KR20050044862A - 조절된 선택성을 갖는 면역시토카인 - Google Patents

Abstract

본 발명은 증가된 치료적 지수를 갖는 시토카인 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질의 치료적 지수를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질은 세포 상에 발현되는 하나의 유형 이상의 시토카인 수용체에 결합할 수 있고, 또한 하나 이상의 세포 유형에 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 대응하는 천연 생성 시토카인에 비해 환자의 체내에서 더 긴 순환 반감기를 나타낸다.

Description

조절된 선택성을 갖는 면역시토카인 {IMMUNOCYTOKINES WITH MODULATED SELECTIVITY}

본 발명은 일반적으로 시토카인을 포함하는 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질의 치료적 유효성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 대응하는 천연 생성 시토카인에 비해 환자의 체내에서 더 긴 순환 반감기를 나타내며 개선된 치료적 특성을 갖는 시토카인 융합 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 개선된 치료적 특징을 갖는 IL2 융합 단백질에 관한 것이다.

인터류킨-2 (IL-2) 는 면역계 상에 작용하여 일차적으로 세포 매개 면역 반응을 일으키는 강력한 시토카인이다. 적절한 조건 하에서, IL-2 는 항원에 대한 면역 반응을 일으키기 위해 필요한 보조자극 신호를 공급하기 위해, 항원 부위 근처에서 국소적으로 고농도로 생성된다. T 세포의 성장 및 분화에 있어서의 그 역할로 인해, IL-2 는 종양 치료를 위한 면역치료적 접근의 후보가 되어 왔다. T 세포의 자극에 부가하여, IL-2 는 또한 B 세포, NK 세포, 림포카인 활성화 살세포 (LAK), 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 자극하는 것으로 나타나 있다.

IL-2 는 전이성 신장 암종 및 전이성 흑색종의 치료에 대해 허가된 치료제이지만, 열, 구토, 혈관 유출 및 저혈압을 포함하는 심각한 독성 부작용으로 인해 그 사용이 제한된다. IL-2 투여로 관찰되는 다양한 독성 효과 가운데, 가장 바람직하지 않으며 실질적으로 IL-2 치료법을 방해하는 것으로 여겨지는 하나의 독성 효과는 혈관 유출 증후군 (VLS) 및 이와 연관된 합병증이다.

따라서, IL-2 단백질의 치료적 유용성을 더욱 증강시키는 것이 당분야에서 여전히 요구되고 있다.

본 발명의 개요

본 발명은 부분적으로 환자에게 투여되는 경우 단백질에 대한 최대 유효성 용량에 대한 단백질의 최대 관용 용량을 증가시키기 위한, IL-2 융합 단백질의 IL-2 부분 내 돌연변이의 동정에 근거한다. 바람직한 융합 단백질은 환자의 체내에서 동일한 세포 상에 발현되는 하나 이상의 수용체종에 별개의 상호작용에 의해 결합할 수 있다. 바람직한 시토카인 융합 단백질에는 하나 이상의 유형의 시토카인 수용체 복합체 및 하나 이상의 세포 유형에 결합할 수 있는 시토카인이 포함된다. 본 발명은 또한 유용한 특성을 갖는 특정 시토카인 융합 단백질 변이체의 동정 방법을 제공한다.

본 발명은 돌연변이 IL-2 부분에 융합된 비-IL-2 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기서 융합 단백질은 비-돌연변이 IL-2 부분에 융합된 비-IL-2 부분을 포함하는 참고 단백질에 비해 더 큰 선택성을 나타내고, 상기 선택성은 IL-2Rβγ수용체를 발현하는 세포의 활성화에 대한 IL-2Rαβγ수용체를 발현하는 세포의 활성화 비로서 측정된다.

융합 단백질의 돌연변이 IL-2 부분에는 성숙한 인간 IL-2 단백질의 하나 이상의 아미노산 내 돌연변이가 포함된다. 하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 융합 단백질에는 IL-2 부분의 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 치환이 포함된다. 또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 융합 단백질에는 IL-2 부분의 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 결실이 포함된다. 또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 융합 단백질에는 융합 단백질의 IL-2 부분에서 하나 이상의 아미노산의 개질이 포함된다.

본 발명의 융합 단백질 내 돌연변이는 참고 융합 단백질에 비해 융합 단백질의 선택성을 변형시키며, 여기서 선택성은 IL-2Rβγ수용체를 발현하는 세포의 활성화에 대한 IL-2Rαβγ수용체를 발현하는 세포의 활성화 비로서 측정된다. 융합 단백질 내 돌연변이는 또한 IL-2Rαβγ수용체에 대한 융합 단백질의 친화도에 비해 IL-2Rβγ수용체에 대한 융합 단백질의 친화도 상에 차별적 효과를 일으킬 수 있다. 바람직한 돌연변이 또는 변형은 융합 단백질의 IL-2Rαβγ수용체를 발현하는 세포 활성화에 비해 융합 단백질의 IL-2Rβγ수용체를 발현하는 세포 활성화를 감소시킨다.

본 발명의 바람직한 융합 단백질은 일반적으로 약 2 배를 초과하는 차별적 효과를 나타낸다. 하나의 측면에 있어서, 차별적 효과는 성장을 위해 IL-2 에 의존하는 세포 또는 세포주의 증식 반응으로 측정된다. 융합 단백질에 대한 상기 반응은 ED50 값으로 표현되며, 이는 용량 반응 곡선을 도시하고, 최대 반응의 절반을 일으키는 단백질 농도를 결정하여 수득된다. 참고 융합 단백질의 ED50 값의 비에 대한, 본 발명의 융합 단백질의 IL-2Rβγ수용체를 발현하는 세포 대 IL-2Rαβγ수용체를 발현하는 세포에 대해 얻어진 ED50 값의 비는 융합 단백질에 대한 차별적 효과의 척도를 나타낸다.

본 발명의 융합 단백질의 선택성은 비-돌연변이 IL-2 부분에 융합된 융합 단백질에서와 동일한 비-IL-2 부분을 포함하는 참고 융합 단백질에 대해 측정될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 상술된 바와 같이 본 발명의 융합 단백질에 대해 측정된 차별적 효과는 약 5 배 내지 약 10 배이다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질이 나타내는 차별적 효과는 약 10 배 내지 약 1000 배이다.

대안적인 바람직한 구현예에 있어서, 융합 단백질의 선택성은 위치 88 에서 아스파라긴을 아르기닌으로 변화시키는 아미노산 치환 (N88R) 을 갖는 성숙한 인간 IL-2 를 포함하는 IL-2 부분에 융합된 융합 단백질에서와 동일한 비-IL-2 부분을 포함하는 참고 융합 단백질의 선택성과 비교된다. 개선된 치료적 지수를 갖는 본 발명의 융합 단백질에는 N88R 에서와 가까운 선택성을 갖지만 N88R 아미노산 치환을 갖는 참고 융합 단백질의 선택성의 약 0.1% 내지 약 100% 를 갖는 융합 단백질이 포함된다. 또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은 IL-2 부분에 N88R 아미노산 치환을 갖는 참고 융합 단백질의 선택성의 약 0.1% 내지 약 30% 의 선택성을 갖는다. 본 발명의 융합 단백질에는 또한 IL-2 부분에 N88R 아미노산 치환을 갖는 참고 융합 단백질의 선택성의 약 1% 내지 약 20% 의 선택성을 갖는 융합 단백질이 포함된다. 본 발명의 융합 단백질의 선택성은 또한 성숙한 인간 IL-2 부분에 N88R 아미노산 치환을 포함하는 참고 융합 단백질의 선택성의 약 2% 내지 약 10% 일 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 성숙한 인간 IL-2 단백질의 혈청 반감기보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 본 발명의 융합 단백질의 긴 혈청 반감기는 융합 단백질의 비-IL-2 부분에 기인할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 융합 단백질의 비-IL-2 부분은 알부민이다. 또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 융합 단백질의 비-IL2 부분은, 예를 들어 KS-1/4 항체 도메인의 변이체, NHS76 항체 도메인의 변이체 및 14.18 항체 도메인의 변이체를 포함하는 항체 도메인이다. 항체 도메인은 또한 다양한 다른 항체, 예를 들어 다양한 종양 및 바이러스 항원에 대한 항체로부터 선택될 수 있다.

바람직한 구현예에 있어서, 상술된 바와 같이 본 발명의 융합 단백질에 대해 측정되는 차별적 효과는 약 5 배 내지 약 10 배이다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질이 나타내는 차별적 효과는 약 10 배 내지 약 1000 배이다.

2 배 이상의 차별적 효과를 일으키는, 본 발명의 융합 단백질의 IL-2 부분 내 아미노산을 돌연변이시키는 것이 유용하다. IL-2 부분 내 상이한 아미노산 돌연변이는 약 2 배 초과, 약 5 배 내지 약 10 배, 또는 바람직하게는 약 10 배 내지 약 1000 배의 차별적 효과를 일으킨다. 바람직한 구현예에 있어서, 아미노산 돌연변이는 성숙한 인간 IL-2 부분의 위치 20 에 대응하는 아스파르트산의 트레오닌으로의 치환 (D20T) 이다. 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 아미노산 돌연변이는 성숙한 인간 IL-2 단백질의 위치 88 에 대응하는 아스파라긴의 아르기닌으로의 치환 (N88R) 이다. 본 발명의 융합 단백질에는 또한 하나 이상의 아미노산 위치에서의 돌연변이가 포함될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 융합 단백질에는 성숙한 인간 IL-2 단백질의 위치 88 에서 아스파라긴을 아르기닌으로, 위치 85 에서 류신을 트레오닌으로, 및 위치 86 에서 이소류신을 트레오닌으로 변화시키는 아미노산 치환이 포함된다.

IL-2 부분 내 특정 위치에서 아미노산의 돌연변이는 약 2 배 초과의 차별적 효과를 일으킨다. 성숙한 인간 IL-2 단백질의 위치 K8, Q13, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, H79, L80, R81, D84, N88, I92, 및 E95 에 대응하는 아미노산을 돌연변이시키는 것이 유용하다. 돌연변이시킬 수 있는 부가적으로 유용한 아미노산 위치는 성숙한 인간 IL-2 단백질의 L25, N31, L40, M46, K48, K49, D109, E110, A112, T113, V115, E116, N119, R120, I122, T123, Q126, S127, S130, 및 T131 이다. 본 발명의 융합 단백질에서 돌연변이되는 바람직한 아미노산 위치에는 D20, N88, 및 Q126 이 포함된다.

하나의 구현예에 있어서, 상기 기재된 바람직한 위치에서 하나 이상의 아미노산은 융합 단백질 내에서 돌연변이된다. 바람직한 구현예에 있어서, 위치 88 의 아미노산 아스파라긴은 아르기닌으로 치환된다 (N88R). 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 위치 20 의 아미노산 아스파르트산은 트레오닌으로 치환된다 (D20T). 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 위치 126 의 글루타민은 아스파르트산으로 치환된다 (Q126D). 다양한 아미노산 치환은 IL-2Rβγ수용체를 갖는 세포에 비해 IL-2Rαβγ수용체를 갖는 세포에 대한 본 발명의 융합 단백질의 활성에 있어서 선택성을 일으키며, 이는 융합 단백질의 IL-2Rαβγ수용체에 대한 친화도에 비해 융합 단백질의 IL-2Rβγ수용체에 대한 친화도에 반영될 수 있다.

상술된 하나 이상의 아미노산 위치에서 돌연변이를 갖는 융합 단백질은 약 2 배 초과인 차별적 효과를 갖는다. 바람직하게는, 차별적 효과는 약 5 배 내지 약 10 배이며, 보다 바람직하게는 약 10 배 내지 약 1000 배이다.

IL-2 부분 내 아미노산을 돌연변이시키는 것에 부가하여, 비-IL-2 부분 내 아미노산도 돌연변이시킬 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 비-IL-2 부분은 항체 도메인이다. 항체 도메인은 여러 상이한 면역글로불린 (Ig) 항체, 바람직하게는 예를 들어 IgG 감마 1, IgG 감마 2 및 IgG 감마 4 항체 도메인, 또는 임의 조합의 상기 항체 도메인을 포함하는 IgG 항체로부터 선택될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항체" 및 "면역글로불린" 은 하기를 의미하는 것으로 이해된다: (i) 온전한 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체), (ii) 예를 들어, Fab 절편, Fab' 절편, (Fab')₂ 절편, Fv 절편, 단일쇄 항체 결합 부위, sFv 를 포함하는 이들의 항원 결합부, (iii) 2 특이적 항체 및 이들의 항원 결합부, 및 (iv) 다중 특이적 항체 및 이들의 항원 결합부. 본 발명의 단백질에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역에는 하나 이상의 면역글로불린 불변 중쇄 영역, 예를 들어 면역글로불린 불변 중쇄 2 (CH2) 도메인, 면역글로불린 불변 중쇄 3 (CH3) 도메인, 및 Fc 영역을 생성하기 위해 사용되는 면역글로불린의 유형에 따라 임의로 면역글로불린 불변 중쇄 4 (CH4) 도메인, 또는 상기의 조합이 포함될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역에는 면역글로불린 불변 중쇄 1 (CH1) 도메인이 없을 수 있다. 면역글로불린 Fc 영역은 임의의 면역글로불린 클래스, 예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 에 근거할 수 있지만, IgG 에 근거하는 면역글로불린 Fc 영역이 바람직하다. 본 발명의 융합 단백질 내에 포함되는 항체 부분은 바람직하게는 인간 유래이지만, 쥐과 항체, 또는 임의의 다른 포유류 또는 비포유류 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질에 사용되는 Fc 영역이 분자의 특정 적용에 순응될 수 있는 것도 의도된다. 하나의 구현예에 있어서, Fc 영역은 면역글로불린 γ1 이소형 또는 이들의 변이체 유래이다. 또다른 구현예에 있어서, Fc 영역은 면역글로불린 γ2 이소형 또는 이들의 변이체 유래이다. 또다른 구현예에 있어서, Fc 영역은 면역글로불린 γ3 이소형 또는 이들의 변이체 유래일 수 있다. Fc 영역에는 Fc 영역 자체와 상이한 면역글로불린 이소형에서 유래된 힌지 (hinge) 영역이 포함될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역은 면역글로불린 γ2 이소형 유래이고, 면역글로불린 γ1 이소형 또는 이들의 변이체 유래의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 있어서, Fc 영역은 면역글로불린 γ4 이소형 유래이다. 면역글로불린 γ1 이소형 또는 이들의 변이체 유래의 힌지 영역을 포함하도록 개질된 면역글로불린 γ4 이소형이 특히 바람직하다.

하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 융합 단백질에는 Ig 부분 내 돌연변이가 포함된다. 유용한 돌연변이는 IgG 감마 1 서열 QYNSTYR (서열 번호 1) 에서 N 을 Q 로 바꾸는 돌연변이이며; 특히 유용한 돌연변이는 감마 2 또는 4 서열 QFNST (서열 번호 2) 에서, 디펩티드 모티프 FN 을 AQ 로 바꾸는 돌연변이이다.

본 발명은 또한 본 발명의 다양한 융합 단백질을 코딩하는 DNA 구축물을 특징으로 한다. 본 발명의 융합 단백질은 암, 바이러스 감염 및 면역 장애의 치료에 특히 유용하다.

상기 및 기타 목적은 본원에 개시된 본 발명의 이점 및 특징과 함께, 하기의 설명, 도면 및 청구범위로부터 보다 자명해질 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 시토카인의 천연 결합 특징을 변형시키는 제 2 단백질 부분으로의 시토카인의 융합을 나타낸다. 도 1A 는 이량체성 분자로서 IL-2 로의 융합 파트너, 예컨대 Fc-포함 융합 단백질의 Fc 부 또는 항체를 나타내며, 이에 따라 융합 단백질의 IL-2 부분이 그 수용체와 상호작용하는 경우 2 분자의 IL-2 가 세포 표면으로 가게 된다. 도 1B 는 동일한 효과를 만드는 제 2 기전을 나타낸다.

도 2 는 융합 단백질 면역시토카인 huKS-IL2 (삼각형으로 나타냄) 및 2 개 변이체 huKS-ala-IL2 (원형으로 나타냄) 및 huKS-ala-IL2(N88R) (별로 나타냄) 의 전형적 약동역학 프로파일을 나타낸다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 특히 IL-2 융합 단백질 및 IL-2 면역시토카인의 치료적 지수를 증강시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 치료적 분자의 치료적 지수는 분자의 최대 관용 용량을 상기 분자에 대한 최대 유효성 용량으로 나눈 비의 척도이다. 본 발명에는 자유 IL-2 에 비해 유의미하게 더 긴 순환 반감기를 나타내는 IL-2 면역시토카인의 개선된 변이체가 포함된다. 본 발명은 또한 IL-2 융합 단백질, 및 특히 IL-2 의 독성 효과의 주요 원인인 본 발명의 융합 단백질에 의한 다양한 효과기 기능을 갖는 세포의 활성화 감소로 반영되는 선택적 IL-2 반응을 나타내는 IL-2 면역시토카인을 제공한다. 또한, 본 발명은 개선된 활성을 갖는 IL-2 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 IL-2 융합 단백질에는 상이한 IL-2 수용체에 대한 IL-2 융합 단백질의 상대적 친화도를 변형시켜 IL-2 융합 단백질의 생물학적 특성을 변형시키는, 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변화가 포함된다. 본 발명은 IL-2 치료법과 연관된 임의의 독성을 감소시키거나 최소화하는데 유용하다. 임의의 주어진 IL-2 독성, 예컨대 VLS 의 근원적 기전과는 무관하게, 독성은 부분적으로 IL-2 가 정맥내 투여되어, IL-2 의 효과가 특정 부위에서만 요망됨에도 불구하고 체내에서 전신 작용한다는 사실에 기인한다. 상기 문제점은 IL-2 의 전신 투여가 국소 투여에 비해 훨씬 더 높은 용량을 필요로 하여, 다시 더 낮은 용량에서는 볼 수 없을 독성을 촉진할 수 있다는 사실에 의해 악화된다. 본 발명은 독성이 감소된 IL-2 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 독성이 감소된 IL-2 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

일반적으로, 본 발명은 비-IL-2 부분에 융합된 IL-2 부분을 포함하는 융합 단백질에 유용하다. 본 발명에 따르면, 비-IL-2 부분은 합성 또는 천연 단백질이거나 이들의 부 또는 변이체 (종, 대립유전자 및 돌연변이 변이체가 포함됨) 일 수 있다. 바람직한 비-IL-2 부분에는 Fc 및 알부민 부분이 포함된다. 본 발명에 따르면, IL-2 부분은 천연 IL-2 분자이거나, 하나 이상의 IL-2 활성 또는 기능을 보유하는 이들의 부 또는 변이체 (종, 대립유전자 및 돌연변이 변이체가 포함됨) 일 수 있다 (IL-2 부분은 본 발명에 따라 상이한 IL-2 수용체 결합 친화도를 갖도록 개질된 IL-2 일 수 있다).

본 발명에 따르면, 세포는 2 개 형태로 존재하는 특정 세포 표면 수용체 (IL-2R) 를 통해 IL-2 에 반응한다. 고친화도 수용체는 α, β및 γ서브유닛으로 이루어진 이종삼량체이며; 중간 친화도 수용체는 β및 γ서브유닛으로 이루어진 이종이량체이다. IL-2R 의 상기 2 개 형태에 대한 IL-2 의 결합 상수는 2 차수 크기로 상이하다. 신호 전달은 βγ복합체 내의 상호작용을 통해 수용체의 세포질측에서 매개된다. 상이한 세포 유형은 다양한 양의 α, β 및 γ서브유닛을 발현한다. 예를 들어, 활성화된 T 세포는 모든 서브유닛을 발현하여 고친화도 IL-2Rαβγ를 형성하는 반면에, 성숙한 휴면 T 세포 및 NK 세포는 β및 γ서브유닛을 발현하여 중간 친화도 IL-2Rβγ를 만든다. 즉, 세포는 자극을 위해 IL-2 에 대한 상이한 수준의 노출을 필요로 하며, 반대로 특정 세포 환경 내에서 IL-2 활성을 조절함으로써 면역 반응의 성질이 조절될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물은 특히 IL-2 융합 단백질, 예컨대 IL-2 를 갖는 면역시토카인 환경에서 유용하다. 본 발명에 따르면, IL-2 를 갖는 면역시토카인은 IL-2 를 종양 미세환경 내로 직접 타겟팅하여, IL-2 치료법의 효능을 유의미하게 증가시키는 것으로 나타난 합성 분자이다. 면역시토카인은 항체 부분 및 시토카인 부분, 예컨대 IL-2 부분으로 이루어진 융합 단백질이다. 본 발명에 따르면, 항체 부분은 전체 항체 또는 면역글로불린이거나, 생물학적 기능, 예컨대 항원 특이적 결합 친화도를 갖는 이들의 부 또는 변이체 (종, 대립유전자 및 돌연변이 변이체가 포함됨) 일 수 있다. 유사하게, 본 발명의 시토카인 부분은 천연 시토카인, 또는 일부 이상의 시토카인 활성을 보유하는 이들의 부 또는 변이체 (종, 대립유전자 및 돌연변이 변이체가 포함됨) 일 수 있다. 면역시토카인 치료법의 이득은 쉽게 식별할 수 있다. 예를 들어, 면역시토카인의 항체 부분은 종양 특이적 에피토프를 인지하여, 면역시토카인 분자를 종양 부위로 타겟팅한다. 따라서, 자유 IL-2 에 필요할 것보다 훨씬 더 낮은 용량의 면역시토카인을 사용하여, 고농도의 IL-2 가 종양 미세환경 내로 전달되어 상기 언급된 다양한 면역 효과기 세포의 활성화 및 증식을 일으킬 수 있다. 또한, 자유 IL-2 와 비교하여 면역시토카인의 증가된 순환 반감기는 면역시토카인의 효능에 기여한다. 그리고 마지막으로, 예를 들어 FcγRIII 를 갖는 NK 세포에서 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 을 활성화시켜 항체의 천연 효과기 기능을 또한 이용할 수 있다.

IL-2 면역시토카인은 자유 IL-2 에 비해 더 우수한 효능을 갖는다. 그러나, IL-2 면역시토카인의 일부 특징은 IL-2 분자의 잠재적인 부작용을 악화시킬 수 있다. 자유 IL-2 에 비해 혈류 중 IL-2 면역시토카인의 유의미하게 더 긴 순환 반감기로 인해, IL-2 또는 융합 단백질 분자의 다른 부가 혈관계 내에 일반적으로 존재하는 성분을 활성화시킬 가능성이 증가된다. 동일한 우려가 또다른 부분, 예컨대 Fc 또는 알부민에 융합된 IL-2 를 포함하여 순환 중 IL-2 의 반감기를 증가시키는 다른 융합 단백질에도 적용된다.

본 발명은 융합 단백질의 비변형 형태에 비해 독성이 감소된, 변형 IL-2 융합 단백질, 예컨대 온전한 항체 또는 항체의 부, 또는 알부민에 융합된 IL-2 를 제공한다. 본 발명은 또한 β및 γIL-2 수용체 서브유닛을 발현하는 세포에 비해 α, β및 γIL-2 수용체 서브유닛을 발현하는 세포에서 융합 단백질의 상대 활성을 변형시키는, IL-2 및/또는 비-IL-2 부분 내에 하나 이상의 변형을 갖는 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 융합 단백질의 비변형 형태에 비해 IL-2 수용체의 α, β또는 γ서브유닛에 대한 변형된 친화도를 나타내는 변형 IL-2 포함 융합 단백질을 제공한다.

여러 IL-2-포함 항체 융합 단백질은 자유 IL-2 에 비해 정량적으로 변형되었지만, 치료적 적용을 위해 정성적으로 최적이 아닌 IL-2 활성을 나타낸다. 본 발명은 IL-2 또는 항체, 또는 두 부분 모두가 주어진 적용에 대하여 IL-2 활성을 정성적으로 개선시키도록 변형된 항체-IL2 융합 단백질의 개질 형태를 제공한다.

본 발명은 또한 질환의 치료를 위해 개질된 융합 단백질을 고안하는데 특히 유용한, 개질 유형의 결정 전략을 제공한다.

도 1 은 융합 단백질 내 부분의 수용체-결합 특성이 변형되어 융합 단백질이 세포 표면에 결합할 수 있게 하는 기전을 나타낸다. 예를 들어, 도 1A 에는 이량체 분자로서 IL-2 로의 융합 파트너가 도시된다. 이는, 예를 들어 결합에서 전체 증가를 일으키는 오프-속도 (off-rate) 를 감소시킴으로써, 제 2 IL-2 분자가 그 수용체와 상호작용하는 가능성을 증가시킨다. 도 1B 는 동일한 효과를 만드는 제 2 기전을 나타낸다. IL-2 에 대한 수용체 및 융합 단백질의 IL-2 융합 파트너에 대한 수용체 (예컨대 Ig 부분의 Fc 부에 대한 Fc 수용체) 를 둘 다 갖는 세포에 있어서, 융합 파트너에 대한 수용체 (예컨대 Fc 수용체) 는 융합 단백질을 구속하고 이를 세포 표면에 속박하여, 이제 IL-2 수용체에 결합하는 가능성이 증가되었다.

최근에 huKS-IL2 로 명명된 항체-시토카인 융합 단백질의 I/II 상 시험이 종료되었다. huKS-IL2 는 시토카인인 인터류킨-2 에 융합된 KS-1/4 항체로 이루어진 융합 단백질이다. KS-1/4 는 종양 세포 표면 항원 EpCAM (상피 세포 부착 분자) 을 인지하고, 종양 부위에 IL-2 를 농축시키는 효과를 갖는다. 상기 시험 과정에서, 치료에 반응한 환자가 측정되었다. 치료법에 유의미한 반응을 나타낸 한 환자는 임상적 일부 반응 후, 질환 안정화 및 진통제 사용의 감소를 경험하였다. 이 환자는 이미 실패한 선행 표준 치료를 수여받았다. 환자의 수명은 상기 치료의 부재 하에 예측되는 것을 넘어서서 유의미하게 연장되었다.

놀랍게도, 선행 화학요법의 결과, 상기 환자의 T 세포군은 본질적으로 제거되었다. 상기 환자는 시험에서의 모든 다른 환자에 비해 훨씬 더 적은 T 세포 수를 가졌다. IL-2 가 T 세포를 활성화시키는 것으로 공지되어 있고, 예를 들어 종양 세포에 대한 CD8(+) T 세포의 세포 독성을 증강시키는 것으로 공지되어 있는 것을 감안할 때, 명백히 T 세포가 결여된 상기 환자의 강한 반응은 특히 예상치 못한 것이었다. 상기 관찰은, IL-2 부분이 변형된 세포 특이성을 나타낼 수 있어서 IL-2 융합 단백질의 치료적 지수가 개선된 신규 항체-IL-2 융합 단백질의 추가 연구를 고무하였다.

IL-2 의 결정 구조, 관련 시토카인과의 서열 비교, 및 부위 지정 돌연변이화 연구로부터, 상이한 IL-2 수용체 서브유닛과 접촉하는 IL-2 내의 아미노산 및 이들의 생물학적 활성에 대한 영향을 밝히는데 많은 진전이 있었다. 예를 들어, 포유류 종에 걸쳐 IL-2 에서 보존된 D20 잔기는 IL-2 수용체의 β서브유닛에 결합하기 위해 결정적인 잔기이며, 상기 위치에서의 다양한 치환은 별개의 효과를 갖는다. 예를 들어, 변이체 IL-2(D20K) 는 임의의 IL-2R 복합체에 결합하는데 실패하며 일반적으로 불활성인 반면, 변이체 IL-2(D20E) 또는 IL2(D20T) 는 이들의 생물학적 활성을 보유한다. 아미노산 위치 R38 및 F42 는 α서브유닛에 결합하기 위해 결정적인 잔기인 반면, 상기 부위에서의 돌연변이는 고친화도 수용체 IL-2Rαβγ와 IL-2 의 상호작용을 감소시키고, 이는 여전히 중간 친화도 수용체 IL-2Rβγ에 결합하므로, 일부 생활성은 보유된다. N88 은 β서브유닛과의 상호작용 매개에 관여하는 또다른 잔기이며, IL-2(N88R) 변이체가 중간 친화도 수용체에 대해 매우 감소된 친화도를 갖는 반면, 고친화도 수용체에 대한 그 친화도는 본질적으로 변하지 않는다. 따라서 IL-2 의 N88R 돌연변이는 여전히 T 세포를 활성화시킬 수 있다.

본 발명의 융합 단백질의 상이한 수용체에 대한 결합 친화도는, 예를 들어 방사성면역분석을 포함하는 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 결정될 수 있다.

또한 하나의 수용체 서브유닛과 접촉하는 특정 아미노산을 돌연변이시키거나 아미노산 잔기의 조합을 변형시킴으로써 IL-2 구조를 교란시켜, 이것이 또다른 IL-2 수용체 복합체와 비교하여 하나의 IL-2 수용체 복합체에 대해 더 큰 친화도를 나타내도록 할 수 있다. 결과적으로, 상기 분자는 다른 것에 비해 하나의 세포 유형에서 더 큰 활성을 나타낸다. 본 발명에 따르면, 목적하는 효과를 수득하기 위해 Ig-IL2 융합 단백질 환경에서 IL-2 구조를 조작할 수 있다. 또한, 일부 경우에 있어서, Ig-IL2 변이체 융합 단백질은 대응하는 자유 IL-2 돌연변이 단백질과 비교하여 상이한 생물학적 특징을 보유한다.

또한 본 발명에 따르면, 융합 단백질 내 IL-2 부분을 조작하여, 이것이 하나 이상의 IL-2 수용체 서브유닛 (α, β 또는 γ) 에 대해 변형된 친화도를 나타내고, 융합 단백질의 생활성에 있어서 전체적 감소를 일으킬 수 있다. 상기 변이체는 IL-2 반응성 세포를 활성화시킬 수 있지만, 자유 IL-2 에 비해 더 높은 농도를 필요로 한다. 따라서, 예를 들어 부분의 타겟팅에 의해 IL-2 융합 단백질이 목적하는 표적 부위에 농축된 경우, 상기 변이체는 개선된 치료적 지수를 갖는다.

IL-2R 의 α수용체 서브유닛은 속박 기능을 담당하는 것으로 나타난다: 상기 저친화도 수용체는 IL-2 에 결합하고 IL-2 를 세포 표면 가까이 유지시켜서, 세포 표면 IL-2Rβ및 IL-2Rγ수용체 서브유닛 근방에서 유효 농도가 증가된다. 함께, IL-2 수용체의 α-서브유닛 및 βγ-서브유닛은 고친화도 IL-2R 복합체를 생성한다. 본 발명은 부분적으로, IL-2 융합 단백질이 세포 표면 상의 수용체와 여러 별개의 상호작용에 관여할 수 있다는 인식에 근거한다. 예를 들어, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질의 경우, 항체 부분 자체는 융합 단백질의 세포 표면으로의 결합을 촉진할 수 있고, 나아가 IL-2 는 융합 단백질 내에서 여러 카피로 존재할 수 있다. 결과적으로, IL-2 는 IL-2R 의 β및 γ서브유닛만을 발현하는 세포에 속박되어, 상기 세포를 활성화시키는 증강된 능력을 가질 수 있다.

예를 들어, IL-2 에 융합된 이량체 면역글로불린 (Ig) 은 2 개 카피의 IL-2 를 보유하여, 하나의 IL-2 부분의 그 수용체로의 결합이 동일한 세포 표면 상의 수용체 분자와 제 2 IL-2 부분의 상호작용 가능성을 증강시킨다. 도 1A 의 모식도는 세포 표면 상의 Ig-IL2 융합 단백질의 가능한 배치를 나타낸다. 본 발명은 IL-2 부분이 IL-2Rβγ수용체로의 결합을 감소시키도록 변형된 Ig-IL2 융합 단백질을 제공한다.

Ig-IL2 융합 단백질이 특정 면역 세포의 표면에 대해 변형된 결합을 가질 수 있는 제 2 기전은 세포 표면 상의 Fc 수용체가 Ig 부분의 Fc 부분에 결합하여 IL-2 를 Fc 수용체 및 IL-2 수용체를 둘 다 보유하는 세포 표면으로 속박할 수 있는 것이다 (도 1B). 상기 세포에는 NK 세포, B 세포, 및 대식세포가 포함된다. 본 발명은 Ig 부분이 변형되어 Fc 수용체로의 결합이 감소된 Ig-IL2 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 Ig-부분 및 IL-2 부분 둘 다에 상술된 성질의 변형이 도입된 Ig-IL2 융합 단백질을 제공한다.

Ig-IL2 융합 단백질이 IL-2 수용체 서브유닛을 갖는 세포에 인공적으로 속박될 수 있다는 식견에 근거하여, 속박 부분이 변형된 변이체 융합 단백질을 고안할 수 있다. 예를 들어, Ig-IL2 융합 단백질의 Fc-수용체 결합 특징을 변형시키는 것이 유용하다. 이는, 예를 들어 단백질의 돌연변이 또는 효소적 소화에 의해, Fc 부분 내의 공지된 아미노산 접촉 부위를 돌연변이시키거나 N-연결 글리코실화 부위를 제거함으로써 수행될 수 있다.

유사하게, 본 발명에 따르면 IL-2 수용체 서브유닛으로의 결합에 영향을 갖는 IL-2 부분 내에 돌연변이를 도입하는 것이 유용하다. 특히, IL-2 수용체의 β서브유닛과 접촉하는 IL-2 내 아미노산을 돌연변이시키는 것이 유용하다. 특히 유용한 유형의 돌연변이는 IL-2 및 IL-2Rβ간의 결합 에너지를 감소시키지만 상기 상호작용을 입체적으로 방해하지는 않는 것이다. 예를 들어, 접촉 아미노산의 더 작은 측쇄를 갖는 아미노산으로의 돌연변이가 특히 유용하다. 상기 돌연변이의 효과는 상당한 정도로 IL-2 수용체의 β-γ형태에 대한 IL-2 의 친화도를 감소시키고 또한 상기 수용체에 의해 매개되는 신호화 경로의 활성화를 감소시키지만 IL-2 수용체의 α-β-γ형태로의 결합 또는 상기 IL-2 수용체를 갖는 세포 내에서 IL-2 에 의해 야기되는 활성 상에는 상대적으로 거의 효과가 없거나 효과가 없다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 돌연변이는 IL-2 수용체의 β-γ형태에 대한 친화도를 감소시키지만 이를 제거하지는 않는다.

유사하게, IL-2 수용체의 α서브유닛과 상호작용하는 IL-2 의 표면 상 아미노산 내에 돌연변이를 도입하는 것이 유용하다. 특히 유용한 유형의 돌연변이는 IL-2 및 IL-2Rα간의 결합 에너지를 감소시키지만 상기 상호작용을 입체적으로 방해하지는 않는 것이다. 예를 들어, 접촉 아미노산의 더 작은 측쇄를 갖는 아미노산으로의 돌연변이가 특히 유용하다. 상기 돌연변이의 효과는 상당한 정도로 IL-2 수용체의 α-β-γ형태에 대한 친화도를 감소시키지만 IL-2 수용체의 β-γ형태로의 결합에는 상대적으로 거의 효과가 없거나 효과가 없다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 돌연변이는 IL-2 수용체의 α-β-γ형태에 대한 친화도를 감소시키지만 이를 제거하지는 않는다.

유사하게, IL-2 수용체의 γ서브유닛과 상호작용하는 IL-2 의 표면 상 아미노산 내에 돌연변이를 도입하는 것이 또한 유용하다. 선행 경우에서와 같이, 특히 유용한 유형의 돌연변이는 IL-2 및 IL-2Rγ간의 결합 에너지를 감소시키지만 상기 상호작용을 입체적으로 방해하지는 않는 것이다. 예를 들어, 접촉 아미노산의 더 작은 측쇄를 갖는 아미노산으로의 돌연변이가 특히 유용하다. 상기 돌연변이의 효과는 상당한 정도로 IL-2 수용체의 β-γ형태에 대한 친화도를 감소시키지만 IL-2 수용체의 α-β-γ형태로의 결합에는 상대적으로 거의 효과가 없거나 효과가 없다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 돌연변이는 IL-2 수용체의 β-γ형태에 대한 친화도를 감소시키지만 이를 제거하지는 않는다.

IL-2 수용체 서브유닛의 상이한 표면과 상호작용하는 IL-2 내로 아미노산 돌연변이의 조합을 도입하는 것이 또한 유용하다. 각각의 돌연변이는 독립적으로 IL-2 수용체의 α-β-γ또는 β-γ형태에 대한 IL-2 의 결합에는 거의 효과가 없거나 효과가 없을 수 있지만, 돌연변이의 조합은 IL-2 의 생활성 또는 그 수용체에 대한 IL-2 의 친화도에 있어서 목적하는 감소를 성취할 수 있을 것이다

본 발명에 따르면, IL-2 의 다른 부에서의 돌연변이는 간접적으로 IL-2 수용체의 β-γ형태 또는 α-β-γ형태에 대한 IL-2 의 상호작용을 변형시키는데 기여함으로써, 조절된 활성을 갖는 IL-2 분자가 얻어진다. 예를 들어, 돌연변이는 분자의 배좌를 약간 변형시키고, 그 결합 특성을 변형시킬 수 있다.

본 발명에 따르면, IL-2 부분의 IL-2 수용체 복합체로의 결합 및 항체 부분 내의 돌연변이를 또한 조절하는 IL-2 부분 내 돌연변이를 포함하는 융합 단백질을 생성하는 것이 또한 유용하다. 상기 융합 단백질은 이것이 Ig-IL2 융합 단백질과 특정 Fc 수용체의 상호작용을 변형시키는 것이 요망되는 경우 특히 유용할 수 있다.

자유 IL-2 부분은 IL-2 부분이 또다른 단백질 부분, 예컨대 Ig 에 융합된 경우, IL-2R 복합체에 대해 상이한 결합 특징을 나타낼 수 있다. 이것이 일어날 수 있는 하나의 가능한 기전이 상기에 제시된다. 또다른 가능한 기전은, IL-2 가 면역시토카인 환경 내에서 입체적으로 또는 배좌적으로 구속되고, 특정 구속이 상이한 IL-2 수용체 복합체에 대한 IL-2 부분의 결합 특징에 반영되는 것이다. 따라서, 상기 구속을 조절할 변형을 융합 단백질 내에 도입하는 것이 유용하다. 예를 들어, 비-IL-2 부분 내의 변화는 IL-2 의 활성 조절에 유용하다.

특정 적용, 예컨대 인간 질환의 치료를 위한 특정 IL-2 융합 단백질, 예컨대 Ig-IL2 융합물 또는 Fc 또는 알부민을 포함하는 IL-2 융합 단백질의 유용성은 적절한 세포 또는 동물 모델에서 시험된다. 가능한 경우, 동물에서의 시험은, 상기 시험이 인간 질환에서 면역계 거동의 전체 복잡성에 더 유사하기 때문에 바람직하다. 예를 들어, 특정 세포의 특정 균형은, 관심 질환, 예컨대 암 또는 박테리아, 바이러스 또는 기생충으로의 감염에 대해 대항하기 위해 최적일 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 높은 수준의 T 세포 활성이 특정 종양 유형에 대해 유용할 수 있는 반면, 상대적으로 높은 수준의 NK 세포 활성이 상이한 종양 유형에 대해 유용할 수 있다.

본 발명의 또다른 특징은 더 우수한 독성 프로파일을 갖는 IL-2 융합 단백질 변이체, 예컨대 Ig-IL2 융합물 또는 Fc 또는 알부민을 포함하는 IL-2 융합물이다. 예를 들어, 돌연변이 D20T 를 포함하는 Ig-IL2 융합 단백질은 위치 20 에서 D 를 갖는 대응하는 Ig-IL2 융합 단백질과 비교하여 동물, 예컨대 마우스에서 감소된 독성을 나타낸다. 또다른 예에 있어서, IL-2 부분에 돌연변이 N88R 또는 돌연변이 L85T, I86T, N88R 의 조합을 포함하는 Ig-IL2 융합 단백질은 위치 88 에서 N 을 갖는 대응하는 Ig-IL2 융합 단백질과 비교하여 동물, 예컨대 마우스에서 감소된 독성을 나타낸다. 또한, IL-2 부분에 돌연변이 D20T 또는 돌연변이 N88R 을 포함하는 항체-IL2 융합 단백질은 항체의 항원 타겟을 발현하는 종양을 치료하기 위해 사용되는 경우 대응하는 부모 항체-IL2 융합 단백질에 필적하는 효력을 나타낸다.

Ig-IL2 융합 단백질의 D20T 변이체의 특성은 특히, 자유 IL-2 단백질에서 D20T 돌연변이의 보고된 특성의 견지에서 놀라운 것이다. 구체적으로, 자유 IL-2 단백질 내 D20T 돌연변이는 IL-2R-αβγ를 갖는 세포 또는 IL-2R-βγ를 갖는 세포에 대한 그 활성에 있어서 야생형 IL-2 단백질에 비해 차이를 나타내지는 않는다 (Shanafelt 등, PCT W099/60128). 그러나, D20T 돌연변이를 포함하는 Ig-IL2 융합 단백질은 IL-2R-βγ를 갖는 세포의 활성화에 있어서 현저히 감소된 효력을 갖지만, IL-2Rαβγ를 갖는 세포의 활성화에 있어서는 본질적으로 정상적인 효력을 갖는다.

따라서, Ig-IL2 융합 단백질의 IL-2 부분 내 여러 아미노산의 돌연변이는 독성을 감소시키는 반면, 다양한 질환의 치료에 있어서 융합 단백질의 효력 상에는 비교적 거의 효과를 갖지 않는다. 예를 들어, IL-2 융합 단백질 변이체의 그 수용체에 대한 친화도가 변형될 수 있는 정도는 특정 융합 단백질이 얼마나 잘 그 목적 타겟 부위에 농축되는가의 함수이다. IL-2 부분 내 하나 이상의 하기 아미노산을 돌연변이시키는 것이 특히 유용하다: Lys8, Gln13, Glu15, His16, Leu19, Asp2O, Gln22, Met23, Asn26, Arg38, Phe42, Lys43, Thr51, His79, Leu8O, Arg81, Asp84, Asn88, Val91, Ile92, 및 Glu95. 또한 IL-2 부분 내 하나 이상의 하기 아미노산을 돌연변이시키는 것이 유용하다: Leu25, Asn31, Leu4O, Met46, Lys48, Lys49, Asp109, Glu110, Ala112, Thr113, Val115, Glu116, Asn119, Arg120, Ile122, Thr123, Gln126, Ser127, Ser13O, 및 Thr131.

본 발명에는 IL-2 에 융합된 Ig 부분의 형태, 예를 들어 항체-IL2 융합물, 예컨대 huKS-IL2 또는 dI-NHS76-IL2 가 개시되어 있으며, 여기서 IL-2 에 융합된 Ig 부분 내 변화는 융합 단백질의 IL-2R 복합체로의 결합 특성에 영향을 미친다. 상기 변화는 중쇄의 아미노산 서열 내 아미노산 치환 또는 화학적 개질일 수 있다. 유용한 아미노산 치환에는 융합 단백질의 글리코실화에 영향을 미치거나 Fc 수용체와의 상호작용에 직접적으로 영향을 미치는 것들이 포함된다. 특히 유용한 치환은 IgG 중쇄의 위치 N297 (EU 명명법) 에서 보통 발견되는 글리코실화를 저해하는 것일 수 있다. 화학적 및 생화학적 개질에는 분자의 PEG 화 또는 N 연결 글리코실쇄를 제거하기 위한 N-글리카나아제로의 처리가 포함된다. 이론에 구애받지 않고, 분자의 항체부 내의 특정 변화가, 예를 들어 항체 분자의 견고성을 변형시켜 IL-2 의 배좌에 영향을 줄 수 있음을 파악할 수 있다. huKS-IL2 의 경우, 상기 변형은 현재 세포 기반 생분석 (bioassay) 에서 T 세포에 대해 증가된 선택성을 나타내는 KS-IL2 분자를 유도할 수 있다.

항체-IL2 융합 단백질에 있어서, 종종 다른 목적 특성을 분자에 부여하는 Ig 부분을 선택하는 것이 유용하다. 예를 들어, 감마 1 서브클래스의 IgG 부분은 면역학적 효과기 기능, 예컨대 ADCC 를 유지하기 위해 바람직할 수 있다. 이와는 달리, 감마 2 또는 감마 4 서브클래스의 IgG 부분은, 예를 들어 FcR 수용체 상호작용을 감소시키기 위해 바람직할 수 있다. 서브클래스 감마 2 또는 감마 4 의 IgG 부분을 사용하는 경우, 감마 1 유래의 힌지 영역을 포함시키는 것이 특히 바람직하다.

종종 별개의 유용한 특성을 갖는 다른 돌연변이, 예컨대 특정 Fc 영역의 C-말단에서 라이신의 알라닌 또는 또다른 소수성 잔기로의 돌연변이와 조합된, Ig-IL2 융합 단백질의 돌연변이 및 화학적 또는 생화학적 개질을 이용하는 것이 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 개질을 항체 융합 단백질 huKS-ala-IL2 또는 dI-NHS(76)-ala-IL2 에 적용하는 것이 특히 유용하다. 또한 분자 내에 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하는 추가 돌연변이를 도입하는 것이 바람직하다. 상기 돌연변이가 분자의 목적 특성을 실질적으로 변형시키지 않는 것이 특히 바람직하다.

본 발명에는 또한 IL-2 에 융합된 Ig 부분의 형태, 예를 들어 항체-IL2 융합물, 예컨대 huKS-IL2 가 개시되며, 여기서 IL-2 의 아미노산 서열 내 특정 변형, 예를 들어 IL2(D20T) 또는 IL2(N88R) 은 융합 단백질의 IL-2R 복합체로의 결합 특성을 변화시킨다. 성숙한 인간 IL-2 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 3 에 나타낸다. 결합 특성의 변화는 세포 기반 생분석에서 T 세포에 대해 증가된 선택성으로 반영된다. 특정 돌연변이는 T 세포에 대한 선택성 정도에 영향을 미친다. 또한, 상기 변화는 예를 들어 huKS-ala-IL2 에 비해 마우스에 투여되는 경우 전신적으로 더 적은 독성 부작용을 갖는 융합 분자, 예를 들어 huKS-ala-IL2(D20T) 또는 huKS-ala-IL2(N88R) 를 만든다. 또한 상기 변화는, 예를 들어 여러 마우스 종양 모델 내 종양 치료법에 있어서 적어도 보통 huKS-IL2 또는 huKS-ala-IL2 만큼 효과적인 융합 단백질, 예를 들어 huKS-ala-IL2(N88R) 을 만든다.

종양을 제거하기 위해 필요한 면역학적 반응이 복합적이고 또한 종양 유형마다 다양하므로, 감소된 독성을 갖는 분자가 사용되는 경우 분자로부터 기능성을 완전 제거하는 것이 바람직하지 않을 수 있다. 예를 들어, 결장 암종의 폐 전이가 유도된 마우스 모델에서, huKS-IL2 는 NK 세포를 필요로 하지 않는 T 세포 매개 기전에 의해 암을 효과적으로 치료하는 것으로 나타난 반면, 신경아세포종에 대한 마우스 모델에서, huKS-IL2 에 의한 종양의 제거는 T 세포가 아닌 NK 세포를 필요로 하는 것으로 나타났다. 따라서, NK 매개 반응을 여전히 허용하기 위해 선택성 프로파일이 보다 적절히 조절될 수 있는 경우가 있다. 본 발명의 하나의 구현예에 있어서, 보다 바람직한 접근법은 가장 바람직하게는 분자가 농축되는 부위에서, 다중 수용체 유형이 관여하는 반응이 여전히 성취되도록 분자의 선택성 프로파일을 미묘하게 변형시키는 것이다. 예를 들어, 본 발명은 IL-2Rβγ에 비해 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 대응하는 비개질 Ig-IL2 융합 단백질에 비해 2 내지 10 배, 10 내지 100 배, 100 내지 1000 배, 또는 1000 배 초과로 증강되는 Ig-IL2 융합 단백질의 변형을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적은 암 또는 감염성 질환의 치료를 위해 감소된 독성을 갖는 Ig-IL2 융합 단백질의 최적 사용을 제공하는 것이다. 변형된 선택성이 혈관 독성을 감소시킬 수 있지만, 융합 단백질의 용량 증가 시 치료적 지수의 최적 증가를 일으키지는 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 용량 증가는 면역 반응을 조절하는 네가티브 조절 기전을 유도할 수 있다. 따라서, 저독성 Ig-IL2 융합 단백질과 상기 효과를 감소시키는 제제를 조합하는 치료 양상을 이용하는 것이 유용할 수 있다.

최근 동정된 세포성 면역 반응의 하나의 강력한 저해제는 고친화도 IL-2R 을 발현하는 CD4⁺CD25⁺ 조절 T 세포 클래스이다 (개론으로 Maloy 및 Powrie, (2001) Nature Immunol. 2: 816 참조). 본 발명에 따르면, 증가된 용량의 저독성 Ig-IL2 융합 단백질은 부가적으로 상기 세포를 활성화시킬 수 있다. 자극 시, 상기 세포는 이들의 세포 표면 상의 CTLA-4 를 상향조절하며, 이는 면역 세포 상의 세포 표면 분자 B7-1 및 B7-2 를 구속하고, 다시 강력한 네가티브 신호를 일으킨다 (Takahashi 등, (2000) J. Exp. Med. 192: 303). 따라서, 상기 과정의 저해제는 본 발명의 융합 단백질과의 병용 치료법에 유용할 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, CTLA-4 및 그 효과를 중화시키는 항체가 사용될 수 있다. 또다른 구현예에 있어서, 유사 활성을 갖는 다른 단백질, 예컨대 가용성 B7 수용체 및 이들의 융합 단백질 (예컨대 B7-Ig) 이 사용될 수 있다. 추가 구현예에는 상기 조절 T 세포 자체를 죽이거나 저해하는 항체, 예컨대 항-CD4 및 항-CD25 의 사용이 포함된다. 바람직한 구현예에 있어서, 후자는 동시적이기 보다 순차적으로 투여된다.

본 발명에 따르면, 또다른 유용한 기전에는 면역 반응을 저해하는 것으로 공지된 프로스타글란딘을 생성시키는 시클로옥시게나아제 2 (COX-2) 의 과다자극이 관여된다 (PCT US99/08376 참조). 따라서, 추가 구현예에는 저독성 Ig-IL2 분자와 COX-2 저해제, 예컨대 인도메타신 (Indomethacin), 또는 보다 특이적인 저해제 셀레콕시브 (Celecoxib, Pfizer) 및 로페콕시브 (Rofecoxib, Merck & Co) 의 사용이 조합된다. 여전히 다른 면역 기전이 증가된 용량의 저독성 Ig-IL2 융합 단백질로 활성화될 수 있으며, 병용 치료법이 상기 기전을 유도하도록 고안될 수 있음이 이해된다. 또한, 저용량의 특정 세포독성 약물, 예컨대 생체 내에서 면역 증강 효과를 갖는 시클로포스파미드는 병용 치료법에 포함될 유용한 치료제일 수 있다.

알부민 융합은 증강된 혈청 반감기를 갖는 치료적 융합 단백질을 생성하기 위한 목적으로 개발되었다. 예를 들어, Yeh 등 (Yeh P 등, Proc Natl Acad Sci USA. [1992] 89: 1904-8) 은 대응하는 CD4 부분 단독에서보다 훨씬 더 긴 혈청 반감기를 갖는 알부민-CD4 융합 단백질을 구축하였다.

IL-2, 에리트로포이에틴, 인터페론-알파 및 기타 리간드로의 알부민 융합물을 구축하는 것이 유용하다. 상기 융합 단백질은 대응하는 리간드 단독에서보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 상기 융합물은 표준 유전자 조작 및 단백질 발현 기법을 이용하여, 리간드-알부민 융합물 또는 알부민-리간드 융합물에서와 같이 N- 에서 C-말단 방향으로 구축될 수 있다. 이와는 달리, 알부민 및 리간드는 화학적 콘쥬게이션에 의해 결합될 수 있다.

그러나, 알부민-리간드 융합 단백질은 종종 바람직하지 않은 특성을 갖는다. 이론에 구애받지 않고, 알부민-리간드 융합 단백질이 바람직하지 않은 특성을 가질 수 있는 하나의 이유는 혈관 내피 세포 상에 알부민에 대한 수용체가 존재한다는 점이다 (Tiruppathi 등, Proc Natl Acad Sci USA. [1996] 93: 250-4). 결과적으로, 혈관 내피 세포 상에서 리간드의 효과가 증강될 수 있다.

예를 들어, 알부민-IL2 융합 단백질은 증강된 혈청 반감기를 갖지만, 또한 증강된 혈관 유출이 야기된다. 이론에 구애받지 않고, 혈관계에서 IL-2 매개 반응의 활성화는 혈관계의 내피 세포 상에 존재하는 알부민 수용체로의 융합 단백질의 결합으로 인해 증가되는 것으로 주지된다. 알부민 및 IL-2 모두에 대한 수용체를 갖는 세포로의 알부민-IL2 융합 단백질의 결합은 세포 표면으로의 Ig-리간드 융합 단백질의 결합 증강에 대한 도 1b 에 나타낸 바와 유사한 기전으로 증강된다.

알부민-IL2 에 의해 야기되는 혈관 유출을 감소시키기 위해, IL-2Rβγ수용체에 대한 IL-2 의 친화도를 특이적으로 감소시키는 돌연변이를 IL-2 부분 내에 도입하는 것이 유용하다. 예를 들어, 알부민-IL2(N88R) 또는 알부민-IL2(D20T) 융합 단백질이 구축되어, 이어서 동물, 예컨대 마우스에서의 질환 모델에 대해 감소된 독성 및 증강된 치료적 지수를 갖는 것으로 나타났다.

본 발명의 분자는 악성종양 및 종양의 치료, 특히 고형 종양의 치료에 유용하다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 종양의 예는 난소암, 전립선암, 위암, 간암, 방광암, 두부암 및 경부암으로 제시되지만 이에 제한되는 것은 아닌 상피 기원의 종양이다. 마찬가지로, 본 발명에 따르면, 신경외배엽 기원의 악성종양 및 종양, 예컨대 이에 제한되지는 않는 흑색종, 소세포성 폐암종, 연조직 육종 및 신경아세포종이 치료에 적합한 후보이다.

본 발명에 따르면, 종양 부위 또는 악성종양 또는 전이 부위에 타겟팅될 치료제에 유용하다. 종양 또는 악성종양 세포가 우선적으로 제시하는 항원에 대한 항체를 포함하는 Ig-융합 단백질이 특히 유용하다. 예를 들어, EpCAM (예컨대, KS1/4), 또는 배아 피브로넥틴 (예컨대 BC1), 또는 CEA, 또는 염색질 복합체 (예컨대 NHS76), 또는 GD2 (예컨대 14.18), 또는 CD19, 또는 CD20, 또는 CD52, 또는 HER2/neu/c-erbB-2, 또는 MUC-1, 또는 PSMA 에 대한 특이성을 갖는 항체 부분을 포함하는 융합 단백질이 특히 유용하다. 또한, 다양한 바이러스 항원에 대한 항체가 특히 유용하다.

실시예 1: IL-2 코딩 서열 또는 항체 코딩 서열 내에 코돈 치환을 갖는 Ig-IL2 융합 유전자의 구축.

면역시토카인에 대한 발현 벡터는 [Gillies 등, (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203] 에 기재되어 있다. 뉴클레오티드 서열 내 여러 개질로 인간 γ-1 유전자의 3' 말단에 코딩 서열을 부가할 수 있었다. 중쇄를 코딩하는 인간 γ-1 유전자에 있어서, 번역 정지 코돈의 280 bp 상류에 위치한 XmaI 제한 부위를 침묵 돌연변이 (silent mutation, TCC 를 TCA 로) 를 도입하여 파괴하였다. 또다른 침묵 돌연변이 (TCT 를 TCC 로) 를 중쇄의 C 말단 라이신의 3 개 잔기 상류의 Ser 코돈에 도입하여, 새로운 XmaI 부위를 포함하는 서열 TCC CCG GGT AAA (서열 번호 4) 를 생성하였다 [Lo 등, (1998) Protein Engineering 11: 495-500].

IL-2 cDNA 는 화학적 합성으로 구축하였고, 이는 새로운 단일 PvuII 제한 부위를 포함하였다 [Gillies 등, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1428-1432]. XmaI 및 PvuII 부위는 모두 발현 벡터 내에서 단일하며, 이들은 하기를 포함하는 항체-IL2 변이체의 구축을 촉진하였다.

1) huKS-ala-IL2. huKS-ala-IL2 의 구축은 예전에 기재되어 있다 (예컨대 WO01/58957). 생성 단백질은 Ig 중쇄 불변 영역 및 성숙한 huIL-2 간 연결부에 아미노산 치환을 포함하였다. 연결부는 보통 서열 SPGK-APT (서열 번호 5) 를 가지며, 여기서 -SPGK- 는 중쇄의 C-말단이고, -APT- 는 성숙한 IL-2 단백질의 N-말단이었다. huKS-ala-IL2 에서, K 의 A 로의 치환이 도입되어 (위치 K[-1] 로 언급됨) 연결부가 이제 서열 SPGA-APT (서열 번호 6) 를 갖게 되었다. 결과적으로, 상기 단백질의 혈청 반감기가 개선되었다 (실시예 5 참조).

2) dI-KS-ala-IL2. 상기 KS-IL2 융합 단백질은 잠재적인 T-세포 에피토프가 제거된 버전의 융합 단백질을 생성하는 KS-ala-IL2 내 치환을 포함하였다 (공동 계류중인 특허 출원 U.S.S.N. 10/112,582 및 10/138,727 에 기재되어 있으며, 그 전체 개시가 본원에 참고로 도입된다).

본 발명의 융합 단백질의 Ig 부의 불변 영역은 보통 가변 영역과 연합된 불변 영역, 또는 상이한 서브클래스의 IgG 분자 또는 상이한 종으로부터의 가변 및 불변 영역을 포함하는 Ig 부와의 융합 단백질을 만드는 상이한 불변 영역으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, IgG 의 감마 4 불변 영역 (서열 번호 7) 이 감마 1 불변 영역 (서열 번호 8) 대신 사용될 수 있었다. 변형은 감마 4 사슬이 더 긴 혈청 반감기를 가질 수 있는 이점을 가졌다. 따라서, IgG 감마 2 불변 영역 (서열 번호 9) 이 또한 IgG 감마 1 불변 영역 (서열 번호 8) 대신 사용될 수 있었다. 또한, IgG 감마 1 유래의 힌지 영역 (서열 번호 10) 이 IgG 감마 2 (서열 번호 11) 또는 IgG 감마 4 불변 영역 (서열 번호 12) 에서 보통 생성되는 힌지 영역을 대체할 수 있었다. 융합 단백질의 Ig 성분은 또한 IgG 가 하나 이상의 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII 에 대해 감소된 결합 친화도를 갖도록 불변 영역 내에 돌연변이를 포함할 수 있었다. 본 발명의 융합 단백질은 잠재적인 글리코실화 부위 및 T-세포 에피토프를 제거하기 위해 IgG 불변 영역 내 돌연변이를 포함할 수 있었다. 예를 들어, 다양한 불변 영역에는 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하기 위해 불변 영역의 C-말단부 내에 변형을 포함할 수 있었다. 예를 들어, IgG 분자의 다양한 불변 영역의 C-말단부 내의 잠재적인 T-세포 에피토프는 IgG 감마 1 및 IgG 감마 2 불변 영역 내 아미노산 서열 KSLSLSPGK (서열 번호 13) 및 IgG 감마4 불변 영역 내 아미노산 서열 KSLSLSLGK (서열 번호 14) 을 아미노산 서열 KSATATPGA (서열 번호 15) 로 변화시켜 제거되었다.

3) huKS-ala-IL2(N88R). 상기 huKS-IL2 변이체에는 상술된 바와 같은 성숙한 huIL-2 및 Ig 중쇄 불변 영역 간의 연결부에서 동일한 아미노산 치환 (K[-1]A, AAA 에서 GCC 로의 코돈 변화에 의해 생성됨) 이 포함되며, 또한 성숙한 huIL-2 서열 내 위치 N88 에서 R 을 선호하는 치환 (aAT 에서 aGG 로의 코돈 변화에 의해 생성됨) 이 포함되었다. 추가 변형은 침묵 돌연변이 (아미노산 위치 G98, 코돈은 ggA tcc 에서 ggC tcc 로 스위치됨) 를 도입함으로써, BamHI 에 대해 존재하는 제한 부위를 제거하기 위해 huIL-2 의 뉴클레오티드 서열 내에 도입되었다.

PCR-기반 돌연변이화 전략이 huKS-ala-IL2(N88R) 의 구축에 이용되었다. 성숙한 huIL2 의 코딩 서열에 걸친 2 개의 겹치는 PCR 절편을 주형으로서 Bluescript 벡터 (Stratagene) 내 huIL2 을 이용하여 생성하였다. 상류 PCR 절편에는 상기 돌연변이를 각각 센스 및 안티센스 프라이머 내로 도입함으로써 K[-1]A 및 N88R 을 코딩하는 뉴클레오티드 변화가 포함되었다. 상기 변화는 프라이머 서열 내 진한 뉴클레오티드로 나타내었다. 센스 프라이머 서열은 하기와 같았다: 5'CCCCGGGTGCCGCCCCAACTTCAAGTTCTACA3'(서열 번호 16); 안티센스 프라이머 서열은 하기와 같았다: 5'A G CCCTTTAGTTCCAGAACTATTACGTTGATCCTGCTGATTAAGTCCCTAGGT3' (서열 번호 17). 밑줄친 뉴클레오티드는 BamHI 부위를 파괴하는 변화를 나타내었다. 두번째로, 하류 PCR 절편에는 상류 PCR 절편과의 20 개 뉴클레오티드의 겹치는 영역 및 나머지 IL2 서열이 포함되었다. 상기 반응에 사용되는 센스 프라이머는 하기와 같았다: 5'AGTTCTGGAACTAAAGGG C TCCGAAACAACATTCATGTGT (서열 번호 18). 다시, 밑줄친 뉴클레오티드는 BamHI 부위를 파괴하는 침묵 돌연변이를 나타내었다. 사용된 안티센스 프라이머는 pBluescript 벡터 내 서열과 어닐링하는 표준 M13 역방향 프라이머였다. 상기 겹치는 PCR 절편이 서열 번호 16 의 프라이머 및 M13 역방향 프라이머와의 반응에 사용되어 최종 PCT 산물을 생성하고, 이어서 이를 TA 벡터 (Invitrogen) 내로 삽입하였다.

삽입된 절편의 서열을 확인하고, 개질된 IL2 서열을 포함하는 442 bp Xma I/Xho I 절편 (플라스미드 TA-IL2(N88R) 유래) 을 이용하여, 부모 면역시토카인 발현 플라스미드 내 야생형 huIL-2 서열 (huKS-IL2 를 코딩함) 을 대체하였다. huKS-ala-IL2(N88R) 을 코딩하는 생성 면역시토카인 발현 플라스미드를 제한 맵핑 및 서열분석으로 확인하였다.

4) huKS M1-IL2(TTSR (서열 번호 19)). 면역시토카인 변이체 huKS M1-IL2 를 표준 재조합 DNA 기법에 의해 구축하였다 (예컨대 공동 계류 중인 특허 출원 U.S.S.N. 10/112,582 에 기재되며, 그 전체 개시가 본원에 참고로 도입됨). 이것은 융합 단백질의 항체 IL-2 연결부 영역 내에 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하고 면역원성이 더 적은 단백질을 만드는 다중 아미노산 치환을 포함하였다. 서열은 KSLSLSPGA-APT (서열 번호 20) 에서 KSATATPGA-APT (서열 번호 21) (대시는 Ig/IL-2 연결부 부위를 나타내며, 치환된 아미노산은 밑줄을 쳤음) 로 변화되었고, "M1" 로 나타내었다. 또한 상기 변이체에는 연결부 앞의 마지막 아미노산에서, 면역시토카인의 혈청 반감기를 증가시키는 것으로 나타난 K 에서 A 로의 변화가 도입되었다.

huKS M1-IL2(TTSR) 은 추가로 면역시토카인의 IL-2 부 내에 위치한 아미노산 치환을 포함하였다. 상술된 N88R 치환에 의해 생성된 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하기 위해, 서열을 천연 huIL-2 의 -DLISNI- (서열 번호 22) 에서 -DTTSRI- (서열 번호 23) 로 변화시켰다.

PCR 기반 돌연변이화 접근법을 이용하여, 돌연변이를 센스 프라이머 내로 도입함으로써 huIL-2 유전자의 뉴클레오티드 서열 내에 변화를 도입하였다. 서열 TTxR 은 각각 코돈 변화 ACC, ACC 및 AGG 에 의해 생성되었다. huIL-2 서열의 3' 말단을 포함하는 돌연변이화 197 bp PCR 절편은 서열 5'ACTTAAGACCTAGGGACACCACCAGCAGGATCAACGTAATAGT3' (서열 번호 24) 의 센스 프라이머 및 서열 5'ATCATGTCTGGATCCCTC3' (서열 번호 25) 의 안티센스 프라이머를 사용하여 주형인 huKS-ala-IL2(N88R) 을 코딩하는 면역시토카인 발현 플라스미드로부터 생성되었다. PCR 절편을 TA 벡터 내로 클로닝하고, 서열을 확인하였다. 완전한 IL-2 서열을 재생시키기 위해, 상기 절편을 Afl II/Xho I 제한 소화물로서 huKS-ala-IL2(N88R) 을 코딩하는 면역시토카인 발현 플라스미드로부터 수득되는 2 kb Hind III/Afl II 절편에 접합하고 Hind III/Xho I 제한 pBluescript 벡터 내에 삽입하였다. 이어서, 돌연변이화 IL-2 유전자를 3-웨이 접합으로, KS M1-IL2 를 코딩하는 면역시토카인 발현 플라스미드 내 천연 huIL-2 서열 대신에 교환하였다.

5) huKS(N 에서 Q 로)-IL2. huKS(N 에서 Q 로)-IL2 를 코딩하는 면역시토카인 발현 플라스미드를 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 구축하였다. huKS(N 에서 Q 로)-IL2 는 항체 Fc 감마 1 불변 영역의 CH2 도메인 내에 N-연결 글리코실화를 제거하는 아미노산 치환을 포함하였다. 아미노산 서열을 QYNSTYR (서열 번호 1) 에서 QYQSTYR (서열 번호 26) 로 변화시켰고, 치환된 아미노산을 진하게 나타내었다. 유사하게, 아미노산 서열 QFNST (서열 번호 2) 를 QAQST (서열 번호 27) 로 변화시키는 돌연변이를 포함하는, 감마 2 및 감마 4 불변 영역을 포함하는 융합 단백질 구축하여, 잠재적 T 세포 에피토프를 추가로 제거하였다.

실시예 2: 개질된 수용체 특이성을 만드는 Ig-IL2 융합 단백질의 화학적 또는 효소적 개질:

본 실시예에는 PEG 화 huKS-IL2 또는 탈글리코실화 huKS-IL2, 및 이들의 변이체를 생성하는데 사용된 면역시토카인의 생화학적 조작이 기재되어 있다. 동일한 방법이 다른 IL-2 융합 단백질, 에컨대 면역시토카인 14.18-IL2 또는 알부민-시토카인 융합물에 적용될 수 있다. 상기 변이체는 후속 실시예에서 세포 기반 생분석에서 다양한 세포주의 증식 반응에 대한 이들의 효과 (표 1) 또는 분자의 약동역학 특성을 조사하는데 사용되었다.

huKS-IL2 의 PEG 화. PEG (20,000) 를 단백질 상에 존재하는 아민기를 통해 단백질에 공유 부착하였다. 상기 목적을 위해, 숙신이미드 링커를 포함하는 PEG 의 반응성 유도체 (mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트, 하기에서 "SPA-PEG" 로 명명됨) 를 사용하였다. huKS-IL2 를 50 mM 인산나트륨 (pH 7.5), 0.05% Tween 80 으로 이루어진 무아민 완충액 중에서 대규모로 투석하여 농축하였다. 과량의 SPA-PEG 를 huKS-IL2 와 5:1 또는 10:1 의 몰비로 조합하였다. 사용 직전에, 5 mM SPA-PEG 스톡 용액을 탈이온수 중에 제조하였다. 적절한 부피의 SPA-PEG 용액을 huKS-IL2 와 조합하고, 반응물을 실온에서 30 내지 40 분 동안 록킹 플랫폼에서 인큐베이션하였다. 5 내지 10 몰 과량의 글리신을 첨가하여 반응을 켄칭하고, 반응 산물을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 50 mM HEPES 및 150 mM NaCl 로 평형화된 Superdex 200 칼럼에 반응 샘플을 로딩하고, PEG 화 단백질을 포함하는 용출 분획을 모아서 농축하였다.

huKS-IL2 의 N-글리카나아제 처리. huKS-IL2 (1.5 mg) 를 37℃ 에서 하룻밤 동안 30 mU PNGaseF (New England Biolabs) 와 인큐베이션하였다. 반응 산물을 단백질 A-Sepharose 칼럼을 통해 통과시키고 결합된 huKS-IL2 를 pH 3 에서 용출하여 정제하였다. 용출액을 중화하고, PBS 및 0.05% Tween8O 의 완충액 내 스핀 칼럼 중에서 농축하였다. huKS-IL2 의 탈글리코실화를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 및 요소 겔 상에서 확인하였다.

실시예 3: Ig-IL2 및 Ig-IL2 변이체의 발현 및 정제

huKS-ala-IL2(N88R) 에 대해 상술된 일반 절차를 시토카인을 돌연변이시키기 위한 Ig-융합물을 포함하는 광범위한 Ig-시토카인 융합 단백질에 대해 이용할 수 있었다. huKS-ala-IL2(N88R) 을 발현하는 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 수득하기 위해, huKS-ala-IL2(N88R) 을 코딩하는 면역시토카인 발현 플라스미드의 DNA 를 전기천공화에 의해 마우스 골수종 NS/O 세포 내로 도입하였다. NS/O 세포를 10% 열로 불활성화된 소태아 혈청, 2 mM 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지 내에서 키웠다. 약 5 ×10⁶ 개 세포를 단회 PBS 로 세척하고, 0.5 ml PBS 중에 재현탁하였다. 이어서, 10 ㎍ 의 선형화 플라스미드 DNA 를 얼음 상에서 10 분 동안 Gene Pulser Cuvette (0.4 cm 전극 갭, BioRad) 내 세포와 인큐베이션하였다. 0.25 V 및 500 μF 설정의 Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) 를 이용하여 전기천공화를 수행하였다. 세포를 얼음 상에서 10 분 동안 회복하도록 방치한 후, 이들을 성장 배지 중에 재현탁하고, 96 웰 플레이트 상에 접종하였다. 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 트랜스펙션 2 일 후 성장 배지에 첨가된 100 nM 메토트렉세이트 (MTX) 의 존재 하 성장에 의해 선택하였다. 세포에 매 3 일 마다 2 내지 3 회 배지를 공급하였으며, MTX 내성 클론은 2 내지 3 주 내에 나타났다. 클론으로부터의 상청액을 항-Fc ELISA 로 분석하여, 고 생산 클론을 동정하였다. 고 생산 클론을 단리하고, 100 nM MTX 를 포함하는 성장 배지 중에서 증식시켰다.

면역시토카인을 단백질 A 친화도 칼럼 크로마토그래피에 의해 조직 배양 상청액으로부터 정제하였다. huKS-ala-IL2(N88R) 에 있어서, 재조합 단백질 A (rPA) Agarose 칼럼을 10 배 부피의 주행 완충액, 예컨대 100 mM 아르기닌, 5 mM 시트레이트, 0.01% Tween 80, pH 5.6 으로 사전 평형화시키고, 칼럼에 huKS-ala-IL2(N88R) 을 포함하는 여과된 세포 배양 상청액을 16 ml/분으로 대략 40 mg/ml 의 결합된 rPA 수지에 로딩하였다. 칼럼을 동일한 완충액으로 대규모로 세척하고, 최종적으로 면역시토카인을 pH 3 에서 50 mM 글리신으로 용출하였다. 피크 분획을 수집하고, pH 를 1 N NaOH 로 중화시켰다.

실시예 4: 생분석에서 Ig-IL2 변이체의 활성.

세포 기반 생분석에 있어서, 성장을 위해 IL-2 에 의존하는 세포주를 이용하였으며, Ig-융합 단백질, 예를 들어 huKS-IL2 및 huKS-IL2 변이체의 활성을 상기 세포의 증식으로 평가하였다. 예를 들어, CTLL-2 (ATCC# TIB-214; Matesanz 및 Alcina, 1996) 및 TF-1β(Farner 등, [1995] Blood 86: 4568-4578) 를 사용하여 T 세포 반응 및 NK 세포-유사 반응을 추적하였다. CTLL-2 는 고친화도 IL-2Rαβγ를 발현하는 쥐과 T 림프모세포 세포주이며, TF-1β는 중간 친화도 IL-2Rβγ를 발현하는 미성숙 전구 적혈모세포 유래의 인간 세포주이다. 상기 분석을 위해 유용한 또다른 세포주는, 예를 들어 인간 성인 T 세포 림프종 유래 세포주 Kit-225 (K6) (Uchida 등, [1987] Blood 7O: 1069-1072) 이다. 세포주 TF-1β 와 함께, 융합 단백질의 활성은 동일한 포유류종의 수용체를 보유하는 한쌍의 세포주에서 평가되었다. 상기 분석은 또한 IL-2Rβγ를 갖는 NK-세포를 단리하거나 IL-2Rαβγ를 발현하는 활성화된 T 세포를 생성하기 위해, 인간 PBMC (말초 혈액 단핵 세포) 유래 세포군으로 수행될 수 있었다. hu PBMC 로부터 상기 세포군을 단리하는 기법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, T 세포, 또는 PHA-배아는 10 ㎍/ml 의 피토헤마글루티닌 중에서 3 일 동안 PBMC 를 배양하여 수득된다 (PHA-P; L9017, Sigma, St. Louis). 휴면 NK 세포는 통상 네가티브 선택 프로토콜에 의해, 예를 들어 인간 세포에 대한 NK-세포 단리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) 를 이용하여 상업적으로 수득되었다. 마우스 종양 모델에서 수득되는 결과와 상기 융합 단백질의 활성을 연관시키기 위해서는, 하나 또는 다른 하나의 IL-2 수용체 복합체를 발현하는 마우스에서 수득되는 세포군 상에서 상기 분석을 수행하는 것이 또한 유용하다. 예를 들어, NK 세포군은 SPINSEP^TM 쥐과 NK-세포 농축 키트 (Stemcell Technologies Inc, Vancouver, BC, Canada) 를 이용한 재조합 결핍 (SCID) Balb/C 마우스의 비장으로부터 수득될 수 있다. 임의의 상기 농축 군의 순도는 FACS 분석으로 평가될 수 있다.

간단하게, 세척된 세포를 10,000 개 세포/웰의 밀도로 96 웰 마이크로타이터 플레이트 상에 접종하고, 예를 들어 정제된 huKS-IL2 또는 huKS-IL2 변이체로 보충된 세포 배지 중에서 인큐베이션하였다. 또한, R&D Systems (Minneapolis, MN) 에서 입수한 야생형 huIL-2 단백질을 표준물질로서 분석하였다. 첨가된 단백질은 0.45 ng/ml 내지 420 ng/ml 사이에서 대략 1000 배 농도에 걸쳐 일련의 희석물로 제조되었다 (IL2 의 몰 당량에 대해 표준화함). 32 시간 후, 0.3 μCi 의 [메틸-3H]티미딘 (Dupont-NEN-027) 을 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 추가 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 수획하고, 유리 필터 상에서 용해시켰다. DNA 내로 도입된 3H-티미딘을 신틸레이션 카운터 내에서 측정하였다.

용량 반응 곡선을 도시하고 최대 반응의 절반을 일으키는 단백질 농도를 확인하여, 세포 증식과 관련하여 각각의 huKS-IL2 단백질 변이체에 대한 ED50 값을 수득하였다. 반응의 선택성을 ED50 값의 비, 예를 들어 ED50[TF1-β]/ED50[CTLL-2] 로 표시하였다. 따라서, 높은 ED50 비는 상대적으로 더 높은 용량의 단백질이 CTLL-2 세포 반응에 비해 TF-1β반응을 일으키는데 필요하다는 것을 나타낸다. huKS-IL2 변이체의 ED50 값의 비를 자유 huIL-2 및 부모 huKS-IL2 단백질과 비교하였다. 상기 표준화 값은 차별적 효과의 척도이다. 참고 단백질에 대해 수득된 것보다 더 큰 값은 CTLL-2 세포로의 선택성 이동을 나타내었다. 일부 경우에 있어서, 동일한 종에서 유래된 세포주로 ED50 비를 수득하는 것은 IL-2 활성이 이들의 수용체와의 상호작용에 있어서 종간 차이에 의해 부가적으로 영향받지 않으므로, 바람직할 수 있다. 하기 예에서는 Ig-IL2 융합 단백질 및 자유 IL-2 의 ED50 비를 계산하기 위해 쥐과 CTLL-2 및 인간 TF-1β세포를 이용하였으며, 상기 실험의 대표적 결과를 표 1 에 나타내었다.

상기 실시예에 있어서, 자유 IL-2 로 수득된 ED50 비 (0.81) 와 비교하여, 대략 5 배 더 낮은 ED50 비 (0.17) 가 huKS-IL2 로 수득되었다. 이는, 융합 단백질의 선택성 프로파일이 이동하였으며, TF-1β세포 쪽으로 더 큰 선택성을 나타냄을 시사하였다. 상이한 항체/IL-2 조합인 14.18-IL2 도 또한 IL-2 단독에 비해 TF-1β에 대해 보다 선택적이었으며 (ED50 비 0.07), 상기 효과가 항체-IL2 융합 단백질에 포함된 특정 항체에 제한되지 않고, huIL-2 에 비해 쥐과 고친화도 수용체를 갖는 세포에 대한 인간 Ig-IL2 융합 단백질의 감소된 활성이 Ig-IL2 융합 단백질의 일반적 특징을 반영할 수 있음을 시사하였다.

다른 변이체는 CTLL-2 세포 반응이 선호되도록 하는 변형된 ED50 비를 가졌다. huKS-ala-IL2(N88R) 로 현저한 효과가 나타났으며, 그 ED50 비는 2000 을 초과하여 중간 친화도 수용체에 의해 상기 세포에서 매개되는 TF-1β세포 증식이 거의 검출할 수 없음을 반영하였다. 따라서, huKS-ala-IL2(N88R) 은 IL-2Rαβγ를 갖는 세포의 신호화를 활성화시키지만, IL-2Rβγ를 갖는 세포는 유의미하게 활성화시키지 않았다. huKS-ala-IL2(N88R) 의 활성은 또한 쥐과 IL-2Rβγ복합체를 발현하는 정제된 쥐과 NK 세포 상에서 분석할 수 있었으며; 마우스 T 및 NK 세포가 조사된 경우 선택성이 실질적으로 소실됨을 나타내는 (Wetzel 등, ASCO 2001 회의 초록 참조) 자유 인간 IL2(N88R) 단백질에 대해 보고된 바와는 대조적으로- 마우스 NK 세포에서 huKS-ala-IL2(N88R) 에 대한 ED50 값은 TF-1β세포로 관찰되는 것과 유사하였다.

CTLL-2 세포에 대한 반응 선택성의 미묘한 이동이 융합 단백질 항체부의 글리코실화에 영향을 미치는 변형을 갖는 Ig-IL2 변이체에서 관찰되었다. 구체적으로, 항체의 Fc 부 내에 글리코실화 부위가 없는 KS(N 에서 Q 로)-IL2 는 huKS-IL2 에 비해 ED50 비의 3 배 증가 (0.72) 를 나타낸 반면, N-글리카나아제가 처리된 huKS-IL2 는 huKS-IL2 에 비해 2 배 증가 (ED50 비 0.45) 를 나타내었다. 마찬가지로, 상이한 항체 분자에 융합된 IL-2 의 N-글리카나아제 처리는 유사한 결과를 나타내었다; 예를 들어, N-글리카나아제 처리된 14.18-IL2 는 비처리 14.18-IL2 에 비해 ED50 비의 3 배 증가를 나타내었다. 상기 결과는, 분자의 항체 부 내 특정 변형 자체가 이에 융합된 IL-2 분자의 결합 및 활성화 특성에 영향을 미침을 시사하였다.

융합 단백질의 PEG 화는 또한 그 선택성 프로파일을 변형시켰다. 다시, CTLL-2 자극 활성에 대한 이동이 관찰되었다. huKS-IL2 에 있어서, PEG 화 변이체는 CTLL-2 세포를 선호하는 선택성에 있어서 9 배 증가 (ED50 비 1.99) 를 나타내었고, 14.18-IL2 에 있어서 PEG 화에 의해 20 배 증가가 유도되었다 (ED50 비 1.34).

일부 경우에 있어서, 주어진 단백질에 대한 상기 선택성 이동은 또한 표 2 에 나타낸 대표적 결과에서 예시되는 바와 같이, 분석에 사용된 특정 조합의 세포 유형을 반영할 수 있었다. 예를 들어, KS-IL2, KS-ala-IL2 및 IL-2 가 쥐과 CTLL-2 대신 인간 IL-2Rαβγ를 갖는 세포주 Kit 225 를 이용하여 비교되는 경우, 선택성 이동 패턴은 유지되지 않았다. 특히 Kit 225 세포에 관하여, 상기 3 개 단백질은 본질적으로 동일한 활성을 나타내었다. 그러나 대개, TF-1β세포 및 Kit-225 세포 간 Ig-IL2 변이체의 선택성 반응에 있어서의 경향은 Ig-IL2 융합 단백질의 Fc-부분의 탈글리코실화 효과를 포함하여, TF-1β세포 및 CTLL-2 세포로 구축된 것에서와 유사한 것으로 나타났다. (대표적 결과는 하기 표 2 및 실시예 10 에서 참조).

또한, Kit-225 세포는 CTLL-2 세포에 비해 IL-2 및 IL-2 융합 단백질과 이들의 변이체에 보다 민감한 것으로 나타났다. 예를 들어, huKS-ala-IL2 에 대한 ED50 값은 Kit 225 세포에서 0.08 및 CTLL-2 세포에서 5.0 이었고, KS-ala-IL2(N88R) 에 대해서는 Kit 225 세포에서 0.13 및 CTLL-2 세포에서 3 으로, 상기 분석에서 Kit-225 세포의 민감도에 있어 대략 10 - 50 배 증가를 시사하였다. 따라서, 주어진 단백질에 대한 ED50 비의 값은 사용되는 특정 조합의 세포 유형에 근거하였다.

실시예 5: 개질된 수용체 결합 특징을 갖는 IL-2 융합 단백질의 약동역학

huKS-ala-IL2(N88R) 의 약동역학 (PK) 프로파일을 huKS-ala-IL2 및 huKS-IL2 의 프로파일과 비교하였다. 각각의 단백질에 대하여, 3 마리의 6-8 주령 마우스를 사용하였다. PBS 중에 125 ㎍/ml 로 희석된 25 ㎍ 의 융합 단백질을 마우스의 꼬리 정맥으로 주사하고, 주사 직후 (0 시간) 및 주사 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 24 시간 후에 역궤도 (retro-orbital) 방혈에 의해 50 ㎕ 혈액 샘플을 수득하였다. 혈액 샘플을 헤파린이 코팅된 튜브 내에 수집하여 핼액 응고를 예방하고, 후-세포성 혈장 상청액 중 면역시토카인 수준을 ELISA 분석으로 측정하였다. 약동역학 연구에 사용된 ELISA 분석 절차는 이전에 기재되어 있다 (WO01/58957). 상기 분석은 온전한 면역시토카인의 존재를 측정하였다. 혈장으로부터 면역시토카인의 포획은 EpCAM-코팅 플레이트 상에서 수행하였고, 검출은 IL-2 에 대한 HRP-콘쥬게이션된 항체로 수행하였다. 연결부에 K 에서 A 로의 치환을 갖는 huKS-IL2 변이체 huKS-ala-IL2 가 huKS-IL2 에 비해 순환 반감기가 현저히 개선됨이 이미 나타나 있다 (WO01/58957). 실제로, huKS-ala-IL2(N88R) 의 순환 반감기는 유사하게 개선된 것으로 나타나서, 분자의 IL-2 부 내 N88R 변형이 약동역학 상에 실질적 효과를 갖지 않음을 시사하였다. 대표적 실험 결과를 도 2 에 나타내었다. 도 2 는 24 시간에 걸쳐 혈청 중에 존재하는 면역시토카인 농도의 시간 경과를 나타내었다 (정맥내 투여 직후 존재하는 출발 농도에 대해, 혈청 중에 존재하는 단백질 농도의 백분율로 나타냄). 단백질 농도는 면역시토카인이 그 항체 부분에 의해 포획되고 그 시토카인 부분에 의해 검출되는 ELISA 분석으로 결정되었다. X-축 = 시간 t (시간); Y 축 = log(잔여 단백질 농도%).

실시예 6: 포유류에서 개질된 수용체 결합 특징을 갖는 Ig-IL2 융합 단백질의 독성

마우스에서 KS-IL2 변이체 huKS-IL2, huKS-ala-IL2, 및 huKS-ala-IL2(N88R) 의 상대적 독성을 조사하였다. 실시예 5 에 나타낸 바와 같이, huKS-ala-IL2 및 huKS-ala-IL2(N88R) 는 huKS-IL2 와 비교하는 경우 실질적으로 증가된 PK 를 가졌다. 역시 비교 목적을 위해, PK 의 차이에도 불구하고 상이한 분자에 대해 동일한 투여 스케줄을 이용하였다. 더 긴 혈청 반감기는 치료제의 효능을 증가시킬 수 있지만, 또한 증가된 독성을 야기할 수 있다. 그러나 이 실시예는, huKS-ala-IL2 가 huKS-IL2 에 비해 증가된 독성을 갖는 반면 (더 긴 순환 반감기 때문에), huKS-ala-IL2(N88R) 은 더 긴 순환 반감기에도 불구하고 huKS-IL2 에 비해 감소된 독성을 갖는 것을 나타내었다.

Balb/C 마우스 (실험 조건 당 3 마리 동물) 에 연속 5 일 동안 3 개 단백질 중 하나를 매일 정맥내 주사하였다. 융합 단백질을 200 ㎕ 의 PBS 중에 희석하고, 하기 투여량으로 투여하였다: huKS-IL2 및 huKS-ala-IL2 는 마우스 당 25, 50, 또는 75 ㎍, 및 huKS-ala-IL2(N88R) 은 마우스 당 50, 75, 또는 100 ㎍. 대조군에는 PBS 를 정맥내 주사하였다. 마우스의 생존을 매일 모니터링하고, 마우스 생존에 대한 효과를 조사하였다. 마우스는 모든 용량의 huKS-IL2 투여에서 생존하였다. 그러나, huKS-ala-IL2 는 보다 독성을 가졌다. 마우스는 25 ㎍ 용량의 huKS-ala-IL2 를 관용하지만, 3 마리 마우스 모두 50 ㎍ 용량에서 6 일째에 죽었고, 75 ㎍ 용량에서 2 마리 마우스가 4.5 일째에 죽었으며, 세번째 마우스는 5 일째에 죽었다. 반면에 huKS-ala-IL2(N88R) 는 100 ㎍ 을 포함하는 모든 용량에서 잘 관용되었다. 사실상, huKS-ala-IL2(N88R) 은 또한 마우스 당 200 ㎍ 의 용량으로 투여되었고, 마우스는 생존하였다. 즉, huKS-ala-IL2(N88R) 은 huKS-ala-IL2 에 비해 유의미하게 독성이 더 적었다.

huKS-ala-IL2 로의 처리 과정에서 죽은 마우스를 해부하고, 이들의 기관을 검사하였다. 폐, 비장, 간, 위 및 신장을 포함하는 모든 기관은 광범위한 혈관 유출을 시사하며 전체적으로 팽창되어 있었다. 변이체 huKS-ala-IL2(N88R) 로 처리된 동물의 기관을 또한 검사하였다. 마우스는 상술된 바와 같이 처리하였고, huKS-ala-IL2(N88R)-처리 동물로부터의 기관 무게는 특히 폐 및 간에 대해 대조군 동물에서와 일반적으로 유사함을 발견하였다. 이론에 구애받지 않고, 비장 중량의 증가는 혈관 유출 보다는 상기 인간 단백질에 대한 항체 면역 반응에 의해 야기되는 세포성의 증가에 보다 기인할 것으로 생각되었다. huKS-ala-IL2(N88R) 이 huKS-ala-IL2 에 비해 덜 심각한 혈관 유출을 일으키는 것으로 추측되었다. 표 3 에는 대조군 마우스의 기관에 대한 기관 중량의 x 배 증가에 대한 근사치의 예가 제공된다.

이들의 면역계 구성에 공지된 변형을 갖는 다양한 마우스 계통 배경의 효과를 상기 Ig-IL2 융합 단백질의 독성에 대해 평가하였다. 마우스 계통 DBA/2, Balb/C, B6.CB17-Prkdc^scid/SzJ (SCID), 베이지, 및 SCID/베이지를 이용하였다. 융합 단백질은 상기에서와 같이, huKS-ala-IL2 에 대해 마우스당 25 ㎍ 내지 50㎍ 용량, 및 huKS-ala-IL2(N88R) 에 대해 마우스 당 200 ㎍ 용량으로 투여하고, 2 주 기간에 걸쳐 마우스 생존 및 중량을 평가하였다.

huKS-ala-IL2 의 경우, 대부분의 마우스 계통은 상기 보고된 Balb/C 마우스에서 나타나는 것과 유사한 결과를 나타내었다: 50 ㎍ 용량은 5 일째에 동물을 죽게 했지만, 더 낮은 용량에서 동물은 생존하였으며, 이들의 중량은 이들의 초기 중량 근처로 회복되었지만 비처리 대조군 동물의 중량 증가에는 도달하지 못했다. 흥미롭게도, 기능적 NK 세포가 결손된 베이지 마우스는 50 ㎍ 의 고용량을 더욱 잘 관용할 수 있었다; 2 마리 동물은 9 일째에 죽었지만, 초기에 상당한 중량 (7 일째에 25%) 을 잃은 한 마리는 회복되었고, 15 일째에 비처리 동물 및 저용량으로 처리된 동물의 체중에 도달하였다. DBA/2 마우스는 huKS-ala-IL2 에 보다 민감하였다; 더 낮은 용량에서도, DBA/2 동물은 5 일째 및 9 일째에 죽었다.

huKS-ala-IL2(N88R) 에 대해, DBA/2 마우스의 Ig-IL2 융합 단백질로의 증가된 감수성 또한 자명하였다: 8 일째에, 모든 동물이 죽었고, 절반 용량 (100 ㎍) 에서도 동물들은 9 일째에 죽었다. 다시, 융합 단백질은 베이지 마우스에서 가장 잘 관용된 반면, SCID/베이지 마우스는 상당한 중량을 잃었다 (10 일째에 비처리 대조군의 80% 근처에서 안정하게 유지됨).

실시예 7: 포유류에서 다양한 종양의 처리에 있어서 개질된 수용체 결합 특징을 갖는 Ig-IL2 융합 단백질의 효능.

a) Balb/C 마우스에서 CT26/KSA 피하 종양의 처리. 인간 KS 항원 (KSA) 을 코딩하는 유전자가 형질도입된 CT26 결장 암종 세포를 사용하여 피하 종양을 유도하였다. 2 ×10⁶ 개 생존 세포를 100 ㎕ 의 PBS 중에 현탁하고, 6 주령 Balb/C 마우스의 등 내로 피하 주사하였다. 종양 크기가 100 - 200 mm³ 에 도달하면, 8 마리 마우스군을 하기 3 개 조건 중 하나로 처리하였다: 연속 5 일 동안, 200 ㎕ PBS 중에 희석된 15 ㎍ 의 huKS-ala-IL2 또는 huKS-ala-IL2(N88R), 또는 PBS 단독의 정맥내 주사를 투여하였다. 질환 진행은 50 일 동안 1 주에 2 회 종양 부피를 측정하여 평가하였다. 대조군 동물에 있어서, 종양 부피는 지속적으로 증가하여, 32 일째 근처인 희생 시점에서 대략 3500 내지 6000 mm³ 크기에 도달하였다. 대조적으로, 두 실험군에 대한 종양 부피는 50 일까지 본질적으로 일정하게 남아 있어서, huKS-ala-IL2(N88R) 이 종양 성장의 예방에 있어서 huKS-ala-IL2 만큼 유효함을 시사하였다.

b) C57BL/6 마우스에서 LLC/KSA 피하 종양의 처리. 제 2 종양 모델에 있어서, KS 항원을 코딩하는 유전자가 형질도입된 Lewis 폐 암종 세포를 이용하여 피하 종양을 유도하였다. EpCAM을 발현하는 1 ×10⁶ 개 생존 LLC 세포를 100 ㎕ 의 PBS 중에 현탁하고, 6-8 주령의 C57BL/6 마우스 등 내로 피하 주사하였다. 종양 크기가 100-150 mm³ 에 도달하면, 투여 용량이 주사 당 20 ㎍ 으로 증가된 것을 제외하고, 8 마리 마우스군을 상기와 같이 처리 및 평가하였다. 대조군 동물에 있어서, 종양 부피는 급속히 증가하여 20 일 동안 6500 mm³ 을 초과하였다; 두 실험 조건에 대한 종양의 성장은 동일한 정도로 지연되어, 동일한 기간에 걸쳐 4000 mm³ 에 도달하였고, 다시 동일한 용량에서 huKS-ala-IL2 및 huKS-ala-IL2(N88R) 로의 처리 간에 효능 차이가 없음을 시사하였다.

c) B6.CB17-Prkdc^scid/SzJ 마우스에서 LLC/KSA 피하 종양의 처리. 본 발명의 융합 단백질은 또한 성숙한 T 세포 이외의 세포 상에서 효과적일 수 있다. 예를 들어, 하나의 실험에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은 성숙한 T 세포가 없는 마우스에서도 종양 성장을 지연시켰다. 상기 결과는, 본 발명의 융합 단백질이 예를 들어 면역타협 (immunocompromised) 환자에서 종양의 치료에 유용할 수 있음을 제시하였다.

LLC/KSA 피하 종양 모델을, 이들의 T-세포 및 B-세포 매개 면역 반응이 타협된 11 주령 B6.CB17-Prkdc^scid/SzJ 마우스에서 평가하였다. 상술된 바와 동일한 처리 프로토콜을 따랐다. 대조군 동물에서의 종양은 15 일 동안 3500 mm³ 로 급속히 성장하였다. huKS-ala-IL2 및 huKS-ala-IL2(N88R) 은 모두 동일한 기간에 걸쳐 상기 크기의 절반 미만으로 종양 성장을 지연하는데 유사하게 효과적이었다. 또한, 온전한 면역계를 갖는 C57BL/6 마우스 및 T 세포와 B 세포가 없는 B6.CB17-Prkdc^scid/SzJ 마우스 간의 종양 성장 속도의 차이는 최소였다.

또한, KS-ala-IL2 가 온전한 면역계를 갖는 마우스 및 기능적 T 세포가 없는 마우스에서 동일하게 잘 종양을 치료한다는 사실은, 상기 종양 모델에 있어서, 면역학적 반응이 비-T 세포 매개 기전을 통해 작동함을 시사하였다. 따라서, 치료적 분자 내에 다양한 효과기 세포를 통해 면역학적 반응을 자극하는 선택권을 유지하는 것이 가치있다. 두 마우스 배경에서 KS-ala-IL2 에서만큼 유효했던 KS-ala-IL2(N88R) 의 경우에 있어서, T 세포와 무관하게 작용하는 효과기 세포 활성이 현저히 보존되었다.

d) C57BL/6 마우스 폐로의 LLC/KSA 전이의 처리.

LLC/KSA 세포를 또한 폐 전이 모델에 사용하였다. 1 ×10⁶ 개 생존 세포를 200 ㎕ PBS 중에 현탁하고, 6-8 주령 C57BL/6 마우스에 정맥내 주사하였다. 4 일째에, 8 마리 마우스군을 하기 조건 중 하나로 처리하였다: 연속 5 일 동안, 마우스에 200 ㎕ PBS, 또는 200 ㎕ PBS 중에 희석된 20 ㎍ 의 KS-ala-IL2 또는 KS-ala-IL2(N88R) 를 정맥내 주사하였다. 동물을 약 27 일째에 희생시키고, 폐를 해부하여 Bouin's 용액 중에 고정하였다. 폐 내 전이 정도를 전이로 덮인 표면적의 백분율을 스코어링하고, 폐 중량에 의해 평가하였다.

대조군의 폐는 96% 를 초과하는 이들의 표면적이 전이로 덮여 있었고, 정상 폐에 비해 대략 5 배의 폐 중량 증가 (0.75 g) 를 가졌다. 대조적으로, huKS-ala-IL2 로 처리된 마우스의 폐는 최소한으로 전이로 덮였으며 (5.6%), huKS-ala-IL2(N88R) 로 처리된 마우스에서는 실제로 전이가 없었다 (0%). huKS-ala-IL2 및 huKS-ala-IL2(N88R) 로 처리된 동물의 폐는 정상 중량이었다. 즉, huKS-ala-IL2(N88R) 은 이들의 생존에 영향을 미칠 역치보다 여러배 미만의 용량에서 폐 전이의 처리에 있어서 huKS-ala-IL2 만큼 유효한 것으로 입증되었다.

실시예 8: 병용 치료법에서의 KS-IL2 변이체.

종양 치료를 위한 제 2 면역 조절제와 연합된 저독성 KS-IL2 변이체, 예컨대 huKS-ala-IL2(N88R) 의 투여 효과를 실시예 7b 에 기재된 바와 같은 마우스 내 피하 종양 모델 LLC/KSA 를 사용하여 조사하였다.

a) huKS-ala-IL2 변이체 및 시클로포스파미드. 병용 치료법을 위해, 종양이 평균 90 mm³ 인 시점에서 0 일째에 시클로포스파미드를 75 mg/kg 용량으로 복강내 투여하고, 5 일에 걸쳐 (제 1 일부터 제 5 일까지) 융합 단백질을 매일 투여하였다. huKS-ala-IL2(N88R) 은 20 ㎍ 또는 100 ㎍ 용량으로 투여하였다. 대조군 조건에는 비처리 동물, 및 huKS-ala-IL2 단독 20 ㎍ 용량, 또는 huKS-ala-IL2(N88R) 단독 20 ㎍ 또는 100 ㎍ 용량으로 처리된 동물이 포함되었다. 비처리 동물 내 종양은 19 일째에 약 5000 mm³ 로 진전된 반면, huKS-ala-IL2 로 처리된 동물의 종양은 약 2200 mm³ 였고, 20 ㎍ 또는 100 ㎍ 의 huKS-ala-IL2(N88R) 로 처리된 마우스에서는 각각 약 2600 mm³ 및 1700 mm³ 이었다. 시클로포스파미드의 공동 투여로 huKS-ala-IL2 단독으로 처리된 것보다 유의미하게 더 작은, 20 ㎍ 용량의 huKS-ala-IL2(N88R) 에서 1700 mm³ 및 더 높은 용량에서 1250 mm³ 의 종양이 얻어졌다.

b) huKS-ala-IL2 변이체 및 인도메타신. 병용 치료법을 위해, 인도메타신을 5 일에 걸쳐 (1 일부터 5 일까지) 매일 융합 단백질의 투여와 함께 35 ㎍/마우스/일 용량으로 경구 투여하였다. 종양은 초기에 평균 90 mm³ 이었다. huKS-ala-IL2(N88R) 을 20 ㎍ 용량으로 투여하였다. 대조군 조건에는 비처리 동물 및 huKS-ala-IL2 단독 20 ㎍ 용량, 또는 huKS-ala-IL2(N88R) 단독 20 ㎍ 용량으로 처리된 동물이 포함되었다. 비처리 동물에서의 종양은 19 일째에 약 5000 mm³ 으로 진행된 반면, huKS-ala-IL2 로 처리된 마우스의 종양은 약 2200 mm³ 이었고, 20 ㎍ 용량의 huKS-ala-IL2(N88R) 로 처리된 마우스의 종양은 각각 약 2600 mm³ 및 1700 mm³ 이었다. 인도메타신의 공동 투여로 20 ㎍ 용량의 huKS-ala-IL2(N88R) 에서 종양 크기는 huKS-ala-IL2 단독 처리에 의해 수득된 종양보다 유의미하게 더 작은 종양인 850 mm³ 로 감소되었다.

실시예 9: 개선된 치료적 지수를 갖는 KS-IL2 변이체.

IL-2 서열 내 특정 위치에 돌연변이를 갖는 KS-IL2 변이체를 구축하였다. 예를 들어, 치환은 IL-2 수용체의 α서브유닛을 방해할 것 같은 위치에 생성되었다. 적합한 잔기는, 예를 들어 huIL-2 의 성숙한 서열 내 F42 이다. 상기 아미노산의 방향족 고리 구조는 IL-2 의 국소 배좌를 안정화시키는 것으로 여겨지며 (Mott 등, JMB 1995, 247: 979), 면역시토카인 내에서, 예를 들어 Y, A 또는 K 로 상기 위치를 치환시키는 것은 점진적으로 감소된 IL-2 수용체 친화도 및 생활성을 갖는 분자를 만드는 것으로 나타났다. 상기 분자를 동물에서 시험하여, 면역시토카인의 비변형 형태와 비교할 때 종양 처리에 있어서 치료적 지수의 증가가 달성되는 것으로 나타났다. 효과적인 다른 치환은 위치 R38 및 K43 에 존재하였다.

면역시토카인 IL-2 부 내에서의 다른 치환은 β서브유닛을 방해할 것 같은 영역 내에, 예를 들어 성숙한 huIL-2 의 위치 E15 또는 L19 에 존재하였다. 면역시토카인 내 상기 잔기를, 예를 들어 A 또는 R 로 돌연변이시키는 경우, 변이체 면역시토카인은 면역시토카인의 비변형 형태와 비교할 때 IL-2 수용체의 β서브유닛에 대해 감소된 친화도를 갖는 것으로 나타났다. 일반적으로, R 로의 치환이 A 로의 치환보다 효과가 심각한 것으로 나타났으며, 이는 R 측쇄의 큰 부피와 연관될 수 있다. 상기 분자를 동물에서 시험하여, 면역시토카인의 비변형 형태와 비교할 때 종양 치료에 있어서 치료적 지수의 증가가 달성되는 것으로 나타났다. 다른 치환이 위치 D84 및 V91 에 도입되어, 또한 치료적 지수의 증가에 효과적인 것으로 나타났다.

IL-2 수용체의 γ서브유닛을 방해하는 분자 영역에 영향을 미칠 것 같은 면역시토카인의 IL-2 부 내 치환이 성숙한 huIL-2 의 위치 N119 에 도입되었다. A 로의 돌연변이로 보다 미묘한 면역시토카인 변이체가 생성되었고, R 로의 돌연변이로 보다 파괴적인 돌연변이가 생성되었다. 상기 변이체의 효과를 종양을 갖는 동물에서 시험하여, 면역시토카인의 비변형 형태와 비교할 때 상기 변이체 면역시토카인이 개선된 치료적 지수를 갖는 것으로 나타났다.

또한, 치료적 지수의 증가는 특히 면역시토카인 내 단독 돌연변이가 최저의 또는 무시할만한 치료적 지수의 증가를 나타내는 분자에 대해, IL-2 면역시토카인 내 다중 돌연변이를 생성하여 달성될 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, F42A 와 L19A, 또는 L19A 와 N119A 의 조합을 포함하는 면역시토카인은 면역시토카인 변이체 단독보다 효과적인 것으로 나타났다. 다중 돌연변이가 관여되는 적용을 위해, 아미노산 측쇄의 크기를 감소시키는 돌연변이를 이용하는 것이 특히 유용하다. 면역시토카인의 IL-2 부 내로 도입되는 또다른 치환은 성숙한 huIL-2 의 T51 이다. A 로의 돌연변이는 치료적 지수의 개선을 나타내지 않지만, P 로의 돌연변이는 종양의 치료에 있어서 면역시토카인의 비변형 형태와 비교할 때 개선된 치료적 지수를 갖는 면역시토카인을 생성하였다.

실시예 10: Ig-IL2 융합 단백질 변이체 huKS-ala-IL2(D20T) 및 이들의 유도체.

성숙한 huIL-2 의 위치 20 에서 아스파르테이트의 트레오닌으로의 치환을 포함하는 Ig-IL2(D20T) 에 근거한 변이체가 생성되었다. 상기 변이체는 Ig 도메인, 예컨대 Fc 부 내 또는 항체 타겟팅 도메인 내 부가적 치환을 포함하였다. 상기 분자를 코딩하는 DNA 구축물을 생성하기 위해, 당업자에게 익숙한 적절한 클로닝 전략 및 돌연변이를 도입하기 위한 구축물 특이적 프라이머로의 PCR 접근법을 이용하여, 본질적으로 실시예 1 에 기재된 바와 같은 절차를 따랐다.

a) huKS-ala-IL2(D20T). 돌연변이 D20T 를 도입하기 위해, PCR 돌연변이화 접근법을 프라이머 세트 5'-CAGCTGCAACTGGAGCATCTCCTGCTGACCCTCCAGATGATTCTGAAT -3' (진한 뉴클레오티드는 치환 코돈을 나타냄) (서열 번호 28) 및 프라이머 T3 (5'-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3') (서열 번호 29) 과 함께 이용하여, DNA 절편을 pBS 플라스미드 상의 야생형 huIL-2 DNA 로부터 증폭하고, TA 벡터 (Invitrogen) 내로 삽입하여 TA-IL2(D20T) 를 생성하였다. 돌연변이화를 서열분석으로 확인하였다. huKS-ala-IL2 내 본래의 IL-2 서열을 치환하기 위해, TA-IL2(D20T) 로부터의 385 bp PvuII/XhoI 절편을 삼중 결찰 반응에서 부모 면역시토카인 플라스미드 내에 클로닝하였다. 융합 단백질을 발현하고, 본질적으로 실시예 3 에 기재된 바와 같이 정제하였다. hu-KS 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대응하는 아미노산 서열을 각각 서열 번호 30 및 31 에 나타내었다.

huKS-ala-IL2(D20T) 의 추가 변이체를 생성하여, 상이한 플라스미드 골격 내로 동일한 PCR-유래 절편을 도입하였다.

b) dI-KS-ala-IL2(D20T). 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하는 변형을 갖는 버전의 KS-ala-IL2 는 이미 설명되어 있다. 융합 단백질을 본질적으로 실시예 3 에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다. IL2(D20T) 변이체에 융합된 dI-KS 항체의 중쇄에 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 32 로 나타내었다. 서열 번호 33 및 34 는 각각 dI-KS 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 해당하였다.

c) 탈글리코실화 dI-KS-ala-IL2(D2OT). N-글리카나아제를 사용한 효소적 탈글리코실화를 본질적으로 실시예 2 에 기재된 바와 같이 단백질 dI-KS-ala-IL2(D2OT) 상에서 수행하였다.

d) dI-KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T). 상기 IL-2(D20T) 융합 단백질의 Ig-부분은 IgG γ4 서브클래스의 불변 영역 (서열 번호 7) 에서 유래되었으며, 또한 IgG γ1 힌지 (서열 번호 10) 의 특징을 보유하였다. 또한, 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하는 돌연변이가 도입되었다. 부가적으로, 상기 융합 단백질은 Fc 내 N-글리코실화 부위를 제거하는, 아스파라긴에서 글루타민으로의 치환을 포함하였다 (실시예 4 참조). 페닐알라닌에서 알라닌으로의 동시적 치환은 잠재적인 T 세포 에피토프를 제거하였다. 융합 단백질을 본질적으로 실시예 3 에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다.

e) dI-NHS76(γ2h)-ala-IL2(D2OT). 상기 IL-2(D20T) 융합 단백질의 Ig-부분은 IgG γ2 서브클래스의 불변 영역에서 유래되었으며, 또한 IgG γ1 힌지의 특징을 보유하였다. NHS76 에서, Ig 가변 영역은 DNA-히스톤 복합체 내에 포함된 에피토프에 대한 것이며, 종양의 괴사 중심을 특이적으로 인지하였다 (Williams 등, PCT WO00/01822). 또한, 경쇄 가변 영역 내에서 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하는 돌연변이가 도입되었다. 상기 잔기 류신 104 는 CDR3 V-J 연결부에 존재하며, 발린으로 치환되었다. 융합 단백질을 본질적으로 실시예 3 에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다.

f) dI-NHS76(γ2h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T). 실시예 10e 의 단백질에 근거하는 상기 단백질은 부가적으로 실시예 10d 에 기재된 바와 같은 잠재적인 T-세포 에피토프 및 Fc 내 N-연결 글리코실화를 제거하는 돌연변이를 포함하였다. 융합 단백질을 본질적으로 실시예 3 에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다. 하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 융합 단백질에는 서열 번호 35 에 나타낸 바와 같은 IL2(D20T) 변이체에 융합된 NHS76(γ2h)(FN>AQ) 분자의 중쇄 서열 및 서열 번호 36 에 대응하는 경쇄 가변 및 불변 영역 서열이 포함되었다. 그러나, 서열 번호 35 의 중쇄 영역은 임의의 IgG 경쇄 가변 또는 불변 영역과 조합되어 이용될 수 있다.

g) dI-NHS76(γ4h)-ala-IL2(D20T). 상기 단백질은 실시예 10e 에 기재된 하나와 유사하지만, 중쇄가 γ2 IgG 서브클래스가 아닌 γ4 에서 유래되었다. 융합 단백질을 본질적으로 실시예 3 에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다.

h) dI-NHS76(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T). 실시예 10g 의 단백질에 근거하는 상기 단백질은 부가적으로 실시예 10d 에 기재된 바와 같은 잠재적인 T-세포 에피토프 및 Fc 내 N-연결 글리코실화를 제거하는 돌연변이를 포함하였다. 융합 단백질을 본질적으로 실시예 3 에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다. 하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 융합 단백질에는 서열 번호 37 에 나타낸 바와 같은 IL-2(D20T) 변이체에 융합된 dI-NHS76(γ4h)(FN>AQ) 분자의 중쇄 서열 및 서열 번호 36 에 대응하는 경쇄 가변 및 불변 영역 서열이 포함되었다. 그러나, 서열 번호 37 의 중쇄 영역은 임의의 IgG 경쇄 가변 또는 불변 영역과 조합되어 이용될 수 있다

본 발명의 융합 단백질의 Ig 부분에는 상이한 종에서 유래된 IgG 분자의 도메인을 포함하는 조합을 포함하는, 임의의 IgG 서브클래스 유래의 중쇄 불변 영역 도메인이 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질에는 임의의 IgG 서브클래스 유래의 힌지 영역, 예를 들어 IgG 감마 1 (서열 번호 10), 감마 2 (서열 번호 11) 또는 감마 4 (서열 번호 12) 유래의 힌지 영역이 포함될 수 있다.

생분석에서 Ig-IL2(D20T) 변이체의 활성: Ig-IL2(D20T) 융합 단백질을 ED50 값 (실시예 4 참조) 으로 표현되는, 성장을 위해 IL-2 에 의존하는 세포의 증식능을 측정하는 생분석에서 시험하였다. 분석을 쥐과 CTLL-2 세포 또는 인간 Kit-225 세포 (IL-2Rαβγ를 발현함), 및 인간 TF-1β세포 또는 단리된 쥐과 NK 세포 (IL-2Rβγ를 발현함) 상에서 수행하였다.

예를 들어, 대표적 실험에서, huKS-ala-IL2 에 비해, IL-2Rαβγ를 갖는 세포 CTLL-2 에서 dI-KS-ala-IL2(D2OT) 에 대한 ED50 값이 변하지 않은 반면, IL-2Rβγ를 갖는 세포 TF-1β에서는 대략 900 배 더 높은 것으로 나타났다. 따라서, 실시예 4 에 정의된 바와 같은 ED50 비는 약 150 으로, huKS-ala-IL2 와 비교하여 IL-2Rαβγ를 갖는 CTLL-2 세포에 대한 선택성에 있어서 대략 750 배 이동을 나타내었다. 상기 세포주쌍에서 dI-KS-ala-IL2(N88R) 로 관찰되는 대략 20,000 배 (KS-ala-IL2 에 비해) 의 선택성 이동과 비교하여, dI-KS-ala-IL2(D20T) 에 대한 선택성은 약 10 내지 20 배 감소되어, IL-2Rβγ발현 세포에서 수득되는 측정가능한 증식 반응을 반영하였다. 상기 경향은 또한 인간 Kit 225 세포가 사용되는 경우 현저하였다. KS 항체를 포함하는 다른 Ig-융합 단백질에서 나타나는 바와 같이, 항체부의 탈글리코실화는 IL-2Rβγ발현 세포 내 융합 단백질 활성의 감소에 대해 작지만 일관된 효과를 가졌다.

IL-2 의존성 세포 증식을 또한 상이한 항체 부분을 포함하는 Ig-IL(D20T) 변이체에서 측정하였다. dI-NHS76(γ2)-ala-IL2 에 비해, IL-2Rαβγ를 갖는 세포 Kit-225 에서의 dI-NHS76(γ2)-ala-IL2(D20T) 에 대한 ED50 값은 3 배 증가한 반면, IL-2Rβγ를 갖는 세포 TF-1β에서는 대략 230 배 증가하는 것으로 나타났다. 결과적인 ED50 비 350 은 dI-KS(γ4)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 로 관찰되는 것과 동일한 범위 내이며, huKS-ala-IL2(N88R) 에 비해 10 배 덜 선택적인 것이다. 대표적 결과를 표 4 에 나타내었다.

Ig-IL2(D20T) 변이체의 약동역학: Ig-IL2 변이체와 세포 표면 Fc 수용체의 상호작용을 평가하기 위해, FcγR 수용체에 대한 Ig-IL2 융합 단백질의 결합을 U937 세포를 이용하여 세포-기반 ELISA 에서 분석하였다. 융합 단백질 (huKS-ala-IL2, dI-huKS-ala-IL2, dI-KS-ala-IL2(D20T), 및 dI-KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T)) 을 100 ㎍/ml 내지 780 ng/ml 범위에 걸쳐 2 배 희석하고, 세포와 인큐베이션하고, FITC-콘쥬게이션된 항인간 IgG Fc Ab F(ab')₂ (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 를 이용하여 결합을 검출하였다. 상기 세포에 대한 huKS-ala-IL2 및 dI-KS-ala-IL2 의 최대 결합의 절반 농도는 약 5 ㎍/ml 이었으며, 흥미롭게도 dI-KS-ala-IL2(D20T) 단백질로 2 배 증가하였다. Ig 부분의 글리코실화를 예방하는 돌연변이 (dI-KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T)) 의 도입이 상기 단백질의 U973 세포에 대한 결합을 5- 내지 10 배 감소시키지만, 결합은 완전 소실되지는 않았다.

마우스에서 Ig-IL2(D20T) 변이체의 약동역학 특성을 본질적으로 실시예 5 에 기재된 바와 같이 조사하였다. 놀랍게도, dI-KS-ala-IL2 와 비교하는 경우, dI-KS-ala-IL2(D20T) 의 반감기는 현저히 감소하였다. PK 프로파일의 분석은, 그 효과가 특히 α상 도중에 현저함을 나타내었다: 50% 의 dI-KS-ala-IL2 가 1 시간 후에도 여전히 이용가능한데 비해, 대략 5% 의 dI-KS-ala-IL2(D20T) 만이 여전히 존재하였다. 상기 단백질에 대한 PK 프로파일의 β상의 기울기는 유사하였다. dI-KS-ala-IL2(D20T) 로 관찰되는 것과 본질적으로 동일한 PK 프로파일이 보통 최저 FcR 결합 친화도를 나타내는 서브클래스 γ2 의 IgG 를 포함하는 융합 단백질 dI-NHS76(γ2h)-ala-IL2(D20T) 에서 관찰되었다. 따라서, 융합 단백질 상의 IL(D20T) 단백질 부분의 효과는 항체 dI-KS 에 제한되지 않았다.

Ig 융합 단백질의 탈글리코실화는 일반적으로 PK 프로파일의 α-상을 증강시키는 효과를 갖는 것으로 관찰되었다. 따라서, PK 프로파일에 대한 dI-KS-ala-IL2(D20T) 의 효소적 탈글리코실화 효과를 조사하였다. 실제로, PK 프로파일의 α-상은 본질적으로 dI-KS-ala-IL2 에서 관찰된 것으로 복귀하였다. 융합 단백질 dI-KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 에서와 같이 돌연변이화에 의해 글리코실화가 소실된 경우, 동일한 효과가 얻어졌다. 따라서, PK 프로파일에 대한 효과는 감소된 FcR 결합 때문인 것일 수 있다.

Ig-IL2(D20T) 변이체의 독성: Ig-IL2(D20T) 변이체 KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 의 독성을 실시예 6 에 기재된 바와 같이 Balb/C 마우스에서 dI-KS-ala-IL2 에서와 비교하였다.

두 융합 단백질은 마우스에서 유사한 혈청 반감기를 가졌다. dI-(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 는 1 일 5 회 100 ㎍/마우스, 200 ㎍/마우스 또는 400 ㎍/마우스 용량으로 투여한 반면, dI-KS-ala-IL2 는 1 일 5 회 40 ㎍/마우스 용량으로 투여하였다. 마우스는 400 ㎍/마우스 용량의 dI-KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 에서도 생존한 반면, 1/10 용량의 dI-KS-ala-IL2 를 수여받은 대조군 마우스는 6 일째에 죽은 것으로 나타났다. dI-KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 로 처리된 마우스의 체중은 약간 영향을 받아서, 7 일째에 초기 체중의 97% 로 일시적으로 감소하였다. 관용 용량에 있어서 10 배 초과의 차이는 치료적 지수에 있어서의 상당한 개선을 시사하였다.

종양 치료를 위한 Ig-IL(D20T) 변이체의 효능: Ig-IL2(D20T) 변이체의 효능을 실시예 7a 에 기재된 바와 같이 CT26/KSA 세포 유래의 피하 종양을 갖는 Balb/C 마우스에서 평가하였다.

융합 단백질 dI-KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 를 15 ㎍/마우스 및 30 ㎍/마우스 용량으로 투여하였다. 종양은 평균 크기 126 mm³ 에서 시작하여, 28 일째에 1800 mm³ 내지 5000 mm³ 크기에 도달하였다. 15 ㎍/마우스의 dI-KS-ala-IL2 로 처리된 마우스에서의 종양은 평균 크기 355 mm³ 로 성장한 반면, 15 ㎍/마우스의 dI-KS-ala-IL2(D20T) 로 처리된 마우스에서의 종양은 평균 크기 2250 mm³ 에 도달하였다. 이는 가장 크게는 상기 분자의 불량한 PK 에 기인할 수 있다. 15 ㎍/마우스의 더 낮은 용량의 dI-KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 로 처리된 마우스에서의 종양은 어느 정도, 1450 mm³ 평균 크기로 성장하였으나, 30 ㎍/마우스 용량에서 종양은 평균 크기 950 mm³ 에 도달하여, 유의미하게 마우스의 절반 초과에서 종양이 현저히 성장하지 않았다. 즉, 증가된 용량에서 dI-KS(γ4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 는 종양 성장 저해에 현저한 효과를 가졌다. 실제로, 상기 실험에 사용된 용량은 상기 분자에 대한 최대 관용 용량의 적어도 12 배 낮으므로, 최대 관용 용량의 1/2 내지 1/3 로 투여되어 대조된 huKS-ala-IL2 에 비해 개선된 치료적 지수를 가질 수 있을 것이다.

실시예 11: 상이한 IL-2 수용체에 대한 야생형 및 돌연변이 IL-2 융합 단백질의 상대적 친화도.

IL-2Rαβγ수용체에 비해 IL-2Rβγ수용체에 대한 본 발명의 다양한 융합 단백질의 상이한 친화도를 방사성면역분석과 같은 분석으로 측정할 수 있다. 동일한 수의 IL-2Rαβγ수용체 발현 세포 또는 IL-2Rβγ수용체 발현 세포를 플라스틱 플레이트 상에 접종하였다. 동일한 수의 IL-2Rαβγ수용체 발현 세포 또는 IL-2Rβγ수용체 발현 세포에 첨가된 동량의 야생형 또는 돌연변이 IL-2 융합 단백질로 일련의 희석을 수행하여 표준 곡선을 수득하였다. 비결합 융합 단백질을 세척 제거하고, 각각의 세포 유형에 결합한 융합 단백질의 양을 방사표지 리간드로 검출하였다. Fc-IL-2 융합 단백질의 경우에 있어서, 리간드는 IgG 의 Fc 부에 결합하는 스타필로코코스 단백질 A 와 같은 분자일 수 있다. 리간드는 또한 특정 서브클래스의 IgG 분자의 부를 인자하는 또다른 항체, 예를 들어 IgG 감마 1, IgG 감마 2 또는 IgG 감마 4 불변 영역에 대한 항체일 수 있다. 비결합 리간드를 세척 제거하고, 야생형 IL-2 융합 단백질과 결합한 IL-2Rαβγ발현 세포; 돌연변이 IL-2 융합 단백질과 결합한 IL-2Rαβγ발현 세포; 야생형 IL-2 융합 단백질과 결합한 IL-2Rβγ발현 세포 또는 돌연변이 융합 단백질과 결합한 IL-2Rβγ발현 세포를 포함하는 플레이트의 방사활성을 감마 카운터 상에서 측정하였다. 결합 분석에서 수득한 데이타를 표준화시켜, 세포 상에서 발현되는 수용체 및 세포의 수를 계수하였다.

또다른 분석에 있어서, 융합 단백질 자체를 당분야에 널리 공지된 다양한 기법을 이용하여 방사활성으로 또는 비방사활성으로 표지할 수 있었다. 표지 리간드에 대해 상술된 분석과 유사하게, 야생형 또는 돌연변이 표지 융합 단백질을 동일한 수의 접종 세포에 첨가하고, 표지 융합 단백질의 양을 측정하였다.

특정 수용체에 대한 융합 단백질의 결합 친화도를 상술된 바와 같이 결합 리간드 또는 결합 융합 단백질의 농도에 대한 비결합 리간드 또는 비결합 융합 단백질의 농도 및 각 반응에 첨가된 융합 단백질의 총 농도의 곱의 비로 측정하였다. 야생형 IL-2 융합 단백질과 비교하여, IL-2 부분 내 특정 돌연변이는 IL-2Rβγ수용체 및 IL-2Rαβγ수용체에 대한 융합 단백질의 상대적 친화도를 변형시켰다.

동등물

본 발명은 그 요지 또는 본질적 특징에서 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 구현예는 본원에 기재된 본 발명을 제한하는 것이 아니라 모든 측면에서 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 설명이 아닌 첨부된 청구범위에 의해 제시되며, 청구범위의 동등물의 범위 및 의미 내에 주어지는 모든 변화가 여기에 포함되는 것으로 의도된다.

본원에 참고된 모든 특허, 특허 출원 및 과학적 문헌은 그 전문이 참고로 도입된다.

관련 출원에 대한 참고

본 출원은 2001. 12. 4. 일자로 출원된 U.S.S.N. 60/337,113 및 2002. 4. 12. 일자로 출원된 U.S.S.N. 60/371,966 을 우선권으로 청구하며, 그 전체 개시가 본원에 참고로 도입된다.

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primer <400> 18 agttctggaa ctaaagggct ccgaaacaac attcatgtgt 40 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant sequence in huKS M1 IL-2 variant <400> 19 Thr Thr Ser Arg 1 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody-IL-2 junction sequence <400> 20 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Ala Pro Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant antibody-IL-2 junction sequence <400> 21 Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala Pro Thr 1 5 10 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence in huKS M1-IL2 variant <400> 22 Asp Leu Ile Ser Asn Ile 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant sequence in huKS M1-IL2 variant <400> 23 Asp Thr Thr Ser Arg Ile 1 5 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for generating the N88R mutation <400> 24 acttaagacc tagggacacc accagcagga tcaacgtaat agt 43 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for N88R mutation <400> 25 atcatgtctg gatccctc 18 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N to Q mutation in the CH2 domain of the Fc gamma 1 constant region <400> 26 Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FN to AQ mutation in Fc portion of gamma 2 or 4 constant regions <400> 27 Gln Ala Gln Ser Thr 1 5 <210> 28 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for D20T mutation <400> 28 cagctgcaac tggagcatct cctgctgacc ctccagatga ttctgaat 48 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for D20T mutation <400> 29 attaaccctc actaaaggga 20 <210> 30 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu-KS heavy chain variable region <400> 30 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Thr Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu-KS light chain variable region <400> 31 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 32 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Claims (48)

1. 돌연변이 IL-2 부분에 융합된 비-IL-2 부분을 포함하는 융합 단백질에 있어서, 상기 융합 단백질이 고친화도 수용체를 발현하는 세포에 대해 참고 단백질보다 더 큰 선택성을 나타내며, 상기 참고 단백질에는 비-돌연변이 IL-2 부분에 융합된 비-IL-2 부분이 포함되고, 상기 선택성은 IL-2Rβγ수용체를 발현하는 세포의 활성화에 대한 IL-2Rαβγ수용체를 발현하는 세포의 활성화의 비로 측정되는 단백질.
2. 제 1 항에 있어서, 돌연변이 IL-2 부분에 아미노산 치환, 아미노산 결실 및 아미노산 개질로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 돌연변이가 포함되는 융합 단백질.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 선택성이 성숙한 인간 IL-2 단백질의 위치 88 에 N 에서 R 로의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 인간 IL-2 부분에 융합된 비-IL-2 부분을 포함하는 참고 융합 단백질의 선택성의 약 0.1% 내지 약 100% 인 융합 단백질.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 선택성이 성숙한 인간 IL-2 단백질의 위치 88 에 N 에서 R 로의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 인간 IL-2 부분에 융합된 비-IL-2 부분을 포함하는 참고 융합 단백질의 선택성의 약 0.1% 내지 약 30% 인 융합 단백질.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 선택성이 성숙한 인간 IL-2 단백질의 위치 88 에 N 에서 R 로의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 인간 IL-2 부분에 융합된 비-IL-2 부분을 포함하는 참고 융합 단백질의 선택성의 약 1% 내지 약 20% 인 융합 단백질.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 선택성이 성숙한 인간 IL-2 단백질의 위치 88 에 N 에서 R 로의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 인간 IL-2 부분에 융합된 비-IL-2 부분을 포함하는 참고 융합 단백질의 선택성의 약 2% 내지 약 10% 인 융합 단백질.
7. 제 1 항에 있어서, IL-2Rαβγ수용체를 발현하는 세포가 CTLL-2, Kit 225 및 성숙한 T-세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
8. 제 1 항에 있어서, IL-2Rβγ수용체를 발현하는 세포가 TF-1β세포 및 NK 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
9. 제 1 항에 있어서, 성숙한 인간 IL-2 단백질 보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는 융합 단백질.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 비-IL-2 부분이 알부민인 융합 단백질.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 비-IL-2 부분에 항체 도메인이 포함되는 융합 단백질.
12. 제 11 항에 있어서, 항체 도메인이 KS-1/4, dI-KS, dI-KS(γ4h)(FN>AQ), huKS, huKS(N 에서 Q 로), NHS76(γ2h), NHS(γ4h), NHS76(γ2h)(FN>AQ), NHS76(γ4h)(FN>AQ) 및 14.18 로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
13. 제 2 항에 있어서, 상기 돌연변이가 IL-2Rαβγ수용체에 대한 단백질의 친화도에 비해 IL-2Rβγ수용체에 대한 융합 단백질의 친화도 상에 차별적 효과를 갖는 융합 단백질.
14. 제 1 항에 있어서, 차별적 효과가 2 배 초과이며, 하기와 같이 정의되는 융합 단백질:
15. 제 14 항에 있어서, 차별적 효과가 약 5 배 내지 약 10 배인 융합 단백질.
16. 제 14 항에 있어서, 차별적 효과가 약 10 배 내지 약 1000 배인 융합 단백질.
17. 제 14 항에 있어서, 돌연변이 IL-2 부분에 아미노산 치환 N88R 또는 D20T 가 포함되는 융합 단백질.
18. 제 1 항에 있어서, 성숙한 인간 IL-2 단백질의 위치 88 에 N 에서 R 로 변화되는 아미노산 치환이 포함되는 융합 단백질.
19. 제 18 항에 있어서, 성숙한 인간 IL-2 단백질의 위치 85 에 L 에서 T 로, 및 위치 86 에서 I 에서 T 로 변화되는 아미노산 치환이 추가 포함되는 융합 단백질.
20. 제 1 항에 있어서, 성숙한 인간 IL-2 단백질의 위치 20 에 D 에서 T 로 변화되는 아미노산 치환이 포함되는 융합 단백질.
21. 제 1 항에 있어서, 상기 돌연변이 IL-2 부분에 K8, Q13, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, H79, L80, R81, D84, N88, I92 및 E95 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에 돌연변이를 갖는 성숙한 인간 IL-2 단백질이 포함되는 융합 단백질.
22. 제 1 항에 있어서, 상기 돌연변이 IL-2 부분에 L25, N31, L40, M46, K48, K49, D109, E110, A112, T113, V115, E116, N119, R120, I122, T123, Q126, S127, S130 및 T131 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에 돌연변이를 갖는 성숙한 인간 IL-2 단백질이 포함되는 융합 단백질.
23. 제 21 항에 있어서, 아미노산 치환이 N88R 인 융합 단백질.
24. 제 21 항에 있어서, 아미노산 치환이 D20T 인 융합 단백질.
25. 제 22 항에 있어서, 아미노산 치환이 Q126D 인 융합 단백질.
26. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 하나 이상의 상기 아미노산 치환이 IL-2Rαβγ수용체에 대한 상기 단백질의 친화도에 비해 IL-2Rβγ수용체에 대한 상기 융합 단백질의 친화도 상에 차별적 효과를 갖는 융합 단백질.
27. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 차별적 효과가 2 배 초과이며, 하기와 같이 정의되는 융합 단백질:
28. IL-2 부분 및 비-IL-2 부분을 포함하는 융합 단백질에 있어서, 상기 비-IL-2 부분에 IL-2Rαβγ수용체에 대한 상기 융합 단백질의 친화도에 비해 IL-2Rβγ수용체에 대한 상기 융합 단백질의 친화도 상에 차별적 효과를 갖는 돌연변이가 포함되는 융합 단백질.
29. 제 28 항에 있어서, 상기 차별적 효과가 약 5 배 내지 약 10 배인 융합 단백질.
30. 제 28 항에 있어서, 상기 차별적 효과가 약 10 배 내지 약 1000 배인 융합 단백질.
31. 제 28 항에 있어서, 상기 비-IL-2 부분에 항체 도메인이 포함되는 융합 단백질.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 항체 도메인에 IgG 감마 1 도메인, IgG 감마 2 도메인 또는 IgG 감마 4 도메인이 포함되는 융합 단백질.
33. 제 31 항에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 항체 도메인 내에 존재하는 융합 단백질.
34. 제 33 항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열 번호 1 에서 N 을 상이한 아미노산으로 변화시키는 융합 단백질.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 N 이 Q 로 변화되는 융합 단백질.
36. 제 32 항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열 번호 2 에서 FN 을 AQ 로 변화시키는 융합 단백질.
37. 제 31 항에 있어서, 서열 번호 35 및 서열 번호 36 의 아미노산 서열이 포함되는 융합 단백질.
38. 제 11 항에 있어서, 상기 항체 도메인에 IgG 감마 1 도메인, IgG 감마 2 도메인 또는 IgG 감마 4 도메인이 포함되는 융합 단백질.
39. 제 11 항에 있어서, 상기 항체 도메인에 돌연변이가 포함되는 융합 단백질.
40. 제 39 항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열 번호 1 에서 N 을 상이한 아미노산으로 변화시키는 융합 단백질.
41. 제 40 항에 있어서, 상기 N 이 Q 로 변화되는 융합 단백질.
42. 제 41 항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열 번호 2 에서 FN 을 AQ 로 변화시키는 융합 단백질.
43. 제 11 항에 있어서, 서열 번호 35 및 서열 번호 36 의 아미노산 서열을 포함하는 2 개 펩티드의 이량체인 융합 단백질.
44. 하기를 포함하는, 세포 표면 상의 별개의 수용체에 결합하는 2 개 이상의 단백질 도메인을 포함하는 치료적 융합 단백질의 개선 방법:

    i. 상기 별개의 수용체에 특이적인 2 개 이상의 시험관 내 분석에서의 활성에 대해 상기 융합 단백질을 시험하고,

    ii. 돌연변이, 또는 화학적 또는 생화학적 개질에 의해 상기 융합 단백질을 개질시키고,

    iii. 상기 개질된 융합 단백질을 상기 2 개 이상의 분석에서 시험하고,

    iv. 상기 비-개질된 융합 단백질에 비해 상기 분석에서 이들의 활성에 상이하게 영향을 미치는 개질된 융합 단백질을 동정하고,

    V. 상기 동정된 개질 융합 단백질을 동물에서 활성에 대해 시험함.
45. 제 44 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 상기 개질이 상기 부분에 대한 수용체와 융합 단백질 내 부분의 상호작용에 영향을 미치는 방법.
46. 제 45 항에 있어서, 상기 수용체가 하나 이상의 상기 시험관 내 분석에서 존재하는 방법.
47. 제 46 항에 있어서, 상기 시험관 내 분석이 세포 기반 분석인 방법.
48. 제 47 항에 있어서, 상기 분석이 IL-2Rαβγ또는 IL-2Rβγ또는 둘 다를 발현하는 세포를 이용하는 방법.