한 하이브리드는 IgG1 및 IgG4 도메인을 포함한다.
항체 구조
항체는 Y 모양의 분자로, 두 개의 중쇄 (H) 및 두 개의 경쇄 (L) 로 구성된다. 각각의 중쇄는 디술피드 결합에 의해 경쇄에 연결되고, 서로에 대한 두 쇄의 적당한 정위(定位)를 위해 공유 및 비공유 상호작용에 의존한다. 상기 두 쇄의 아미노 말단의 가변 도메인은 항원 결합 부위를 함유하고, CH1 도메인과 함께, 분자의 Fab 말단을 정의한다.
4 개의 쇄는, 복합체를 안정화시키기 위해, 중쇄 사이의 소수성 결합, 및 하나 이상의 사슬간 디술피드 결합을 사용한다. 이를테면, 완전한 면역글로불린은 두개의 동일한 항원 결합 부위를 갖는 2 가 (bivalent)이다. 일정한 면역글로불린, 예컨대 IgM 및 IgA 는 일반적으로 추가적인 다합체화를 수행한다.
각각의 폴리펩티드 쇄는 2 내지 5 개의 도메인을 갖고; 경쇄는 2 개의 도메인을 함유하는 반면, 중쇄는 4 개 또는 5 개를 함유한다. 각각의 쇄의 단일 아미노 말단 도메인은 확장된 서열 변이성으로 인해 가변 영역으로 불리는 반면, 몇몇 카르복시-말단 도메인은 보존 영역으로 불려진다. 중쇄 영역은 CH1, 경첩, CH2, CH3, CH4 로 나누어지고, Fc 수용체 (FcR) 결합 및 보체 고착 (complement fixation) 을 포함하는 수많은 중요한 항체 기능에 관여한다.
중쇄 C 영역에는 IgA, IgG, IgD, IgE, IgM 으로 분류되는 5 가지 주요한 이소타입 계열이 존재하며, 각각은 특징적인 작동체 기능을 갖는다 (IgG 는 4 가지의 γ 이소타입 서브클래스로 분리된다: γ1, γ2, γ3, γ4). 경쇄의 보존 영역은 단지 하나의 C 도메인을 갖고, 두가지 계열 (Cκ및 Cλ)중 하나일 수 있으며, 이들은 뚜렷한 기능적 기여에 대해 알려진 바가 없다 (W.E. Paul, ed., 1993, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, N.Y. 참조).
모든 면역글로불린은 분자의 Fab 및 Fc 영역을 분리하는 중쇄의 C 말단에서 CH1 도메인까지 위치된 경첩 영역을 갖는다. 대부분의 경우에, 경첩 영역은 분자의 항원 결합 (Fab 말단) 및 작동체-상호작용 (Fc) 성분 사이에 높은 정도의 유연성 (flexibility)을 허용하여, 항체의 두 가지의 중요 기능 요소를 연결한다. IgG 이소타입에 있어서, 사슬간 디술피드 결합은 전형적으로 상기 경첩 영역내에서 형성되어, 최종적으로 4합체 분자를 생성한다.
IgM 을 제외하고는, 경첩 영역은 프롤린, 세린 및 트레오닌, 2차 구조의 형성을 억제하는 경향이 있고 경첩 유연성을 제공하는 것으로 여겨지는 아미노산이 우세하다. 융합 단백질용으로 종종 사용되는 IgG1 이소타입은 중쇄를 서로 연결하는 경첩 영역내에 두 개의 디술피드 결합을 갖는다. 반대로, IgG2 이소타입은 4 개의 디술피드 결합을 갖는다 (도 1). 본 발명에 따르면, 상기 디술피드 결합은, 실시예에서 예상치못한 발견에서 보는 바와 같이, 항체와 Ig 융합 단백질의 부정확한 조립을 촉진하는 경향이 있다.
Ig 융합 단백질의 유용한 배치
면역사이토카인은 본 발명의 방법 및 조성물이 유용한 종양 표적 융합 단백질 치료의 단지 하나의 예이다. 다른 종양독성 분자가 본 발명에 따른 종양 특이적 항체와의 융합에 의해 종양을 또한 표적할 수 있다. 또한, 다른 형태의 질환 세포, 예컨대 바이러스 감염 세포를 본 발명에 따른 항체 융합 단백질로 공격할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 Fc-X 및 X-Fc 기술의 사용과 조합하는 경우 또한 유용하다. 본 발명에 따르면, 융합 단백질내 하이브리드 항체 이소타입의 사용은 면역글로불린의 Fc 부분에 연결된 목적 표적 단백질 또는 폴리펩티드의 생산 및 수집을 더욱 개선한다. Fc-X 융합 단백질의 경우, 면역글로불린 유전자의 Fc 절편이 뒤어지는 시그널 펩티드는 표적 단백질에 대한 N-말단 융합 파트너이다. 이어서, 상기 융합 단백질은 숙주 세포, 예컨대 면역글로불린을 천연적으로 발현하는 세포와 같은 포유동물 세포에서 발현된다. N-말단 융합 파트너 중의 시그널 펩티드-Fc 절편은, 융합 단백질이 용이하게 분비되도록 분비 경로를 통해 표적 단백질을 표적한다. 또한, 일반적으로 글리코실화되고 중성 pH 에서 높게 대전되는 Fc 절편의 사용은 더욱 소수성인 단백질의 용해를 용이하게 한다. 분비성 경로를 통한 Fc-X 융합 단백질의 표적화는 또한 세포 내에서의 단백질 독성에 관련된 문제를 경감시키고, 안정한 세포주의 단리를 용이하게 한다. 융합단백질 생성물은, 생물학적 및 효소학적 활성이 유지되는 본래의 형상으로 배양 배지로부터 용이하게 수집되면서, 쉽게 분석되고 정제된다. 상기 기술의 효율성은 Fc-렙틴 및 Fc-에리트로포이에틴을 이용하여 보여졌다. 상기 이점의 일부는 또한 X-Fc 단백질에 고유하다.
본 발명에 따르면, 항체 부분구조의 유용한 융합물의 예는 Fc-X, X-Fc 및 X-Fc-Y 단백질을 포함한다. 상기 단백질은 N-말단, C-말단 또는 N-말단과 C-말단 모두에 융합된 비-항체 단백질 또는 단백질 절편을 갖는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역에 대한 융합물의 하나의 유리한 효과는 융합 파트너의 혈청 반감기가 현저하게 연장된다는 것이다. 두번째 유리한 효과는 'X' 가 Fc 로의 부착에 의해 효과적으로 이합체화될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 엔브렐 (Enbrel) 은 TNF 수용체의 부분과 인간 IgG1 Fc 영역으로 이루어진 융합 단백질이다.
본 발명의 일부 구현예에 의하면, X-Fc 배향으로 하이브리드 이소타입을 갖는 융합 단백질을 가공하는 것이 특히 이롭다. 이러한 구축물과 함께, 표적 단백질은 N-말단 융합 단백질이고, Fc 절편이 뒤따른다. 일부 단백질의 경우에, 이런 접근법이 유용할 수 있다 (예컨대 림프구 세포 표면 글리코프로테인 (LHR) (US 특허 5,428,130 참조)).
본 발명에 따르면, 재조합 항체계 융합 단백질의 실용성은, 단백질 또는 사이토카인 단독 치료법 보다 좋기는 할지라도, 항체 융합 단백질이 유리 항체 보다 현저하게 낮은 생체내 순환 반감기를 갖기 때문에, 순환으로부터의 빠른 생체내 제거에 의해 제한될 수 있다. 감소된 순환 반감기는 Fc 수용체 (FcR)을 통해 증가된 제거를 초래할 것 같다. 이소타입의 교체는 반감기와 같은 특성이 변경될 수 있도록 하는 하나의 메커니즘인 것으로 증명되었다. 두 가지 사이토카인의 반감기의 개선이 IgGγ1 또는 IgGγ3 로부터 감소된 FcR 결합을 갖는 이소타입인 IgGγ4 로 인간 중쇄 C 영역의 이소타입을 변형시키는 것에 의해 보여졌다 (Cancer Research 59(9): 2159-66, 1999). IgG4 계의 면역사이토카인 및 융합 단백질은 10 배 감소된 FcR 결합 및 감소된 Fc 수용체 작동체 기능, 예컨대 ADCC 를 갖지만, 본래의 IgGγ1 계의 융합 단백질의 것보다 마우스 종양 모델에서 유사하거나 우수한 효험성을 나타낸다. 그러나, 본 발명은 단일 분자 내의 상이한 항체 형태의 기능 특성과 구조적 특성을 결합시킨 하이브리드 항체에 기초한 융합 단백질을 제공한다.
따라서, 일부 적용의 경우에, IgG2 이소타입은 상당히 감소된 Fc 수용체 결합성을 갖기 때문에, 항체 융합 단백질에 대한 우수한 속성을 부여한다 (Hulett 등 [1994] adv. Immunol. 57: 1127). 전체 항체 융합 단백질에 있어서, Fc 영역만을 함유하는 융합 단백질 중의 γ2 이소타입을 사용하는 것이 종종 이롭다. 그 근거는 전체 항체에 대한 것과 동일하고; 다른 이소타입으로부터 유도된 Fc 영역에 의해 매개되는 Fc 수용체와의 결합을 피하는 것이 종종 요구될 수 있다.
그러나, 융합 단백질 중의 IgG2 이소타입의 사용은 일반적으로, 본원에 기재한 바와 같이, 어느 수준의 부적합한 조립을 유도한다. 본 발명의 방법 및 조성물은, IgG2 이소타입의 최소화된 작동체 기능을 갖지만 상기 이소타입의 응집 특성을 갖지 않는 항체 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에 따르면, 신규한 하이브리드 이소타입 항체 및 융합 단백질은, IgG2 계의 융합 단백질 보다 강화된 발현 및 개선된 조립성을 나타낸다. 또한, 하이브리드 이소타입 항체 및 융합 단백질은 Fc 수용체 작동체 기능이 요구되지 않는 치료법에서 증가된 효험성을 가질 수 있다.
경첩의 형태
본 발명의 하이브리드 이소타입 항체는 또한 경첩 영역이 돌연변이 경첩 영역, 바람직하게는 감소된 수의 시스테인 잔기를 갖는 경첩 영역, 예컨대 첫번째 시스테인이 세린으로 변이된 변형된 IgG1 경첩 영역인 항체를 포함한다. IgG1 경첩 영역의 첫번째 시스테인은 일반적으로 경쇄에 결합한다. Fc-X 단백질 또는 X-Fc 단백질 또는 경쇄가 결핍된 임의의 다른 항체 융합 단백질에 있어서, 상기 시스테인은 자연적 기능을 제공하지 않아, 따라서 변이될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 경쇄는 일반적으로 IgG2 CH1 도메인 내의 시스테인과 디술피드 결합을 형성할 수 있기 때문에, 첫번째 시스테인이 없는 IgG1 경첩을 갖는 하이브리드 이소타입 항체와 IgG2 CH1 도메인은 경쇄와 회합할 수 있다. IgG2 경첩내의 4 가지의 시스테인은 서로 디술피드 결합을 형성하는 것으로 여겨진다.
본 발명에 따르면, 중쇄-중쇄 동종이합체화 (homodimerization)에 관련된 항체 또는 Ig 융합 단백질의 경첩 영역 중의 시스테인은 항체 또는 Ig 융합 단백질의 발현 및 조립에 대해 상당한 효과를 가질 수 있다. 특히, 많은 수의 시스테인은, 부정확한 디술피드 결합 형성으로 인해, 항체 또는 Ig 융합 단백질의 부정확한 조립을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 중쇄 동종이합체화에 연관된 하나이상의 시스테인의 돌연변이가 항체 또는 Ig 융합 단백질의 발현 또는 조립의 개선을 유도할 수 있음을 개시한다. 바람직한 구현예에 의하면, 중쇄 동종이합체화 시스테인은 일반적으로 바람직한 순서로 세린, 알라닌, 트레오닌, 프롤린, 글루탐산, 글루타민, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파트산, 글리신, 메티오닌, 발린, 이소루신, 루신, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 또는 셀레노시스테인으로 변이될 수 있다.
첫번째 가장 N-말단의 시스테인을 변이시킨 IgG1 경첩을 사용하는 것이 특히 적당하다. 상기 경첩 영역의 이점은 두 개의 시스테인만을 갖는다는 것이다. IgG1 경첩 중의 첫번째 시스테인은 일반적으로 경쇄 중에 시스테인을 갖는 디술피드 결합을 형성한다. 그러나, 경쇄가 경여된 Ig 융합 단백질, 예컨대 Fc-X, X-Fc 및 X-Fc-Y 단백질에서, IgG1 경첩 중의 가장 N-말단의 시스테인은 이러한 목적을 제공하지 않으므로, 따라서 변이될 수 있다 (Lo 등, Protein Engineering 11: 405-500 [1998]). 실시예에 기재된 바에 따르면, 두 개의 시스테인 IgG1 경첩은, IgG2 CH1 도메인이 경쇄와 함께 디술피드 결합을 형성할 수 있는 시스테인을 갖기 때문에, CH1 도메인이 IgG2 로부터 유도된 온전한 항체 또는 온전한 항체 융합 단백질에서 또한 사용될 수 있다.
Fc 수용체
IgG 분자는 IgG 계열의 항체에 특이적인 세 가지 계열의 Fcγ 수용체 (FcγR), 즉 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 를 포함하는 복수 계열의 세포 수용체와 상호작용한다. 이들 수용체는 항원-항체 복합체의 수용 (uptake) 때문이다.Fc 상의 Fc 수용체 결합 부위는 경첩 부근의 CH2 도메인 상에서 발견되고, V 영역과 항체의 결합은 입체적으로 차단하는 경첩으로부터 경쇄 보존 영역의 대체를 돕는 것으로 여겨진다. 이런 방식으로, 항원에 결합된 항체는 Fc 수용체에 의해 편향적으로 결합된다.
'보호 수용체' (FcRp) 또는 '신생아 수용체' (FcRn) 으로 또한 불려지는 4 번째 수용체는, 항원-항체 복합체의 세포내분열(endocytosis) 및 이들의 엔도좀에서의 탈응집 후에 엔도좀으로부터 항체를 재순환시키는데 관련되어 있다. FcRp 에 대한 결합 부위는 3 차원적 항체 구조 중의 CH2 및 CH3 도메인 사이의 접합부에서 발견된다. IgG 항체의 혈청 반감기는 기능성 FcRp 와의 생산적 상호작용에 의존한다. 다른 항체 형태, 예컨대 IgM, IgD, IgE 및 IgA 는 FcRp 에 결합하지 않는다.
일부 항체의 또 다른 결합 파트너는 보체 고착을 매개하는 C1q 이다.
Fc 수용체 및 FcRp 와의 상호작용은 또한 Fc 부분구조를 함유하는 융합 단백질의 생물학적 활성 및 대사작용에 영향을 미친다.
예를 들어, FcR 에 대해 불량한 결합성을 갖는 융합 단백질은 FcR 에 대해 양호한 결합성을 갖는 대응 융합 단백질 보다 긴 혈청 반감기를 갖는다. FcRp 에 대해 불량한 결합성을 갖는 융합 단백질은 FcRp 에 대해 양호한 결합성을 갖는 대응 융합 단백질 보다 단축된 혈청 반감기를 갖는다.
예를 들어, IgG2 의 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 Ig 융합 단백질은 IgG1 을 함유하는 융합 단백질 보다 긴 혈청 반감기를 갖는다. 유사하게, IgG3 로부터 유도된 Fc 영역을 함유하는 융합 단백질은 IgG1 또는 IgG2 를 함유하는 대응 융합 단백질 보다 단축된 혈청 반감기를 갖는다. IgM, IgD, IgE 및 IgA 로부터 유도된 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 융합 단백질은 대응 IgG 유도 융합 단백질 보다 훨씬 단축된 혈청 반감기를 갖는다.
본 발명의 용도를 예시하기 위하여, 항체 및 Ig 융합 단백질을 두 개의 일반적인 계열로 그룹화하는 것이 적당하다: 면역학적 작동체 기능이 목적되는 단백질, 및 Ig 부분구조가 면역학적으로 불활성인 담체로서 제공되고 작동체 기능이 결여된 단백질. 전자의 단백질 부류에서는, 작동체 기능의 특정 성좌가 생성되는 하이브리드 이소타입을 갖는 단백질을 구축하는 것이 적당하다. 후자의 부류에서는, 최소한의 작동체 기능을 갖는 일정한 이소타입의 영역 및 하술하는 단백질의 조립을 강화하는 다른 이소타입 유래의 영역을 포함하는 하이브리드 이소타입을 갖는 단백질을 구축하는 것이 적당하다.
항체 및 Ig 융합 단백질의 조립
본 발명은 항체 또는 Ig 융합 단백질의 경첩이 포유동물 세포로부터 분비된 Ig 융합 단백질과 같은 융합 단백질의 적절한 조립과 응집성의 결여에 중요한 역할을 수행한다는 발견을 개시한다. 예를 들어, 이론에 의해 한정되기를 희망하지는 않지만, 항체 및 Ig 융합 단백질 조립은 두 개의 중쇄가 우선 비공유적으로 CH3 도메인내의 소수성 패치(patch)에 의해 회합되는 단계를 포함하는 것으로 여겨진다. 상기 회합 후에, 경첩 영역이 배열되고, 사슬간 디술피드 결합이 형성된다. 경첩 영역은 CH3 도메인 중의 소수성 패치로부터 약 50 Å 거리이다.
항체 또는 Ig 융합 단백질 구축물을 고안함에 있어서, 경첩 영역을 변화시키는 것이 유용하다. 예를 들어, 소정의 발현 구축물 중의 경첩 영역을 코딩하는 DNA 를 상이한 경첩영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE 또는 IgY 유래의 경첩 영역을 코딩하는 DNA 로 교체하는 것이 유용하다.
본 발명의 이론에 따르면, 예를 들어 상당한 수의 시스테인을 갖는 경첩 영역을 함유하는 항체 및 Ig 융합 단백질은 소수의 시스테인을 갖는 대응 단백질 만큼 효과적으로 조립되지 않는다. 이론에 한정되는 것을 바라지는 않지만, 많은 수의 시스테인을 갖는 경첩 영역은 시스테인의 부정확한 배열 및 부정확한 디술피드 결합 형성에 대한 상당한 가능성을 나타낸다. 결과적으로, 많은 수의 시스테인을 함유하는 경첩 영역을 갖는 항체 및 Ig 융합 단백질은 훨씬 높게 응집되고, 적은 수의 시스테인을 함유하는 경첩 영역을 갖는 대응 항체 및 Ig 융합 단백질과 비교하여 다수의 전기영동 종류를 나타낸다는 것이 발견되었다. 이런 현상의 예시는 실시예에 나타낸다.
예를 들어, 4 개의 시스테인을 함유하는 경첩 영역을 포함하는 항체 및 Ig 융합 단백질은 3 개 또는 2 개의 시스테인을 함유하는 항체 및 Ig 융합 단백질 보다 덜 효율적으로 조립된다. 예를 들어, IgG2 유래의 경첩 영역을 함유하는 단백질은 IgG1 유래의 경첩 영역을 함유하는 대응 단백질 보다 덜 효율적으로 조립된다. 다른 실시예에 의하면, IgG3 유래의 경첩 영역을 함유하는 단백질은 불량하게 조립되며, IgG3 경첩 영역은 11 개의 시스테인을 함유한다.
본 발명의 실용성은 Fc 수용체 I 에의 최소한의 결합이 요구되는 상황에서특히 보여진다. 예를 들어, 융합 단백질과 관련하여, FcR 에의 결합이 상당히 감소되기 때문에, ADCC 가 감소되고 혈청 반감기가 강화되기 위해서 IgG2 유래의 CH2 및 CH3 영역을 사용하는 것이 적당하다. 그러나, IgG2 경첩 영역의 사용은 초래된 항체 또는 Ig 융합물이 불량하게 조립되는 것을 유발한다. 하기 각종 실시예에서 보여진 바와 같이, IgG1 경첩과 조합된 IgG2 CH2 및 CH3 영역을 사용하는 것이 특히 적당하다.
몇몇 실시예에서 보여준 대등한 발견은, 특정한 경첩 및 다른 도메인의 선택이 항체 또는 Ig 융합물의 생산 수준에 영항을 미칠 수 있다는 것이다. 온전한 항체와 같은 단백질 약물은 많은 양, 예컨대 환자마다 투여당 수백 밀리그램으로 투여되는 것이 요구되기 때문에, 이런 발견은 상당한 경제적 중요성을 갖는다. 최소한의 수, 예컨대 3 개 또는 2 개의 시스테인을 갖는 경첩의 선택은 진핵 발현계로부터 항체 또는 Ig 융합 단백질의 수율을 개선한다는 것이 일반적으로 발견되었다. 시스테인의 수를 감소시키는 것은 경첩의 하나의 이소타입을 다른 것으로 돌연변이시키거나 치환시키거나 이들 둘 다를 수행하는 것에 의해 성취될 수 있다.
프로테아제 저항성의 강화
경첩 영역은 프로테아제에 특히 민감하다. 보편적인 실험에서, 항체는 경첩 영역 중의 프로테아제 절단에 의해 Fab 영역 및 Fc 영역으로 나누어진다.
IgA 유래의 경첩 영역 및 다른 항체 이소타입 유래의 그외 성분을 갖는 항체 및 Ig 융합 단백질을 구축하는 것이 적당하다. 예를 들어, 항체 또는 Ig 융합단백질이 경구 전달되거나 코, 폐, 질 또는 직장 점막을 교차하는 경우, 존재하는 프로테아제로부터 항체 또는 Ig 융합 단백질을 보호하기 위해서 특히 포르테아제 저항성 단백질을 갖는 것이 유용하다. 예를 들어, IgA 경첩과 IgG 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 항체 또는 Ig 융합 단백질을 구축하는 것이 유용하며, 이런 하이브리드 이소타입 단백질은 프로테아제 저항성 특성을 갖고, 단백질이 순환계에 유입될 경우 혈청 반감기가 연장될 것이다. IgA1 경첩 중의 글리코실화 부위는 폭넓은 범위의 프로테아제에 대한 저항성을 부여하기 때문에, IgA1 의 경첩은 바람직한 경첩이다. 반대로, IgA2 의 경첩은 보다 짧으며, IgA1 경첩을 특이적으로 절단하는 박테리아 프로테아제에 대해 저항성을 갖는다.
다른 이소타입의 중쇄는 또한 프로테아제 저항성에 기여하는 글리코실화 부위를 함유한다. 예를 들어, IgA, IgD, IgE 및 IgM 은 프로테아제 저항성에 기여하는 보존 영역 중의 글리코실화 부위를 함유한다. 예를 들어, IgE CH1 도메인은 세 개의 N-연결된 글리코실화 부위를 함유한다. 예를 들어 IgA 유래의 경첩 부위 및 IgG 유래의 CH2 및 CH3 도메인과 함께 IgE CH1 도메인을 조합시키는 것이 유용하다.
하나의 이소타입 유래의 글리코실화 부위를 다른 이소타입의 CH2 또는 CH3 영역으로 혼입시키는 것이 또한 유용하다. 이런 경우에, 전체 도메인이 단일 엑손에 의해 코딩된 영역에 의해 정의되는 항체 또는 Ig 융합 단백질을 구축하는 것은 일반적으로 불충분하며, 하이브리드 도메인을 구축하는 것이 유용하다. 예를 들어, IgG 이소타입의 특징적인 FcRp 결합 특성과 다른 이소타입의 프로테아제 저항성 특성을 조합하는 것이 유용하다. 상기한 특성의 조합을 성취하기 위해서, 두 개의 상이한 이소타입 유래의 아미노산 서열을 갖는 개별적인 도메인을 구축하는 것이 필요하다. 이어서, 초래된 하이브리드 도메인은 비-Ig 부분구조와의 Ig 융합물을 구축하기 위해 사용된다.
예를 들어, IgG CH2 도메인의 대응 아미노산에 대한 서열 VNLTW (서열번호 3)을 포함하는 IgE CH2 도메인 유래의 일련의 아미노산을 치환하는 것이 적당하다. 예를 들어, IgG1 에서 상기 아미노산은 VKFNW (서열번호 4) 이고, IgG3 에서 상기 아미노산은 VQFKW (서열번호 5) 이다. 본 발명에 따르면, 다른 CH2 도메인의 대응 아미노산은 다른 이소타입의 CH2 도메인의 컴퓨터에 기초한 또는 구조적 배열에 의해, 또는 공개된 문헌 (Paul, WEFundamental Immunology, 제 4 판, 챕터 3, p.46-47)으로부터 결정될 수 있다.
유사하게, 다른 글리코실화 부위를 IgG 로 혼입시키는 것이 또한 유용하다. 예를 들어, IgD 유래의 서열 NTSGF (서열번호 6) 또는 LNASR (서열번호 7)을 포함하는 서열 분획은 항체 또는 Ig 융합 단백질 중의 IgG 유래의 Fc 영역의 대응 서열을 교체하기 위해 사용된다. 본 발명에 따르면, 항체 보존 영역 내의 다른 유용한 글리코실화 부위는 Paul (Fundamental Immunology, 제 4 판, 챕터 3) 에 개시되어 있고, 이는 본원에 참고문헌으로 통합한다.
본 발명의 일부 구현예에 의하면, 비-IgG 글리코실화 부위의 혼입은 FcRp 와의 상호작용을 감소시킨다. 이런 경우에, 프로테아제 저항성의 개선과 혈청 반감기의 감소 간에 트레이드(trade-off)가 존재하고, 상기 하이브리드 이소타입 단백질의 유용성은 특정 적용에 관련하여 평가되어야만 한다.
본 발명에 따르면, 특정 하이브리드 이소타입 항체 또는 Ig 융합 단백질의 프로테아제 저항성은 표준 절차에 따라 검사된다. 프로테아제는 시판원으로부터 구입될 수 있으며, 제조사의 지적사항에 따라 특정한 하이브리드 이소타입 항체 또는 Ig 융합 단백질의 존재하에서 배양된다. 단백분해는 예를 들어 출발 물질 및 절단 산물의 SDS 겔 전기영동 및 정량에 의해 측정된다.
본 발명에 따르면, FcRp 와 상호작용하기 위한 하이브리드 이소타입 항체 또는 Ig 융합 단백질의 능력은 또한 표준 절차에 따라 측정된다. 예를 들어, 항체 또는 Ig 융합 단백질의 약동학적 특성은 마우스, 래트, 토끼, 개, 비인간 영장류 또는 인간과 같은 포유동물에서 측정된다. 항체 또는 Ig 융합 단백질의 약동학적 특성은 FcRp 결합의 실제 지표이며, 일반적으로 항체 또는 Ig 융합 단백질로 결합하는 FcRp 의 특성을 포함시키는 목적은 항체의 약동학적 특성을 개선시키기 위함이다. 또한, 특정 하이브리드 이소타입 항체 또는 Ig 융합 단백질이 FcRp 와 상호작용할 것인지에 대한 여부를 결정하기 위해서 FcRp-Fc 복합체의 3차원 구조를 검사하는 것이 적당하다 (Martin, W.L. 등: Crystal Structure at 2.8 Å of FcRn/heterodimeric Fc Complex: Mechanism of pH-Dependent Binding.Mol. Cell7 pp. 867 [2001]; structure ID 1I1A athttp://www.rcsb.org/pdb/).
본 발명의 상기 양태에 따르면, Fc-X 형태의 단백질 [식중, Fc 영역은 IgA1 유래의 경첩 영역이고, FcRp 와의 결합을 매개하는 IgG2 의 요소를 포함하는 CH2 및 CH3 영역, 및 다른 IgG 와 비교하여 감소된 작동체 기능을 갖는 CH2 의 요소를함유한다] 을 구축하는 것이 특히 유용하다.
항체 또는 Ig 융합 단백질의 분자가의 증가
본 발명에 따르면, 높은 분자가를 갖지만 작동체 기능 또는 낮은 분자가 항체의 특징적인 다른 특성을 또한 갖는 하이브리드 이소타입 항체 또는 Ig 융합 단백질을 구축하는 것이 종종 유용하다. IgA 및 IgM 은 CH3 영역 중의 사슬간 디술피드 결합을 통한 올리고머화로 인해 높은 분자가를 갖는다. IgA 및 IgM 은 또한 CH4 의 C-말단 부근의 시스테인으로부터 J 영역까지의 디술피드 결합을 갖는다. IgA 는 이합체이고, IgM 은 5합체 또는 6합체이며, 따라서 IgA 는 4 개의 항원 결합 부위를 갖고, IgM 은 10 또는 12 개의 항원 결합 부위를 갖는다.
그러나, IgM 및 IgA 는 ADCC 를 매개하지 않는다. ADCC 를 매개하는 다가 (polyvalent) 항체 또는 Ig 융합물을 구축하기 위해서, IgG 의 CH2 도메인과 IgM 또는 IgA 의 CH3 및 CH4 도메인을 갖는 단백질을 구축하는 것이 유용하다. 일반적으로, 초래된 하이브리드 이소타입 단백질은 대응 IgA 함유 하이브리드 이소타입 단백질 보다 높은 분자가를 갖기 때문에, IgM CH3 및 CH4 도메인을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
하기 적용은 증가된 분자가를 갖는 하이브리드 이소타입 융합 단백질의 이용성을 나타낸다. 수많은 종양 세포는 그들의 세포 표면에 EGF 수용체를 과발현한다. EGF 수용체는 또한 수많은 정상 세포의 표면 상에서도 발현되고, 정상 세포와 종양 세포 사이의 EGF 수용체 발현 차이는 단지 정량적인 것이다. 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 유용한 IgG-IgM 하이브리드 이소타입 단백질은 인간 EGF 수용체와 약하게 상호작용하는 V 영역을 포함한다. 상기 V 영역의 친화도는 정상 세포 상에서 EGF-R 과 효율적으로 상호작용하지 않지만, 결합활성 효과(avidity effect)의 결과로서 종양 세포 상에서 과발현된 EGF 수용체와 상호작용하므로 선택된다. IgG 의 CH2 도메인, 예컨대 IgG1 의 CH2 도메인의 사용은 종양 세포에 대한 ADCC 를 매개한다.
종양세포의 특이적 사멸을 강화하기 위해서, 항-EGF-R IgG-IgM 하이브리드 이소타입 단백질과 항-종양 활성을 갖는 단백질, 예컨대 사이토카인을 융합시키는 것이 또한 유용하다. 예를 들어, IL-2 가 사용될 수 있다. 다르게는, 종양 영역에서 상기 하이브리드 이소타입 단백질의 농도가 종양의 편향적인 조사 (irradiation)를 유발하도록, 하이브리드 이소타입 단백질에 방사선 원자를 콘쥬게이트시키는 것이 유용하다. 예를 들어, 이트륨-90 이 IgG-IgM 하이브리드 이소타입 단백질에 콘쥬게이트시킬 수 있다. ADCC 와 IL-2 작용 또는 ADCC 와 조사를 조합하는 것은 종양 세포의 사멸에 특히 유용하다.
상기 기재된 항종양 단백질과 같은 IgG-IgM 융합 단백질에서, IgG, 바람직하게는 IgG1 유래의 경첩 영역을 사용하는 것이 일반적으로 또한 유용하다. 수많은 적용의 경우에, IgG3 유래의 경첩 영역은 가장 바람직하지 않은 IgG 경첩 영역이며, 이는 이 경첩 영역이 가변적인 조립을 유발하고, 또한 IgG3 경첩은 쉽게 단백분해될 수 있기 때문이다 (Baici A, 등., Scand J Immunol. [1980] 12: 41-50).
하기의 예는 본 발명의 상기 양태의 일반적인 원리를 설명한다: 정상적인 세포 보다 표적 세포 형태 상에서 훨씬 많이 발현되는 항원은 높은 분자가를 갖지만상대적으로 낮은 1가 친화도를 갖는 항체 또는 Ig 융합 단백질에 의해 더욱 효과적으로 표적될 수 있음.
예를 들어, 자가면역 질환에서, T 세포와 같은 일정한 면역 세포는 사이토카인 수용체와 같은 세포 표면 단백질을 고수준으로 발현한다. 상향조절된(up-regulated) 표면 단백질을 표적하는 높은 분자가의 IgG1, IgG2 또는 IgG4-IgM 항체 또는 Ig 융합 단백질을 이용하여 상기한 면역 세포를 공격하는 것이 유용하다. 이런 방식으로, 세포 표면 단백질은 존재하지만 상향조절되지 않는 세포의 표적화를 최적화시킬 수 있다. 예를 들어, 자가면역 질환의 공격 동안에, V 영역이 예를 들어 IL-2 수용체, IL-12 수용체 또는 임의의 다른 상향조절된 수용체를 표적하는 IgG-IgM 융합 단백질을 이용하여 환자를 치료하는 것이 유용하다. 경첩 영역 및 CH2 도메인은 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 로부터 유도되고, CH3 및 CH4 영역은 바람직하게는 IgM 으로부터 유도된다. V 영역은 바람직하게는 자가면역질환의 치료를 위한 IL-2 또는 IL-12 수용체에 약하게 결합한다. 이런 치료는 전체 T 세포의 전 종류가 아닌 T 세포 서브유닛을 사멸시키는데 효과를 갖는다.
하이브리드 이소타입을 갖는 항체 및 Ig 융합 단백질을 발현하는 발현 플라스미드의 구축
본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 전사되어 번역되었을 때 시그널 펩티드를 초래하는 분비 카세트를 코딩 핵산이 또한 코딩할 경우, 본 발명은 최적으로 실시된다. 시그널 펩티드는일반적으로 성숙 생성물로부터 절단된다. 분비된 융합 단백질은 숙주 세포의 용해를 필요로 하지 않고 배양배지로부터 수집될 수 있고, 목적하는 바와 따라 통상적인 시약을 사용하여 활성이 검사되거나 정제될 수 있다. 일부 경우에, 사이토카인 CNTF 와 같은 일정한 융합 파트너의 존재는 분비 카세트 없이 Ig 융합 단백질의 분비를 가능하게 한다.
천연 생성 인트론은 CH1 및 CH2 도메인을 코딩하는 DNA 로부터 경첩을 코딩하는 DNA 를 분리하기 때문에, 당업자는 인트론을 갖는 DNA 를 사용하여 상기 재조합 DNA 구축을 수행할 수 있다. 인트론내 제한효소 부위가 사용될 수 있다. 다르게는, 경첩 영역은 일반적으로 단지 약 15 내지 70 아미노산 길이를 갖기 때문에, 예를 들어 올로고뉴클레오타이드 합성, PCR 또는 이들의 조합을 이용하여 전체 경첩 영역을 코딩하는 합성 DNA 를 구축할 수 있다. 이어서, 합성 경첩 코딩 영역은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 Ig 융합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드로 위치시킬 수 있다.
본 발명을 하기 비제한적인 실시예에 의해 더욱 설명한다.
실시예 1:
상이한 항체 이소타입 유래의 경첩 영역 및 CH2 영역을 갖는 Fc-X 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 구축
HuFcγ1-렙틴을 발현하는 플라스미드의 구축물은 PCR 공개 WO 00/040615 A2 에 기재되었다.
IgG2 유래의 Fc 및 C-말단 융합 파트너의 융합물을 발현하는 플라스미드는하기와 같이 구축되었다.
우선, 인간 γ2 Fc 의 게놈 서열을 수득하였다. 인간 Fcγ2 를 코딩하는 게놈 DNA 는 인간 PBMC 로부터 단리된 세포 DNA 상에서 PCR 에 의해 수득하였다. 포워드 프라이머는 서열 5'-CC TTA AGC GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG (서열번호 8) 을 가지며, 이때 aflII 제한효소 부위C TTA AG는 영역 GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG (서열번호 9) 를 코딩하는 γ2 경첩의 바로앞 상류 영역에 도입되었다. 리버스 프라이머는 서열 5'-CCTCGAG TCATTT ACC CGG G GA CAG GGA G (서열번호 10) 를 가지며, XhoI 제한효소 부위CTCGAG는 전사 종결 코돈 (반대코돈TCA)의 바로 다음에 도입되었다. 또한, 리버스 프로이머에 또한 침묵 돌연변이 (밑줄친 A 에서 G 로의 치환) 에 의해 SmaICC CGG G 를 도입하였다. 910 bp 의 PCR 절편이 서열 확인을 위해 TOPO TA 클로닝 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로 클로닝되었다.
두번째로, 인간 γ2 Fc 가 발현 벡터로 위치되었다. 상위 CH3 영역을 코딩하는 DNA 서열 CTG CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG (서열번호 11) 중의 천연 SmaI 제한효소 부위를, 중복(overlapping) PCR 기술에 의해 도입된 침묵 돌연변이에 의해 삭제하였다 (Daugherty, B.L. 등, Nucleic Acids Res. 19: 2471-6, 1991). 포워드 프라이머는 서열 5'-CTG CCC CCA TCACGG GAG GAG ATG ACC AAG (서열번호 12) 를 가지며, C 에서 A 로의 치환은 밑줄쳤고; 리버스 프라이머는 서열 5'-GGT CAT CTC CTC CCGTGA TGG GGG CAG GGT GTA C (서열번호 13) 를 가지며, G 에서 T 로의 치환은 밑줄쳤다. 서열 확인 후, γ2 의 Fc 를 코딩하는 생성된AflII-XhoI 제한효소 절편은, 번역 종결 코돈의 상류에 유일한 SmaI 부위를, 종결코돈의 하류에 XhoI 부위를 함유하였다. 이어서, Fcγ2 를 코딩하는 AflII-SmaI 절편을 pdCs-huFcγ1-렙틴 (PCR 공개 WO 00/040615 A2) 중의 Fcγ1 을 코딩하는 대응 제한효소 절편을 교체하기 위해 사용하여, pdCs-huFcγ2-렙틴을 수득하였다.
세번째로, Fcγ2 의 경첩을 코딩하는 DNA 를 γ1 으로부터 변경된 경첩으로 대체하였다. γ2 경첩 영역은 4 개의 디술피드 결합을 함유한다. γ2 경첩 엑손을 함유하는 AflII-StuI 절편은 하기에 나타낸다. AflII 부위 (CTTA AG) 의 앞에는 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 선행된다. 글루탐산 (E) 는 γ2 경첩의 첫번째 아미노산 잔기이다. 일부 경우에, 문자는 인트론 서열 이후의 γ2 경첩 엑손을 나타낸다. StuI 제한효소 부위 (aggcct) 는, 서열 ccagg 및 리버스 가닥 cctgg 중의 C-메틸화로 인해, DCM 메틸라아제에 의해 대부분의E.coli균주에서 C-메틸화되고; 메틸화된 경우, 이 부위는 StuI 으로 절단될 수 없다.
pdCs-huFcγ2-렙틴 중의 γ2 경첩 엑손을 함유하는 AflII-StuI 절편을 pdCs-huFcγ1-렙틴 유래의 γ1 경첩 엑손을 함유하는 대응 AflII-StuI 절편으로 대체하였고, 이는 하기와 같다:
pdCs-HuFcγ1 중의 γ1 경첩 서열은, IgG1 에서 경쇄와 디술피드 결합을 형성하는 Cys 잔기를 제거한 Cys 의 Ser 로의 돌연변이 (밑줄침) 를 함유한다 (Lo 등, (1998) Protein Engineering 11: 495-500). γ1 및 γ2 엑손 모두에서 StuI 부위는 C-메틸화되고 StuI 제한 엔도뉴클레아제는 메틸화에 민감하므로, 두 플라스미드 모두는 StuI 효소에 의한 절단 전에 DCM 음성 균주의 박테리아로부터 단리하였다. pdCs-huFcγ1 유래의 경첩 영역을 갖는 생성된 pdCs-huFcγ2-렙틴을 pdCs-huFcγ2h-렙틴 (γ2h: 변형된 경첩을 갖는 γ2) 로 지칭하였다.
실시예 2:
huFcγ2-렙틴 및 huFcγ2h-렙틴 면역융합물의 올리고머화 상태의 특성
γ1, γ2 및 γ2h 이소타입을 갖는 발현 벡터 pdCs-huFc-huLeptin 을 사용하여 NS/0 세포로부터의 단백질 발현을 평가하였다. huFc 부분구조가 γ1, γ2 및 γ2h 이소타입으로부터 유도된 huFc-huLeptin 의 상이한 형태의 물리적 상태가 평가되었다.
상기 및 Lo 등에 기재된 바와 같이 생성된 DNA 구축물을 NS/0 세포에 형질감염시키고, 안정한 발현 세포주를 표준 절차에 따라 생성하였다.
본 실시예 및 하기 실시예에서, 안정한 형질감염체는 하기에 따라 생성되었다. 플라스미드 DNA 를, 마우스 골수종 NS/0 세포에 전기천공(electroporation)을 통해 도입하였다. NS/0 세포를, 10% 우태아혈청, 2 mM 글루타민 및 페닐실린/스트렙토마이신을 보충한 둘베코 변형된 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 에서 성장시켰다. 약 5 ×106세포를 PBS 로 한번 세척하고, 0.5 ㎖ 의 PBS 로 재현탁하였다. 이어서, 10 ㎍ 의 선형화된 플라스미드 DNA 를 얼음 상에서 10 분 동안 Gene Pulser Cuvette (0.4 ㎝ 전극 간격, BioRad) 중에서 세포와 함께 배양시켰다. Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) 를 사용하여 0.25 V 및 500 ㎌ 의 세팅 하에서 전기천공을 수행하였다. 얼음 상에서 세포를 10 분 동안 회수한 다음, 이들을 성장 배지에 재현탁한 후, 두 개의 96웰 플레이트에 치상하였다. 안정하게 형질감염된 클론을, 형질감염후 2 일간 도입된 100 nM 의 메토트렉세이트 (methodtrexate; MTX) 의 존재하에 성장시켜 선별하였다. 이 세포에 3 일마다 2 내지 3 번 더 공급하였고, MTX 저항성 클론이 2 내지 3 주내에 나타났다. 클론으로부터의 상청액을 항-Fc ELISA 로 검사하여, 높은 생산 생물을 동정하였다. 많이 생산하는 클론을 단리하고, 100 nM MTX 를 함유하는 성장 배지 중에서 증식시켰다.
항-huFc 항체 (서양고추냉이 퍼옥시다아제-콘쥬게이트된 염소 항-huIgG, Fcγ1 또는 Fcγ2, Jackson ImmunoResearch 제조) 를 사용하여, 항-huFc ELISA 에 의해 상청액 중의 HuFc-huLeptin 의 농도를 결정하였다. 상대적으로 낮은 수준의 발현이 γ2 구축물의 상청액에서 검출된 반면, γ1 및 γ2 구축물은 일과성 및 안정한 혈질감염 모두에서 높은 수준의 발현을 제공하였다. huFcγ2-huLeptin 및huFcγ2h-huLeptin 을 코딩하는 동등한 발현 벡터에 의한 일과성 형질감염에서, huFcγ2h-huLeptin 은 8 배 높은 수준으로 생성되었다.
정제를 위하여, 조직 배양 상청액 중의 융합 단백질을 프로테인 A 세파로오스에 결합시킨 다음, 인산나트륨 완충액 (100 mM NaH2PO4, pH 3, 및 150 mM NaCl) 으로 용출하였다. 이어서, 용출물을 0.1 부피의 2 M 트리스-히드로클로라이드 (pH 8) 로 중화시키고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (DSD-PAGE) 및 HPLC-크기 절단 크로마토그래피 (SEC) 에 의해 평가하였다.
융합 단백질을 비환원 조건하에서 SDS-PAGE 로 검사하였다. 쿠마시 염색 (Coomassie staining)에 의해 가시화된 단백질 밴드는 96 kD 의 명백한 MW 를 갖는 huFcγ1-huLeptin 을 보여주었고, 이는 2가 단량체라는 것을 보여준다. SDS-PAGE 에 의한 분석은 상당한 huFcγ2-huLeptin 융합 단백질이 고분자량 형태로 존재하여, Fc-렙틴 보다 훨씬 높은 명백한 분자량을 갖는 밴드의 래더 (ladder)로서 이동한다는 것을 나타낸다. 반대로, huFcγ2h-huLeptin 은 우선적으로 96 kD 에서 이동하는 단일 종류이었다.
huFcγ2h 구축물의 크기 절단 크로마토그래피 (SEC) 분석은 SDS-PAGE 결과와 상관관계를 가지며, huFcγ2h-렙틴 및 huFcγ1-렙틴 모두가 83% 단량체성인 것을 보여준 반면, 비교되는 huFcγ2-huLeptin 융합 단백질은 약 55% 단량체성이었다.
FcγR 계열의 수용체가 많은 고착된 J774 세포를 이용한 연구는, 단지 huFcγ1-huLeptin 융합 단백질만이 Fc 결합 활성을 나타내는 것으로 보여주었다.또한, 렙틴 수용체를 발현하여 증식이 렙틴에 의해 자극되도록 (Gainsford, T., 등 PNAS [1996] 93: 14564-14568) 형질감염시킨 BAF-3 세포를 사용하였다. BAF3/렙틴 수용체 세포를 이용한 연구는 huFcγ1-huLeptin, huFcγ2-huLeptin 및 huFcγ2h-huLeptin 은 렙틴 생물이용성에 있어서 동등하다는 것을 보여주었다.
huFcγ2-huLeptin 및 huFcγ2h-huLeptin 을 발현하는 포유동물 세포의 안정한 클론도 또한 동일하다. 세포 감염을 본질적으로는 동일한 조건하에서 수행하였고, 동일한 수의 안정하게 감염된 세포가 huFcγ2-huLeptin 및 huFcγ2h-huLeptin 의 생산을 위해 클로닝되어 검사되었다. huFcγ2h-huLeptin 을 최적으로 발현하는 클론은, huFcγ2-huLeptin 을 최적으로 발현하는 클론보다 huFc-huLeptin 을 약 5 배 더 생성하였다.
실시예 3:
상이한 항체 이소타입 유래의 경첩 영역 및 CH2 도메인을 갖는 X-Fc 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 구축
글루카곤형 펩티드 1 (GLP-1) 아미노산 잔기 7 내지 37 (서열번호 19) 를 코딩하는 합성 DNA 서열 (서열번호 18)을 하기에 개시한다
GLP-1 펩티드를 코딩하는 DNA 의 앞에는C TTA AGC가 선행되며, 이때 이 AflII 제한효소 부위는 시그널 펩티드 (Lo 등 Protein Engineering) 를 코딩하는 DNA 절편에 연결하기 위해 상기 DNA 절편을 사용되었다. 3' 말단에서, GLP-1을 코딩하는 DNA 의 뒤에는 BamHI 제한효소 부위 (GGA TCC, 이는 아미노산 잔기 G 및 S 를 코딩한다) 와, 번역 종결 코돈을 갖는 Fcγ2 를 코딩하는 AflII-XhoI 제한효소 절편 (또는 Fcγ2h) 에 결찰시키기 위해 사용되는 AflII 제한효소 부위가 후행되었다 (실시예 1 참조).
실시예 4:
GLP1-huFcγ2 및 GLP1-huFcγ2h 면역융합물의 올리고머화 상태의 특징
실시예 3 으로부터 생성된 벡터인 pdCs GLP-1 huFcγ1, pdCs GLP-1 huFcγ2 및 pdCs GLP-1 huFcγ2h 를 사용하여, GLP-1(7-37)huFcγ1, GLP-1(7-37)huFcγ2 및 GLP-1(7-37)huFcγ2h의 발현을 위한 포유동물 세포를 일과성으로 및 안정하게 형질감염시켰다.
각각의 GLP-1 huFc 융합 단백질에 대한 응집 상태 및 총 단백질 발현의 평가는, 실시예 2 에 기재된 일반적인 방법을 사용하여 프로테인 A 세파로오스에 의해 분리한 후, SDS-PAGE 및 HPLC-SEC 에 의해 수행되었다. 단백질 밴드는 쿠마시 염색에 의해 가시화되었다. GLP-1 huFcγ2 및 GLP-1 huFcγ2h 는 SDS-PAGE 에 의해 대략 60 kD 의 명백한 분자량을 가졌다. 상청액 중의 GLP-1 huFc 변이체의 농도는 항-huFc ELISA 에 의해 결정되었다. GLP1-huFcγ2 및 GLP1-huFcγ2h 를 코딩하는 동등한 발현 벡터를 갖는 일과성 형질전환에 있어서, GLP1-huFcγ2h 는 약 1.5 배 높은 수준으로 생성되었다.
SDS-PAGE 에 의한 총 세포 용해물의 분석은, 100 내지 200 kD 의 명백한 분자량을 갖고 이동하는 몇몇 높은 분자량의 존재에 의해 보여진 바와 같이, 거의 절반의 GLP1-huFcγ2 융합 단백질이 부정확한 디술피드 결합을 갖는 다는 것이 나타났다. 반대로, 검출가능한 GLP1-huFcγ2h 융합 단백질 모두는 본질적으로는 약 60 kD 의 명백한 분자량을 갖고 이동하였다. SDS-PAGE 전에 샘플이 환원되는 경우, GLP1-huFcγ2 및 GLP1-huFcγ2h 단백질은 본질적으로 동일한 약 34 kD 의 명백한 분자량을 갖고 이동하였다.
γ1, γ2 및 γ2h 융합 단백질의 HPLC-SEC 에 의한 비교 분석은, 변형된 γ2h 융합 당백질이 다른 융합 단백질 보다 상당히 더욱 단량체성이라는 것을 보여주었다. 변형된 GLP1-huFcγ2h 융합 단백질은 단일 피크로 보여진 바와 같이, 84% 의 2가 단량체인 반면, GLP1-huFcγ1 및 GLP1-huFcγ2 융합 단백질은 각각 약 42 및 33% 의 2가 단량체에 대응하는 복수의 피크를 가졌다.
따라서, IgG1 의 경첩과 IgG2 의 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 GLP-1-Fc 융합 단백질은 전체 Fc영역이 IgG1 또는 IgG2 로부터 유도된 GLP-1-Fc 융합 단백질 보다 더욱 우수한 조립 특성을 놀랍게도 나타내었다.
실시예 5:
IgG2 의 CH1, CH2 및 CH3 도메인과 IgG1 의 경첩을 함유하는 질환 세포에 특이적인 온전한 항체의 구축
면역글로불린 γ2 보존 영역 (CH1, 경첩, CH2 및 CH3)을 코딩하는 게놈 DNA 는 인간 PBMC 로부터 단리된 세포 DNA 를 사용하여 PCR 에 의해 수득되었다. 포워드 프라이머는 서열 5'-CAAGCTTTCTGGGGCGAGC (서열번호 20)를 가지며, 이때 HindIII 제한효소 부위AGCTT는 CH1 엑손의 약 220 bp 상류의 인트론 서열에 도입되었다. 리버스 프라이머는 서열 5'-CCTCGAG TCATTT ACC CGG G GA CAG GGA G (서열번호 21) 을 가지며, 이때 XhoI 제한효소 부위CTCGAG는 번역 종결 코돈 (반대코돈TCA) 의 바로 뒤에 도입되었고, SmaICC CGG G 는 실시예 1 에 기재된 바와 같이 침묵 돌연변이에 의해 생성되었다. 상위 CH3 영역을 코딩하는 DNA 서열에서 천연 SmaI 제한효소 부위는 또한, 실시예 1 에 기재된 바와 같이, 중복 PCR 에 의해 도입된 침묵돌연변이에 의해 삭제되었다. 실시예 1 에서 얻어진 Fcγ2 를 코딩하는 제한효소 절편의 이점을 취하는 것에 의해서, CH1, 경첩, CH2 및 CH3 영역을 코딩하고 유일한 SmaI 제한효소 부위를 함유하는 약 1810 염기쌍 (bp) 의 HindIII-XhoI 제한효소 절편이 용이하게 구축될 수 있었다. 서열 확인 후, γ2 보존 영역을 코딩하는 HindIII-XhoI 절편을 사용하여 pdHL7-huKSγ1-IL2 중의 γ1 보존영역-IL2 를 코딩하는 HindIII-XhoI 절편을 대체함으로써, pdHL7-huKSγ2 항체를 수득하였다.
huKSγ2h 항체에 대한 발현 벡터를 하기와 같이 구축하였다. 플라스미드 pdCs-huFcγ2h-렙틴을, 시스테인이 세린으로 변형된 γ1 경첩 영역만을 코딩하는 약 130 bp 의 PstI-PvuII 제한효소 절편을 생성하기 위한 PCR 주형으로서 사용하였다. 포워드 프라이머는 서열 5'-CTGCAGAGCCCAAATCTTC (서열번호 22)을 가지며, 이는 γ1 경첩 엑손 (상기 기재된 C 에서 S 로의 돌연변이를 가짐)의 시작부에 본래 PstI (CTGCAG) 제한효소 부위를 회복시킨다. 리버스 프라이머는 서열 5'-CAGCTGGGGCCTGTCCCTG (서열번호 23)을 가지며, 이는 경첩 및 CH2 엑손 사이의 인트론 중의 PvuII 부위 (CAGCTG)에 해당한다. 서열 확인 후, 상기 약 130 bp 의 PstI-PvuII 제한효소 절편을 사용하여 pdHL7-huKSγ2 항체 중의 대응 절편을 교체시킴으로써, pdHL7-huKSγ2h 항체를 수득하였다.
실시예 6:
질환 세포를 표적하는 γ2 항체 및 대응 γ2h 항체의 비환원 상태의 특징
일과성 형질감염을 위하여, IgGγ1, γ2 및 γ2h 이소타입을 갖는 KS 항체의 pdHL7 벡터를, 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 플러스 (Lipofectamin Plus; Life Technologies, Caithersburg, MD) 를 사용하는 리포펙션 (lipofection)에 의해 포유동물 세포에 도입하였다. 안정한 형질전환체는 실시예 2 에서와 같이 생성하였다.
조건화 배지 (10% 혈청) 중의 KS 항체를 프로테인 A 세파로오스 (Repligen, Cambridge, MA) 상에 포획한 다음, SDS-PAGE 에 의한 특징분석 전에 2-메르캅토에탄올의 존재 또는 부재하에 단백질 샘플 완충액 중에서 끓여내어 용출하였다. 쿠마스 염색에 의한 가시화는 비환원 KS γ2 항체가 약 150 kD 의 분자량을 갖는 몇몇 종류로서 이동하는 것이 보여졌다. 반대로, KSγ2h 항체는 150 kD 의 명확한 분자량을 갖는 주요 밴드로 이동하였다. KSγ2 항체 및 KSγ2h 항체가 SDS-PAGE 전에 메르캅토에탄올에 의해 환원된 경우, 중쇄 및 경쇄에 대응하는 밴드의 동일 패턴이 KSγ2 항체 및 KSγ2h 항체 모두에서 관찰되었다.
이론에 의해 한정되는 것을 바라지는 않지만, 상기 관찰은 KSγ2 로 보여지는 구별되어 이동하는 종류가 디술피드 결합 패턴의 다양성에 기인한 것임을 제안한다.
KSγ2 항체 및 KSγ2h 항체를 발현하는 포유동물 세포의 안정한 클론이 또한동정되었다. 세포 형질감염은 본질적으로 동일한 조건하에서 수행되었고, 안정하게 형질감염된 세포의 유사한 군이 클로닝되어 huFc KSγ2 항체 및 KSγ2h 항체의 생산에 대해 시험하였다. KSγ2h 항체를 최적으로 발현하는 4 개의 클론은 조직 배양 상청액 ㎖ 당 114, 98, 85 및 49 ㎎ 의 항체 만들어내는 반면, 동일한 조건하에서 huFc KSγ2 항체를 최적으로 발현하는 4 개의 클론은 조직 배양 상청액 ㎖ 당 36, 34, 15 및 13 ㎎ 의 항체를 만들어내었다.
실시예 7:
IgG2 의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 및 IgG1 의 경첩을 함유하는 완전한 항체를 포함하는 융합 단백질의 구축
본 실시예에서, 항체 부분구조가 하이브리드 이소타입을 갖는 항체 융합 단백질의 유용성을 검사하였다.
huKSγ2-IL2 에 대한 발현 벡터 pdHL7-huKSγ2-IL2 는, 서열 GGGTAAATGA (서열번호 24) 다음에 XhoI 스티키 말단 (sticky end)을 함유하는 pdHL7-huKSγ2 항체 중의 SmaI-XhoI 제한효소 절편을 pdHL7-huKS-IL2 로부터 단리된 SmaI-XhoI 제한효소 절편으로 교체하는 것에 의해 구축하였다. 상기 후자의 절편은 GGGTAAA 서열 바로 다음에 번역 종결 코돈을 포함하는 성숙 IL2 를 코딩하는 DNA 서열을 함유한다. 생성된 발현 벡터인 pdHL7-huKSγ2-IL2 가 단백질 발현용 세포를 형질감염시키기 위해 사용되었다.
유사하게, huKSγ2h-IL2 에 대한 발현 벡터 pdHL7-huKSγ2-IL2 는, 상기 단락에 기재한 바와 같이, 서열 GGGTAAATGA (서열번호 24) 다음에 XhoI 스티키 말단 (sticky end)을 함유하는 pdHL7-huKSγ2h 항체 중의 SmaI-XhoI 제한효소 절편을pdHL7-huKS-IL2 로부터 단리된 SmaI-XhoI 제한효소 절편으로 교체하는 것에 의해 구축하였다. 생성된 발현벡터인 pdHL7-huKSγ2h-IL2 가 단백질 발현을 위한 세포를 형질감염시키기 위해 사용되었다.
실시예 8:
γ2-항체 융합 단백질 및 대응 γ2h 항체 융합 단백질의 비환원 상태의 특징
일과성 발현을 위하여, KSγ2-IL2 및 KSγ2h-IL2 를 코딩하는 플라스미드를 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 플러스 (Life Technologies; Gaithersburg, MD) 를 사용하여 리포펙션에 의해 포유동물세포로 도입하였다.
안정하게 형질감염된 클론을 얻기 위해서, 실시예 2 에 기재된 바와 같이, 전기천공에 의해 플라스미드 DNA 를 마우스 골수종 NS/0 세포에 도입하였다.
실시예 6 에 기재된 바와 같이, γ2 및 γ2h 이소타입을 갖는 KS-IL2 융합 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 특징분석하였다. 조건화 배지 (10% 혈청) 중의 항체 융합 단백질을 프로테인 A 세파로오스 (Repligen, Cambridge, MA) 상에서 포획한 다음, SDS-PAGE 에 의해 특정분석하기 전에 2-메르캅토에탄올의 존재 또는 부재하에 단백질 샘플 완충액 중에서 끓여서 용출하였다. 쿠마시 염색에 의한 가시화는 비환원 KSγ2-IL2 가 약 180 kD 의 분자량을 갖는 몇몇 종류로서 이동하는 것을 보여주었다. 반대로, KSγ2h-IL2 은 약 180 kD 의 명백한 분자량을 갖는 주요한 밴드로서 이동하였다. KSγ2-IL2 및 KSγ2h-IL2 가 SDS-PAGE 전에 메르캅토에탄올에 의해 환원되는 경우, 중쇄-IL2 및 경쇄에 대응하는 밴드의 동일한 패턴이 KSγ2-IL2 및 KSγ2h-IL2 에서 관찰되었다.
이론에 의해 한정되는 것을 바라지는 않지만, 상기 관찰은 KSγ2-IL2 에 대해 보여진 구별되어 이동하는 종류가 디술피드 결합 패턴의 다양성에 기인한 것임을 제안한다.
변형된 γ2h 면역사이토카인이 동물에서 검사되었고, 본래의 IgGγ1 계의 면역사이토카인에 대한 동물 종양 모델에서 보다 우수한 효험성을 갖는 확장된 반감기를 가졌다.
KSγ2-IL2 및 KSγ2h-IL2 를 발현하는 포유동물 세포의 안정한 클론이 또한 동정되었다. 세포 형질감염은 본질적으로는 동일한 조건하에서 수행되었고, 유사한 수의 안정하게 형질감염된 세포가 클로닝되어 KSγ2-IL2 및 KSγ2h-IL2 의 생산에 대해 검사하였다. KSγ2h-IL2 를 최적으로 발현하는 4 개의 클론은 조직 배양 상청액 ㎖ 당 약 52, 37, 31 및 30 ㎎ 의 융합 단백질을 만든 반면, 동일한 조건하에서 KSγ2-IL2 를 최적으로 발현하는 4 개의 클론은 조직 배양 상청액 ㎖ 당 약 31, 27, 27 및 17 ㎎ 의 융합 단백질을 만들었다.
실시예 9:
융합 단백질의 활성에 영향을 미치는 하이브리드 이소타입 및 제 2 의 돌연변이를 갖는 항체 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 구축
huKSγ2-Ala-IL2 대 huKSγ2h-Ala-IL2
발현벡터 pdHL7-huKSγ2-Ala-IL2 및 pdHL7-huKSγ2h-Ala-IL2 (상기 기재됨) 는, 서열 GGGTAAATGA (서열번호 24) 다음에 XhoI 스티키 말단을 함유하는 각각의 pdHL7-huKSγ2 항체 및 pdHL7-huKSγ2h 항체 중의 SmaI-XhoI 제한효소 절편을 pdHL7-huKSγ1-Ala-IL2 로부터 단리된 대응 SmaI-XhoI 제한효소 절편으로 대체하는것에 의해 구축하였다. 상기 후자의 절편은 GGGTGCA 서열 바로 다음에 번역 종결 코돈을 포함하는 성숙 IL2 를 코딩하는 DNA 서열을 함유한다. GCA 는 융합 단백질의 접합부에서 리신에서 알라닌으로의 치환을 코딩한다. 생성된 벡터는 huKSγ2-Ala-IL2 및 huKSγ2h-Ala-IL2 의 생산을 위한 세포를 형질감염시키기 위해 사용되었다.
실시예 10:
융합 단백질에 영향을 미치는 제 2 의 돌연변이를 갖는 γ2-항체 융합 단백질 및 대응 γ2h 항체 융합 단백질의 비환원 상태의 특징
일과성 발현을 위하여, KSγ2-Ala-IL2 및 KSγ2h-Ala-IL2 를 코딩하는 플라스미드를 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 플러스 (Life Technologies; Gaithersburg, MD) 를 사용하여 리포펙션에 의해 포유동물 세포로 도입하였다.
KSγ2-Ala-IL2 및 KSγ2h-Ala-IL2 를 발현하는 포유동물 세포의 안정한 클론을 또한 실시예 2 에서와 같이 동정하였다. 세포 형질감염은 본질적으로는 동일한 조건하에서 수행되었고, 유사한 수의 안정하게 형질감염된 세포가 클로닝되어 KSγ2-Ala-IL2 및 KSγ2h-Ala-IL2 의 생산에 대해 검사하였다. KSγ2h-Ala-IL2 를 최적으로 발현하는 3 개의 클론은 조직 배양 상청액 ㎖ 당 약 39, 38 및 29 ㎎ 의 융합 단백질을 만든 반면, 동일한 조건하에서 KSγ2-Ala-IL2 를 최적으로 발현하는 3 개의 클론은 조직 배양 상청액 ㎖ 당 약 22, 17 및 6 ㎎ 의 융합 단백질을 만들었다. 실시예 6 에 기재된 바와 같이, γ2 및 γ2h 이소타입을 갖는 KS-Ala-IL2 융합 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 특징분석하였다. 조건화 배지 (10% 혈청) 중의 KS-Ala-IL2 융합 단백질을 프로테인 A 세파로오스 (Repligen,Cambridge, MA) 상에서 포획한 다음, SDS-PAGE 에 의해 특정분석하기 전에 2-메르캅토에탄올의 존재 또는 부재하에서 단백질 샘플 완충액 중에서 끓여서 용출하였다. 쿠마시 염색에 의한 가시화는 비환원 KSγ2-Ala-IL2 가 몇몇 종류로서 이동하는 것을 보여주었다. 반대로, KSγ2h-Ala-IL2 는 하나의 주요한 종류로서 이동하였다. KSγ2-Ala-IL2 및 KSγ2h-Ala-IL2 가 SDS-PAGE 전에 메르캅토에탄올에 의해 환원되는 경우, 중쇄-IL2 및 경쇄에 대응하는 밴드의 동일한 패턴이 KSγ2-Ala-IL2 및 KSγ2h-Ala-IL2 모두에서 관찰되었다.
이론에 의해 한정되는 것을 바라지는 않지만, 상기 관찰은 KSγ2-Ala-IL2 에 대해 보여진 구별되어 이동하는 종류가 디술피드 결합 패턴의 다양성에 기인한 것임을 제안한다.
실시예 11:
상이한 이소타입으로부터 유도된 보존 영역을 갖는 항체 융합 단백질의 발현
일부 경우에, 경첩 영역과 함께 상이한 보존 영역이 상이한 중쇄 이소타입으로부터 유도된 Ig 융합 단백질을 구축하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 계열의 분자의 특성을 검사하기 위하여, 하기 실험이 수행되었다.
KS VH, IgG1 유래의 경첩 영역 및 IgG2 유래의 CH2-CH3 영역 (상기한 바와 같이, 융합 접합부에 리신의 알라닌으로의 치환을 가짐), 그에 이은 IL-2 를 포함하는 IgG 중쇄와의 항체-IL2 융합 단백질인 huKS(γ1:CH1-H)(γ2:CH2-CH3)-Ala-IL2 단백질은 하기와 같이 발현되었다. 발현벡터 pdHL7-huKS(γ1:CH1-H)(γ2:CH2-CH3)-Ala-IL2 는 pdHL7-KSγ2-Ala-IL2 중의 HindIII-AflIII 제한효소 절편을pdHL7-KS-IL2 유래의 CH1 및 경첩 영역을 함유하는 대응 HindIII-AflIII 제한효소 절편으로 대체하는 것에 의해 구축되었다. 상기 발현벡터를, 상기 기재된 배양된 포유동물 세포에 형질감염시켜, 하이브리드 이소타입을 갖는 항체 융합 단백질을 수득하였다.
huKS(γ1:CH1-H)(γ2:CH2-CH3)(Ala)-IL2 하이브리드 및 huKSγ2(Ala)-IL2 항체-사이토카인 융합 단백질은, 실시예 6 에 기재된 비환원 SDS-PAGE 에 의해 특징분석하였다. huKS(γ1:CH1-H)(γ2:CH2-CH3)(Ala)-IL2 하이브리드 이소타입 융합 단백질은 약 180 kD 의 분자량을 갖는 주요 밴드로서 이동하였다. 반대로, huKSγ2(Ala)-IL2 항체-사이토카인 융합 단백질은 180 kD 크기 범위의 복수 밴드로서 이동하였다.
huKS(γ1:CH1-H)(γ2:CH2-CH3)(Ala)-IL2 하이브리드 및 huKSγ2(Ala)-IL2 항체-사이토카인 융합 단백질을 환원 SDS-PAGE 에 의해 특징분석하였고, 이들 두 단백질은 경쇄 및 중쇄-IL2 융합 폴리펩티드에 대응하는 동일한 패턴의 밴드를 제공하였다.
이론에 의해 한정되는 것은 아니지만, huKSγ2(Ala)-IL2 항체-사이토카인 융합 단백질은 둘 이상의 상이한 이성질체 배치들로 존재하며, 이러한 차이는 디술피드 결합 패턴의 차이에 기인하는 것 같다.
실시예 12:
비-단백질 항원 특이성 및 다수-서브유닛 융합 파트너를 갖는 하이브리드 이소타입 항체 융합 단백질의 발현
14.18 항체는 당지질 항원 GD2 에 결합한다. 인터루킨-12 는 디술피드결합에 의해 공유적으로 부착된 p35 및 p40 서브유닛을 포함하는 이종이합체 사이토카인이다.
상술한 바와 같이, IgG1/IgG2 하이브리드와 같은 하이브리드 이소타입의 사용은 IgG2 와 같은 천연 이소타입과 비교하여 강화된 조립성을 유도한다. 강화된 조립성은 증가된 별현 수준에 의해 증명될 수 있다.
하나의 경우로, 14.18(γ2)-Ala-IL12 및 14.18(γ2h)-Ala-IL12 발현 플라스미드를 구축하고, 상기 및 Gillies 등 (WO 09929732) 에 기재된 바와 동일한 조건하에서 병렬적으로 세포에 일과적으로 형질감염시켰다. 조직 배양 상청액 중의 단백질의 수준은, 14.18(γ2h)-Ala-IL12 발현 플라스미드에 의해 형질감염된 배양물 유래의 것이 14.18(γ2)-Ala-IL12 발현 플라스미드에 의해 형질감염된 배양물 유래의 것 보다 약 40% 더 높았다.
14.18(γ2)-Ala-IL12 및 14.18(γ2h)-Ala-IL12 발현 플라스미드는 또한 상술한 바와 같이 안정하게 세포로 형질감염시켰고, 각각의 형질감염으로부터 가장 높게 발현하는 4 개의 클론을 더 연구하였다. 14.18(γ2h)-Ala-IL12 에서 최적으로 발현하는 4 개의 클론의 평균은, 14.18(γ2)-Ala-IL12 발현 플라스미드로부터 유도된 최적으로 발현하는 4 개의 클론 보다 약 45% 더 높았다.
두번째 경우로, 14.18(γ2)-IL12 및 14.18(γ2h)-IL12 발현 플라스미드를 구축하고, 상기 기재된 바와 동일한 조건하에서 병렬적으로 세포에 일과적으로 형질감염시켰다. 마우스 IL-12 가 사용되었다. 조직 배양 상청액 중의 단백질의 수준은, 14.18(γ2h)-IL12 발현 플라스미드에 의해 형질감염된 배양물 유래의것이 14.18(γ2)-IL12 발현 플라스미드에 의해 형질감염된 배양물 유래의 것 보다 약 40% 더 높았다.
뮤린 IL-12 를 사용하는 14.18(γ2)-IL12 및 14.18(γ2h)-IL12 발현 플라스미드는 또한 상술한 바와 같이 안정하게 세포로 형질감염시켰고, 각각의 형질감염으로부터 가장 높게 발현하는 4 개의 클론을 더 연구하였다. 14.18(γ2h)-IL12 에서 최적으로 발현하는 4 개의 클론의 평균은, 14.18(γ2)-IL12 발현 플라스미드로부터 유도된 최적으로 발현하는 4 개의 클론 보다 약 35% 더 높았다.
이러한 결과는, 융합 단백질로의 하이브리드 이소타입의 사용이 상이한 항체 및 상이한 비-Ig 부분구조를 사용하는 경우에 상기한 예에서 보다 강화된 발현을 유도함을 나타낸다. 본 실시예에서, 비-Ig 부분구조로서 IL-12 의 사용은, IL-12 가 이종이합체이기 때문에, Ig 융합 단백질의 조립을 상당히 복합하게 할 것으로 예상된다. 그럼에도 불구하고, 하이브리드 이소타입의 사용은 이로운 효과를 갖는다.
실시예 13:
IgA 유래의 경첩 영역을 사용하는 하이브리드 이소타입 항체 융합 단백질의 발현
강화된 프로테아제 저항성을 갖는 Ig 융합 단백질을 구축하기 위해서, IgA/IgG 융합 단백질을 제조하였다.
예를 들어, 인간 IgA1 의 경첩 영역과 IgG2 의 CH2 및 CH3 영역을 함유하는 Fc-X 융합 단백질이 구축되었다.
인간 IgA1 유래의 경첩 영역과 IgG2 의 CH2 및 CH3 영역을 함유하는 Fc-X 융합 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터의 구축의 예는 하기와 같다. 실시예 1 로부터의 플라스미드 pdCs-huFcγ2-렙틴을 벡터로서 사용하였다.
pdCs-huFcγ2-렙틴 중의 γ2 경첩을 함유하는 AflII-StuI 절편을 하기에 나타내어진 IgA1 경첩 엑손을 함유하는 대응 AflII-StuI 절편 (서열번호 25)으로 교체하였다.
구체적으로 하기 올리고뉴클레오타이드가 합성되었다:
상기 올리고뉴클레오타이드는 어닐링되었고, pdCs-huFcγ2-렙틴 중의 대응 절편을 교체하기 위해 사용되었다.
γ2 엑손 중의 StuI 부위는 C-메틸화되고 StuI 제한 엔도뉴클레아제는 메틸화에 민감하므로, 상기 플라스미드를 StuI 효소에 의한 절단 전에 DCM 음성 균주의 박테리아로부터 단리하였다. IgA1 유래의 경첩 영역을 갖는 생성된 pdCs-huFcγ2-렙틴을 pdCs-huFcα1/γ2-렙틴으로 지칭하였다.
플라스미드 pdCs-huFcα1/γ2-렙틴을 진핵 세포로 형질감염시키고, α1(경첩)-γ2 (CH2, CH3)-렙틴 형태의 Fc-X 단백질이 분비성 단백질로 발현되었다. 예를 들어, 실시예 2 의 세포 및 방법이 사용되었다. 생성된 α1-γ2-렙틴 단백질이 정제되었고, 특징분석되었으며, 렙틴 활성을 갖고 경첩 영역에서 프로테아제 절단에 대해 상대적으로 민감하지 않다는 것이 발견되었다.
실시예 14:
IgG 의 성분 및 다가 면역글로불린을 사용하는 하이브리드 이소타입 항체 융합 단백질의 발현
IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG3 의 작동체 기능 및 증가된 분자가를 갖는 항체 융합 단백질을 구축하기 위하여, IgG 의 CH1, 경첩 및 CH2 영역과 IgA 또는 IgM 의 CH3 및 CH4 영역을 사용하는 하이브리드 이소타입 Ig 융합 단백질을 구축하였다. 도 4 는 IgG-IgM 하이브리드 이소타입 융합 항체의 구조를 나타낸다. IgA 또는 IgM CH4 도메인의 C-말단에 비-Ig 부분구조를 융합하는 것이 적당하다.
특히 IgG/IgA 또는 IgG/IgM 이소타입 융합 단백질이 J 사슬의 부재하에 발현되는 경우, 가장 C-말단인 시스테인 앞에서 IgA 또는 IgM 중쇄를 자르거나 이 시스테인을 변이시키는 것이 또한 적당하다. 상기 C-말단 시스테인의 정상적인 기능은 J 사슬과의 디술피드 결합을 형성하는 것이다. 특히 비-Ig 부분구조를 중쇄의 C-말단에 융합시키는 경우에, 공동발현된 J 사슬의 부재하에서 IgG/IgA 또는 IG/IgM 하이브리드 이소타입 융합 단백질을 발현하는 것이 요구될 수 있다.
예를 들어, IgG-IgM 하이브리드 이소타입 융합 단백질은 다음과 같이 구축된다. 플라스미드 pdHL7-huKSγ1-IL2 는 상피세포 흡착 분자에 결합되는 가변 영역 및 인간 IgG1 유래의 보존 영역을 갖는 항체를 발현할 수 있었다. 이 플라스미드는 IgG1 CH2 및 CH3 코딩 서열 사이의 인트론내에 유일한 Ngo M IV 부위를 함유하고, 또한 IgG1 CH3 및 IL-2 부분구조에 대한 코딩 서열 사이의 접합부에 유일한 XmaI 부위를 함유하였다. 인간 IgM CH3 및 CH4 서열을 코딩하는 DNA 절편은 하기 프라이머를 사용하여 인간 게놈 DNA 로부터 PCR 증폭에 의해 생성되었다:
다르게는, 하기 프라이머가 사용되고; 이들은 IgM 부분구조에서 가장 C-말단의 시스테인이 세린으로 변이되는 특징을 갖는다.
생성된 DNA 절편을 Ngo M IV 및 XmaI 으로 절단하고, 이어서 Ngo M IV 및 XmaI 으로 절단된 pdHL7-huKSγ1-IL2 에 직접 또는 간접적으로 결찰시켰다. 예를 들어, IgM CH3 및 CH4 도메인을 코딩하는 PCR 절편을 우선 TA 클로닝 벡터 (Invitrogen, Carlsbad CA) 와 같은 벡터로 서브클로닝하고, 삽입부의 서열을 확인한 다음, 삽입부를 Ngo M IV 및 XmaI 을 사용하여 제거하고, pdHL7-huKSγ1-IL2 로 결찰시켰다. 인간 IL-2 에 융합된 생성된 하이브리드 이소타입 중쇄의 아미노산은 서열번호 33 에서 보는 바와 같다. 융합 단백질의 IgM 부분을 밑줄쳤다. 인간 IgM 중쇄의 천연 생성 다형성으로 인해, 밀접하게 관련된 기능적으로 유사한서열을 또한 생성할 수 있다.
수많은 다른 DNA 구축 전략이 가능하다. 예를 들어, IgM CH3 및 CH4 도메인을 코딩하는 DNA 서열이 IgM 발현 세포주 또는 세포 집단으로부터 RT-PCR 에 의해 생성될 수 있었다. 3' PCR 프라이머는 상기 보여진 것과 동일하지만, 5' 프라이머는 Mgo M IV 와 IgM CH3 코딩 서열의 시작부 사이에 인공적인 5' 스플라이스 부위를 포함시켰다.
이어서, 진핵세포를 생성된 플라스미드 pdHL-7-huKSγ1/μ-IL2 로 형질전환시키고, 생성된 단백질으로 세포로부터 발현 및 분비시켰다. 예를 들어, 상기 실시예에 기재된 세포 및 방법이 사용되었다. 정제된 단백질은 예를 들어 전자 현미경 또는 크기 절단 크로마토그래피에 의해 시험하였고, 다합체성 구조를 갖는다는 것이 확인되었다.
정제된 단백질은 예를 들어 펩티드 매핑(mapping)에 의해 더욱 연구되었고, 서열 ...ASICEDD... (서열번호 34) 중의 시스테인이 다른 IgG/IgM 하이브리드 이소타입 서브유닛과의 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 것으로 발견되었다. 이러한 연결의 예는 도 4 에서 도시된다. 도 4 의 5합체 구조에 더하여, IgG/IgM하이브리드 이소타입 단백질의 최종 형태는 6합체 또는 다른 형태의 다합체성 구조일 수 있다.
생성된 IgG/IgM 하이브리드 이소타입 융합 단백질은 Fcγ수용체에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 이 융합 단백질은 인간 IgG 와 경쟁하는 방식으로 J774 세포에 결합한다.
실시예 15:
IgG1 및 IgG4 의 성분을 사용하는 하이브리드 이소타입 항체의 발현
실시예 15-17 의 실험 목적은, 부분적으로는 1차적으로는 IgG4 로 이루어진 분자의 조립성을 개선시킨 하이브리드 이소타입 항체의 이용성을 보여주기 위함이다. 일반적으로 IgG 분자의 통상적으로 바람직한 형태는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 갖는 H2L2형태이다. 그러나, IgG4 항체의 상당한 부분은 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 갖는 HL "절반 분자" 로서 합성된다. Angal 등 (1993; Molec. Immunol. 30: 105) 은 분비성 인간 IgG4 에서 확인된 "절반 분자" 의 양을 감소시키는 세린의 프롤린으로의 치환을 기재한다.
본 실시예는 동일한 V 영역을 함유하는 세 가지 항체 (IgG4 형태; IgG1 유래의 경첩 및 IgG4 유래의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 갖는 형태; 경첩 영역에서 돌연변이를 갖는 IgG4 형태 (Angal 등, ibid.))의 조립 특성을 비교하였다.
표준 플라스미드 구축 기술을 사용하여, pdHL7-KS-γ4 로 불려지는 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드는 실시예 5 에 기재된 플라스미드 pdHL7-huKSγ2 와 동일하지만, IgG2 중쇄 보존 영역 대신에 IgG4 중쇄 보존 영역을 코딩한다.
pdHL7-KS-γ4h 를 구축하기 위해서, pdHL7-KS-γ2h 플라스미드를dcm(-)균주의 E.Coli 내에서 성장시키고, 플라스미드 DNA 를 단리한 다음, 변형된 IgG1 경첩 영역을 코딩하는 60 bp 의 PstI-StuI 절편을 단리하고, pdHL7-KS-γ4 중의 대응 절편을 대체하기 위해 사용하였다.
비교를 위하여, 경첩 영역 중에 돌연변이를 갖는 IgG4 형태 (Angal 등, ibid.) 를 하기와 같이 구축하였다. 세린의 프롤린으로의 치환을 갖는 γ4 경첩과, 5'pstI스티키 말단 및 3'StuI블런트 말단을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드 이중체 (duplex) 를 하기와 같이 구축하였다.
이 올리고뉴클레오타이드 이중체는 pdHL7-KS-γ4 중의 대응 DNA 절편을 대체하기 위해 사용함으로써, pdHL7-KS-γ4(S 에서 P)를 수득하였다.
pdHL7-KS-γ4, pdHL7-KS-γ4h 및 pdHL7-KS-γ4(S 에서 P) 플라스미드를, 예를 들어 Lo 등 (1998; Protein Engineering 11: 495-500) 에 기재된 바와 같이, 표준 기술에 따라 포유동물 세포로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포의 상청액으로부터, pdHL7-KS-γ4, pdHL7-KS-γ4h 및 pdHL7-KS-γ4(S 에서 P) 에 의해 코딩된 항체 단백질을 정제하고, SDS 겔 전기영동에 의해 특징분석하여, 환원 및 비환원된샘플을 비교하였다.
비환원 분자를 검사하는 것에 의해, KS-γ4 항체 집단이 약 50% 의 HL "절반-분자" 및 50% 의 H2L2분자로서 존재한다는 것을 확인하였다. 반대로, KS-γ4h 항체 집단 및 KS-γ4(S 에서 P) 항체 집단은 거의 전체적으로 H2L2분자로서 존재하였다. HL 절반-분자의 비율은 KS-γ4h 항체 집단 및 KS-γ4(S 에서 P) 항체 집단에서 거의 동일하였다. 환원된 분자를 검사한 경우에, KS-γ4, KS-γ4h 및 KS-γ4(S 에서 P) 에서 보여진 중쇄 및 경쇄 패턴은 구별되지 않았다.
실시예 16:
IgG1 및 IgG4 의 성분을 사용하는 하이브리드 이소타입 항체 융합 단백질의 발현
플라스미드 pdHL7-KS-γ4-IL2 는 Gillies 등 (Cancer Research [1999] 59: 2159) 에 기재되어 있다. 이 플라스미드는 EpCAM 항원을 인식하고 C-말단에 인터루킨-2 가 융합된 IgG4 의 중쇄를 함유하는 V 영역을 갖는 항체 융합 단백질을 코딩한다.
실시예 15 에서 사용된 것과 유사한 재조합 DNA 절차에 의해서, 플라스미드 pdHL7-KS-γ4h-IL2 및 pdHL7-KS-γ4(S 에서 P)-IL2 를 포유동물 세포에 형질감염시키고, 대응 단백질을, 예를 들어 Lo 등 (ref) 에 기재된 바와 같이, 표준 절차에 따라 발현 및 정제하였다. 형질감염된 세포의 상청액으로부터, pdHL7-KS-γ4-IL-2, pdHL7-KS-γ4h-IL-2 및 pdHL7-KS-γ4(S 에서 P)-IL-2 에 의해 코딩된 융합 단백질을 SDS 겔 전기영동에 의해 정제 및 특징분석하여, 환원 및 비환원 샘플을비교하였다.
비환원 분자를 검사하는 것에 의해, KS-γ4-IL-2 융합 단백질 집단이 약 50% 의 HL "절반-분자" 및 50% 의 H2L2분자로서 존재한다는 것을 확인하였다. 반대로, KS-γ4h-IL-2 융합 단백질 집단 및 KS-γ4(S 에서 P)-IL-2 융합 단백질 집단은 거의 전체적으로 H2L2분자로서 존재하였다. HL 절반-분자의 비율은 KS-γ4h-IL-2 융합 단백질 집단 및 KS-γ4(S 에서 P)-IL-2 융합 단백질 집단에서 거의 동일하였다. 환원된 분자를 검사한 경우에, KS-γ4-IL-2, KS-γ4h-IL-2 및 KS-γ4(S 에서 P)-IL-2 에서 보여진 중쇄 및 경쇄 패턴은 구별되지 않았다.
실시예 17:
IgG1 및 IgG4 의 성분을 사용하는 하이브리드 이소타입 Fc 융합 단백질의 발현
경첩 영역, CH2 및 CH3 도메인, 및 비-Ig 부분구조를 함유하는, Ig 부분구조가 IgG4 및 IgG1 으로부터 유도된 융합 단백질의 발현을 위한 플라스미드의 세트를 생성하기 위해서, 하기 단계가 수행되었다.
우선, 실시예 1 에 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, pdCs-huFcγ1 (Lo 등 [1998] Protein Engineearing 11: 495-500)의 IgG1 유래 DNA 서열을 IgG4 의 대응 부분을 코딩하는 서열로 대체하는 것에 의해서, IgG4 유래의 Fc 영역을 코딩하는 발현 벡터를 생성하였다. 구체적으로, IgG4 경첩, CH2 및 CH3 도메인 영역을 코딩하는 DNA 분획을 증폭하기 위한 5' 프라이머로서, 5' 말단에서 AflII 부위를 코딩하는 하기 올리고뉴클레오타이드가 사용되었다:
3' 프라이머는, IgG2 Fc 영역을 증복하기 위하여, 실시예 1 에서 사용된 프라이머와 유사하게, 5' 말단에 XhoI 부위를 함유하였다. 생성된 AflII-XhoI 절편을 XhoI+AflII 절단 pdCs-huFcγ1 에 삽입하여 pdCs-huFcγ4 를 생성하였다.
Fcγ4 의 C-말단에서 비-IgG 부분구조를 코딩하는 핵산의 삽입을 용이하게 하기 위해서, pdCs-huFcγ4 중 Fcγ4 코딩 영역의 C-말단 부근에서 하기한 Leu 의 Pro 로의 변화를 도입하는 것에 의해, 하기와 같이, SmaI 부위를 생성하였다.
표준 부위 직접 돌연변이형성 기술(site-directed mutagenesis techniques) 이 pdCs-huFcγ4 로 SmaI 부위를 도입하기 위해 사용되었다.
변형된 IgG1 경첩의 뒤에 IgG4 CH2 및 CH3 도메인을 코딩하는 pdCs-huFcγ4h 로 불려지는 플라스미드를 생성하기 위하여, IgG2 CH2 및 CH3 도메인을 코딩하는 pdCs-huFcγ2h (실시예 1) 의 Stu-XhoI 절편을 pdCs-huFcγ4 유래의 대응 절편으로 대체하였다. 상기 구축에서, 각각의 모체 플라스미드는dcm(-)균주의 E.Coli 로부터 유도되었다. pdCs-huFcγ4 플라스미드는, γ4 코딩 DNA 중에 추가적인 StuI 부위가 존재하므로 XhoI 에 의해서는 완전하게 절단하고, StuI 에 의해서는 부분적으로 절단하여, 약 300, 500 및 800 염기쌍의 절편을 수득하였다. 약800 염기쌍의 절편을 pdCs-huFcγ2h 중의 대응 절편을 교체하기 위해 사용하였다.
센스 프라이머 CCCGGGTATGAGC TAC AAC TTG CTT GGA TTC (서열번호 43) [여기에서,ATG는 성숙 단백질의 N-말단 잔기이고, CCCGGG 는 도입된 SmaI 제한효소 부위이다] 및 리버스 프라이머 CTCGAGTCAGTT TCG GAG GTA ACC TGT AAG (서열번호 44) [여기에서, TCA 는 번역 종결 코돈의 반대 코돈이며, CTCGAG 는 도입된 XhoI 제한효소 부위이다]를 사용하여, IFNβ cDNA 를 PCR 에 의해 클로닝하였다. 주형 DNA 는 pLG117R (Taniguchi 등, [1980] Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77: 5230-5233) 이었고, American Type Culture Collection 로부터 구입하였다 (ATCC 번호 31903). 서열 확인 후, 클로닝된 SmaI-XhoI 절편을 pdCs-huFcγ4 발현벡터의 SmaI 및 XhoI 부위에 결찰시켜, pdCs-huFcγ4-IFNβ를 수득하였다. 유사한 pdCs-huFcγ4h-IFNβ 발현 플라스미드가 또한 유사한 방법으로 구축되었다.
pdCs-huFcγ4(S 에서 P)-IFNβ 발현 플라스미드를 구축하기 위해서, 세린의 프롤린으로의 치환과, 5' AflII 스티키 말단 및 3' StuI 블런트 말단을 갖는 γ4 경첩을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드 이중체를 하기와 같이 합성하였다:
pdCs-Fc-g4-IFNβ 중의 대응 DNA 절편을 교체하기 위해, 상기 DNA 서열을 사용하여, pdCs-huFcγ4(S 에서 P)-IFNβ를 수득하였다.
플라스미드 pdCs-huFcγ4-IFNβ, pdCs-huFcγ4h-IFNβ 및 pdCs-huFcγ4(S 에서 P)-IFNβ를 각각 포유동물 세포에 형질감염시켰다. 발현된 Fc 함유 단백질을 정제하고, 환원 및 비환원 SDS 겔 전기영동에 의해 검사하였다. 포유동물 세포로부터 발현된 huFcγ4-IFNβ의 상당한 비율은 정상적인 항체인 이합체라기 보다는 단량체성 절반-분자이었다. 그러나, 발현된 huFcγ4h-IFNβ 및 huFcγ4(S 에서 P)-IFNβ 융합 단백질은 거의 전체적으로 정확하게 조립된 이합체이었다. huFcγ4h-IFNβ 및 huFcγ4(S 에서 P)-IFNβ 융합 단백질 모두에 있어서, 단량체의 비율은 거의 동일하였다.
함께 고려하면, 실시예 15, 16 및 17 의 결과는, 일차적으로 IgG4 로 이루어지지만 변형된 IgG1 경첩을 갖는 하이브리드 이소타입 항체 및 Ig 융합 단백질이 IgG4 로부터 전체적으로 유도된 대응 단백질과 비교하여 우월한 조립 특성을 가짐을 나타낸다. 또한, 실시예 15-17 의 결과는, 다른 실시예에와 조합하면, 하이브리드 이소타입 단백질의 개선된 조립성은 몇가지 상이한 방식에 의해 명백해질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 하이브리드 이소타입 항체 또는 융합 단백질은, 대응 단일 이소타입 항체 또는 Ig 융합 단백질과 비교하여, 감소된 응집성을 나타내고; 다른 경우에서는, 하이브리드 이소타입 항체 또는 융합 단백질은, 대응 단일 이소타입 항체 또는 Ig 융합 단백질과 비교하여, 강화된 정확한 올리고머화를 나타낸다.
실시예 18:
IgG1 및 IgG4 의 성분을 사용하는 하이브리드 이소타입 Fc 융합 단백질의 발현
포유동물 세포로부터 발현될 경우 최소한으로 응집되는 Fc-에리트로포이에틴 융합 단백질을 생성하기 위해서, 표준 분자생물학 기술을 이용하여 하기의 발현 플라스미드를 구축하였다. WO 01/36489 에 개시된, 아미노산 치환 His32Gly, Cys33Pro, Trp88Cys 및 Pro90Ala 의 아미노산 치환을 초래하는 돌연변이를 갖는 인간 에리트로포이에틴 코딩 서열의 형태를 함유하는 XmaI-XhoI DNA 절편을 사용하였다. 대응 단백질의 서열은 서열번호 47 에 나타낸다:
상기 XmaI-XhoI DNA 절편을 IgG1 유래의 경첩 영역과 IgG2 유래의 CH2 및 CH3 영역을 코딩하는 플라스미드에 삽입하였고, 이는 실시예 1 에서 구축된 벡터와 실질적으로 동일하지만, CH3 C-말단 및 Epo N-말단의 접합부에서의 서열이 하기와 같이 되도록 CH3 C-말단의 영역에서 아미노산 치환을 초래하는 두 세트의 돌연변이가 존재한다:
IgG2 CH3 영역의 서열 KSLSLSPG (서열번호 49) 를 KSATATPG (서열번호 45) 로 변화시킨 첫번째 세트의 돌연변이는 U.S. 특허출원 제 60/280,625 호에 개시되어 있다. Leu-Ser-Leu-Ser (서열번호 49 의 위치 3 에서 위치 6) 을 Ala-Thr-Ala-Thr (서열번호 50 의 위치 3 에서 위치 6)로 치환한 효과는, 인간 Fc 및 인간 에리트로포이에틴 사이의 접합부가 비-자기 펩티드 서열을 함유하기 때문에 일어날 수 있는 잠재적인 인간 비-자기 T-세포 에피토프를 제거하는 것이다. CH3 영역의 C-말단 아미노산에서 K 의 A 로의 단일 아미노산 치환으로 이루어진 두 번째 세트는 U.S. 특허출원 제 09/780,668 호에 개시되어 있다.
생성된 플라스미드를 NS/0 세포에 형질감염시키고, 실시예 1 및 2 의 절차에 따라 Fc-Epo 융합 단백질을 발현 및 정제하였다. 프로테인 A 에 기초한 정제후에, 상술한 IgG2 CH3 및 에리트로포이에틴 치환을 함유하는 huFcγ2h-huEpo 단백질은 크기 절단 크로마토그래피에 의해 특징분석하였고, 두 개의 독립적인 제제내에서 97% 의 단량체 및 90% 의 단량체로 이루어진 것이 확인되었다. 상술한 IgG2 CH3 및 에리트로포이에틴 치환을 함유하는 huFcγ2h-huEpo 단백질은, TF-1 세포 분열을 자극하는 에리트로포에틴인 단백질의 능력을 측정하는 세포에 기초한 검사에서, 몰 기준으로 인간 에리트로포이에틴과 거의 동일한 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 이 검사는 WO 01/36489 에 기재된 바와 같이 수행하였다.
또한, 비-돌연변이 에리트로포이에틴과, IgG1(경첩-CH2-CH3), IgG2(경첩-CH2-CH3) 또는 IgG1(경첩)-IgG2(CH2-CH3) 로 이루어진 Fc 영역의 C-말단과의 융합에 대해 특징분석하였다. 비-돌연변이 인간 Fc 서열과 비-돌연변이 에리트로포이에틴 서열을 포함하는 발현 플라스미드는 상기 및 실시예 1 에 기재된 플라스미드와 유사하게 구축하였다. NS/0 세포를 Fcγ1-Epo, Fcγ2-Epo 및 Fcγ2h-Epo 발현 플라스미드로 형질감염시키고, 각 플라스미드에 대해 대략 동일한 수의 클론을 스크리닝한 후 단리하였다. 최적으로 생산하는 클론은 Fcγ1-Epo 의 경우 50 ㎍/㎖, Fcγ2-Epo 의 경우 20 ㎍/㎖, 그리고 Fcγ2h-Epo 의 경우 120 ㎍/㎖ 이었다.
균등물
본 발명은, 본 발명의 개념 및 본질적인 특징으로부터 벗어남 없이, 다른 특정한 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상술한 구현예는 본원에 기재된 본 발명을 제한하기 보다는 모든 점에 있어서 예시하기 위한 것으로 예시되어야만 한다. 따라서, 본 발명의 범주는 상술한 상세한 설명 보다는 첨부된 청구범위에 의해 나타내어지며, 상기 청구범위와 균등한 의미 및 범위내에서의 변화도 본원에 포함되는 것으로 의도한다.
참고문헌으로의 통합
본원에서 언급된 모든 특허, 모든 출원 및 과학관련 간행물은 전체적으로 본 출원에 참고문헌으로 통합된다.
Claims (28)
- 비(非)-면역글로불린 부분구조(moiety) 에 융합된 면역글로불린 구조를 포함하는 융합 단백질에 있어서, 상기 면역글로불린 부분구조가 제 1 항체 이소타입 유래의 제 1 도메인(domain)과 제 2 항체 이소타입 유래의 제 2 도메인을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로불린 영역이 제 1 항체 이소타입 유래의 경첩 영역과 제 2 항체 이소타입 유래의 보존 영역을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 2 항에 있어서, 상기 보존 영역이 CH2 도메인임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 3 항에 있어서, 상기 CH2 도메인이 인간 IgG2 중쇄 유래이며, 상기 경첩 영역이 세 개 이하의 시스테인 잔기를 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 3 항에 있어서, 상기 CH2 도메인이 인간 IgG4 중쇄 유래임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 2 항에 있어서, 상기 경첩 영역이 비-IgG2 경첩 영역임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 2 항에 있어서, 상기 경첩 영역이 인간 IgG1 으로부터 유도됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경첩 영역이 둘 이하의 시스테인을 가짐을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로불린 도메인이 항원 결합 부위가 결여되어 있음을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 상구 면역글로불린 도메인이 항원 결합 부위를 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 비-Ig 부분구조가 Ig 도메인의 중쇄의 C-말단에 유전공학적으로 융합됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 비-Ig 부분구조가 Ig 도메인의 중쇄의 N-말단에 유전공학적으로 융합됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 비-Ig 부분구조가 경쇄 폴리펩티드에 융합됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 2 항에 있어서, 상기 경첩 영역이 인간 IgA 유래임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 면역글로불린 도메인이 CH2 도메인이고, 상기 제 2 면역글로불린 도메인이 CH3 도메인임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 15 항에 있어서, 제 1 항체 이소타입이 IgG 이고, 제 2 항체 이소타입이 IgM 또는 IgA 임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- IgG2 경첩이 두 개의 시스테인을 함유하도록 변이된 IgG2 항체 부분구조를 포함함을 특징으로 하는 항체 또는 Ig 융합 단백질.
- 제 1 항체 이소타입 유래의 제 1 도메인과 제 2 항체 이소타입 유래의 제 2 도메인을 포함함을 특징으로 하는, 종양 관련 항원을 표적하는 V 도메인을 포함하는 면역글로불린 부분구조.
- 제 18 항에 있어서, 불활성 Fc 수용체 I 결합 부위와, 세 개 이하의 시스테인을 갖는 경첩 영역을 포함함을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항, 제 17 항 및 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
- 제 1 항, 제 17 항 및 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 발현하는 안정하게 형질감염된 세포.
- 하기 단계를 포함함을 특징으로 하는, 항체 또는 Ig 융합 단백질의 개선된 조립 (assembly) 방법:a. 상기 단백질의 경첩 영역을 상이한 경첩 영역으로 대체하는 단계;b. 변경된 단백질의 조립을 시험하는 단계.
- 제 22 항에 있어서, 상기 단백질 및 상기 변경된 단백질이 유전공학기술에 의해 제조됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로불린 부분구조가 Fc 중쇄 영역을 포함하고, 비-면역글로불린 부분구조가 에리트로포이에틴 분자를 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 24 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
- 제 1 항에 있어서, 비-면역글로불린 부분구조가 에리트로포이에틴 분자를 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 하기 단계를 포함함을 특징으로 하는, 세포로부터의 항체 또는 Ig 융합 단백질의 개선된 제조 방법:a. 상기 단백질의 경첩 영역을 상이한 경첩 영역으로 대체하는 단계;b. 상기 변경된 단백질의 제조를 시험하는 단계.
- 제 27 항에 있어서, 상기 단백질 및 상기 변경된 단백질이 유전공학기술에 의해 제조됨을 특징으로 하는 방법.
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