CN1922204A - Il－4/il－13特异性的多肽和其治疗应用 - Google Patents

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CN1922204A CN 200580006034 CN200580006034A CN1922204A CN 1922204 A CN1922204 A CN 1922204A CN 200580006034 CN200580006034 CN 200580006034 CN 200580006034 A CN200580006034 A CN 200580006034A CN 1922204 A CN1922204 A CN 1922204A
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Abstract

提供了能结合白介素－4(IL－4)和白介素－13(IL－13)的多肽和多聚多肽，其可以在治疗上用于治疗IL－4和IL－13有关的病状或疾病的方法中。本发明表征了编码白介素4(IL－4)和IL－13结合性融合多肽(R1) x－(R2) y－F的核酸分子，其中R1是能特异性地抑制IL－4活性的修饰的IL－4受体α(IL－4R－α)组分，R2是能特异性地抑制IL－13活性的IL－13受体α1或2(IL－13R－α1或IL－13R－α2)，F是融合组分，且x和y各自独立地是＞或＝1的正整数。

Description

IL-4/IL-13特异性的多肽和其治疗应用
发明领域
本发明包括IL-4/IL-13-特异性的多肽，以及这样的多肽用于抑制IL-4和/或IL-13活性的治疗应用。
相关领域的描述
在US6,472,179中，Stahl等描述了细胞因子融合蛋白融合多肽，其能结合细胞因子，形成由2个受体组分和1个多聚化组分组成的无功能的复合物。白介素-4受体α(IL-4Rα)和IL-13受体α组分(IL-13Rα)记载在例如US 5,856,296，和5,840,869，和EP 876482中。
发明简述
在第一方面，本发明表征了编码白介素4(IL-4)和IL-13结合性融合多肽(R1)x-(R2)y-F的核酸分子，其中R1是修饰的IL-4受体α(IL-4Rα)组分，当作为融合多肽中的组分存在时，其能以至少10-10M的IC50特异性地抑制IL-4活性，R2是IL-13受体α1或2(IL-13Rα1或IL-13Rα2)，当作为融合多肽中的组分存在时，其能以至少10-10M的IC50特异性地抑制IL-13活性，F是融合组分，且x和y各自独立地是≥1的正整数。融合多肽的组分可以以不同的次序排列，例如，F-(R1)x(R2)y，(R1)x-F-(R2)y，或(R2)y-F-(R1)x。更具体地，R1源自亲本IL-4Rα，包含SEQ ID NO：2(由SEQ ID NO：1的核酸序列编码)的氨基酸1-231，24-231，28-231，或24-221，或其等位基因变体，且被修饰组I中定义的1-10个修饰所修饰，和R2是IL-13受体α(IL-13Rα1或IL-13Rα2)组分，其包含SEQ ID NO：3的1-343或27-343，或其片段，任选地被修饰组II中定义的一个或多个修饰所修饰，或包含SEQ IDNO：4的氨基酸1-343或23-343，任选地被修饰组III中定义的一个或多个修饰所修饰。任选地，(R1)x-(R2)y-F还包含信号序列(SS)。在一个实施方案中，修饰融合多肽的R1组分，以相对于未修饰的组分，表现出增加的或减少的IL-4抑制活性和/或增加的或减少的IL-13抑制活性，优选地，对R1的修饰能增加IL-4和IL-13抑制。
R1：天然产生的野生型IL-4Rα蛋白是800个氨基酸的蛋白质，其具有SEQ ID NO：2所示的细胞外结构域。已知的SEQ ID NO：2的等位基因变体包括但不限于，在位置75的Phe、Val或Leu(Ile75Phe/Val/Leu)和/或Val131Leu。在一个实施方案中，R1包含SEQID NO：2的氨基酸24-231，或其等位基因变体，还任选地被修饰组I中定义的一个或多个修饰所修饰。在另一个实施方案中，R1是SEQ ID NO：2的氨基酸1-231，或其等位基因变体，其具有至少一个选自修饰组I的修饰。这些修饰能为新的多肽提供特别需要的性质，例如，提高的溶解度，减少的免疫原性，提高的PK，提高的产生特征，和/或提高的阻断IL-4和/或IL-13活性的能力。
修饰组1：在SEQ ID NO：2的位置67，68，71，152，164，171，172，175，198，和/或207处的氨基酸被替换为不同的氨基酸。在优选的实施方案中，氨基酸取代如下：在位置67的Leu被替换为Tyr(Leu67Tyr)；Leu68Asn，其可以去除疏水碎片(patch)，且在特定的为了提高溶解度和/或阻断IL-4和/或IL-13的能力的情形下可能是希望的；Asp171Tyr/Phe；Phe172Ser，其可以中和酸性电位和减小疏水碎片的大小，从而可以用于提高溶解度和/或折叠融合多肽；Tyr152Phe，其能改变在配体结合位点的氨基酸，因而可以用于提高对IL-13和/或IL-4的抑制活性；Arg198Ser，其能去除带正电荷的碎片，因而可以用于提高纯化性质；和Cys207Ser，其能减少异常的二硫键的形成，因而可以用于减少共价聚集和/或错误的二硫键合。能导致糖基化位点的添加的修饰包括Ala71Asn和Trp164Ser。在一些实施方案中，需要添加一个或多个糖基化位点，以相对于没有额外的糖基化位点的相同蛋白质，减少免疫原性，或增加溶解度或体内稳定性。在优选的实施方案中，R1包含SEQ ID NO：2的1-231，其具有Cys207Ser，还被在位置67，68，152，171和172中的一个或多个位置处的变化所修饰。在优选的实施方案中，R1包含在下述位置的修饰：(i)67，68和207；(ii)67，68，152和207；(iii)152和207；(iv)67，171，172和207；(v)68，171，172，和207；(vi)67，68，171和207；(vii)67，68，172和207；(viii)152，171，172和207；(ix)67，68，171，172和207；(x)67，68，152，171，172和207；(xi)171，172，和207。在其它优选的实施方案中，R1包含Cys 207Ser和选自下述的修饰：(i)Leu67Tyr+Leu68Asn，(ii)Tyr152Phe，(iii)Asp171Tyr/Phe+Phe172Ser，(iv)Leu67Tyr+Leu68Asn+Tyr152Phe，(v)Tyr152Phe+Asp171Tyr/Phe+Phe172Ser，(vi)Leu67Tyr+Leu68Asn+Asp171Tyr/Phe+Phe172Ser，(vii)Tyr152Phe+Leu67Tyr+Leu68Asn+Asp171Tyr/Phe+Phe172Ser。
R2：天然产生的人野生型IL-13Rα1蛋白是427个氨基酸的蛋白质，其具有SEQ ID NO：3的序列，包括343个氨基酸的细胞外结构域。在一个实施方案中，R2是结合IL-13的多肽组分，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸1-343或27-343，任选地被修饰组II中定义的一个或多个修饰所修饰。在另一个实施方案中，R2是结合IL-13的多肽组分，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸1-343或23-343，任选地被修饰组III中定义的一个或多个修饰所修饰。
修饰组II：(a)SEQ ID NO：3的氨基酸1-120被替换为人gp130(SEQ ID NO：5)的氨基酸1-123；(b)删除SEQ ID NO：3的氨基酸338-343；(c)SEQ ID NO：3的氨基酸1-26被替换为不同的信号序列，例如，SEQ ID NO：6，或(d)在SEQ ID NO：3的位置46，73，143，235，293和/或329处的一个或多个氨基酸被替换为不同的氨基酸。在更具体的实施方案中，优选的替换是：在(SEQ ID NO：3的)位置46的Cys被替换为Ala，Gly，或Tyr中的任一个(Cys46Ala/Gly/Tyr)，优选地被替换为Ala，其在特殊的实施方案中，可以用于减少异常的二硫键形成和共价聚集体；Lys73Gln；Lys143Gln，其能去除带高度正电荷的碎片，且可以在特殊的实施方案中用于减少聚集和/或增加溶解度。可以在一个或多个糖基化位点处进一步修饰R2，以去除未完全糖基化的位点，且可以用于提高药物动力学和/或生产一致性：Asn235Ser/His，Asn293Gly，Asn329Asp。
修饰组III：(a′)删除SEQ ID NO：4的氨基酸1-22。在特殊的实施方案中，可能需要用例如信号序列如SEQ ID NO：6替代删除的氨基酸，从而去除Cys22，以减少异常的二硫键形成；(b′)SEQ ID NO：4的Cys252Ile；(c′)在SEQ ID NO：4的位置310处改变的氨基酸。在一个具体的实施方案中，Ser310被替换为Cys，其可以用于稳定蛋白的三级结构。
任选的融合组分(F)是能增强融合多肽的功能性的任意组分。因而，例如，融合组分可以增强融合多肽的生物活性，辅助它的产生和/或回收，或增强融合多肽的药理学性质或药物动力学特性，通过例如增强它的血清半衰期、组织渗透性、免疫原性缺乏或稳定性。在优选的实施方案中，融合组分选自多聚化(multimerizing)组分，血清蛋白，或能结合血清蛋白的分子。
当融合组分是多聚化组分时，它包括任意的天然或合成的序列，其能与另一种多聚化组分相互作用而形成高级结构，例如，二聚体、三聚体等。在具体的实施方案中，多聚化组分选自(i)免疫球蛋白-衍生的结构域，(ii)可剪切的区域(C-区域)，(ii)1至约500个氨基酸长的氨基酸序列，任选地包含至少一个半胱氨酸残基，(iii)亮氨酸拉链，(iv)螺旋环基序，和(v)卷曲-卷曲基序。在一个更具体的实施方案中，免疫球蛋白-衍生的结构域选自IgG的Fc结构域或IgG的重链。在一个最具体的实施方案中，IgG的Fc结构域是人FcΔ1(a)，即缺失了参与和轻链形成二硫键的区域的Fc分子。
当融合组分是血清蛋白时，血清蛋白可以是任意的血清蛋白或血清蛋白的片段，例如α-1-微球蛋白，AGP-1，白蛋白，维生素D结合蛋白，血红素结合蛋白，afamin，或触珠蛋白。当融合组分是能结合血清蛋白的分子时，它可以是小分子，核酸，肽，或寡糖。它也可以是蛋白质例如FcγR1，ScFv，等。在优选的实施方案中，融合组分由核酸编码，后者编码本发明的融合多肽。但是，在一些实施方案中，例如当融合组分是寡糖时，融合组分翻译后地结合到表达的融合多肽上。
本发明的核酸分子还可以任选地包含信号序列(SS)组分。当SS是多肽的一部分时，可以使用本领域已知的任何SS，包括任何来源的合成的或天然的序列，例如，来自分泌的或膜结合的蛋白。在一个优选的实施方案中，使用ROR信号序列(SEQ ID NO：6)。
在相关的第二方面，本发明表征了包含本发明的核酸分子的载体。在进一步的第三和第四方面，本发明包括包含本发明的核酸分子的载体，包括包含与表达控制序列可操作地连接的核酸分子的表达载体，和用于在合适的宿主细胞中产生融合多肽的宿主-载体系统，其包含表达载体；宿主-载体系统，其中合适的宿主细胞是，但不限于，细菌，酵母，昆虫，哺乳动物细胞，或植物例如烟草，或动物例如奶牛，小鼠，或兔子。合适的细胞的实例包括大肠杆菌(E.coli)，枯草芽胞杆菌(B.subtilis)，BHK，COS和CHO细胞。另外包括通过乙酰化或PEG化修饰的本发明的融合多肽。
在有关的第五方面，本发明表征了生产本发明的融合多肽的方法，其包括，在适合宿主细胞表达蛋白质的条件下，培养用包含本发明的核酸分子的载体转染的宿主细胞，和回收这样产生的多肽。
在第六、第七和第八方面，本发明表征了包含(R1)x-(R2)y-F的IL-4和IL-13融合多肽，其中R1、R2、F、x和y如上所定义。在一个优选的实施方案中，x和y是1-3；更优选地，x和y分别是1。
在第九方面，本发明表征了多聚多肽，其包含2个或更多个本发明的融合多肽。在更具体的实施方案中，多聚多肽是二聚体。本发明的二聚的IL-4/13-特异性的融合多肽能以至少10-10M的IC50抑制IL-4和IL-13，如通过本领域已知的测定方法所测得的。可以例如用下述的TF1生物测定法来测定IC50。通常，例如通过游离的和/或结合的配体的生物测定法或ELISA，可以测量二聚的IL-4/13融合多肽抑制(例如，阻断)hIL-4和hIL-13的生物活性的能力。生物测定法可以包括使用STAT6启动子元件的基于萤光素酶的测定法，和/或细胞系例如TF1或人外周血细胞的hIL-4或hIL-13刺激，其以例如生长或sCD23分泌的形式显示。在本发明的二聚的IL-4/13多肽的不同实施方案中，修饰R1组分，以表现出增加的或减少的阻断hIL-4活性和/或hIL-13活性的能力，和/或修饰R2组分，以表现出增加的或减少的阻断IL-4活性和/或IL-13活性的能力。
在第十方面，本发明表征了药物组合物，其包含本发明的融合多肽和药学上可接受的载体。这样的药物组合物可以包含单体的或多聚的多肽，或编码该融合多肽的核酸。
本发明的IL-4/13特异性的多肽在治疗上可以用于治疗能通过去除、抑制或减少IL-4和/或IL-13而被改进、改善或抑制的任何疾病或病状。这些多肽特别适用于治疗能通过去除、抑制或减少IL-4和IL-13而被改进、改善或抑制的病状，例如哮喘。因此，在另一个方面，本发明表征了用于治疗IL-4和/或IL-13有关的疾病或病状的治疗方法，其包括将本发明的融合多肽施用给患有IL-4和/或IL-13有关的疾病或病状的受试者。尽管本发明的治疗方法可以治疗任意的哺乳动物，但受试者优选地是人患者，其患有能用本发明的融合多肽改进、改善、抑制或治疗的病状或疾病，或处于患有这些病状或疾病的风险中。
在另一个方面，本发明还表征了诊断和预后方法，以及试剂盒，后者使用本发明的融合多肽检测、定量和/或监测IL-4和/或IL-13。
阅读下面的详细描述，可以明白其它目的和优点。
发明详述
在描述本方法之前，应当理解本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为这样的方法和条件可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅仅用于描述特定实施方案的目的，无意进行限制，因为本发明的范围仅仅由所附权利要求书进行限制。
如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数形式，除非上下文另有清楚的说明。因而，例如，“一种方法”包括一种或多种方法，和/或本文所述的和/或本领域的技术人员能在阅读本公开内容等以后明白的类型的步骤。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管在实现或测试本发明时，可以使用类似于或等同于本文所述的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。在本文中提及的所有出版物都引作参考，以描述与引用的出版物有关的方法和/或材料。
定义
术语对IL-4和/或IL-13的″亲和力″指，本发明的融合多肽能以至少10-10M、优选地至少10-11M的亲和力结合所希望的细胞因子，如通过本领域已知的测定方法所测得的，例如，BiaCore分析。术语″能特异性地阻断″或“能抑制IL-4和/或IL-13的活性”指，本发明的IL-4/13融合多肽能抑制靶细胞因子的生物活性，如通过例如游离的和/或结合的配体的生物测定法或ELISA所测得的。生物测定法可以包括使用STAT6启动子元件的基于萤光素酶的测定法，和/或细胞系例如TF1或人外周血细胞的IL-4或IL-13刺激，其以例如生长或sCD23分泌的形式显示。″IC50″被定义为，抑制50％对IL-4或IL-13的反应所需的融合蛋白的浓度，如在生物测定法中测得的。本发明的融合多肽优选地能以至少1×10-10M、更优选地10-11M(对IL-13)的IC50抑制IL-4和/或IL-13的生物活性。
术语“治疗”等在本文中通常用于指得到需要的药理学和/或生理效应。该效应可以是预防性的，完全或部分地预防疾病、病状或其症状，和/或可以是治疗性的，部分或完全治愈疾病或病状和/或由于疾病或病状导致的不良结果。如本文使用的，″治疗″涵盖哺乳动物、尤其是人的疾病或病状的任何治疗，包括：(a)预防疾病或病状在易患该疾病或病状但是尚未确诊患有它的受试者中发生；(b)抑制疾病或病状，即，阻止它的发展；或(c)缓解疾病或病状，即，造成疾病或病状的消退。通过本发明的方法治疗的受试者群体包括患有不希望的病状或疾病的受试者，以及处于形成病状或疾病的危险中的受试者。
术语″治疗有效剂量″指，能产生施用它所希望的效应的剂量。准确剂量依赖于治疗目的，本领域的技术人员使用已知的技术(见，例如，Lloyd(1999)The Art，Science and Technology of PharmaceuticalCompounding)可以确定其剂量。
如本文使用的，″病状或疾病″通常包括哺乳动物宿主、尤其是人宿主的病状，它是宿主不希望的和/或有害的。因而，用IL-4/13特异性的融合多肽治疗病状或病症包括治疗哺乳动物，尤其是人，其具有能反映提高的或有害的IL-4和/或IL-13的症状，或预期其具有疾病、病状或治疗方案引起的这种降低的活化。治疗IL-4和/或IL-13有关的病状或疾病，包括治疗人受试者，其中用本发明的融合多肽降低IL-4和/或IL-13水平，会导致IL-4和/或IL-13有关的病状或疾病引起的不希望的症状的改善。
一般描述
在缺乏IL-4和IL-13的动物中的研究已经证实，这些细胞因子在诱导Th2-样反应例如嗜曙红细胞浸润、免疫球蛋白E产生和IL-5产生中起重叠和附加的作用(McKenzie等(1999)J.Exp.Med.189(10)：1565-72)。本发明提供了新的多肽，单体和多聚体，其能起IL-4和/或IL-13特异性的融合多肽或拮抗剂的作用，所述IL-4和/或IL-13特异性的融合多肽或拮抗剂能结合IL-4和/或IL-13并阻断这些生物作用。
核酸构建体和表达
本发明提供了能编码IL-4/13特异性的多肽的核酸分子的构建。如上所述，本发明的核酸分子能编码野生型(或天然产生的)人IL-4Rα和/或IL-13Rα蛋白的修饰的片段。因此，核酸分子可以称作″重组的″，″人工的″，或″合成的″，因为它们不是天然发现的核酸分子，例如，不是天然产生的序列，而是通过重组DNA技术构建的序列。
将这些核酸分子插入当导入适当的宿主细胞时能表达本发明的融合多肽的载体中。适当的宿主细胞包括但不限于，细菌，酵母，昆虫，和哺乳动物细胞。可以使用本领域的技术人员已知的将DNA片段插入载体的任一种方法，构建编码在转录和/或翻译控制信号控制下的本发明的融合多肽的表达载体。
本发明的核酸分子的表达，可以由第二个核酸序列调节，以便在用重组DNA分子转化的宿主中表达该分子。例如，表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子元件控制。可以用于控制嵌合多肽分子的表达的启动子包括但不限于，长末端重复序列(Squinto等(1991)Cell 65：1-20)；SV40早期启动子区域，CMV，M-MuLV，胸苷激酶启动子，金属硫蛋白(metallothionine)基因的调节序列；原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子，或tac启动子(也见Scientific American(1980)242：74-94)；来自酵母或其它真菌的启动子元件，例如Gal 4启动子，ADH，PGK，碱性磷酸酶，和源自基因例如弹性蛋白酶I的组织特异性的转录控制区。
使用能在细菌或真核宿主中复制的包含本发明核酸分子的表达载体来转染宿主，从而指导这样的核酸的表达，以产生本发明的融合多肽。转染的细胞可以短暂地或优选组成性地且永久地表达本发明的多肽。当这样表达的多肽包含融合组分例如能结合第二个多肽的多聚化组分的多聚化组分时，由于多聚化组分之间的相互作用，这样表达的单体会多聚化，从而形成多聚多肽(WO 00/18932)。
通过本领域已知的任何技术，可以纯化本发明的融合多肽。当本发明的多肽包含多聚化组分时，其自发地与另一个多肽形成多聚体，使用的纯化技术允许随后形成稳定的、生物活性的多聚多肽，其也称作″融合多肽″。例如，且不作为限制，可以作为可溶蛋白或作为包涵体从细胞中回收这些因子，通过8M盐酸胍和渗析，可以从中定量提取这些因子(见，例如，US专利5,663,304)。为了进一步纯化这些因子，可以使用常规的离子交换色谱，疏水相互作用色谱，反相色谱或凝胶过滤。
融合组分
本发明的融合多肽包含融合组分(F)，在具体的实施方案中，其选自多聚化组分，血清蛋白，或能结合血清蛋白的分子。当F是多聚化组分时，它包括任何天然的或合成的序列，其能与另一个多聚化组分相互作用，形成高级结构，例如，二聚体，三聚体等。多聚化组分可以选自(i)包含可剪切区的多聚化组分，(ii)截短的多聚化组分，(iii)1至约500个氨基酸长的氨基酸序列，(iv)亮氨酸拉链，(v)螺旋环基序，和(vi)卷曲-卷曲基序。当F是包含1至约500个氨基酸长的多聚化组分时，该序列可以含有一个或多个半胱氨酸残基，其能与另一个包含具有一个或多个半胱氨酸残基的F的融合多肽上的对应半胱氨酸残基形成二硫键。
在一个优选的实施方案中，多聚化组分包含一个或多个来自人IgG，IgM或IgA的免疫球蛋白-衍生的结构域。在具体的实施方案中，免疫球蛋白-衍生的结构域选自IgG的Fc结构域或IgG的重链。IgG的Fc结构域可以选自同种型IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，以及每个同种型组中的任意异型。在一个具体的实施方案中，F是IgG4的Fc结构域，其Ser 228(Cabot编号)突变成Pro，以稳定共价二聚体形成(Mol.Immunol.(1993)30：105-108)，和/或Leu235→Glu，其能消除残余效应物功能(Reddy等(2000)J.Immunol.164：1925-1933)。在一个优选的实施方案中，F是IgG1的Fc结构域，或其衍生物，为特别需要的性质，可以修饰它(见，例如，Armour等(2003)Mol.Immunol.40：585-593；Shields等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。在具体的实施方案中，本发明的IL-4/13特异性的多肽包含1个或2个IgG1的Fc结构域。
在一个实施方案中，F是血清蛋白或其片段，选自α-1-微球蛋白，AGP-1，血清类粘蛋白，α-1-酸性糖蛋白，维生素D结合蛋白(DBP)，血红素结合蛋白，人血清白蛋白(hSA)，转铁蛋白，铁蛋白，afamin，触珠蛋白，α-胎儿球蛋白甲状腺球蛋白，α-2-HS-糖蛋白，β-2-糖蛋白，透明质烷结合蛋白，突触融合蛋白，C1R，C1q a链，galectin3-Mac2结合蛋白，纤维蛋白原，聚合的Ig受体(PIGR)，α-2-巨球蛋白，尿素(urea)转运蛋白，触珠蛋白，IGFBPs，巨噬细胞消除受体，纤连蛋白，giantin，Fc，α-1-抗胰凝乳蛋白酶(α-1-antichyromotrypsin)，α-1-抗胰蛋白酶，抗凝血酶III，载脂蛋白A-I，载脂蛋白B，β-2-微球蛋白，血浆铜蓝蛋白，补体组分C3或C4，C1酯酶抑制剂，C-反应蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，和C蛋白。在一个更具体的实施方案中，F选自α-1-微球蛋白，AGP-1，血清类粘蛋白，α-1-酸性糖蛋白，维生素D结合蛋白(DBP)，血红素结合蛋白，人血清白蛋白(hSA)，afamin，和触珠蛋白。当需要时，F组分的包含，可以延长本发明的IL-4/13特异性的多肽的血清半衰期。见，例如，US专利号6,423,512、5,876,969、6,593,295和6,548,653，例如血清白蛋白融合蛋白。
当F是能结合血清蛋白的分子时，该分子可以是合成的小分子，脂类或脂质体，核酸，包括合成的核酸例如aptomer，肽，或寡糖。该分子还可以是蛋白质，例如，FcγR1，FcγR2，FcγR3，聚合的Ig受体(PIGR)，ScFv，和对血清蛋白特异性的其它抗体片段。
任选的组分间隔物
本发明的融合多肽的组分可以直接彼此相连，或通过间隔物相连。通常，术语″间隔物″(或连接物)指一个或多个分子，例如，核酸或氨基酸，或非肽部分，例如聚乙二醇，其可以插入一个或多个组分结构域之间。例如，间隔物序列可以用于提供需要的组分之间的目标位点，以方便操作。还可以提供间隔物，以增强宿主细胞对融合蛋白的表达，减少位阻，以便组分可以采取它的最佳的三级结构和/或与它的靶分子适当地相互作用。关于间隔物和鉴别需要的间隔物的方法，见，例如，George等(2003)Protein Engineering 15：871-879。间隔物序列可以包括一个或多个天然地连接到受体组分上的氨基酸，或可以是附加的序列，其用于增强融合蛋白的表达，提供特别需要的目标位点，允许组分结构域形成最佳的三级结构和/或增强组分与它的靶分子的相互作用。在一个实施方案中，间隔物包含在一个或多个组分之间的一个或多个肽序列，其具有1-100个氨基酸，优选地1-25个氨基酸。在一个具体的实施方案中，间隔物是3个氨基酸的序列；更具体地，是Gly SerGly的3个氨基酸序列。
IL-4和/或IL-13生物活性的抑制
本发明的融合多肽能以至少1×10-10M(对于二者)、甚至更优选地10-11M(对于IL-13)的IC50(抑制50％对IL-4或IL-13的反应所需的融合蛋白的浓度)，抑制IL-4和/或IL-13的生物活性。下面表1-7中所示的数据，是在IL-4或IL-13刺激生长的TF1生物测定法中测得的，如下所述。用于测定IC50的其它生物测定法，是本领域已知的，包括例如，使用STAT6启动子元件的基于萤光素酶的测定法，和/或人外周血细胞的hIL-4或hIL-13刺激，其以例如sCD23分泌的形式显示。下面表1-7中所示的数据，显示为与亲本分子的倍数差异(变体融合多肽的IC50值除以亲本1132分子的IC50值)。如下面的实验所证实的，相对于亲本分子，变体融合多肽可以具有提高1.5-3.0倍或甚至更高的阻断IL-4和/或IL-13的能力。在具体的实施方案中，本发明的变体融合多肽的阻断IL-4和/或IL-13的能力具有至少2.0倍提高或更大，至少2.5倍提高或更大，或甚至至少3-倍提高或更大。
治疗应用
本发明的融合多肽在治疗上可以用于治疗能通过去除、抑制或减少IL-4和/或IL-13而得到改进、改善、抑制或预防的任何疾病或病状。IL-4和IL-13独立地或一起地，已经涉入许多临床病状，例如嗜曙红细胞浸润、IgE产生和IL-5产生，其特征在于Th2细胞驱动的反应。因此，用融合多肽阻断这些反应，可以治疗其中存在增加的TH2型T-辅助细胞发生的任何疾病或病状。
在一个实施方案中，IL-4/13融合多肽用于治疗哮喘。源自动物实验和哮喘患者的检查的数据表明，IL-4和IL-3是特应性的病状的关键引发剂和作为哮喘肺的典型特征的慢性炎症状态永久保持剂。IL-4和IL-13能诱导与哮喘表型有关的效应，包括同种型转变成IgE的产生，嗜曙红细胞增多，肥大细胞增多症，粘液形成，增加的血管渗透性，气道高反应性，平滑肌增生，和上皮下纤维化(Hogan等(1997)Pharmcol.Ther.74(3)：259-283；McKenzie等(2000)Pharmacol.Ther.88(2)：143-151；Wills-Karp(2001)J.Allergy Clin.Immunol.，107(1)：9-18)。实际上，小鼠中对变应原的IgE反应的发展，需要IL-4和IL-13信号传导，在IL-4Ra缺陷的小鼠中，减弱了对卵白蛋白的哮喘反应的发展。而且，在小鼠肺中的IL-4或IL-13的转基因表达，会导致哮喘表型，其可以通过将IL-4或IL-13蛋白直接施用进鼠肺中来模仿。因此，预期IL-4和IL-13的阻断，会导致一些或所有上述参数的减轻。而且，由于IL-4或IL-13的独立启动信号传导级联反应和诱导哮喘表型的能力，同时抑制这两种分子可以导致更有效的抗哮喘效应。
通过抑制或减少IL-4和/或IL-13而提高的具体病状的非穷尽列表包括特应性皮炎，免疫复合物病(例如狼疮，肾炎，和Grave′s病)，过敏性病状，高IgE综合征，免疫缺陷，特发性肺纤维化，肝纤维化，HIV，肺‘重塑’，COPD，溃疡性结肠炎，癌症，何杰金淋巴瘤，大疱性类天疱疮，移植物和嫁接物抗宿主病，病毒、寄生物、细菌性疾病和真菌感染(12/11/01发生的U.S.6,328,954。Idzerda，R.J.等1990JExp.Med.171：861-873)。
在可选的实施方案中，融合多肽用作疫苗的佐剂，以促进对细胞介导的免疫之一的免疫反应，其经常伴有Ig同种型以及CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应的变化。CTL主要是CD8阳性T细胞，其能辅助破坏病毒或细胞内细菌感染的细胞和肿瘤细胞。
合适的治疗受试者
合适的治疗受试者是被诊断出患有能通过抑制或减少IL-4和/或IL-13可得到改善的特定病状的人，包括特应性皮炎，免疫复合物病(例如狼疮，肾炎，和Grave′s病)，过敏性病状，高IgE综合征，免疫缺陷，特发性肺纤维化，肝纤维化，HIV，肺‘重塑’，COPD，溃疡性结肠炎，癌症，何杰金淋巴瘤，大疱性类天疱疮，移植物和嫁接物抗宿主病，病毒、寄生物、细菌性疾病和真菌感染。
联合疗法
在许多实施方案中，本发明的融合多肽可以与一种或多种其它的化合物或疗法组合施用。组合包括，短效的吸入的β2激动剂，口服的β2激动剂，吸入的抗胆碱能药，口服的皮质类固醇，吸入的皮质类固醇，色甘酸二钠(GastrocromTM/Celltech)，奈多罗米，长效β2激动剂，白三烯调节物，茶碱，钙调磷酸酶抑制剂，picrolimus，西罗莫司，抗-IgE(ZolairTM，Genentech)，NFKB抑制剂，p38MAP激酶抑制剂(VX-702)，ICE抑制剂(VX-765)，IL-1抑制剂(IL-1特异性的融合多肽，Regeneron；阿那白滞素，Amgen)，TNFa抑制剂(RemicadeTM，Centocor；EnbrelTM，Amgen；HumiraTM，Abbott)，IL-5抑制剂，IL-18抑制剂，IFNY抑制剂，IFNα阻断剂。例如，可以共同施用多种融合多肽，或可以将一种或多种多肽与一种或多种治疗化合物一起施用。当本发明的多肽去除IL-4和/或IL-13时，一种或多种其它的治疗剂是用于预防或治疗与IL-4和/或IL-13的存在有关的病状的治疗剂。组合使用本发明的融合多肽和第二种治疗剂的优点是，能提供任一种治疗剂的提高的功效和/或减少的毒性。
施用方法
本发明提供了治疗方法，包括给受试者施用有效量的本发明的融合多肽。在一个优选的方面，融合多肽是基本上纯的(例如，基本上不含有会限制它的作用或产生不希望的副作用的物质)。受试者优选地是哺乳动物，最优选人。
多种输送系统是已知的，且可以用于施用本发明的试剂，例如，包封在脂质体、微粒、微胶囊中，能表达该化合物的重组细胞，受体介导的胞吞作用(见，例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)，作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建，等。导入方法可以是肠内的或肠胃外的，包括但不限于皮内的，肌肉内的，关节内的，输注polypeptideeritoneal，静脉内的，皮下的，鼻内的，眼内的，和口服的途径。可以通过任何方便的途径施用化合物，例如通过输注或推注注射，通过经上皮或粘膜皮肤层(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜，等)的吸收，且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。施用可以是急性的或长期的(例如，每天，每周，每月，等)，或与其它试剂相组合。也可以采用肺施用，例如，通过使用吸入器或雾化器，和具有气溶胶化剂的制剂。
在另一个实施方案中，可以在介质、尤其是脂质体中，在受控释放系统中，或在泵中，输送活性剂。在另一个其中本发明的活性剂是能编码蛋白质的核酸的实施方案中，可以体内地施用核酸，以促进它编码的蛋白质的表达，方法是构建它作为适当的核酸表达载体的一部分，并施用它，以便使它变成细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(见，例如，U.S.专利号4,980,286)，通过直接注射，或通过使用微粒轰击，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过与已知能进入核的同源框样肽连接地施用它(见例如，Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)，等。或者，可以细胞内地导入核酸，并通过同源重组整合在宿主细胞DNA中以便表达。通过质粒注射(皮内地或肌肉内地)和电穿孔进细胞，也可以实现全身表达。
在一个具体的实施方案中，可以希望局部地施用本发明的药物组合物到需要治疗的区域；这可以得到实现，例如，但不作为限制，通过手术过程中的局部输注，局部应用，例如，通过注射，借助于导管，或借助于植入物，该植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜，例如sialastic膜，纤维，或商业的皮肤替代品。
用于实现本发明的方法的组合物可以是液体，其包含有在溶液、悬浮液或二者中的本发明的试剂。术语″溶液/悬浮液″指液体组合物，其中活性剂的第一部分存在于溶液中，和活性剂的第二部分以颗粒形式存在于在液体基质中的悬浮液中。液体组合物也包括凝胶。液体组合物可以是水性的，或软膏的形式。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物是持续释放的组合物。用于输送生物活性肽的持续释放制剂是本领域已知的。例如，US6,740,634，描述了一种持续释放制剂，其含有生物活性物质的羟基萘甲酸盐和生物可降解聚合物。US6,699,500公开了一种持续释放制剂，其能在至少5个月的时间内释放生理活性物质。
诊断和筛选方法
本发明的融合多肽可以用于诊断和/或筛选方法中。例如，融合多肽可以用于监测临床研究过程中IL-4和/或IL-13的水平，以评价治疗功效。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物用于筛选进入临床研究的个体，以鉴别具有例如太高或太低水平的IL-4和/或IL-13的个体。本发明的融合多肽可以用于本领域已知的与IL-4和/或IL-13的定位和活性有关的方法中，例如，诊断方法中的成像、测量其在适当的生理样品中的水平，等。
本发明的融合多肽可以用于体内和体外筛选测定法中，以定量例如存在于筛选方法中的未结合的IL-4和/或IL-13的量，以鉴别能降低IL-4和/或IL-13的表达的测试试剂。更一般地，本发明的融合多肽可以用在其中希望定量和/或分离IL-4和/或IL-13的任何测定法或方法中。
药物组合物
本发明也提供了药物组合物，其包含本发明的融合多肽。这样的组合物包含治疗有效量的一种或多种融合多肽，和药学上可接受的载体。术语″药学上可接受的″指，对于用于动物，更特别地用于人，被联邦或州政府的管理机构批准，或列在美国药典或其它通常公认的药典中。术语″载体″指与治疗剂一起施用的稀释剂，佐剂，赋形剂，或介质。这样的药物载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，稻米，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，脱脂奶粉，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇等。如果需要，组合物也可以含有小量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等的形式。合适的药物载体的实例记载在E.W.Martin的″Remington′s PharmaceuticalSciences″中。
本发明的融合多肽可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括用游离氨基形成的那些，例如源自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的那些，和用游离羧基形成的那些，例如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。
基于本说明书，通过标准临床技术，可以确定对于其所希望的治疗应用有效的融合多肽的量。另外，可以任选地采用体外测定法，以辅助鉴别最佳的剂量范围。通常，静脉内施用的合适的剂量范围通常是约0.02-10毫克活性化合物/千克体重。鼻内施用的合适的剂量范围通常是约0.01pg/kg体重至10mg/kg体重。从源自体外或动物模型测试系统的剂量-效应曲线，可以外推出有效剂量。当然，施用的化合物的量依赖于接受治疗的受试者，受试者的体重，疾病的严重性，施用方式，和处方医生的判断。在症状可检测时，或甚至当它们不可检测时，可以间歇地重复该治疗。
细胞转染和基因治疗
本发明包括能编码本发明的融合多肽的核酸在体外和体内细胞转染中的应用。可以将这些核酸插入众多公知的用于转染靶细胞和生物体的载体之任一。通过由脂质混合物或电穿孔促进的载体和靶细胞的相互作用，可以将核酸离体和体内地转染进细胞。以足以引起治疗反应的量，将组合物施用(例如，通过注射进肌肉)给受试者。足以完成它的量，被定义为″治疗有效剂量或量″。
在另一个方面，本发明提供了减少人或其它动物中的IL-4和/或IL-13水平的方法，其包括用编码本发明的多肽的核酸转染细胞，其中所述核酸包含可诱导的启动子，其可操作地连接到编码所述多肽的核酸上。关于在治疗或预防人疾病中的基因治疗方法，见例如，Van Brunt(1998)Biotechnology 6：1149-1154。
试剂盒
本发明也提供了药物包或试剂盒，其包含一个或多个容器，其中装有一种或多种本发明的药物组合物的成分。任选地，这样的容器伴有由负责管理药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的通告，该通告反映了(a)该生产、使用或销售的管理机构对于人施用的批准，(b)使用说明，或二者。
实施例
提出了下面的实施例，以便为本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完全公开和描述，且无意限制发明人认为是他们的发明的内容的范围。已经进行了确保使用的数值(例如，数量，温度，等)的准确性的努力，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
实施例1.IL-4/13变体融合多肽的构建
为了建立亲本IL-4/13融合多肽，1132(SEQ ID NO：8)，使用标准的PCR技术，扩增了编码人IL-4Rα细胞外结构域(SEQ ID NO：1-2)和人IL-13Rα1细胞外结构域(SEQ ID NO：3的27-343)的核酸，并连接进含有人Fc序列的表达载体，从而建立融合蛋白，其从N至C端，由IL-4Rα和/或IL-13Rα1，和人IgG1的铰链区、CH2和CH3区域组成。使用本领域已知的标准技术，通过定位诱变，导入以下取代：SEQ ID NO：8的Cys207→Ser和SEQ ID NO：8的Cys251→Ala(Cys251相应于SEQID NO：3的Cys46)。通过标准的技术，证实所有序列。使用标准的分子生物学技术，将适当的编码序列亚克隆进真核表达载体中。使用本领域已知的技术，通过亲本1132融合多肽的定位诱变，建立了IL-4/13融合多肽变体，并通过测序加以证实。
使用Lipofectamine/LIPO PlusTM(Life Technologies)，通过用能编码变体蛋白的DNA构建体瞬时转染CHO细胞，作为小规模上清液产生变体IL-4/13融合多肽。72小时后，收集上清液，并通过使用抗-人Fc HRP-缀合的抗体(Promega)的蛋白质印迹测量蛋白表达和通过ECL(Pierce)显现。为了大规模纯化变体IL/4/13融合多肽，使用FASTR技术(US专利申请公开20020168702)，将能编码融合蛋白的DNA转染进CHO细胞，以瞬时表达或建立稳定的株系。收集来自1-2升能表达融合蛋白的细胞的培养基，并经过A蛋白柱，以捕获含有Fc的融合蛋白。根据生产商的技术方案(Amersham)，进行A蛋白纯化。浓缩后，表征融合蛋白的污染性聚集物的百分比，并通过使用Superdex 200柱(Amersham)或类似柱的尺寸排阻色谱(SEC)进一步纯化。
使用标准的方法，包括20个冻/融循环后通过SEC和蛋白质印迹进行分析，在37℃、在低(10mM磷酸钠缓冲液)和中盐(PBS)缓冲液中温育蛋白7天，或于在各种pH缓冲的PBS溶液中温育蛋白2小时，来评价变体IL-4/13融合多肽的稳定性。
通过给小鼠或大鼠静脉内或皮下注射1mg/kg IL-4/13融合多肽变体，在不同的时间点收集血液，并分离血清，检测分子的药物动力学。使用ELISA，用抗-IL-13Ra单克隆抗体捕获融合蛋白，用生物素化的抗-IL-4Ra单克隆抗体形成复合物，并用链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物检测复合物，来分析血清样品中变体融合多肽的量。通过对比来自血清样品的OD和从使用纯化的融合蛋白生成的标准曲线得到的OD，确定融合多肽的浓度。还使用用于检测的3种抗体(抗-IL-13Ra、抗-IL-4Ra或抗-人Fc抗体和HRP-缀合的二抗)之一，通过1ul血清的蛋白质印迹分析，监测融合多肽质量。
实施例2.变体融合多肽对hIL-4和hIL-13生物活性的抑制
TF1生物测定法。将已经用hIL-13Rα1稳定转染的TF1细胞维持在生长培养基(10ng/ml GM-CSF，RPMI 1640，10％FBS，L-谷氨酰胺，青霉素，链霉素)中。为了生物测定，在测定培养基(同上，但是没有GM-CSF)中洗涤细胞3次，然后以2×104细胞涂布在50μl测定培养基中。将纯化的融合多肽系列稀释进测定培养基中。将25ul每种变体IL-4/13融合多肽加入细胞中。然后，将25μl IL-13(15pM)或IL-4(20或40pM)加入含有细胞和融合多肽的孔中。然后，在37℃、5％CO2，温育细胞约70小时。根据生产商的技术方案(Dojindo Laboratories)，通过CCK-8测定法测量TF1细胞增殖的程度。
表1-7的所有生物测定法包括亲本IL-4/13融合多肽，1132(显示为具有信号序列的SEQ ID NO：8，该信号序列能从成熟的多肽剪切掉)(由SEQ ID NO：7编码)，其包含信号序列(氨基酸1-23)+IL-4Rα组分(SEQ ID NO：8的氨基酸24-231，具有Cys207→Ser)(相应于SEQ ID NO：2的24-231)+IL-13Rα1组分(SEQ ID NO：8的氨基酸232-548，具有Cys251→Ala)(Cys251相应于SEQ ID NO：3的Cys46)(相应于SEQ ID NO：3的27-343)+多聚化组分(IgG1 Fc)(SEQ IDNO：8的549-776)。除了另外特别指出的那些外(表1)，所有变体融合多肽含有亲本Cys207→Ser突变，且所有变体融合多肽含有IL-13Ra1组分中的Cys251→Ala(SEQ ID NO：3的Cys46)突变。见例如，SEQID NO：10(构建体2674；由SEQ ID NO：9编码)，SEQ ID NO：12(构建体2681；由SEQ ID NO：11编码)，SEQ ID NO：14(构建体2795；由SEQ ID NO：13编码)，和SEQ ID NO：16(构建体2796；由SEQ ID NO：15编码)，其包括最终会从成熟的融合多肽剪切掉的信号序列)。表1显示了亲本捕获剂(trap)，1132，和2个实施例变体融合蛋白的IC50数据(抑制50％细胞生长时的浓度)，以及变体融合多肽与亲本IL-4/13融合多肽1132的IC50值的倍数差异(亲本融合多肽的IC50除以变体融合多肽的IC50)。
表1.融合多肽2674和2681的IC50和倍数差异数据
  构建体   IL-4IC50(pM)   IL-13IC50(pM)   IL-4倍数差异   IL-13倍数差异
  113226742681   141±4964±3041±14   21±910±59±4 2.3±0.73.65±1.4 2.3±0.62.5±0.8
表2-6显示了使用CHO瞬时上清液测定的变体融合多肽的IC50生物测定值的倍数差异，通过蛋白质印迹分析测定其浓度。表2显示了具有半胱氨酸突变的变体阻断hIL-13或hIL-4活性的能力的IC50的倍数差异；表3显示了具有核心稳定化和活性位点突变的融合多肽变体阻断hIL-13或hIL-4活性的能力；表4显示了阻断hIL-13或hIL-4活性的电荷(charge)变化变体和组合；表5显示了阻断hIL-13或hIL-4活性的疏水碎片变体和组合；表6显示了具有IL-4RαN和C末端缺失的变体融合多肽的活性(都表示为相对于亲本融合多肽1132)。
表2.半胱氨酸变体的抑制IL-13和IL-4活性的能力
  构建体编号   从亲本分子的变化   IL-13抑制   IL-4抑制
  405   C207S，13Rα1C46A(亲本分子)   1   1
  2576   C207，13Rα1C46A   0.09-0.15   0.71-1.22
  2594   C207，13Rα1C46   0.01   0.22
  2615   C207S，13Rα1C46   0.58-1.29   0.65-1.04
  2575   Q206H，C207，13Rα1C46   0.01   0.35
  2551   C207H   0.07-0.13   0.50-0.84
  2588   C207N   0.23-0.40   0.92-1.38
  2589   C207D   0.9-0.15   0.57-0.61
  2590   C207E   0.06-0.10   0.63-0.68
  2591   C207Y   0.03-0.04   1.02-1.24
  2642   C207G   0.24-0.27   1.18-1.53
  2648   C207A   0.39-0.77   1.89-2.64
  2684   C207T   0.07-0.67   0.30-0.41
  2683   C207A，L67Y，L68N，Y152F   1.03   2.06
  2682   C207A，L67Y，L68N，D171Y，F172S 0.95-2.25   1.48-4.81
表3.核心稳定化和活性位点变体的阻断IL-13和IL-4活性的能力
  构建体编号   从亲本1132的变化   IL-13抑制   IL-4抑制
  2595   S42I   0.15   0.15
  2596   A105I   0.44   1.12
  2597   A199I   0.27   0.27
  2598   A203I   0.10   0.22
  2599   A205I   0.16   0.33
  2600   A203I，A205I   0.06   0.68
  2675   L60K   0.46   (n/a)
  2676   L60Q   0.23   (n/a)
  2677   L60Y   0.43   (n/a)
  2707   L64K   0.03-0.04   0.04
  2708   L64Y   0.03-0.06   0.04
  2560   Y152F   0.73-0.98   0.97-1.71
  2561   Y152K   0.15   0.16
  2562   Y152R   0.19-0.40   0.07-0.16
  2592   D150N   1.11-1.33   0.12-0.19
  2593   Y152H   0.31-0.37   0.09-0.15
  2601   L67Q，L68S，Y152F   0.77   0.31
  2586   Y152F，D171Y，F172S，Y175H   0.53-0.80   1.06-1.08
  2587   Y152F，D171Y，F172S，Y175H，R198S   0.50-0.57   0.70-1.02
  2651   L67Y，L68N，Y152F   1.57-1.58   2.30-2.96
表4.抑制IL-4和IL-13活性的电荷变体和组合变体
  构建体   从亲本1132的修饰   IL-13抑制   IL-4抑制
  2549   D171Y，F172S，Y175H   0.32-1.91   0.28-1.97
  2550   R198S   0.95-1.08   0.82-1.25
  2558   R198S，D171Y，F172S，Y175H   0.39-1.02   0.39-0.94
  2586   Y152F，D171Y，F172S，Y175H   0.53-0.80   1.06-1.08
  2587   Y152F，D171Y，F172S，Y175H，R198S   0.50-0.57   0.70-1.02
  2643   E70G   0.27   ＜0.10
  2644   E119T   0.21   0.36
  2645   E181A   0.46-0.90   0.29-0.91
  2646   STLK189-192H DAW   0.05   ＜0.10
  2647   D171Y，F172S   1.16-1.44   1.79-2.00
  2653   E181A，D171Y，F172S   0.55-1.44   0.71-1.71
  2680   D171Y，F172S，Y152F   0.72-1.00   1.01-1.30
  2688   D171Y   1.46-1.93   1.46-1.68
  2689   F172S   1.23-2.00   0.62-2.23
  2699   L67Y，D171Y   0.81-1.77   0.84-1.59
  2700   L67Y，F172S   1.22-1.56   0.91-0.98
  2701   L67Y，D171Y，F172S   1.02-1.65   1.14-1.44
  2702   L68N，D171Y   1.28-1.95   1.32-1.96
  2703   L68N，F172S   0.79-1.79   0.55-0.98
  2704   L68N，D171Y，F172S   1.10-2.29   1.01-2.07
  2705   L67Y，L68N，D171Y   0.89-2.15   1.25-2.74
  2706   L67Y，L68N，F172S   1.10-3.22   1.01-2.96
表5.疏水碎片和组合变体的抑制IL-13和IL-4活性的能力
  构建体   从亲本1132的变化   IL-13抑制   IL-4抑制
  2547   L67Q，L68S   0.45-0.90   0.13-0.24
  2601   L67Q，L68S，Y152F   0.77   0.31
  2602   L67Y，L68N   1.00-2.00   0.98-2.21
  2649   L67Y，L68N，D171Y，F172S，Y175H   1.38-1.48   0.84-0.98
  2650   L67Y，L68N，R198S   2.25-4.20   1.43-1.62
  2651   L67Y，L68N，Y152F   1.57-1.58   2.30-2.96
  2674   L67Y，L68N，D171Y，F172S   3.00-3.60   3.35-3.58
  2681   L67Y，L68N，D171Y，F172S，Y152F   1.46-3.60   2.09-5.70
  2686   L67Y   1.80-2.42   0.96-1.04
  2687   L68N   1.44-1.62   0.82-0.87
  2699   L67Y，D171Y   0.81-1.77   0.84-1.59
  2700   L67Y，F172S   1.22-1.56   0.91-0.98
  2701   L67Y，D171Y，F172S   1.02-1.65   1.14-1.44
  2702   L68N，D171Y   1.28-1.95   1.32-1.96
  2703   L68N，F172S   0.79-1.79   0.55-0.98
  2704   L68N，D171Y，F172S   1.10-2.29   1.01-2.07
  2705   L67Y，L68N，D171Y   0.89-2.15   1.25-2.74
  2706   L67Y，L68N，F172S   1.10-3.22   1.01-2.96
  2795   L67Y，L68N，D171F，F172S   3.5-4.3   3.3-4.9
  2796   L67Y，L68N，Y152F，D171F，F172S   1.8-4.5   2.1-9.1
  2797   L67Y，L68N，D171A，F172S   0.9-2.8   0.87-2.8
  2798   L67Y，L68N，Y152F，D171A，F172S   1.4-3.1   1.7-4.8
表6.N-和C-末端变体的抑制IL-13和IL-4活性的能力
  构建体编号   从亲本1132的变化   IL-13抑制   IL-4抑制
  2713   缺失aa24-27   0.39-0.43   1.36-1.90
  2714   缺失aa222-231   0.70-0.71   0.49-0.87
实施例3.纯化的融合多肽变体的生物活性的表征
表7显示了变体融合多肽阻断IL-4和IL-13活性的能力。结果显示为对于亲本融合多肽即IL-4/13融合多肽1132(SEQ ID NO：8)的IC50值的倍数差异(亲本融合多肽的IC50除以变体融合多肽的IC50)。亲本分子包含信号序列(氨基酸1-23)+IL-4Rα组分(氨基酸24-231，具有Cys207Ser)(相应于SEQ ID NO：2的24-231)+IL-13Rα1组分(氨基酸232-548，具有Cys251Ala)(相应于SEQ ID NO：3的27-343)+多聚化组分(IgG1Fc)(549-776)。测定3次或更多次，得出标准误差。除了具有Cys207的其它指定的取代的那些外，所有变体融合多肽都含有Cys207→Ser突变，且所有变体融合多肽都含有IL-13Ra 1组分中的Cys251→Ala突变。
表7.变体分子的抑制IL-13和IL-4活性的能力
  构建体   从亲本分子1132的变化   IL-13抑制   IL-4抑制
  2547   L67Q，L68S   1.49   0.24
  2549   D171Y，F172S，Y175H   0.61   0.64
  2558   D171Y，F172S，Y175H，R198S   0.43   0.63
  2560   Y152F   1.4±0.4   1.7±0.3
  2576   S207C   0.07   0.85
  2586   Y152F，D171Y，F172S，Y175H   0.61   0.88
  2594   S207C，A228C   0.02   0.55
  2602   L67Y，L68N   2.2±0.1   1.3±0.1
  2647   D171Y，F172S   1.6±0.2   1.5±0.1
  2651   L67Y，L68N，Y152F   1.8±0.2   2.0±0.2
  2674   L67Y，L68N，D171Y，F172S   2.3±0.2   1.9±0.1
  2681   L67Y，L68N，Y152F，D171Y，F172S 2.2±0.1   2.9±0.2
实施例4.使用BIAcore，测定变体的IL-4/13结合亲和力
如WO 00/75319所述，使用BIAcore 2000或BIAcore 3000，测量IL-4/13-特异性的多肽对人IL-4和IL-13的亲和力。BIAcore测定法相对于R1-R2-Fc变体测试了亲本1132(SEQ ID NO：8)构建体，它们都包含信号序列，IL-4Rα组分，然后是IL-13Rα1组分和多聚化组分(IgG1 Fc)。使用抗-人Fc抗体，将IL-4/13融合多肽变体捕获到芯片表面上。在表面上注射各种不同浓度的人IL-4和/或IL-13，并监视结合和解离的时间进程。使用BIA评价软件，进行动力学分析，以得到结合和解离速度常数。结果显示在表8中。
表8.通过BIAcore测量的IL-4/IL-13结合亲和力
  构建体编号                     IL-4                     IL-13
  变体   KD   KON   KOFF   KD   KON   KOFF
1132 亲本 1.04×10-11 8.75×107 9.09×10-4   4.56×10-124.11×10-12   2.36×1063.11×106   1.08×10-51.28×10-5
  2547   L67Q，L68S   4.79×10-11   7.12×107   3.41×10-3   2.73×10-12   3.01×106   3.41×10-3
  2549   D171Y，F172S，Y175H   1.09×10-11   7.46×107   8.13×10-4   1.09×10-11   7.46×107   8.23×10-6
  2558   D171Y，F172S，Y175H，R198S   3.18×10-11   2.5×107   7.96×10-4   1.63×10-12   3.39×106   5.52×10-5
  2560   Y152F   6.62×10-12   8.8×107   5.87×10-4   2.09×10-12   2.21×106   4.61×10-6
  2576   S207C   3.13×10-11   5.37×107   1.66×10-3   3.15×10-12   4.02×108   1.26×10-5
  2586   Y152F，D171Y，F172S，Y175H   2.07×10-11   1.06×108   2.18×10-3   2.17×10-12   6.12×106   1.33×10-5
  2594   A228C   3.45×10-11   7.92×107   2.73×10-3   9.71×10-12   5.28×106   5.13×10-5
  2602   L67Y，L68N   1.45×10-11   6.90×107   1.00×10-3   3.01×10-12   1.12×107   3.36×10-5
  2647   D171YF172S   6.87×10-12   4.80×107   3.30×10-4   5.09×10-12   1.07×107   5.44×10-5
  2651   L67Y，L68N，Y152F   1.08×10-11   5.15×107   5.57×10-4   4.26×10-12   7.83×106   3.34×10-5
  2674   L67Y，L68N，D171Y，F172S 1.78×10-11 1.94×108 3.46×10-3   5.99×10-12   3.33×106   2.00×10-5
  2681   L67Y，L68N，Y152F，D171Y，F172S 9.54×10-12 6.32×107 6.03×10-4 4.96×10-12 3.18×106 1.58×10-5
实施例5.组分变体的抑制IL-4和IL-13活性的能力
表9显示了如上所述使用CHO瞬时上清液测定的融合多肽的IC50生物测定值的倍数差异。这些融合多肽含有可选的组分排列，例如，R2-R1-F(SEQ ID NO：3和2)，并与1132亲本分子相对比。测试的变体包含ROR信号序列(氨基酸1-29)+IL-13Rα1组分(氨基酸30-346，具有Cys46Ser，相应于SEQ ID NO：3的27-343)+IL-4Rα组分(氨基酸347-554，具有Cys207Ser，相应于SEQ ID NO：2的24-231)+多聚化组分(IgG1 Fc，氨基酸555-784)。
表9.组分排列变体
  构建体编号   从亲本1132的变化   IL-13抑制   IL-4抑制
  2819   R2-R1-Fc   1.2-1.6   0.9-1.1
  2821   R2-R1(L67Y，L68N，Y152F，D171Y，F172S)-Fc   2.0-2.4   3.2-3.9
序列表
<110>Regeneron Pharmaceuticals，Inc.
<120>IL-4/IL-13特异性的多肽和其治疗应用
<130>2020A-WO
<140>PCT/US2005/006266
<141>2005-02-25
<150>60/548,541
<151>2004-02-27
<150>60/602,139
<151>2004-08-17
<150>60/628,343
<151>2004-11-16
<160>16
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>693
<212>DNA
<213>智人
<400>1
atggtgtggc tttgctctgg gctcctgttc cctgtgagct gcctggtcct gctgcaggtg 60
gcaagctctg ggaacatgaa ggtcttgcag gagcccacct gcgtctccga ctacatgagc 120
atctctactt gcgagtggaa gatgaatggt cccaccaatt gcagcaccga gctccgcctg 180
ttgtaccagc tggtttttct gctctccgaa gcccacacgt gtatccctga gaacaacgga 240
ggcgcggggt gcgtgtgcca cctgctcatg gatgacgtgg tcagtgcgga taactataca 300
ctggacctgt gggctgggca gcagctgctg tggaagggct ccttcaagcc cagcgagcat 360
gtgaaaccca gggccccagg aaacctgaca gttcacacca atgtctccga cactctgctg 420
ctgacctgga gcaacccgta tccccctgac aattacctgt ataatcatct cacctatgca 480
gtcaacattt ggagtgaaaa cgacccggca gatttcagaa tctataacgt gacctaccta 540
gaaccctccc tccgcatcgc agccagcacc ctgaagtctg ggatttccta cagggcacgc 600
gtacgggcct gggctcagag ctataacacc acctggagtg agtggagccc cagcaccaag 660
tggcacaact cctacaggga gcccttcgag cag                              693
<210>2
<211>231
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Val Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val
 1               5                  10                  15
Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro
            20                  25                  30
Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met
        35                  40                  45
Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu
    50                  55                  60
Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly
65                  70                  75                  80
Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala
                85                  90                  95
Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys
            100                 105                 110
Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn
        115                 120                 125
Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser
    130                 135                 140
Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala
145                 150                 155                 160
Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn
                165                 170                 175
Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys
            180                 185                 190
Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr
        195                 200                 205
Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser
    210                 215                 220
Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln
225                 230
<210>3
<211>427
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Met Glu Trp Pro Ala Arg Leu Cys Gly Leu Trp Ala Leu Leu Leu Cys
 1               5                  10                  15
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Pro Thr Glu Thr Gln
            20                  25                  30
Pro Pro Val Thr Asn Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Cys Thr Val
        35                  40                  45
Ile Trp Thr Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu
    50                  55                  60
Trp Tyr Phe Ser His Phe Gly Asp Lys Gln Asp Lys Lys Ile Ala Pro
65                  70                  75                  80
Glu Thr Arg Arg Ser Ile Glu Val Pro Leu Asn Glu Arg Ile Cys Leu
                85                  90                  95
Gln Val Gly Ser Gln Cys Ser Thr Asn Glu Ser Glu Lys Pro Ser Ile
            100                 105                 110
Leu Val Glu Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp Pro Glu Ser Ala
        115                 120                 125
Val Thr Glu Leu Gln Cys Ile Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys
    130                 135                 140
Ser Trp Leu Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr Asn Tyr Thr Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Trp His Arg Ser Leu Glu Lys Ile His Gln Cys Glu Asn Ile
                165                 170                 175
Phe Arg Glu Gly Gln Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Asp Leu Thr Lys Val
            180                 185                 190
Lys Asp Ser Ser Phe Glu Gln His Ser Val Gln Ile Met Val Lys Asp
        195                 200                 205
Asn Ala Gly Lys Ile Lys Pro Ser Phe Asn Ile Val Pro Leu Thr Ser
    210                 215                 220
Arg Val Lys Pro Asp Pro Pro His Ile Lys Asn Leu Ser Phe His Asn
225                 230                 235                 240
Asp Asp Leu Tyr Val Gln Trp Glu Asn Pro Gln Asn Phe Ile Ser Arg
                245                 250                 255
Cys Leu Phe Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn Ser Gln Thr Glu Thr His
            260                 265                 270
Asn Val Phe Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu
        275                 280                 285
Arg Asn Val Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met Val Pro Gly Val Leu Pro
    290                 295                 300
Asp Thr Leu Asn Thr Val Arg Ile Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys
305                 310                 315                 320
Tyr Glu Asp Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gln Glu Met Ser Ile
                325                 330                 335
Gly Lys Lys Arg Asn Ser Thr Leu Tyr Ile Thr Met Leu Leu Ile Val
            340                 345                 350
Pro Val Ile Val Ala Gly Ala Ile Ile Val Leu Leu Leu Tyr Leu Lys
        355                 360                 365
Arg Leu Lys Ile Ile Ile Phe Pro Pro Ile Pro Asp Pro Gly Lys Ile
    370                 375                 380
Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gln Asn Asp Asp Thr Leu His Trp Lys
385                 390                 395                 400
Lys Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Thr Lys Glu Glu Thr Asp Ser Val
                405                 410                 415
Val Leu Ile Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ser Gln
            420                 425
<210>4
<211>380
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
 1               5                  10                  15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
            20                  25                  30
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
    50                  55                  60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65                  70                  75                  80
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
                85                  90                  95
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
            100                 105                 110
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
        115                 120                 125
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
    130                 135                 140
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
145                 150                 155                 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
                165                 170                 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
            180                 185                 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
        195                 200                 205
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
    210                 215                 220
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
225                 230                 235                 240
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
                245                 250                 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
            260                 265                 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
        275                 280                 285
Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
    290                 295                 300
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
305                 310                 315                 320
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
                325                 330                 335
Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu
            340                 345                 350
Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr
        355                 360                 365
Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr
    370                 375                 380
<210>5
<211>918
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Met Leu Thr Leu Gln Thr Trp Leu Val Gln Ala Leu Phe Ile Phe Leu
 1               5                  10                  15
Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser
            20                  25                  30
Pro Glu Ser Pro Val Val Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys
        35                  40                  45
Val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr
    50                  55                  60
Ile Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser
                85                  90                  95
Leu Asn Ile Gln Leu Thr Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu
            100                 105                 110
Gln Asn Val Tyr Gly Ile Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys
        115                 120                 125
Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys
    130                 135                 140
Glu Trp Asp Gly Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu
145                 150                 155                 160
Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg
                165                 170                 175
Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val
            180                 185                 190
Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr
        195                 200                 205
Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro
    210                 215                 220
Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu
225                 230                 235                 240
Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys
                245                 250                 255
Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile
            260                 265                 270
Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp
        275                 280                 285
Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu
    290                 295                 300
Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Glu Asp Arg Pro Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile
                325                 330                 335
Asp Pro Ser His Thr Gln Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Phe Glu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val
        355                 360                 365
Thr Leu Thr Arg Trp Lys Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala
    370                 375                 380
Thr Lys Leu Thr Val Asn Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu
385                 390                 395                 400
Thr Val Arg Asn Leu Val Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile
                405                 410                 415
Pro Ala Cys Asp Phe Gln Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala
            420                 425                 430
Phe Pro Lys Asp Asn Met Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu
        435                 440                 445
Ser Val Lys Lys Tyr Ile Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala
    450                 455                 460
Pro Cys Ile Thr Asp Trp Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr
465                 470                 475                 480
Tyr Leu Arg Gly Asn Leu Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val
                485                 490                 495
Thr Pro Val Tyr Ala Asp Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala
            500                 505                 510
Tyr Leu Lys Gln Ala Pro Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys
        515                 520                 525
Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val
    530                 535                 540
Asp Val Gln Asn Gly Phe Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr
545                 550                 555                 560
Ile Ile Gly Asn Glu Thr Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu
                565                 570                 575
Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met
            580                 585                 590
Ala Ala Tyr Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe
        595                 600                 605
Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gln Gly Glu Ile Glu Ala Ile Val Val Pro
    610                 615                 620
Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly Val Leu Phe Cys
625                 630                 635                 640
Phe Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro
                645                 650                 655
Asp Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro
            660                 665                 670
Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe
        675                 680                 685
Thr Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys Pro Phe
    690                  695                 700
Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys Ile Asn
705                 710                 715                 720
Thr Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met Ser Ser
                725                 730                 735
Ser Arg Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Ser Gln Asn
            740                 745                 750
Thr Ser Ser Thr Val Gln Tyr Ser Thr Val Val His Ser Gly Tyr Arg
        755                 760                 765
His Gln Val Pro Ser Val Gln Val Phe Ser Arg Ser Glu Ser Thr Gln
    770                 775                 780
Pro Leu Leu Asp Ser Glu Glu Arg Pro Glu Asp Leu Gln Leu Val Asp
785                 790                 795                 800
His Val Asp Gly Gly Asp Gly Ile Leu Pro Arg Gln Gln Tyr Phe Lys
                805                 810                 815
Gln Asn Cys Ser Gln His Glu Ser Ser Pro Asp Ile Ser His Phe Glu
            820                 825                 830
Arg Ser Lys Gln Val Ser Ser Val Asn Glu Glu Asp Phe Val Arg Leu
        835                 840                 845
Lys Gln Gln Ile Ser Asp His Ile Ser Gln Ser Cys Gly Ser Gly Gln
    850                 855                 860
Met Lys Met Phe Gln Glu Val Ser Ala Ala Asp Ala Phe Gly Pro Gly
865                 870                 875                 880
Thr Glu Gly Gln Val Glu Arg Phe Glu Thr Val Gly Met Glu Ala Ala
                885                 890                 895
Thr Asp Glu Gly Met Pro Lys Ser Tyr Leu Pro Gln Thr Val Arg Gln
            900                 905                 910
Gly Gly Tyr Met Pro Gln
        915
<210>6
<211>29
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Pro Leu Ala Leu
  1               5                  10                  15
Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Asp Ala
             20                  25
<210>7
<211>2331
<212>DNA
<213>智人
<400>7
atggtgtggc tttgctctgg gctcctgttc cctgtgagct gcctggtcct gctgcaggtg 60
gcaagctctg ggaacatgaa ggtcttgcag gagcccacct gcgtctccga ctacatgagc 120
atctctactt gcgagtggaa gatgaatggt cccaccaatt gcagcaccga gctccgcctg 180
ttgtaccagc tggtttttct gctctccgaa gcccacacgt gtatccctga gaacaacgga 240
ggcgcggggt gcgtgtgcca cctgctcatg gatgacgtgg tcagtgcgga taactataca 300
ctggacctgt gggctgggca gcagctgctg tggaagggct ccttcaagcc cagcgagcat 360
gtgaaaccca gggccccagg aaacctgaca gttcacacca atgtctccga cactctgctg 420
ctgacctgga gcaacccgta tccccctgac aattacctgt ataatcatct cacctatgca 480
gtcaacattt ggagtgaaaa cgacccggca gatttcagaa tctataacgt gacctaccta 540
gaaccctccc tccgcatcgc agccagcacc ctgaagtctg ggatttccta cagggcacgc 600
gtacgggcct gggctcagag ctataacacc acctggagtg agtggagccc cagcaccaag 660
tggcacaact cctacaggga gcccttcgag caggcgccta cggaaactca gccacctgtg 720
acaaatttga gtgtctctgt tgaaaacctc gcgacagtaa tatggacatg gaatccaccc 780
gagggagcca gctcaaattg tagtctatgg tattttagtc attttggcga caaacaagat 840
aagaaaatag ctccggaaac tcgtcgttca atagaagtac ccctgaatga gaggatttgt 900
ctgcaagtgg ggtcccagtg tagcaccaat gagagtgaga agcctagcat tttggttgaa 960
aaatgcatct cacccccaga aggtgatcct gagtctgctg tgactgagct tcaatgcatt 1020
tggcacaacc tgagctacat gaagtgttct tggctccctg gaaggaatac cagtcccgac 1080
actaactata ctctctacta ttggcacaga agcctggaaa aaattcatca atgtgaaaac 1140
atctttagag aaggccaata ctttggttgt tcctttgatc tgaccaaagt gaaggattcc 1200
agttttgaac aacacagtgt ccaaataatg gtcaaggata atgcaggaaa aattaaacca 1260
tccttcaata tagtgccttt aacttcccgt gtgaaacctg atcctccaca tattaaaaac 1320
ctctccttcc acaatgatga cctatatgtg caatgggaga atccacagaa ttttattagc 1380
agatgcctat tttatgaagt agaagtcaat aacagccaaa ctgagacaca taatgttttc 1440
tacgtccaag aggctaaatg tgagaatcca gaatttgaga gaaatgtgga gaatacatct 1500
tgtttcatgg tccctggtgt tcttcctgat actttgaaca cagtcagaat aagagtcaaa 1560
acaaataagt tatgctatga ggatgacaaa ctctggagta attggagcca agaaatgagt 1620
ataggtaaga agcgcaattc caccggtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1680
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 1740
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 1800
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1860
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1920
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1980
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 2040
cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 2100
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 2160
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 2220
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 2280
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a          2331
<210>8
<211>776
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Met Val Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val
 1               5                  10                  15
Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro
            20                  25                  30
Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met
        35                  40                  45
Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu
    50                  55                  60
Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly
65                  70                  75                  80
Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala
                85                  90                  95
Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys
            100                 105                 110
Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn
        115                 120                 125
Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser
    130                 135                 140
Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala
145                 150                 155                 160
Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn
                165                 170                 175
Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys
            180                 185                 190
Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Ser Tyr
        195                 200                 205
Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser
    210                 215                 220
Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln Ala Pro Thr Glu Thr Gln Pro Pro Val
225                 230                 235                 240
Thr Asn Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Ala Thr Val Ile Trp Thr
                245                 250                 255
Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu Trp Tyr Phe
            260                 265                 270
Ser His Phe Gly Asp Lys Gln Asp Lys Lys Ile Ala Pro Glu Thr Arg
        275                 280                 285
Arg Ser Ile Glu Val Pro Leu Asn Glu Arg Ile Cys Leu Gln Val Gly
    290                 295                 300
Ser Gln Cys Ser Thr Asn Glu Ser Glu Lys Pro Ser Ile Leu Val Glu
305                 310                 315                 320
Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp Pro Glu Ser Ala Val Thr Glu
                325                 330                 335
Leu Gln Cys Ile Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys Ser Trp Leu
            340                 345                 350
Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp
        355                 360                 365
His Arg Ser Leu Glu Lys Ile His Gln Cys Glu Asn Ile Phe Arg Glu
    370                 375                 380
Gly Gln Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Asp Leu Thr Lys Val Lys Asp Ser
385                 390                 395                 400
Ser Phe Glu Gln His Ser Val Gln Ile Met Val Lys Asp Asn Ala Gly
                405                 410                 415
Lys Ile Lys Pro Ser Phe Asn Ile Val Pro Leu Thr Ser Arg Val Lys
            420                 425                 430
Pro Asp Pro Pro His Ile Lys Asn Leu Ser Phe His Asn Asp Asp Leu
        435                 440                 445
Tyr Val Gln Trp Glu Asn Pro Gln Asn Phe Ile Ser Arg Cys Leu Phe
    450                 455                 460
Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn Ser Gln Thr Glu Thr His Asn Val Phe
465                 470                 475                 480
Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu Arg Asn Val
                485                 490                 495
Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met Val Pro Gly Val Leu Pro Asp Thr Leu
            500                 505                 510
Asn Thr Val Arg Ile Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys Tyr Glu Asp
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Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gln Glu Met Ser Ile Gly Lys Lys
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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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<210>9
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<213>智人
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Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp Pro Glu Ser Ala Val Thr Glu
                325                 330                 335
Leu Gln Cys Ile Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys Ser Trp Leu
            340                 345                 350
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Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu Arg Asn Val
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<210>13
<211>2331
<212>DNA
<213>智人
<400>13
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<213>智人
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Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro
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Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met
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Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn
        115                 120                 125
Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser
    130                 135                 140
Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Phe Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala
145                 150                 155                 160
Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Phe Ser Arg Ile Tyr Asn
                165                 170                 175
Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys
            180                 185                 190
Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Ser Tyr
        195                 200                 205
Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser
    210                 215                 220
Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln Ala Pro Thr Glu Thr Gln Pro Pro Val
225                 230                 235                 240
Thr Asn Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Ala Thr Val Ile Trp Thr
                245                 250                 255
Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu Trp Tyr Phe
            260                 265                 270
Ser His Phe Gly Asp Lys Gln Asp Lys Lys Ile Ala Pro Glu Thr Arg
        275                 280                 285
Arg Ser Ile Glu Val Pro Leu Asn Glu Arg Ile Cys Leu Gln Val Gly
    290                 295                 300
Ser Gln Cys Ser Thr Asn Glu Ser Glu Lys Pro Ser Ile Leu Val Glu
305                 310                 315                 320
Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp Pro Glu Ser Ala Val Thr Glu
                325                 330                 335
Leu Gln Cys Ile Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys Ser Trp Leu
            340                 345                 350
Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp
        355                 360                 365
His Arg Ser Leu Glu Lys Ile His Gln Cys Glu Asn Ile Phe Arg Glu
    370                 375                 380
Gly Gln Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Asp Leu Thr Lys Val Lys Asp Ser
385                 390                 395                 400
Ser Phe Glu Gln His Ser Val Gln Ile Met Val Lys Asp Asn Ala Gly
                405                 410                 415
Lys Ile Lys Pro Ser Phe Asn Ile Val Pro Leu Thr Ser Arg Val Lys
            420                 425                 430
Pro Asp Pro Pro His Ile Lys Asn Leu Ser Phe His Asn Asp Asp Leu
        435                 440                 445
Tyr Val Gln Trp Glu Asn Pro Gln Asn Phe Ile Ser Arg Cys Leu Phe
    450                 455                 460
Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn Ser Gln Thr Glu Thr His Asn Val Phe
465                 470                 475                 480
Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu Arg Asn Val
                485                 490                 495
Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met Val Pro Gly Val Leu Pro Asp Thr Leu
            500                 505                 510
Asn Thr Val Arg Ile Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys Tyr Glu Asp
        515                 520                 525
Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gln Glu Met Ser Ile Gly Lys Lys
    530                 535                 540
Arg Asn Ser Thr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
545                 550                 555                 560
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
                565                 570                 575
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
            580                 585                 590
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
        595                 600                 605
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
    610                 615                 620
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
625                 630                 635                 640
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
                645                 650                 655
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
            660                 665                 670
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
        675                 680                 685
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
    690                 695                 700
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
705                 710                 715                 720
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
                725                 730                 735
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
            740                 745                 750
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Hi s Asn His Tyr Thr Gln Lys
        755                 760                  765
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    770                 775

Claims (30)

1.融合多肽(R1)x-(R2)y-F，其中：
R1选自SEQ ID NO：2的序列1-231和24-231，所述序列可以包含1-10个修饰；
R2选自序列SEQ ID NO：3和4，所述序列可以包含1-3个修饰；
F是融合组分，且x和y各自独立地是≥1的正整数。
2.权利要求1的融合多肽，其中R1通过在位置67、68、71、152、164、171、172、175、198和/或207处的一个或多个氨基酸被不同的氨基酸取代而进行修饰。
3.权利要求2的融合多肽，其中在位置67的氨基酸被取代为Tyr。
4.权利要求2的融合多肽，其中在位置68的氨基酸被取代为Asn。
5.权利要求2的融合多肽，其中在位置171的氨基酸被取代为Tyr或Phe。
6.权利要求2的融合多肽，其中在位置172的氨基酸被取代为Ser。
7.权利要求2的融合多肽，其中在位置152的氨基酸被取代为Phe。
8.权利要求2的融合多肽，其中在位置198的氨基酸被取代为Ser。
9.权利要求2的融合多肽，其中在位置207的氨基酸被取代为Ser。
10.权利要求2的融合多肽，其中R1通过在位置67、68和207处的取代而进行修饰。
11.权利要求10的融合多肽，其中在位置67的氨基酸被取代为Tyr。
12.权利要求10的融合多肽，其中在位置68的氨基酸被取代为Asn。
13.权利要求11的融合多肽，其中在位置68的氨基酸被取代为Asn。
14.权利要求10的融合多肽，其中R1通过在位置171和172处的取代而进行进一步修饰。
15.权利要求14的融合多肽，其中在位置171的氨基酸被取代为Tyr或Phe。
16.权利要求15的融合多肽，其中在位置172的氨基酸被取代为Ser。
17.权利要求14的融合多肽，其中R1通过在位置152处的取代而进行进一步修饰。
18.权利要求17的融合多肽，其中在位置152的氨基酸被取代为Phe。
19.上述权利要求中的任一项的融合多肽，其中R2选自(i)SEQ IDNO：3的1-343或27-343，和(ii)SEQ ID NO：4的1-343或23-343。
20.权利要求19的融合多肽，其中(i)通过下述方式修饰：
(a)用SEQ ID NO：5的氨基酸1-123替代SEQ ID NO：3的氨基酸1-120；
(b)删除SEQ ID NO：3的氨基酸338-343；
(c)用SEQ ID NO：6替代SEQ ID NO：3的氨基酸1-26，或
(d)用不同的氨基酸取代在位置46、73、143、235、293和/或329处的一个或多个氨基酸。
21.权利要求19的融合多肽，其中(ii)通过下述方式修饰：
(a′)删除SEQ ID NO：4的氨基酸1-22；
(b′)Cys251Ile；或
(c′)取代在SEQ ID NO：4的位置310处的氨基酸。
22.上述权利要求中的任一项的融合多肽，其中F选自多聚化组分、血清蛋白或能结合血清蛋白的分子。
23.权利要求22的融合多肽，其中F是多聚化组分，其选自(i)免疫球蛋白-衍生的结构域，(ii)可剪切的区域(C-区域)，(ii)1至约500个氨基酸长的氨基酸序列，任选地包含至少一个半胱氨酸残基，(iii)亮氨酸拉链，(iv)螺旋环基序，和(v)卷曲-卷曲基序。
24.权利要求23的融合多肽，其中F是免疫球蛋白-衍生的结构域，其选自IgG的Fc结构域或IgG的重链。
25.多聚蛋白，其包含2个或更多个权利要求1-24中的任一项的融合多肽。
26.权利要求25的多聚蛋白，其是包含2个融合多肽的二聚体。
27.核酸分子，其编码权利要求1-24中的任一项的融合多肽。
28.载体，其包含权利要求27的核酸分子。
29.在合适的宿主细胞中的宿主-载体系统，其包含权利要求28的载体。
30.生产融合多肽的方法，其包含在适合宿主细胞表达蛋白质的条件下培养权利要求29的宿主-载体系统，和回收这样产生的多肽。
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