JP7438756B2 - Ｉｎ ｓｉｔｕ免疫調節癌ワクチン接種のための標的化された放射線治療用キレート - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２０１６年７月２５日出願の米国特許仮出願第６２／３６６３４０号の利益を主張する。

連邦政府資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられたＣＡ１９７０７８の下で政府支援によってなされた。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。

本開示は、一般に癌を治療する方法に関する。特に、本開示は、対象において（ａ）固形腫瘍組織によって差別的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）取り込まれ保持される、免疫調節用量の放射性金属キレート化合物を対象に全身投与すること、および（ｂ）腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の治療を用いて、対象の１以上の悪性固形腫瘍にｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種を実施することによる、１以上の悪性固形腫瘍を含む癌を治療する方法に向けられる。

現在の癌治療は、一般に、標的化されない小分子または細胞毒性薬剤に対する抗体が優先的に癌細胞に侵入するか、癌細胞と結合し（薬剤に対する抗体の場合）、多様な機構によって癌細胞を死滅させる、全身性の化学療法を含む。外照射療法（ｘＲＴ）は、しばしば化学療法と併用され、核ＤＮＡ二重鎖の切断を誘導し、その結果、細胞周期の死をもたらすことによって癌細胞を死滅させる。全身化学療法とは異なり、ｘＲＴは、腫瘍の解剖学的部位を正確に決定する能力に依存する。また、腫瘍の外科的切除は、腫瘍を調べる能力と完全な除去に依存する、それは残存腫瘍細胞が手術後に腫瘍を急速に再建するためである。手術およびｘＲＴは通常、悪性腫瘍の局所治療において限界があり、したがって播種性または転移性疾患の治療に限定されている。これが、これらの治療様式と併せて化学療法がしばしば使用される理由である。全身化学療法は、脳転移は例外かもしれないが、多くの遠隔転移部位に到達することができるが、あまりにも多くの患者にとって、応答は一般に短命（数カ月から数年）であり、最終的に腫瘍再発をもたらす。

身体の自然免疫系は、癌細胞を認識後に破壊することもできるので、免疫学的手法は癌治療のパラダイムにおいて急速に普及しつつある。しかし、一部の癌細胞、そしてさらに多くの範囲で癌幹細胞は、最初は免疫監視を回避しようとし、比較的免疫的に見えないままでいることによって進化し、最終的に生き延びる能力を実際に獲得する［Ｇａｉｐｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ６：５９７－６１０，２０１４］。

ますます調査されている１つの特定の免疫学的手法は、「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種」、つまり、腫瘍免疫原性を増強し、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を生成し、「ワクチン接種していない」播種性腫瘍に対する全身性抗腫瘍免疫応答を引き起こそうとする戦略である。ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種では、腫瘍の免疫を寛容化する微小環境を逆転させる炎症促進性シグナルを同時に提供しながら、悪性固形腫瘍に、腫瘍抗原の放出を促進する１以上の薬剤を注射する（またはそれで治療する）［Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｏｅｕｔｉｃｓ １１（８）：１９０１－１９０９，２０１５；Ｍａｒａｂｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０（７）：１７４７－５６，２０１４；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｅ－ｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ，２０１６］。臨床試験および前臨床モデルから得た最近のデータはそのような手法の可能性を示しているが、全身の有効性の改良されたｉｎ－ｓｉｔｕワクチン接種方法が当技術分野で大いに必要とされている。

放射線ホルミシスは、低用量のイオン化ＲＴが、イオン化ＲＴの非存在下では活性化されない天然の保護修復機構の活性化を刺激することによって有益となり得るという数十年前の仮説である［Ｃａｍｅｒｏｎ ａｎｄ Ｍｏｕｌｄｅｒ，Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．２５：１４０７，１９９８］。予備修復機構は、イオン化ＲＴの有害作用を取り消すだけでなく、ＲＴ曝露に関連しない疾患を抑制するように刺激された場合に十分に有効であると仮定される。おそらく関連している、アブスコパル効果は、１つの腫瘍のｘＲＴ治療が、ＲＴ治療領域外の別の腫瘍の縮小を実際に引き起こす、１９５０年代に報告された現象である。稀ではあるが、この現象は免疫系の活性化に依存すると考えられる。まとめると、ホルミシスおよびアブスコパル効果は、低用量（免疫刺激性であるが非細胞毒性）ＲＴによる免疫系の相互作用および刺激作用の可能性を裏付ける。これを次にｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種などのその他の免疫学的手法と組み合わせることができる。

本発明者らは、１つの腫瘍が存在する場合には、局所ｘＲＴ＋ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の組合せが、マウスにおける大きな確立された腫瘍を治療する際に強力に相乗的であることを、以前に発表した［Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｅ－ｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ，２０１６］。

本発明者らは驚くべきことに、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種とｘＲＴの組合せが、第２の非照射腫瘍の存在下で腫瘍増殖を抑制しないことを見出した（そして本明細書に開示した）。明らかに、非照射腫瘍は、照射腫瘍に対するｘＲＴおよびｉｎ ｓｉｔｕワクチンの免疫調節効果に対する抑制効果（本発明者らは「付随する免疫寛容」と呼ぶ）を示す。ｘＲＴが腫瘍の全領域に投与される場合、この付随する免疫寛容は克服されることができ、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の有効性を可能にする。しかし、ｘＲＴは、複数の腫瘍が存在する場合、特に腫瘍の数が少なくない場合、または１以上の腫瘍の部位が正確に分かっていない場合、またはｘＲＴを腫瘍のすべての部位に送達することができない場合には、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種法と組み合わせて効果的に使用することができない。したがって、腫瘍の数および解剖学的部位にかかわらず、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種と組み合わせて、免疫調節用量のＲＴを対象内のすべての腫瘍に送達する改善された方法が必要とされている。

本発明者らは、特定のアルキルホスホコリン類似体が悪性固形腫瘍細胞によって優先的に取り込まれ保持されることを以前に示した。参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／００３０１８７号において、Ｗｅｉｃｈｅｒｔらは、多様な悪性固形腫瘍の検出および位置特定ならびに治療のための主剤１８－（ｐ－ヨードフェニル）オクタデシルホスホコリン（ＮＭ４０４；図１参照）の類似体の使用を開示している。ヨード部分がイメージングに最適化された放射性核種、例えばヨウ素－１２４（［^１２４Ｉ］－ＮＭ４０４）である場合、この類似体を、固形腫瘍のポジトロン放出断層撮影－コンピュータ断層撮影（ＰＥＴ／ＣＴ）または単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像法で使用することができる。あるいは、ヨード部分が、ヨウ素－１２５またはヨウ素－１３１（［^１２５Ｉ］－ＮＭ４０４または［^１３１Ｉ］－ＮＭ４０４）などの、類似体が取り込まれる固形腫瘍細胞に治療用量のＲＴを送達するために最適化された放射性核種である場合、この類似体を用いて固形腫瘍を治療することができる。

そのような類似体は、インビボで幅広い種類の固形腫瘍型を標的とするだけでなく、腫瘍細胞において長期間の選択的な保持を受け、したがってＲＴ剤として高い可能性をもたらす。さらに、腫瘍取り込みは悪性癌に限定され、前悪性または良性病変にはなされない。

しかし、以前に開示されたアルキルホスホコリン類似体で使用される放射性ヨウ素同位体よりも最適化されたイメージングおよび／またはＲＴに良好な特性を有する金属同位体がある。例えば、イメージング同位体として、Ｉ－１２４はポジトロン放出が不十分であり（放射の約２４％しかポジトロンでない）、さらにガンマ放射（６００ＫｅＶ）と混同される。これは実際に通常の５１１ＫｅＶのＰＥＴ検出を妨害する。特定のポジトロン放出金属は良好なイメージング特性を有する。別の例として、ＲＴ同位体として、Ｉ－１３１は他のエネルギーで他の非治療的放出を生成し、それは骨髄をはじめとする隣接する正常組織に、望まない放射線線量測定を追加する。Ｉ－１３１のベータ粒子範囲も非常に長く、標的外の毒性に寄与する。数個の金属放射線治療同位体は、よりクリーンな放出プロファイルと、より短い経路長、したがってより少ない潜在的毒性を提供する。

本発明者らは、放射性ヨウ素同位体（例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第１５／３４３６０４号参照）の代わりにキレート化された放射性金属同位体を含む改善されたアルキルホスホコリン類似体を開発した。この類似体は、以前に開示された放射性ヨウ素化化合物と同じ骨格を含むので、これらは依然として腫瘍細胞に選択的に取り込まれ保持される。しかし、キレート化された放射性金属同位体は、イメージングおよび／または放射線治療用途のために改善された放出を提供する。そのような薬剤は、腫瘍の数および解剖学的部位が分かっていようといまいと、対象内に存在するすべての悪性腫瘍に細胞毒性未満であるが免疫調節用量のイオン化ＲＴを送達するのに非常に適している。

したがって、第１の態様では、本開示は、対象において１以上の悪性固形腫瘍を含む癌を治療する方法を包含する。本方法は、（ａ）悪性固形腫瘍組織によって差別的に取り込まれ保持される免疫調節用量の放射性リン脂質金属キレート化合物を対象に投与するステップ；および（ｂ）腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の治療を用いて、対象の１以上の悪性固形腫瘍にｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種を実施するステップを含む。「免疫調節用量」は、標的化された放射線治療剤の低いかまたは細胞毒性未満のＲＴ用量である。ＮＭ４０４が下の実施例のいくつかで使用されているが、その他の実施例は、同様に固形腫瘍組織を標的化するリン脂質金属キレート化合物ＮＭ６００を使用する。放射線治療用途には、化合物にキレート化される放射金属としては、任意のアルファ、ベータ、オージェ、および／またはガンマ放出金属が挙げられ得る。重要な特徴は、標的化された放射線治療剤が、癌細胞または関連する免疫細胞のいずれにも致死性でない低いかまたは細胞毒性未満のＲＴ用量を放出することである。

いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の治療は、腫瘍をｘＲＴで治療することを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の治療には、少なくとも１つの悪性固形腫瘍に、腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の薬剤を含む組成物を腫瘍内注射することが含まれる。いくつかの実施形態では、そのような薬剤には、免疫刺激性モノクローナル抗体、パターン認識受容体アゴニスト、免疫刺激性サイトカイン、免疫刺激性ナノ粒子、腫瘍溶解性ウイルス、またはそれらの任意の組合せが含まれ得る。使用され得る免疫刺激性モノクローナル抗体の限定されない例としては、抗ＧＤ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＤ４０抗体、またはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫刺激性モノクローナル抗体は、腫瘍特異的抗原に対する抗体である。いくつかの実施形態では、１以上の免疫刺激性モノクローナル抗体を含む組成物は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）も含んでよい。いくつかの実施形態では、使用される抗ＧＤ２抗体は、ｈｕ１４．１８を含んでよく、所望により、ＩＬ－２（すなわちこれら２つの融合タンパク質）をさらに含んでよい。

いくつかの実施形態では、免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ－２、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、またはインターフェロン（ＩＦＮ）である。

いくつかの実施形態では、パターン認識受容体アゴニストは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニストである。そのようなＴＬＲの限定されない例としては、ＴＬＲ－１、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－４、ＴＬＲ－５、ＴＬＲ－６、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＴＬＲ－９、またはＴＬＲ－１０が挙げられる。

いくつかの実施形態では、放射性リン脂質金属キレート化合物は、式：
またはその塩を有する。Ｒ_１は、金属原子にキレート化されたキレート剤を含み、前記金属原子は、６時間よりも長く３０日未満の半減期をもつアルファ、ベータまたはオージェ放出金属同位体であり；ａは、０または１であり；ｎは、１２～３０の整数であり；ｍは、０または１であり；Ｙは、－Ｈ、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯＸ、－ＯＣＯＸ、または－ＯＸであり、Ｘは、アルキルまたはアリールであり；Ｒ_２は、－Ｎ^＋Ｈ_３、－Ｎ^＋Ｈ_２Ｚ、－Ｎ^＋ＨＺ_２、または－Ｎ^＋Ｚ_３であり、各Ｚは、独立にアルキルまたはアロアルキルであり；かつ、ｂは、１または２である。使用され得る金属同位体の限定されない例としては、Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ｈｏ－１６６、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｃｕ－６７、Ａｕ－１９９、Ｒｈ－１０５、Ｒａ－２２３、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｐｂ－２１２、またはＴｈ－２２７が挙げられる。

いくつかの実施形態では、キレート剤は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－三酢酸（ＤＯ３Ａ）またはその誘導体の１つ；１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４－二酢酸（ＮＯＤＡ）またはその誘導体の１つ；１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）またはその誘導体の１つ；１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）またはその誘導体の１つ；１，４，７－トリアザシクロノナン，１－グルタル酸－４，７－二酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）またはその誘導体の１つ；１，４，７，１０－テトラアザシクロデカン，１－グルタル酸－４，７，１０－三酢酸（ＤＯＴＡＧＡ）またはその誘導体の１つ；１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）またはその誘導体の１つ；１，４，８，１１－テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン－４，１１－二酢酸（ＣＢ－ＴＥ２Ａ）またはその誘導体の１つ；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、そのジエステル、またはその誘導体の１つ；２－シクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡ）またはその誘導体の１つ；デフォロキサミン（ｄｅｆｏｒｏｘａｍｉｎｅ）（ＤＦＯ）またはその誘導体の１つ；１，２－［［６－カルボキシピリジン－２－イル］メチルアミノ］エタン（Ｈ_２ｄｅｄｐａ）またはその誘導体の１つ；およびＤＡＤＡまたはその誘導体の１つからなる群から選択され、ＤＡＤＡは次の構造：
を有する。

いくつかの実施形態では、ａは１である（脂肪族アリール－アルキル鎖）。他の実施形態では、ａは０である（脂肪族アルキル鎖）。

いくつかの実施形態では、ｍは１である（アシルリン脂質シリーズ）。いくつかのそのような実施形態では、ｎは１２～２０の間の整数である。いくつかの実施形態では、Ｙは－ＯＣＯＸ、－ＣＯＯＸまたは－ＯＸである。

いくつかの実施形態では、Ｘは－ＣＨ_２ＣＨ_３または－ＣＨ_３である。

いくつかの実施形態では、ｍは０である（アルキルリン脂質シリーズ）。

いくつかの実施形態では、ｂは１である。

いくつかの実施形態では、ｎは１８である。

いくつかの実施形態では、Ｒ_２は－Ｎ^＋Ｚ_３である。いくつかのそのような実施形態では、各Ｚは、独立に－ＣＨ_２ＣＨ_３または－ＣＨ_３である。いくつかのそのような実施形態では、各Ｚは、－ＣＨ_３である。

いくつかの実施形態では、金属原子にキレート化されたキレート剤は：

である。

いくつかの実施形態では、放射性リン脂質金属キレート化合物は、選択された化合物が金属原子にキレート化されている以下の化合物の１つである：

いくつかの実施形態では、放射性リン脂質キレート化合物は、静脈内投与される。

いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

いくつかの実施形態では、この方法は所望により、悪性固形腫瘍の１つをｘＲＴに曝露することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本方法は所望により、放射性リン脂質キレート化合物の免疫刺激用量を決定するステップを含む。いくつかのそのような実施形態では、放射性リン脂質キレート化合物の前記免疫調節用量を決定するステップは、金属原子が４時間以上の半減期をもつポジトロンまたは単一光子放出金属同位体であることを除いて前述の放射性リン脂質キレート化合物の検出促進用量を対象に投与し、続いて放射性リン脂質キレート化合物内の金属同位体に特徴的な、対象内の１以上の悪性固形腫瘍から発するシグナルを検出することを含む。いくつかのそのような実施形態では、ポジトロンまたは単一光子放出金属同位体は、Ｇａ－６６、Ｃｕ－６４、Ｙ－８６、Ｃｏ－５５、Ｚｒ－８９、Ｓｒ－８３、Ｍｎ－５２、Ａｓ－７２、Ｓｃ－４４、Ｇａ－６７、Ｉｎ－１１１、またはＴｃ－９９ｍである。

いくつかの実施形態では、放射性リン脂質キレート化合物の免疫調節用量は、対象内の１以上の悪性固形腫瘍から発するシグナルの強度から計算される。

いくつかの実施形態では、金属同位体に特徴的なシグナルを検出するステップは、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）画像法、または単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）画像法によって実施される。

本開示の方法を用いて治療され得る、悪性固形腫瘍として示される癌の限定されない例としては、黒色腫、神経芽細胞腫、肺癌、副腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、皮下癌、皮膚または頭頸部の扁平上皮癌、腸癌、網膜芽細胞腫、子宮頸癌、神経膠腫、乳癌、膵臓癌、軟部組織肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、または小児脳腫瘍が挙げられる。

本発明のその他の目的、特徴および利点は、明細書、特許請求の範囲および図面を検討した後に明らかになるであろう。

主剤１８－（ｐ－ヨードフェニル）オクタデシルホスホコリン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ ｐｈｏｓｐｈｃｈｏｌｉｎｅ）（ＮＭ４０４）の化学構造を示す図である。 図２Ａは、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣがｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種を誘発することを示す、一連のグラフを示す図である。図２Ａ）腫瘍増殖曲線および図２Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線は、ｘＲＴとＩＴ－ｈｕ１４．１８－ＩＬ２との間の相乗効果を示す。ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣで処置したマウスの７１％（２２／３１）が、無病になっている。図２Ｃ）これらの９０％が、Ｂ７８黒色腫によるその後の生着を拒絶する。 図２Ｂは、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣがｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種を誘発することを示す、一連のグラフを示す図である。図２Ａ）腫瘍増殖曲線および図２Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線は、ｘＲＴとＩＴ－ｈｕ１４．１８－ＩＬ２との間の相乗効果を示す。ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣで処置したマウスの７１％（２２／３１）が、無病になっている。図２Ｃ）これらの９０％が、Ｂ７８黒色腫によるその後の生着を拒絶する。 図２Ｃは、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣがｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種を誘発することを示す、一連のグラフを示す図である。図２Ａ）腫瘍増殖曲線および図２Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線は、ｘＲＴとＩＴ－ｈｕ１４．１８－ＩＬ２との間の相乗効果を示す。ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣで処置したマウスの７１％（２２／３１）が、無病になっている。図２Ｃ）これらの９０％が、Ｂ７８黒色腫によるその後の生着を拒絶する。 付随する免疫寛容を示すグラフを示す図である。原発性腫瘍応答が示される。遠隔未処置腫瘍は、２腫瘍Ｂ７８黒色腫モデルにおいてｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する応答を抑制する。この抑制は、第２の腫瘍を照射することによって克服することができる。 付随する免疫寛容がＴｒｅｇに起因することを示すグラフを示す図である。原発性腫瘍応答が示される。遠隔未処置腫瘍は、２腫瘍Ｂ７８黒色腫モデルにおいてｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する応答を抑制し、この抑制は、Ｔｒｅｇを枯渇させる（ジフテリア毒素受容体をそれらのＴｒｅｇに発現するトランスジェニックＤＥＲＥＧマウスを使用し、したがってジフテリア毒素を投与することによってＴｒｅｇを枯渇させる）ことによって克服することができる。 Ｂ７８黒色腫による^１２４Ｉ－ＮＭ４０４の選択的取り込みを示す画像を示す図である。約２００ｍｍ^３のＢ７８腫瘍を有するマウスに^１２４Ｉ－ＮＭ４０４を静脈内投与し、連続ＰＥＴ／ＣＴスキャンを行った。７１時間でのこの画像は、腫瘍による選択的取り込みと、心臓および肝臓によるいくらかの残留バックグラウンド取り込みを示す。 ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種が、残留レベルの分子標的化放射線治療（ＴＲＴ）の存在下で誘発され得ることを示すグラフを示す図である。併用されたｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣによる治療は、３μＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の存在下または不在下で等しく効果的である。これは、実施例４に記載されるように、本発明者らがｘＲＴ（０日目）に続いてＩＴ－ＩＣ（６～１０日目）を送達する場合に存在するであろうＴＲＴの残留活性に近づく。 腫瘍を有するマウスのＧｄ－ＮＭ６００の注射後２４時間までの腫瘍（Ｔ）の増強を示す経時的ＭＲＩ画像の推移を示す図である。 図８Ａは、マウス黒色腫および膵腫瘍モデルにおける遠隔未処置腫瘍による、局所ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの組合せに対する原発性腫瘍応答の腫瘍特異的抑制を示す一連のグラフを示す図である。同系のジシアロガングリオシドを発現する（ＧＤ２＋）原発性側腹部腫瘍＋／－対側腹部の続発性腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように原発性腫瘍だけに、「１」日目にｘＲＴによって、そして６～１０日目に５０ｍｃｇの抗ＧＤ２免疫サイトカイン（ＩＣ）、ｈｕ１４．１８－ＩＬ２（抗ＧＤ２ ｍＡｂとＩＬ２の融合体）の腫瘍内（ＩＴ）注射によって処置した。平均原発性腫瘍体積を図８Ａおよび８Ｃ－８Ｅに示す。８Ａ）原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、未処置の続発性Ｂ７８腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答に拮抗した。本発明者らは、この作用を「付随する免疫寛容」－ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する処置腫瘍の局所応答への、未処置遠隔腫瘍の拮抗作用－として説明する。８Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線は、パネルＡのマウスと反復実験について示される。ほぼすべてのマウスが原発性腫瘍の進行のために安楽死した。８Ｃ）原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍を有するマウスでは、反対側腹部の続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍の有無にかかわらず、未処置のＰａｎｃ０２続発性腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍の応答を抑制した。８Ｄ）原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｂ７８腫瘍がＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答を抑制したが、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍はこの作用を発揮しなかった。８Ｅ）原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍がｘＲＴおよびＩＴ－ｈｕ１４．１８－ＩＬ２の併用に対する原発性腫瘍応答を抑制したが、Ｂ７８続発性腫瘍は抑制しなかった。ｎ＝１群当たりのマウスの数。ＮＳ＝有意でない、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図８Ｂは、マウス黒色腫および膵腫瘍モデルにおける遠隔未処置腫瘍による、局所ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの組合せに対する原発性腫瘍応答の腫瘍特異的抑制を示す一連のグラフを示す図である。同系のジシアロガングリオシドを発現する（ＧＤ２＋）原発性側腹部腫瘍＋／－対側腹部の続発性腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように原発性腫瘍だけに、「１」日目にｘＲＴによって、そして６～１０日目に５０ｍｃｇの抗ＧＤ２免疫サイトカイン（ＩＣ）、ｈｕ１４．１８－ＩＬ２（抗ＧＤ２ ｍＡｂとＩＬ２の融合体）の腫瘍内（ＩＴ）注射によって処置した。平均原発性腫瘍体積を図８Ａおよび８Ｃ－８Ｅに示す。８Ａ）原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、未処置の続発性Ｂ７８腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答に拮抗した。本発明者らは、この作用を「付随する免疫寛容」－ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する処置腫瘍の局所応答への、未処置遠隔腫瘍の拮抗作用－として説明する。８Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線は、パネルＡのマウスと反復実験について示される。ほぼすべてのマウスが原発性腫瘍の進行のために安楽死した。８Ｃ）原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍を有するマウスでは、反対側腹部の続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍の有無にかかわらず、未処置のＰａｎｃ０２続発性腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍の応答を抑制した。８Ｄ）原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｂ７８腫瘍がＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答を抑制したが、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍はこの作用を発揮しなかった。８Ｅ）原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍がｘＲＴおよびＩＴ－ｈｕ１４．１８－ＩＬ２の併用に対する原発性腫瘍応答を抑制したが、Ｂ７８続発性腫瘍は抑制しなかった。ｎ＝１群当たりのマウスの数。ＮＳ＝有意でない、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図８Ｃは、マウス黒色腫および膵腫瘍モデルにおける遠隔未処置腫瘍による、局所ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの組合せに対する原発性腫瘍応答の腫瘍特異的抑制を示す一連のグラフを示す図である。同系のジシアロガングリオシドを発現する（ＧＤ２＋）原発性側腹部腫瘍＋／－対側腹部の続発性腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように原発性腫瘍だけに、「１」日目にｘＲＴによって、そして６～１０日目に５０ｍｃｇの抗ＧＤ２免疫サイトカイン（ＩＣ）、ｈｕ１４．１８－ＩＬ２（抗ＧＤ２ ｍＡｂとＩＬ２の融合体）の腫瘍内（ＩＴ）注射によって処置した。平均原発性腫瘍体積を図８Ａおよび８Ｃ－８Ｅに示す。８Ａ）原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、未処置の続発性Ｂ７８腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答に拮抗した。本発明者らは、この作用を「付随する免疫寛容」－ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する処置腫瘍の局所応答への、未処置遠隔腫瘍の拮抗作用－として説明する。８Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線は、パネルＡのマウスと反復実験について示される。ほぼすべてのマウスが原発性腫瘍の進行のために安楽死した。８Ｃ）原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍を有するマウスでは、反対側腹部の続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍の有無にかかわらず、未処置のＰａｎｃ０２続発性腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍の応答を抑制した。８Ｄ）原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｂ７８腫瘍がＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答を抑制したが、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍はこの作用を発揮しなかった。８Ｅ）原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍がｘＲＴおよびＩＴ－ｈｕ１４．１８－ＩＬ２の併用に対する原発性腫瘍応答を抑制したが、Ｂ７８続発性腫瘍は抑制しなかった。ｎ＝１群当たりのマウスの数。ＮＳ＝有意でない、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図８Ｄは、マウス黒色腫および膵腫瘍モデルにおける遠隔未処置腫瘍による、局所ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの組合せに対する原発性腫瘍応答の腫瘍特異的抑制を示す一連のグラフを示す図である。同系のジシアロガングリオシドを発現する（ＧＤ２＋）原発性側腹部腫瘍＋／－対側腹部の続発性腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように原発性腫瘍だけに、「１」日目にｘＲＴによって、そして６～１０日目に５０ｍｃｇの抗ＧＤ２免疫サイトカイン（ＩＣ）、ｈｕ１４．１８－ＩＬ２（抗ＧＤ２ ｍＡｂとＩＬ２の融合体）の腫瘍内（ＩＴ）注射によって処置した。平均原発性腫瘍体積を図８Ａおよび８Ｃ－８Ｅに示す。８Ａ）原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、未処置の続発性Ｂ７８腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答に拮抗した。本発明者らは、この作用を「付随する免疫寛容」－ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する処置腫瘍の局所応答への、未処置遠隔腫瘍の拮抗作用－として説明する。８Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線は、パネルＡのマウスと反復実験について示される。ほぼすべてのマウスが原発性腫瘍の進行のために安楽死した。８Ｃ）原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍を有するマウスでは、反対側腹部の続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍の有無にかかわらず、未処置のＰａｎｃ０２続発性腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍の応答を抑制した。８Ｄ）原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｂ７８腫瘍がＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答を抑制したが、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍はこの作用を発揮しなかった。８Ｅ）原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍がｘＲＴおよびＩＴ－ｈｕ１４．１８－ＩＬ２の併用に対する原発性腫瘍応答を抑制したが、Ｂ７８続発性腫瘍は抑制しなかった。ｎ＝１群当たりのマウスの数。ＮＳ＝有意でない、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図８Ｅは、マウス黒色腫および膵腫瘍モデルにおける遠隔未処置腫瘍による、局所ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの組合せに対する原発性腫瘍応答の腫瘍特異的抑制を示す一連のグラフを示す図である。同系のジシアロガングリオシドを発現する（ＧＤ２＋）原発性側腹部腫瘍＋／－対側腹部の続発性腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように原発性腫瘍だけに、「１」日目にｘＲＴによって、そして６～１０日目に５０ｍｃｇの抗ＧＤ２免疫サイトカイン（ＩＣ）、ｈｕ１４．１８－ＩＬ２（抗ＧＤ２ ｍＡｂとＩＬ２の融合体）の腫瘍内（ＩＴ）注射によって処置した。平均原発性腫瘍体積を図８Ａおよび８Ｃ－８Ｅに示す。８Ａ）原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、未処置の続発性Ｂ７８腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答に拮抗した。本発明者らは、この作用を「付随する免疫寛容」－ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する処置腫瘍の局所応答への、未処置遠隔腫瘍の拮抗作用－として説明する。８Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線は、パネルＡのマウスと反復実験について示される。ほぼすべてのマウスが原発性腫瘍の進行のために安楽死した。８Ｃ）原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍を有するマウスでは、反対側腹部の続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍の有無にかかわらず、未処置のＰａｎｃ０２続発性腫瘍の存在が、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍の応答を抑制した。８Ｄ）原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｂ７８腫瘍がＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答を抑制したが、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍はこの作用を発揮しなかった。８Ｅ）原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍がｘＲＴおよびＩＴ－ｈｕ１４．１８－ＩＬ２の併用に対する原発性腫瘍応答を抑制したが、Ｂ７８続発性腫瘍は抑制しなかった。ｎ＝１群当たりのマウスの数。ＮＳ＝有意でない、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図９Ａは、付随する免疫寛容が、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の特異的枯渇によって回避されることを示す免疫組織化学画像およびグラフを示す図である。９Ａ）腫瘍を１つ（Ａ１およびＡ２）または２つ（Ａ３およびＡ４）有するマウスにおいてｘＲＴ後６日目に評価された腫瘍のＴｒｅｇマーカー、ＦｏｘＰ３の免疫組織化学（代表的な４００倍画像が示される）。マウスはｘＲＴを受けなかったか、または原発性腫瘍に対してのみｘＲＴを受けた。原発性腫瘍をＡ１～Ａ３に示し、続発性腫瘍をＡ４に示す。小さな矢印は、ＦｏｘＰ３＋細胞の一部を指摘する（褐色の核＝ＦｏｘＰ３＋、青色＝ヘマトキシリン対比染色）。右側のグラフは、それぞれＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４に示される条件に対応する、２００倍視野当たりのＦｏｘＰ３＋細胞の盲検定量化を示す。図９Ｂおよび９Ｃ）ＤＥＲＥＧマウスは、Ｔｒｅｇ特異的ＦｏｘＰ３プロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体を発現し、ジフテリア毒素のＩＰ注射時にＴｒｅｇの特異的枯渇を可能にする。原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するＤＥＲＥＧマウスを、原発性腫瘍へのｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣと、ジフテリア毒素またはＰＢＳのいずれかのＩＰ注射で処置した（最初の反復実験を示す）。付随する免疫寛容は、これらのマウスにおいてＴｒｅｇの枯渇の後に排除され、９Ｂ）原発性および９Ｃ）続発性の腫瘍応答の改善がもたらされる。ｎ＝１群当たりのマウスの数。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図９Ｂは、付随する免疫寛容が、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の特異的枯渇によって回避されることを示す免疫組織化学画像およびグラフを示す図である。９Ａ）腫瘍を１つ（Ａ１およびＡ２）または２つ（Ａ３およびＡ４）有するマウスにおいてｘＲＴ後６日目に評価された腫瘍のＴｒｅｇマーカー、ＦｏｘＰ３の免疫組織化学（代表的な４００倍画像が示される）。マウスはｘＲＴを受けなかったか、または原発性腫瘍に対してのみｘＲＴを受けた。原発性腫瘍をＡ１～Ａ３に示し、続発性腫瘍をＡ４に示す。小さな矢印は、ＦｏｘＰ３＋細胞の一部を指摘する（褐色の核＝ＦｏｘＰ３＋、青色＝ヘマトキシリン対比染色）。右側のグラフは、それぞれＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４に示される条件に対応する、２００倍視野当たりのＦｏｘＰ３＋細胞の盲検定量化を示す。図９Ｂおよび９Ｃ）ＤＥＲＥＧマウスは、Ｔｒｅｇ特異的ＦｏｘＰ３プロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体を発現し、ジフテリア毒素のＩＰ注射時にＴｒｅｇの特異的枯渇を可能にする。原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するＤＥＲＥＧマウスを、原発性腫瘍へのｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣと、ジフテリア毒素またはＰＢＳのいずれかのＩＰ注射で処置した（最初の反復実験を示す）。付随する免疫寛容は、これらのマウスにおいてＴｒｅｇの枯渇の後に排除され、９Ｂ）原発性および９Ｃ）続発性の腫瘍応答の改善がもたらされる。ｎ＝１群当たりのマウスの数。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図９Ｃは、付随する免疫寛容が、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の特異的枯渇によって回避されることを示す免疫組織化学画像およびグラフを示す図である。９Ａ）腫瘍を１つ（Ａ１およびＡ２）または２つ（Ａ３およびＡ４）有するマウスにおいてｘＲＴ後６日目に評価された腫瘍のＴｒｅｇマーカー、ＦｏｘＰ３の免疫組織化学（代表的な４００倍画像が示される）。マウスはｘＲＴを受けなかったか、または原発性腫瘍に対してのみｘＲＴを受けた。原発性腫瘍をＡ１～Ａ３に示し、続発性腫瘍をＡ４に示す。小さな矢印は、ＦｏｘＰ３＋細胞の一部を指摘する（褐色の核＝ＦｏｘＰ３＋、青色＝ヘマトキシリン対比染色）。右側のグラフは、それぞれＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４に示される条件に対応する、２００倍視野当たりのＦｏｘＰ３＋細胞の盲検定量化を示す。図９Ｂおよび９Ｃ）ＤＥＲＥＧマウスは、Ｔｒｅｇ特異的ＦｏｘＰ３プロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体を発現し、ジフテリア毒素のＩＰ注射時にＴｒｅｇの特異的枯渇を可能にする。原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するＤＥＲＥＧマウスを、原発性腫瘍へのｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣと、ジフテリア毒素またはＰＢＳのいずれかのＩＰ注射で処置した（最初の反復実験を示す）。付随する免疫寛容は、これらのマウスにおいてＴｒｅｇの枯渇の後に排除され、９Ｂ）原発性および９Ｃ）続発性の腫瘍応答の改善がもたらされる。ｎ＝１群当たりのマウスの数。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１０Ａは、付随する免疫寛容がｘＲＴを両方の腫瘍部位に送達することによって克服されることを示すグラフを示す図である。原発性および続発性Ｂ７８腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍は、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣによる原発性腫瘍処置に対する原発性腫瘍応答を抑制する。これは、１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍と続発性腫瘍の両方に、そしてＩＴ－ＩＣを原発性腫瘍に送達することによって克服され、その結果１０Ａ）原発性腫瘍応答（最初の反復実験を示す）および１０Ｂ）反復実験からの総動物生存率（ａｇｇｒｅｇａｔｅ ａｎｉｍａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）が改善される。ｎ＝１群当たりのマウスの数。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１０Ｂは、付随する免疫寛容がｘＲＴを両方の腫瘍部位に送達することによって克服されることを示すグラフを示す図である。原発性および続発性Ｂ７８腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍は、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣによる原発性腫瘍処置に対する原発性腫瘍応答を抑制する。これは、１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍と続発性腫瘍の両方に、そしてＩＴ－ＩＣを原発性腫瘍に送達することによって克服され、その結果１０Ａ）原発性腫瘍応答（最初の反復実験を示す）および１０Ｂ）反復実験からの総動物生存率（ａｇｇｒｅｇａｔｅ ａｎｉｍａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）が改善される。ｎ＝１群当たりのマウスの数。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１１Ａは、低用量のｘＲＴは、単独ではｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発しないが、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位の１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣ処置とともに遠隔腫瘍部位に送達した場合に、付随する免疫寛容を実際に克服することを示す一連のグラフを示す図である。１１Ａ）原発性Ｂ７８腫瘍のみを有するマウスでは、１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣは、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発し（すでに示した通り）、大部分のマウスにおける完全な腫瘍退縮（本実験では４／６）および記憶性免疫応答をもたらす（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１６）。一方、ＩＴ－ＩＣ単独かまたは低用量（２Ｇｙ）ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの後に完全な腫瘍退縮を示す動物はない（両方の群で０／６）ｐ＜０．０５。１１Ｂ）原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍に送達された低用量ｘＲＴ（２Ｇｙまたは５Ｇｙ）は、原発性腫瘍で付随する免疫寛容を克服するその能力では１２Ｇｙに匹敵する。１１Ｃ）これらの同じ動物において、低用量ｘＲＴを続発性腫瘍に送達することによって付随する免疫寛容を克服することが、ＩＴ－ＩＣ免疫療法に対する全身応答を救済することは明らかである。これに関連して、ｘＲＴがすべての腫瘍部位に送達されると、原発性腫瘍のＩＴ－ＩＣ注射は、全身性抗腫瘍効果を引き起こし、２Ｇｙまたは５Ｇｙに対する続発性腫瘍応答を、原発性腫瘍のＩＴ－ＩＣ注射を行わない場合の１２ＧｙのｘＲＴに対する応答よりも大きくする。 図１１Ｂは、低用量のｘＲＴは、単独ではｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発しないが、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位の１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣ処置とともに遠隔腫瘍部位に送達した場合に、付随する免疫寛容を実際に克服することを示す一連のグラフを示す図である。１１Ａ）原発性Ｂ７８腫瘍のみを有するマウスでは、１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣは、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発し（すでに示した通り）、大部分のマウスにおける完全な腫瘍退縮（本実験では４／６）および記憶性免疫応答をもたらす（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１６）。一方、ＩＴ－ＩＣ単独かまたは低用量（２Ｇｙ）ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの後に完全な腫瘍退縮を示す動物はない（両方の群で０／６）ｐ＜０．０５。１１Ｂ）原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍に送達された低用量ｘＲＴ（２Ｇｙまたは５Ｇｙ）は、原発性腫瘍で付随する免疫寛容を克服するその能力では１２Ｇｙに匹敵する。１１Ｃ）これらの同じ動物において、低用量ｘＲＴを続発性腫瘍に送達することによって付随する免疫寛容を克服することが、ＩＴ－ＩＣ免疫療法に対する全身応答を救済することは明らかである。これに関連して、ｘＲＴがすべての腫瘍部位に送達されると、原発性腫瘍のＩＴ－ＩＣ注射は、全身性抗腫瘍効果を引き起こし、２Ｇｙまたは５Ｇｙに対する続発性腫瘍応答を、原発性腫瘍のＩＴ－ＩＣ注射を行わない場合の１２ＧｙのｘＲＴに対する応答よりも大きくする。 図１１Ｃは、低用量のｘＲＴは、単独ではｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発しないが、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位の１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣ処置とともに遠隔腫瘍部位に送達した場合に、付随する免疫寛容を実際に克服することを示す一連のグラフを示す図である。１１Ａ）原発性Ｂ７８腫瘍のみを有するマウスでは、１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣは、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発し（すでに示した通り）、大部分のマウスにおける完全な腫瘍退縮（本実験では４／６）および記憶性免疫応答をもたらす（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１６）。一方、ＩＴ－ＩＣ単独かまたは低用量（２Ｇｙ）ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの後に完全な腫瘍退縮を示す動物はない（両方の群で０／６）ｐ＜０．０５。１１Ｂ）原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍に送達された低用量ｘＲＴ（２Ｇｙまたは５Ｇｙ）は、原発性腫瘍で付随する免疫寛容を克服するその能力では１２Ｇｙに匹敵する。１１Ｃ）これらの同じ動物において、低用量ｘＲＴを続発性腫瘍に送達することによって付随する免疫寛容を克服することが、ＩＴ－ＩＣ免疫療法に対する全身応答を救済することは明らかである。これに関連して、ｘＲＴがすべての腫瘍部位に送達されると、原発性腫瘍のＩＴ－ＩＣ注射は、全身性抗腫瘍効果を引き起こし、２Ｇｙまたは５Ｇｙに対する続発性腫瘍応答を、原発性腫瘍のＩＴ－ＩＣ注射を行わない場合の１２ＧｙのｘＲＴに対する応答よりも大きくする。 図１２Ａは、低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が、全身性白血球減少症を伴わないかまたは腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を枯渇させずに、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを効果的に枯渇させることを示すＰＥＴ画像（１２Ａ）および一連の棒グラフ（１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄ）を示す図である。大部分の臨床シナリオでは、免疫抑制をもたらすことになる顕著な骨髄枯渇および白血球減少を引き起こすことなく、低用量でさえもすべての腫瘍部位に外照射を送達することは実現不可能である。ここで、本発明者らは、ＴＲＴを全身投与して、全身の免疫細胞の枯渇および白血球減少症を引き起こすことなく、腫瘍浸潤抑制性免疫細胞（Ｔｒｅｇ）を特異的に枯渇させることができるかどうかを試験した。１２Ａ）ポジトロン放出^１２４Ｉ－ＮＭ４０４を用いるこのＢ７８黒色腫腫瘍モデルにおける線量測定研究は、ＮＭ４０４の腫瘍選択的取り込みを裏付ける。Ｂ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、６０μＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４で処置した。この活性は、約２ＧｙのＴＲＴをＢ７８腫瘍に送達するのに必要な^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の量に近づく。末梢血および腫瘍試料を未処置の対照マウス（Ｃ）およびその後８日間隔（Ｔ１＝ｄ８、Ｔ２＝ｄ１６、Ｔ３＝ｄ２４、Ｔ４＝ｄ３２）で収集した。１２Ｂ）この用量のＴＲＴは有意な全身性白血球減少症をもたらさず、１２Ｃ）は腫瘍浸潤ＣＤ８エフェクターＴ細胞のレベルに有意な影響を及ぼさなかった（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．２５）。１２Ｄ）しかし、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、この用量のＴＲＴによって有意に枯渇した（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０３；^＊ｐ＜０．０５）。 図１２Ｂは、低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が、全身性白血球減少症を伴わないかまたは腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を枯渇させずに、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを効果的に枯渇させることを示すＰＥＴ画像（１２Ａ）および一連の棒グラフ（１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄ）を示す図である。大部分の臨床シナリオでは、免疫抑制をもたらすことになる顕著な骨髄枯渇および白血球減少を引き起こすことなく、低用量でさえもすべての腫瘍部位に外照射を送達することは実現不可能である。ここで、本発明者らは、ＴＲＴを全身投与して、全身の免疫細胞の枯渇および白血球減少症を引き起こすことなく、腫瘍浸潤抑制性免疫細胞（Ｔｒｅｇ）を特異的に枯渇させることができるかどうかを試験した。１２Ａ）ポジトロン放出^１２４Ｉ－ＮＭ４０４を用いるこのＢ７８黒色腫腫瘍モデルにおける線量測定研究は、ＮＭ４０４の腫瘍選択的取り込みを裏付ける。Ｂ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、６０μＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４で処置した。この活性は、約２ＧｙのＴＲＴをＢ７８腫瘍に送達するのに必要な^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の量に近づく。末梢血および腫瘍試料を未処置の対照マウス（Ｃ）およびその後８日間隔（Ｔ１＝ｄ８、Ｔ２＝ｄ１６、Ｔ３＝ｄ２４、Ｔ４＝ｄ３２）で収集した。１２Ｂ）この用量のＴＲＴは有意な全身性白血球減少症をもたらさず、１２Ｃ）は腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞のレベルに有意な影響を及ぼさなかった（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．２５）。１２Ｄ）しかし、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、この用量のＴＲＴによって有意に枯渇した（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０３；^＊ｐ＜０．０５）。 図１２Ｃは、低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が、全身性白血球減少症を伴わないかまたは腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を枯渇させずに、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを効果的に枯渇させることを示すＰＥＴ画像（１２Ａ）および一連の棒グラフ（１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄ）を示す図である。大部分の臨床シナリオでは、免疫抑制をもたらすことになる顕著な骨髄枯渇および白血球減少を引き起こすことなく、低用量でさえもすべての腫瘍部位に外照射を送達することは実現不可能である。ここで、本発明者らは、ＴＲＴを全身投与して、全身の免疫細胞の枯渇および白血球減少症を引き起こすことなく、腫瘍浸潤抑制性免疫細胞（Ｔｒｅｇ）を特異的に枯渇させることができるかどうかを試験した。１２Ａ）ポジトロン放出^１２４Ｉ－ＮＭ４０４を用いるこのＢ７８黒色腫腫瘍モデルにおける線量測定研究は、ＮＭ４０４の腫瘍選択的取り込みを裏付ける。Ｂ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、６０μＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４で処置した。この活性は、約２ＧｙのＴＲＴをＢ７８腫瘍に送達するのに必要な^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の量に近づく。末梢血および腫瘍試料を未処置の対照マウス（Ｃ）およびその後８日間隔（Ｔ１＝ｄ８、Ｔ２＝ｄ１６、Ｔ３＝ｄ２４、Ｔ４＝ｄ３２）で収集した。１２Ｂ）この用量のＴＲＴは有意な全身性白血球減少症をもたらさず、１２Ｃ）は腫瘍浸潤ＣＤ８エフェクターＴ細胞のレベルに有意な影響を及ぼさなかった（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．２５）。１２Ｄ）しかし、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、この用量のＴＲＴによって有意に枯渇した（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０３；^＊ｐ＜０．０５）。 図１２Ｄは、低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が、全身性白血球減少症を伴わないかまたは腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を枯渇させずに、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを効果的に枯渇させることを示すＰＥＴ画像（１２Ａ）および一連の棒グラフ（１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄ）を示す図である。大部分の臨床シナリオでは、免疫抑制をもたらすことになる顕著な骨髄枯渇および白血球減少を引き起こすことなく、低用量でさえもすべての腫瘍部位に外照射を送達することは実現不可能である。ここで、本発明者らは、ＴＲＴを全身投与して、全身の免疫細胞の枯渇および白血球減少症を引き起こすことなく、腫瘍浸潤抑制性免疫細胞（Ｔｒｅｇ）を特異的に枯渇させることができるかどうかを試験した。１２Ａ）ポジトロン放出^１２４Ｉ－ＮＭ４０４を用いるこのＢ７８黒色腫腫瘍モデルにおける線量測定研究は、ＮＭ４０４の腫瘍選択的取り込みを裏付ける。Ｂ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、６０μＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４で処置した。この活性は、約２ＧｙのＴＲＴをＢ７８腫瘍に送達するのに必要な^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の量に近づく。末梢血および腫瘍試料を未処置の対照マウス（Ｃ）およびその後８日間隔（Ｔ１＝ｄ８、Ｔ２＝ｄ１６、Ｔ３＝ｄ２４、Ｔ４＝ｄ３２）で収集した。１２Ｂ）この用量のＴＲＴは有意な全身性白血球減少症をもたらさず、１２Ｃ）は腫瘍浸潤ＣＤ８エフェクターＴ細胞のレベルに有意な影響を及ぼさなかった（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．２５）。１２Ｄ）しかし、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、この用量のＴＲＴによって有意に枯渇した（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０３；^＊ｐ＜０．０５）。 図１３Ａは、低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済することを示すグラフを示す図である。低用量^１３１Ｉ－ＮＭ４０４ ＴＲＴが、マウスを白血球減少症にすることなく腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを枯渇させる能力を考慮に入れて、本発明者らは低用量^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が付随する免疫寛容を効果的に克服するかどうかについて試験した。２つのＢ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように、１日目に６０ｍｃＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４で処置した（ＮＭ４０４）。１半減期（８日）後、動物に１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）に投与したか、またはｘＲＴを投与しなかった。^１３１Ｉ－ＮＭ４０４を投与しなかった対照マウスに、示されるような（０、２、または１２Ｇｙ）処置を続発性腫瘍に対して行った。１３～１７日目に、示されるように、マウスに原発性腫瘍（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）へのＩＣのＩＴ注射を毎日投与した。１３Ａ）原発性腫瘍および１３Ｂ）続発性腫瘍応答が示され、低用量ＴＲＴの投与が付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済することが実証される。 図１３Ｂは、低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済することを示すグラフを示す図である。低用量^１３１Ｉ－ＮＭ４０４ ＴＲＴが、マウスを白血球減少症にすることなく腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを枯渇させる能力を考慮に入れて、本発明者らは低用量^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が付随する免疫寛容を効果的に克服するかどうかについて試験した。２つのＢ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように、１日目に６０ｍｃＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４で処置した（ＮＭ４０４）。１半減期（８日）後、動物に１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）に投与したか、またはｘＲＴを投与しなかった。^１３１Ｉ－ＮＭ４０４を投与しなかった対照マウスに、示されるような（０、２、または１２Ｇｙ）処置を続発性腫瘍に対して行った。１３～１７日目に、示されるように、マウスに原発性腫瘍（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）へのＩＣのＩＴ注射を毎日投与した。１３Ａ）原発性腫瘍および１３Ｂ）続発性腫瘍応答が示され、低用量ＴＲＴの投与が付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済することが実証される。 例となるアルキルホスホコリン（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｃｈｏｌｉｎｅ）金属キレート（^６４Ｃｕ－ＮＭ６００）の化学構造を示す図である。その他の金属を^６４Ｃｕの代わりに使用してもよい。 ２匹の１腫瘍Ｂ７８マウスの^８６Ｙ－ＮＭ６００での注射後４８時間に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。 ２匹の２腫瘍Ｂ７８マウスの^８６Ｙ－ＮＭ６００での注射後４８時間に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。 Ｕ８７ＭＧマウスの^６４Ｃｕ－ＮＭ６００での注射後３時間（左パネル）、２４時間（中央パネル）および４８時間（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは右端に表示）として計算される組織放射能を示す。 ４Ｔ１マウスの^６４Ｃｕ－ＮＭ６００での注射後３時間（左パネル）、２４時間（中央パネル）および４８時間（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは右端に表示）として計算される組織放射能を示す。 ＨＣＴ－１１６マウスの^６４Ｃｕ－ＮＭ６００での注射後３時間（左パネル）、２４時間（中央パネル）および４８時間（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは右端に表示）として計算される組織放射能を示す。 Ａ５４９マウスの^６４Ｃｕ－ＮＭ６００での注射後３時間（左パネル）、２４時間（中央パネル）および４８時間（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは右端に表示）として計算される組織放射能を示す。 ＰＣ－３マウスの^６４Ｃｕ－ＮＭ６００での注射後３時間（左パネル）、２４時間（中央パネル）および４８時間（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは右端に表示）として計算される組織放射能を示す。 ＨＴ－２９マウスの^６４Ｃｕ－ＮＭ６００での注射後３時間（左パネル）、２４時間（中央パネル）および４８時間（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは右端に表示）として計算される組織放射能を示す。 ＭｉａＰａｃａマウスの^６４Ｃｕ－ＮＭ６００での注射後３時間（左パネル）、２４時間（中央パネル）および４８時間（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは右端に表示）として計算される組織放射能を示す。 ４Ｔ１マウスの^８６Ｙ－ＮＭ６００での注射後３時間（左パネル）、２４時間（中央パネル）および４８時間（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは右端に表示）として計算される組織放射能を示す。 ４Ｔ１マウスの^８９Ｚｒ－ＮＭ６００での注射後３時間（左パネル）、２４時間（中央パネル）および４８時間（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは右端に表示）として計算される組織放射能を示す。 ＨＴ－２９マウスの^５２Ｍｎ－ＮＭ６００での注射後４時間（左パネル）および１日（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは右端に表示）として計算される組織放射能を示す。 ＰＣ－３マウスの^５２Ｍｎ－ＮＭ６００での注射後４時間（左パネル）および１日（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは各画像の右に表示）として計算される組織放射能を示す。 ＨＴ－２９マウスの^５２Ｍｎ－ＮＭ６００での注射後２日（左パネル）、３日（左から２番目のパネル）、５日（右から２番目のパネル）および７日（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは画像の右に表示）として計算される組織放射能を示す。 ＰＣ－３マウスの^５２Ｍｎ－ＮＭ６００での注射後２日（左パネル）、３日（左から２番目のパネル）、５日（右から２番目のパネル）および７日（右パネル）に行われたスキャンからのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。これらの画像は、注射された用量／ｇ組織の百分率（％ＩＤ／ｇ、スケールは画像の右に表示）として計算される組織放射能を示す。 ^８６Ｙ－ＮＭ６００、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００および^８９Ｚｒ－ＮＭ－６００を注射した４Ｔ１マウスの４Ｔ１腫瘍組織についての目的データ（時間の関数としてのキレート取り込み）のＰＥＴ定量範囲を示すグラフを示す図である。 ^８６Ｙ－ＮＭ６００、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００および^８９Ｚｒ－ＮＭ－６００を注射した４Ｔ１マウスの心臓組織についての目的データ（時間の関数としてのキレート取り込み）のＰＥＴ定量範囲を示すグラフを示す図である。 ^８６Ｙ－ＮＭ６００、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００および^８９Ｚｒ－ＮＭ－６００を注射した４Ｔ１マウスの肝臓組織についての目的データ（時間の関数としてのキレート取り込み）のＰＥＴ定量範囲を示すグラフを示す図である。 ^８６Ｙ－ＮＭ６００、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００および^８９Ｚｒ－ＮＭ－６００を注射した４Ｔ１マウスの全身についての目的データ（時間の関数としてのキレート取り込み）のＰＥＴ定量範囲を示すグラフを示す図である。 金属キレートの注射後４８時間（^８６Ｙ－ＮＭ６００、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００、^８９Ｚｒ－ＮＭ－６００および^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００）および９６時間（^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００）の４Ｔ１マウスの健常組織および腫瘍組織のエクスビボでのキレート体内分布を示す棒グラフを示す図である。 例となるアルキルホスホコリン（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｃｈｏｌｉｎｅ）金属キレート（^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００）の化学構造を示す図である。その他の金属を^１７７Ｌｕの代わりに使用してもよい。 ^９０Ｙ－ＮＭ６００の注射の４８時間後に撮影した３匹のＢ７８マウスのオーディオラジオグラフィー画像（ａｕｄｉｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｍａｇｅ）を示す図である。異種移植Ｂ７８腫瘍は、各マウス画像の右下の大きな黒い点として見える。 ^９０Ｙ－ＮＭ６００の注射の９６時間後に撮影した３匹のＢ７８マウスのオーディオラジオグラフィー画像を示す図である。異種移植Ｂ７８腫瘍は、各マウス画像の右下の大きな黒い点として見える。 ^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００による注射後５日目に撮影したＢ７８マウスのオーディオラジオグラフィー画像を示す図である。異種移植Ｂ７８腫瘍は、マウスの下部の２つの黒い点として見える。 ^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００による注射後１３日目に撮影したＢ７８マウスのオーディオラジオグラフィー画像を示す図である。異種移植Ｂ７８腫瘍は、マウスの下部の２つの黒い点として見える。 ^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００による注射の１０日後に撮影したＭｉａＰａｃａマウスのオーディオラジオグラフィー画像を示す図である。異種移植ＭｉａＰａｃａ腫瘍の位置は、矢印および破線円で示される。 ^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００の注射の４８時間後に撮影した３匹の４Ｔ１マウスのオーディオラジオグラフィー画像を示す図である。異種移植４Ｔ１腫瘍の位置は、矢印および破線円で示される。 ^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００の注射の９６時間後に撮影した３匹の４Ｔ１マウスのオーディオラジオグラフィー画像を示す図である。異種移植４Ｔ１腫瘍の位置は、破線円で示される。 ^９０Ｙ－ＮＭ６００の注射の４時間後に撮影した３匹の４Ｔ１マウスのオーディオラジオグラフィー画像を示す図である。異種移植４Ｔ１腫瘍の位置は、矢印および破線円で示される。 ^９０Ｙ－ＮＭ６００の注射の４８時間後に撮影した３匹の４Ｔ１マウスのオーディオラジオグラフィー画像を示す図である。異種移植４Ｔ１腫瘍は、各マウス画像の右下の大きな黒い点として見える。 ^９０Ｙ－ＮＭ６００の注射の９６時間後に撮影した３匹の４Ｔ１マウスのオーディオラジオグラフィー画像を示す図である。異種移植４Ｔ１腫瘍は、各マウス画像の右下の大きな黒い点として見える。 対照（賦形剤のみ）と比較した、Ｂ７８異種移植マウスモデルにおける２つの異なる用量（１５０μＣｉおよび３００μＣｉ）の^９０Ｙ－ＮＭ６００の放射線治療の効果を説明するグラフを示す図である。データは、測定された腫瘍体積（ｍｍ^３）として、注射後の日数で表される時間の関数として示される。 対照（賦形剤のみ）と比較した、Ｂ７８異種移植マウスモデルにおける^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００の５００μＣｉ単回投与の放射線治療の効果を説明するグラフを示す図である。データは、測定された腫瘍体積（ｍｍ^３）として、注射後の日数で表される時間の関数として示される。 対照（賦形剤のみ）と比較した、ＭｉａＰａｃａ異種移植マウスモデルにおける^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００の４００μＣｉ単回投与の放射線治療の効果を説明するグラフを示す図である。データは、測定された腫瘍体積（ｍｍ^３）として、注射後の日数で表される時間の関数として示される。 対照（賦形剤のみ）と比較した、４Ｔ１異種移植マウスモデルにおける^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００の５００μＣｉ単回投与の放射線治療の効果を説明するグラフを示す図である。データは、測定された腫瘍体積（ｍｍ^３）として、注射後の日数で表される時間の関数として示される。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 対照（賦形剤のみ）と比較した、４Ｔ１異種移植マウスモデルにおける^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００の２回の連続投与（５００μＣｉおよび２５０μＣｉ）の放射線治療の効果を説明するグラフを示す図である。データは、測定された腫瘍体積（ｍｍ^３）として、注射後の日数で表される時間の関数として示される。 対照（賦形剤のみ）と比較した、４Ｔ１異種移植マウスモデルにおける２つの異なる用量（５００μＣｉおよび２５０μＣｉ）の^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００の放射線治療の効果を説明するグラフを示す図である。データは、測定された腫瘍体積（ｍｍ^３）として、注射後の日数で表される時間の関数として示される。 従来のＴＲＴにおける^９０Ｙ－ＮＭ６００および^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の治療効力の比較への腫瘍量の影響を示すグラフを示す図である。 アミン類似体とともに、ＮＭ４０４の３つの異なる金属キレート類似体の平均アルブミン結合エネルギーを比較する棒グラフを示す図である。比較のために、Ｉ－ＮＭ４０４結合エネルギーを点線として示す。

Ｉ．概要
本開示が記載されている特定の方法論、プロトコール、材料、および試薬に限定されず、これらが変わる可能性があることは理解される。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、後に出願された非仮出願によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本明細書および添付される特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに指示されている場合を除いて複数形への言及が含まれる。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書において同義的に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその変化形は、これらの用語が本明細書および特許請求の範囲に現れる場合には限定的な意味を有さない。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」は、同義的に使用され得る。

別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等のどんな方法および材料も本発明の実践または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書に具体的に言及されたすべての刊行物および特許は、本発明に関連して使用され得る刊行物に報告されている化学物質、機器、統計解析および方法論を記載および開示することを含むあらゆる目的のために参照により組み込まれる。本明細書中で引用されたすべての参考文献は、当業者の技術水準を示すものとして解釈される。

本明細書に記載の専門用語は、実施形態の説明のためのだけのものであり、全体として本発明を限定するものと解釈されるべきではない。特に断りのない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「少なくとも１つ」は同義的に使用され、１つまたは複数を意味する。

本開示は、本明細書に記載される化合物（中間体を含む）をその薬剤的に許容される形態のいずれかで含み、その形態には異性体（例えば、ジアステレオマーおよびエナンチオマー）、互変異性体、塩、溶媒和物、多形体、プロドラッグなどが含まれる。特に、化合物が光学活性である場合、本発明は、化合物のエナンチオマーの各々、ならびにエナンチオマーのラセミ混合物を具体的に含む。用語「化合物」は、（時折、「塩」が明示的に述べられているが）明示的に述べられているかいないかにかかわらず、そのような形態のいずれかまたはすべてを含むことを理解されたい。

本明細書において使用される「薬剤的に許容される」とは、その化合物または組成物または担体が、治療の必要性を考慮して過度に有害な副作用なく本明細書に記載の治療を達成するための対象への投与に適していることを意味する。

用語「有効量」とは、本明細書において、研究者、獣医師、医師またはその他の臨床医が求める対象、組織または細胞の生物学的または医学的応答を引き出す化合物の量または投与量をさす。

本明細書において、「薬剤的に許容される担体」には、ありとあらゆる乾燥粉末、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが含まれる。薬剤的に許容される担体は、本発明の方法において化合物を投与するために有用な物質である。この物質は好ましくは無毒であり、固体、液体または気体の物質であってよく、その他の点では不活性であって薬剤的に許容され、本発明の化合物と相溶性である。そのような担体の例としては、限定されるものではないが、さまざまなラクトース、マンニトール、トウモロコシ油などの油、ＰＢＳなどの緩衝液、生理食塩水、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミドなどのアミド、アルブミンなどのタンパク質、およびＴｗｅｅｎ８０などの界面活性剤、グルコース、ラクトース、シクロデキストリンおよびデンプンなどの単糖類およびオリゴ多糖類が挙げられる。

用語「投与すること」または「投与」とは、本明細書において、治療または予防されるべき疾患または状態に罹患しているかまたはその危険性がある対象に本発明の化合物または医薬組成物を提供することをさす。

薬理学において投与経路は薬物が体内に取り込まれる経路である。投与経路は、通常、物質が適用される部位によって分類される。一般的な例としては、経口および静脈内投与が含まれる。また、経路は作用標的がどこにあるかに基づいて分類されることもできる。作用は、局所的、経腸的（全身に及ぶ作用、ただし消化管を通じて送達される）、または吸入によって肺を経由する非経口的（全身作用、ただし消化管以外の経路によって送達される）であってよい。本出願で言及される局所投与の一形態は、腫瘍内（ＩＴ）であり、薬剤が既知の腫瘍部位に直接または隣接して注入される。

局所投与は局所的な作用を強調し、物質はその作用が望まれる場所に直接適用される。しかし、時には、局所という用語は、物質の標的効果を伴わなくても、身体の局所領域に、または身体部分の表面に適用されるものとして定義されることがあり、この分類をどちらかといえば適用部位に基づく分類の変形とする。経腸投与では、望ましい作用は全身的（非局所的）であり、物質は消化管を介して投与される。非経口投与では、望ましい作用は全身的であり、物質は消化管以外の経路によって投与される。

局所投与の限定されない例としては、経皮投与（皮膚に適用）、例えばアレルギー試験または典型的な局所麻酔、吸入、例えば喘息薬、浣腸、例えば腸のイメージング用の造影剤、点眼薬（結膜に適用）、例えば結膜炎用の抗生物質、点耳薬、例えば外耳炎用の抗生物質および副腎皮質ステロイド、ならびに身体内の粘膜を介する投与を挙げることができる。

経腸投与は、消化管のいずれかの部分を伴い、全身性の作用を有する投与であってよい。例としては、経口（経口）による、錠剤、カプセル剤、または滴剤としての多くの薬物の投与、胃栄養チューブ、十二指腸栄養チューブ、または胃瘻造設による、多くの薬物および経腸栄養の投与、ならびに直腸内への坐剤中のさまざまな薬物の投与を挙げることができる。

非経口投与の例としては、静脈内（静脈内への）投与、例えば多くの薬物、中心動脈栄養法の動脈内（動脈の中への）投与、例えば、血管攣縮の治療における血管拡張薬および塞栓症の治療のための血栓溶解薬、骨内注入（骨髄内への）投与、筋肉内投与、大脳内（脳実質内への）投与、脳室内（脳室系内への）投与、髄腔内投与（脊柱管への注射）、ならびに皮下（皮膚の下への）投与を挙げることができる。これらの中で、骨内注入は、骨髄が静脈系に直接排出されるので、実質的に、間接的静脈内アクセスである。骨内注入は、静脈内へのアクセスが困難な場合に、救急医療や小児科において薬物や輸液に時折使用されることがある。

本開示では以下の略語が使用される：ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性；Ｂ１６、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスと同系の黒色腫；Ｂ７８、ＧＤ２シンターゼによるトランスフェクションのためにＧＤ２を発現するＢ１６の変異体；Ｄ、日；Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、実施例に開示される調査で使用される一次免疫サイトカイン（ＧＤ２に対して反応する）；ＩＣ、イムノサイトリン（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｌｉｎｅ）（ＩＬ２に結合した腫瘍反応性ｍＡｂの融合タンパク質）；ＩＬ２、インターロイキン２；ＩＴ、腫瘍内；ＩＶ、静脈内；ｍＡｂ、モノクローナル抗体；ＭＡＨＡ、マウス抗ヒト抗体；ＮＭ４０４、図１に示されるリン脂質エーテルをさすために使用され、大部分の腫瘍によって選択的に取り込まれ、実施例に開示される調査においてＴＲＴに使用される；ＮＭ６００、図１４に示されるリン脂質エーテルをさすために使用され、どんな金属ともキレート化されることができ、これも大部分の腫瘍によって選択的に取り込まれ、実施例に開示される調査においてＴＲＴに使用される；ＮＸＳ２、ＡＪマウスと同系の神経芽細胞腫；Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２、ＧＤ２シンターゼによるトランスフェクションのためにＧＤ２を発現するＣ５７Ｂｌ／６マウスと同系の膵臓癌；ＰＬＥ、リン脂質エーテル；ＲＴ、放射線治療；ＴＲＴ、標的化された放射線治療；Ｗ、週；９４６４Ｄ－ＧＤ２、ＧＤ２シンターゼによるトランスフェクションのためにＧＤ２を発現するＣ５７Ｂｌ／６マウスと同系の神経芽細胞腫。

ＩＩ．本発明
本開示は、１つ以上の悪性の固形腫瘍として存在するあらゆる癌を治療する方法に関する。開示される方法は、２つの治療ステップを組み合わせ、予期せぬ相乗効果によって、悪性固形腫瘍に対してはるかに改善されたｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種効果をもたらす。具体的には、悪性固形腫瘍組織によって差別的に取り込まれ保持される免疫調節用量の放射性リン脂質金属キレート化合物が患者に投与され、免疫刺激剤で治療されている少なくとも１つの悪性固形腫瘍への追加のｘＲＴの有無にかかわらず、腫瘍微小環境内の特定の免疫細胞を刺激することができる１以上の薬剤を含む組成物を、少なくとも１つの悪性固形腫瘍内に腫瘍内注射すること（または適用すること）によって、ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種が実施される。免疫調節用量の放射性リン脂質金属キレート化合物は、Ｔｒｅｇレベル（およびその他の免疫抑制要素）を低下させる可能性が高く、ｘＲＴを１つの腫瘍に対して使用し、１以上の追加の腫瘍が照射されない場合に生じる免疫系の低下（付随する免疫寛容）を防ぐが、機序の理解は本発明の実践に必要ではなく、本発明は特定の作用機序に限定されない。

Ａ．腫瘍内免疫化－ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種
腫瘍内免疫化に使用される組成物としては、限定されるものではないが、１以上のサイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、パターン認識アゴニスト、および／または腫瘍特異的抗原に対する抗体を含む免疫刺激性モノクローナル抗体を挙げることができる。腫瘍内免疫化／ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種戦略の概説には（戦略の中には使用可能なものもある）、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １１（８）：１９０１－１９０９，２０１５；およびＭａｒａｂｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０（７）：１７４７－５６，２０１４；およびＭｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｅ－ｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ，２０１６を参照されたい；これらすべては参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される限定されない例では、腫瘍内（ｉｍｔｒａｔｕｍｏｒａｌ）免疫化は、抗ＧＤ２ ｍＡｂとインターロイキン２の融合タンパク質（ｈｕ１４．１８－ＩＬ２）を注射することによって実施された。しかし、開示される方法は、決してこれらの例に限定されない。

Ｂ．免疫調節用量の放射性リン脂質金属キレート化合物
使用される放射性リン脂質金属キレート化合物は、金属キレート化合物にキレート化された金属同位体によって放出されるＲＴが、放出されたＲＴにその他の組織種を実質的にさらすことなく、悪性固形腫瘍組織に向けられるように、広範囲の固形腫瘍細胞種を選択的に標的とするべきである。放射性リン脂質金属キレート化合物に含められる放射性金属同位体は、イオン化ＲＴを化合物に取り込まれる細胞の免疫活性化をもたらす形で放出することが公知のどんな放射性金属同位体であってもよい。使用され得る放射性金属同位体の限定されない例としては、Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ｈｏ－１６６、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｃｕ－６７、Ａｕ－１９９、Ｒｈ－１０５、Ｒａ－２２３、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｐｂ－２１２、またはＴｈ－２２７が挙げられる。

放射性リン脂質金属キレート化合物の免疫調節ＲＴ用量は（注射される用量とは対照的に）、悪性固形腫瘍に対して従来ＲＴに使用される用量よりもはるかに少ない。具体的には、用量は、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を担う望ましい免疫細胞を除去しない一方で、（おそらく免疫抑制Ｔｒｅｇレベルおよびその他の免疫抑制細胞または分子を減少させることによって）腫瘍微小環境内の免疫細胞において応答を刺激するのに十分であるべきである。

適切な免疫調節用量は、「検出促進」用量の放射性金属キレート化合物を投与した後に得られる画像データから計算することができる。検出促進用量は、免疫調節用量とは全く異なっていることがあり、放射性金属キレート化合物に組み込まれる放射性金属同位体は異なっていることがある（しかし化合物構造の残りは同じであるべきである）。検出ステップおよび線量測定計算で用いられる放射性金属同位体は、従来のイメージング手段によってすぐに検出可能な形態でＲＴを放出することが公知のどんな放射性金属同位体であってもよい。「従来のイメージング手段」の限定されない例としては、ガンマ線検出、ＰＥＴ走査、およびＳＰＥＣＴ走査が挙げられる。使用され得る放射性金属同位体の限定されない例としては、Ｇａ－６６、Ｃｕ－６４、Ｙ－８６、Ｃｏ－５５、Ｚｒ－８９、Ｓｒ－８３、Ｍｎ－５２、Ａｓ－７２、Ｓｃ－４４、Ｇａ－６７、Ｉｎ－１１１、またはＴｃ－９９ｍが挙げられる。

Ｃ．ＰＬＥ類似体の金属キレート
開示される構造は、アルキルホスホコリン（ＡＰＣ）担体骨格を利用する。合成されれば、薬剤は、関連する放射性ハロゲン化化合物で以前に実証したように腫瘍選択性を保持すると同時にそれらを注射に適したものにする製剤特性を有するべきである。開示される構造には、放射性金属同位体とキレート化して最終的なイメージングまたは治療薬を生成するキレート部分が含まれる。

Ｄ．例となるＭ－ＰＬＥ類似体を合成する方法
化合物１の提案される合成を以下に示す。合成の最初のステップは、Ｏｒｇ Ｓｙｎｔｈ，２００８，８５，１０－１４に記載されるものに類似している。合成はサイクレンから出発し、これをＤＯ３Ａトリス－Ｂｎエステルに変換する。次に、この中間体を塩基およびＰｄ触媒の存在下でＮＭ４０４とコンジュゲートさせる。最後に、ベンジル保護基を接触水素化によって除去する。

化合物２の合成を以下に示す。合成はＤＯ３Ａトリス－Ｂｎエステルから開始し、これを３－（ブロモ－プロパ－１－イニル）－トリメチルシランでアルキル化する。アルキル化後、トリメチルシリル（ｔｒｉｍｅｔｈｊｙｌｓｉｌｙｌ）基を除去し、中間体アセチレンを薗頭反応によってＮＭ４０４とカップリングさせる。ベンジル基を除去し、合成の最後のステップで三重結合を同時に水素化する。

化合物５および６は、以下のスキームに示すように、同じ前駆体、ＤＴＰＡ二無水物および１８－ｐ－（３－ヒドロキシエチル－フェニル）－オクタデシルホスホコリンから合成することができる。

ＮＯＴＡ－ＮＭ４０４コンジュゲートは類似の方法で合成することができる。一例は、以下のＮＯＴＡ－ＮＭ４０４コンジュゲート７である。

Ｅ．剤形および投与方法
Ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種は、腫瘍内注射によって実施することができるが、その他の投与を（局所または全身に）適用することができる。相乗的標的化ＲＴには、どんな投与経路も適するであろう。一実施形態では、開示されるアルキルホスホコリン類似体は、静脈内注射を介して対象に投与されてよい。もう一つの実施形態では、開示されるアルキルホスホコリン類似体は、任意のその他の適した全身送達、例えば非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、直腸投与、または経皮投与を介して対象に投与されてよい。

もう一つの実施形態では、開示されるアルキルホスホコリン類似体は、鼻腔系または口を介して、例えば、吸入によって対象に投与されてよい。

もう一つの実施形態では、開示されるアルキルホスホコリン類似体は、腹腔内注射またはＩＰ注射を介して対象に投与されてよい。

ある種の実施形態では、開示されるアルキルホスホコリン類似体は、薬剤的に許容される塩として提供されてよい。しかし、その他の塩は、アルキルホスホコリン類似体またはその薬剤的に許容される塩の調製に有用であることがある。適した薬剤的に許容される塩としては、限定されるものではないが、例えば、アルキルホスホコリン類似体の溶液を、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸などの薬剤的に許容される酸の溶液と混合することによって形成され得る酸付加塩が挙げられる。

開示されるアルキルホスホコリン類似体が少なくとも１つの不斉中心を有する場合、それらはそれに応じてエナンチオマーとして存在してよい。開示されるアルキルホスホコリン類似体が２以上の不斉中心を有する場合、それらはそれに応じてジアステレオ異性体として存在してよい。そのような異性体およびその任意の割合の混合物がすべて本開示の範囲内に包含されることは理解される。

本開示は、１以上の開示されるアルキルホスホコリン類似体を薬剤的に許容される担体とともに含む医薬組成物を使用する方法も含む。好ましくは、これらの組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口液剤または懸濁剤、定量エアゾール剤または液体スプレー剤、滴剤、アンプル剤、自動注射装置または坐剤などの、非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与もしくは直腸投与、または吸入もしくは吹送による投与用の、単位剤形の形である。

錠剤などの固体組成物を調製するには、主要な有効成分を、薬学的に許容される担体、例えば従来の錠剤化成分、例えばトウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴム、およびその他の薬学的希釈剤、例えば水などと混合して、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩のための均質な混合物を含有する、固体の予備製剤組成物を形成する。これらの予備製剤組成物を均質と呼ぶ場合、それは、有効成分が組成物全体にわたって均一に分散されているので、組成物が錠剤、丸剤およびカプセル剤などの等しく有効な単位剤形に容易に細分され得ることを意味する。この固体の予備製剤組成物は、次に、０．１～約５００ｍｇの本発明の有効成分を含有する上記の種類の単位剤形に細分される。典型的な単位剤形は、１～１００ｍｇ、例えば、１、２、５、１０、２５、５０または１００ｍｇの有効成分を含有する。新規組成物の錠剤または丸剤は、長期作用の利点を与える投与量を提供するためにコーティングされるか、または別の方法で配合され得る。例えば、錠剤または丸薬は、内側投薬成分および外側投薬成分を含むことができ、後者は、前者の上の外被の形態である。２つの成分は、胃での分解に抵抗するのに役立ち、内側の成分が損傷を受けずに十二指腸に入るかまたは放出が遅延されるのに役立つ、腸溶層によって隔てられ得る。多様な材料がそのような腸溶層または腸溶コーティングに使用され得、そのような材料には、多数のポリマー酸、ならびにポリマー酸と、セラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースとしてのそのような材料との混合物が含まれる。

アルキルホスホコリン類似体を経口または注射による投与のために組み込んでよい液体形態としては、水溶液、適切に風味付けされたシロップ、水性または油性懸濁液、および、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油またはピーナッツ油などの食用油を含む風味付き乳濁液、ならびにエリキシル剤および同様の薬学的賦形剤が挙げられる。水性懸濁液に適した分散剤または沈殿防止剤としては、トラガカントゴム、アラビアゴム、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンなどの合成および天然ゴムが挙げられる。

開示されるアルキルホスホコリン類似体は、注射可能な担体系との組合せを含む、薬学的に注射可能な投薬形態に処方される場合に特に有用である。本明細書において、注射可能な剤形および注入剤形（すなわち非経口剤形）としては、限定されるものではないが、リポソーム注射剤または活性のある原薬を封入するリン脂質を有する脂質二重層小胞が挙げられる。注射剤には、非経口使用を意図した無菌調製物が含まれる。

ＵＳＰによって定義されるように５つの異なるクラスの注射剤：乳濁液、脂質、粉末、溶液および懸濁液が存在する。乳濁液注射には、非経口投与が意図される無菌の発熱物質を含まない調製物を含む乳濁液が含まれる。溶液注射用の脂質複合体および粉末は、非経口使用のための溶液を形成するための再構成を意図した無菌調製物である。懸濁液注射用粉末は、非経口使用のための懸濁液を形成するための再構成を意図した無菌調製物である。リポソーム懸濁液注射用の凍結乾燥粉末は、再構成時に製剤が形成される、非経口使用のための再構成を目的とする無菌のフリーズドライ調製物であり、これは、脂質二重層内または水性空間に活性のある原薬を封入するために使用されるリン脂質を有する、脂質二重層小胞などのリポソームの組み込みを可能にする形で処方される。溶液注射用の凍結乾燥粉末は、その製法がごく低圧で凍結状態の生成物から水分を除去することを含み、その後の液体の添加により注射の必要条件にあらゆる点で適合する溶液を生成する、凍結乾燥（「フリーズドライ」）によって調製される溶液用の剤形である。懸濁液注射用の凍結乾燥粉末は、適した液状媒体中に懸濁された固体を含む、非経口使用を目的とする液体調製物であり、そしてそれは、懸濁液を意図する薬剤が凍結乾燥によって調製される、滅菌懸濁液の必要条件にあらゆる点で適合する。溶液注射は、注射に適している、適した溶媒または相互に混和性の溶媒の混合物に溶解した１以上の原薬を含有する液体調製物を含む。

溶液濃縮物注射は、適した溶媒を添加すると、注射の必要条件にあらゆる点で適合する溶液を生じる非経口使用用の無菌調製物を含む。懸濁液注射は、粒子が不溶性であり、油相が水相全体に分散しているかまたは逆も同じである、液相全体にわたって分散した固体粒子を含有する液体調製物（注射に適している）を含む。懸濁リポソーム注射剤は、リポソーム（脂質二重層内かまたは水性空間のいずれかに活性のある原薬を封入するために使用されるリン脂質を通常含有する脂質二重層小胞）が形成されるように、油相が水相全体に分散した液体調製物（注射に適している）である。懸濁液超音波処理注射液は、粒子が不溶性である、液相全体に分散した固体粒子を含有する液体調製物（注射に適している）である。その上、生成物は、ガスを懸濁液に吹き込む際に超音波処理されてもよく、その結果、固体粒子によるミクロスフェアが形成される。

非経口担体系には、１以上の薬学的に適した賦形剤、例えば溶媒および共溶媒、可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤、増粘剤、乳化剤、キレート剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、還元剤、抗菌性保存剤、充填剤、保護剤、等張化剤、および特殊添加剤などが含まれる。

以下の実施例は説明目的のためだけに提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。実際に、本明細書中に示され記載されたものに加えて、本発明のさまざまな変更は、前述の説明および以下の実施例から当業者に明らかとなり、添付される特許請求の範囲に入る。

ＩＩＩ．実施例
実施例の序論
これらの実施例は、予想外の非常に強力な相乗効果を利用して、癌治療研究における２つの非常に異なる最先端の学問分野を１つにする可能性を示す。これらの学問分野は、１）全身投与されたＴＲＴ、および２）局所に向けられる、抗体に媒介される癌免疫療法である。本明細書に提示されるデータは、これらの手法を組み合わせることによって生じる強力な相乗効果を示唆する。一緒に、これらの２つの戦略を用いて、どんな部位のどんな種類の固形腫瘍に対しても、破壊された癌細胞が持続性残存転移性疾患を根絶することの可能な腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を生じる強力なｉｎ ｓｉｔｕワクチンとして機能することを可能にする方法で、目に見える肉眼的腫瘍を破壊することができる。

本発明者らの進行中の前臨床研究は、腫瘍特異的ｍＡｂとＩＬ２（自然免疫細胞を活性化するための）の組合せが抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の増強［１、２］；神経芽細胞腫の小児に対する臨床的利益にすでに変換されているプロセス［３］をもたらすことを示した。最近の前臨床データは、ｍＡｂ－ＩＬ２融合タンパク質が腫瘍内注射（ＩＴ）された場合の、より強力な抗腫瘍効果を示す［４、５］。注目すべきことに、これらのｍＡｂ／ＩＬ２注射に応答せず、局所ｘＲＴのみで治療した場合には成長し続ける大きな腫瘍は、ｘＲＴをｍＡｂ／ＩＬ２治療と組み合わせると完全に根絶することができる。大部分のマウスが治癒し、同様の腫瘍細胞による再攻撃を拒絶するＴ細胞記憶を発達させており［６］；併用されたｘＲＴ＋ｍＡｂ／ＩＬ２が強力な「ｉｎ ｓｉｔｕ」抗癌ワクチンとして作用していることを示している。

重要な制限は、これらの動物が原発性（第１の）腫瘍に対してｘＲＴ＋ｍＡｂ／ＩＬ２治療を受けた場合に別の肉眼的腫瘍が存在するならば、第２の腫瘍は増殖し続け、本発明者らの驚くべきことに、免疫反応を抑制して、１回目の治療を受けた腫瘍の縮小を防ぐことである。この「付随する免疫寛容」は、一部分、第２の腫瘍の抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に起因する。ＲＴだけを両方の腫瘍に送達すると最小の抗腫瘍効果があるが、これらのＴｒｅｇを枯渇させる。このように、第１の腫瘍をｘＲＴ＋ｍＡｂ／ＩＬ２で治療すると、第２の腫瘍へのＲＴの追加によってこの免疫寛容が回避され、両方の腫瘍の根絶が可能になる［７］。これらの知見は、転移性の状況におけるｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種の制限を示すが、ＲＴがこの制限を克服する強い能力も示唆する。

ｘＲＴは、一般に、禁止された正常組織毒性および免疫抑制なしに転移性の部位に送達されることができない。しかし、肉眼的疾患のすべての部位にｘＲＴを送達しなくても、抑制性免疫系統を無傷のままにすることがあり、それは本発明者らの局所的ｘＲＴ＋ｍＡｂ／ＩＬ２免疫療法に対する免疫学的応答を抑制することができる。そのため、必要とされているのは、標的化された方法で癌患者のすべての腫瘍部位にＲＴを送達する手段である。

本発明者らは、全身投与されたＲＴを原発性癌と転移性癌の両方に標的化することができるＴＲＴ賦形剤を開発した。そのようなＴＲＴ試薬の１つである、^１３１Ｉ－ＮＭ４０４は、静脈内（ＩＶ）投与されるリン脂質エーテル（ＰＬＥ）類似体で、６０を超えるインビボ癌および癌幹細胞モデルにおいてほぼ万能の腫瘍標的化特性を示した。この試薬は現在、複数のイメージングおよび臨床試験で臨床的に評価されている［８、９］。^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の全身注射は、解剖学的部位にかかわらず、すべての腫瘍に集中して、効果的な腫瘍根絶性免疫応答の生成を防ぐことのできる、腫瘍内免疫抑制経路を切断するのに十分なＲＴを内部的に提供する。この手法の独特の特質は、ＮＭ４０４のほぼ万能の腫瘍標的化能力、ならびに免疫調節性の致死量以下の用量のＲＴをすべての腫瘍部位に送達する能力であり、これは一般にｘＲＴでは実現不可能である。これについての新しいことは、本発明者らのＴＲＴ剤が、解剖学的部位にかかわらず、すべての腫瘍を免疫調節し、付随する寛容性を克服することができ、それにより局所ｘＲＴとそれに続く腫瘍特異的ｍＡｂ＋ＩＬ２の注射の後に長期間のｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種効果がもたらされるということである。ますます多くの腫瘍特異的ｍＡｂが臨床使用のために承認されるようになっているので、この併用戦略は、腫瘍反応性ｍＡｂによって標的化され得るどんな腫瘍型に対しても手法の拡張を提供する。さらに、この手法は、すべてのｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン接種戦略に容易に一般化することができる。

近年、本発明者らは、^１３１Ｉ－ＮＭ４０４中のヨウ素を、幅広い種類の金属イメージング（ＭＲＩおよびＰＥＴ）およびＴＲＴ放射線治療部分を有することのできるキレート剤で置換できることを見出した。これらの実施例では、本発明者らは、局所のｘＲＴ＋ｍＡｂ／ＩＬ２併用治療が強力な放射免役促進性のｉｎ ｓｉｔｕ癌ワクチンを誘導することを可能にするために必要な全身免疫調節応答を開始する^１３１Ｉ－ＮＭ４０４（およびしたがって、関連する金属キレート類似体）の能力を評価する方法を説明する。同様の手法は、ＰＬＥ類似体に送達されるＴＲＴとその他のｉｎ ｓｉｔｕ癌ワクチン法の併用に用いることができる。

要するに、本発明者らは、一見したところ切り離された癌治療の学問分野に由来する２つの異なる方法を１つの統合された治療に組み合わせる治療および研究プロセスを本明細書において開示する。これらの実施例に提示されるデータは、これら２つの方法を相乗的に組み合わせて、悪性固形腫瘍を効果的に排除し、腫瘍再発を防ぐことができることを示す。この手法の根底にある３つの重要な概念は、（Ａ）局所ｘＲＴ＋ＩＴ ｍＡｂ／ＩＬ２が既存の１つの腫瘍を根絶し、Ｔ細胞記憶を生成する（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン）；（Ｂ）照射されない限り、遠隔腫瘍が付随する免疫寛容を引き起こし、ｉｎ ｓｉｔｕワクチンの有効性を妨げる；および（Ｃ）全身ＲＴとは異なり、ＴＲＴは重度の全身性のＲＴによる免疫抑制を伴わずに、すべての腫瘍に局在することができる、である。これらの概念は、本発明者らのデータとともに、対象の原発性腫瘍に対するｘＲＴ＋ＩＴ ｍＡｂ／ＩＬ２と、転移に起因する寛容性を排除するためのＴＲＴは、すべての悪性固形腫瘍に基づく癌（原発部位および転移部位）を根絶するために効果的なｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を可能にするという結論をもたらす。

実施例１では、本発明者らは、本方法の裏付けとしてＢ７８ ＧＤ２＋モデルから得たバックグラウンドデータを提示する。

実施例２では、本発明者らは、原発性腫瘍に対する最適なｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果に必要なｘＲＴの用量、および付随する免疫寛容を防ぐために必要な遠隔腫瘍に対するｘＲＴの最小用量を決定するためのガイダンスを提供する。

実施例３では、本発明者らは、実施例２で決定されるように、転移に対するｘＲＴの必要な投薬に近づく、^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の投薬を決定し、その後、^１３１Ｉ－ＮＭ４０４用量のインビボ免疫機能への効果を評価するためのガイダンスを提供する。そのようなガイダンスは、開示される放射性リン脂質金属キレート化合物をＴＲＴ剤として使用する場合に同様に適用され得る。

実施例４では、本発明者らは、実施例２および３から得たデータを使用して、２以上の腫瘍を有するマウスにおいて、局所的に治療された腫瘍を破壊し、すべての遠隔腫瘍のＴ細胞媒介性根絶を誘導するための、^１３１Ｉ－ＮＭ４０４＋局所ｘＲＴ＋ＩＴ－ｍＡｂ／ＩＬ２の投与計画を設計／試験／開発するためのガイダンスを提供する。ＴＲＴおよびｘＲＴの用量および時間の重大な問題は、抗腫瘍効果のために最適化されている。この場合もやはり、そのようなガイダンスは、開示される放射性リン脂質金属キレート化合物をＴＲＴ剤として使用する場合に同様に適用され得る。

実施例５では、本発明者らは、放射性金属同位体をキレート化している類似化合物の合成にも用途を見出す、例となる合成を提供する。

実施例６では、本発明者らは、ＮＭ４０４（Ｇｄ－ＮＭ６００）のヨウ素部分の代わりに用いられるキレート剤およびキレート化された金属を有する類似体が、固形腫瘍組織に取り込まれ（そして固形腫瘍内で画像化され得）、したがって開示される金属キレートをＴＲＴ剤として使用する概念の証明を提供することを示す。

実施例７、８、９および１０では、本発明者らは、実施例１～４のガイダンスに従って実施された実証研究から得た情報および具体的なデータを提供する。

実施例１１および１２では、本発明者らは、ＮＭ４０４のヨウ素部分の代わりに用いられるキレート剤およびキレート化された金属を有するさらなる類似体が、インビボモデルにおいてさまざまな固形腫瘍に取り込まれ、固形腫瘍内で画像化され得、さまざまな固形腫瘍におけるＴＲＴに治療的に使用され得、したがって開示される方法においてＴＲＴ剤として開示される金属キレートを使用するための概念のさらなる証明を提供することを示す。

実施例１３では、本発明者らは、どのように線量測定を既知の放射線感受性と組み合わせて使用すれば、当業者が任意の固形腫瘍の処置投薬量を最適化することができるかを考察する。

実施例１４では、本発明者らは、実施例１～４および７～１０に例示されるヨウ素化化合物ではなく、開示される方法においてアルキルホスホコリン金属キレートを使用することの違いおよび利点を考察する。

実施例１：バックグラウンドを裏付けるデータ
Ｓｏｎｄｅｌ研究室は、腫瘍特異的ｍＡｂ＋ＩＬ２が自然免疫細胞を活性化させてマウスにおいてＡＤＣＣを媒介し［２］、神経芽腫をもつ小児にとって臨床的に有益である［３］ことを示した。マウスにおいて、ｈｕ１４．１８－ＩＬ２のＩＶ投与は、抗ＧＤ２ ｍＡｂ＋ＩＬ２のＩＶ投与よりも強力であった［２、１０］。これは、ごく小さい、最近確立されたＧＤ２＋腫瘍またはごく小さい顕微鏡レベルの転移に対して劇的な抗腫瘍効果を提供することができ、寛解状態であるが再発の危険性が高い患者におけるこの手法の臨床使用を潜在的に説明する［３］。測定可能な肉眼的腫瘍［すなわち、約５０ｍｍ^３のＧＤ２＋腫瘍］に対するより強力な抗腫瘍効果は、ＩＣがＩＶよりもむしろ腫瘍内注射された（ＩＴ－ＩＣ）場合に実現され得る［４、５］。

本発明者らはこれから、はるかに大きい肉眼的腫瘍の状況で利益をもたらす方法に注目する。５週間前に確立された、中程度の大きさ（２００ｍｍ^３）のＢ７８黒色腫腫瘍を有するマウスは、ＩＶ－ＩＣに対して応答を示さず、ＩＴ－ＩＣによってその増殖が遅くされているが、腫瘍は増殖を続ける。これらの同じ２００ｍｍ^３腫瘍も、１２ＧｙのｘＲＴの後に増殖する。対照的に、ＩＴ－ＩＣおよびｘＲＴを併用すると、７３％の動物の腫瘍がなくなり、その疾患が治癒したように見える（図２Ａおよび２Ｂ）。次に、これらのマウスは、同じ腫瘍による再負荷のＴ細胞媒介性拒絶を示す（図２Ｃ）。したがってＩＴ－ＩＣ＋ｘＲＴは相乗作用を示し、腫瘍が「ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍ワクチン」になることを誘導する［６］。

臨床転移をシミュレートするために、本発明者らはＢ７８を１日目にマウスの側腹部に、そして２週間目に他方の側腹部に接種する。５週目に、第１の腫瘍は２００ｍｍ^３であり、第２の腫瘍は５０ｍｍ^３である。本発明者らは、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣが第１の腫瘍を破壊し、得られるＴ細胞応答が次に第２の腫瘍を破壊するであろうと予測した。しかし、ＩＴ－ＩＣをｘＲＴに加えても、５０ｍｍ^３腫瘍にも２００ｍｍ^３腫瘍にも実質的に効果がなかった（図３）。これは本発明者らが提供した治療法への重要な制限を示した；つまり、これらのマウスがｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣを第１の腫瘍に受けたときに別の腫瘍が存在する場合、第２の腫瘍は全身性の腫瘍特異的な付随する免疫寛容作用を引き起こし、どちらの腫瘍の縮小も防ぐことになることである。重要なことに、本発明者らは、第１および第２の腫瘍に対する局所ｘＲＴ（１２Ｇｙ）が同時にこの寛容作用を抑止し、大部分のマウスで両方の腫瘍を根絶する免疫応答を第１の腫瘍に対するＩＴ－ＩＣに誘導させることを見出した（図４）［７］。Ｔｒｅｇ枯渇ｍＡｂ（図示せず）または選択的Ｔｒｅｇ枯渇を可能にするトランスジェニックマウス（図４）［７］を用いる最近のデータは、この免疫寛容が、一部分、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって媒介されることを示す；第１および第２の腫瘍に対するＲＴは、これらのＴｒｅｇを部分的に枯渇させ、両方の腫瘍への照射が寛容作用を回避する方法を潜在的に説明する［７］。

第１および第２の腫瘍の両方に対する局所ｘＲＴは寛容性を回避するが、臨床転移性疾患は多くの場合、数個の部位に存在する。すべての肉眼的転移性疾患は、免疫寛容を阻止し、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣがすべての腫瘍部位を効果的に根絶することを可能にするためにＲＴを受けなければならない。しかし、１２ＧｙのｘＲＴをすべての疾患部位に送達することは、主な用量依存的（致死となり得る）毒性および深刻な全身性免疫抑制を伴う「全身ＲＴ」に近い可能性がある。

以前に、Ｗｅｉｃｈｅｒｔ研究室は、すべての全身性腫瘍部位にＲＴを送達し、同時に正常組織（特に骨髄および免疫組織）に対する「標的外」ＲＴを最小限に抑えるために、ＴＲＴを先駆的に開発した。

腫瘍細胞が過剰なリン脂質エーテル（ＰＬＥ）を含むという知見に基づいて［１１］、本発明者らは、腫瘍を選択的に標的化する類似体を同定することを狙って３０を超える放射性ヨウ素化ＰＬＥ類似体を合成した［１２］。これらのうちの１つである、ＮＭ４０４は、脳転移および癌幹細胞を含む解剖学的部位にかかわらず、調査した７０を超えるインビボモデルの３つを除くすべてにおいてほぼ万能の腫瘍取り込みを示しただけでなく、腫瘍細胞に侵入すると、長期間選択的に保持された［８］。これらのｄｉａｐｅｕｔｉｃ ＰＬＥ類似体は、それらが前悪性病変および炎症性病変を回避するという点で独特である。正常細胞と比較して癌細胞で過剰発現する表面膜脂質ラフトは、ＮＭ４０４を含むＰＬＥの癌および癌幹細胞への侵入の入り口として役立つ［８］。放射性ヨウ素化ＮＭ４０４（Ｉ－１２４およびＩ－１３１）は、今回５回の第１相および第２相ＰＥＴイメージング試験および３回の第１相ＴＲＴ放射線療法試験においてそれぞれ評価され、１ダースを超えるヒト癌種において同様の腫瘍取り込みおよび保持特性を示す［８］。これらの例に関連する癌モデル（Ｂ７８ ＧＤ２＋マウス黒色腫）での優れた腫瘍取り込みは、^１２４Ｉ－ＮＭ４０４ ＰＥＴイメージングで確認された（図５）。

実施例２：ｘＲＴの投与量の決定
本発明者らのデータはこれらの４つの仮説を示唆する：（１）１つの腫瘍を治療するために使用したｘＲＴの用量は、適度の直接インビボ腫瘍死を引き起こし、免疫に媒介される死（ＡＤＣＣとＴ細胞の両方による）に対する感受性を増大させる；（２）ＩＴ ｍＡｂでなくＩＴ－ＩＣの添加によってもたらされる強いＴ細胞応答は、ＩＬ２の存在下で照射を受けた腫瘍細胞と結合するｍＡｂが、抗原提示および適応免疫の誘導の増強を促進することを示唆する；（３）第２の腫瘍が存在すると、第２の腫瘍に存在する免疫抑制細胞［例えばＴｒｅｇおよびおそらく骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）など］の全身作用によって主に引き起こされる寛容性のために、第１の腫瘍へのｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣが実質的にどんな抗腫瘍効果も引き起こさない；この寛容性は、Ｔｒｅｇの枯渇（図４）または第２の腫瘍への照射（図３）によって回避することができる；（４）寛容性を回避するために第２の腫瘍で必要なＲＴの用量は、第１の腫瘍が「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」となるために必要なｘＲＴ用量よりもはるかに低いかもしれない［１４］。

原発性（「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」）腫瘍部位のｘＲＴ用量の最適化

ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの本発明者らのインビボ研究は、第１の腫瘍に対する１用量の１２Ｇｙに注目してきた。これは、本発明者らのｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣのｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果が、機能的Ｆａｓ－Ｌを有するマウスを必要とすることを実証するインビボデータと組み合わせた、インビトロＲＴがＢ７８腫瘍細胞でＦａｓの用量依存性の機能アップレギュレーション（＞１２Ｇｙのピーク付近）を誘導することを示す本発明者らのデータに基づく（６）。本発明者らは１２Ｇｙの用量を選択する前にインビボ予備研究を実施した。それは高用量（１６Ｇｙ）または分割を増加した側腹部ＲＴが毒性（皮膚炎、潰瘍、および後肢浮腫）を有することを示し、腫瘍応答の改善は示さなかった。本発明者らは、インビボ研究に１２Ｇｙの１回照射（ｓｉｎｇｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）のｘＲＴを選択したが、本発明者らが臨床解釈へと進む時に、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を安全かつ効果的に誘導するために、局所ｘＲＴ効果の機構およびその用量条件をより良く理解することが有益であろう。

本発明者らのマウスデータ（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）は、たとえ１２ＧｙのｘＲＴ単独では腫瘍の縮小が引き起こされないとしても、１２ＧｙのｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣで強力なワクチン効果を誘導することができることを示す；それは進行性の成長を遅らせるだけである。本発明者らは、より低い用量のＲＴを用いるｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を同じように強力であると考えるかもしれないと考えられた。これを試験するために、本発明者らは、約２００ｍｍ^３のＢ７８腫瘍を有するマウスにおいて一連のｘＲＴ用量（４～１６Ｇｙ）を１回照射として、それに続いて本発明者らの標準的なＩＴ－ＩＣ投与計画（６～１０日目に５０ｍｃｇ／日）によって評価する。本発明者らは、ＩＴ－ＩＣと併用した場合に、どのｘＲＴ用量が最適な腫瘍根絶およびＴ細胞記憶をもたらすかを決定する。１２Ｇｙ未満の用量がより毒性が少なく、匹敵する有効性を示す場合、そのようなより低い用量は、実施例３および４の「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」部位への本発明者らのｘＲＴ用量のより良い標的となるであろう。同様の手法を用いて特定の標的または対象に対する投薬を最適化してもよい。

寛容性が「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種」を阻止することを防ぐための遠隔腫瘍でのｘＲＴ用量の最適化。

第１の腫瘍と第２の腫瘍の両方を１２Ｇｙで治療することにより（図３）、第１の腫瘍へのＩＴ－ＩＣが、両方の腫瘍を根絶する強力な応答を誘導することが可能になる。本発明者らの目的は、寛容性を回避するために転移部位で必要な最小ＲＴ用量を使用しながら、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣを１つの腫瘍に提供することによってこの同じｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果の達成を可能にすることである。本発明者らは、ｘＲＴ自体が、特に広まっている場合には、骨髄／免疫抑制性になり得ることを認識している。そのため、本発明者らは実施例３および４でＴＲＴを追跡している。たとえ標的化されているとしても、ＴＲＴはＲＴのいくらかの全身送達を行っている。ＴＲＴからの全身性免疫抑制を最小にするために、本発明者らは、全身性ＲＴ誘導性の全体的な免疫抑制を引き起こさずに、腫瘍誘導性免疫寛容を効果的に抑制するのに必要な限り低い用量のＴＲＴを投与することを望んでいる。そのため、第１の腫瘍へのＩＴ－ＩＣと併用した場合に、第１の腫瘍へのより高いｘＲＴ用量が、ｉｎ ｓｉｔｕワクチンとして機能することを可能にするために、遠隔腫瘍に送達するために必要な最小用量のｘＲＴを選択することが最善である。

例となる最適化実験として、２００ｍｍ^３の第１のＢ７８腫瘍（ｔｕｍｏｔ）および約５０ｍｍ^３の第２のＢ７８腫瘍を有するマウスは、０日目（第１のＢ７８腫瘍の移植の約５週間後）に１２ＧｙのｘＲＴを第１の腫瘍に投与される。これに続いて、６～１０日目に本発明者らの標準的なＩＴ－ＩＣの投与計画が行われる。別々の群のマウスには、さまざまな用量のｘＲＴが第２の腫瘍に投与される。３Ｇｙの全身ｘＲＴが骨髄腫モデルにおいて免疫抑制作用を防ぐことができることを示すＢ．Ｊｏｈｎｓｏｎの研究室のデータに基づいて（１５）、本発明者らは、０、１、５および８Ｇｙの用量を（現在効果的であると分かっている１２Ｇｙ量に加えて）評価する。第２の腫瘍に対して実質的に１２Ｇｙ未満の用量でも、免疫寛容を排除する上で十分な１２Ｇｙの用量と同じくらい効果的であるかどうかが分かるであろう。

本発明者らが有益な効果を失うｘＲＴの限界用量を選択したら、限界用量をより良好に最適化するために次の分析を実行する。例えば、５Ｇｙが１２Ｇｙと同程度に効果的であるが、１Ｇｙが０Ｇｙとあまり変わらない場合は、本発明者らは、１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣを第１の腫瘍に投与されるこの２つの腫瘍モデルで２、３、および４Ｇｙを比較して、寛容性を排除して効力を得るために必要な限界最低有効ＲＴ用量を特定する。

次に、反復研究を行って、第１の腫瘍に対する用量が１２Ｇｙの用量でなく１腫瘍モデルでの最小有効量（上の実施例２で試験済み）である場合に、第２の腫瘍へのこの最小有効量が有効なｉｎ ｓｉｔｕワクチンをなお可能にするかを確かめる。要するに、実施例２の研究は、本発明者らが１２Ｇｙで両方に対して実証した有効性を失うことなく、第１および第２の腫瘍の最小ｘＲＴ用量を最適化する。

Ｂ７８以外の腫瘍を有するマウスにおける第１および第２の腫瘍への必要なｘＲＴ用量の研究の開始。

本発明者らのマウス研究によってより多くの臨床一般化可能性が提案されるようにするために、ＧＤ２＋腫瘍の追加のモデルでＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの分析を開始する。本発明者らは、ＧＤ２＋ＮＸＳ２神経芽細胞腫を有するＡＪマウスにおけるｈｕ１４．１８－ＩＬ２ ＩＣを伴うＩＴ－ＩＣについて発表した［５］。また、本発明者らは、ＧＤ２＋９４６４Ｄ－ＧＤ２神経芽細胞腫、および、ＧＤ２シンターゼの遺伝子の挿入によってＧＤ２を発現するＰａｎｃ０２－ＧＤ２膵臓癌を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてこの同じＩＣでのＩＴ－ＩＣを評価している。実施例２に関して、各モデルについて本発明者らは、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を保持するために原発性腫瘍および二次性腫瘍に必要な最小有効ｘＲＴ用量を決定する。

実施例３：
^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の投与量の決定および免疫機能への効果の評価
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＴＲＴによる線量測定およびＴＲＴからの免疫抑制。
^１３１Ｉ－ＮＭ４０４は、＞９５％の腫瘍株（ヒトおよびマウス）においてインビトロで選択的な取り込みを示し、非悪性細胞による取り込みは少なく、インビボでも同様の腫瘍特異性が見られる。これには、Ｂ７８腫瘍によるインビボでの選択的取り込みが含まれる（図５）。予備的線量測定研究では、本発明者らは^１２４Ｉ－ＮＭ４０４をＣ５７ＢＬ／６マウスに投与し、連続ＰＥＴ／ＣＴイメージングによって（図５のように）ＴＲＴ曝露の経時的推移を特徴付けた。この研究に基づくモンテカルロ線量測定計算［１６－１８］により、４週間の崩壊期間にわたって確立されたＢ７８腫瘍に約３Ｇｙを送達するために、約６０μＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が必要であることが示された。その４週間後、Ｂ７８腫瘍への残りのＴＲＴ用量は、０．２５Ｇｙ未満となることになる。本発明者らは、ｘＲＴを用いて２腫瘍モデルで得たデータを複製する（図３）が、遠隔疾患のすべての部位の腫瘍に誘導される寛容性を効果的に排除することを可能にする、あり得る最小用量の標的化された^１３１Ｉ－ＮＭ４０４ ＴＲＴを使用する。しかし、数分ですべての線量を送達し、その後行われるｘＲＴとは違って、ＴＲＴは、標的化された同位体の生物学的半減期と物理的半減期の両方（^１３１Ｉについて８日ｔ１／２）に応じて、経時的に用量を蓄積させる。本発明者らは、免疫寛容を根絶するために遠隔腫瘍部位に初期ＴＲＴ効果を求める；しかし、本発明者らは、ＩＴ－ＩＣを投与してＡＤＣＣおよびｉｎ ｓｉｔｕワクチン抗腫瘍効果を誘導すると免疫抑制ＴＲＴ効果が最小であることを求める。これはすべての部位で完全に腫瘍を破壊するために必要不可欠である。

予備データから線量測定計算を用いて、本発明者らは３μＣｉの用量の^１３１Ｉ－ＮＭ４０４は、約０．２Ｇｙに相当する量を腫瘍部位に送達するはずであると推定した。本発明者らが仮定した用量は免疫抑制性であるべきでなく、リンパ球に媒介される腫瘍破壊を妨げるべきでない。上記のように、これは６０μＣｉの初期^１３１Ｉ－ＮＭ４０４用量の２８日後になってもまだ送達されていないと本発明者らが推定した用量である。このようにして、本発明者らは単一の２００ｍｍ^３のＢ７８腫瘍を有するマウスの群を評価した。０日目に、すべてのマウスに１２ＧｙのｘＲＴをその腫瘍に投与し、６～１０日目に、すべてのマウスに５０ｍｃｇ／日のＩＴ－ＩＣを投与した。１つの群には０日目に３μＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４も投与した（約０．２Ｇｙ）。図６は、^１３１Ｉ－ＮＭ４０４を投与された群が、^１３１Ｉ－ＮＭ４０４を投与されていない群と同程度の腫瘍根絶を示したことを示し、腫瘍のこの低用量の「残留」ＴＲＴが、ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣ ｉｎ ｓｉｔｕワクチンによる免疫媒介性破壊を阻止しないことを実証する。したがって、本発明者らは、２２日目に６０μＣｉの初期用量の^１３１Ｉ－ＮＭ４０４ ＴＲＴを使用すると、それは遠隔腫瘍の免疫寛容原性作用を効果的に阻止し、さらに第１の腫瘍に対する０日目のｘＲＴ、および６～１０日目（ＴＲＴの２８日後）のＩＴ－ＩＣをｉｎ ｓｉｔｕワクチンとして機能させ、その後すべての腫瘍を根絶する適応応答を誘導すると仮定する。

この実施例に概説した実験は、図６で試験された用量相関を最適化する。本発明者らの１腫瘍Ｂ７８モデルにおいて、本発明者らは、^１３１Ｉ－ＮＭ４０４ ＴＲＴの用量範囲を試験して、望ましいｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を妨げる（そしてそれによって第１の腫瘍の根絶を遅らせるかまたは防ぐ）のに十分な望ましくない全身性免疫抑制をもたらす、最良のＴＲＴ用量を選択する。これは、実施例４にとって重要である、それは遠隔疾患を有するマウスにおいて第１の腫瘍へのＩＴ－ＩＣを開始した時点で、ＴＲＴの残留放射能がこの値よりも小さく減衰したことを確認することができるためである。本発明者らはまた、さまざまなＴＲＴ用量後のＴＲＴ応答の速度を評価して、「寛容性を妨げるＴＲＴ用量」を複数の腫瘍を有する動物に投与した後に、第１の腫瘍のＲＴ＋ＩＴ－ＩＣ治療がなおｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を誘導し、原発性腫瘍ならびに遠隔腫瘍を根絶させるために、待つべき時間の長さの最適な期間を選択する。

関連研究は、単剤治療として投与されるＴＲＴのどの用量が、単一のＢ７８腫瘍の緩徐化、縮小、根絶に対して最も有益であるかについても注目する。腫瘍誘導性免疫寛容を排除するために最も有益なＴＲＴの用量は、（ＴＲＴ単独から）完全な腫瘍破壊を実際に誘導するために必要なＴＲＴ用量よりも実質的に少ないであろう。

最後に、さまざまな最適化された用量のＴＲＴの効果が１腫瘍モデルで決定されれば、本発明者らはこれらの対象の血清をＩＣのヒトＩｇＧ成分に対する免疫応答について評価することによって、ＴＲＴのわずかな免疫抑制効果を評価する。本発明者らは、免疫適格マウスがこれらのヒト化ＩＣでの処置の後に容易に定量されるレベルのマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）を生成することを示した（１９）。本発明者らが見ているどんな用量でＴＲＴがマウス免疫応答の強度の検出可能な用量依存性減少を引き起こすかを決定する手段として本発明者らはこれを使用し、これらのマウスがこのＴＲＴから受け取る全身用量のＲＴからの全体的な免疫抑制効果を計測する。本発明者らが腫瘍誘導性免疫寛容を阻止するために必要とする低いＴＲＴ用量は、最小の全身性免疫抑制を引き起こすであろう。

実施例４：２以上の腫瘍を有するマウスにおける^１３１Ｉ－ＮＭ４０４＋局所ｘＲＴ＋ＩＴ－ｍＡｂ／ＩＬ２の最適な投与計画の開発
２腫瘍Ｂ７８モデルにおけるＴＲＴ＋ＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの有効性の試験。

実施例２および３で概説した研究から得られた用量およびタイミングの情報は、本発明者らの２腫瘍モデルでの有効性に必要なＴＲＴの投薬およびタイミングを最適化するために必要な情報をもたらす。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ７８を左（Ｌ）および右（Ｒ）側腹部に同時に接種する。各腫瘍は、２週間後に約５０ｍｍ^３、５週間後に約２００ｍｍ^３であるはずである。実施例３の線量測定計算で、３ＧｙのＲＴ（免疫寛容を阻止するため）に近づけるために６０μＣｉのＴＲＴを第２の腫瘍に送達する必要があると本発明者らが考える場合、本発明者らの外部照射ｘＲＴ研究は、この用量が腫瘍増殖に最小限の減速効果を有するはずであると予測している。本発明者らは、２週間の時点で（腫瘍が約５０ｍｍ^３であるとき）、異なる群のマウスを３０、６０または９０μＣｉで処置することを計画するであろう。３週間後、腫瘍は約２００ｍｍ^３になっているはずである；その時点で本発明者らは、ｘＲＴ（実施例２に概説した通り決定した用量）を投与し、続いて６日後（ＴＲＴの約２８日後）にＬ側腹部の腫瘍にＩＴ－ＩＣの注射を毎日５回投与して、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を誘導する。対照マウスには、遠隔腫瘍からの寛容性のためにｉｎ ｓｉｔｕワクチンがないことを見込んで、ＴＲＴを投与せず、ｘＲＴおよびＩＴ－ＩＣだけをＬ側腹部に投与する。別の群には、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果による両方の腫瘍の根絶を見込んで、局所ｘＲＴを両方の腫瘍に、そしてＩＴ－ＩＣをＬ側腹部に投与する。別の群には、不完全なワクチン効果を見込んで、ＴＲＴ＋ＩＴ－ＩＣを投与するが局所ｘＲＴは投与しない。

追跡実験は、さまざまな用量のＴＲＴおよびＴＲＴと原発性腫瘍（Ｌ側腹部）への局所ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣとの間のタイミングの変動をさらに評価する。読み出し情報は、（Ａ）原発性腫瘍の根絶；（Ｂ）続発性腫瘍の根絶；および（Ｃ）ＭＡＨＡ応答のＥＬＩＳＡ分析による全身性免疫抑制、となる。本発明者らの目的は、（ＭＡＨＡ応答によって測定される）全身免疫抑制を最小限に抑えながら、大部分の対象において両方の腫瘍を根絶させることのできる局所ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣ投与計画を加えるために、特定の対象および疾患モデルによって最適なＴＲＴ用量およびタイミングを特定することである。

２よりも多いＢ７８腫瘍を有するマウスにおけるＴＲＴ＋ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの最適化。

実施例４のこの項は、関連する臨床状況；つまり、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位として使用することのでき得る注射可能な腫瘍を有するが、各々が腫瘍誘導性免疫寛容を引き起こすことのあり得る複数の遠隔転移を有する患者に最も類似している。これらの研究は、実施例４（上記）の最初の部分で最も効果的であることが見出された条件を再現することになる。重要な違いは、これらの対象の各々がＬおよびＲ側腹部とＬおよびＲ肩甲側部に４つの別々の腫瘍を有することである。ＴＲＴは、実施例４の最初の項で概説した研究で最も効果的であると認められた用量およびタイミングで投与され、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣがその後Ｌ側腹部病変にのみ投与される。ＴＲＴは、ｘＲＴを投与されていない３つの部位によって引き起こされる腫瘍誘導性免疫寛容を効果的に排除するので、ここでの目的は、最も効果的なｉｎ ｓｉｔｕワクチンを可能にするＴＲＴ用量およびタイミングの問題を選択することである。有効性の尺度は、大部分の対象における４つすべての腫瘍の除去である。最も効果的な最適化された投与計画を生成するために、ＴＲＴの用量およびタイミングの変更が試験される。そのような投与計画は、すべてを外部ビームによって照射することはできないが、「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」部位への局所ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣと併用した場合にＴＲＴによって照射されることがあり得る、複数の遠隔転移を有する患者のために、診療所において用途が見出される。

実施例５：金属キレート化ＮＭ６００の合成
この実施例では、本発明者らは、１つの例となるリン脂質キレート、Ｇｄ－ＮＭ６００を合成するために使用される合成スキームを示す。さまざまな放射性同位元素を組み込んでいる類似体を同様の方法で合成することもでき、ここで問題の放射性同位体は、Ｇｄの代わりに用いられる。

Ｇｄ－ＮＭ６００を合成するためのスキーム（開示される放射性金属同位体はＧｄの代わりに使用され得る）：

実施例６：インビボイメージングによる概念実証
この実施例では、本発明者らは、Ｇｄ－ＮＭ６００をＭＲＩ造影剤として使用し、腫瘍のインビボＭＲＩイメージングの成功を実証する。データは、骨格リン脂質およびキレート剤が固形腫瘍によって取り込まれ保持されることを実証し、本明細書に開示される、さまざまな放射性金属を組み込んでいるそのようなキレートが同様の特性を示すことを実証する。

Ｇｄ－ＮＭ４０４剤の腫瘍取り込みの概念実証インビボイメージングのために、側腹部Ａ５４９腫瘍（非小細胞肺癌）異種移植を有する胸腺欠損ヌードマウスをスキャンした。Ｇｄ－ＮＭ６００剤（２．７ｍｇ）は尾静脈注射によって送達された。マウスを麻酔し、造影剤投与の前と、造影剤送達後１、４、２４、４８、および７２時間に走査を実施した。イメージングは、体積直角位相コイルを備えた４．７Ｔ Ｖａｒｉａｎ前臨床ＭＲＩスキャナで行った。以下のパルスシーケンスパラメータ：反復時間（ＴＲ）＝２０６ミリ秒、エコー間隔＝９ミリ秒、エコートレイン長＝２、実効エコー時間（ＴＥ）＝９ミリ秒、平均数１０で、視野４０×４０ｍｍ^２、１９２×１９２マトリックス、厚さ各１ｍｍの１０切片を用いる高速スピンエコースキャンを使用して、すべての撮像時点でＴ１強調画像を取得した。

図７に見られるように、腫瘍のＭＲＩイメージングは、注射後２４時間までに大幅に増強された。

これらの結果は、アルキルホスホコリン類似体の示差的な取り込みおよび保持が、本明細書に開示される金属キレート化された類似体に関して維持されることを実証する。したがって、開示される金属キレートは、臨床治療および画像化用途に容易に適用されることができる。

実施例７：原発性腫瘍に対する最適なｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果に必要なｘＲＴの用量、および付随する免疫寛容を防ぐために必要な遠隔腫瘍に対するｘＲＴの最小用量を決定する実験。
実施例１～４の追跡調査として、１または２の腫瘍を有するマウスに対するさまざまなｘＲＴ用量を評価する用量滴定実験が実施された。第１の目的は、１つの腫瘍を有するマウスにおいて、相乗作用、およびＩＴ－ＩＣ、ＩＬ２と結合した腫瘍反応性ｍＡｂを含む「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」を促進するために必要なｘＲＴの用量を試験することであった。初期実験により、１２ＧｙのＲＴ単独は確立されたＢ７８黒色腫腫瘍を根絶することもその増殖後退させることもなく（完全な退縮は０％）、一方、１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣは１つの腫瘍を有するマウスにおいて大部分のＢ７８腫瘍の完全な退縮をもたらす（６６％）という、本発明者らの以前の知見が確認された。一方、２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣは、ＩＴ－ＩＣ単独と比較して腫瘍の進行を遅らせる（３２日目の平均腫瘍サイズは、それぞれ、４７２ｍｍ^３と１２１４ｍｍ^３）が、どのマウスも無病にならなかった（完全な退縮０％）。

本発明者らの「２腫瘍モデル」では、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣによる１つの「原発性」腫瘍の治療が、治療された原発性腫瘍または未治療の「続発性」腫瘍のいずれの治療にも効果がないことが以前に示された。実際に、この２腫瘍モデルにおいて、第２の腫瘍の存在が、ｘＲＴの後のＩＴ－ＩＣ注射の効力を除去することを本発明者らは観察した。本発明者らはこの現象を「付随する免疫寛容」（ＣＩＴ）と命名し、これが少なくとも一部分、遠隔（非照射）続発性腫瘍の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）から生じ、それが全身を循環し、ｘＲＴ処置／ＩＴ－ＩＣ注射された原発性腫瘍に再び集合することを実証した。原発性腫瘍に戻るこれらのＴｒｅｇは、望ましい「ｉｎ ｓｉｔｕワクチン」効果を妨害すると思われる。

本発明者らは、今回、１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍と続発性腫瘍の両方に送達することによってＣＩＴが克服され得るという本発明者らの以前の知見を確認した。重要なことに、ＴｒｅｇはＲＴに対する感受性がかなり高いと考えて、ＣＩＴを克服し、原発性腫瘍（１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣで処置した原発性腫瘍）でのｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種に対する応答を救済するために、より低用量のＲＴを続発性腫瘍に送達することができると本発明者らは仮定した。本発明者らはここでこれを試験し、続発性腫瘍への２Ｇｙまたは５ＧｙのｘＲＴ用量が、ＣＩＴを鈍らせ、１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣによる原発性腫瘍処置に対する応答を救済する能力では１２Ｇｙに匹敵することを観察した。これらの重要な実験は、二回繰り返され、（仮定したように）ＣＩＴを防ぐために遠隔腫瘍に投与されなければならないｘＲＴの用量は、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を生じる目的でＩＴ－ＩＣを注射した原発性腫瘍部位で必要な用量よりもはるかに低いことを示唆する。

これは、本開示中の本発明者らの包括的な仮説を裏付け、本発明者らが複数の腫瘍を有する動物において、標的化された放射線治療薬（ＴＲＴ）ＮＭ６００を使用して比較的低用量のＲＴを疾患のすべての部位に送達することが可能となり、それによって、これを局所ｘＲＴおよび１つの腫瘍部位（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）のＩＴ－ＩＣ注射と併用すると、ＣＩＴを克服することになることを示唆する。

実施例８：上記で決定されたように、転移に対するｘＲＴの必要な投与量に近い^１３１Ｉ－ＮＭ４０４投与量を決定し、次に、その^１３１Ｉ－ＮＭ４０４用量のインビボ免疫機能への効果を評価する実験
実施例１～４の上記の予備データに基づいて、これらの概念をＴＲＴを用いるインビボ試験に移すための研究が行われてきた。線量測定研究は、１または２のＢ７８腫瘍を有するマウス（本発明者らの最良のｉｎ ｓｉｔｕワクチン手法およびＣＩＴのハードルを実証するために本発明者らが使用している腫瘍モデル）で実施した。これは、約２ＧｙのｘＲＴに近づくために必要となる^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の量を推定するために行われた。

次に、約２Ｇｙの等価線量の^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が腫瘍内リンパ球系細胞（特にＴｒｅｇ）に対して望ましい効果を有するかどうかを決定するために、２つの別々の手法が追求されてきた。最初に、本発明者らは、Ｂ７８腫瘍に匹敵するＮＭ４０４取り込みを示す放射線感受性リンパ腫腫瘍を有するマウスにこの用量の^１３１Ｉ－ＮＭ４０４を投与した。これに続いて、本発明者らは、Ｂ７８腫瘍の実質的な縮小／減速も循環リンパ球系細胞の明白な枯渇（末梢全血球数によって計測される通り）も引き起こさない条件下で、強力なリンパ系腫瘍の縮小／用量依存性の抑制を記述した。これらのデータは、リンパ球系細胞が典型的な固形腫瘍細胞よりも低用量のＲＴに対してはるかに敏感であるという事実と一致しており、腫瘍におけるＴＲＴの選択的取り込みが、全身性リンパ球減少症を伴わない腫瘍内リンパ球系細胞枯渇を可能にすることがあることを示唆する。これらの研究はまた、そのようなリンパ系腫瘍が、腫瘍内リンパ球系細胞へのＴＲＴの効果を同定しモニターするためのインビボの生物学的「線量計」として役立ち得ることを示唆する。

第２の手法は、Ｂ７８腫瘍を有するマウスをこれらの同じ用量の^１３１Ｉ－ＮＭ４０４で処置することを伴った。次に、これらの動物を半減期（８日）の間隔で犠牲にし、放射性崩壊のための十分な遅延の後に、免疫組織化学によってエフェクターＴ細胞およびＴｒｅｇの存在について腫瘍を染色した。興味深いことに、この初期実験で^１３１Ｉ－ＮＭ４０４を投与された動物は、どの時点でも全身性リンパ球減少症を示さず（末梢の全血球数による）、ＴＲＴ投与に続く２半減期で腫瘍内ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの減少を示した。この２半減期の時点で、本発明者らは腫瘍内エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の減少も観察した。しかし、重要なことに、その後の３および４半減期の時点で、本発明者らは、どちらも未治療のベースラインおよび第２の半減期レベルと比較して、腫瘍内ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の増加、ただし、腫瘍内Ｔｒｅｇレベルのさらなる低下を観察した。この知見もやはり、複数の腫瘍を有する動物においてｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を救済するために、ＴＲＴを使用してＴｒｅｇに媒介されるＣＩＴを克服することが実現可能であろうという本発明者らの仮説を裏付ける。

最後に、腫瘍内の免疫細胞へのＴＲＴの免疫学的効果を特徴付けるために、本発明者らはＢ７８を有するマウスを^１３１Ｉ－ＮＭ４０４で処置し、前処置およびその後の半減期（８日）の間隔で腫瘍組織を採取した。次に、これらの組織を、免疫シグネチャー（ｉｍｍｕｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）のパネルの遺伝子発現についてＲＴ－ＰＣＲによって分析した。結果は、ＴＲＴ処置が単独で、免疫感受性の腫瘍細胞マーカーの発現と免疫細胞によってのみ通常発現する遺伝子の顕著な変化を引き起こし、後者は発現の減少とそれに続くリバウンドの過剰発現（ｒｅｂｏｕｎｄ ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の明白な経時的推移を示すことを示す。

実施例９：実施例５および６から得たデータを使用して、２以上の腫瘍を有するマウスにおける^１３１Ｉ－ＮＭ４０４＋局所ｘＲＴ＋ＩＴ－ｍＡｂ／ＩＬ２の投与計画を開発し、すべての遠隔腫瘍のＴ細胞媒介性根絶を誘導する実験
この実施例は、少なくとも２つの部位に腫瘍を有する動物を治療することを説明する。本発明者らの戦略は、すべての腫瘍部位で抗腫瘍免疫活性を増強させるために、ＣＩＴを抑制するための全身性ＴＲＴと組み合わせた、ｘＲＴおよびｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位での局所ＩＴ－ＩＣの使用を含む。ＴＲＴおよびｘＲＴの用量およびタイミングの重大な問題は、抗腫瘍効果のために最適化される。

実施例７および８でまとめたデータを用いて、２つの別個のＢ７８腫瘍を有するマウスで研究を行った。マウスに、推定される必要な全身への^１３１Ｉ－ＮＭ４０４用量を投与し、それに続いてｘＲＴおよびｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位への局所免疫療法を投与した。適切な制御によって、^１３１Ｉ－ＮＭ４０４のこの用量は、２つの腫瘍を有するマウスにおいて求められるように、ＣＩＴを弱めると思われた。その上、１つの腫瘍を有するマウスでは、このＴＲＴ用量は、局所ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を（仮定され、望まれたように）妨害するように見えなかった。ｉｎ ｓｉｔｕワクチン効果を抑制することなくＣＩＴを阻止する望ましい作用を最大化しようとして、さらなる試験、および実験変数の一部の修正が行われている。これらの実験に関するさらなる詳細は、下の実施例１０に開示される。

実施例１０：２以上の腫瘍を有するマウスから得られるデータ
マウス黒色腫および膵腫瘍モデルにおける遠隔未処置腫瘍による、局所ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの組合せに対する原発性腫瘍応答の腫瘍特異的抑制。

同系のＧＤ２＋原発性側腹部腫瘍＋／－対側腹部の続発性腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示されるように原発性腫瘍だけに、「１」日目にｘＲＴによって、そして６～１０日目に５０ｍｃｇの抗ＧＤ２ ＩＣ、ｈｕ１４．１８－ＩＬ２のＩＴ注射によって処置した。

原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、未処置の続発性Ｂ７８腫瘍の存在は、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答に拮抗した（図８Ａ）。本発明者らは、この作用を「付随する免疫寛容」－ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する処置腫瘍の局所応答への、未処置遠隔腫瘍の拮抗作用－として説明する。カプラン・マイヤー生存曲線を。これらのマウスと反復実験について得た（図８Ｂ）。ほぼすべてのマウスが原発性腫瘍の進行のために安楽死した。

原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍を有するマウスでは、反対側腹部の続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍の有無にかかわらず、未処置のＰａｎｃ０２続発性腫瘍の存在が、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍の応答を抑制した（図８Ｃ）。原発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｂ７８腫瘍がｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣに対する原発性腫瘍応答を抑制したが、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋膵腫瘍はこの作用を発揮しなかった（図８Ｄ）。原発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２＋腫瘍を有するマウスでは、続発性Ｐａｎｃ０２－ＧＤ２－腫瘍がｘＲＴおよびＩＴ－ｈｕ１４．１８－ＩＬ２の併用に対する原発性腫瘍応答を抑制したが、Ｂ７８続発性腫瘍は抑制しなかった図８Ｅ）。

付随する免疫寛容は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の特異的枯渇によって回避される。

腫瘍を１または２個有するマウスにおいてｘＲＴ後６日目に調べた腫瘍の、Ｔｒｅｇマーカー、ＦｏｘＰ３についての免疫組織化学画像を得た（図９Ａ）。マウスはｘＲＴを受けなかったか、または原発性腫瘍に対してのみｘＲＴを受けた。ＤＥＲＥＧマウスは、Ｔｒｅｇ特異的ＦｏｘＰ３プロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体を発現し、ジフテリア毒素のＩＰ注射と同時にＴｒｅｇの特異的枯渇を可能にする（図９Ｂおよび９Ｃ）。原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するＤＥＲＥＧマウスを、原発性腫瘍へのｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣと、ジフテリア毒素またはＰＢＳのいずれかのＩＰ注射で処置した。付随する免疫寛容は、これらのマウスにおいてＴｒｅｇの枯渇の後に排除され、原発性（図９Ｂ）および続発性（図９Ｃ）腫瘍応答の改善をもたらす。

付随する免疫寛容は、ｘＲＴを両方の腫瘍部位に送達することによって克服される。

原発性および続発性Ｂ７８腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍は、ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣによる原発性腫瘍処置に対する原発性腫瘍応答を抑制する。これは、１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍と続発性腫瘍の両方に、そしてＩＴ－ＩＣを原発性腫瘍に送達することによって克服され、その結果改善された原発性腫瘍応答（図１０Ａ）および反復実験からの総動物生存率（ａｇｇｒｅｇａｔｅ ａｎｉｍａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）（図１０Ｂ）が改善される。

低用量のｘＲＴは、単独ではｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発しないが、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位の１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣ処置とともに遠隔腫瘍部位に送達した場合に、付随する免疫寛容を実際に克服する。

原発性Ｂ７８腫瘍のみを有するマウスでは、１２Ｇｙ＋ＩＴ－ＩＣは、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を誘発し（すでに示した通り）、大部分のマウスにおける完全な腫瘍退縮（図１１Ａ）および記憶性免疫応答をもたらす（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１６）。一方、ＩＴ－ＩＣ単独または低用量（２Ｇｙ）ｘＲＴ＋ＩＴ－ＩＣの後に完全な腫瘍退縮を示す動物はない（両方の群で０／６）ｐ＜０．０５。

原発性および続発性Ｂ７８黒色腫腫瘍を有するマウスでは、続発性腫瘍に送達された低用量ｘＲＴ（２Ｇｙまたは５Ｇｙ）は、原発性腫瘍で付随する免疫寛容を克服するその能力では１２Ｇｙに匹敵する（図１１Ｂ）。これらの同じ動物において、低用量ｘＲＴを続発性腫瘍に送達することによって付随する免疫寛容を克服することが、ＩＴ－ＩＣ免疫療法に対する全身応答を救済することは明らかである（図１１Ｃ）。これに関連して、ＲＴがすべての腫瘍部位に送達されると、原発性腫瘍のＩＴ－ＩＣ注射は、全身性抗腫瘍効果を引き起こし、２Ｇｙまたは５Ｇｙに対する続発性腫瘍応答を、原発性腫瘍のＩＴ－ＩＣ注射を行わない場合の１２ＧｙのＲＴに対する応答よりも大きくする。

低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ－ＮＭ４０４は、全身性白血球減少症を伴わないかまたは腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を枯渇させずに、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを効果的に枯渇させる。

大部分の臨床シナリオでは、免疫抑制をもたらすことになる顕著な骨髄枯渇および白血球減少を引き起こすことなく、低用量でさえもすべての腫瘍部位に外照射を送達することは実現不可能である。ここで、本発明者らは、ＴＲＴを全身投与して、全身の免疫細胞の枯渇および白血球減少症を引き起こすことなく、腫瘍浸潤抑制性免疫細胞（Ｔｒｅｇ）を特異的に枯渇させることができるかどうかを試験した。このＢ７８黒色腫腫瘍モデルにおける線量測定研究は、ポジトロン放出^１２４Ｉ－ＮＭ４０４を用いて実施して、ＮＭ４０４の腫瘍選択的取り込みを確認した（図１２Ａ）。Ｂ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、６０μＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４で処置した。この活性は、約２ＧｙのＴＲＴをＢ７８腫瘍に送達するのに必要な^１３１Ｉ－ＮＭ４０４の量に近づく。末梢血および腫瘍試料を未処置の対照マウス（Ｃ）およびその後８日間隔（Ｔ１＝ｄ８、Ｔ２＝ｄ１６、Ｔ３＝ｄ２４、Ｔ４＝ｄ３２）で収集した。この用量のＴＲＴは有意な全身性白血球減少症をもたらさず（図１２Ｂ）、腫瘍浸潤ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞のレベルに有意な影響を及ぼさなかった（図１２Ｃ）。しかし、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、この用量のＴＲＴによって有意に枯渇した（図１２Ｄ）。

低用量ＴＲＴと^１３１Ｉ－ＮＭ４０４は、付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済する。

低用量^１３１Ｉ－ＮＭ４０４ ＴＲＴが、マウスを白血球減少症にすることなく腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを枯渇させる能力を考慮に入れて、本発明者らは低用量^１３１Ｉ－ＮＭ４０４が付随する免疫寛容を効果的に克服するかどうかについて試験した。２つのＢ７８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、示したように１日目に６０μＣｉの^１３１Ｉ－ＮＭ４０４で処置した（ＮＭ４０４）。１半減期（８日）後、動物に１２ＧｙのｘＲＴを原発性腫瘍（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）に投与したか、またはｘＲＴを投与しなかった。^１３１Ｉ－ＮＭ４０４を投与しなかった対照マウスに、示されるような（０、２、または１２Ｇｙ）処置を続発性腫瘍に対して行った。１３～１７日目に、マウスに毎日ＩＣのＩＴ注射を示されるように原発性腫瘍（ｉｎ ｓｉｔｕワクチン部位）に投与した。原発性腫瘍（図１３Ａ）および続発性腫瘍（図１３Ｂ）応答は、低用量ＴＲＴの投与が付随する免疫寛容を効果的に克服し、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種の全身性抗腫瘍効果を救済することを実証する。
実施例１～４および７～１０で引用された参考文献：
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［１６］Ｂｅｄｎａｒｚ Ｂ．，Ｂｅｓｅｍｅｒ Ａ．，Ｙａｎｇ Ｙ．Ａ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ‐Ｂａｓｅｄ Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｐｒｅ‐Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ：Ｐｒｏｏｆ ｏｆ Ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．３９，３８９９．２０１２．
［１７］Ｂｅｓｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｗａｒｄｓ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉａｐｅｕｔｉｃ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．４０，３８２． ２０１３．
［１８］Ｂｅｓｅｍｅｒ Ａ． ａｎｄ Ｂｅｄｎａｒｚ Ｂ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｔｉｅｎｔ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．４１，３０３．２０１４．
［１９］Ｉｍｂｏｄｅｎ Ｍ，Ｍｕｒｐｈｙ ＫＲ，Ｒａｋｈｍｉｌｅｖｉｃｈ ＡＬ，Ｎｅａｌ ＺＣ，Ｘｉａｎｇ Ｒ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ＲＡ，Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ａｎｄ Ｓｏｎｄｅｌ ＰＭ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｍｕｒｉｎｅ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃａｎ ｃｈａｎｇｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：１５００‐７．２００１．

実施例１１：
ＰＥＴイメージングによって実証される、８つの異なる固形腫瘍型を異種移植したマウスにおける複数のＮＭ６００金属キレートのインビボ取り込み
この実施例では、本発明者らは、４つの異なる金属でキレート化されたＮＭ６００の示差的取り込みをインビボでさまざまな固形腫瘍において、そのような腫瘍のＰＥＴ／ＣＴイメージングによって実証されているように実証する。これらのデータは、本明細書に開示されるように、腫瘍誘導性免疫寛容を排除するためのＴＲＴ剤として金属キレート化されたアルキルホスホコリン類似体を使用するためのさらなる裏付けを提供する。ＮＭ６００の構造は、^６４Ｃｕでキレート化された例示的な種（^６４Ｃｕ－ＮＭ６００）として図１４に示される；しかし、どんな金属もＮＭ６００に容易にキレート化することができる。

具体的には、マウスを８つの異なる固形腫瘍細胞株（Ｂ７８（黒色腫）、Ｕ８７ＭＧ（神経膠芽腫）、４Ｔ１（乳癌）、ＨＣＴ－１１６（結腸直腸癌）、Ａ５４９（肺癌）、ＰＣ－３（前立腺癌）、ＨＴ－２９（結腸直腸腺癌）、またはＭｉａＰａｃａ（膵癌）の１つでそれぞれ異種移植した。異種移植したマウスのそれぞれに対して、腫瘍細胞を含有する細胞懸濁液を、マウスの片方または両方の側腹部の皮下組織に接種した。異種移植腫瘍が最大サイズに達したら、それぞれのマウスに、１５０～３００μＣｉの間の、^６４Ｃｕ、^８９Ｚｒ、^８６Ｙ、または^５２Ｍｎで放射標識されたＮＭ６００を外側尾静脈注射によって注射した。取り込み期間の後、ＰＥＴイメージングをＩｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏ ＰＥＴ／ＣＴで実施した。それぞれのスキャンの直前に、マウスをイソフルラン（２％）で麻酔し、腹臥位でスキャナに置いた。経時的な４０００～８０００万の一致イベントの静的ＰＥＴスキャンを放射性トレーサの注射後３、１２、２４、および４８時間に取得し、ＯＳＥＭ３Ｄ／ＭＡＰ再構築アルゴリズムを用いて画像を再構築した。

図１５は、^８６Ｙ－ＮＭ６００を注射した１腫瘍Ｂ７８マウスの注射後４８時間に得られた画像を示す；図１６は、^８６Ｙ－ＮＭ６００を注射した２腫瘍Ｂ７８マウスの注射後４８時間に得られた画像を示す；図１７は、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００を注射したＵ８７ＭＧマウスの注射後３、２４および４８時間に得られた画像を示す；図１８は、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００を注射した４Ｔ１マウスの注射後３、２４および４８時間に得られた画像を示す；図１９は、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００を注射したＨＣＴ－１１６マウスの注射後３、２４および４８時間に得られた画像を示す；図２０は、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００を注射したＡ５４９マウスの注射後３、２４および４８時間に得られた画像を示す；図２１は、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００を注射したＰＣ－３マウスの注射後３、２４および４８時間に得られた画像を示す；図２２は、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００を注射したＨＴ－２９マウスの注射後３、２４および４８時間に得られた画像を示す；図２３は、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００を注射したＭｉａＰａｃａマウスの注射後３、２４および４８時間に得られた画像を示す；図２４は、^８６Ｙ－ＮＭ６００を注射した４Ｔ１マウスの注射後３、２４および４８時間に得られた画像を示す；図２５は、^８９Ｚｒ－ＮＭ６００を注射した４Ｔ１マウスの注射後３、２４および４８時間に得られた画像を示す。

^５２Ｍｎ－ＮＭ６００を注射したＨＴ－２９およびＰＣ３マウスについて、ＰＥＴ画像は注射後４時間、および１日目（ＨＴ－２９に関して図２６；ＰＣ３に関して図２７）、ならびに注射後２、３、５および７日目に取得した（ＨＴ－２９に関して図２８；ＰＣ－３に関して図２９）。

図１５～２９に見られるように、スキャンされたマウスは、異種移植した腫瘍に集中した累積吸収線量分布を示す、ＰＥＴ／ＣＴ三次元ボリュームレンダリングを生成した。これらの結果により、金属キレート化されたＮＭ６００の異種移植した固形腫瘍組織への示差的取り込みが確認され、開示される治療方法において放射性金属同位体を組み込んでいるＮＭ６００類似体の使用可能性が実証される。

画像の定量的関心領域分析を、目的の腫瘍およびその他の器官の輪郭を手で描くことによって実施した。定量的データは、組織１ｇ当たりの注入量の百分率（％ＩＤ／ｇ）として表した。例示的なデータは、４Ｔ１腫瘍組織が、時間とともにその取り込みを増加させ、試験した３つすべてのＮＭ６００キレートを効果的に保持したが（^８６Ｙ－ＮＭ６００、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００および^８９Ｚｒ－ＮＭ６００、図３０参照）、健常な心臓（図３１）、肝臓（図３２）および全身組織（図３３）はすべて時間とともに取り込み／保持の大幅な低下を示したことを示す。

エクスビボでの体内分布分析を、最後の経時的ＰＥＴスキャンの後に実施した。マウスを麻酔し、組織を回収し、湿重量を測定し、自動ガンマカウンターで計数した（Ｗｉｚａｒｄ ２４８０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。例示的体内分布データは、腫瘍組織（４Ｔ１）における有意な取り込みおよび保持を異なるＮＭ－６００キレートについて示す（^８６Ｙ－ＮＭ６００、^６４Ｃｕ－ＮＭ６００、^８９Ｚｒ－ＮＭ６００および^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００、図３４参照）。

総合して、これらの結果は、開示される金属キレートが、開示される治療方法のＴＲＴステップに容易に使用され得ることを実証する。

実施例１２：
異種移植したマウスにおける複数の固形腫瘍型に対する２つの異なるＮＭ６００金属キレートによる抗腫瘍活性および腫瘍オートラジオグラフィーの実証
この実施例では、３つの異なる固形腫瘍モデルを使用し、アルキルホスホコリン金属キレート類似体が従来のＴＲＴを促進するために効果的に使用され得ることを本発明者らは示す。これらの結果は、金属キレートをここに開示される治療方法のＴＲＴステップで使用する可能性をさらに実証する。

Ｂ７８、ＭｉａＰａｃａおよび４Ｔ１の皮下側腹部異種移植を、前述のようにマウスに導入した。その後に、マウスに治療用量（２５０～５００μＣｉ）の^９０Ｙ－ＮＭ６００、^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００、または対照溶液を外側尾静脈注射によって投与した。

薬剤の体内分布の平面２Ｄ蛍光体画像を、サイクロンホスホイメージャー（Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて撮像した。マウスを麻酔し、蛍光体プレートに仰臥位で直接接触させて置き、そこでマウスを１５～３０分の間そのままにし；その後、プレートをホスホイメージャーで読み取った。放射線量の注射後４時間～９６時間の間にさまざまな画像を記録した。得られるオートラジオグラフィー画像は、試験した固形腫瘍組織型のすべてにおいてキレートの迅速かつ選択的な取り込みおよび長期保持を実証する（図４０、４１、４２、４３、４４および４５参照）。

腫瘍応答を、治療マウスと対照マウスの腫瘍増殖を比較することにより評価した。腫瘍体積は、ノギスで腫瘍の長さおよび幅を測定し、楕円体の体積を求める式を用いて体積を計算することによって決定した。マウス体重も記録した。人道的エンドポイントを：腫瘍体積＞２５００ｍ^３または１３ｇ未満の有意な体重減少、と定義した。

図４６、４７、４８、４９、５０および５１に見られるように、これらの結果は、２つの試験したＮＭ６００キレートが、対照と比較した場合に統計学的に有意なインビボ治療効果を有しており、その結果、４Ｔ１異種移植片において２倍用量の^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００について平均腫瘍体積が減少し（図５０参照）、単一用量の^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００を投与したＭｉａＰａｃａ、４Ｔ１またはＢ７８異種移植片（図４７、４８、および４９参照）あるいは単一用量の^９０Ｙ－ＮＭ６００を投与したＢ７８または４Ｔ１異種移植片（図４６および５１参照）の増殖をゼロ近くまで低下させるかまたはその増殖速度を遅くすることを実証する。

これらの結果は、さまざまな種類の固形腫を効率的に治療するためにＴＲＴを送達するために、開示されるアルキルホスホコリン（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｏｃｈｏｌｉｎｅ）金属キレートを使用する有効性をさらに実証する。

実施例１３：
広範囲の固形腫瘍型におけるＴＲＴ応答を予測するための放射線線量測定と放射線感受性指数の結合
この実施例では、本発明者らはさまざまな固形腫瘍型において開示される方法のＴＲＴステップに適切なキレート用量を決定するための要因を考察する。

腫瘍吸収線量の推定

投与される^１７７Ｌｕ／^９０Ｙ－ＮＭ６００の量が免疫刺激性であるかまたは細胞毒性であるかは、腫瘍吸収線量によって決まる。^６４Ｃｕ／^８６Ｙ－ＮＭ６００を治療用金属^１７７Ｌｕ／^９０Ｙ－ＮＭ６００のイメージングの代用としてそれぞれ使用することができる、ＮＭ６００のｄｉａｐｅｕｔｉｃ特性を活用して腫瘍線量測定を推定した。最後に、^６４Ｃｕ／^８６Ｙ－ＮＭ６００のＰＥＴ／ＣＴを用いてインビボでの体内分布を定量的に測定し、線量を制限する器官および^１７７Ｌｕ／^９０Ｙ－ＮＭ６００ ＴＲＴの潜在的腫瘍有効性を特定するのに役立ち得る放射線線量測定を推定した。

一般的な概念は次の通りである：（１）腫瘍内の^６４Ｃｕ／^８６Ｙ－ＮＭ６００の濃度を、長期ＰＥＴ／ＣＴイメージングを用いて経時的に定量化する、（２）^６４Ｃｕ／^８６Ｙ－ＮＭ６００の濃度を減衰補正して^６４Ｃｕ／^８６Ｙ－ＮＭ６００と^１７７Ｌｕ／^９０Ｙ－ＮＭ６００の間の減衰率の違いを説明する、（３）腫瘍内の^１７７Ｌｕ／^９０Ｙ－ＮＭ６００の濃度を時間積分して累積放射能か、または減衰の総数を算出する、（４）放射性核種崩壊の堆積を腫瘍内でモデル化し、定量化する。

ステップ（１）から（３）は、医用画像処理ソフトウェアパッケージで実施することができるが、ステップ（４）には高性能な放射線線量測定ソフトウェアが必要である。ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭ（Ｓｔａｂｉｎ， Ｓｐａｒｋｓ ａｎｄ Ｃｒｏｗｅ ２００５）は、米国核医学会の医療内部被曝線量（ＭＩＲＤ）委員会によって開発された形式を使用する、５１０（ｋ）が承認された線量測定推定ソフトウェアである（Ｂｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ．、２００９）。ＭＩＲＤの手法は、器官自体の内部からまたは別のソース器官から放出される放射線に起因する、組織または器官が受け取った平均吸収線量を推定する。ＭＩＲＤの式の最も簡単な形である、

は、ソース領域内の放射性核種放射能ｓから標的領域ｔへの吸収線量、Ｄ［ｍＧｙ］を与える。ｓの放射性核種放射能は、累積放射能

として表され、これはＭＢｑ－ｓの単位で表される放射性核種崩壊の総数である。Ｓ因子、

［ｍＧｙ／ＭＢｑ－ｓ］は、標的領域ｔの質量、ｍ_ｔによって正規化された、標的領域ｔ内に堆積する、ソース領域ｓ内の１つの放射性核種の崩壊によって放出されるエネルギーの分数である。Ｓ因子は、一組の標準的なファントムおよび器官においてモンテカルロを用いて計算された、表にされた値である。一般に、本発明者らは注射された放射能の単位当たりの用量、

［ｍＧｙ／ＭＢｑ］に関心がある。この式は、滞留時間、τ_ｈ、［ＭＢｑ－ｓ／ＭＢｑ_ｉｎｊ］に関して、

と書かれ、上式は、累積放射能および注射放射能、Ａ_ｉｎｊ ［ＭＢｑ］の比であり、

として表される。

腫瘍線量測定を計算する場合、ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭは、ステップ（１）の一部として生成された関心の腫瘍領域（ＲＯＩ）からその体積が推定された、単離された単位密度球として腫瘍をモデル化する。腫瘍内のＮＭ６００の濃度（％ＩＤ／ｇ）を各々の時点で求め、減衰補正した。次に、台形の区分積分を用いてすべての時間にわたって濃度を積分することによって累積放射能を計算した。

多くの細胞株についての放射線線量測定の結果を表１に示す。この情報を用いて、腫瘍の根絶かまたは免疫系の刺激のいずれかを目的とする放射線治療研究のための吸収線量を推定することができる。
表１：代用として^６４Ｃｕ－ＮＭ６００か^８６Ｙ－ＮＭ６００のいずれかのＰＥＴイメージングを使用する、^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００および^９０Ｙ－ＮＭ６００（Ｇｙ／ＭＢｑ_ｉｎｊ）の両方の線量測定推定値

線量応答を予測するための放射線感受性指数

固有の放射線感受性は、放射線治療応答の根底にある重要な要因である；そして、それを癌型についてそれを事前に知っていることは、ＴＲＴからの放射線にそれがどのように応答するかを予測することの助けになり得る。しかし、腫瘍でのその日常的評価のための方法はないので、放射線感受性は、クローン原性検定によって２Ｇｙ（ＳＦ２）で照射した後の生存率（０～１の間）として測定される。癌細胞表現型の相対的な放射線感受性は、非常に低い放射線感受性を有するもの（膵臓、結腸直腸、神経膠腫および乳房）から高い放射線感受性を有するもの（リンパ腫）に及ぶ。癌は、その放射線感受性指数によって分類するかまたはランク付けすることができる（表２）。

本発明者らが、リンパ腫のような放射線感受性の高い腫瘍、および神経膠腫、乳房、膵臓または結腸直腸のような放射線抵抗性の高い腫瘍において、ＡＰＣ金属キレートを用いて良好な腫瘍取り込みおよび増殖抑制を示すことができる場合、それらがインビボで腫瘍を標的にすることができるならば、これらの薬剤がリンパ腫と神経膠腫の間のＳＦ_２値（０．３～０．８２）を有するどんな腫瘍に対しても有効であることを意味することができる。その場合には、神経膠腫腫瘍細胞を根絶するために必要とされる放射線量は、より放射線感受性の高いリンパ腫細胞を治療するために必要とされる放射線量よりも高くなるとも予想される。

本発明者らは現在、インビボイメージングを行って、表２に列挙されるすべての腫瘍細胞株での腫瘍選択性および治療応答（腫瘍増殖抑制）データを確認している。場合によっては、十分な癌細胞の死滅を誘発するためにＡＰＣキレートを複数回投与する必要があることがある。定量的イメージングを放射線線量測定計算と結び付けて使用することにより、本発明者らは、本明細書に開示されるように、癌細胞を死滅させるため（高線量）かまたは免疫系を刺激するため（低線量）に必要な腫瘍吸収線量を推定することができる。

多様な癌細胞株（表１）の線量測定推定値と、それらのそれぞれの放射線感受性指数（表２）を組み合わせることにより、ＮＭ６００の線量応答ランドスケープの確立が裏付けられる。一連の細胞株内のＮＭ６００の腫瘍標的化特性および有効性を知ることによって、同様の放射線感受性指数をもつ細胞株の吸収された腫瘍線量および潜在的有効性を推定することが可能である。さらに、治療線量は、腫瘍根絶または免疫刺激という望ましい結果（本明細書に開示される通り）に応じて、表１に従って直線的に増減され得る。
表２：癌細胞の相対的な放射線感受性

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実施例１３で引用された参考文献：

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実施例１４：
放射性ヨウ素化化合物、例えば実施例１～４および７～１０に例示されるものの代わりにアルキルホスホコリン（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｏｃｈｏｌｉｎｅ）金属キレートを使用する場合の利点および相違
この実施例では、本発明者らは放射性ヨウ素化（ｒａｄｉｏｄｉｎａｔｅｄ）化合物（実施例１～４および７～１０に例示される化合物）の代わりにＡＰＣ金属キレートを使用することの利点を考察する。本発明者らはまた、開示される方法のＴＲＴステップで使用される予定の金属キレートの投与量を最適化する際に当業者に考察されるべき要因も考察する。

キレートは、画像化および治療のための幅広い種類の安定なまたは放射性の金属イオンの使用を可能にする。それらは幅広い種類の任意のアルファ、ベータ、オージェ、ガンマおよびポジトロン放射体とコンジュゲートされ得るが、ヨウ素は１つのポジトロン（Ｉ－１２４）、１つのベータ（Ｉ－１３１）、１つのガンマ（Ｉ－１２３）および１つのオージェ（Ｉ－１２５）同位体に制限される。

金属同位体は、Ｉ－１３１およびＩ－１２４よりもｄｉａｐｅｕｔｉｃ的に（ｄｉａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ）有効である。

Ｌｕ－１７７は高エネルギーのガンマが少ないため、ＳＰＥＣＴイメージングおよび線量測定に好ましい。しかし、そのベータエネルギーはＩ－１３１よりもわずかに小さいため、小さい腫瘍の治療には理想的である。

Ｉ－１３１およびＬｕ－１７７は、治療効力の「馬力」において同等であるが、Ｌｕ－１７７のガンマ放出からの全体的な線量への寄与は著しく少ない。Ｙ－９０の場合、ガンマ放出からの放射線量の寄与はごくわずかである。

Ｉ－１３１と比較して、図５２に見られ下でさらに考察されるように、Ｙ－９０は、従来のＴＲＴによる癌細胞の死滅についてＩ－１３１よりも有効である。

医療内部被曝線量（ＭＩＲＤ）委員会は、投与された放射性医薬品からの内部放射線量を評価するための標準法、モデル、仮定および数学的スキーマを開発している。このＭＩＲＤの手法は、多くの異なる放射性核種について放射線量を評価する問題を単純化したものであり、広く使用されている５１０（ｋ）承認ソフトウェア、ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭ１に実装されている。その多くの標準的な擬人化ファントムとともに、ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭは、腫瘍線量を概算するために使用することのできるＳｐｈｅｒｅｓ Ｍｏｄｅｌを有する。Ｓｐｈｅｒｅｓ Ｍｏｄｅｌは、さまざまな腫瘍量（０．０１～６，０００ｇ）の単位密度球内に放射性医薬品が均一に分布していることを前提とする。

この標準モデルを使用して、本発明者らは投与された放射能で正規化した放射線量に関して、Ｙ－９０とＩ－１３１を比較した。この比較の結果を、１～１００ｇの間の腫瘍量について、図５２に示す。Ｙ－９０とＩ－１３１の比は、腫瘍４ｇで４に達し、腫瘍１００ｇまで４．０～４．２の間に留まり、ｍＣｉ／ｍＣｉベースで、Ｙ－９０は、１０ｇまでの大きさの腫瘍でＩ－１３１の３．６～４．１倍の細胞毒性であり、１０ｇを超える大きさの腫瘍では約４．１倍効果的であることを強く示唆することに注意されたい。

異なる薬物動態特性

ヨウ素化類似体とは違って、ＡＰＣキレートは、血漿の既知のアルブミン結合ポケットに収まるには大きすぎるので、異なるインビボ薬物動態および体内分布プロファイルを示す（図５３参照）。結合エネルギーが低いと、血漿中の遊離分子の割合が大きくなり、それによってより急速な腫瘍の取り込みが可能になる。一部のＡＰＣキレートは腎臓系を介して除去されるが、ヨウ素化類似体は肝胆道系によって除去される。ＡＰＣキレートは、腫瘍にも蓄積し、ヨウ素化類似体よりも素早く血液から除去される。より迅速な血液浄化は、骨髄の減少および治療用放射性医薬品の標的外毒性と直接関連している。

ＰＫおよび体内分布プロファイルにおけるこれらの相違は、異なる用量制限臓器毒性および最終的な有用性をもたらす。血液学的毒性から用量制限毒性のための腎臓または肝臓への移動は、ＴＲＴ用の放射性金属キレートの有用性を高めることになる。

さらに、ＡＰＣキレートの薬物動態プロファイルは、キレートの構造（例えばキレート電荷）のわずかな変化によって容易に操作され得る。キレート剤の選択は莫大である。正常組織からのクリアランスが速いほど、画像コントラストおよび治療ウィンドウが改善され、その結果、最大許容線量が高くなる。

ＡＰＣキレートは、ヨウ素化類似体とは異なる物理化学的特性を有する。ＡＰＣキレートははるかに水溶性が高く、そのためそれらを静脈内注射に適するようにするために界面活性剤を必要としない。ＡＰＣキレートは金属のキレートへのイオン結合に基づいているが、ヨウ素化化合物はそれらの担体分子と共有結合を形成する。インビボでの脱ヨウ素化はヨウ化アルキルでは非常に一般的であるが、キレートはインビボでは極めて安定している傾向がある。

脱ヨウ素化が起こると、遊離ヨウ化物は甲状腺に急速に蓄積し、非常に長いその後の排出半減期を伴うが、遊離放射性金属は通常身体から排出されるかまたははるかに迅速に解毒される。

ＡＰＣキレートのインビボでの体内分布は、金属イオンに応じてかなり異なる可能性があるので、金属およびキレートの両方もＡＰＣの腫瘍標的化特性に寄与する。すべてのキレートが腫瘍を標的化するのではない。腫瘍標的化は、ＡＰＣ担体の累積特性、キレートの種類（直鎖キレートは急速な腎臓除去を受けるが、大環状キレートは肝胆汁排泄を受ける）、および金属イオンに依存する。キレート構造のわずかな変化でさえもインビボ特性に有意な変動をもたらす。同位体の単純な変化は、腫瘍標的化を、５０％を超えて変化させ得る。

放射性ＡＰＣ－金属キレートは手軽な条件下でほぼ定量的（＞９８％）収率で容易に放射性標識されるが、ヨウ素化類似体の放射性ヨウ素化収率ははるかに低い（一般にＩ－１３１について約５０％、Ｉ－１２４では６０％）。さらに、高い比活性がキレートを用いて達成され得る。合成は、精巧な換気装置または訓練を必要とせずに、あらゆる核薬学で放射標識キットを用いて行うことができる。放射ヨウ素化は、標識反応中の放射性ヨウ素の揮発性のため、排水監視装置を備えたドラフト内で行わなければならない。

造影剤は、必ずしも良い治療薬を作るわけではなく、逆もまた同じである。

造影剤を用いて良好に腫瘍取り込みが行われるからといって、そのことが、治療が明白であることを意味すると仮定することはできない。良好な腫瘍取り込みを有することに加えて、治療薬は、正常組織と比較して長期の腫瘍保持を有する必要があり、骨髄曝露および関連する毒性を低下させるために血液から迅速に除去されなければならない。ヨウ素化類似体は長期間血液に滞留し、用量制限骨髄毒性をもたらす。対照的に、本発明者らのＡＰＣキレートは、上に述べたように、血漿中のアルブミン結合が低いために、はるかに速い血液クリアランス動態を示す可能性が最も高い。

最後に、ヨウ素－１３１と比較して金属ベータおよびアルファ放射体の短い経路長および物理的性質により、注射の後に医療従事者または家族に対する曝露の懸念はない。Ｉ－１３１治療を受けている患者は、しばしば退院する前に病院から解放される前に鉛で遮蔽された部屋にしばらくの間（最長１週間）収容されなければならない。放射性アルファおよびベータ放出するＡＰＣキレートを注射された患者は、入院を続ける必要はなくなるであろう。

実施例の結論
これらの実施例は、２つの既知治療方法：（１）放射線療法の標的化全身送達（Ｊ． Ｗｅｉｃｈｅｒｔおよび同僚ら）、および（２）ｉｎ ｓｉｔｕ癌ワクチンを誘導するための複合免疫療法の局所送達（Ｐ． Ｓｏｎｄｅｌおよび同僚ら）、の相乗的かつ広く応用可能な組合せに基づく、新規な、これまでに試験または検討されていない抗癌戦略を説明する。開示される金属キレート化されたアルキルホスホコリン類似体は、事実上どんな組織の癌も標的にすることができ、抗腫瘍ｍＡｂ＋ＩＬ２の局所投与は事実上どんな癌型にも用途が見出されるので（腫瘍反応性ｍＡｂは承認されているか、または臨床試験でほぼすべての癌組織種に対応するので）、この複合戦略の臨床的解釈は、事実上すべてのハイリスク癌に広く適用される。

本発明のその他の実施形態および使用は、本明細書に開示される本発明の明細書および実践を考慮すれば当業者に明白である。すべての学術誌の引用および米国／海外の特許および特許出願を含む、何らかの事情により本明細書に引用されるすべての参考文献は、参照により具体的にかつ完全に本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書に例示され説明される特定の試薬、製剤、反応条件等に限定されないが、そのようなそれらの変更形態を以下の特許請求の範囲内に入るとして包含することは理解される。

Claims (2)

1. 下記式で示されるＮＭ６００：
   に^９０Ｙ又は^１７７Ｌｕがキレート化されてなる放射性リン脂質キレート化合物である^９０Ｙ－ＮＭ６００又は^１７７Ｌｕ－ＮＭ６００であって、各化合物における^９０Ｙ又は^１７７Ｌｕは、前記ＮＭ６００中の
   の部位にキレート化されてなるものである放射性リン脂質キレート化合物を含む、原発性悪性固形腫瘍、および付随する免疫寛容（ＣＩＴ）を引き起こすことができる１以上の転移性悪性固形腫瘍を含む転移性癌の治療剤。
2. 前記転移性癌が、黒色腫、神経芽腫、肺癌、副腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、皮下癌、皮膚または頭頸部の扁平上皮癌、腸癌、網膜芽細胞腫、子宮頸癌、神経膠腫、乳癌、膵臓癌、軟部組織肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、および小児脳腫瘍からなる群から選択される、請求項１に記載の治療剤。

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