CN104136457A - 包括白细胞介素10和白细胞介素4的融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含白细胞介素10和白细胞介素4的融合蛋白、编码这种融合蛋白的核酸分子、包含这种核酸分子的载体、及包含这种核酸分子或这种载体的宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生这种融合蛋白的方法。所述融合蛋白或编码该融合蛋白的基因治疗载体可用于预防和/或治疗骨关节炎、慢性疼痛、以局部或全身炎症、免疫激活和/或淋巴组织增生为特征的病症。
Description
技术领域
本发明属于免疫学和药理学领域，特别地涉及用于治疗骨关节炎、慢性疼痛、炎症疾病或病症、及相关疾病和病症。本发明特别地涉及可选择地通过接头(linker)物理融合在一起的包括白细胞介素4(IL-4)和白细胞介素10(IL-10)的新融合蛋白。具体地，本发明提供相对于单独细胞因子的组合具有更强生物活性的IL4-IL10融合蛋白。本发明还提供编码IL4-IL10融合蛋白的核酸序列、包含这种核酸序列的表达载体、为了载有(harbour)编码IL4-IL10融合蛋白的核酸序列而被改变的宿主细胞或宿主生物体、及IL4-IL10融合蛋白本身。本发明进一步提供使用载有这种核酸序列的细胞或生物体产生IL4-IL10融合蛋白的方法。还提供包含本发明的核酸序列的转基因生物体。本发明还涉及包含IL4-IL10融合蛋白的药物组合物。最后，本文教导了IL4-IL10融合蛋白作为特别地用于预防和/或治疗骨关节炎和/或以局部或全身炎症、免疫激活、淋巴组织增生和/或慢性疼痛为特征的病症的药物中的用途。
背景技术
炎症疾病及其相关病症，比如局部或全身炎症、免疫激活和/或淋巴组织增生选自由由败血症、成人呼吸窘迫综合征、同种异体移植和异种移植、皮炎、炎性肠病、结节病、过敏症、银屑病、强直性脊椎脊柱炎(ankylosing spondylarthitis)、例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的自身免疫疾病、肾小球肾炎、免疫复合物诱发的及其它形式的血管炎、多发性硬化症、舍格伦病、痛风、非霍奇金淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞性白血病的淋巴组织增生疾病、烧伤、多发性创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、局部缺血-再灌注损伤、体内给药细胞因子或治疗性单克隆抗体诱发的毒性、慢性疼痛综合征和神经性和/或炎性疼痛组成的组中，它们是临床实践中观察到的最常见的使人虚弱的病症。炎症过程是这些医学病症的重要过程，其中促炎细胞因子和抗炎细胞因子作为炎性过程的介质起重要作用。
促炎细胞因子促进局部和全身性炎症。在大量的促炎细胞因子中，两种特别重要，即肿瘤坏死因子(TNFα)和白细胞介素1(IL1β)。许多努力致力于开发针对抑制TNFα和IL1β的治疗策略。特别地，已经通过数个策略比如中和抗体、可溶性受体、受体拮抗剂和将非活性前体转化为活性分子的蛋白酶的抑制剂实现了TNFα和IL1β的生物学活性的降低。例如，TNFα抑制剂比如英夫利昔单(抗-TNFα抗体)、(全人抗-TNFα抗体)、(TNF-受体-Fc-融合蛋白)、和阿那白滞素(IL1受体拮抗剂，IL1ra)已经在临床试验中进行了检测。尽管阻断TNFα和/或IL1β在许多患有类风湿性关节炎和炎性肠疾病的患者中获得了成功，但是并非所有患者对这种类型的治疗介入有良好的反应。因此，仍然迫切需要治疗炎症疾病、慢性疼痛和相关病症的可替代的有效治疗策略。
骨关节炎(OA)是最常见的关节病症，有超过65岁的大多数个人具有OA的放射照相证据和/或临床证据的证据。最经常受影响的部位是手、膝、臀部和脊柱。重要地，症状通常与显著的功能障碍有关，以及为炎症的体征和症状，包括疼痛、强直和运动机能丧失。OA的特征性结构改变包括关节软骨的渐进性损失、软骨下板的厚度增加、关节边缘形成新骨骼(骨赘)和软骨下骨囊肿的发展。另外，在关节软骨和相邻软骨下骨骼的连接处，在所谓的潮线(tidemark)部位，存在钙化软骨的残余部分。随着OA发展，有证据说明血管浸润和钙化软骨的这个区域进入关节软骨，其进一步导致关节软骨的厚度的减小。关节软骨和关节周围骨骼的这些结构变化可能导致相邻关节连接面(articulating surfaces)的轮廓改变。这些变化以及软骨下骨重建和骨模量的相应改变可进一步引起不利的生物力学环境发展，并且增强关节软骨退化的发展。已经显示出多种因素影响OA的发展，包括多关节疾病的存在、年龄增加、相关的关节内结晶沉积、肥胖、关节不稳定性和/或错位、肌肉无力和周围神经病。这些因素可以分成多个种类，包括遗传性影响、机械因素和衰老影响。对于治疗OA仅提出了非常有限的介入治疗，仅有的可用的介入治疗针对疼痛控制而不是功能缺损的治疗。
因此，需要提供单一分子，其临床开发是可行的，并且其可用于预防或治疗OA、以及慢性疼痛，和用于预防或治疗以局部或全身炎症、免疫激活和/或淋巴组织增生为特征的病症。这将能够使临床开发用于非常不同的病因的多种疾病或病症的单一分子。
发明内容
在第一方面，本发明涉及包含白细胞介素4(IL4)和白细胞介素10(IL10)的融合蛋白。
在一个实施方式中，所述IL4和所述IL10是由接头连接。
在一个实施方式中，IL4与IL10的N-末端融合。
在一个实施方式中，IL10与IL4的N-末端融合。
在一个实施方式中，所述融合蛋白进一步包括一个或多个化学修饰。所述化学修饰可选自糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化组成的组中。
在一个实施方式中，所述IL10为人IL10。
在一个实施方式中，所述IL4为人IL4。
在第二方面，本发明涉及核酸分子，所述核酸分子包括编码本文教导的融合蛋白的多核苷酸。
在另一个方面，本发明涉及包括本文教导的核酸分子的载体。
在一方面，本发明涉及包括本文教导的核酸分子或本文教导的载体的宿主细胞。
在一个方面，本发明提供了产生如本文教导的融合蛋白的方法，所述方法包括步骤：在允许产生如本文教导的融合蛋白的情况下培养如本文教导的宿主细胞；和可选地，回收该融合蛋白。
在再一个方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包括如本文教导的融合蛋白和药学上可接受载体。
本发明还涉及如本文教导的融合蛋白，用作药物，例如用于预防或治疗以局部或全身炎症、免疫激活、淋巴组织增生和/或疼痛为特征的病症。
所述以局部或全身炎症、免疫激活、淋巴组织增生和/或慢性疼痛为特征的病症可以选自由：败血症、成人呼吸窘迫综合征、同种异体移植和异种移植、皮炎、炎性肠病、结节病、过敏症、银屑病、骨关节炎、强直性脊椎关节炎、例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的自身免疫疾病、肾小球肾炎、免疫复合物-诱发的及其它形式的血管炎、多发性硬化症、舍格伦病、痛风、例如非霍奇金淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞性白血病的淋巴组织增生疾病、烧伤、多发性创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、局部缺血-再灌注损伤、周围神经病、体内给药细胞因子或治疗性单克隆抗体诱发的毒性、慢性疼痛综合征和神经性和/或炎性疼痛组成的组中。
在一个方面，本发明涉及如本文教导的融合蛋白，用于预防或治疗例如人类的哺乳动物中IL10指征的临床病症。
本发明还涉及如本文教导的融合蛋白，用于预防或治疗例如人类的哺乳动物中IL4指征的临床病症。
最后，本发明教导如本文教导的载体，用于预防或治疗以局部或全身炎症、免疫激活、淋巴组织增生和/或慢性疼痛为特征的病症，其中所述病症可以选自：败血症、成人呼吸窘迫综合征、同种异体移植和异种移植、皮炎、炎性肠病、结节病、过敏症、银屑病、骨关节炎、强直性脊椎关节炎、例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的自身免疫疾病、肾小球肾炎、免疫复合物-诱发的及其它形式的血管炎、多发性硬化症、舍格伦病、痛风、例如非霍奇金淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞性白血病的淋巴组织增生疾病、烧伤、多发性创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、局部缺血-再灌注损伤、体内给药细胞因子或治疗性单克隆抗体诱发的毒性、慢性疼痛综合征和神经性和/或炎性疼痛组成的组中。
具体实施方式
一般定义
术语“核酸分子”(或“核酸序列”、“多核苷酸”或“核苷酸序列”)指单链或双链形式的DNA或RNA分子，特别是编码根据本发明的蛋白的DNA。“分离的核酸序列”指不再位于从其中分离的自然环境中的核酸序列，例如在细菌宿主细胞中或在植物核基因组或质体基因组中的核酸序列。
术语“蛋白”或“多肽”可互换地使用，并且是指由氨基酸链组成的分子，不涉及特定作用方式、尺寸、3维结构或来源。“分离的蛋白”用于指不再位于其自然环境中的蛋白，例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。
术语“融合蛋白”指具有来源于两种或多种蛋白的氨基酸序列的蛋白或多肽。融合蛋白也可包括氨基酸部分之间的来源于单独蛋白的连接区或氨基酸的接头。
术语“IL4-IL10融合蛋白”指至少包含可选地通过接头彼此偶联的IL4和IL10的融合多肽。融合蛋白可以包括另外的多肽序列，例如信号序列、组氨酸标签、抗体Fc片段等。
如本文使用的“接头”指用于偶联两个蛋白质或多肽如IL4和IL10的多肽。接头通常为氨基酸的延伸，例如主要是甘氨酸和/或丝氨酸。在实施方式中，接头为具有直到100个核苷酸长度的氨基酸的延伸，例如约2、5、7、10、15个氨基酸，直到约15、20、25、30、35、50、75或100个氨基酸，优选主要包括丝氨酸和甘氨酸残基。
如本文使用的“白细胞介素10”(IL10)指任何哺乳动物的IL10，比如人IL10、小鼠IL10、或其活性种类或等位基因变异体、片段或衍生物。
如本文使用的“白细胞介素4”(IL4)指任何哺乳动物的IL4，比如人IL4、小鼠IL4、或其活性种类或等位基因变异体、片段或衍生物。
如本文使用的术语“二聚体”指其中两个多肽通过共价或非共价相互作用稳定地结合的分子。术语“同型二聚体”指其中两个相同的多肽通过共价或非共价相互作用稳定地结合的分子。在合适的实施方式中，它们通过非共价相互作用稳定地结合。
关于本发明的融合蛋白(或其变异体或片段)的“功能性的”指同时显示出IL4和IL10功能性的性能。用于IL4和IL10的功能性测定为全血中脂多糖(LPS)诱发的细胞因子释放(例如IL1、IL6、IL8、TNFα)。
术语“基因”指包含区域(转录区)的DNA序列，其在细胞中被转录成RNA分子(例如mRNA)，可操作地连接合适的调控区(例如启动子)。因此，基因可以包括几个可操作地连接的序列，例如启动子、包含例如参与翻译起始的序列的5’前导序列、(蛋白)编码区(cDNA或基因组DNA)、内含子、及包含例如转录终止位点的3’非翻译序列。
“3’UTR”或“3’非翻译序列”(通常也称为“3'非翻译区”或“3'端”)指在基因的编码序列下游存在的核酸序列，其包括例如转录终止位点和(在大部分但非全部的真核mRNA中)多腺苷酸化信号(比如，例如AAUAAA或其变体)。在转录终止之后，可以切除所述多腺苷酸化信号下游的mRNA转录产物并且加上多腺苷酸的尾，该尾参与所述mRNA到细胞质(其中进行翻译)的转运。
“基因的表达”指其中可操作地连接合适的调控区(特别是启动子)的DNA区域被转录成具有生物学活性的RNA，所述RNA能够被翻译成生物学活性蛋白或肽(或活性肽片段)的过程。此外，“多肽的表达”是指其中mRNA被翻译成可以或不可以被分泌的蛋白产物的过程。
“转录调控序列”在本文中被定义为能够调节与所述转录调控序列可操作地连接的(编码)序列的转录速率的核酸序列。因此，如本文定义的转录调控序列将包括启动转录(启动子元件)、维持和调节转录(包括例如衰减子或增强子)必需的所有序列元件。尽管提及的主要是编码序列的上游(5’)转录调控序列，但是该定义也包括在编码序列的下游(3’)存在的调控序列。
如本文使用，术语“启动子”指起控制一个或多个基因转录作用的核酸片段，其位于所述基因转录起始位点的转录方向上的上游，并且结构特征为存在DNA依赖的RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其它的DNA序列：包括，但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和活化蛋白结合位点、以及本领域普通技术人员已知的直接地或间接地调节从该启动子转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是受生理调控的启动子(例如通过外部应用某些化合物)或受发育调控的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中有活性。
如本文使用，术语“可操作地连接”指多核苷酸元件在功能关系方面的连接。当一个核酸与另一个核酸序列具有功能联系时该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子，更确切地说转录调节序列影响编码序列的转录，则它们可操作地连接编码序列。可操作地连接指被连接的DNA序列通常是连续的。
“核酸构建体”或“载体”在本文可理解为使用重组DNA技术产生并用于把外源DNA递送至宿主细胞内的人造核酸分子。载体通常包括有利于将其用于分子克隆的其它遗传元件，比如，例如可选择标记、多克隆位点等(见下文)。
“严格杂交条件”可以用于鉴定核苷酸序列，该核苷酸序列与指定核苷酸序列基本相同。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境中有差异。通常，选择在确定的离子强度和pH下特定序列的热熔点(Tm)低约5℃的严格条件。Tm是(在确定的离子强度和pH下)50％的靶向序列与完全匹配探针杂交的温度。选择通常的严格条件，其中在pH7下盐浓度为约0.02摩尔，温度为至少60℃。降低盐浓度和/或升高温度提高严格度。RNA-DNA杂交(使用例如100nt的探针的RNA印迹法)的严格条件为例如包括在63℃下在0.2×SSC中洗涤20分钟，至少一次的条件或等效的条件的那些。DNA-DNA杂交(使用例如100nt的探针的DNA印迹法)的严格条件为例如包括在至少50℃(通常约55℃)的温度下在0.2×SSC中洗涤20分钟，至少一次(通常2次)的条件或者等效的条件的那些。也参见Sambrook等(1989)和Sambrook与Russell(2001)。
可通过使用全局或局部比对算法比对两个肽或两个核苷酸序列而确定“序列同一性”和“序列相似性”。然后，当序列(当通过例如使用默认参数的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时)共有至少某一最小百分数的序列同一性(如下文中定义)时，那么它们可以被称为是“基本相同的”或“基本相似的”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法对两个序列进行全长比对，使匹配的数目最大化并使空位的数目最小化。通常使用GAP的默认参数，其空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，而对于蛋白，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS89,915-919)。可以通过使用计算机程序(例如GCGWisconsin Package(版本10.3，可从Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA92121-3752USA获得)或版本2.10.0的EmbossWin(使用程序“needle”))确定序列比对和序列同一性百分数得分。或者，可以通过使用例如FASTA、BLAST等算法搜索数据库确定相似性或同一性的百分数。优选地，序列同一性指序列全长上的序列同一性。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”或“转化细胞”是指将至少一种核酸分子(特别是包含编码所需蛋白的核酸分子)引入而产生的新个体细胞(或生物体)的术语。宿主细胞优选地为植物细胞或细菌细胞。所述宿主细胞可以包含作为染色体外(附加体)复制分子的本发明的核酸分子或载体，或者更优选地包含整合进入宿主细胞的基因组的本发明的核酸分子或载体。
术语“可选择标记”是本领域普通技术人员熟悉的术语，并且在本文用于描述任何遗传实体，当其被表达时可用于选择包含所述可选择的标记的一个或多个细胞。可选择的标记基因产物赋予例如抗生素抗性或营养需求。
术语“生物学半衰期”指生物系统(例如动物或人体内的循环系统)中的物质(例如蛋白)的量由于生物进程(例如肾清除和降解)而减少至其值的一半所需要的时间。
在本文及其权利要求书中，动词“包括”及其词形变化形式以其非限制意义使用，意味着包括该词之后的项目，但是并不排除没有明确提及的项目。其还涵盖更限制性动词“由...组成”。另外，用不定冠词“一个”或“一种”提及某一要素时，并不排除存在超过一种所述要素的可能性，除非上下文中清楚地要求有且仅有一种该要素。因此，不定冠词“一个”或“一种”通常指“至少一种”。还应理解的是，当本文中提及“序列”时，通常是指具有某条亚单元(例如氨基酸)序列的实际物理分子。
本发明的蛋白、核酸序列、载体和宿主细胞
现在，本发明人设计了新的“单分子治疗”。特别地，本发明人提供融合蛋白，其包含可选择地通过接头物理融合在一起的IL4蛋白和IL10蛋白。特别地，发现本发明的融合蛋白相对于其单独对应物，即分别的IL4和IL10，具有更好的生物活性(例如，抑制TNFα和IL1β)。特别地，发现本发明的融合蛋白比单独的细胞因子(两种都＜20kD)显著地更大(～35kD)。本发明人还出人意料地发现融合蛋白本身形成二聚体(通过融合蛋白的IL10部分)，因此提供具有甚至更大分子量(～70kD)的融合蛋白。与单独的细胞因子相比，这样的分子量及导致的分子半径的增加不仅显著地延长IL4-IL10融合蛋白在循环中的生物学半衰期，而且将其在炎症位点的生物利用度提高至前所未有的水平。本发明的融合蛋白还极大地延长IL4和IL10之间发生协同作用的治疗时间窗，因为该融合蛋白在炎症位点输送两种细胞因子，其中它们可以发挥在彼此存在时等时间量的它们的作用。而且，出人意料地发现本发明的融合蛋白也发挥双重治疗作用。特别地，当系统给药时，IL4-IL10融合蛋白显示出起抗炎剂作用，而当鞘内给药时，其起抗痛觉过敏剂作用。
在本发明的一个实施方式中，提供了IL4-IL10融合蛋白的核酸序列和氨基酸序列(包括其变异体和片段)。IL4-IL10融合蛋白、以及其功能片段和变异体显示出IL4活性以及IL10活性。
在一个方面，提供包括IL4和IL10的融合蛋白。所述融合蛋白包括IL4蛋白、或其变异体或片段。IL4蛋白优选地为哺乳动物IL4蛋白，例如人类IL4或小鼠IL4。IL4的一个氨基酸序列在SEQ ID NO:1中说明。IL4的变异体包括例如与SEQ IDNO:1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的例如100％的氨基酸序列同一性的蛋白，优选地在全长上。氨基酸序列同一性优选地通过使用如上定义的Needleman和Wunsch算法和GAP默认参数成对比对确定。变异体也包括具有IL4活性的蛋白，其通过从具有氨基酸序列SEQ IDNO:1的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的方式衍生。优选地，这样的蛋白包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或直至约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸取代、缺失或插入。
所述融合蛋白进一步包括IL10蛋白、或其变异体或片段。IL10蛋白优选地为哺乳动物IL10蛋白，例如人IL10或小鼠IL10。一个表示IL10的氨基酸序列在SEQID NO:2中说明。IL10的变异体包括例如与SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更大，例如100％的氨基酸序列同一性的蛋白，优选地在全长上。氨基酸序列同一性优选地通过使用如上定义的Needleman和Wunsch算法和GAP默认参数成对比对确定。变异体也包括具有IL10活性的蛋白，其是通过具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入衍生的。优选地，这样的蛋白包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或直至约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸取代、缺失或插入。
融合蛋白中的IL4和IL10可以或不可以通过接头连接。另外的氨基酸序列可以存在于本发明的融合蛋白的N-和/或C-末端，例如便于纯化。例如，组氨酸标签可以存在于C-或N-末端，以便于纯化。或者，本发明的IL4-IL10融合蛋白可选择地可包括另外的蛋白部分，比如能够靶向的部分，例如包含一个或多个抗体Fc区域的蛋白部分。
IL4可以位于IL10的N-末端，或者可以位于IL10的C-末端。在优选的实施方式中，IL4分子位于IL10分子的N-末端。发现后面的融合蛋白显示出比其中IL4分子位于IL10分子的C末端的IL4-IL10融合蛋白更高的特定活性(数据没有显示)。
IL4-IL10融合蛋白可以其单体形式存在，在这种情形下，其具有约35kDa的kDa，或者其可以为二聚体IL4-IL10融合蛋白，即两个IL4-IL10融合蛋白可以彼此非共价结合，在这种情形下，其具有约70kDa的kDa。
在实施方式中，本发明的融合蛋白基本上由可选择地通过接头连接的IL4和IL10组成。
在实施方式中，本发明的融合蛋白之内的IL4和IL10部分都具有活性，并且能够给细胞发信号，以抑制至少一种炎症细胞因子或介质产生，例如IL1β、IL6、IL8、TNFα。优选地，抑制至少TNFα、IL6和IL8。
在实施方式中，所述融合蛋白抑制细胞因子(例如TNFα、IL1β、IL6、IL8及其它炎症细胞因子)的产生，同时它们诱导抑制分子的分泌，例如IL1受体拮抗剂和可溶性TNF受体(通过炎症)及内毒素刺激的其它细胞、其它Toll-样受体(TLR)激动剂或其它刺激剂。
在实施方式中，本发明的融合蛋白通过包括内毒素、其它TLR、或其它刺激物刺激的炎症细胞、内皮细胞和其它细胞抑制粘附分子的表达。
在实施方式中，所述融合蛋白通过内毒素、其它TLR激动剂、或其它刺激物刺激的内皮细胞、炎症细胞及其它细胞抑制组织因子的表达。
在实施方式中，本发明的融合蛋白通过内毒素、其它TLR激动剂、或其它刺激物刺激的炎症细胞及其它细胞抑制氧自由基的生成。
在实施方式中，在存在或不存在自体抗原或非自体抗原、超级抗原刺激的抗原呈递细胞下，所述融合蛋白抑制IFNγ-和IL17分泌性Th1和Th17细胞的活性，并且诱导或维持产生的FoxP3的抑制性T细胞(CD25+)、分泌TGFβ的Th2、Tr1和Th3细胞的体外表达，所述超级抗原包括葡萄球菌肠毒素B(SEB)或有丝分裂原(例如包括CD3、CD28、植物凝集素(PHA))或佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)。
在实施方式中，融合蛋白抑制活化Fcγ受体的表达，同时它们诱导抑制性Fcγ受体的表达，阻止细胞(例如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)被包含IgG-的免疫复合物活化。
在合适的实施方式中，本发明的融合蛋白以同型二聚体形式存在。
在一个实施方式中，其具有大于60kDa的分子量。
可以通过对本领域技术人员来说常规的技术制备本发明的融合蛋白。例如，可以通过使用提供用于在培养基中由传代细胞系产生重组融合蛋白的技术制备。例如，可以使用重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生本发明的融合蛋白。
例如，为了表达本发明的融合蛋白，可以通过标准分子生物学技术制备编码本发明的融合蛋白的核酸分子。本发明的核酸分子优选地可操作地连接转录调控序列，比如启动子和可选择的3’非翻译区。本发明的核酸分子可以插入载体(例如表达载体)中，使得所述基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。选择表达载体和转录调控序列以与所使用的表达宿主细胞相配。编码本发明的融合蛋白的核酸分子可以通过常规方法插入表达载体中。本发明的核酸分子或载体可以进一步包括编码信号肽的核苷酸序列，其可以促进宿主细胞分泌融合蛋白。所述编码信号肽的核苷酸序列可以可操作地连接本发明的核酸分子。优选地，所述信号肽可操作地连接到本发明的融合蛋白的氨基末端，因而编码所述信号肽的核苷酸序列可以位于编码本发明的融合蛋白的核酸分子的5’。信号肽可以是细胞因子信号肽或来自非细胞因子蛋白的信号肽。启动子可以是组成型或诱导型。载体可以包括用于选择带有载体的宿主细胞的可选择标记。当载体为可复制载体时，载体可以包括复制起点。
可以通过化学合成从头合成根据本发明的融合蛋白(使用例如，比如AppliedBiosystems提供的肽合成仪)，或者可以通过表达编码所述融合蛋白、片段或变异体的核酸序列由重组宿主细胞产生。变异体和片段优选地具有功能性，即具有IL4和/或IL10活性，优选IL4和IL10活性。
可以使用常规方法确定IL4和IL10以及IL4-IL10融合蛋白的抗炎活性及由此的官能性。例如，IL4和IL10以及IL4-IL10融合蛋白的功能性的合适的测定是在全血中脂多糖(LPS)诱导的细胞因子释放(IL1b、IL6、IL8、TNFα)，例如如在实施例5中阐述的。
在另一个方面，提供编码任一种上述融合蛋白的分离的核酸序列，比如cDNA、基因组DNA和RNA序列。由于遗传密码的简并性，多种核酸序列可以编码相同的氨基酸序列。编码本发明的融合蛋白的任一种核酸序列在本文中都称为“IL4-IL10融合蛋白编码核酸序列”。提供的核酸序列包括重组、人工或合成的核酸序列。应当理解，当提到RNA而描述序列描述为DNA序列时，RNA分子的实际碱基序列相同，差别为胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)替代。本发明的核酸序列特别地用于表达本发明的IL4-IL10融合蛋白，用于这些蛋白的产生或基因治疗目的。
编码本发明的IL4-IL10融合蛋白的核酸序列，特别是DNA序列，可以插入表达载体中以产生(高的量)的IL4-IL10融合蛋白。合适的载体包括，不限于直链核苷酸、质粒、噬菌粒、粘粒、RNA载体、病毒载体等。病毒载体的非限制性实例包括逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调控序列包括病毒元件，其在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白表达，例如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。备选地，可以使用非病毒调控序列，比如泛素启动子。
除了编码IL4-IL10融合蛋白的核酸分子和调控序列之外，本发明的重组表达载体可以带有另外的序列，比如调节宿主细胞中载体的复制(例如复制起点)，和可选择标记基因。所述可选择标记基因有助于选择所述载体已经导入其中的宿主细胞(参见，例如Axel等的US4,399,216、US4,634,665和US5,179,017)。例如，可选择标记基因通常赋予载体导入其中的宿主细胞中对药物(例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。优选的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在dhfr-宿主细胞中用甲氨蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。最后，除了编码本发明的融合蛋白的核酸序列，重组表达载体可以包含编码糖基转移酶的基因。
在另一个方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列的宿主细胞，或包含本发明的核酸序列的核酸构建物或载体。宿主细胞可以是任何宿主细胞。宿主细胞可以选自原核细胞和真核细胞。宿主细胞也可以是细胞系，比如原核细胞系或真核细胞系。宿主细胞优选地为动物细胞或细胞系，比如哺乳动物细胞或细胞系。
在一个实施方式中，本发明的融合蛋白在真核细胞(例如如哺乳动物宿主细胞)中表达。用于表达本发明的重组IL4-IL10融合蛋白的优选的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞(包括dhfr-CHO细胞，在(Urlaub等，1980)中描述，使用DHFR可选择标记，NS/0骨髓瘤细胞、COS细胞、HEK293细胞和SP2.0细胞。当包含编码IL4-IL10融合蛋白的核酸序列的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞中时，可以通过培养宿主细胞足够长的时段类产生本发明的融合蛋白，以使融合蛋白在宿主细胞中表达、或更优选地使融合蛋白分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中。本发明的融合蛋白可以从宿主细胞在其中生长的培养基中回收，或者可以使用标准蛋白纯化方法从培养基纯化。
备选地，编码本发明的融合蛋白的核酸序列可以在其它表达系统中表达，所述其它表达系统包括原核细胞，比如微生物，例如大肠杆菌、藻类、以及昆虫细胞。而且，本发明的融合蛋白可以在转基因非人类动物(比如来自绵羊和兔子的奶中或来自母鸡的蛋)或转基因植物中产生。
将本发明的核酸序列引入宿主细胞中可以通过本领域已知的任何标准技术进行。对于本发明的融合蛋白的表达，可以通过标准技术将编码融合蛋白的表达载体转染到宿主细胞中。各种形式的术语“转染”旨在涵盖用于将外源DNA引入到原核或真核宿主细胞中通常使用的各种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、脂质体转染和冻干方法转染等。分泌本发明的融合蛋白的细胞系可以通过测定培养基上清液中融合蛋白的存在来鉴定。优选的筛选过程包括两个顺序步骤，第一个是鉴定分泌融合蛋白的细胞系，第二个是测定融合蛋白的性质比如融合蛋白抑制LPS或其他Toll-样受体激动剂、糖基化模式等刺激血细胞产生细胞因子的能力。
对于在宿主细胞中的最佳表达，可以通过调整在宿主细胞基因中最优选的密码子用法对IL4-IL10融合蛋白编码DNA序列进行密码子-最优化。用于修饰宿主细胞优选的密码子用法的一些技术可以在专利和科学文献中找到。密码子用法修饰的精确方法对于本发明不是关键性的。
在本发明的另一个实施方式中，提供用于检测IL4-IL10融合蛋白编码DNA或RNA序列的PCR引物和/或探针和试剂盒。扩增来自样品的IL4-IL10融合蛋白编码DNA的简并或特定PCR引物对可以是合成的(参见Dieffenbach and Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,andMcPherson at al.(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,First Edition,Springer Verlag,Germany)。例如，可以使用IL4-IL10融合蛋白编码核酸序列(或互补链)的9、10、11、12、13、14、15、16、18或更多个邻接核苷酸的任何延伸作为引物或探针。同样地，可以使用IL4-IL10融合蛋白编码核酸序列的DNA片段作为杂交探针。IL4-IL10融合蛋白编码核酸序列的检检测剂盒可以包括对IL4-IL10融合蛋白编码核酸序列特异性的引物，和/或对IL4-IL10融合蛋白编码核酸序列特异性的探针，及使用所述引物或探针特异性检测样品中IL4-IL10融合蛋白编码核酸序列的相关试验设计。这样的检测试剂盒可以例如用于测定宿主细胞是否已经被本发明的特定IL4-IL10融合蛋白编码核酸序列所转化。因为遗传密码的简并性，某些氨基酸密码子可以被其它氨基酸密码子替代而不会改变蛋白的氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种产生IL4-IL10融合蛋白的方法，所述方法包括步骤：在允许产生IL4-IL10融合蛋白的情况下，培养本发明的宿主细胞；和可选择地，回收该融合蛋白。本领域技术人员能够按常规选择允许产生的IL4-IL10融合蛋白的条件。另外，本领域技术人员能够使用常规方法回收产生的融合蛋白，所述常规方法包括而不限于色谱方法(包括而不限于尺寸排阻色谱、疏水性相互作用色谱、离子交换色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱、金属结合等)、免疫沉淀反应、HPLC、超离心法、沉淀和差别性溶解、及萃取。如上所述，可以通过加入例如组氨酸标签到融合蛋白而促进融合蛋白的回收或纯化。
药物组合物
在一个方面，本发明涉及包括本发明的融合蛋白和药学可接收载体的药物组合物。
可以根据常规技术(例如，如在Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第19版，Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995中描述)将所述药物组合物与药学可接受载体或稀释剂以及任何其它已知的助剂和赋形剂配制在一起。
术语“药学可接受载体”指天然无毒性和非治疗性的载体或赋形剂。这样的赋形剂的实例为但不限于盐水、林格溶液、葡萄糖、溶液和Hank's溶液。也可以使用非水赋形剂，例如不挥发油和油酸乙酯。优选的赋形剂为5％的葡萄糖盐水溶液。所述赋形剂可以包含少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质，包括缓冲剂和防腐剂。
药物组合物可以通过任何合适的途径和方式给药。如本领域技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据期望的结果而变化。
根据本发明的药物组合物可以根据用于通过任何途径给药的常规方法配制，所述途径比如口服、局部、肠胃外、舌下、透皮或吸入。所述组合物可以是片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、锭剂、乳霜或液体制剂(例如口服或无菌肠胃外溶液或悬浮液的形式，或者是喷雾剂、气雾剂或其它常规吸入方法)的形式。
本发明的药物组合物包括适于口服、鼻腔、局部(包括含服和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外给药的那些。
在实施方式中，胃外给药所述药物组合物肠。
如本文使用的术语“肠胃外给药”和“肠胃外施用”指不同于肠内和局部给药的给药方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内注射、肌内注射、动脉内注射、鞘内注射、囊内注射、眶内注射、心内注射、真皮内注射、腹膜内注射、经气管注射、皮下注射、表皮下注射、关节内注射、囊下注射、蛛网膜下注射、脊柱内注射、硬膜外和胸骨内注射及输注。
在实施方式中，药物组合物是通过静脉内或皮下注射或输注给药。
在实施方式中，本发明的融合蛋白通过皮下注射以结晶形式给药。
如本文使用的“药学可接受载体”包括任何和所有的生理学相容的的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧剂和吸收延迟剂等。
药学可接受载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时配制无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。本领域所熟知使用用于药物可接受活性物质的这样的介质和试剂。除非在任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的情况下，考虑其用于本发明的药物组合物中。优选地，所述载体适于肠胃外给药，例如静脉内或皮下注射或输注。
药物组合物通常在制备和贮存条件下必须是无菌且稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳剂、脂质体、或适于高药物浓度的其它有序结构。可以应用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)、及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。例如，可以通过使用包衣材料(例如卵磷脂、在分散液的情况下通过保持期望的粒径并通过使用表面活性剂来保持合适的流动性。
可以通过将延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)包含在组合物中得到可注射药物的延长吸收。
可以通过将需要量的活性化合物加入具有例如如上述列举的一种成分或多种成分组合(根据需要)的合适溶剂中，接着过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物引入到包含碱性分散介质和所需其它成分(例如来自上述列举的那些)的无菌载体中制备分散液。在用于配制无菌可注射溶液的无菌粉末的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其得到活性成分与来自其之前无菌滤过的溶液的任何另外期望成分的粉末。
根据给药途径，活性化合物，即IL4-IL10融合蛋白可以涂布在材料中以保护其不受酸及可灭活该化合物的其它自然条件的作用。例如，可以将化合物在合适的载体(例如脂质体)中给药至受试者。脂质体包括水包油包水型CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等，1984)。
本发明的融合蛋白也可以用防止其快速释放的载体配制，比如控释剂型，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，比如乙烯-乙酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。本领域技术人员通常已知配制这样的制剂的方法。参见，例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可以调整剂量方案，以提供最佳期望的响应(例如治疗反应)。例如，可以给药单次推注(bolus)，可以随时间推移给药一些分剂量，或者可以如按照治疗情形的紧迫性指示的相应地减少或增加剂量。为了给药方便和剂量均匀，特别有益的是配制剂量单位形式的肠胃外组合物。如本文使用的剂量单位形式指适合单剂量给予将被治疗受试者的物理上分开的单位；每个单位包含与所需药用载体一起产生所需治疗效果而计算的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由下述确定且直接取决于下述：(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域配制这样的活性化合物以用于个体敏感性治疗的固有限制。
为了获得对于具体患者、组合物和给药方式实现期望治疗反应的有效而对患者无毒性的IL4-IL10融合蛋白的量(“有效量”)，本发明的药物组合物中IL4-IL10融合蛋白的实际剂量水平可以变化。所选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括本发明施用的具体组合物的活性、给药途径、给药时间、排泄速率、治疗的持续时间、与施用的具体组合物共同使用的其它药物化合物和/或物质、待治疗患者的年龄、性别、体重、病症、总体健康状态和之前病史、以及医学领域中已知的相似因素。
在一个实施方式中，本发明的IL4-IL10融合蛋白可以作为静脉内注射或短期输注给予，在另一个实施方式中，它们通过长期的缓慢连续输注给药，例如超过24小时，以便减少毒副作用。
在再一个实施方式中，本发明的IL4-IL10融合蛋白可以作为维持治疗给药，比如例如每周一次，给药6个月或更长时间。
治疗用途
在进一步的方面，本发明涉及用作药物的本发明的融合蛋白或包括该融合蛋白的药物组合物。
在一个方面，本发明涉及用于预防或治疗骨关节炎的本发明的融合蛋白或包含该融合蛋白的药物组合物。特别地，发现本发明的融合蛋白具有软骨保护活性。因此，该融合蛋白可用于预防和治疗软骨破坏，特别是在骨关节炎中。此外，发现在犬科动物骨关节炎模型中，与没有给予本发明的融合蛋白的狗相比，给予本发明的融合蛋白的狗经历的疼痛显著地更小。因而，本发明的融合蛋白可以特别地用于预防或治疗骨关节炎(预防或治疗软骨退化)与其相关慢性疼痛。
在进一步的方面，本发明涉及本发明的融合蛋白或包括该融合蛋白的药物组合物，其用于预防或治疗骨关节炎、慢性疼痛、以局部或全身炎症为特征的病症、免疫激活和/或淋巴细胞增生。
在实施方式中，所述以局部或全身炎症、免疫激活和/或淋巴组织增生为特征的病症选自：败血症、成人呼吸窘迫综合征、同种异体移植和异种移植、皮炎、炎性肠病、结节病、过敏症、银屑病、强直性脊椎脊柱炎、例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的自身免疫疾病、肾小球肾炎、免疫复合物诱发的及其它形式的血管炎、多发性硬化症、舍格伦病、痛风、例如非霍奇金淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞性白血病的淋巴组织增生疾病、烧伤、多发性创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、局部缺血-再灌注损伤、体内给药细胞因子或治疗性单克隆抗体诱发的毒性、慢性疼痛综合征和神经性和/或炎性疼痛组成的组中。
在实施方式中，所述病症以疼痛为特征，并且可选自炎性疼痛和神经性疼痛。
在另一方面，本发明涉及本发明的融合蛋白，用于预防或治疗例如人类的哺乳动物中IL10指征的临床病症。
在进一步的方面，本发明涉及本发明的融合蛋白，用于预防或治疗例如人类的哺乳动物中IL4指征的临床病症。
在本发明的实施方式中，本发明的融合多肽用于预防或治疗其中抑制促炎细胞因子及其它炎症介质的产生是有益的疾病或病症。
在另一个方面，本发明涉及一种用于预防或治疗其中抑制促炎细胞因子及其它炎症介质的产生具有有益作用的疾病或病症的方法，包括向需要它的受试者给药有效量的本发明的融合蛋白的步骤，以治疗或预防所述疾病或病症。
在一个实施方式中，这样的疾病或病症为通过产生促炎细胞因子(例如TNF、IL1β、IL6)、趋化因子(例如IL8)及其它炎症介质的产生介导的炎性疾病。
根据一个实施方式，本文教导的融合蛋白可用于抑制细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、T-淋巴细胞及其它细胞)产生和释放细胞因子及其它炎症介质。因此，本发明的融合蛋白可用于配制通过抑制体内这些细胞释放细胞因子及其它炎症介质减弱炎症反应的药物。本发明的融合蛋白可以独立的药物使用或与其它药物组合使用。
治疗(预防性或治疗性)可由肠胃外，优选静脉内、肌内、鞘内、硬膜外(epidurally)、脊柱内或皮下给药本发明的融合蛋白组成。然而，对于包含上述列举的融合蛋白的药物组合物，也可以使用如上所述其它给药途经。剂量和给药方案可以取决于所针对炎症细胞因子的产生和释放的抑制程度。通常，给予融合蛋白的量的范围为0.5μg至1mg/kg体重。当以生物样品给药时，可以通过测量循环细胞因子(IL10、IL4)的量测定或调节剂量。
对于肠胃外给药，融合蛋白优选地与药学可接收肠胃外载体混合配制成可注射形式。这样的载体是本领域熟知的，实例包括盐水、葡萄糖溶液、林格氏溶液和包含少量人血清白蛋白的溶液。
通常，本发明的融合蛋白可以以约50μg至约100mg/ml的浓度配制在这样的载体中。在本发明的一个实施方式中，通过静脉内注射给药融合蛋白。
其它给药详细内容在上述关于包括本发明的融合蛋白的药物组合物部分中阐述。
基因治疗
本发明的核酸构建物或载体可以用作用于治疗上述列举的病症的基因治疗试剂。在本发明的一个实施方式中，使用腺病毒相关病毒作为基因治疗载体。
因而，本发明的一个方面涉及如上所述的基因治疗载体，用于预防或治疗骨关节炎，慢性疼痛，以局部或全身炎症、免疫激活和/或淋巴组织增生为特征的病症，优选地其中所述以局部或全身炎症、免疫激活和/或淋巴组织增生为特征的病症选自：败血症、成人呼吸窘迫综合征、同种异体移植和异种移植、皮炎、炎性肠病、结节病、过敏症、银屑病、强直性脊椎脊柱炎、例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的自身免疫疾病、肾小球肾炎、免疫复合物诱发的及其它形式的血管炎、多发性硬化症、舍格伦病、痛风、例如非霍奇金淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞性白血病的淋巴组织增生疾病、烧伤、多发性创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、局部缺血-再灌注损伤、及体内给药细胞因子或治疗性单克隆抗体诱发的毒性、慢性疼痛综合征和神经性和/或炎性疼痛组成的组中。
现在，本发明将参照给出特别优选的实施方式的下述实施例来阐述。然而，应当注意，这些实施方式是示例性的，而不能解释为以任何方式限制本发明。
序列表
SEQ ID NO:1–IL4的氨基酸序列
HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS
SEQ ID NO:2–IL10的氨基酸序列
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO:3–接头的氨基酸序列
GSGGGGSGT
SEQ ID NO:4–IL4-IL10融合蛋白的氨基酸序列(接头序列为下划线的；IL4
位于IL10的N-末端)
HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSSGSGGGGSGTSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
附图说明
图1显示从用IL4-IL10融合蛋白转染的HEK293细胞获得的IL4-IL10融合蛋白的水平。根据制造商的说明，在夹心ELISA测定中检测HEK293细胞上清液的IL4(A)和IL10(B)，所述HEK293细胞被载有IL4-IL10融合蛋白的转基因的pUPE表达载体所转染。结果表示为光密度(OD)对比培养物上清液的稀释度。
图2显示通过交叉ELISA(cross-ELISA)进行IL4-IL10融合蛋白的免疫化学鉴别。在交叉ELISA中，用抗-IL4(A)或抗-IL10单克隆抗体(用作捕获抗体)(B)、及生物素化的抗-IL10(A)或抗-IL4(B)单克隆抗体(用作检测抗体)检测HEK293细胞的上清液，所述HEK293细胞被携带IL4-IL10融合蛋白的转基因的pUPE表达载体所转染。重组IL10作为阴性对照检测。结果显示通过它的IL10部分(图A)及它的IL4部分(图B)都可以检测IL4-IL10蛋白。
图3显示鉴别HEK293细胞上清液中IL4-IL10融合蛋白的蛋白质印迹。在SDS-PAGE上进行从HEK293细胞获得的10微升量的上清液的电泳分析，所述HEK293细胞被编码IL4-IL10融合蛋白的cDNA所转染。用标记的抗-IL4抗体(A)或标记的抗-IL10抗体(B)显色印迹。作为对照，使用重组IL4和IL10。泳道1＝分子标记物，泳道2＝未处理的IL4-IL10融合蛋白，泳道3＝去糖基化的IL4-IL10融合蛋白，泳道4＝IL4，及泳道5＝IL10。
图4显示鉴别IL4-IL10融合蛋白聚合的高效尺寸排阻色谱测定的结果。在高效液相色谱系统上运行IL4-IL10融合蛋白、重组IL4和重组IL10的样品。使用甲状腺球蛋白、牛血清蛋白(66KD，左边的第一个虚线)、碳酸酐酶(30KD，左边的第二个虚线)、肌球蛋白(18KD，左边的第三个虚线)和核糖核酸酶(13.7KD，左边的第四个虚线)的蛋白质混合物校准柱。使用这些标记物，通过比较保留时间估计各级分中蛋白质的分子量。用ELISA测量各批(runs)的级分中IL4和IL10含量，并且表示为ng/ml。IL4洗脱为明显的单体，IL10为明显的二聚体，而IL4-IL10融合蛋白的洗脱图案显示为明显的二聚体。
图5显示IL4-IL10融合蛋白抑制全血培养物中LPS-诱导的细胞因子释放。将来自健康志愿者的肝素化血液在培养基中以1:10稀释，并且在多种浓度的IL4-IL10融合蛋白的存在下，以10ng/mL的浓度用LPS培养。用ELISA测量上清液中的TNFα。图A显示IL4-IL10融合蛋白抑制TNF产生的能力(结果表示为抑制％)。注意到当检测类似体积的不含IL4-IL10融合蛋白的培养基时，没有看到TNF产生的抑制。图B显示LPS-诱导的TNFα(左图)、IL6(中图)和IL8(右图)产生的抑制(在Y轴中给出由上清液测量的TNFα、IL6和IL8的浓度)。以100ng/mL检测IL4-IL10融合蛋白，并且与在每种50ng/mL的最终浓度的重组IL4和IL10的混合物的作用进行比较。图C显示相对于仅加入培养基(不含抗体)，当加入抗IL4受体(抗-IL4R)和IL10受体(抗-IL10R)两者的受体阻断抗体两种时，完全消除了IL4-IL10融合蛋白对LPS-诱导的IL6产生的作用。注意到当加入抗IL4受体(抗-IL4R)或IL10受体(抗-IL10R)的受体阻断抗体(而不是两者)时，仅仅部分地消除了IL4-IL10融合蛋白的作用。
图6显示IL4-IL10融合蛋白对Th1和Th17细胞因子产生的强抑制作用与超级抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)-活化的单核细胞培养物中持续调控的(FoxP3+)T-细胞百分数相关。骨髓细胞和B细胞的活化关键取决于促炎症反应Th1和Th17及调控FoxP3-表达的CD4T细胞的平衡。为了评价IL4-IL10融合蛋白对T细胞活化的作用，从健康供体的外围血液(PBMC)分离单核细胞。通过在存在或不存在SEB(1ng/mL)和/或IL4-IL10融合蛋白下，PBMC(5.105/ml)处理3天诱导T细胞活化。在该培养期增殖(图A)后，测量FoxP3表达和促炎症反应T-细胞细胞因子产生(图B)。SEB诱导与FoxP3表达的上调(图B)相关的显著增殖(图A)。增殖(图A)和FoxP3表达(图B)几乎都不受IL4-10融合蛋白的影响。相反，Th1和Th17细胞因子IFNγ(左图，图C)、IL17(中图，图C)和TNFα(右图，图C)全都被IL4-IL10融合蛋白强有力地减少。总之，这证实IL4-IL10融合蛋白强有力地改变抑制性调控CD4T细胞和促炎症反应Th1和Th17细胞之间的平衡。
图7显示在葡萄球菌肠毒素B(SEB)-活化单核细胞培养物中IL4-IL10融合蛋白对单核细胞上IgG受体表达的稳定作用。IgG(FcγRs)的活化受体和抑制受体之间的平衡在免疫复合物介导的骨髓细胞和淋巴细胞的活化方面起关键作用。为了评价IL4-IL10融合蛋白对单核细胞上FcγR表达的作用，从健康供体分离来自外周血的单核细胞(PBMC)。通过在存在或不存在超级抗原SEB(0.1ng/mL)和/或IL4-IL10融合蛋白下处理PBMC(5.105/ml)2天来诱导T-细胞依赖性单核细胞活化。在该培养期之后，测量FcγRs表达。IL10上调FcγRI、FcγRIIa和Fcγriii的表达。与不存在细胞因子下培养的细胞相比，单独的IL4显示出这些活化的FcγRs的表达稍微降低。IL4和IL10的组合与IL4-IL10融合蛋白使FcγRI和FcRγIIa的表达正常化。测量IL4与IL10的组合或IL4-IL10融合蛋白在FcγRIII表达方面的微小增加，尽管与单独的IL10诱导该受体的上调相比可忽略。单独的IL4显示出FcγRIIb的表达微小降低。IL4与IL10的组合和IL4-IL10融合蛋白不会改变抑制性FcγRIIb的表达。同时，该结果证实IL4-IL10融合蛋白稳定活化FcγRs的表达，其依次可以抑制免疫复合物-诱发的免疫激活。
图8显示IL4-IL10融合蛋白对软骨蛋白多糖周转(turnover)的剂量-响应作用。将5个供体的软骨移植物暴露于5个供体(n＝5)的50％v/v血液4天。在血液暴露期间，加入0.0001至100ng/mL浓度的IL4-IL10融合蛋白。在12天的恢复期之后，测定蛋白多糖的合成速率(A)、释放(B)和含量(C)。当与对照软骨相比时由于血液暴露蛋白多糖的合成速率和含量显著地减小，而蛋白多糖的释放增加(由星号表示；p<0.05)。散列标签指示与50％v/v血液相比具有统计学显著性差异(p<0.05)，而A和B中的虚线突出了剂量-响应的S形外观。描述平均值±四分位范围。向软骨培养物中加入IL4-IL10融合蛋白导致蛋白多糖合成速率的剂量依赖性恢复；蛋白多糖释放的正常化，且抑制了含量降低。
图9显示IL4-IL10融合蛋白预防血液诱导的软骨损伤。将8个供体的软骨移植物暴露于8个供体的50％v/v血液4天。在血液暴露期间，加入IL4-IL10融合蛋白以及IL4、IL10、及IL4与IL10的组合(全都为10ng/mL)。由于血液暴露，软骨移植物的蛋白多糖合成速率降低76％(A，p＝0.012)。与单独的血液暴露相比，IL4-IL10融合蛋白使蛋白多糖合成速率提高241％。血液暴露的软骨显示蛋白多糖释放增加59％(B，p＝0.017)。加入IL4-IL10融合蛋白使血液诱发的蛋白多糖释放(p＝0.012)降回到对照值。与对照相比，暴露于血液的软骨显示出蛋白多糖含量降低10％(C，p＝0.012)。与单独的血液暴露相比，IL4-IL10融合蛋白显著地增加蛋白多糖含量(p＝0.012)。符号*指示与对照相比的统计学显著性差异，符号#指示与50％v/v血液相比的统计学显著性差异(p<0.05)。描述了平均值±四分位范围。
图10显示在骨关节炎的犬科动物Groove模型中IL4-IL10融合蛋白减少疼痛。在4只狗中诱导骨关节炎(OA)，并且在OA诱导之后的5周(1μg/ml)和7周(10μg/ml)关节内注射给予1ml的IL4-IL10融合蛋白(参见箭头)。从诱导之前的第3周开始至诱导后的第8周停止，每2周进行力板分析(FPA)，另外在IL4-IL10融合蛋白注射之后每日进行FPA。由站立力的峰信号所指示，与临注射前的水平相比，OA关节(试验关节对对侧关节)的负荷几乎正常化。在负荷再次下降后的数天期间，获得表现出疼痛缓解的对负荷的该作用。在第7周第二次注射之后，与达到pre OA负荷相比，卸荷从7％(与pre OA负荷相比)改变至2％。因此，再次证实IL4-IL10融合蛋白对受影响的OA关节的负荷模式的积极作用且几乎完全正常化。符号*指示与注射前的值相比p＝0.05，而符号#指示与基准值相比p<0.05。弯曲的虚线指示在没有治疗下OA疼痛(卸荷)的自然过程。
图11显示在用IL4-IL10融合蛋白处理的小鼠中角叉菜胶诱导的热痛觉过敏的时间过程。使用Hargreaves检测来测定热缩爪反应潜伏期。小鼠接受脚掌内注射角叉菜胶(参见左边的第一个箭头)，且测定热缩爪反应潜伏期的减小。鞘内注射IL4-IL10融合蛋白(参见左边的第二个箭头)显著地降低对脚掌内角叉菜胶的痛觉过敏性响应。虽然在48小时之后，用IL4-IL10融合蛋白处理的小鼠显示的热缩爪反应潜伏期减小仍然显著地小于盐水处理的小鼠，但是在2天之后IL4-IL10融合蛋白的作用显然更小。数据表示为平均值±SEM。符号*指示p＜0.05；符号**指示p＜0.001。
图12显示使用Hargreaves检测来测定热缩爪反应潜伏期。小鼠接受脚掌内注射角叉菜胶，并且测定热缩爪反应潜伏期的减小。在诱导痛觉过敏滞后6天，给予鞘内注射(参见箭头)IL4或IL10(A)或IL4-IL10融合蛋白(B)。IL4和IL10都稍微减小对脚掌内角叉菜胶疼痛响应的痛觉过敏响应，但是与IL4-IL10融合蛋白的作用相比，IL4和IL10的组合的作用可忽略。单独的IL4或IL10的作用持续1天，而IL4-IL10融合蛋白的作用持续的时期长得多，达到4天。数据表示为平均值±SEM。符号*指示p＜0.05；符号**指示p＜0.001。
图13显示IL4-IL10融合蛋白抑制全血培养物中LPS-诱导的细胞因子释放。将来自健康志愿者的肝素化血液在培养基中以1:10稀释，并且在包含不同IL4-IL10融合蛋白构建物的多种浓度的池存在下，用10ng/mL浓度的LPS培养。用ELISA测量上清液中的TNFα。结果表示为抑制％。在不存在IL4-IL10融合蛋白下TNF产生引起0％抑制。与其中IL10c-末端连接IL4的n-末端的第1个和第3个池相比，在相似的浓度下，其中IL4c-末端连接IL10的n-末端的第2个和第4个池显示出最高的对TNFα产生的抑制。这指示IL4-10融合蛋白的功能性取决于单独的细胞因子在IL4-IL10融合蛋白之内的连接方式。
实施例
实施例1.HEK293细胞的转染
方法：根据标准方法，用包含转基因的载体瞬时转染HEK293细胞(Y Derocher等，Nucleic Acids Research2002，30卷，no2,e9)。简而言之，在包含血清胱抑素(cystatin)信号序列的pUPE表达载体中克隆IL4-IL10融合蛋白插入片段。然后，用包含本发明的IL4-IL10融合蛋白的pUPE表达载体转染HEK293E细胞。同时，细胞与载有用于β-半乳糖苷α-2,3-涎基转移酶5(SIAT9)人类的转基因的载体共转染，以最优化用唾液酸对聚糖的封端(capping)。将细胞培养在含有0.9％primatone和～0.04％，v/v胎牛血清的FreeStyle培养基(Invitrogen)中。在转染之后5天，通过低速离心收集条件培养基，其后将其经10kDa QuixStand空心纤维柱(GE Healthcare)浓缩，并且用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析。
实施例2.用于免疫化学检测IL4-IL10融合蛋白、IL4和IL10的ELISA测定
方法：根据制造商的说明，通过ELISA(IL4PeliPair ELISA Kit；Sanquin,Amsterdam,the Netherlands；Cat#M9314或IL10PeliPair ELISA Kit；Sanquin；Cat#M9310)测量培养物上清液或色谱级分中IL4和IL10的量。简而言之，将针对IL4或IL10的捕捉抗体(catching antibodies)在磷酸盐缓冲盐水(pH7.4(PBS))中以1:200稀释，并且涂布在ELISA板上过夜。在补充有0.1％,w/v，吐温-20(PBS-T)的PBS中进行所有后续步骤。检测由连续稀释以得到100至2pg/ml的重组体IL4或IL10所组成的剂量响应曲线。采用链霉亲和素-聚-HRP(Sanquin)检测结合抗体，接着用TMB(3,3',5,5"-四甲基联苯胺；Invitrogen,Carlsbad,CA,USA；Cat#SB02)培养。用1M硫酸(Chem Lab；Cat#_CL05-2658-1000)终止反应。将ELISA的结果与制造商提供的重组IL4和IL10稀释液的对照曲线的结果进行比较。
通过使用抗-IL4涂布的板和生物素化的抗-IL10单克隆抗体进行特异性检测IL4-IL10融合蛋白的交叉ELISA，以进行检测。除了使用抗-IL4涂布的板代替抗-IL10涂布的板之外，与用于IL10的ELISA相同精确地进行交叉ELISA。如对于IL4ELISA所描述的，精确地制备抗IL4涂布的板。由于对于该测定没有任何标准，将结果以OD给出。在该IL4-L10融合蛋白特异性交叉ELISA中，检测相当于75pg/ml的对照重组IL10和IL4-IL10融合蛋白的固定量的上清液。
结果：IL4-IL10融合蛋白的检测。两种ELISA测定(参见图1和图2)都得到了转染的HEK293细胞的培养物上清液的剂量-响应曲线，表明存在IL4和IL10蛋白，其具有ELISA中所使用的单克隆抗体可识别的结构构型(图1)。然后，修饰ELISA(交叉ELISA)以特异性测量IL4-IL10融合蛋白，而不用测量重组野生型细胞因子分子(参见图2A和图B)。当在该交叉ELISA中测定等同于75pg/ml的量的重组IL10和IL4-IL10融合蛋白时，仅IL4-IL10融合蛋白发信号，而IL10没有(图2A和图B)没有。因此，这些结果证实仅从HEK293细胞获得的上清液(用本发明的IL4-IL10融合蛋白的序列转染的)包含其中IL4和IL10序列彼此连接的蛋白。
实施例3.SDS-Page和蛋白质印迹
方法：将样品在包含710mM的2-巯基乙醇的样品缓冲液(Tris-HCl pH6.8，25％，w/v，甘油，2％，w/v，SDS，0.01％，w/v，溴酚蓝；BioRad，Richmond，VA，USA，Cat#161-0737)中以1:1稀释，并且在100℃下培养10分钟。接着，将样品负载在7.5％，w/v，聚丙烯酰胺Tris/聚丙烯酰胺凝胶(不含SDS的Mini-PROTEAN TGX Precast Gels；BioRad，Cat#456-1023)上。将分子量标记物(WesternC Standard，250-10kD；BioRad；Cat#161-0376)在单独的泳道上运行。在还原条件下，使用Tris/甘氨酸/SDS缓冲液(BioRad；Cat#_161-0732)进行电泳。为了鉴别IL4-IL10融合蛋白，用抗-IL4或抗-IL10抗体进行免疫印迹。如上所述在SDS-PAGE上分离蛋白，然后在100V下通过使用Tris/甘氨酸缓冲液(BioRad；Cat#_161-0734)的蛋白质印迹1小时将其转移到PVDF-膜(BioRad；Cat#_161-0277)。
在印迹之后，用包含4％，w/v奶粉(Elk奶粉；Campina,Zaltbommel,Netherlands)的PBS-T培养所述膜，以阻断剩余的结合位点。接着，在PBS-T中洗涤PVDF膜3×，并且用在1％w/v乳(溶于PBST中)的一级抗体(小鼠IgG1抗-人IL4；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA；Cat#SC80093或小鼠IgG1抗-人IL10；Santa Cruz；Cat#SC32815)培养1小时。在另一个洗涤步骤之后，将该印迹用在PBST-1％乳中的二级抗体(马-辣根过氧化物酶(HRP)-结合的山羊抗小鼠IgG；Santa Cruz；Cat SC2005)和WesternC标记检测抗体(StrepTactin-HRP；BioRad；Cat#161-0382)培养1小时。将ECL溶液(GE Healthcare,Diegem,Belgium,Cat#RPN2132)加入到洗涤的膜中，此后将该膜转移到盒中，并使用Kodak Imager显影直至15分钟。为了进一步表征IL4-IL10融合蛋白，根据制造商的说明，也用PNGaseF(Sigma Aldrich,cat#_G5166)处理培养物上清液，以使IL4-IL10融合蛋白去糖基化，此后如上述的在SDS-PAGE上分析并免疫印迹。
结果：野生型IL4和IL10都发生迁移，具有与MW<20kD一致的相对迁移(Mr)(图3A和B中显示的印迹的泳道4和5)。根据从转染的HEK293获得的上清液，IL4-IL10融合蛋白呈双条带迁移，具有与MW～30～35kD一致的Mr。两个条带都被抗-IL4(图3A)和抗-IL10单克隆抗体(图3B)可识别，因此两者都代表IL4-IL10融合蛋白的变异体，推测为不同的糖型。显著地，没有检测到对应于在重组野生型IL4或IL10(图3A和3B中的泳道2)范围内的Mr的条带。这些结果证实在转染的HEK293细胞的上清液中仅检测到IL4-IL10融合蛋白而没有单独的细胞因子(即IL4和IL10)。为了证实在图3A和3B的泳道2中描述的双条带为糖型，将包含IL4-IL10融合蛋白的上清液用PNGaseF处理以去糖基化，并且通过免疫印迹与未处理的上清液进行比较。结果显示在去糖基化之后仅仅检测到一个条带(参见图3A和3B中显示的两个印迹中的泳道3)，其证实在两个印迹的泳道2中看到的双条带(图2A和B)实际上为本发明的IL4-IL10融合蛋白，但是为糖基化形式。
实施例4.IL4-IL10融合蛋白的凝胶过滤-高压尺寸排阻色谱(SEC)
方法：为了测定IL4-IL10融合蛋白的分子量，进行高效尺寸排阻色谱(HP-SEC)测定。在高效液相层析系统(Shimadzu)上进行凝胶过滤(BioSuite1254μm UHRSEC Column；Waters；Cat#186002161)，所述高效液相层析系统具有作为流动相的含0.5M NaCl的20mM的磷酸盐缓冲液。在运行之前，使用甲状腺球蛋白、牛血清蛋白、碳酸酐酶、肌球蛋白和核糖核酸酶校准柱。通过汇集并浓缩具有最高IL4-IL10融合蛋白含量(将2ml汇集的级分浓缩至100μl，包含2μg的IL4-IL10融合蛋白)的色谱级分，通过阳离子交换纯化IL4-IL10融合蛋白。注入50μl的20μg/ml汇集的IL4-IL10融合蛋白，并且以0.35ml/min的流速且在35bar的压力下穿过柱。收集175μl的级分，并且在上述IL4和IL10ELISA(1/500稀释)中测量IL4和IL10含量。进行采用重组人IL4(Sigma，Cat#_I4269)和重组人IL10(Sigma,Cat#_I9276)的类似运行，以比较IL4-IL10融合蛋白与野生型细胞因子的分子大小。
结果：IL4的HP-SEC洗脱方案指示IL4作为单体(～15kD)存在。IL10的洗脱模式显示该细胞因子以二聚体形式(～40kD)存在，其为IL10的天然存在形式(Zdanov等，Stucture1995,3:591-601)。IL4-IL10融合蛋白的模式表明其主要以二聚体形式(～70kD)存在(图4)。
实施例5.用于测量促炎细胞因子的测定
方法：根据制造商的说明，使用市售ELISA(TNF-αPelipair ELISA Kit；Sanquin,Amsterdam,the Netherlands；Cat#M9323)测量TNFα产生。简而言之，用在碳酸盐/二碳酸盐缓冲液pH9.6中以1比150稀释的抗-TNFα捕捉抗体涂布各板，用PBS-T洗涤3次，并且用在PBS中的2.5％w/v牛血清白蛋白(BSA；Roche AppliedScience,Mannheim,Germany,Cat#10735108001)培养，以阻断板上任何其余结合位点。在另一次洗涤步骤之后，用在PBS-T中稀释的样品培养各孔。测定在PBS-T中浓度为200～1.56pg/ml的重组TNF-α的标准曲线用于参照。重组TNF-α由试剂盒提供。最后，通过分别用在PBS-T中的生物素化的抗TNF-α和链霉亲和素-聚-HRP(Sanquin；Cat#_2032)培养来检测结合的TNF-α。用TMB(3,3'5,5''-四甲基联苯胺；Invitrogen；Cat#SB02)显影结合的HRP。为了完成ELISA，加入1M硫酸(Chem Lab；Cat#_CL05-2658-1000)。结果参照重组TNFα的标准曲线的结果，并且表示为pg/ml。使用类似的ELISA方法测量IL6和IL8(购自Sanquin)及IFNγ和IL17(购自Biosource)。
实施例6.用于测量IL4-IL10融合蛋白、IL4和IL10活性的测定
方法：使用全血中的脂多糖(LPS)诱发的细胞因子释放(IL6、IL8、TNFα)作为IL4和IL10的功能测定。肝素化的人血获自健康志愿者，并且在补充有Pen/Strep(PAA Laboratories,Pasching,Austria；Cat#P11-013)的RPMI培养基(Glutamax；Invitrogen,Cat#_61870010)中以1比10稀释。加入LPS(脂多糖；Sigma；Cat#_L4391)，得到终浓度10ng/ml。以100ng/ml的终浓度为加入IL4-IL10融合蛋白。以各自50ng/mL的终浓度加入重组人IL4(Sigma，cat#_i4269)和重组人IL10(Sigma,Cat#_I9276)作为对照。为了证实IL10和IL4的活性，分别以10μg/ml和20μg/ml的终浓度加入抗人IL4-受体(a-hIL4-R；R&D Systems；Minneapolis,MN,USA,Cat#MAB230)和人IL10-受体(a-hIL4-R；R&D Systems；Minneapolis,MN,USA,Cat#MAB230)的受体阻断抗体。然后，在37℃下培养全血培养物18小时，其中在收集上清液之后，贮存在-80℃下直到检测细胞因子。
结果：用ELISA测量上清液中存在的TNFα的水平，并且表示为TNFα的抑制％(图5A)。结果显示在不存在IL4-IL10融合蛋白下，TNFα的产生导致0％抑制(图5A)。当检测相似体积的缺少IL4-IL10融合蛋白的缓冲液时，未看到TNFα的抑制(图5A)。
还使用ELISA测定测量IL4-IL10融合蛋白或IL4和IL10的组合对LPS-诱导的TNFα、IL6和IL8产生的抑制(图5B)。上清液中存在的TNFα、IL6和IL8的浓度在Y-轴中给出。以50ng/mL检测IL4-IL10融合蛋白，并且与各自25ng/mL的终浓度为的重组人IL4和IL10的混合物的作用相比较。结果显示相对于对照(即，不含细胞因子的培养基)，IL4-IL10融合蛋白及IL4和IL10的组合都显著地抑制LPS-诱导的TNF、IL6和IL8产生。相对于对照情形(例如仅仅培养基)，当加入抗人IL4-受体(a-hIL4-R)和抗人IL-10-受体(a-IL10-R)的受体阻断抗体时，IL4-IL10融合蛋白对LPS-诱导的IL6产生的作用被完全消除。然而，相对于对照情形(例如仅仅培养基)，当两个部分的一个(即，IL4或IL10)被抗人IL4-受体(a-hIL4-R)或抗人IL-10-受体(a-IL10-R)的受体阻断抗体阻断时，IL4-IL10融合蛋白对LPS-诱导的IL6产生的作用被部分消除。
实施例7.IL4-IL10融合蛋白对促炎症反应(Th1和Th17细胞因子表达细胞)和调控T-细胞活性(FoxP3-表达CD4T细胞)的平衡的作用
方法：骨髓细胞和B细胞的活化关键取决于促炎症反应Th1和Th17及调控FoxP3-表达CD4T细胞的T-细胞平衡。为了评价IL4-IL10融合蛋白对T-细胞细胞因子产生的作用，从健康供体分离来自外周血(PBMC)的单核细胞。简而言之，用包含青霉素(100U/ml,Yamanouchi,Leiderdorp,The Netherlands)、链霉素(100mg/ml,Fisiopharma,Milano,Italy)和谷氨酰胺(2mM,Gibco BRL)的RPMI1640培养基1:1稀释血液。通过Ficoll-Paque密度梯度离心(Pharmacia,Uppsala,Sweden)分离PBMC。在37℃下，将PBMC(5.105/ml)在加入青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)和10％汇集的胎牛血清(FCS,Gibco BRL)的RPMI/glutamax(Gibco BRL)中培养3天。在存在或不存在超级抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB,1ng/mL)和/或IL4-IL10融合蛋白下，培养PBMC。在该培养期之后，收集上清液，使其不含细胞，并且贮存在-80℃下直到通过ELISA检测IFNγ、IL17和TNFα。另外，通过3H-胸苷结合测量细胞增殖。在3天细胞培养的最后18小时期间，向各孔中加入3H-胸苷(5mCi/ml,NEN Life Science Products,Amsterdam,TheNetherlands)。在该培养期之后，收集细胞，并且通过液体闪烁计数测量3H-胸苷结合，以每分钟计数(CPM)表示。而且，使用APC-共轭的大鼠抗人FoxP3染色装置(eBioscience,San Diego,USA)进行细胞内FoxP3染色。对于细胞内染色，使用APC-标记的大鼠同型对照抗体(eBioscience)。基于使用同型对照设定的标记物测定阳性/阴性细胞的百分数。使用FACScan流式细胞仪进行细胞采集，并且用FlowJo软件，版本7.5(Tree Star Inc.,Oregon,USA)分析数据。
还检测IL4-IL10融合蛋白对单核细胞上抑制性Fcγ受体(FcγRIIb)表达的协同作用。这与活化FcγRI和FcγRIII的调控进行比较。在37℃下，在加入青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)和10％汇集的人AB血清(Gibco BRL)的RPMI/glutamax(Gibco BRL)中培养PBMC(1.106/ml)4天。在存在或不存在超级抗原SEB(1ng/mL)和/或IL4-IL10融合蛋白下培养PBMC。在该培养期之后，通过FACS分析评价FcγRs的表达。对于FACS分析，用APC-标记的CD14mAb、FITC-标记的抗FcγRI和抗FcgRIII mabs(Pharmingen)、及FITC-标记的抗-FcgRIIb mab(2B6,Genmab,Utrecht,Netherlands)培养单核细胞。使用FACScan流式细胞仪进行细胞采集，并且用FlowJo软件，版本7.5(Tree Star Inc.,Oregon,USA)分析数据。
结果：SEB诱导显著的增殖，其与FoxP3表达上调有关。增殖和FoxP3表达几乎都不受IL4-IL10融合蛋白的影响(分别为图6A和图B)。相反，Th1和Th17细胞因子IFNγ(左图)、IL-17(中图)和TNFα(右图)全都被IL4-IL10融合蛋白及IL4和IL10的组合强有力地减少(图6C)。总之，这证实IL4-10融合蛋白很强地改变抑制性调节CD4T细胞和促炎症反应Th1和Th17细胞之间的平衡。
实施例8.IL4-IL10融合蛋白对于IL4-IL10融合蛋白、IL4、IL10、及IL4和IL10组合对活化Fcγ受体I和III与抑制性FcγRIIb的平衡的作用
方法：IgG(FcγRs)的活化和抑制性受体之间的平衡在免疫复合物介导的骨髓细胞和淋巴细胞的活化中起关键作用。为了评价IL4-IL10融合蛋白对FcγR在单核细胞上表达的作用，从健康供体分离来自外周血(PBMC)的单核细胞。通过在存在或不存在超级抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)(0.1ng/mL)和/或IL4-IL10融合蛋白下，处理PBMC(5.105/ml)2天来诱导T-细胞依赖性单核细胞活化。在该培养期之后，测量FcγR表达。
结果：IL10上调FcγRI、FcγRIIa和FcγRIII的表达(图7)，而在这些条件下IL4显示与在不存在细胞因子的条件下培养的细胞相比，这些活化FcγRs的表达稍有降低。IL4和IL10的组合与IL4-IL10融合蛋白都使FcγRI和FcγIIa的表达正常化。尽管通过IL4和IL10的组合与IL4-IL10融合蛋白可见FcγRIII稍有增加，但是与单独的IL10诱导的该受体上调相比可忽略。单独的IL10显示抑制性FcγRIIb的表达稍有增加，而单独的IL4显示该受体的表达稍有下降。IL4和IL10的组合与IL4-IL10融合蛋白不会改变抑制性FcγRIIb的表达(图7)。总之，这证实本发明的IL4-IL10融合蛋白稳定活化FcγRs的表达，其从而可以抑制免疫复合物诱导的免疫激活。
实施例9.用于血液-诱发的软骨损伤的软骨培养物
方法：经University Medical Centre Utrecht的医学伦理管理机构的批准，在供体死亡后24小时之内从肱骨头尸检获得健康人关节软骨组织。供体(n＝8；平均年龄69.8±8.7岁，3名男性，5名女性)没有已知的关节病史。从肱骨头(排除底层骨)无菌切下全厚软骨切片，并且保存在磷酸缓冲盐水(PBS,pH7.4)中。在解剖后1小时之内，将切片无菌切成小的全厚立方移植物(cubic explants)并称重(范围5～15mg，精度±0.1mg)。将移植物分别在96-孔圆底微量滴定板(在空气中5％CO2下，pH7.4，37℃和95％湿度)培养。培养基由补充有谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100IU/mL)、硫酸链霉素(100μg/mL；全都PAA)、抗坏血酸(85μM；Sigma)和10％热灭活汇集的男人AB+血清(Gemini Bioproducts)的Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM；Invitrogen)组成。
对于每个实验，从健康人供体(n＝8，平均年龄28.0±5.0岁，2名男性和6名女性)将新鲜血液抽入收集管(nr.367895；Becton Dickinson)中。为了模拟人关节出血，将软骨暴露于50％v/v全血4天，其被认为是来自关节腔的血液自然排出时间。在血液暴露之后，在培养条件下洗涤软骨移植物45分钟，洗涤2次，以除去所有添加剂，并且再培养12天。每4天更新培养基。在使用8个供体的5个的软骨和血液第一个试验设置中，通过在血液暴露期间加入浓度为0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30和100ng/mL(n＝5)的IL4-IL10融合蛋白制备IL4-IL10融合蛋白的剂量-响应曲线。在单独的实验中，将最佳浓度的10ng/mL IL4-IL10融合蛋白与类似浓度的IL10加IL4组合以及单独的组分(各自10ng/mL，n＝8)进行比较。
作为蛋白多糖合成速率的测量，蛋白多糖为主要软骨基质组分之一，测定加入糖胺聚糖(GAGs)的硫酸盐速率。在每个实验结束时，每孔加入74kBq的Na2 35SO4(无载体的NEX-041-H；DuPont)。在脉冲标记新形成的硫化的GAG4小时之后，将软骨样品在冷PBS中洗涤两次，并贮存在-20℃下。将解冻的样品在65℃下用2％木瓜蛋白酶(Sigma)消化2小时。通过用在0.2M NaCl中的0.3M氯化十六烷基吡啶一水合物(CPC；Sigma)沉淀GAG而测定蛋白多糖合成速率。将沉淀物溶于3M NaCl中，并且通过液体闪烁分析测量放射性的量。将放射性计数标准化为培养基的比活性、标记时间、软骨的湿重。结果表示为每克湿重的软骨组织加入的硫酸盐的纳摩尔数(nmol/h*g)。
可以通过染色和分别用在软骨样品的木瓜蛋白酶消化物和在培养基中的阿尔新蓝(Sigma)沉淀GAG，确定每个软骨移植物的蛋白多糖含量及蛋白多糖向培养基中的释放量。使用硫酸软骨素(Sigma)作为参照，通过在620nm下吸光测定法定量染色。对于含量和释放量，结果分别表示为mg GAG/湿重的软骨组织(mg/g)和在4天期间释放的mg GAG/湿重的组织(mg/g)。因为软骨的组成和生物活性的病灶差异(focal differences)，测定相同供体的10个软骨移植物的蛋白多糖再循环参数，随机获得并分别处理。将这10个样品的平均值作为软骨供体的代表值。
结果：软骨暴露于50％v/v血液4天强烈地降低了蛋白多糖合成速率74％(图8A；p＝0.043)。加入IL4-融合蛋白导致蛋白多糖合成速率的剂量依赖性恢复，即从0.1ng/mL的IL4-IL10融合蛋白以上(onwards)，当与不含IL4-IL10融合蛋白的血液暴露相比时，观察到蛋白多糖合成速率显著地增加(所有的p＝0.043)(图8A)。通过加入0.1ng/mL以上的IL4-IL10融合蛋白，由于血液暴露引起的蛋白多糖释放中升高62％是(统计学)显著地可逆的(恢复到对照水平)(图8B，所有的p＝0.043，除了1ng/mL，p＝0.080)。这将导致蛋白多糖释放标准化，即不同形式的对照培养物不再不同。当将软骨移植物暴露于血液时，总蛋白多糖含量减小11％(图8C；p＝0.043)。通过加入浓度为0.3ng/mL以上的IL4-IL10融合蛋白，血液暴露的量下降得到抑制(所有的p＝0.043，除了1和100ng/mL之外，这两者的p＝0.080)。
为了比较IL4-IL10融合蛋白对细胞因子的组合和单独组分的作用，在相同测定中检测IL4-IL10融合蛋白、IL4、IL10及两者的组合(各自10ng/mL)。由于血液暴露，蛋白多糖合成速率降低76％(图9A；p＝0.012)。当与血液相比时，IL10和IL4都统计学显著地增加合成速率(分别地，p＝0.017和p＝0.012)。以相同浓度使用IL4-IL10融合蛋白还增加蛋白多糖合成速率，因此其与两种单独的细胞因子的组合同样有效(与血液暴露相比，分别为241％和245％)。而且，IL4-IL10融合蛋白的作用也比单独的IL10的作用统计学显著地更好(p＝0.025)。使用IL4-IL10融合蛋白、两种细胞因子的组合、及单独的IL4的培养物的蛋白多糖合成速率与对照没有任何显著地不同。获得从血液诱导的蛋白多糖合成抑制的完全恢复，即正常化。软骨的血液暴露增加了蛋白多糖释放59％(图9B；p＝0.017)。加入IL10降低了该增强释放(与血液相比，p＝0.012)。当与血液暴露相比时，IL-4、IL-4和IL-10的组合、及IL4-IL10融合蛋白极大程度地降低了所述释放(所有的p＝0.012)，并且与单独的细胞因子的组合同样有效(p＝0.611)。
暴露于血液的软骨显示蛋白多糖含量降低10％(图9C；p＝0.012)。单独的细胞因子IL4和IL10不会防止该含量降低(当与血液暴露相比时，分别为p＝0.093和p＝0.327)。然而，与没有添加物的血液暴露相比，IL4-IL10融合蛋白(统计学)显著地增加蛋白多糖含量(p＝0.012)。
实施例10.用于疼痛和骨关节炎的犬科动物Groove-模型
方法：IL4-IL10融合蛋白对骨关节炎的犬科动物Groove-模型中疼痛和功能性能力的作用。Groove模型的特性反映人骨关节炎(OA)的特性，使其成为研究人OA的合适模型。Groove-模型是独特的，因为退化软骨变化是渐进性的，最终引起骨关节炎(OA)，而滑液炎症随时间推移减少。为此，药物对软骨退化和疼痛的直接效果的评价可较少地受到对炎症的可能间接作用的影响。另外，该模型是独特的，因为没有引起关节损伤的长久的触发物，使该模型对治疗更敏感。关节损伤的长久触发物，例如其它OA(犬科动物)模型中使用的关节不稳定性将抑制可能的治疗有益作用。总之，Groove-模型适于通过OA检测IL4-IL10融合蛋白对软骨损伤和疼痛引起残疾的治疗效果。疼痛和功能性能力被认为是临床骨关节炎研究中非常重要的参数，因为这些参数而不是结构变化迫使患者寻求医学照顾。在犬科动物模型中，可以通过力-板分析(FPA)评价疼痛和功能能力的制动(braking)、直立和驱动地面反作用力指示物的变化。关节负荷受疼痛和功能性能力的影响，取决于关节退化过程的阶段。在OA诱导之后的第一个两周中，发现卸荷明显减少，很可能是由外科手术相关疼痛引起。然而，在3周之后，作为OA-相关疼痛的结果，出现受影响肢体的更稳定的卸荷。
根据Groove模型，在4只Mongrels狗(杂种，骨骼成熟)中，在右膝诱导骨关节炎(OA)。在股骨踝的负重部分上造成深度0.5mm的十个纵向和对角线凹槽。尽可能防止出血和软组织损伤，以防止与炎症驱动模型(inflammatory drivenmodels)和特异性关节炎模型形成对照的炎症组分占优势。在外科手术之后，缝合滑膜、筋膜和皮肤。对侧未手术的膝充当对照。在外科手术之后，缝合滑膜、筋膜和皮肤。对侧未手术的膝充当对照。在OA诱导之后5周，给予关节内注射1ml的IL4-IL10融合蛋白(1ug/ml)(参见左边第一个箭头)。在第一次注射之后2周(7周)，给予较高剂量(10ug/ml)的第二次注射(参见左边第二个箭头)。
通过力板分析(FPA)评价作为疼痛和功能性能力测量的地面步态模式(Groundgait pattern)。在犬科动物模型中，可以通过FPA对每条腿进行制动、直立和推动反作用力(GRF)的纵向变化评价。力-板(FP)嵌装在11m通道的采样(100Hz)峰GRF的表面上。通过体重和时间使力标准化，并且以N/kg表示。单个训练者通过皮带引导狗在FP上以等速(1±0.2m/s)步行。成功的奔跑包括右前爪和右后爪或左前爪和左后爪分别连续地、明显地爪击。收集狗的每侧的十次正确的奔跑，并平均四条腿的每条的GRF。从诱导开始之前3周至停止之后8周，每2周进行FPA。在注入IL4-IL10融合蛋白(第5周和第7周)之后进行另外的每日FPA。
结果∶结果显示在第一次IL4-IL10融合蛋白注射之后，如由站立力的峰信号所表示的，与临注射前的水平相比(与pre OA负荷相比，抑制9％)，OA关节(试验关节相对于对侧对照关节)的负荷几乎正常化(与pre OA负荷相比，抑制2％)(图10)。在负荷再次下降后数天，获得表现出疼痛缓解的对负荷的该作用。在第7周第二次注射之后，在受影响的OA关节的负荷模式上也看到IL4-IL10融合蛋白的积极的效果。这可由与pre OA负荷相比卸荷从-7％(与pre OA负荷相比)改变为-2％所显示，几乎再次完全正常化。因此，在OA的该犬科动物模型中，IL4-IL10融合蛋白能够减少疼痛。
实施例11.用于疼痛和骨关节炎的犬科动物Groove-模型
方法：根据Groove模型，在Mongrels狗(杂种，骨骼成熟)中，在右膝诱导骨关节炎(OA)。在股骨踝的负重部分上造成深度0.5mm的十个纵向和对角线凹槽。尽可能防止出血和软组织损伤，以防止与炎症驱动模型和特异性关节炎模型形成对照的炎症组分占优势。在外科手术之后，缝合滑膜、筋膜和皮肤。对侧未手术的膝充当对照。将狗分成两组。第一组在OA诱导之后5周，接受关节内注射IL4-IL10融合蛋白。第二组在OA诱导之后5周，接受关节内注射IL4和IL10两者，但是以游离形式。在第一次注射之后2周(第7周)，给予第一组(10ug/ml的IL4-IL10融合蛋白)和第二组(5ug/ml的IL4和5ug/ml的IL10)较高剂量的第二次注射。
通过力板分析(FPA)评价作为疼痛和功能性能力测量的地面步态模式。在犬科动物模型中，可以通过FPA对每条腿进行制动、直立和推动反作用力(GRF)的纵向变化评价。力-板(FP)嵌装在11m通道的采样(100Hz)峰GRF的表面上。通过体重和时间使力标准化，并且以N/kg表示。单个训练者通过皮带引导狗在FP上以等速(1±0.2m/s)步行。成功的奔跑包括右前爪和右后爪或左前爪和左后爪分别连续地、明显地爪击。收集狗的每侧的十次有效的奔跑，并平均四条腿的每条的GRF。从诱导开始之前3周至停止之后8周，每2周进行FPA。在两组中，在注射IL4-IL10融合蛋白(第1组)和注射游离形式的IL4和IL10(第2组)之后，在第5周和第7周都进行另外的每日FPA。
结果：结果显示在两次注射之后(第5周和第7周)，采用IL4-IL10融合蛋白(第1组)或游离形式的IL4和IL10的组合(第2组)处理都对受影响的OA关节的负荷模式产生了积极的影响。然而，在第5周和第7周，相对于用游离形式的IL4和IL10的组合治疗，用IL4-IL10融合蛋白治疗观察到受影响的OA关节的负荷模式具有非常大的改善。还观察到与游离形式的IL4和IL10的组合治疗的效果相比，用IL4-IL10融合蛋白治疗的作用随时间推移更持久。因此，与用游离形式的IL4和IL10的组合获得的效果相比，本发明的IL4-IL10融合蛋白能够非常大程度地减少OA的犬科动物模型中的疼痛。
实施例12.鼠科动物角叉菜胶-诱导的痛觉过敏模型。
方法：第0天，通过在后爪脚掌内注射稀释在盐水中的5μlλ-角叉菜胶(2％w/v；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)在雌性C57BL/6小鼠中诱导痛觉过敏。脚掌内单独注射的盐水不会诱导可检测的痛觉过敏。使用Hargreaves试验(IITCLife Science Woodland Hills,CA)测定对红外热刺激的响应，测量为抽回爪的潜伏期。选择光束强度以诱导在基准约8秒的热缩爪反应潜伏期。在三个连续日测定基准缩爪反应潜伏期。在注射角叉菜胶之后，通过持续至少10天的缩爪反应潜伏期减小证实小鼠发展为痛觉过敏。在第6天，小鼠接受单次鞘内注射IL4(100ng)、IL10(100ng)、或IL4-IL10融合蛋白(40、100和200ng)、或载体(盐水)(参见图11和12中的箭头)。
结果：缩爪反应潜伏期减小表明，在注射角叉菜胶之后直至6天，小鼠显示痛觉过敏(图11)。在第6天，小鼠接受单次鞘内注射100ng的IL4-IL10融合蛋白(n＝4)或作为对照的盐水(n＝4)。在注射IL4-IL10融合蛋白之后，通过缩爪反应潜伏期值减小返回基准值证实痛觉过敏得到抑制(图11)。单一剂量的IL4-IL10融合蛋白的作用持续直至2天。在48小时之后，该作用降低，但是与对照盐水处理的小鼠中潜伏期减小％仍然显著地不同(图11)。
在使用如上所述相同方法的补充实验中，在用IL4、IL10、或IL4-IL10融合蛋白处理的小鼠中也评价角叉菜胶-诱导的热痛觉过敏。特别地，在诱导痛觉过敏之后第6天，给予鞘内注射IL4或IL10(A)或IL4-IL10融合蛋白(B)(图12)。尽管IL4和IL10都稍微减小了对脚掌内角叉菜胶疼痛响应的痛觉过敏响应，但是与IL4-IL10融合蛋白的作用相比该作用可忽略(图12)。单独的IL4或IL10的作用持续1天，而IL4-IL10融合蛋白的作用持续的时期长得多，即直至4天(图12B)。
实施例13：鼠科动物角叉菜胶诱导的痛觉过敏模型
方法：第0天，通过在后爪脚掌内注射稀释在盐水中的5μlλ-角叉菜胶(2％w/v；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)在雌性C57BL/6小鼠中诱导痛觉过敏。脚掌内单独注射的盐水不会诱导可检测的痛觉过敏。使用Hargreaves试验(IITCLife Science Woodland Hills,CA)测定对红外热刺激的响应，测量为抽回爪的潜伏期。选择光束强度以诱导在基准约8秒的热缩爪反应潜伏期。在三个连续日测定基准缩爪反应潜伏期。在注射角叉菜胶之后，通过持续至少10天的缩爪反应潜伏期减小证实小鼠发展为痛觉过敏。在第6天，小鼠接受单次鞘内注射IL4-IL10融合蛋白(40、100和200ng)，或包含游离形式的IL4(100ng)和IL10(100ng)组合的溶液，或载体(盐水)。
结果：结果显示，相对对照情形(载体处理)，用IL4-IL10融合蛋白或游离形式的IL4和IL10的组合处理产生显著降低痛觉过敏。然而，观察到与基于游离形式的IL4和IL10的组合处理相比，用IL4-IL10融合蛋白处理对于痛觉过敏发挥明显更大的抑制作用。还观察到单次剂量的IL4-IL10融合蛋白对痛觉过敏耐受性的作用比同等剂量的单独细胞因子(即，游离形式的IL4和IL10的组合)的作用随时间推移延长明显更长。
实施例14.IL4-IL10融合蛋白对全血培养物中LPS诱导的TNF产生的活性
方法：使用全血中脂多糖(LPS)诱导的细胞因子释放(TNFα)作为IL4-IL10融合蛋白活性的功能性测定。从健康志愿者获得肝素化的人血液，并且在补充有Pen/Strep(澳大利亚Pasching，PAA Laboratories；Cat#_P11-013)的RPMI1640培养基(Glutamax；Invitrogen，Cat#_61870010)中以1比10稀释。加入LPS(脂多糖；Sigma；Cat#_L4391)，得到终浓度10ng/ml。检测包含不同的IL4-IL10融合蛋白构建物的四个不同的池。各池之间的不同在于IL4与IL10的连接方式(例如IL4的C末端连接IL10的N-末端，或者反之亦然)。以2、10、20、30、40和50ng/ml的终浓度为加入不同的构建物。然后，将全血培养物在37℃下培养18小时，其中在收集上清液之后，贮存在-80℃下，直到检测TNFα含量。使用ELISA测定(如上实施例2和5中所述)测量上清液中的TNFα水平。
结果：结果显示为TNFα产生的抑制％。在不存在IL4-IL10融合蛋白下，没有观察到对TNFα产生的抑制。与其中IL10c-末端连接IL4的n-末端(以相同浓度使用)的池1和3相比，其中IL4c-末端连接IL10的n-末端的池2和4显示出TNFα产生的最高抑制。这些结果表明IL4-10融合蛋白的功能性取决于单独的细胞因子在IL4-IL10融合蛋白之内连接的方式。
Claims (20)
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括白细胞介素4和白细胞介素10。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述白细胞介素4和所述白细胞介素10由接头序列连接。
3.如权利要求1或2的任一项所述的融合蛋白，其中，所述白细胞介素4与所述白细胞介素10的N-末端融合。
4.如权利要求1或2的任一项所述的融合蛋白，其中，所述白细胞介素10与所述白细胞介素4的N-末端融合。
5.如前述权利要求的任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包括一个或多个化学修饰。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述化学修饰选自糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化组成的组中。
7.如前述权利要求的任一项所述的融合蛋白，其中，所述白细胞介素10为人白细胞介素10。
8.如前述权利要求的任一项所述的融合蛋白，其中，所述白细胞介素4为人白细胞介素4。
9.一种核酸分子，所述核酸分子包括编码如前述权利要求的任一项的融合蛋白的多核苷酸。
10.一种载体，所述载体包括权利要求9所述的核酸分子。
11.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如权利要求9所述的核酸分子或如权利要求10所述的载体。
12.用于产生如权利要求1～8的任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括步骤：
在允许产生如权利要求1～8的任一项所述的融合蛋白的条件下培养如权利要求11所述的宿主细胞；
可选择地，回收所述融合蛋白。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包括如权利要求1～8中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。
14.如权利要求1～8的任一项的融合蛋白，所述融合蛋白用作药物。
15.如权利要求1～8的任一项所述的融合蛋白，用于预防或治疗骨关节炎、慢性疼痛、以局部或全身炎症、免疫激活和/或淋巴组织增生为特征的病症。
16.具有权利要求13中所述用途的融合蛋白，其中，所述以局部或全身炎症、免疫激活、淋巴组织增生和/或慢性疼痛为特征的病症选自由败血症、成人呼吸窘迫综合征、同种异体移植和异种移植、皮炎、炎性肠病、结节病、过敏症、银屑病、强直性脊椎脊柱炎、例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的自身免疫疾病、肾小球肾炎、免疫复合物诱发的及其它形式的血管炎、多发性硬化症、舍格伦病、痛风、例如非霍奇金淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞性白血病的淋巴组织增生疾病、烧伤、多发性创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、局部缺血-再灌注损伤、体内给药细胞因子或治疗性单克隆抗体诱发的毒性、慢性疼痛综合征和神经性和/或炎性疼痛组成的组中。
17.如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，用于预防和/或治疗例如人类的哺乳动物中白细胞介素10指征的临床病症。
18.如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，用于预防和/或治疗例如人类的哺乳动物中白细胞介素4指征的临床病症。
19.如权利要求10的基因治疗载体，用于预防和/或治疗骨关节炎、慢性疼痛、以局部或全身炎症、免疫激活和/或淋巴组织增生为特征的病症。
20.具有权利要求17中所述用途的载体，其中所述以局部或全身炎症、免疫激活和/或淋巴组织增生为特征的病症选自败血症、成人呼吸窘迫综合征、同种异体移植和异种移植、皮炎、炎性肠病、结节病、过敏症、银屑病、强直性脊椎脊柱炎、例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的自身免疫疾病、肾小球肾炎、免疫复合物诱发的及其它形式的血管炎、多发性硬化症、舍格伦病、痛风、例如非霍奇金淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞性白血病的淋巴组织增生疾病、烧伤、多发性创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、局部缺血-再灌注损伤、体内给药细胞因子或治疗性单克隆抗体诱发的毒性、慢性疼痛综合征和神经性和/或炎性疼痛组成的组中。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141105 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |