JP2005511755A - 複数種類のタンパク質を高スループットで産生および精製するための、融通性の高い方法および装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書内にて以下の用語に含まれる範囲を始めとする本願の明細書および請求の範囲を明確かつ矛盾なく理解できるように、用語を以下のように定義する。
「タンパク質およびペプチド類」を、天然のタンパク質およびペプチド類、あるいは、トランスフェクションまたは遺伝子導入形質転換により産生された組換えタンパク質およびペプチド類のいずれかとして定義する。
概要(図1)
本発明によれば、1種類または複数種類の目的タンパク質は、図1に示すように、さまざまな方法のいずれかにより産生される。
1.本発明の一態様によれば、必要な材料および時間を最小限に抑え、目的タンパク質の産生量を最大限にするため、特定量の1種類または複数種類の目的タンパク質が自動的に産生および精製される。
タンパク質およびインサートの選択(図2)
産生および精製用に1種類または複数種類の目的タンパク質を選択できる工程は、その機能または目的に応じて数多くある。例えば、その1種類または複数種類の目的タンパク質を、2000年3月10日に出願された、係属中の米国特許出願第09/522,900号に記載されているように、ワクチンなどの患者に特異な薬剤にすることができる。この場合、患者自身のDNAから、特異タンパク質を発現させるための配列が得られる。あるいは、目的タンパク質を、マイクロアレイまたは所謂タンパク質チップに用いるための標的タンパク質にすることもでき、この場合には、収集した試料(血液、結成、尿、痰、髄液またの生体サンプル)からの生理学的パラメータ、器官機能または機能障害の評価、ならびに種々の病理学的感染状態の特定ができるように、タンパク質標的を選択することができる。
ベクターの選択
本発明によれば、上述したように、また本願と同一の譲受人に譲渡された上記特許に記載されているように、単離した目的DNA配列をベクター内に挿入して、目的の組換えタンパク質を、細菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系および酵母発現系を含むさまざまな方法のいずれかにより、またはGENEWARE(登録商標)技術の特徴を用いることにより、産生させることができる。具体的に言えば、GENEWARE(登録商標)発現系の場合、ベクター、タグおよびウィルスがコードするタンパク質に対して特異的に選択された、目的の遺伝子配列またはインサートを含むように、ウィルスが遺伝学的に操作される。するとこのウィルスが、タバコ植物の葉などの広葉植物組織に適用されて、その有機体に感染する。この植物とウィルスとが協働して特異なタンパク質を発現させ、このタンパク質がその植物組織から抽出され、精製されるのである。こうした本発明による方法体系の基本的ワークフローを、本発明による方法体系を有効にするために使用する装置の詳しい説明と併せて、以下に詳述する。さらに、以下により明確に説明する方法でこのワークフローを追跡し、その工程における種々の態様の判別を補助するコンピュータシステムについても説明する。
組換えベクターのスクリーニング
転写解析
目的タンパク質の発現をスケールアップする前に、目的配列を含むベクターを、標的に対する正確な転写について評価することができる。cDNAのクローニングベクター内への正確な挿入を、アレイ形態におけるin vitro発現系、原核生物発現系、真核生物発現系または植物転写発現系を用いて評価し、精製された転写物のサイズ解析を行うことができる。好適な一実施形態が図13に示されている。この場合、in vitro転写解析により、発現および精製に使用する可能性のあるベクター構築物をプレスクリーニングする。適したベクター内へのインサートのクローニングから予め選択したベクター構築物を、ステップS100に示す、この例では3×6アレイであるアレイフォーマット内に配置して、同時に解析することができる。このベクター構築物は、さまざまな発現系から選択することができ、その発現系の例として、昆虫発現系、植物発現系(Geneware Vector(登録商標))(GWV)および細菌発現系(大腸菌)が挙げられる。インサートDNAを1つのクローニング内にうまく挿入できなかった場合には、A1〜A6として示すクローニング試料から複数のクローンをスクリーニングすると有用となり得る。ベクター構築物に、cDNAインサートの上流に位置するT7プロモーターまたはin vitro転写が可能な他のプロモーターを含めることができる。ステップS105として示すT7in vitro転写を、細菌T7TNAポリメラーゼの添加により開始し、ステップS110にて、RNAアガロース、ポリアクリルアミドまたは他種のRNAサイズ分離ゲル電気泳動またはRNA解析システムで転写物長さを解析することができる。転写物の予想サイズにしたがって、成功した反応S115および不成功だった反応S120を記録し、許容範囲内の転写物数が50〜75%などの所定閾値を下回っていれば、各(またはプレート全体)転写反応を繰り返すことができる。許容範囲内の転写物数が上述した所定閾値を下回っている場合、そのクローンを適した宿主ベクター内に再度形質転換して、引き続きT7ベクターを増幅および再精製し、次にT7RNAポリメラーゼを用いて転写することができる。
発現解析
目的配列をベクター内に正確に挿入したことを確認したら、タンパク質発現について評価して、タンパク質発現に対する最適なベクターおよび条件を判別することができる。別法として、ベクター構築物をタンパク質発現について直接試験して、転写やRNA解析すべてを省略することも可能である。いずれの形態においても、小規模でのタンパク質発現評価をスクリーニング方法体系として用いて、上述したタンパク質精製方法体系と併用するための最適なタンパク質発現系を決定できる。
タンパク質発現のスケールアップ
タンパク質の評価およびスクリーニングを行った後、タンパク質の発現および精製をスケールアップすることができる。図1のS3に示すように、タンパク質の評価には、所望のタンパク質が発現したことの確認、植物当たりに得られた植物量、および標的タンパク質の発現レベルが含まれる。次に、図1のS4に示すように、得られた植物量および標的タンパク質発現レベルを用いて、所望量の標的タンパク質の産生に必要な有機体(すなわちタバコ植物)の数を算出する。図1のS4に示すように、所望量の標的タンパク質の産生に必要な数の有機体(すなわちタバコ植物)が植えられ、この有機体に、その中で発現させたいトランスジェニックウィルスおよびタンパク質を感染させる。ステップS1〜ステップ4に類似した一連のステップを、哺乳動物系、酵母系、昆虫系または細菌系タンパク質産生系の使用に適用できることを理解されたい。
浄化され正規化された緑液汁を、図4のステップS17に示すように、図5〜図11を参照しながら以下に説明する装置などの精製装置内に投入する。
ここで、図4に示した本発明の方法に関する説明を、図5〜図11に示す装置の説明と突き合わせる。
精製モードにおいて、バルブ60は通常、流体をチューブ55からチューブ65まで連通させるように設定される。バルブ60を、カラム50の洗浄またはカラム50内で精製した目的タンパク質の除去を目的として、流体をチューブ55からチューブ85まで流動させるように設定することも可能である。バルブ60を、流体をチューブ85からチューブ65まで流動させるように設定して、チューブ65のフラッシュおよび洗浄を可能にすることもできる。
混合物全体がカラム50を通過した後、図4のステップS20に示すように、汚染物を洗い流し、特定の緩衝液成分、例えばPEGおよび尿素を除去しなければならない。図10に示すように、汚染物は、プロポーショニングバルブ115を介した、容器105および容器110内に保管されている2種類の溶液の少なくとも一方で、カラム50から洗い出される。例えば、多種タンパク質に対して、低濃度の拮抗阻害剤イミダゾール(10〜90mM)を含む容器110内の緩衝液を用いて、汚染されたタンパク質とアフィニティ樹脂との相互作用を削減することができる。別法として、容器110内の溶液に当初、浄化した緑液汁と同様の濃度で尿素、グリセロールおよび/またはPEGを含有させる。これをカラム50内に通過させ、その流動量を、容器105からの流動量を直線的に増加させるにつれて、漸次直線的に低下させる。リザーバ105内の緩衝液は、異なる濃度、尿素、グリセロールおよび/またはPEGを含有しており、その濃度は通常ゼロである。したがって、不要な成分の濃度はこの工程中に漸次低下する。カラム50内の状態が急激に変化すると保持されている標識タンパク質に悪影響を及ぼすことがあるが、これにより、カラム50内の状態を急速に変化させずにすむ。図10に示すように、洗い出された成分は、配管85を介して排出される。
別法として、カラム50からの溶出前に、洗浄した後に復元緩衝液(例えば、燐酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、または復元に用いられる他の緩衝液)をリニアグラジエントで導入することにより、目的タンパク質をカラムマトリクス上でin situにリフォールドしてもよい。例えば、数多くのヒスチジン標識タンパク質が変性条件下で精製されると、そのヒスチジンタグがカルボキシ末端かアミノ末端にて露出されるため、金属アフィニティマトリクス上に含まれる結合基とのこのタグの結合量が増加する。ヒスチジン標識タンパク質は引き続き、カラム内を通過する緩衝液のpHを低下させることにより、または高濃度のイミダゾールまたはEDTAを導入することにより、変性された状態で金属アフィニティマトリクスから溶出される。溶出されたタンパク質は、濃度がより高い場合に特に、溶液から落下する、または沈降する場合がある。これは、溶出されたタンパク質の変性状態を原因として暴露された疎水基間における分子間相互作用によるものと考えられる。タンパク質が再溶解できない場合、タンパク質の収穫量全体は少なくなる。しかし、洗浄後に復元緩衝液をリニアグラジエントで導入することにより、タンパク質は、アフィニティマトリクスに結合しながらリフォールドできる可能性がある。リフォールドしている間、先に露出されていた疎水基は遮蔽されるため、分子間の疎水性相互作用およびタンパク質の沈降を避けることができる。
図7の装置は、複数の流動チャネルが別個に設けられて専用のカラム50を有したシステムを示している。カラム50はそれぞれ並行に動作して、複数種類のタンパク質を同時に精製する。具体的に言えば、ポンプ30のそれぞれに連結された単一蠕動ポンプモータMにより、複数の流動チャネルの注入動作が得られるため、緑液汁を複数のカラム内に同時に流動させることができる。また、給送リザーバ5それぞれが、単一アイスバス内に浸されている。蠕動ポンプモータの操作により所望のカラム滞留時間が得られる。これにより、上述したように、緑液汁がカラム50内を一定速度で流動することにより緑液汁から目的タンパク質を高い信頼性で捕捉できる。流動速度が遅いため、許容範囲の目的タンパク質の精製を得るにはかなりの時間がかかる可能性がある。図5に示した装置の流動チャネルのように流動チャネルが1つのみであれば、複数種類のタンパク質精製には膨大な時間がかかる。したがって、単一装置内に複数の流動チャネルを平行に設けることにより、複数種類のタンパク質を同時に抽出することができ、タンパク質精製工程に大きな利点となる。
実施例1:抗体生成を目的とする複数種類のタンパク質の発現および精製
発現が肺または脳に限定されている標識に重点をおいたタンパク質のサブセットを、並行して行われるGENEWARE(登録商標)系の発現およびそれに引き続く精製用に選択した。ヒトタンパク質指数(HPI)およびスイススポットなどのタンパク質データベースを、企業内および市販されている遺伝子コレクションからの全長クローンの利用可能性に基づいて選択される、可能性のあるタンパク質およびサブセットについて調べた。各全長クローンに1つの配列IDを割り振り、そのDNA配列および得られたタンパク質を、ベクター生成から確認まで(図1)、実験室情報管理システム(LIMS)内で追跡できるようにした。DNA配列に相補的なプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、各標的の読みとり枠を、増幅させてから精製して、適切なGENEWARE(登録商標)発現ベクター内にライゲーションした。このベクターを、ヒスチジンタグ配列を含むように改変し、これにより、発現したタンパク質がN末端にタグを持つようした。得られたベクターをスクリーニングして、挿入の完全性および配位を確認した。成功したクローン事象をタンパク質の発現について評価し、失敗した事象を、クローン化ワークフローに再導入した。
Claims (20)
- 複数種類のタンパク質を精製する方法であって、
第1の所定の有機体を用いて第1の標識タンパク質を発現させるステップと、
第2の所定の有機体を用いて第2の標識タンパク質を発現させるステップと、
第1の緑液汁を形成するために、前記第1の所定の有機体から前記第1の標識タンパク質を採取するステップと、
第2の緑液汁を形成するために、前記第2の所定の有機体から前記第2の標識タンパク質を採取するステップと、
前記第1の標識タンパク質を抽出するために、前記第1の緑液汁を第1のアフィニティカラム内に注入するのと同時に、前記第2の標識タンパク質を抽出するために、前記第2の緑液汁を第2のアフィニティカラム内に通過させるステップと
を含む方法。 - 前記第1のアフィニティカラムを通過させた後の前記第1の緑液汁を収集するステップと、
前記第2のアフィニティカラムを通過させた後の前記第2の緑液汁を収集するステップと、
前記第1の収集した緑液汁を前記第1のアフィニティカラム内に循環させるのと同時に、前記第2の収集した緑液汁を前記第2のアフィニティカラム内に循環させるステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第1のアフィニティカラムから前記第1の標識タンパク質を回収するステップと、
前記第2のアフィニティカラムから前記第2の標識タンパク質を回収するステップと
をさらに含み、
前記回収された第1の標識タンパク質が、1μgから100mg台の範囲の量で測定可能であり、前記回収された第2の標識タンパク質が、1μgから100mg台の範囲の量で測定可能である、請求項1に記載の方法。 - 前記所定の有機体が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞からなる有機体の1種類または複数種類を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標識タンパク質がそれぞれ、複数のマイクロアレイ構築に使用される別種の組換えタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記標識タンパク質がそれぞれ、患者に特異な別種の薬剤である、請求項1に記載の方法。
- 複数種類のタンパク質を産生および精製する方法であって、
少なくとも2種類のタンパク質標的を選択するステップと、
前記タンパク質標的の正確なタンパク質配列を発現する適した組換えベクターを選択するステップと、
前記被選択組換えベクターのそれぞれを、それぞれの組換えタンパク質を産生するために、別々の所定の有機体内で発現させるステップと、
前記組換えタンパク質それぞれに対応する少なくとも2種類の緑液汁を形成するために、前記有機体を採取するステップと、
前記組換えタンパク質を抽出するために、前記複数種類の緑液汁をそれぞれのアフィニティカラム内に同時に注入するステップと、
を含む方法。 - 前記複数種類の緑液汁を、前記複数のアフィニティカラム内に通過させた後、別々の各容器内に収集するステップと、
前記複数種類の緑液汁を、前記複数のアフィニティカラム内に同時に循環させるステップと
をさらに含む、請求項7に記載の方法。 - 前記組換えタンパク質を、前記アフィニティカラムから回収するステップをさらに含み、
前記回収された組換えタンパク質が、1μgから100mg台の範囲の量で測定可能である、請求項7に記載の方法。 - 前記所定の有機体それぞれが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞細胞、植物細胞および哺乳動物細胞からなる有機体の1種類または複数種類を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質がそれぞれ、複数のマイクロアレイ製造に使用される別種の組換えタンパク質である請求項7に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質がそれぞれ、患者に特異な別種の薬剤である、請求項7に記載の方法。
- 複数種類のタンパク質を精製する装置であって、
種類の異なる緑液汁をそれぞれに入れた複数のリザーバと、
前記リザーバのそれぞれに1つずつ接続される複数のポンプと、
対応する前記ポンプの1つずつに接続され、タンパク質保持材料を中に配置した複数のカラムと、
前記タンパク質を前記カラムから取り出すための手段と、
を含む装置。 - 前記装置を自動制御するために、前記装置の複数部分に接続されたコンピュータをさらに含む、請求項13に記載の装置。
- 複数種類のタンパク質を精製する装置であって、
第1の緑液汁を入れた第1のリザーバと、
前記第1のリザーバが接続された第1のポンプと、
前記第1のポンプに接続され、タンパク質保持材料を中に配置したカラムであって、前前記第1の緑液汁が前記ポンプにより押し出されて前記カラム内を通過するようになっているカラムと、
前記装置を自動制御するために、前記ポンプに接続されたコンピュータと
を含む装置。 - 複数種類の生物学的物質を精製する装置であって、
第1の溶液を入れた第1のリザーバと、
第2の溶液を入れた第2のリザーバと、
前記第1のリザーバを接続した第1のバルブと、
前記第2のリザーバを接続した第2のバルブと、
生物学的物質保持材料を中に配置した第1のカラムであって、前記第1のバルブと流体連通して前記第1の溶液を前記第1のカラム内に方向付けるように接続された第1のカラムと、
生物学的物質保持材料を中に配置した第2のカラムであって、前記第2のバルブと流体連通して前記第2の溶液を前記第1のカラム内に方向付けるように接続された第2のカラムと、
前記装置を自動制御するために前記第1のバルブおよび前記第2のバルブと接続されたコンピュータと
を含み、前記第1のカラムを通過する流路と前記第2のカラムを通過する流路とが互いに隔離されており、前記第1のカラムおよび前記第2のカラム内に同時に前記溶液を流動させることのできる装置。 - 前記第1のカラムを出る流体流を制御するための、前記第1のカラムから下流に位置する第3のバルブと、
前記第2のカラムを出る流体流を制御するための、前記第2のカラムから下流に位置する第4のバルブと
をさらに含み、
前記コンピュータで前記第3のバルブおよび前記第4のバルブの動作を制御できるように、前記第3のバルブおよび前記第4のバルブが前記コンピュータに接続されている、請求項16に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。 - 前記第1のバルブの上流に位置する第1のポンプと、
前記第2のバルブの上流に位置する第2のポンプと、
をさらに含み、
前記コンピュータで前記第1および第2のポンプの動作を制御できるように、前記第1および第2のポンプが前記コンピュータに接続されている、請求項17に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。 - 前記第1および第2のポンプが単一モータに接続され、前記モータの操作が前記コンピュータにより制御される、請求項18に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。
- 前記第1のリザーバ、前記第1のバルブ、前記第1のカラム、前記第1のカラムの下流に位置する前記第3のバルブ、および前記第1のポンプのすべてが第1の流路を画成し、
前記第2のリザーバ、前記第2のバルブ、前記第2のカラム、前記第2のカラムの下流に位置する前記第4のバルブ、および前記第2のポンプのすべてが、前記第1の流路とは別個に設けられた第2の流路を画成し、
前記第1の流路および前記第2の流路と並行して別の生物学的物質を精製するために、前記装置が、前記第1の流路および前記第2の流路とは別個に設けられた第3の流路をさらに含む、請求項18に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。
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