JP2005511755A - A versatile method and apparatus for high-throughput production and purification of multiple types of proteins - Google Patents
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Abstract
さまざまな発現系のいずれかを用いて、複数種類の目的タンパク質または目的ペプチド類、あるいは遺伝学的に発現された他の材料をスクリーニングし、引き続き産生する。その複数種類のタンパク質は、複数種類の別個の処理済み緑液汁から抽出され、各種緑液汁が目的タンパク質の1種類を含有している。多チャネル式装置が、その1チャネルにつき1種類の緑液汁を処理することにより、複数種類の緑液汁を処理する。この装置はコンピュータ制御されており、これにより、各チャネル内のさまざまなバルブおよびポンプが、各目的タンパク質を抽出してこれを専用の貯蔵容器内に送出するように、自動制御されている。 Any of a variety of expression systems are used to screen and subsequently produce multiple types of proteins or peptides of interest, or other genetically expressed material. The multiple types of proteins are extracted from multiple types of separate processed green juices, and each type of green juice contains one type of target protein. A multi-channel apparatus processes multiple types of green juice by processing one type of green juice per channel. This device is computer controlled, which automatically controls the various valves and pumps in each channel to extract each target protein and deliver it into a dedicated storage container.
Description
本発明は、比較的大量の所定組換えタンパク質を発現、抽出および精製するための、融通性に富みスループットの高い方法および装置に関する。本発明はさらに、同時に別々に並行して動作する装置で複数種類の所定のタンパク質を精製するための方法および装置に関する。本発明はさらに、複数種類の所定のタンパク質を同時に産生するための産生系を追跡、計画および管理するための方法および装置に関する。本発明はさらに、個人向け薬剤に使用する複数種類のタンパク質の産生および精製に関する。本発明はさらに、マイクロアレイに使用する複数種類のタンパク質の産生および精製に関する。本発明はさらに、タンパク質関連の研究に使用する複数種類のタンパク質の産生および精製に関する。 The present invention relates to a flexible and high throughput method and apparatus for expressing, extracting and purifying a relatively large amount of a given recombinant protein. The present invention further relates to a method and apparatus for purifying a plurality of types of predetermined proteins in an apparatus operating simultaneously in parallel separately. The present invention further relates to a method and apparatus for tracking, planning and managing a production system for simultaneously producing a plurality of types of predetermined proteins. The invention further relates to the production and purification of multiple types of proteins for use in personal pharmaceuticals. The invention further relates to the production and purification of multiple types of proteins for use in microarrays. The invention further relates to the production and purification of multiple types of proteins for use in protein-related studies.
物理学者および研究者の双方が、ヒトなどの有機体内の生理機能および代謝機能においてタンパク質が果たす役割の重要性を認識するにつれて、タンパク質の研究および利用が、科学界においても医学界においても、ここ数十年ほど重視されてきている。現在、タンパク質のさまざまな側面が研究されており、その例として、タンパク質−タンパク質相互作用、グリコシル化、タンパク質疾患関連標識の同定、および他の特徴が挙げられる。タンパク質は、研究にも臨床用途にもマイクロアレイで使用され、抗体の産生および特徴付けには大量のタンパク質が必要である。このため、タンパク質の産生が、この分野におけるさらなる開発に極めて重要となってきている。 As both physicists and researchers recognize the importance of protein's role in physiological and metabolic functions in organisms such as humans, protein research and utilization is here in both the scientific and medical communities. It has been valued for decades. Various aspects of proteins are currently being studied, examples of which include protein-protein interactions, glycosylation, identification of protein disease-related labels, and other features. Proteins are used in microarrays for research and clinical applications, and large amounts of protein are required for antibody production and characterization. For this reason, protein production has become extremely important for further development in this field.
タンパク質の産生技術は多数あり、それぞれに固有の利点と限界とがある。全長または部分長タンパク質を産生する方法として、細菌発現系、酵母発現系、菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系および、カリフォルニア州VacavilleのLarge Scale Biology Corporationが開発したGENEWARE(登録商標)などの植物発現系が挙げられる。 There are many protein production techniques, each with its own advantages and limitations. Methods for producing full-length or partial-length proteins include bacterial expression systems, yeast expression systems, fungal expression systems, insect expression systems, mammalian expression systems, and GENEWARE (registered trademark) developed by Large Scale Biology Corporation of Vacaville, California. Plant expression systems.
異種タンパク質を発現させるタンパク質発現系すべてにおいて、目的のcDNAまたはDNA配列がまず適したベクター内でクローニングされる。このベクターを宿主種内に転写または誘導すると、その宿主がそのベクターDNAで形質転換される。例えば、細菌発現系では、異種タンパク質の発現に、プラスミド、ファージまたはウィルス由来のベクターを使用する。目的の核酸配列を含むベクターDNA(インサートDNA)を、リン酸カルシウム法およびエレクトロポーレーション法による形質転換技術を始めとする標準形質転換技術を通じて、細菌内に挿入するのである。こうした技術の他にも、単離および精製されたインサートDNAを被選択ベクターシステム内に挿入するために、数多くのキットが現在利用可能である。このため、細菌発現系は、異種タンパク質の日常的な発現および精製用に最も広範に使用されている。このように、細菌発現系は比較的大量の異種タンパク質発現によく使用されているが、適切なフォールディングおよび翻訳後処理の欠如という課題を残しているため、機能的に不活性な分子が生成される可能性がある。したがって、これまでの細菌発現系は、少量の狭い範囲のタンパク質にのみ適している。 In all protein expression systems that express heterologous proteins, the cDNA or DNA sequence of interest is first cloned in a suitable vector. When this vector is transcribed or derived into a host species, the host is transformed with the vector DNA. For example, bacterial expression systems use plasmid, phage or virus-derived vectors for the expression of heterologous proteins. A vector DNA (insert DNA) containing a target nucleic acid sequence is inserted into a bacterium through standard transformation techniques such as a transformation technique using a calcium phosphate method and an electroporation method. In addition to these techniques, a number of kits are currently available for inserting isolated and purified insert DNA into a selected vector system. For this reason, bacterial expression systems are most widely used for routine expression and purification of heterologous proteins. Thus, although bacterial expression systems are often used for the expression of relatively large amounts of heterologous proteins, the problem of lack of proper folding and post-translational processing remains, resulting in functionally inactive molecules. There is a possibility. Thus, conventional bacterial expression systems are only suitable for small amounts of a narrow range of proteins.
昆虫発現系では、また昆虫発現系ほどではないが酵母発現系では、天然の異種タンパク質に見られる場合と同様のフォールディング、翻訳後修飾およびオリゴマー化が得られる場合もあるが、その複雑さでは天然タンパク質に遠くおよばない。タンパク質産生用の昆虫発現系の1例は、昆虫細胞内にバキュロウィルスを使用することである。プラスミド系ショウジョウバエ細胞による発現系も利用可能である。この発現系では、バキュロウィルスの操作および管理が不要である。バキュロウィルス発現系の場合もプラスミド系ショウジョウバエ発現系の場合も、宿主細胞内に異種タンパク質を挿入して連続的に発現させるために、細菌発現系と同様のベクターを用いる。酵母発現系の場合も、市販されているpESC、pYES、pNMT、pYD、pPICopGAPなどのDNAベクターを用いる。 In insect expression systems, and not as much as in insect expression systems, yeast expression systems may provide folding, post-translational modifications and oligomerization similar to those found in natural heterologous proteins, but at the complexity they are natural. Not far from protein. One example of an insect expression system for protein production is the use of baculovirus in insect cells. Expression systems using plasmid-based Drosophila cells can also be used. This expression system does not require baculovirus manipulation and management. In both the baculovirus expression system and the plasmid system Drosophila expression system, a vector similar to the bacterial expression system is used to insert a heterologous protein into a host cell for continuous expression. Also in the case of a yeast expression system, commercially available DNA vectors such as pESC, pYES, pNMT, pYD, and pPICopGAP are used.
プラスミドやファージ系ベクターでトランスフェクトした、またはウィルスベクターを感染させた哺乳動物細胞培養(例えば、NIH3T3、HeLa、K562、293および他の細胞培養)などの哺乳動物発現系では、実質的な翻訳後修飾の実施が可能である。哺乳動物発現系に使用する市販のベクターの例として、アデノ関連ウィルス、pFBレトロウイルスベクターおよびアデノウィルスなどのウィルス類、pACT、pBIND、pCAT、pCI、phRG−CMV、phRG−TK、phRL−TK、pSIおよびpERVなどのプラスミド、pBK、pBK−CMVおよびpBK−RSVなどのファージ系ベクターが挙げられる。しかし、哺乳動物細胞の場合、異種タンパク質の発現に培養集約的作業が必要なため、大量生産へと拡大させるにはより多くの課題が生じかねない。また、所望量のタンパク質を含む十分な細胞を産生させるには、技術上の熟練者が必要な場合がある。というのも、例えば、特に哺乳動物細胞の場合、トランジエントなトランスフェクションの効率が悪いため、ベクターDNAの安定した形質転換および染色体組込みが必要となり得るからである。 In mammalian expression systems such as mammalian cell cultures transfected with plasmids or phage-based vectors or infected with viral vectors (eg, NIH3T3, HeLa, K562, 293 and other cell cultures), substantial post-translational Modifications can be made. Examples of commercially available vectors for use in mammalian expression systems include adeno-associated viruses, pFB retroviral vectors and viruses such as adenovirus, pACT, pBIND, pCAT, pCI, phRG-CMV, phRG-TK, phRL-TK, pSI And plasmids such as pERV, and phage-based vectors such as pBK, pBK-CMV and pBK-RSV. However, in the case of mammalian cells, culture-intensive work is required for the expression of heterologous proteins, and thus more problems may arise in order to expand to mass production. In addition, skilled artisans may be required to produce sufficient cells containing the desired amount of protein. This is because, for example, in the case of mammalian cells in particular, the efficiency of transient transfection is poor, which may require stable transformation of vector DNA and chromosomal integration.
植物発現系で発現するタンパク質にも、異種タンパク質発現用のベクターが必要である。例えば、Donsonらに付与された米国特許第5,316,931号および同第5,589,367号には、植物における異種遺伝物質の体系的発現に適した植物ウィルスベクターが例示されている。これらの特許内容全体を本明細書内に引用したものとする。Donsonらは、異種遺伝子の体系的発現用に異種サブゲノムプロモーターを有する植物ウィルスベクターについて説明している。このような組換え植物ウィルスベクターが利用可能であるため、目的のタンパク質およびペプチド類を、組換えにより植物宿主内に産生させることができる。 Proteins expressed in plant expression systems also require vectors for heterologous protein expression. For example, US Pat. Nos. 5,316,931 and 5,589,367 granted to Donson et al. Illustrate plant viral vectors suitable for systematic expression of heterologous genetic material in plants. The entire contents of these patents are hereby incorporated by reference. Donson et al. Describe plant viral vectors with heterologous subgenomic promoters for systematic expression of heterologous genes. Since such a recombinant plant virus vector can be used, the target protein and peptides can be produced in a plant host by recombination.
細菌、酵母、昆虫(バキュロウィルス)および哺乳動物培養内に産生されたタンパク質を単離することも周知である。例えば、カリフォルニア州ValenciaのQiagenから、6×Hisタグタンパク質の精製に使用される96ウェルプレートフォーマットに使用可能な金属アフィニティ樹脂および磁気ビードが販売されている。こうした精製技術は、「A Handbook For High Level Expression And Purification Of 6×His−tagged Proteins」(Qiagen March 2001)に記載されているほか、米国特許第4,877,830号、同第5,047,513号、同第5,284,933号および同第5,310,663号に開示されている。その内容全体を本明細書内に引用したものとする。しかし、上述した特許に開示されている方法の多くおよびQiagenから販売されている材料は、μg以下の単位で測定されるタンパク質量の単離に最適化されたものである上(mg単位ではない)、植物内で産生されたタンパク質の精製用に特に設計されているものでもない。 It is also well known to isolate proteins produced in bacteria, yeast, insects (baculovirus) and mammalian culture. For example, Qiagen, Valencia, Calif. Sells metal affinity resins and magnetic beads that can be used in a 96-well plate format used for purification of 6 × His tag proteins. Such purification techniques are described in “A Handbook For High Level Expression And Purification Of 6 × His-tagged Proteins” (Qiagen March 2001), as well as US Pat. Nos. 4,877,830 and 5,047. No. 513, No. 5,284,933, and No. 5,310,663. The entire contents thereof are cited in this specification. However, many of the methods disclosed in the above-mentioned patents and the materials sold by Qiagen are optimized for the isolation of protein amounts measured in units of micrograms (not in mg) ), Not specifically designed for the purification of proteins produced in plants.
植物からタンパク質、ペプチド類およびウィルス類を単離するための処理も、これまでにその数種類が文献に記載されている(Johalに付与された米国特許第4,400,471号、Johalに付与された米国特許第4,334,024号、Wildmanらに付与された米国特許第4,268,632号、Wildmanらに付与された米国特許第4,289,147号、Wildmanらに付与された米国特許第4,347,324号、Holloらに付与された米国特許第3,637,396号、Kochに付与された米国特許第4,233,210号、Kochに付与された米国特許第4,250,197号。これらの開示内容全体を本明細書内に引用したものとする)。 Several treatments for isolating proteins, peptides and viruses from plants have also been described in the literature so far (US Pat. No. 4,400,471 to Johal, granted to Johal). U.S. Pat. No. 4,334,024, U.S. Pat. No. 4,268,632 to Wildman et al., U.S. Pat. No. 4,289,147 to Wildman et al., U.S. Pat. U.S. Pat. No. 4,347,324, U.S. Pat. No. 3,637,396 granted to Hollo et al., U.S. Pat. No. 4,233,210 granted to Koch, U.S. Pat. No. 4, granted to Koch 250, 197, the entire disclosures of which are incorporated herein by reference).
植物内で産生する生理活性種のコストパフォーマンスの良い大量精製に対する方法体系がこれまでに開発されてきている。こうした生理活性種として、タンパク質またはペプチド類が当てはまり、特に、組換えタンパク質またはペプチド類、あるいはウィルス粒子、特に遺伝子組換えが行われたウィルス類が当てはまる。具体的に言えば、Gargerらに付与された米国特許第6,037,456号には、例えば組換タバコモザイクウィルスを感染させたタバコ植物から抽出した大量のタンパク質を単離および精製する方法が開示されている。米国特許第6,037,456号に開示されている方法は主に、単離されるタンパク質量が数百グラムからキログラムとなり得る、大量のタバコ植物または他の許容範囲内植物材料から得たタンパク質の単離および精製を目的としている。また、2001年10月3日に出願された、係属中であり譲受人を同じとする米国特許出願第09/970,150号「Flexible Processing Apparatus for Isolating and Purifying Viruses, Soluble Proteins and Peptides from Plant Sources」には、植物内で生成された大量のタンパク質を精製する自動装置が開示されている。ただしこの場合も、単離されるタンパク質量は数百グラムからキログラムを単位としている。上記特許および係属中の特許出願に記載されている方法には数多くの利点があるが、その方法は材料の大量生成を目的としているため、各種タンパク質の量をマイクログラムからミリグラムの単位とする、それより少ない少量の複数種タンパク質の単離に適用することは容易ではない。米国特許第6,037,456号および2001年10月3日に出願された、係属中であり譲受人を同じとする米国特許出願第09/970,150号「Flexible Processing Apparatus for Isolating and Purifying Viruses, Soluble Proteins and Peptides from Plant Sources」の双方の内容全体を本明細書内に引用したものとする。 A method system for mass purification of bioactive species produced in plants with good cost performance has been developed so far. Such biologically active species include proteins or peptides, particularly recombinant proteins or peptides, or virus particles, particularly viruses that have undergone genetic recombination. Specifically, US Pat. No. 6,037,456 issued to Garger et al. Describes a method for isolating and purifying large amounts of protein extracted, for example, from tobacco plants infected with recombinant tobacco mosaic virus. It is disclosed. The method disclosed in US Pat. No. 6,037,456 is primarily for proteins obtained from large amounts of tobacco plants or other acceptable plant material, where the amount of protein isolated can be from a few hundred grams to kilograms. For isolation and purification purposes. Also, pending US Patent Application No. 09 / 970,150, filed Oct. 3, 2001, which has the same assignee, “Flexible Processing Appraising for Purifying Viruses, Soluble Proteins and Peptoids. Discloses an automatic apparatus for purifying a large amount of protein produced in a plant. However, in this case as well, the amount of protein isolated is in the unit of several hundred grams to kilograms. The methods described in the above patents and pending patent applications have a number of advantages, but because the methods are intended for mass production of materials, the amounts of various proteins are in units of micrograms to milligrams, It is not easy to apply to the isolation of a smaller amount of multiple proteins. U.S. Patent No. 6,037,456 and U.S. Patent Application No. 09 / 970,150 filed Oct. 3, 2001, the same as assignee, "Flexible Processing Apparatus for Purifying Viruses and Pursuing Viruses". , Soluble Proteins and Peptides from Plant Sources, the entire contents of both are incorporated herein by reference.
したがって、タンパク質をさまざまな培養のいずれかで産生することができ、そのタンパク質を信頼性の高い方法で精製して所望量の各タンパク質を提供できる、複数種類のタンパク質の産生および精製を目的とした、融通性の高い発現系が必要である。また、開始生物量が10g〜10kg未満である植物材料から得られる100μg台〜数mgの組換えタンパク質の産生および単離を効率よく行う方法および装置も必要である。さらに、細菌、昆虫、哺乳動物および/または酵母培養で産生された同様量の組換えタンパク質の産しおよび単離を効率よく行う方法および装置も必要である。また、規定された細胞、組織または宿主有機体内におけるプロテオームの構造および関係を決定するための、目的タンパク質を付随したタンパク質のタンパク質の産生および単離を効率よく実施できる方法および装置も必要である。 Therefore, the aim was to produce and purify multiple types of proteins that can be produced in any of a variety of cultures and that can be purified in a reliable manner to provide the desired amount of each protein. There is a need for a highly flexible expression system. There is also a need for a method and apparatus for efficiently producing and isolating 100 μg to several mg of recombinant protein obtained from plant material having a starting biomass of less than 10 g to 10 kg. Further, there is a need for methods and devices that efficiently produce and isolate similar amounts of recombinant protein produced in bacterial, insect, mammalian and / or yeast cultures. There is also a need for a method and apparatus that can efficiently perform protein production and isolation of a protein associated with a protein of interest for determining the structure and relationship of the proteome in a defined cell, tissue or host organism.
また現在は、ヒトゲノム研究が進んだため、医療形態を確実に変化させる医療を実施するための新たなパラダイムへの道が開かれている。個別用薬剤、標識を補助とする診断の利用、および個人の分子プロファイルに由来する標的治療法を実施できれば、これらが、医薬品の開発方法および医療実施方法に影響を与える可能性がある。そうなれば、医薬品の発見および開発に対する従来の線形工程が、じきに統合型発見的アプローチに取って代わられる可能性がある。製薬業者は現在のところ、目的の製薬品が、目的とする患者集団の他の人々には望ましくない不都合な反応があるため、患者集団の一部のみを治療できることを立証する統計的根拠を基にその単一調合薬を大量に製造している。薬剤が特定の個人または患者集団に合うように製造される、小規模な製薬品の製造方法が必要である。 At present, human genome research has progressed, opening the way to a new paradigm for implementing medical care that will surely change medical forms. If individualized drugs, the use of label-assisted diagnostics, and targeted therapies derived from the individual's molecular profile can be implemented, these can affect the way pharmaceuticals are developed and practiced. If so, the traditional linear process for drug discovery and development could soon be replaced by an integrated heuristic approach. Pharmaceutical companies currently rely on statistical evidence to prove that the target drug product can treat only a portion of the patient population due to adverse reactions that are undesirable for other people in the target patient population. The company manufactures a large amount of the single preparation. There is a need for small scale drug manufacturing methods where the drug is manufactured to fit a particular individual or patient population.
単離されるウィルスまたはタンパク質が、製薬品として製造されることを目的としたものである場合、一貫性があり、立証可能な方法体系が必要である。したがって、自動装置が、単離工程で使用される方法体系をモニタして、その追跡および立証を提供する、タンパク質を単離するための自動化された方法体系および装置が必要である。 If the virus or protein to be isolated is intended to be manufactured as a pharmaceutical product, a consistent and verifiable methodology is needed. Therefore, there is a need for an automated methodology and apparatus for isolating proteins, where an automated apparatus monitors the methodology used in the isolation process and provides its tracking and verification.
本発明は、複数種類のタンパク質を同時に並行して精製するための多チャネル式装置に関する。 The present invention relates to a multichannel apparatus for simultaneously purifying a plurality of types of proteins in parallel.
本発明はまた、複数種類のタンパク質を同時に産生および精製するため方法および装置に関する。 The present invention also relates to a method and apparatus for simultaneously producing and purifying multiple types of proteins.
定義
本明細書内にて以下の用語に含まれる範囲を始めとする本願の明細書および請求の範囲を明確かつ矛盾なく理解できるように、用語を以下のように定義する。
Definitions In order to provide a clear and consistent understanding of the specification and claims of this application, including the scope of the following terms, the terms are defined as follows.
GENEWARE(登録商標)は、新規な遺伝子およびその遺伝子がコードするタンパク質の機能を試験し、そのタンパク質を大量に製造するための、カリフォルニア州VacavilleのLarge Scale Biology Corporationにより開発された技術である。GENEWARE(登録商標)には、試験有機体内にいずれかの遺伝子または多数の遺伝子を配置するようにウィルスから改変されたベクターを使用することが含まれる。その有機体に、その遺伝子のタンパク質産生物を製造させて、その産生物を研究、収集および精製するものである。 GENEWARE (R) is a technology developed by Large Scale Biology Corporation of Vacaville, California to test the function of a new gene and the protein encoded by the gene and to produce the protein in large quantities. GENEWARE (R) includes the use of vectors modified from viruses to place any gene or multiple genes in the test organism. Let the organism produce the protein product of the gene and study, collect and purify the product.
好ましくは、GENEWARE(登録商標)には、移植遺伝子のタバコモザイクウィルスを感染させたタバコ植物またはこれに関連するタバコ属種を使用する。タバコ植物が早く成長するために、植物遺伝子を研究するための極めて有用なモデル有機体が得られる、また、動物タンパク質または植物タンパク質のいずれであっても大量に製造する高収益向上が得られるという理由から、GENEWARE(登録商標)技術の例として通常、タバコ植物の使用が挙げられる。GENEWARE(登録商標)技術のさまざまな側面が、Large Scale Biology Corporationに譲渡された米国特許(Donsonらに付与された米国特許第5,316,931号、Donsonらに付与された同第5,589,367号、Carringtonらに付与された同第5,766,885号、Turpenらに付与された同第5,811,653号、Donsonらに付与された同第5,866,785号、Donsonらに付与された同第5,889,190号、Turpenらに付与された同第5,889,191号、Kumagaiらに付与された同第5,922,602号、Turpenらに付与された同第5,965,794号およびDonsonらに付与された同第6,054,566号)に開示されている。これらの内容全体を本明細書内に引用したものとする。ただし、GENEWARE(登録商標)技術は、トウモロコシ、イネなどのタバコ以外の植物を使用する場合にも適用可能であることを理解されたい。 Preferably, GENEWARE (R) uses tobacco plants infected with the transgenic tobacco tobacco virus or tobacco species associated therewith. The rapid growth of tobacco plants provides a very useful model organism for studying plant genes, and the high profitability of producing large quantities of either animal or plant proteins. For reasons, an example of GENEWARE (R) technology usually includes the use of tobacco plants. Various aspects of GENEWARE® technology are described in US patents assigned to Large Scale Biology Corporation (US Pat. No. 5,316,931 assigned to Donson et al., US Pat. No. 5,589 assigned to Donson et al.). No. 367, No. 5,766,885 granted to Carrington et al. No. 5,811,653 granted to Turpen et al. No. 5,866,785 granted to Donson et al., Donson No. 5,889,190 granted to Turpen et al. No. 5,889,191 granted to Turpen et al. No. 5,922,602 granted to Kumagai et al. No. 5,965,794 and No. 6,054,5 granted to Donson et al. Disclosed in No. 6). The entire contents thereof are cited in the present specification. However, it should be understood that the GENEWARE (registered trademark) technology can also be applied when using plants other than tobacco, such as corn and rice.
以下の説明において使用する用語「生物量」「バイオ物質」および「植物源」はすべて、採取される植物、種子、または、ウィルス、タンパク質および/またはそのペプチド類などの目的材料を抽出または単離するために処理可能な植物部分すべてをいう。例えば、バイオ物質処理には、数多くの種類の植物や、植物材料の種子、花、柄、茎、根、塊茎、ならびに葉部分などの植物部分を含めることができる。通常、タバコ植物の多肉多液葉が、GENEWARE(登録商標)技術を用いた所定タンパク質の大量生成に理想的であるが、以下の説明から、タバコ以外の植物もGENEWARE(登録商標)技術を用いたタンパク質産生に使用可能であることを理解されたい。 In the following description, the terms “biomass”, “biomaterial” and “plant source” all extract or isolate the harvested plant, seed or target material such as viruses, proteins and / or peptides thereof. All plant parts that can be processed to do. For example, biomaterial treatment can include many types of plants and plant parts such as seeds, flowers, stalks, stems, roots, tubers, and leaf parts of plant material. Normally, fleshy and multi-leafed tobacco plants are ideal for mass production of certain proteins using GENEWARE (registered trademark) technology. From the following explanation, plants other than tobacco also use GENEWARE (registered trademark) technology It should be understood that it can be used for the production of proteins.
別法として、トウモロコシ、イネ、穀物植物類または他の望ましい植物を、目的のタンパク質およびペプチド類の産生に使用することができる。 Alternatively, corn, rice, cereal plants or other desirable plants can be used to produce the proteins and peptides of interest.
以下の説明では、用語「生物量」および「バイオ物質」も、細菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系および酵母発現系で生成され、以下に記載する方法体系にしたがって産生されるタンパク質の精製用に採取された生物学的材料を指す場合がある。 In the following description, the terms “biomass” and “biomaterial” also refer to proteins produced in bacterial expression systems, insect expression systems, mammalian expression systems and yeast expression systems, and produced according to the methodologies described below. May refer to biological material collected for purification.
用語「緑液汁」は、処理したバイオ物質から抽出される液体をいう。ただし、この緑液汁は、抽出した液体の色にかかわらず、植物材料またはバイオ物質から抽出した液体にいずれをも指す可能性があることを理解されたい。例えば、1種類または複数種類のタンパク質をLarge Scale Biology CorporationのGENEWARE(登録商標)技術を用いて産生した場合、緑液汁は、採取したタバコなどのバイオ物質から得られるため、文字通り緑色となる可能性がある。しかし、目的タンパク質が細菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系、菌発現系および酵母発現系で発現された場合、そこから抽出される液体は緑色以外となり得るが、以下ではこれも緑液汁とする場合がある。 The term “green juice” refers to a liquid extracted from a treated biomaterial. However, it should be understood that this green juice may refer to any liquid extracted from plant material or biomaterial, regardless of the color of the extracted liquid. For example, if one or more proteins are produced using the Large Scale Biology Corporation's GENEWARE (registered trademark) technology, green juice can be literally green because it is obtained from biomaterials such as collected tobacco There is. However, when the target protein is expressed in a bacterial expression system, an insect expression system, a mammalian expression system, a fungal expression system, or a yeast expression system, the liquid extracted from it can be other than green. It may be.
本明細書内でいう「ウィルス」を、1種類または複数種類のウィルス構造タンパク質を組み合わせた感染性核酸配列を含むビリオンと、1種類または複数種類のウィルス構造タンパク質を組み合わせた非感染性核酸を含む非感染性ビリオンと、ウィルス構造タンパク質の凝集体であって、核酸配列を含まず、その凝集体とも核酸配列が組み合わされておらず、ウィルス様中空粒子(VLP)を含む場合もある凝集体とからなる群を含むものと定義する。このウィルス類は、天然のものであっても組換え核酸技術に由来するものでもよく、植物全体、植物組織または植物細胞内における複製用に設計または選択により適合可能なあらゆるウィルス由来核酸を含むものである。 As used herein, “virus” includes a virion comprising an infectious nucleic acid sequence combining one or more types of viral structural proteins and a non-infectious nucleic acid combining one or more types of viral structural proteins. Non-infectious virions and aggregates of viral structural proteins that do not contain nucleic acid sequences, that are not combined with nucleic acid sequences and may contain virus-like hollow particles (VLPs) It is defined as including the group consisting of These viruses may be natural or derived from recombinant nucleic acid technology and include any virus-derived nucleic acid that can be adapted by design or selection for replication in whole plants, plant tissues or plant cells. .
本明細書内でいう「ウィルス集団」を、上記にて定義したと1種類または複数種類のウィルス類して定義する。このウィルス集団は、そのウィルス類のあらゆる組み合わせおよび比率を含む異種選択からなるものである。 The “virus population” as used in this specification is defined as one or more types of viruses as defined above. This virus population consists of a heterologous selection that includes all combinations and proportions of the viruses.
本明細書内でいう「ウィルス様中空粒子(VLP)」を、自己集合構造タンパク質として定義する。この構造タンパク質は、1種類または複数種類の核酸配列によりコードされるものであり、その核酸配列(1つまたは複数)が、宿主ウィルスベクターのゲノム内に挿入される。
「タンパク質およびペプチド類」を、天然のタンパク質およびペプチド類、あるいは、トランスフェクションまたは遺伝子導入形質転換により産生された組換えタンパク質およびペプチド類のいずれかとして定義する。
As used herein, “virus-like hollow particles (VLPs)” are defined as self-assembled structural proteins. This structural protein is encoded by one or more nucleic acid sequences, which nucleic acid sequence (s) are inserted into the genome of the host viral vector.
“Proteins and peptides” are defined as either naturally occurring proteins and peptides, or recombinant proteins and peptides produced by transfection or transgenic transformation.
用語「目的タンパク質」「目的材料」および「複数種類の目的材料」とは、本発明による精製方法および/または装置を用いて単離すべきあらゆる材料、化合物、有機構造体または材料の組み合わせをいう。目的タンパク質あるいは1種類または複数種類の目的材料の例として、これに限定するものではないが、ビリオン、ウィルス様中空粒子、ウィルス類、タンパク質および/またはペプチド類、受容体、受容体拮抗剤、抗体、一本鎖抗体、酵素、ニューロポリペプチド類、インスリン、抗原、ワクチン、ペプチドホルモン、カルシトニン、及びヒト成長ホルモンが挙げられる。また、目的タンパク質あるいは1種類または複数種類の目的材料を、プロテグリン、マゲイニン、セクロピン、メリトチン、インドリシジン、デフェンシン、β−デフェンシン、クリプトジン、クラバイニン、植物デフェンシン、ニシン及びバクテネシンからなる抗菌性ペプチドまたはタンパク質とすることもできる。 The terms “target protein”, “target material” and “multiple types of target material” refer to any material, compound, organic structure or combination of materials to be isolated using the purification method and / or apparatus according to the present invention. Examples of target proteins or one or more target materials include, but are not limited to, virions, virus-like hollow particles, viruses, proteins and / or peptides, receptors, receptor antagonists, antibodies Single chain antibodies, enzymes, neuropolypeptides, insulin, antigens, vaccines, peptide hormones, calcitonin, and human growth hormone. In addition, the target protein or one or a plurality of types of target materials are combined with an antibacterial peptide or protein consisting of protegrin, magainin, cecropin, melittin, indolicidin, defensin, β-defensin, cryptdin, clavinin, plant defensin, herring and bactenine. You can also
本明細書でいう「細菌」を、細胞分割により増殖し、その細胞が通常細胞壁内含まれ、球状、棒状、らせん状または湾曲状で発生し、事実上あらゆる環境で見出すことのできる微細な単細胞微生物からなる群を含むものとして定義する。 As used herein, "bacteria" is a fine single cell that proliferates by cell division, and that the cells are normally contained within the cell wall, occur in a spherical, rod-like, spiral or curved shape and can be found in virtually any environment Defined as including a group of microorganisms.
本明細書でいう「細菌培養」を、in vitroにおける細菌集団の維持および繁殖として定義する。この細菌集団は通常、クローンに由来する、すなわち、単一細菌細胞に由来している。したがって、所与細菌培養内の細菌すべてが同じ遺伝子の補体を含有するため、それがタンパク質発現系であれば、同じ異種タンパク質配列を発現させるはずである。しかし、特定の環境において、この細菌培養が1種類以上の細菌細胞を起源として、異なる遺伝子補体を含む、複数種類の細菌細胞を含有する可能性もある。 As used herein, “bacterial culture” is defined as the maintenance and propagation of bacterial populations in vitro. This bacterial population is usually derived from a clone, ie from a single bacterial cell. Therefore, since all bacteria in a given bacterial culture contain the complement of the same gene, if it is a protein expression system, it should express the same heterologous protein sequence. However, in certain circumstances, this bacterial culture may contain multiple types of bacterial cells originating from one or more types of bacterial cells and containing different gene complements.
本明細書でいう「哺乳動物細胞」を、哺乳動物から由来した細胞からなる群を含むものとして定義する。起点となる哺乳動物細胞として、これに限定するものではないが、ヒトまたの哺乳動物からの組織、流体、血液、器官またの生物学的供給源が挙げられる。 “Mammalian cells” as used herein are defined as including a group consisting of cells derived from mammals. The starting mammalian cell includes, but is not limited to, tissue, fluid, blood, organ or biological source from a human or mammal.
本明細書でいう「哺乳動物細胞培養」を、細胞培地内にてex−vivoで生存可能な、哺乳動物から由来した細胞群を含むものとして定義する。この哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞から直接由来する一次細胞とすることができる。より典型的には、哺乳動物細胞培養内の哺乳動物細胞を不滅化することができる、すなわち、不定数の継代および分裂を通じて増殖および分裂させることができる。 As used herein, “mammalian cell culture” is defined as including a group of cells derived from a mammal that can survive ex-vivo in a cell culture medium. This mammalian cell can be a primary cell derived directly from a mammalian cell. More typically, mammalian cells in mammalian cell culture can be immortalized, i.e., can be propagated and divided through an indefinite number of passages and divisions.
本明細書でいう「酵母細胞」を、出芽または直接的な分裂(核分裂)を通じて、あるいは単なる不整形花糸(菌糸)として成長することにより、成長および増殖できる微小な単細胞有機体からなる群を含むものとして定義する。酵母細胞は、異種ベクター内部に挿入された核酸配列を発現させるために、その異種ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ得るものである。酵母細胞の例として、異種タンパク質のトランスフェクションおよび発現用に一般に使用されるサッカロミケス・セレヴィシエが挙げられる。 As used herein, a group of small unicellular organisms that can grow and proliferate through budding, direct division (fission), or simply growing as an irregular flower (mycelium). Define as including. Yeast cells are those that can be transformed or transfected with a heterologous vector to express a nucleic acid sequence inserted within the heterologous vector. An example of a yeast cell is Saccharomyces cerevisiae, commonly used for transfection and expression of heterologous proteins.
本明細書でいう「昆虫細胞」を、昆虫宿主からex−vivoで生存可能な、昆虫から由来した細胞群を含むものとして定義する。この昆虫細胞は、異種ベクター内部に挿入されたタンパク質配列を発現させるために、その異種ベクターで形質転換、トランスフェクト、または感染され得るものである。昆虫細胞の例として、High Five(商標)細胞、セスジヤブカ細胞、キイロショウジョウバエ細胞およびヨトウガ細胞が挙げられる。 As used herein, “insect cells” are defined as including a group of cells derived from insects that can survive ex-vivo from an insect host. The insect cell can be transformed, transfected, or infected with the heterologous vector to express the protein sequence inserted within the heterologous vector. Examples of insect cells include High Five ™ cells, Sesjavka cells, Drosophila melanogaster cells, and Drosophila cells.
「アフィニティタグ」は、目的タンパク質(ポリペプチド)に付着した分子、リガンドまたはポリペプチドである。アフィニティタグの例として、これに限定するものではないが、ヘキサ−ヒスチジン、他の金属タグ、ストレプタビジン、ビオチン、抗体精製用特異エピトープ標識、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、□−ガラクトシダーゼ、□−アミラーゼ、ならびに、発現したタンパク質の単離および精製を補助できる他のタンパク質または小型分子タグが挙げられる。 An “affinity tag” is a molecule, ligand or polypeptide attached to a protein of interest (polypeptide). Examples of affinity tags include, but are not limited to, hexa-histidine, other metal tags, streptavidin, biotin, specific epitope tags for antibody purification, glutathione-S-transferase, □ -galactosidase, □ -amylase, and Other proteins or small molecule tags that can assist in the isolation and purification of the expressed protein.
「アフィニティマトリクス」は、基質またはリガンドに結合した固体材料をいう。この材料が、目的タンパク質に付着しているアフィニティタグに選択的に結合する。アフィニティタグとアフィニティマトリクスとが結合すると、目的タンパク質は、カラムまたは他の精製装置内に留まる。このため、目的タンパク質を、緑液汁内に不純物が含まれていればそれから分離することができる。アフィニティマトリクスを洗浄した後、アフィニティタグを付着した目的タンパク質を、実質的に精製された形態としてカラムまたは他の装置から溶出させることができる。アフィニティマトリクスの例として、アガロース、セルロース、セファロース、セファデックスおよび他のクロマトグラフィ媒体、ポリスチレンビード、磁気ビード、フィルタ、隔膜、および、選択したアフィニティタグに結合する基質またはリガンドに結合した他の固体材料が挙げられる。 “Affinity matrix” refers to a solid material bound to a substrate or ligand. This material selectively binds to the affinity tag attached to the protein of interest. When the affinity tag and the affinity matrix are bound, the protein of interest remains in the column or other purification device. For this reason, the target protein can be separated therefrom if impurities are contained in the green juice. After washing the affinity matrix, the protein of interest attached with the affinity tag can be eluted from the column or other device in a substantially purified form. Examples of affinity matrices include agarose, cellulose, sepharose, sephadex and other chromatographic media, polystyrene beads, magnetic beads, filters, diaphragms, and other solid materials bound to substrates or ligands that bind to selected affinity tags. Can be mentioned.
「ヒスチジン−標識タンパク質」は、ヒスチジンアフィニティタグがカルボキシ末端、アミノ末端、または目的タンパク質の内部のいずれかに付着している目的タンパク質である。通常、ヒスチジンタグは、6個のヒスチジン部分からなるが、その組み合わせや数量はいずれでもよい。ヒスチジン−標識タンパク質は、ヒスチジン−標識タンパク質をNi−NTAAgarose(QIAGEN,Inc.製)などの金属アフィニティマトリクスに結合させ、結合したアフィニティマトリクスから不純物を洗浄することにより、精製することができる。精製後、酸pH緩衝条件を用いてイミダゾールで競合溶出させることにより、またはEDTA(エチレンジアミンテトラアセテート)でアフィニティマトリクスから金属を剥離することにより、ヒスチジン−標識タンパク質をカラムから溶出させることができる。
概要(図1)
本発明によれば、1種類または複数種類の目的タンパク質は、図1に示すように、さまざまな方法のいずれかにより産生される。
1.本発明の一態様によれば、必要な材料および時間を最小限に抑え、目的タンパク質の産生量を最大限にするため、特定量の1種類または複数種類の目的タンパク質が自動的に産生および精製される。
A “histidine-labeled protein” is a protein of interest having a histidine affinity tag attached to either the carboxy terminus, the amino terminus, or the interior of the protein of interest. Usually, a histidine tag consists of six histidine moieties, but any combination or quantity thereof may be used. The histidine-labeled protein can be purified by binding the histidine-labeled protein to a metal affinity matrix such as Ni-NTAAAgarose (manufactured by QIAGEN, Inc.) and washing impurities from the bound affinity matrix. After purification, the histidine-labeled protein can be eluted from the column by competitive elution with imidazole using acid pH buffer conditions or by stripping the metal from the affinity matrix with EDTA (ethylenediaminetetraacetate).
Overview (Figure 1)
In accordance with the present invention, one or more proteins of interest are produced by any of a variety of methods, as shown in FIG.
1. According to one aspect of the present invention, a specific amount of one or more target proteins is automatically produced and purified in order to minimize the required materials and time and maximize the production of the target protein. Is done.
以下、図1について簡単に説明する。図1に示すステップの詳細については、その後適宜説明する。 Hereinafter, FIG. 1 will be briefly described. Details of the steps shown in FIG. 1 will be described later as appropriate.
図1のS1に示す第1のステップにおいて、1種類または複数種類の目的タンパク質を選択し、これに対応する適したベクターおよびインサートを同定する。このタンパク質、ベクターおよびインサート選択工程については、以下の図2に関する部分でさらに説明する。 In the first step shown in S1 of FIG. 1, one or more types of target proteins are selected, and suitable vectors and inserts corresponding thereto are identified. This protein, vector, and insert selection process is further described in the section relating to FIG. 2 below.
以下、少なくとも1種類のタンパク質の産生および精製について詳述する。以下の大部分に含む内容は、説明を簡潔にし、冗長部分を省き、説明を理解しやくするために、タンパク質1種類のみの産生および精製についての説明であるが、本発明により複数種類のタンパク質が同時に産生および精製できることを、以下の説明から理解されたい。 Hereinafter, the production and purification of at least one protein will be described in detail. In order to simplify the explanation, omit redundant parts, and make the explanation easier to understand, the contents included in most of the following are explanations on the production and purification of only one kind of protein. Should be understood from the following description that can be produced and purified simultaneously.
タンパク質、ベクターおよびインサートを選択した後、図1のS2において、その目的タンパク質の産生試験に適した有機体または発現系を選択する。具体的に言えば、例えば、細菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系、植物発現系、菌発現系および酵母発現系からなる発現系のいずれの1種類または複数種類を用いることができる。 After selecting the protein, vector, and insert, in S2 of FIG. 1, an organism or expression system suitable for the production test of the target protein is selected. Specifically, for example, any one or a plurality of expression systems composed of a bacterial expression system, an insect expression system, a mammalian expression system, a plant expression system, a fungal expression system, and a yeast expression system can be used.
図1のS3において、図1のS2における試験の結果産生されたタンパク質をスクリーニングして、産生試験に用いた有機体または発現系により目的タンパク質が適切に発現したかどうかを判別する。また、産生されたバイオ物質量と発現したタンパク質量との関係も判別する。この段階で発現するタンパク質量は比較的少ないが、これをさまざまな機能試験および構造試験を用いてスクリーニングする。したがって、S3に示すスクリーニング工程は、複数のサブステップからなっており、これについては以下で詳述する。 In S3 of FIG. 1, the protein produced as a result of the test in S2 of FIG. 1 is screened to determine whether the target protein was appropriately expressed by the organism or expression system used in the production test. In addition, the relationship between the amount of biomaterial produced and the amount of expressed protein is also determined. Although the amount of protein expressed at this stage is relatively small, it is screened using various functional and structural tests. Therefore, the screening process shown in S3 includes a plurality of sub-steps, which will be described in detail below.
図1のS4では、どの発現系(細菌、昆虫、哺乳動物、植物、菌または酵母)が目的タンパク質の発現に最適であるかを判別する。例えば、GENEWARE(登録商標)技術を通常、まずS2の試験で用いる。目的タンパク質が適切に発現していなかった場合、細菌発現系などの別の有機体を試験し、S3で示したようにスクリーニングする。目的タンパク質の産生に適切な発現系が構築されたら、所望量の精製タンパク質を産生するために必要なバイオ物質量を算出する。これについては以下で詳述する。別法として、種々のタンパク質発現系を並行に試験して、すなわち、細菌発現系、植物発現系および昆虫発現系を同時に試験して、より大量の発現および精製を目的とする適切な発現系を決定してもよい。 In S4 of FIG. 1, it is determined which expression system (bacteria, insect, mammal, plant, fungus or yeast) is optimal for the expression of the target protein. For example, the GENEWARE® technology is typically first used in the S2 test. If the protein of interest is not properly expressed, another organism such as a bacterial expression system is tested and screened as indicated at S3. When an expression system suitable for production of the target protein is constructed, the amount of biomaterial necessary to produce a desired amount of purified protein is calculated. This will be described in detail below. Alternatively, various protein expression systems can be tested in parallel, i.e., bacterial expression systems, plant expression systems, and insect expression systems can be tested at the same time to produce an appropriate expression system for greater expression and purification. You may decide.
図1のS5に示すように、目的タンパク質を、判別した最適発現系または有機体で発現させる。この最適発現系により産生された生物量を、図1のS6に示すように採取し、S7に示すように精製前に処理または前処理する。このタンパク質発現、採取および前処理ステップについては、以下の図3に関する部分でさらに詳しく説明する。S7に示す精製ステップについては、以下の図4に関する部分でさらに詳しく説明する。 As shown in S5 of FIG. 1, the target protein is expressed in the determined optimal expression system or organism. The biomass produced by this optimal expression system is collected as shown in S6 of FIG. 1 and treated or pretreated before purification as shown in S7. This protein expression, collection and pretreatment steps will be described in more detail in the section relating to FIG. 3 below. The purification step shown in S7 will be described in more detail in the section relating to FIG. 4 below.
図1のS8に示すように、精製した目的タンパク質を試験して、その特徴および一貫性を確認する。
タンパク質およびインサートの選択(図2)
産生および精製用に1種類または複数種類の目的タンパク質を選択できる工程は、その機能または目的に応じて数多くある。例えば、その1種類または複数種類の目的タンパク質を、2000年3月10日に出願された、係属中の米国特許出願第09/522,900号に記載されているように、ワクチンなどの患者に特異な薬剤にすることができる。この場合、患者自身のDNAから、特異タンパク質を発現させるための配列が得られる。あるいは、目的タンパク質を、マイクロアレイまたは所謂タンパク質チップに用いるための標的タンパク質にすることもでき、この場合には、収集した試料(血液、結成、尿、痰、髄液またの生体サンプル)からの生理学的パラメータ、器官機能または機能障害の評価、ならびに種々の病理学的感染状態の特定ができるように、タンパク質標的を選択することができる。
As shown in S8 of FIG. 1, the purified target protein is tested to confirm its characteristics and consistency.
Protein and insert selection (Figure 2)
There are many processes in which one or more types of target proteins can be selected for production and purification, depending on their function or purpose. For example, the protein or proteins of interest can be transferred to a patient, such as a vaccine, as described in pending US patent application Ser. No. 09 / 522,900, filed Mar. 10, 2000. It can be a unique drug. In this case, a sequence for expressing a specific protein is obtained from the patient's own DNA. Alternatively, the target protein can be a target protein for use in a microarray or so-called protein chip, in which case physiology from the collected sample (blood, formation, urine, sputum, cerebrospinal fluid or biological sample) Protein targets can be selected to enable assessment of genetic parameters, organ function or dysfunction, and identification of various pathological infection states.
特異タンパク質または周知のタンパク質(例えば、患者から特に採られた配列ではない配列)を発現させるために配列が必要な場合、その配列を、図2に概略的に示した例などのコンピュータシステムを用いて、共有私有を含むさまざまなデータベースから取り出すことができる。図2の場合、データベースそれぞれは、企業内顧客A、B〜Nがそれぞれのデータベースにアクセスすることでサーチできるようになっている。公的に利用可能なデータベースの例として、National Center for Biotechnology Information(GenBankおよびBLAST)ヌクレオチドおよびタンパク質データベース、European Molecular Biological Laboratory(SWISS-PROT)ヌクレオチドおよびタンパク質データベース、および他のヌクレオチドおよびタンパク質データベース、ならびに医学文献が挙げられる。私有データベースの例として、Human Protein Index(HPI)、MEDS(Molecular Effects Of Drugs)、MAP(Molecular Anatomy and Pathology)および数多くの研究室によるデータベースが挙げられる。こうしたソースには、タンパク質または有機体構成成分を詳述する情報が含まれており、疾患のある被験者と疾患のない被験者とにおけるタンパク質発現、または正常被験者と異常被験者とにおけるタンパク質発現を比較した情報が含まれている場合もある。 If a sequence is required to express a specific protein or a well-known protein (eg, a sequence that is not specifically taken from a patient), the sequence can be expressed using a computer system such as the example schematically shown in FIG. And can be retrieved from a variety of databases, including shared private ownership. In the case of FIG. 2, each of the databases can be searched by in-house customers A and B to N accessing the respective databases. Examples of publicly available databases include: National Center for Biotechnology Information (GenBank and BLAST) nucleotide and protein databases, European Molecular Biological Laboratory (SWISS-PROT) nucleotide and protein databases, and other nucleotide and protein databases Literature is mentioned. Examples of private databases include Human Protein Index (HPI), MEDE (Molecular Effects Of Drugs), MAP (Molecular Analysis and Pathology), and databases from many laboratories. These sources include information detailing the protein or organism constituents, and information comparing protein expression in diseased and non-diseased subjects, or in normal and abnormal subjects. May be included.
遺伝子情報収集、すなわち目的核酸の単離は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、コロニースクリーニングおよび核酸合成を始めとするさまざまな方法で行うことができる。上述したデータベースおよび文献は、研究者や臨床医がこれを利用して所与状態に対して発現させるタンパク質を選択できるだけでなく、ヌクレオチドおよびタンパク質配列の情報を含んでいることから、適した標的プローブを、標的cDNAおよび目的タンパク質を単離するように設計することができる。 Collection of genetic information, that is, isolation of the target nucleic acid can be performed by various methods including polymerase chain reaction (PCR), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), colony screening, and nucleic acid synthesis. The databases and literature mentioned above not only allow researchers and clinicians to select proteins to be expressed for a given state, but also include nucleotide and protein sequence information, so they are suitable target probes Can be designed to isolate the target cDNA and the protein of interest.
単離を目的としてプローブの設計および反応条件を考察することは、目的タンパク質が周知の種であれ未知の種であれ、その特異な目的タンパク質を単離するために重要である。目的cDNAを単離するためのプローブを、上述したデータベースおよび文献から得られるタンパク質またはDNA配列情報に基づいて設計することができる。別法として、2Dゲルまたは他のタンパク質を分画および単離する方法で単離された、それまでは未知のタンパク質から得たトリプシンペプチド情報を用いて、プローブを設計してもよい。このプローブを、標準ジデオキシヌクレオチド化合物(dATP、dGTP、dCTP、dGTP)を組み入れつつ、標準ホスホルアミダイト化学、またの核酸合成化学を利用して合成することができる。あるいは、2種類以上のジデオキシヌクレオチド(dITPまたは他の修飾ヌクレオチド)とハイブリダイズし得る修飾ヌクレオチドを用いてもよい。核酸プローブ用テンプレートとしてタンパク質配列を用いる場合、プローブセットを、核酸配列の1順列をコードする少なくとも1対のプライマーで構成することができる。別法として、アミノ酸コードが縮重するため、対応する核酸配列の別の順列をコードする1対以上のプライマーを用いてもよい。例えば、リジンは、2種類のコドン配列、AAAおよびAAGでコードされる。したがって、アミノ酸リジンを組み入れた配列は、リジン位置にてプローブ内に両方の変化を含むことになる。プロの合成に加えて、より大きな核酸配列から切り出された核酸断片(例えば、クローニングベクター断片および他の核酸断片)を、標的核酸単離のプローブとして用いることができる。 Consideration of probe design and reaction conditions for the purpose of isolation is important for isolating a specific target protein, regardless of whether the target protein is a known or unknown species. Probes for isolating the cDNA of interest can be designed based on protein or DNA sequence information obtained from the databases and literature described above. Alternatively, probes may be designed using tryptic peptide information obtained from previously unknown proteins that have been isolated by methods of fractionating and isolating 2D gels or other proteins. This probe can be synthesized utilizing standard phosphoramidite chemistry or nucleic acid synthesis chemistry while incorporating standard dideoxynucleotide compounds (dATP, dGTP, dCTP, dGTP). Alternatively, modified nucleotides that can hybridize to two or more types of dideoxynucleotides (dITP or other modified nucleotides) may be used. When a protein sequence is used as a template for a nucleic acid probe, the probe set can be composed of at least one pair of primers that encode one permutation of the nucleic acid sequence. Alternatively, since the amino acid code is degenerate, one or more pairs of primers encoding different permutations of the corresponding nucleic acid sequence may be used. For example, lysine is encoded by two codon sequences, AAA and AAG. Thus, a sequence incorporating the amino acid lysine will contain both changes in the probe at the lysine position. In addition to professional synthesis, nucleic acid fragments excised from larger nucleic acid sequences (eg, cloning vector fragments and other nucleic acid fragments) can be used as probes for target nucleic acid isolation.
プローブを、周知のタンパク質配列と同じではないが同様に設計することもできる。こうしたプローブは、関連タンパク質を単離することができる。関連タンパク質は、個人間でそのアミノ酸配列組成が異なる可能性があるため、標準プローブ設計技術では単離しにくい場合もあるタンパク質である。別法として、低ストリンジェンシー条件を用いて核酸プローブでDNAをスクリーニングすることができる。これにより、同じではないが関連するDNA配列を単離および精製することできる。この核酸プローブを、RT−PCR単離、およびmRNAや全RNAサンプルからのクローニングに使用することができる。この核酸プローブをまた、PCR増幅またの単離方法体系を用いて全ゲノムDNAからのゲノムDNAクローニングに用いてもよい。この全RNAまたはゲノムDNAは、動物、植物、あるいは細菌/微生物細胞または組織から、標準RNAまたはDNA精製技術で単離したものでよい。その技術例として、アルカリ溶解、イソチオシアン酸グアニジウム、CsCl密度勾配、フェノール/SDS、フェノール/クロロホルム、ガラス系またはシリカ系クロマトグラフィ、あるいは、さまざまな製造業者から市販されているキットを含む他の方法が挙げられる。全RNAをさらにオリゴdTカラムまたは樹脂上で分画して、ポリA RNAを含むmRNAを得ることができる。さらに、mRNAを、オリゴdTカラムクロマトグラフィと組み合わせた標準溶解プロトコル(アルカリ溶解、界面活性剤溶解、機械的分裂および他の溶解方法体系)を用いて、細胞培養や組織溶解物から直接単離することも可能である。 Probes can be similarly designed, although not the same as well-known protein sequences. Such probes can isolate related proteins. Related proteins are proteins that may be difficult to isolate using standard probe design techniques because their amino acid sequence composition may vary between individuals. Alternatively, DNA can be screened with nucleic acid probes using low stringency conditions. This allows isolation and purification of related but not identical DNA sequences. This nucleic acid probe can be used for RT-PCR isolation and cloning from mRNA and total RNA samples. This nucleic acid probe may also be used for genomic DNA cloning from total genomic DNA using PCR amplification or isolation schemes. The total RNA or genomic DNA may be isolated from animals, plants, or bacterial / microbial cells or tissues using standard RNA or DNA purification techniques. Examples of techniques include alkaline lysis, guanidinium isothiocyanate, CsCl density gradient, phenol / SDS, phenol / chloroform, glass-based or silica-based chromatography, or other methods including kits commercially available from various manufacturers. It is done. Total RNA can be further fractionated on an oligo dT column or resin to obtain mRNA containing poly A RNA. In addition, mRNA can be isolated directly from cell culture and tissue lysates using standard lysis protocols in combination with oligo dT column chromatography (alkaline lysis, detergent lysis, mechanical division and other lysis methods). Is also possible.
RNAの逆転写で得られたcDNA鎖を、DNAポリメラーゼまたは他の利用可能なポリメラーゼを用いて複製し、二本鎖DNAを得ることができる。DNAポリメラーゼを用いるさまざまな標準分子生物技術により、その二本鎖DNAを増幅させ、増幅したcDNAを適した発現ベクター内に挿入およびライゲーションして、さらなる解析を行うことができる。別法として、ゲノムDNAを、DNAポリメラーゼまたは他の利用可能なポリメラーゼを用いて直接PCRで増幅させることも可能である。増幅したcDNAの場合と同様に、増幅したゲノムDNAを適した発現ベクター内に挿入およびライゲーションして、さらなる解析を行うことができる。 The cDNA strand obtained by reverse transcription of RNA can be replicated using DNA polymerase or other available polymerase to obtain double stranded DNA. A variety of standard molecular biology techniques using DNA polymerase can amplify the double stranded DNA and insert and ligate the amplified cDNA into a suitable expression vector for further analysis. Alternatively, genomic DNA can be amplified directly by PCR using DNA polymerase or other available polymerases. As with the amplified cDNA, the amplified genomic DNA can be inserted and ligated into a suitable expression vector for further analysis.
目的のDNA配列を単離するためのもう1つのプロトコルは、標準DNA合成プロトコルを通じて行う、インサート配列およびその相補的結合鎖の合成である。例えば、相補的DNA鎖を、標準ホスホルアミダイト化学を用いて合成することができる。クローニングを目的として、非対称制限酵素配列を合成鎖内に組み入れて、複製および/または発現ベクター内に直接クローニングしてもよい。別法として、DNA鎖にアニール処理を施した後、標準分子生物ライゲーションプロトコルを用いて、制限酵素リンカーの平滑末端ライゲーションを行うことができる。DNA合成方法体系を用いて、配列の長さに応じて大抵変化する、ピコグラム、ナノグラム、ミクログラム、またはミリグラム量を合成および精製することができる。これにより、DNAポリメラーゼ酵素と共に導入されかねない増幅アーチファクトを避けることができる。DNA合成をPCR増幅と組み合わせて、適したベクター内へのDNA挿入およびそれに引き続くDNAの複製に向けて十分な量を増幅させることもできる。 Another protocol for isolating the DNA sequence of interest is the synthesis of the insert sequence and its complementary binding strand through a standard DNA synthesis protocol. For example, complementary DNA strands can be synthesized using standard phosphoramidite chemistry. For cloning purposes, asymmetric restriction enzyme sequences may be incorporated into the synthetic strand and cloned directly into replication and / or expression vectors. Alternatively, blunt-end ligation of restriction enzyme linkers can be performed using a standard molecular biological ligation protocol after annealing the DNA strand. The DNA synthesis methodology can be used to synthesize and purify picograms, nanograms, micrograms, or milligram quantities that vary mostly with the length of the sequence. This avoids amplification artifacts that can be introduced with the DNA polymerase enzyme. DNA synthesis can also be combined with PCR amplification to amplify sufficient quantities for DNA insertion into a suitable vector and subsequent DNA replication.
もう1つの方法は、複数種類のベクター挿入を含む細菌宿主のコロニースクリーニングを用いることである。通常、ベクター挿入は、特異な宿主組織、器官または条件から単離された複数種類の核酸配列を含む。例えば、ネズミの肝臓または特定疾患に対して表現型であるネズミから得た複数種類のベクターインサートに対応する、市販の細菌「ライブラリ」が入手可能である。上記による単離されたプローブを用いて、ニトロセルロースやナイロンによるフィルタまたは膜などの固形培地上に移入された大量の細菌クローンをスクリーニングすることができる。固形培地上の細菌クローンが溶解すると、各クローンに含まれているDNAが変性されてその培地に結合する。これにより、コロニーのパターンが、結合したDNAの同じパターンで置換される。次にこの培地を、目的DNA配列を含むクローンを同定する標識プローブにハイブリダイズする。このクローンが単離され、大量の培養により増幅される結果、そのDNAが他の目的ベクター内への操作を目的として単離され、切り出される。
ベクターの選択
本発明によれば、上述したように、また本願と同一の譲受人に譲渡された上記特許に記載されているように、単離した目的DNA配列をベクター内に挿入して、目的の組換えタンパク質を、細菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系および酵母発現系を含むさまざまな方法のいずれかにより、またはGENEWARE(登録商標)技術の特徴を用いることにより、産生させることができる。具体的に言えば、GENEWARE(登録商標)発現系の場合、ベクター、タグおよびウィルスがコードするタンパク質に対して特異的に選択された、目的の遺伝子配列またはインサートを含むように、ウィルスが遺伝学的に操作される。するとこのウィルスが、タバコ植物の葉などの広葉植物組織に適用されて、その有機体に感染する。この植物とウィルスとが協働して特異なタンパク質を発現させ、このタンパク質がその植物組織から抽出され、精製されるのである。こうした本発明による方法体系の基本的ワークフローを、本発明による方法体系を有効にするために使用する装置の詳しい説明と併せて、以下に詳述する。さらに、以下により明確に説明する方法でこのワークフローを追跡し、その工程における種々の態様の判別を補助するコンピュータシステムについても説明する。
Another method is to use colony screening of bacterial hosts containing multiple types of vector insertions. Vector insertions typically include multiple types of nucleic acid sequences isolated from specific host tissues, organs or conditions. For example, commercially available bacterial “libraries” are available that correspond to multiple types of vector inserts obtained from murine liver or mice that are phenotypic for a particular disease. The isolated probe as described above can be used to screen large numbers of bacterial clones transferred onto solid media such as nitrocellulose or nylon filters or membranes. When the bacterial clones on the solid medium are lysed, the DNA contained in each clone is denatured and binds to the medium. This replaces the colony pattern with the same pattern of bound DNA. This medium is then hybridized to a labeled probe that identifies a clone containing the DNA sequence of interest. As a result of this clone being isolated and amplified by mass cultivation, the DNA is isolated and excised for manipulation into other target vectors.
Selection of vector According to the present invention, as described above and as described in the above-mentioned patent assigned to the same assignee as the present application, the isolated target DNA sequence is inserted into the vector, Can be produced by any of a variety of methods including bacterial expression systems, insect expression systems, mammalian expression systems and yeast expression systems, or by using features of the GENEWARE® technology. it can. Specifically, in the GENEWARE® expression system, the virus is genetically engineered to contain the gene sequence or insert of interest specifically selected for the protein encoded by the vector, tag and virus. Is manipulated. The virus is then applied to broad-leaved plant tissues such as leaves of tobacco plants and infects the organism. The plant and virus cooperate to express a specific protein, which is extracted from the plant tissue and purified. Such a basic workflow of the method according to the present invention will be described in detail below together with a detailed description of the apparatus used to validate the method according to the present invention. In addition, a computer system is described that tracks this workflow in a manner that will be more clearly described below, and that assists in distinguishing various aspects of the process.
本発明によれば、GENEWARE(登録商標)技術を用いる場合、特異なベクターおよびインサートが、タバコモザイクウィルスまたは他の適したウィルス内への挿入用に選択される。図1のS1に示すように、1種類のインサートが、そのインサートの遺伝子配列によりコードされる特異タンパク質用に選択される。以下の説明からより明確にわかるように、複数種類のタンパク質を同時に発現させることができるように、ウィルス毎に1インサートを含むものとして、複数種類のウィルスを使用することができる。さらに、ウィルス内に挿入するための各インサート用に、1種類または複数種類のベクターがさまざまなベクター類から選択される。例えば、すべてのベクターが各インサートと機能するわけではないため、複数種類のベクターを実験して、所望のタンパク質の発現について試験してもよい。 According to the present invention, when using GENEWARE® technology, specific vectors and inserts are selected for insertion into tobacco mosaic virus or other suitable virus. As shown in S1 of FIG. 1, one type of insert is selected for a specific protein encoded by the gene sequence of the insert. As can be seen more clearly from the description below, multiple types of viruses can be used as if each virus contains one insert so that multiple types of proteins can be expressed simultaneously. In addition, one or more vectors are selected from various vectors for each insert for insertion into a virus. For example, since not all vectors function with each insert, multiple types of vectors may be tested and tested for expression of the desired protein.
上述したように、タンパク質の発現および精製に使用するために、さまざまなクローニングベクターおよび発現ベクターを、使用する宿主発現系に応じて用いることができる。通常、クローニングベクターおよび発現ベクターは、1種類の特異な宿主発現系(例えば、植物または細菌のみ)をトランスフェクトする、形質転換する、または感染させることしかできない。しかし、その中に含まれる核酸配列の性質により、複数種類の宿主発現系をトランスフェクト、形質転換、または感染させることのできるクローニングベクターおよび発現ベクターが存在する。当業者であれば、さまざまな宿主発現系をトランスフェクトする、形質転換する、または感染させるようにベクターを設計できることがわかるであろう。このように宿主発現系をトランスフェクトする、形質転換する、または感染させた後、そのベクターインサートの核酸配列をその宿主内に発現させることのできるベクターすべてが、本発明の範囲内であると考えられる。 As described above, various cloning and expression vectors may be used depending on the host expression system used for use in protein expression and purification. Usually, cloning and expression vectors can only transfect, transform, or infect one specific host expression system (eg, plant or bacteria only). However, depending on the nature of the nucleic acid sequences contained therein, there are cloning and expression vectors that can transfect, transform, or infect multiple types of host expression systems. One skilled in the art will appreciate that vectors can be designed to transfect, transform, or infect various host expression systems. All vectors capable of expressing the nucleic acid sequence of the vector insert in the host after transfecting, transforming, or infecting the host expression system are considered within the scope of the present invention. It is done.
上述したように、使用するベクターは、精製工程で予定されている宿主発現系に応じて選択される。例えば、植物発現系の場合には、異種タンパク質の配列を導入し発現させるために、RNAウィルスまたはDNAウィルス由来のウィルスベクターを使用することができる。RNAウィルスベクターは、発現レベルが高く宿主範囲も広いため、好適である。米国特許第5,316,931号に、植物宿主を全身的に感染させ、その植物宿主内に外来遺伝子配列を安定して転写または発現させることのできる異種サブゲノムプロモーターを有する植物ウィルスベクターが記載されている。この特許内容全体を本明細書内に引用したものとする。同様に、米国特許第5,811,653号には、タバコ植物内に遺伝子を過剰発現させることのできる、タバコウィルス群から得るRNAウィルスベクターが記載されている。この特許内容全体を本明細書内に引用したものとする。米国特許第5,977,438号には、外来遺伝子をRNAウィルスタンパク質(例えば、コートタンパク質)に融合させて、比較的大量の外来タンパク質を融合タンパク質として産生するRNAウィルスベクターが記載されている。この特許内容全体を本明細書内に引用したものとする。 As described above, the vector to be used is selected according to the host expression system planned in the purification process. For example, in the case of a plant expression system, a viral vector derived from an RNA virus or a DNA virus can be used to introduce and express a heterologous protein sequence. RNA viral vectors are preferred because of their high expression levels and wide host range. US Pat. No. 5,316,931 describes a plant viral vector having a heterologous subgenomic promoter that can systemically infect a plant host and stably transcribe or express foreign gene sequences in the plant host. Has been. The entire content of this patent is hereby incorporated by reference. Similarly, US Pat. No. 5,811,653 describes an RNA virus vector obtained from a group of tobacco viruses that can overexpress genes in tobacco plants. The entire content of this patent is hereby incorporated by reference. US Pat. No. 5,977,438 describes an RNA virus vector in which a foreign gene is fused to an RNA virus protein (eg, a coat protein) to produce a relatively large amount of the foreign protein as a fusion protein. The entire content of this patent is hereby incorporated by reference.
好適な一実施形態を、タバコウィルス群から得るRNAウィルスベクターとすることができる。この1例は、タバコモザイクウィルス由来のGENEWAREベクターに見られる。このGENEWAREベクターにおいて、TMVレプリカーゼコード配列は、TMV移行タンパク質用コード配列の上流に位置する。TMV移行タンパク質のライゲーションされた3′末端であるcDNAのORF(読みとり枠)は、ヘキサ−ヒスチジンによるアフィニティタグのポリペプチドコード配列または他のアフィニティタグコード配列に、その3′末端または5′末端にてインフレームで結合される。このようにアフィニティタグコード配列をクローニングベクターおよび発現ベクター内に追加すると、目的のアフィニティタグタンパク質をアフィニティマトリクスに結合させた後にこれを洗浄してすべての不純物を除去することにより、複合混合物からタンパク質を精製することができる。精製後、このタンパク質およびアフィニティタグを実質的に純粋な形態として、アフィニティマトリクスから溶出させることができる。このベクターを、プロトプラストおよび接種した葉内でより高いレベルで発現するように最適化すると、このベクターは、複数の制限酵素部位を用いてcDNA挿入部位のポリリンカー領域5′内でクローン化し、発現したタンパク質を適切に停止させるための停止配列を含むことができる。例えば、タバコモザイクウィルス由来ベクターは、TMVレプリカーゼコード配列を含むことができる。この配列により、プロトプラストおよび接種した葉内における発現を実質的に増加させることができる。また、EcoRI、BamHI、SmaI、SacI、NotI、XbaI、SpeI、XhoI、SapIその他を含む制限酵素部位を、所望する核酸配列の挿入部位をフランキングする多重クローニング部位ポリリンカー配列内に含めることができる。タバコウィルスベクターだけでなく他のRNAウィルスベクターも使用可能であり、その例として、これに限定するものではないが、イネ萎縮病ウィルス、創傷腫瘍ウィルス、カブイエロー(turnip yellow)モザイクウィルス(ティモウィルス属)、イネえそウィルス、キュウリモザイクウィルス(ククモウイルス属)、オオムギ黄萎病ウィルス(ルテロウィルス属)、タバコ輪点ウィルス(ネポウィルス属)、ジャガイモXウィルス(ポテクスウィルス属)、ジャガイモYウィルス(ポティウィルス属)、タバコえそウィルス、タバコ茎えそウィルス(トブラウイルス属)、トマトブッシースタントウィルス(トンブスウイルス属)、カボチャモザイクウィルス、ブロムモザイクウィルス (ブロモウィルス)および他のRNAウィルス類が挙げられる。一本鎖RNAウィルス類内のRNAは、プラス(+)鎖またはマイナス(−)鎖のどちらでもよい。 One suitable embodiment may be an RNA virus vector obtained from the tobacco virus group. An example of this is found in the GENEWARE vector derived from tobacco mosaic virus. In this GENEWARE vector, the TMV replicase coding sequence is located upstream of the coding sequence for the TMV transition protein. The ORF (reading frame) of the cDNA that is the ligated 3 'end of the TMV translocation protein is transferred to the polypeptide coding sequence of hexa-histidine affinity tag or other affinity tag coding sequence at its 3' end or 5 'end. Combined in-frame. This addition of the affinity tag coding sequence into the cloning and expression vectors allows the protein to be removed from the complex mixture by binding the desired affinity tag protein to the affinity matrix and then washing it to remove any impurities. Can be purified. After purification, the protein and affinity tag can be eluted from the affinity matrix in a substantially pure form. When this vector is optimized to be expressed at higher levels in protoplasts and inoculated leaves, the vector is cloned into the polylinker region 5 'of the cDNA insertion site using multiple restriction enzyme sites and expressed. A stop sequence can be included to properly stop the processed protein. For example, a tobacco mosaic virus-derived vector can include a TMV replicase coding sequence. This sequence can substantially increase expression in protoplasts and inoculated leaves. In addition, restriction enzyme sites including EcoRI, BamHI, SmaI, SacI, NotI, XbaI, SpeI, XhoI, SapI and others can be included in the multiple cloning site polylinker sequence that flanks the insertion site of the desired nucleic acid sequence. . Not only tobacco virus vectors but also other RNA virus vectors can be used, such as, but not limited to, rice dwarf virus, wound tumor virus, turnip yellow mosaic virus (timovirus) Genus), rice wilt virus, cucumber mosaic virus (genus cucumber virus), barley yellow dwarf virus (genus luterovirus), tobacco ring-point virus (genus nepovirus), potato X virus (genus potexvirus), potato Y Virus (genus Potyvirus), tobacco necrotic virus, tobacco stem necrotic virus (genus Tobravirus), tomato bushy stunt virus (genus Tombus virus), pumpkin mosaic virus, brom mosaic virus (bromovirus) and other RNAs Viruses It is. RNA within single-stranded RNA viruses can be either positive (+) or negative (-) strand.
DNAウィルスベクターを、宿主植物内における次の接種およびタンパク質発現に用いることができる。DNAウィルスベクターの例として、これに限定するものではないが、カリフラワーモザイクウィルスなどのカリモウィルス類、キャッサバ潜在ウィルス、ビーンゴールデンモザイクウィルス、シバ条線(Chloris striate)モザイクウィルス、トウモロコシすじ(maize streak)ウィルス類および他のDNAウィルス類が挙げられる。別法として、根頭癌腫病菌のプラスミドによるベクターをTi媒介による植物形質転換に用いることができる。 The DNA viral vector can be used for subsequent inoculation and protein expression in the host plant. Examples of DNA viral vectors include, but are not limited to, caulimoviruses such as cauliflower mosaic virus, cassava latent virus, bean golden mosaic virus, Chloris striate mosaic virus, maize streak Viruses and other DNA viruses are mentioned. Alternatively, a vector with a plasmid of root cancer can be used for Ti-mediated plant transformation.
上述したように、ベクターは、目的タンパク質のクローン化および精製を補助するために、アフィニティタグ配列(ヘキサ−ヒスチジン、他の金属アフィニティタグ、ストレプタビジン、抗体精製用の特異なエピトープ標識、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、□−ガラクトシダーゼ、および、発現したタンパク質の単離および精製を補助することのできる他のタグ)と多重クローニング部位リンカー配列とを含むことができる。DNAまたはRNAウィルスベクターも、外来タンパク質の発現を間質液またはその培地内へと命令するために、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。これにより、植物宿主により間質液部分内に分泌される内因性タンパク質の量が制限されるため、精製を簡略化し、その効率を高めることができる。この1例として、キメラタンパク質の分泌を、感染した葉や他のトランスフェクトされた植物部分の間質空間内へと命令する、イネα−アミラーゼのシグナルペプチドをコード化するための配列を組み入れる、またはライゲーションすることが挙げられる。 As mentioned above, the vector can be used to support the cloning and purification of the protein of interest by affinity tag sequences (hexa-histidine, other metal affinity tags, streptavidin, specific epitope tags for antibody purification, glutathione-S- Transferase, □ -galactosidase, and other tags that can assist in the isolation and purification of the expressed protein) and multiple cloning site linker sequences. DNA or RNA viral vectors can also include a nucleic acid sequence encoding a signal peptide to direct expression of the foreign protein into the interstitial fluid or medium thereof. This limits the amount of endogenous protein secreted into the interstitial fluid portion by the plant host, thus simplifying purification and increasing its efficiency. As an example of this, it incorporates a sequence for encoding a rice α-amylase signal peptide that directs secretion of the chimeric protein into the interstitial space of infected leaves and other transfected plant parts. Or ligation is mentioned.
植物の形質転換およびそれに引き続く発現および精製を目的とする植物ウィルスベクターに加えて、哺乳動物や原核生物の発現ベクターを、哺乳動物宿主や原核生物宿主への次のトランスフェクションや形質転換用に用いることができる。好適な一実施形態を、細菌宿主内でも哺乳動物宿主内でも転写およびその後の発現が可能な二重哺乳動物/大腸菌発現ベクターとすることができる。この1例が、発現ベクターMEV(哺乳動物発現ベクター)である。これは、従来の制限酵素クローニング部位(BamHI、EcoRI、SmaI、NotIなど)ならびにSapI/EarIクローニング部位を有するポリリンカー部位を含んでいる。哺乳動物CMV即時初期エンハンサープロモーターユニットが、細菌プロモーターユニットより上流に、イントロンで分離されている。シャイン−ダルガルノ/コダック配列が、発現の効率を高めるために含まれている。ヒスチジン−タグコード配列も、発現したタンパク質の単離および精製効率を高めるために含まれている。これは、SupE/F部位の存在によってのみ大腸菌内で発現する。 In addition to plant viral vectors for plant transformation and subsequent expression and purification, mammalian and prokaryotic expression vectors are used for subsequent transfection and transformation into mammalian and prokaryotic hosts. be able to. One suitable embodiment can be a dual mammalian / E. Coli expression vector capable of transcription and subsequent expression in either a bacterial or mammalian host. An example of this is the expression vector MEV (mammalian expression vector). It contains a conventional restriction enzyme cloning site (BamHI, EcoRI, SmaI, NotI, etc.) as well as a polylinker site with a SapI / EarI cloning site. The mammalian CMV immediate early enhancer promoter unit is separated by an intron upstream of the bacterial promoter unit. A Shine-Dalgarno / Kodak sequence is included to increase the efficiency of expression. A histidine-tag coding sequence is also included to increase the isolation and purification efficiency of the expressed protein. It is expressed in E. coli only by the presence of the SupE / F site.
種々の発現系において試験することを目的に核酸インサートを同時に複数のベクター内に挿入できるように、ベクターを構築することができる。例えば、哺乳動物発現系、細菌発現系および植物発現系内で発現できるベクターに、ベクターDNAのリンカー領域内の同じ制限酵素部位を含めることができる。したがって、cDNAインサートは、MEVおよびGENEWAREベクターを始めとする複数のベクターの対応制限酵素部位内にクローン化されることになる。と同時に、所与cDNAインサートに対する全ベクターの同じフレーム配置が確実となる。 Vectors can be constructed so that nucleic acid inserts can be simultaneously inserted into multiple vectors for testing in various expression systems. For example, vectors that can be expressed in mammalian expression systems, bacterial expression systems, and plant expression systems can include the same restriction enzyme sites in the linker region of the vector DNA. Thus, the cDNA insert will be cloned into the corresponding restriction enzyme sites of multiple vectors, including MEV and GENEWARE vectors. At the same time, the same frame arrangement of all vectors for a given cDNA insert is ensured.
植物ウィルスベクターと同様に、他のベクターDNAへの挿入および精製を目的として、アフィニティタグ配列(ヘキサ−ヒスチジン、他の金属アフィニティタグ、ストレプタビジン、タンパク質A、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、キチン結合ドメイン(CBD)、抗体精製用の特異なエピトープ標識、および、発現したタンパク質の単離および精製を補助することのできる他のタグ)と多重クローニング部位リンカー配列とを組み入れることが望ましい場合がある。パッケージとそれに続く分泌用に発現したタンパク質を細胞外流体マトリクス内に分泌するように命令するシグナルペプチ配列を用いて、発現したタンパク質の精製を簡素化し、その効率を高めてもよい。さらに、ベクターのパッケージ機能を高める他の遺伝子配列をベクター配列内に組み入れることも可能である。この1例が、遺伝子配列をコードする顆粒球/マクロファージ-コロニー刺激因子(GM−CSF)を、抗体や他の免疫応答(例えば、ワクチン)の生成に使用可能なタンパク質用哺乳動物発現ベクターに組み入れることである。GM−CSFが抗原提示細胞(APC;樹状細胞およびマクロファージ)を補充すると同時に、幹細胞成長因子の生成を促進する。これにより、免疫修飾物質系が刺激され、哺乳動物宿主が、特異性および親和性のより高い抗体を多く生成できるようになる可能性がある。 Similar to plant virus vectors, affinity tag sequences (hexa-histidine, other metal affinity tags, streptavidin, protein A, calmodulin binding protein (CBP), chitin binding domain (for the purpose of insertion and purification into other vector DNA) It may be desirable to incorporate CBD), specific epitope tags for antibody purification, and other tags that can assist in the isolation and purification of the expressed protein) and multiple cloning site linker sequences. A signal peptidic sequence that directs secretion of the expressed protein for packaging and subsequent secretion into the extracellular fluid matrix may be used to simplify the purification of the expressed protein and increase its efficiency. In addition, other gene sequences that enhance the packaging function of the vector can be incorporated into the vector sequence. One example of this incorporates granulocyte / macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) encoding gene sequences into mammalian expression vectors for proteins that can be used to generate antibodies and other immune responses (eg, vaccines). That is. GM-CSF recruits antigen-presenting cells (APC; dendritic cells and macrophages) and at the same time promotes the generation of stem cell growth factor. This may stimulate the immunomodulator system and allow the mammalian host to produce more antibodies with higher specificity and affinity.
アフィニティタグを用いて、標識目的タンパク質に結合したタンパク質複合体を単離することもできる。例えば、これまでに酵母で立証されたタンデムアフィニティ精製(TAP)タグシステム(Rigaut他著、「1999 Nature Biotechnology 17」、1030〜1032頁;Gavin他著、「2002 Nature 415」、141〜147頁)を用いてプロテオームを単離すると、目的タンパク質がそのTAPタグを含む。TAPシステムでは、目的タンパク質が、特異なTEVプロテアーゼ切断配列により分離された2種類のアフィニティタグ(例えば、タンパク質AおよびCBP)に付着する。目的タンパク質をこの酵母発現系内にて天然レベルで発現させるには、TAPタグをコードするDNAカセットを、目的タンパク質とインフレームで単相酵母細胞のゲノム内に相同組換えすることにより、インテグレートさせる。 A protein complex bound to a target protein can also be isolated using an affinity tag. For example, a tandem affinity purification (TAP) tag system previously demonstrated in yeast (Rigaut et al., “1999 Nature Biotechnology 17”, pages 1030-1032; Gavin et al., “2002 Nature 415”, pages 141-147) Is used to isolate the proteome, the protein of interest contains its TAP tag. In the TAP system, a protein of interest is attached to two types of affinity tags (eg, protein A and CBP) separated by a specific TEV protease cleavage sequence. In order to express a target protein at a natural level in this yeast expression system, a DNA cassette encoding a TAP tag is integrated by homologous recombination into the genome of a single phase yeast cell in frame with the target protein. .
TAPシステムは、非特異結合を削減するための2ステップ精製システムからなる。このアフィニティ精製システムは、特異なTEVプロテアーゼ切断配列の存在と組み合わせられることにより、穏やかな溶出条件を作り出して、プロテオームやタンパク質複合体を単離する可能性を高めることができる。通常、TAP精製はまず、特異なTEVプロテアーゼ切断配列により分離された2種類のアフィニティ標識用コード配列を含むTAP遺伝子カセットを、インフレームで目的遺伝子配列の端部に付着させるステップからなる。TAP遺伝子カセットを、PCRのクローニングまたは増幅、あるいは目的タンパク質を含む適したベクター内への挿入およびライゲーションにより、タンパク質コード配列の端部に付着させることができる。次に、目的のTAP標識タンパク質コード配列を宿主細胞内に挿入して発現させ、目的タンパク質に関連するタンパク質を単離し、同定する。別法として、TAP遺伝子カセットを、宿主有機体の染色体内におけるインフレームでの相同組換えにより、in vitroで目的タンパク質に付着させることもできる。次にTAP標識タンパク質コード配列をin vitroで発現させ、関連タンパク質を単離する。 The TAP system consists of a two-step purification system to reduce nonspecific binding. This affinity purification system can be combined with the presence of a specific TEV protease cleavage sequence to create mild elution conditions and increase the likelihood of isolating proteomes and protein complexes. Usually, TAP purification comprises a step of attaching a TAP gene cassette containing two types of affinity labeling coding sequences separated by a specific TEV protease cleavage sequence to the end of the target gene sequence in frame. The TAP gene cassette can be attached to the end of the protein coding sequence by PCR cloning or amplification, or insertion and ligation into a suitable vector containing the protein of interest. Next, the target TAP-tagged protein coding sequence is inserted into a host cell and expressed, and a protein related to the target protein is isolated and identified. Alternatively, the TAP gene cassette can be attached to the target protein in vitro by in-frame homologous recombination within the chromosome of the host organism. The TAP-tagged protein coding sequence is then expressed in vitro and the related protein is isolated.
関連タンパク質の単離は、2ステップによる精製工程により行われる。まず、TAP標識タンパク質に関連するタンパク質すべてを単離するために、第1のアフィニティ精製を行う。TEVプロテアーゼで切断することによりアフィニティマトリクスからの穏やかな溶出が行われて、プロテオームまたはタンパク質複合体が第1のアフィニティ精製マトリクスから溶出される。非特異タンパク質、汚染物およびTEVプロテアーゼをすべて除去するために、第2のアフィニティ精製マトリクスを使用して第2のアフィニティ精製を行う。次に、EGTA溶出により、結合された目的タンパク質から、関連タンパク質を放出させる。単離したタンパク質を、変性ゲル電気泳動を用いてさらに単離する。各タンパク質バンドは、トリプシンで消化され、マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI−TOF MS)で解析される。このタンパク質を、NCBI SWISS−PROTまたは他の当業者には周知であるデータベースなどのデータベースでのProfound(商標)およびProtein Prospector(商標)などの周知のデータベース探索アルゴリズムにより同定し、プロテオーム内のタンパク質含有量ならびに、単離されたさまざまなプロテオーム構造間のタンパク質含有量について解析することができる。 Isolation of related proteins is performed by a two-step purification process. First, a first affinity purification is performed to isolate all proteins associated with the TAP-labeled protein. Gentle elution is performed from the affinity matrix by cleavage with TEV protease, and the proteome or protein complex is eluted from the first affinity purification matrix. In order to remove all non-specific proteins, contaminants and TEV protease, a second affinity purification matrix is used to perform a second affinity purification. Next, the relevant protein is released from the bound target protein by EGTA elution. The isolated protein is further isolated using denaturing gel electrophoresis. Each protein band is digested with trypsin and analyzed with a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF MS). This protein is identified by well-known database search algorithms such as Profound ™ and Protein Prospector ™ in databases such as NCBI SWISS-PROT or other databases well known to those skilled in the art, and contains proteins within the proteome The amount as well as the protein content between the various proteome structures isolated can be analyzed.
他の哺乳動物、原核生物、昆虫、菌または酵母ベクターも、本明細書内に開示した方法および組成と組み合わせて使用することができる。その例として、これに限定するものではないが、pBluescript、pCDNA3.1、pHAT、pIRES、pGBKT7、pVPack、pCMV−tag、pDual−GC、pBk−CMV、pIB−E、pMelBac、plueBac4、5/V5−His、pYDl、pPIC9K、pYES2、pIB/V5−His、pIZT/V5−His、pIZ/V5−His、pNMTl、pPICZ、pNMTsl、pMET、pPIC3JK、pGAPZ,pA0815、ならびに、原核生物、哺乳動物、酵母、菌または昆虫細胞発現系、あるいは異種発現系による遺伝子成分の組み合わせ内における発現に必要な遺伝子成分や、上記発現系の少なくとも1つで発現するように、異なる発現系からの遺伝子成分の組み合わせを組み入れた他のベクターが挙げられる。
組換えベクターのスクリーニング
転写解析
目的タンパク質の発現をスケールアップする前に、目的配列を含むベクターを、標的に対する正確な転写について評価することができる。cDNAのクローニングベクター内への正確な挿入を、アレイ形態におけるin vitro発現系、原核生物発現系、真核生物発現系または植物転写発現系を用いて評価し、精製された転写物のサイズ解析を行うことができる。好適な一実施形態が図13に示されている。この場合、in vitro転写解析により、発現および精製に使用する可能性のあるベクター構築物をプレスクリーニングする。適したベクター内へのインサートのクローニングから予め選択したベクター構築物を、ステップS100に示す、この例では3×6アレイであるアレイフォーマット内に配置して、同時に解析することができる。このベクター構築物は、さまざまな発現系から選択することができ、その発現系の例として、昆虫発現系、植物発現系(Geneware Vector(登録商標))(GWV)および細菌発現系(大腸菌)が挙げられる。インサートDNAを1つのクローニング内にうまく挿入できなかった場合には、A1〜A6として示すクローニング試料から複数のクローンをスクリーニングすると有用となり得る。ベクター構築物に、cDNAインサートの上流に位置するT7プロモーターまたはin vitro転写が可能な他のプロモーターを含めることができる。ステップS105として示すT7in vitro転写を、細菌T7TNAポリメラーゼの添加により開始し、ステップS110にて、RNAアガロース、ポリアクリルアミドまたは他種のRNAサイズ分離ゲル電気泳動またはRNA解析システムで転写物長さを解析することができる。転写物の予想サイズにしたがって、成功した反応S115および不成功だった反応S120を記録し、許容範囲内の転写物数が50〜75%などの所定閾値を下回っていれば、各(またはプレート全体)転写反応を繰り返すことができる。許容範囲内の転写物数が上述した所定閾値を下回っている場合、そのクローンを適した宿主ベクター内に再度形質転換して、引き続きT7ベクターを増幅および再精製し、次にT7RNAポリメラーゼを用いて転写することができる。
Other mammalian, prokaryotic, insect, fungal or yeast vectors can also be used in combination with the methods and compositions disclosed herein. Examples include, but are not limited to, pBluescript, pCDNA3.1, pHAT, pIRES, pGBKT7, pVPack, pCMV-tag, pDual-GC, pBk-CMV, pIB-E, pMelBac, pureBac4, 5 / V5 -His, pYDl, pPIC9K, pYES2, pIB / V5-His, pIZT / V5-His, pIZ / V5-His, pNMTl, pPICZ, pNMTsl, pMET, pPIC3JK, pGAPZ, pA0815, and prokaryotes, mammals, yeast A gene component required for expression in a combination of gene components by a fungal or insect cell expression system or a heterologous expression system, or a combination of gene components from different expression systems so as to be expressed in at least one of the expression systems Include other vectors incorporating Align.
Recombinant vector screening
Transcription analysis Prior to scaling up the expression of the target protein, the vector containing the target sequence can be evaluated for correct transcription to the target. Accurate insertion of cDNA into cloning vectors is evaluated using in vitro, prokaryotic, eukaryotic or plant transcriptional expression systems in array form, and size analysis of purified transcripts It can be carried out. One preferred embodiment is shown in FIG. In this case, in vitro transcription analysis pre-screens vector constructs that may be used for expression and purification. Pre-selected vector constructs from cloning of inserts into suitable vectors can be placed in an array format shown in step S100, in this example a 3 × 6 array, and analyzed simultaneously. This vector construct can be selected from a variety of expression systems, examples of which include insect expression systems, plant expression systems (Geneware Vector®) (GWV) and bacterial expression systems (E. coli). It is done. If the insert DNA cannot be successfully inserted into one cloning, it may be useful to screen multiple clones from the cloned samples shown as A1-A6. The vector construct can include a T7 promoter located upstream of the cDNA insert or other promoter capable of in vitro transcription. T7 in vitro transcription shown as step S105 is started by adding bacterial T7TNA polymerase, and in step S110, the transcript length is analyzed by RNA agarose, polyacrylamide or other kind of RNA size separation gel electrophoresis or RNA analysis system. be able to. Record successful reaction S115 and unsuccessful reaction S120 according to the expected size of the transcript, and each (or the entire plate) if the number of transcripts within an acceptable range is below a predetermined threshold such as 50-75% ) The transcription reaction can be repeated. If the number of transcripts within an acceptable range is below the predetermined threshold described above, the clone is retransformed into a suitable host vector, followed by amplification and repurification of the T7 vector, followed by T7 RNA polymerase. Can be transferred.
他の転写システムも、各クローン化されたcDNAベクトル内の成功した転写生成物の評価に使用可能である。そのシステム例として、SP6転写、T3RNAポリメラーゼ、または他のあらゆる転写システムが挙げられる。いずれのシステムの場合も、RNAポリメラーゼによる認識のために、適したプロモーター(それぞれのシステムに対してSP6およびT3プロモーター)が必要である。RNAポリメラーゼの添加および転写後、その転写物について、ポリアクリルアミド、アガロースまたのゲルによる電気泳動で、適切なサイズの転写物が含まれているかどうかを解析できる。
発現解析
目的配列をベクター内に正確に挿入したことを確認したら、タンパク質発現について評価して、タンパク質発現に対する最適なベクターおよび条件を判別することができる。別法として、ベクター構築物をタンパク質発現について直接試験して、転写やRNA解析すべてを省略することも可能である。いずれの形態においても、小規模でのタンパク質発現評価をスクリーニング方法体系として用いて、上述したタンパク質精製方法体系と併用するための最適なタンパク質発現系を決定できる。
Other transcription systems can also be used to evaluate successful transcription products within each cloned cDNA vector. Examples of such systems include SP6 transcription, T3 RNA polymerase, or any other transcription system. In any system, suitable promoters (SP6 and T3 promoters for each system) are required for recognition by RNA polymerase. After addition of RNA polymerase and transcription, the transcript can be analyzed by electrophoresis on polyacrylamide, agarose, or gel to determine whether it contains an appropriately sized transcript.
Once it has been confirmed that the target sequence for expression analysis has been correctly inserted into the vector, protein expression can be evaluated to determine the optimal vector and conditions for protein expression. Alternatively, the vector construct can be tested directly for protein expression, omitting all transcription and RNA analysis. In any form, an optimal protein expression system to be used in combination with the above-described protein purification method system can be determined using a small-scale protein expression evaluation as a screening method system.
タンパク質発現の評価を、植物、細菌、酵母、菌、昆虫および哺乳動物発現系などのさまざまな発現系内で行うことができる。好適な発現系は、目的タンパク質の発現に植物発現系を使用することである。しかし、上述したように、タンパク質によっては植物発現系内でうまく発現しない、または全く発現しない種類もある。他の発現系も、その宿主発現系の培養および増幅に利用可能な設備の種類に応じて、発現用に好都合な系となり得る。ベクターおよびインサートの試験を目的とする別の実施形態として、細菌、菌、酵菌、昆虫および哺乳動物発現系が挙げられる。 Assessment of protein expression can be performed in various expression systems such as plant, bacteria, yeast, fungus, insect and mammalian expression systems. A preferred expression system is to use a plant expression system for expression of the protein of interest. However, as mentioned above, some proteins do not express well in plant expression systems or do not express at all. Other expression systems can be convenient systems for expression depending on the type of equipment available for culturing and amplification of the host expression system. Other embodiments for testing vectors and inserts include bacterial, fungal, fermentative, insect and mammalian expression systems.
植物内のタンパク質発現はさまざまな方法で評価可能である。本発明による好適な一実施形態は、図14に示すように、ステップS130に示すプロトプラスト培養内およびステップS125に示す無傷な植物内双方におけるタンパク質発現を評価することである。ステップS125に示す無傷な植物に、目的のタンパク質配列(例えば、GWV=Geneware Vector(登録商標))を発現させた、適したウィルスベクターを感染させることができる。好ましくは、若い葉や茎に、目的配列を含んでタンパク質の外殻で包囲されたウィルスベクターを感染させる。ステップS135に示すように、ウィルスベクターを、エレクトロポーレーション、ボンバードメント(例えば、組換えウィルスベクターをコーティングした極微なチタンまたは金の顆粒を高速で細胞内に打ち込む)、または、目的のタンパク質配列を発現させる異種核酸を無傷な植物細胞内に導入する他の方法で、植物宿主内に挿入することができる。植物ベクターは、17〜28日齢(好ましくは21日齢)の1〜3本という少数の有機体内に挿入すればよい。図1のS2に示すように、ウィルスに感染した植物を、10〜16日(ただしより好ましくは12日)などの所定時間成長させる。成長した植物を採取して、感染した葉や茎を、磨り潰すと同時にホモジェネートを抽出するようにツインローラ式ドラムなどで磨り潰して、または、その植物材料を細かく磨り潰す他のいずれかの方法により処理する。こうして得られる抽出物が緑液汁であり、これをさらに処理して、発現したタンパク質を精製する。例えば、この緑液汁を、25mMのトリスpH8.0、500mMのNaCl、2mMのPMSF、および4%(w/v)PEGに調節された7mMの8−メルカプトエタノール緩衝液と1:2の比率で組み合わせ、1時間半4℃で放置した後、遠心処理を行うと、不純物を除いた緑液汁を得ることができる。この緑液汁を、Ni−NTAビードのスラリ20μlを入れた96ウェルMBPP(メルトブローンポリプロピレン)フィルタプレートに添加する。この緑液汁およびNi−NTAビードを1時間室温にてインキュベートした後、1000×Gにて5分間スピンして緑液汁をウェルから取り出す。Ni−NTAビードを洗浄して、非特異的に結合している緑液汁タンパク質を除去する。目的のアフィニティ標識タンパク質を、イミダゾールまたはEDTAインキュベーションによりビードから溶出させる。溶出したタンパク質を第2の96ウェルプレート内でスピンし、SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動)で、タンパク質の存在について検査する。当業者であればわかるように、緑液汁タンパク質の精製はさまざまな工程で行うことができ、その例として、譲受人と同じとするGargerらに付与された米国特許第6,037,456号に記載の工程;カリフォルニア州ValenciaのQiagenにより2001年3月に発行されたThe QIAexpressionist(登録商標) A Handbook for High−Level Expression and Purification of 6×His−tagged Proteins」に記載の工程が挙げられる。この初期試験ではわずかな量の発現タンパク質を産生することができ、その量を、μgまたはこれより小さな単位で測定可能とすることができる。 Protein expression in plants can be assessed in various ways. One preferred embodiment according to the present invention is to evaluate protein expression both in the protoplast culture shown in step S130 and in the intact plant shown in step S125, as shown in FIG. An intact plant shown in step S125 can be infected with a suitable viral vector that expresses the target protein sequence (eg, GWV = Geneware Vector (registered trademark)). Preferably, young leaves and stems are infected with a viral vector containing the target sequence and surrounded by a protein shell. As shown in step S135, the viral vector is electroporated, bombarded (for example, a fine titanium or gold granule coated with a recombinant viral vector is driven into the cell at high speed), or the target protein sequence is Other methods of introducing heterologous nucleic acid to be expressed into intact plant cells can be inserted into the plant host. What is necessary is just to insert a plant vector in the small organic body of 1-3 pieces of 17-28 days old (preferably 21 days old). As shown in S2 of FIG. 1, a plant infected with a virus is grown for a predetermined time such as 10 to 16 days (but more preferably 12 days). Collect the grown plants and grind the infected leaves and stems with a twin roller drum to extract the homogenate at the same time, or any other method to finely grind the plant material Process by. The extract thus obtained is green juice, which is further processed to purify the expressed protein. For example, this green juice is mixed with 25 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM PMSF, and 7 mM 8-mercaptoethanol buffer adjusted to 4% (w / v) PEG at a ratio of 1: 2. When the combination is allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour and a half and then centrifuged, a green juice from which impurities are removed can be obtained. This green juice is added to a 96 well MBPP (melt blown polypropylene) filter plate containing 20 μl of Ni-NTA bead slurry. After incubating the green juice and Ni-NTA beads for 1 hour at room temperature, the green juice is removed from the well by spinning at 1000 × G for 5 minutes. The Ni-NTA beads are washed to remove non-specifically bound green juice proteins. The affinity labeled protein of interest is eluted from the bead by imidazole or EDTA incubation. The eluted protein is spun in a second 96 well plate and examined for the presence of the protein by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis). As will be appreciated by those skilled in the art, green juice protein purification can be performed in a variety of steps, for example, in US Pat. No. 6,037,456 to Garger et al. The QIA expressionist® A Handbook for High-Level Expression of Purification and 6 × His-tagged process published in March 2001 by Qiagen, Valencia, California. This initial test can produce a small amount of expressed protein, which can be measured in μg or smaller units.
S130(図14)に示すタンパク質の発現には、無傷な植物に感染させるのではなく、植物細胞培養すなわちプロトプラストを植物ベクターでトランスフェクトするほうが望ましい場合がある。植物細胞培養アッセイ用に、標準分子生物プロトコルにしたがってプロトプラストを準備する。プロトプラストは、広範なソースに由来したものでよく、その例として、葉、葯、シュート、根尖、または他の利用可能な植物組織が挙げられる。好適な実施形態は、ニコチアナ・タバカムから得る葉材料の消化物である。他の植物も適したものであれば使用可能であり、それは、核酸の増殖やタンパク質の発現用に選択されたベクターの種類に応じて異なる。その例として、ジャガイモ、シロイヌナズナ、他の被子植物または維管束植物、ならびに苔類やゼニゴケ類を含む多種植物が挙げられる。単一細胞プロトプラストによる懸濁は、まず葉などの外植体組織を収集し、次亜塩素酸ナトリウムに暴露するなどの標準技術を用いてその組織表面を消毒する。次に、その外植体を酵素の適切なカクテルで消化して、単一細胞懸濁を得る。好適な実施形態では、ペクチナーゼ(Macerozyme R10、Pectolyase Y23、Rhozyme HP150および他のペクチナーゼ)およびセルラーゼ(Cellulase、Cellulysin、Driselaseおよび他のセルラーゼ)を使用することができる。ただし、各植物細胞を包囲している間質組織を消化する他の酵素カクテルも使用可能である。 For expression of the protein shown in S130 (FIG. 14), it may be desirable to transfect plant cell cultures or protoplasts with plant vectors rather than infect intact plants. Protoplasts are prepared according to standard molecular biology protocols for plant cell culture assays. Protoplasts can be derived from a wide range of sources, examples of which include leaves, buds, shoots, apex, or other available plant tissues. A preferred embodiment is a digest of leaf material obtained from Nicotiana tabacum. Other plants can also be used if they are suitable, depending on the type of vector selected for nucleic acid growth and protein expression. Examples include potatoes, Arabidopsis, other angiosperms or vascular plants, as well as various plants including moss and genus. Suspension with single cell protoplasts first disinfects the tissue surface using standard techniques such as collecting explant tissues such as leaves and exposing to sodium hypochlorite. The explant is then digested with an appropriate cocktail of enzymes to obtain a single cell suspension. In preferred embodiments, pectinases (Macerozyme R10, Pectolase Y23, Rhozyme HP150 and other pectinases) and cellulases (Cellulase, Cellulsin, Drisease and other cellulases) can be used. However, other enzyme cocktails that digest stromal tissue surrounding each plant cell can also be used.
酵素消化を行った後、プロトプラスト懸濁をマイクロタイタプレート(この例では2×3マイクロタイタプレートアレイであるが、他のマイクロタイタプレートも使用可能)内に当分し、洗浄してから適切な媒体で培養する。好ましくは、これを2枚で行う。好適な実施形態に、市販されている基本のMurashige and Skoog培地を使用することができるが、プロトプラストのin vitroにおける維持に必要なマクロおよびミクロ成分、可溶性炭素源、窒素ビタミン類および他の成長因子の平衡混合物を提供する他の媒体調製物も使用可能である。数多くの異なる組み合わせおよび範囲の媒体成分をプロトプラストの拡大にうまく使用できることは当業者には周知のことである。 After enzymatic digestion, the protoplast suspension is placed in a microtiter plate (in this example a 2 × 3 microtiter plate array, but other microtiter plates can be used) and washed for a suitable medium. Incubate at Preferably, this is done with two sheets. In preferred embodiments, commercially available basic Murashige and Skoog media can be used, but the macro and micro components, soluble carbon sources, nitrogen vitamins and other growth factors necessary for the maintenance of protoplasts in vitro Other media preparations that provide an equilibrium mixture of can also be used. It is well known to those skilled in the art that many different combinations and ranges of media components can be successfully used for protoplast expansion.
プロトプラストの懸濁および適した媒体内におけるインキュベーションを行った後、プロトプラスト細胞に、さまざまな方法でDNAまたはRNAをトランスフェクトすることができる。好ましくは、目的遺伝子をGENEWARE(登録商標)ベクター内に組み入れ、パッケージまたはタンパク質の外殻で包囲し、その包囲したウィルスをプロトプラストに感染させる。これにより、プロトプラストは適したベクターによりトランジエントにトランスフェクトされ、in vitroにて誘導されて、所望のタンパク質を発現する。外来遺伝子の植物細胞内への導入および発現には、直接的なDNAマイクロインジェクション、エレクトロポーレーション、リポゾーム担体、微粒子ボンバード(バイオリスティクス)、炭化ケイ素繊維、または他の方法も使用可能である。 After suspension of the protoplast and incubation in a suitable medium, the protoplast cells can be transfected with DNA or RNA in a variety of ways. Preferably, the gene of interest is incorporated into a GENEWARE® vector, surrounded by a package or protein shell, and the surrounded virus is infected with the protoplast. Thus, the protoplast is transiently transfected with a suitable vector and induced in vitro to express the desired protein. Direct DNA microinjection, electroporation, liposome carriers, fine particle bombards (biolistics), silicon carbide fibers, or other methods can be used for the introduction and expression of foreign genes into plant cells.
別法として、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが媒介するTi移入を、クローン化DNAの外来遺伝子の植物細胞内への導入および発現に使用することができる。例えば、クローン化DNAを、アグロバクテリウムが取り上げた適したベクター内に挿入することができる。挿入後、プロトプラストまたは無傷な植物を、DNAを含むアグロバクテリウムの存在下でインキュベートする。アグロバクテリウムは、Ti遺伝子の存在を通じて、形質転換および組込みをインサートDNAの植物細胞宿主内へ仲介する。引き続き、目的DNAを同時にトランスフェクトされた誘導性プロモーターの制御下にてタンパク質発現を誘導することができる。または、植物宿主下での発現を引き続き規制する天然プロモーターを、トランスフェクトすることができる。こうした天然プロモーターには、高レベルにて外来遺伝子を発現させるように改変することのできる、構成的に活性なプロモーターを含めることができる。 Alternatively, Agrobacterium tumefaciens-mediated Ti transfer can be used to introduce and express foreign DNA into the plant cell of cloned DNA. For example, the cloned DNA can be inserted into a suitable vector taken up by Agrobacterium. After insertion, protoplasts or intact plants are incubated in the presence of Agrobacterium containing DNA. Agrobacterium mediates transformation and integration into the plant cell host of insert DNA through the presence of the Ti gene. Subsequently, protein expression can be induced under the control of an inducible promoter cotransfected with the DNA of interest. Alternatively, a natural promoter that continues to regulate expression under a plant host can be transfected. Such natural promoters can include constitutively active promoters that can be modified to express foreign genes at high levels.
プロトプラストを、細胞内または分泌経路がタンパク質発現に使用されているかどうかを判別するための初期スクリーニングツールとして使用することも可能である。マイクロウェル培養プレートをまず遠心処理してプロトプラスト細胞を細胞培地から分離する。その培地を、プロトプラスト細胞溶解物と共に並行に精製するため、吸引して収集する。プロトプラスト細胞溶解物も培地も、ならびに無傷な植物によるホモジェネート懸濁も、Ni−NTAビードやNiキレートディスク(Pierce製Swell−Gel)などの金属結合マトリクスを含む96ウェルフィルタプレートの別々のウェルに添加する。分画間の流動物を廃棄し、金属結合マトリクス(Niアガロースなど)を40mM イミダゾール/0.5MNaCl/リン酸緩衝液(pH7.9)で洗浄する。次に、結合されているタンパク質を、1Mイミダゾール/0.5MNaCl/リン酸緩衝液(pH7.9)で溶出し、1Dまたは2Dポリアクリルアミドゲル上で解析する(図14のステップS140)。適したサイズの標的タンパク質が産生されていれば、その標的バンドを解析して、その発現レベルを定量する。プロトプラストサンプルに対する標的タンパク質はまた、どのサンプル単離体がHis標識タンパク質を含んでいるかに応じて、分泌された経路または細胞内タンパク質経路について注目される。 Protoplasts can also be used as an initial screening tool to determine whether intracellular or secretory pathways are being used for protein expression. The microwell culture plate is first centrifuged to separate protoplast cells from the cell culture medium. The medium is aspirated and collected for parallel purification with protoplast cell lysate. Protoplast cell lysates and media, as well as homogenate suspensions from intact plants, are added to separate wells of a 96 well filter plate containing a metal binding matrix such as Ni-NTA beads or Ni chelating discs (Swell-Gel from Pierce) To do. The fluid between fractions is discarded and the metal binding matrix (such as Ni agarose) is washed with 40 mM imidazole / 0.5 M NaCl / phosphate buffer (pH 7.9). Next, the bound protein is eluted with 1M imidazole / 0.5M NaCl / phosphate buffer (pH 7.9) and analyzed on a 1D or 2D polyacrylamide gel (step S140 in FIG. 14). If an appropriately sized target protein has been produced, the target band is analyzed to quantify its expression level. Target proteins for protoplast samples are also noted for secreted or intracellular protein pathways, depending on which sample isolate contains the His-tagged protein.
標的バンドを、1Dゲルでの同定によるだけでなく、1Dポリアクリルアミドゲルから切り出して、トリプシンMALDI−TOF(マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置)で解析することができる。この装置は、cDNAのベクター(正確な読みとり枠)内への正確な挿入を確実にし、正確なタンパク質発現を確認できるものである。まずタンパク質をポリアクリルアミドゲルから溶出し、そのタンパク質をトリプシンで消化し、その断片を精製した後、凍結乾燥し、適した溶剤内で可溶化することにより、トリプシンMALDIを実施することができる。その後そのサンプルを、MALDI−TOF質量分析装置または他のイオン脱離方法を用いて解析し、順次ペプチド切断および質量測定を行う。別の実施形態として、標的バンドを1Dポリアクリルアミドゲルから切り出す、またはニトロセルロースやPVDFの膜に移入させてその膜から溶出することができる。次に、単離したタンパク質を、標準タンパク質配列技術(例えば、エドマン分解法、または他のタンパク質配列方法)を用いて配列させることができる。さらに、単離したタンパク質にトリプシン消化を行った後、標準タンパク質配列技術を適用することができる(例えば、エドマン分解法、または他のタンパク質配列方法)。 The target band can be cut from a 1D polyacrylamide gel as well as by identification with a 1D gel and analyzed with trypsin MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometer). This device ensures accurate insertion of cDNA into a vector (accurate reading frame) and can confirm accurate protein expression. Trypsin MALDI can be performed by first eluting the protein from a polyacrylamide gel, digesting the protein with trypsin, purifying the fragment, lyophilizing and solubilizing in a suitable solvent. Thereafter, the sample is analyzed using a MALDI-TOF mass spectrometer or other ion desorption method, and peptide cleavage and mass measurement are sequentially performed. In another embodiment, the target band can be excised from a 1D polyacrylamide gel, or transferred to and eluted from a nitrocellulose or PVDF membrane. The isolated protein can then be sequenced using standard protein sequencing techniques (eg, Edman degradation, or other protein sequencing methods). In addition, after trypsin digestion of the isolated protein, standard protein sequencing techniques can be applied (eg, Edman degradation or other protein sequencing methods).
1DポリアクリルアミドゲルおよびMALDI−TOF MS上の解析を行った後、発現したタンパク質が正しいタンパク質である確率を、標準データベース解析を用いて算出することができる。 After analysis on 1D polyacrylamide gel and MALDI-TOF MS, the probability that the expressed protein is the correct protein can be calculated using standard database analysis.
図13について上述したのと同様に、図14に示すように、ステップS140における解析を、ステップS145では、発現したタンパク質に関する合格の判定に、ステップS150ではその不合格の判定に用いる。 As described above with reference to FIG. 13, as shown in FIG. 14, the analysis in step S <b> 140 is used to determine whether or not the expressed protein is acceptable in step S <b> 145 and to determine the failure in step S <b> 150.
ベクターおよびそのインサートを、細菌、菌、酵母、昆虫および哺乳動物発現系を用いて評価することもできる。例えば、トランスフェクトしたプロトプラスト培養や感染植物からタンパク質が発現しなかった場合、対応するMEVcDNAを大腸菌内の発現について解析して、植物やプロトプラスト内へのDNAトランスフェクションエラーがタンパク質の発現しなかった原因ではないことを確認することができる。別法として、細菌発現系、菌発現系、酵母発現系、昆虫発現系を植物発現系と並行して試験して、タンパク質の発現および精製に最適な発現系を決定してもよい。 Vectors and their inserts can also be evaluated using bacterial, fungal, yeast, insect and mammalian expression systems. For example, if no protein was expressed from a transfected protoplast culture or an infected plant, the corresponding MEV cDNA was analyzed for expression in E. coli and the cause of the DNA transfection error in the plant or protoplast was not expressed. It can be confirmed that it is not. Alternatively, bacterial expression systems, fungal expression systems, yeast expression systems, insect expression systems may be tested in parallel with plant expression systems to determine the optimal expression system for protein expression and purification.
cDNAベクターから外来タンパク質を原核生物宿主内に発現させるための、当業者には周知の方法が数多くある。好適な実施形態として、cDNAまたはゲノムDNAインサートを含むMEVベクターを用いる、NovaBlue DE3などの大腸菌の適した宿主株の96ウェルフォーマット内での形質転換が挙げられる。この転換体を、使用するベクターに応じて選択した抗体を含む固体培地上に配置し、96ディープウェルブロック内にて37℃にて一晩増殖させることができる。増殖させた大腸菌培養を、イソチオプロピル・ガラクトシド(IPTG)を含む新鮮培地内に希釈し、そのベクター内の□−ガラクトシダーゼプロモーターを通じてタンパク質の発現を誘導する。別法として、大腸菌の他の株または適した原核生物宿主株を、ベクターDNAおよびそのインサート、ならびに、温度依存発現または他の誘導性発現系などの代替誘導性プロモーター系を含む他のベクターの増殖に使用することができる。 There are a number of methods well known to those skilled in the art for expressing foreign proteins from a cDNA vector in a prokaryotic host. Preferred embodiments include transformation in a 96 well format of a suitable host strain of E. coli, such as NovaBlue DE3, using a MEV vector containing a cDNA or genomic DNA insert. This transformant can be placed on a solid medium containing an antibody selected according to the vector used and grown overnight at 37 ° C. in a 96 deep well block. The grown E. coli culture is diluted in fresh medium containing isothiopropyl galactoside (IPTG) and protein expression is induced through the □ -galactosidase promoter in the vector. Alternatively, other strains of E. coli or suitable prokaryotic host strains may be propagated with other vectors containing vector DNA and its inserts, and alternative inducible promoter systems such as temperature dependent expression or other inducible expression systems. Can be used for
規定時間による対数増殖の後、2マイクロリットルの培養を8×12グリッドのニトロセルロース膜上にスポットし、標的タンパク質またはタグに対する抗体を用いて、ウェスタンブロットを行うことができる。別法として、発現したタンパク質とそこに付着したヘキサ−ヒスチジンタグとを、上述した96ウェルフィルタプレートのSwell−Gel Niキレートディスクマトリクス上に単離して精製することもできる。溶出したタンパク質を、1Dポリアクリルアミドゲル上で解析して、適したサイズの発現であったかどうかを判別することができる。また、トリプシンMALDI−TOFを、切り出したタンパク質バンドに実施して、さらに同定することができる。
タンパク質発現のスケールアップ
タンパク質の評価およびスクリーニングを行った後、タンパク質の発現および精製をスケールアップすることができる。図1のS3に示すように、タンパク質の評価には、所望のタンパク質が発現したことの確認、植物当たりに得られた植物量、および標的タンパク質の発現レベルが含まれる。次に、図1のS4に示すように、得られた植物量および標的タンパク質発現レベルを用いて、所望量の標的タンパク質の産生に必要な有機体(すなわちタバコ植物)の数を算出する。図1のS4に示すように、所望量の標的タンパク質の産生に必要な数の有機体(すなわちタバコ植物)が植えられ、この有機体に、その中で発現させたいトランスジェニックウィルスおよびタンパク質を感染させる。ステップS1〜ステップ4に類似した一連のステップを、哺乳動物系、酵母系、昆虫系または細菌系タンパク質産生系の使用に適用できることを理解されたい。
After logarithmic growth for a defined time, 2 microliters of culture can be spotted onto an 8 × 12 grid of nitrocellulose membrane and Western blots can be performed using antibodies against the target protein or tag. Alternatively, the expressed protein and the hexa-histidine tag attached thereto can be isolated and purified on the Swell-Gel Ni chelate disk matrix of the 96 well filter plate described above. The eluted protein can be analyzed on a 1D polyacrylamide gel to determine if the expression was of an appropriate size. Alternatively, trypsin MALDI-TOF can be performed on the excised protein band for further identification.
Protein expression scale-up After protein evaluation and screening, protein expression and purification can be scaled up. As shown in S3 of FIG. 1, the protein evaluation includes confirmation that the desired protein was expressed, the amount of plant obtained per plant, and the expression level of the target protein. Next, as shown in S4 of FIG. 1, using the obtained plant quantity and target protein expression level, the number of organisms (ie, tobacco plants) necessary for production of a desired quantity of target protein is calculated. As shown in S4 of FIG. 1, the required number of organisms (ie tobacco plants) for the production of the desired amount of target protein are planted and infected with the transgenic virus and protein that are to be expressed therein. Let It should be understood that a series of steps similar to step S1 to step 4 can be applied to the use of mammalian, yeast, insect or bacterial protein production systems.
図1においてS6およびS7として示すステップについて、図3および図4を参照しながら詳しく説明する。図3のS10に示すように、複数種類のタンパク質が、GENEWAREX(登録商標)発現系などの被選択発現系内に発現できるようになっている。 Steps indicated as S6 and S7 in FIG. 1 will be described in detail with reference to FIGS. As shown in S10 of FIG. 3, a plurality of types of proteins can be expressed in a selected expression system such as a GENEWAREX (registered trademark) expression system.
タバコ植物を採取し、ワーリングブレンダーや市販のジューサーなどの内部にて分解することにより、図3のS11として示すように、所望の1種類または複数種類のタンパク質をその葉の細胞から緑液汁として放出させる。通常、抽出緩衝液に対する生物量の比は1:2であり、その緩衝液を、抽出前に植物材料内に真空浸潤させることができる。一般的抽出組成物は、25mMのトリスpH8.0、500mMのNaCl、2mMのPMSF、および7mMの8−メルカプトエタノールであり、これに1%(w/v)以下のTween−20と5%(w/v)以下のアスコルビン酸ナトリウムとを含有させてもよい。次に、図3のS12として示すように、緑液汁を、NaCl内に通常通常4%(w/v)で含まれるポリエチレングリコール(PEG)(濃度は300mM〜2M)などの洗浄剤で処理する。しかし、ポリビニルピロリドン(PVPP)などの洗浄剤を単独でまたはPEGと組み合わせて使用してもよいことを理解されたい。PEGは、本願発明者らにより、より多くのかなりのクロロフィル含有タンパク質および膜複合体を除去して、クロマトグラフィカラムへの装填を可能にするほど緑液汁を十分に透明としつつ、より小さなサイズのタンパク質(および目的タンパク質)を緑液汁内に懸濁させておく洗浄剤であることがわかっている。具体的に言えば、PEGを水溶液である緑液汁に添加すると、より多くのタンパク質が相互作用するため、その凝集体が遠心処理または濾過により溶液から排出されやすくなる。 A tobacco plant is collected and decomposed inside a Waring blender, a commercially available juicer, etc., and as shown as S11 in FIG. 3, one or more desired proteins are released as green juice from the leaf cells. Let Usually the ratio of biomass to extraction buffer is 1: 2, which can be vacuum infiltrated into the plant material before extraction. A typical extraction composition is 25 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM PMSF, and 7 mM 8-mercaptoethanol to which 1% (w / v) or less Tween-20 and 5% ( w / v) The following sodium ascorbate may be contained. Next, as shown as S12 in FIG. 3, the green juice is treated with a cleaning agent such as polyethylene glycol (PEG) (concentration is 300 mM to 2 M), which is usually contained at 4% (w / v) in NaCl. . However, it should be understood that detergents such as polyvinylpyrrolidone (PVPP) may be used alone or in combination with PEG. PEG is a smaller size protein that allows the inventors to remove more significant chlorophyll-containing proteins and membrane complexes, making the green juice sufficiently transparent to allow loading into a chromatography column. (And the target protein) has been found to be a detergent that suspends in green juice. Specifically, when PEG is added to green juice, which is an aqueous solution, more proteins interact, and the aggregates are easily discharged from the solution by centrifugation or filtration.
洗浄剤で処理した緑液汁を、少なくとも2通りある方法の一方で処理することができる。第1の方法は、図3のS13に示すように、PEGで処理した緑液汁に濾過処理を施すことである。この処理には、緑液汁にパーライト(火山岩)などの濾過補助剤を混合して、その最終濃度を1%(w/v)〜10%(w/v)、好ましくは、4%(w/v)とする。次に、緑液汁を、平均孔サイズが1.2ミクロンであり、パーライトでコーティングしたガラス繊維フィルタ内に通過させる。緑液汁は浄化されて通過するが、パーライトおよびより大きなタンパク質凝集体はフィルタ内に留まる。次に、浄化された緑液汁に、図3のS15として示すステップを施すことができる。ただし、図3のS15として示すステップは任意であり、必須ではないことを理解されたい。 The green juice treated with the detergent can be treated in at least one of two ways. The first method is to subject the green juice treated with PEG to filtration, as shown in S13 of FIG. In this treatment, a greenery juice is mixed with a filter aid such as pearlite (volcanic rock), and the final concentration is 1% (w / v) to 10% (w / v), preferably 4% (w / v). v). The green juice is then passed through a glass fiber filter having an average pore size of 1.2 microns and coated with pearlite. Green juice is clarified and passes, but perlite and larger protein aggregates remain in the filter. Next, the step shown as S15 of FIG. 3 can be given to the purified green juice. However, it should be understood that the step shown as S15 in FIG. 3 is optional and not essential.
もう1つの方法は、ステップS12の後、PEGで処理した緑液汁に、3700Gの力でおよそ20分間遠心処理を施して、図3のS14として示すように、より大きなタンパク質凝集体を、浄化した緑液汁から分離する。ミラクロスを通過する濾過により、うまく細かくならない破壊片が引き続き除去される。このように、クロマトグラフィに適した緑液汁を生成するだけでなく、どちらの浄化方法によっても、感染性ウィルス力価が同様に低下することがわかる。 Another method was to purify larger protein aggregates as shown as S14 in FIG. 3 by centrifuging the green juice treated with PEG for approximately 20 minutes at a force of 3700G after step S12. Separate from green juice. Filtration through the Miracloth continues to remove debris that does not become fine. Thus, it can be seen that in addition to producing green juice suitable for chromatography, both purification methods similarly reduce the infectious virus titer.
必要に応じて、浄化した緑液汁に、図3のS15として示す冷凍解凍処理を施す。具体的に言えば浄化した緑液汁を、ステップS13またはステップS14で冷凍および解凍した後、図3のステップS16に示すように、再遠心処理を施す。冷凍解凍処理により、澱粉状材料および別の汚染性植物タンパク質を沈殿させ、さらに遠心処理または濾過処理を施すことにより、これを浄化した緑液汁から分離する。このステップS15は、濾過または遠心処理後の緑液汁の透明度に応じて任意に行われるものであり、下流の精製ステップを補助するものではあるが、本発明に必須のステップではない。 If necessary, the purified green juice is subjected to a freezing and thawing process shown as S15 in FIG. Specifically, the purified green juice is frozen and thawed in step S13 or step S14, and then re-centrifugated as shown in step S16 of FIG. By freezing and thawing treatment, the starchy material and other contaminating plant proteins are precipitated, and further subjected to centrifugal treatment or filtration treatment to separate them from the purified green juice. This step S15 is arbitrarily performed according to the transparency of the green juice after filtration or centrifugation, and assists the downstream purification step, but is not an essential step in the present invention.
次に、異なるタンパク質を含む複数種類のサンプルを同時に精製できるように、浄化した緑液汁の量を正規化する。正規化にあたり、尿素またはグリセロールを添加して、サンプルを所定の濃度および/またはpH調節値にすることができる。例えば、尿素の濃度を50mM〜4Mにし、グリセロールの濃度を5%(w/v)〜50%(w/v)にして、NaOH(水酸化ナトリウム)またはリン酸ナトリウムあるいはトリス緩衝液を用いて、pHを7.2〜7.3から7.5〜8.0へと上昇させることができる。正規化する間はpHの調節のみ実施できることを理解されたい。さまざまな量の尿素およびグリコールは、所望する目的タンパク質の特徴および性能に応じて、含有させてもさせなくてもよい。
浄化され正規化された緑液汁を、図4のステップS17に示すように、図5〜図11を参照しながら以下に説明する装置などの精製装置内に投入する。
ここで、図4に示した本発明の方法に関する説明を、図5〜図11に示す装置の説明と突き合わせる。
Next, the amount of purified green juice is normalized so that multiple types of samples containing different proteins can be purified simultaneously. For normalization, urea or glycerol can be added to bring the sample to a predetermined concentration and / or pH adjustment value. For example, the concentration of urea is 50 mM to 4 M, the concentration of glycerol is 5% (w / v) to 50% (w / v), and NaOH (sodium hydroxide), sodium phosphate, or Tris buffer is used. The pH can be increased from 7.2 to 7.3 to 7.5 to 8.0. It should be understood that only pH adjustments can be made during normalization. Various amounts of urea and glycol may or may not be included depending on the desired target protein characteristics and performance.
As shown in step S17 of FIG. 4, the purified and normalized green juice is put into a purifying apparatus such as the apparatus described below with reference to FIGS.
Here, the description of the method of the present invention shown in FIG. 4 is matched with the description of the apparatus shown in FIGS.
図5に示すように、本発明の精製装置は、本発明の精製装置は、図4の工程系統図のステップS17に示すように、浄化した緑液汁および緩衝液をまず充填する給送リザーバ5を含む。精製工程中、この給送リザーバ5は、水と氷の混合物などの冷却材で充填されたこれより大きな容器10内に浸漬されている。これにより給送リザーバ5および浄化した緑液汁を10℃未満、好ましくは約4℃、より好ましくは0℃近く、ただし緑液汁の凍結点よりは高い温度に維持する。酸化およびプロテアーゼ活性を最小限に抑えるため、浄化した緑液汁をほぼ低温に維持することが望ましい。浄化した緑液汁の温度を凍結点より高く、ただし10℃未満に維持するため、水および氷などのあらゆる冷却剤を容器10内で使用可能であることを理解されたい。別法として、冷蔵機構を用いて、容器5の周囲を低温に維持することも可能である。図示していないが、給送リザーバ5、これより大きな容器10、および流動貫通収集リザーバ70(以下で説明)をロボット式流体ハンドラ内に配置して、流体類をより自動化された方法で操作してもよい。こうした流体ハンドラとして、さまざまなロボット式流体取り扱い装置のいずれも使用可能であるが、例として、ロボット式サンプルプロセッサであるGenesis RSP、モジュラ自動ワークステーションであるGenesis Freedom、または自動ワークステーションであるGenesis Workstationなどのモデルを含むスイス、ZurichのTECANにより製造販売されている装置が挙げられる。
As shown in FIG. 5, the purifying apparatus of the present invention is a feeding
給送リザーバ5はチューブ15に接続され、このチューブ15は第1のバルブ20に接続される。第1のバルブ20はチューブ25に接続され、このチューブ15はさらに、ポンプ30に接続される。ポンプ30はさまざまなポンプのいずれでもよいが、好ましくは、浄化した緑液汁を本発明の精製装置内をほぼ低速で貫通させる低速ポンプとする。例えば、ポンプ30を、流動速度範囲を0.01〜44.4mL/分とするISMATEC(登録商標)製速度可変ポンプ蠕動ポンプとすることができる。このポンプはまた、それぞれを専用精製装置内に入れる、図7を参照しながら以下で説明する方法で、複数種類のタンパク質を同時に精製できる多チャネル式ポンプである。
The
このポンプ30を第2のバルブ40に接続する。第2のバルブはチューブ45に接続され、このチューブはカラム50に接続される。カラム50は、第3のバルブ60に接続される配管55に接続される。第3のバルブ60は、チューブ65に接続され、このチューブは流動貫通収集リザーバ70に接続される。以下の説明から、給送リザーバ5に充填された緑液汁が、ポンプ30の注入動作を介して、給送リザーバ5からそれぞれのチューブ15、25、35、45、55および65を通過し、カラム50およびバルブ20、40および60を通過して収集リザーバ70内に収容されることを理解されたい。
This
カラム50には、材料を中に保持しつつ流体流を貫通させることにより、流動する流体と保持している材料とを接触させて、これらの間に相互作用を起こすことのできる多孔質フリットが具備されている。本発明の精製装置において、カラム50内のこの材料は、例えば、Qiagen(商標)として市販されている例などのアフィニティ樹脂、またはこれと同様の、所望の目的タンパク質を一時的に保持するための材料である。浄化した緑液汁をカラム50内に流動させると、目的タンパク質がこのアフィニティ樹脂に付着して保持される。
The
バルブ20、40および60はそれぞれ、チューブ75、80および85に接続され、さまざまな目的で精製装置内に具備される。精製モードにおいて、バルブ20は、流体をチューブ15からチューブ25まで連通(流体流動)させるように設定される。バルブ20を、洗浄、精製した目的タンパク質の除去(これについては以下で説明する)、またはポンプ30およびシステムの平衡化の準備などを目的として、流体をチューブ75からチューブ25まで流動させるように設定することも可能である。バルブ20を、流体をチューブ15からチューブ75まで流動させるように設定することも可能である。
精製モードにおいて、バルブ40は、流体をチューブ35からチューブ45まで連通させるように設定される。ただし、バルブ40を、ポンプ30の洗浄または準備を目的として、流体をチューブ35からチューブ80まで流動させるように設定することも可能である。あるいは、バルブ40を、カラム50の洗浄または精製した目的タンパク質の除去を目的として、流体をチューブ80からチューブ45まで流動させるように設定することも可能である。
精製モードにおいて、バルブ60は通常、流体をチューブ55からチューブ65まで連通させるように設定される。バルブ60を、カラム50の洗浄またはカラム50内で精製した目的タンパク質の除去を目的として、流体をチューブ55からチューブ85まで流動させるように設定することも可能である。バルブ60を、流体をチューブ85からチューブ65まで流動させるように設定して、チューブ65のフラッシュおよび洗浄を可能にすることもできる。
In the purification mode, the valve 40 is set to allow fluid to communicate from the tube 35 to the
In the purification mode,
バルブ40は任意の構成要素であり、別法として、装置の用途に応じて、図5に示す装置から省くこともできることを理解されたい。 It should be understood that the valve 40 is an optional component and may alternatively be omitted from the apparatus shown in FIG. 5 depending on the application of the apparatus.
このシステムを配置する環境によって、システムの始動準備が必要となり得る。具体的に言えば、バルブ20および85を操作することにより、流体を容器100からライン15、ライン25、ポンプ30、ライン35、ライン45およびライン55に導入することができる。通常、このシステムの準備は、カラム50を取り出した状態で、ライン45および55を直接相互接続することにより行われる。この準備が終了したら、図5に示すように、着脱式カラム50をライン45とライン55との間に再び挿入する。この準備工程において、チューブ15を準備流体で充填する。準備の段階ではリザーバ5に緑液汁は入っておらず、準備が完了したら自動流体ハンドラを介してリザーバ5内に緑液汁を注入できることを理解されたい。ライン45および55に特殊連結部(図示せず)を具備してもよい。これにより、準備工程時のカラム50の着脱が容易となる。
Depending on the environment in which the system is deployed, it may be necessary to prepare the system for startup. Specifically, by operating
この精製システムの操作にあたり、浄化した緑液汁を液汁容器5内に投入する。投入後、ポンプ30を作動して、浄化した緑液汁を液汁容器5から引き出し、チューブ15、バルブ20、当然ながらポンプ30、チューブ35、チューブ45、およびバルブ40を通過させ、カラム50内へと流入させる。カラム50では、浄化した緑液汁がカラム50内に配置されている材料と相互作用し、理想的には、すべての目的タンパク質がカラム50内に保持され、残りの緑液汁部分がカラム50から基本的に廃棄物として流出する。この廃棄液汁はチューブ55、チューブ65およびバルブ85を通過して、収集リザーバ70内 に流入する。
In the operation of this purification system, the purified green juice is put into the
図4に戻ると、図4のS18に「カラムの平衡化」として示すように、精製前に、精製モード開始前のアフィニティ樹脂およびカラム50の条件を整えなければならない。カラム50を平衡化するために、図8に示すように、容器5内の緑液汁および緩衝液の性質を刺激する平衡化溶液を容器100内に投入する。例えば、平衡化溶液のpHを通常、浄化した緑液汁および緩衝液と等しくし、尿素、PEGおよび/またはグリセロールを、緑液汁および緩衝液に含有されていれば同じ濃度で平衡化溶液に含有させる。この平衡化溶液を、図8に示すように、容器100からカラム50を通過させ、配管85を介して廃棄する。
Returning to FIG. 4, the conditions of the affinity resin and the
その後、バルブ20および60を精製モードに設定して、図9および図4のS19に示すように、浄化した緑液汁および緩衝液混合物を容器5からカラム50を介して収集リザーバ70へ注入する。上述したように、アフィニティ樹脂が、タンパク質内のタグとの相互作用により、目的タンパク質を捕捉する。ポンプ30により、カラム5つまりアフィニティ樹脂内の滞留時間が30秒〜5分となるように、浄化した緑液汁および緩衝液混合物を所定速度でカラム50内を通過させる。ただし好ましくは、緑液汁のカラム内滞留時間がおよそ1分となる一定速度で、緑液汁および緩衝液混合物をポンプ30で注入する。
混合物全体がカラム50を通過した後、図4のステップS20に示すように、汚染物を洗い流し、特定の緩衝液成分、例えばPEGおよび尿素を除去しなければならない。図10に示すように、汚染物は、プロポーショニングバルブ115を介した、容器105および容器110内に保管されている2種類の溶液の少なくとも一方で、カラム50から洗い出される。例えば、多種タンパク質に対して、低濃度の拮抗阻害剤イミダゾール(10〜90mM)を含む容器110内の緩衝液を用いて、汚染されたタンパク質とアフィニティ樹脂との相互作用を削減することができる。別法として、容器110内の溶液に当初、浄化した緑液汁と同様の濃度で尿素、グリセロールおよび/またはPEGを含有させる。これをカラム50内に通過させ、その流動量を、容器105からの流動量を直線的に増加させるにつれて、漸次直線的に低下させる。リザーバ105内の緩衝液は、異なる濃度、尿素、グリセロールおよび/またはPEGを含有しており、その濃度は通常ゼロである。したがって、不要な成分の濃度はこの工程中に漸次低下する。カラム50内の状態が急激に変化すると保持されている標識タンパク質に悪影響を及ぼすことがあるが、これにより、カラム50内の状態を急速に変化させずにすむ。図10に示すように、洗い出された成分は、配管85を介して排出される。
Thereafter, the
After the entire mixture has passed through the
次に、図4のステップS21に示すように、カラム50を溶出して、目的タンパク質を取り出し、図11に示すようにリザーバ内へ給送する。通常、100〜200mMのイミダゾールやEDTAを含む燐酸緩衝生理食塩水などの所定の溶出液が、図5および図11に示すリザーバ127内に供給される。図11に示すように、リザーバ127内の溶液を、バルブ90および20を介してカラム50から給送して、捕捉されている目的タンパク質をカラム50内のアフィニティ材料から放出させ、これをリザーバ118内に捕捉する。
別法として、カラム50からの溶出前に、洗浄した後に復元緩衝液(例えば、燐酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、または復元に用いられる他の緩衝液)をリニアグラジエントで導入することにより、目的タンパク質をカラムマトリクス上でin situにリフォールドしてもよい。例えば、数多くのヒスチジン標識タンパク質が変性条件下で精製されると、そのヒスチジンタグがカルボキシ末端かアミノ末端にて露出されるため、金属アフィニティマトリクス上に含まれる結合基とのこのタグの結合量が増加する。ヒスチジン標識タンパク質は引き続き、カラム内を通過する緩衝液のpHを低下させることにより、または高濃度のイミダゾールまたはEDTAを導入することにより、変性された状態で金属アフィニティマトリクスから溶出される。溶出されたタンパク質は、濃度がより高い場合に特に、溶液から落下する、または沈降する場合がある。これは、溶出されたタンパク質の変性状態を原因として暴露された疎水基間における分子間相互作用によるものと考えられる。タンパク質が再溶解できない場合、タンパク質の収穫量全体は少なくなる。しかし、洗浄後に復元緩衝液をリニアグラジエントで導入することにより、タンパク質は、アフィニティマトリクスに結合しながらリフォールドできる可能性がある。リフォールドしている間、先に露出されていた疎水基は遮蔽されるため、分子間の疎水性相互作用およびタンパク質の沈降を避けることができる。
Next, as shown in step S21 of FIG. 4, the
Alternatively, before elution from the
タンパク質のリフォールドを誘導するようにグラジエントを用いることが重要である。本願が請求する方法は、本願による機構の理解に応じてその実施に変化のあるものではないが、復元緩衝液を漸次導入することにより、タンパク質をアフィニティマトリクスに結合させつつタンパク質の適切なフォールディングを補助して、結合したタンパク質に、複雑な三次構造または四次構造に適切にリフォールドする時間を与えられると考えられる。目的タンパク質をカラム上でリフォールドさせた後、溶出緩衝液を導入して、そのタンパク質をカラムから溶出することができる。 It is important to use a gradient to induce protein refolding. The method claimed by the present application does not change its implementation according to the understanding of the mechanism by the present application. However, by gradually introducing a restoration buffer, the protein is properly folded while binding the protein to the affinity matrix. In assistance, the bound protein may be given time to properly refold into a complex tertiary or quaternary structure. After refolding the target protein on the column, an elution buffer can be introduced to elute the protein from the column.
目的タンパク質をin situでリフォールドさせつつ、アフィニティマトリクスに結合させたい場合、リニアグラジエントメーカーを使用することができる。リニアグラジエントメーカーを使用すると、復元緩衝液を一定量または一定時間にわたり漸次導入することができる。リニアグラジエントメーカーに少なくとも1つのポンプまたはプロポーショニングバルブを具備して、図5および図10に示すリザーバ105および110などの、開始用緩衝液および最終緩衝液を含む2つのリザーバからその液を抜き出すことができる。例えば、第1のリザーバに変性緩衝液を、第2のリザーバに復元緩衝液を含めることができる。第1のリザーバと第2のリザーバとの間に位置する調節バルブまたはプロポーショニングバルブ115が、この2種類の緩衝液の流入量を調節して、第2のリザーバから第1のリザーバへ流動するカラムランニング緩衝液の組成を変更する。カラムランニング緩衝液の組成は、ランニング当初は主に変性緩衝液からなる。この緩衝液組成は、第2のリザーバから第1のリザーバへの復元緩衝液の導入に伴って漸次変化し、最終的にカラムランニング緩衝液は復元緩衝液のみを含んで、タンパク質を徐々にリフォールドさせる。別法として、混合チャンバ(図示せず)を使用できる。この場合、第1のリザーバおよび第2のリザーバ内の溶液は、その混合チャンバ内に注入されてからカラムを通過する。上記と同様に、第1のリザーバと第2のリザーバとの相対比率は変化し、ランニング緩衝液の組成は、ランニング開始時は主に変性緩衝液からなり、ランニング終了時には主に復元緩衝液からなる。タンパク質のフォールディング時に、溶出緩衝液を通過させて、その標識タンパク質をアフィニティマトリクスから除去することができる。
A linear gradient maker can be used to bind to the affinity matrix while refolding the target protein in situ. Using a linear gradient maker, the reconstitution buffer can be gradually introduced over a certain amount or time. A linear gradient maker with at least one pump or proportioning valve to draw its fluid from two reservoirs, including the starting buffer and the final buffer, such as
リニアグラジエントではなく段階的に、復元緩衝液の漸次導入を行うことができる。例えば、塩または尿素濃度を下げた緩衝液を段階的にカラムに流動させることができる。当業者であれば、復元緩衝液を漸次導入して、変性された目的タンパク質のリフォールドをアフィニティマトリクスにてin situで実施するためにさまざまな方法があることは明白であろう。 The restoration buffer can be gradually introduced step by step instead of a linear gradient. For example, a buffer with a reduced salt or urea concentration can be flowed stepwise into the column. It will be apparent to those skilled in the art that there are various ways to gradually introduce reconstitution buffer and perform the refolding of the denatured target protein in situ in the affinity matrix.
タンパク質には、互いから分離しにくい種類がある。したがって、図6に示す代替実施形態では、別法として、図5に示した装置に犠牲カラム46を追加することができる。具体的に言えば、図6において、犠牲カラム46をチューブ45に接続して、チューブ45から流出する液汁すべてがカラム46内に流入するようにチューブ45と流体連通状態とする。カラム46をさらにチューブ47に接続して、この間を流体連通にする。チューブ47はバルブ48に、バルブ48はチューブ49に、チューブ49は上述したカラム50にそれぞれ接続される。これ以外の、図6に示すシステムの構成要素はすべて、図5に示した実施形態の構成要素と同じである。
There are several types of proteins that are difficult to separate from each other. Therefore, in the alternative embodiment shown in FIG. 6, a sacrificial column 46 may alternatively be added to the apparatus shown in FIG. Specifically, in FIG. 6, the sacrificial column 46 is connected to the
バルブ48はチューブ90にも接続される。精製モードにおいて、バルブ48は、チューブ47からの液汁をチューブ49に方向付け、カラム50内に流動させる。ただし、バルブ48を、チューブ47とチューブ90との間を流体連通させるように設定することも可能である。さらに、バルブ48を、以下で説明するように洗浄、フラッシュまたは精製したタンパク質の除去を目的として、チューブ90とチューブ49との間を流体連通させるように設定することも可能である。
また、図9に示すように、緑液汁がカラム50を複数回通過できるように、この装置に循環バルブ200を設けてもよい。
In addition, as shown in FIG. 9, a
図12に示すように、図5〜図11に示す本発明による装置の各実施形態を自動制御するために、コンピュータを設ける。具体的に言えば、このコンピュータを装置のポンプおよびさまざまなバルブに接続する。図5および図8〜図11に示したシステムの操作に関する上記説明が、図6の装置および図7の装置にも適用可能であることを理解されたい。
図7の装置は、複数の流動チャネルが別個に設けられて専用のカラム50を有したシステムを示している。カラム50はそれぞれ並行に動作して、複数種類のタンパク質を同時に精製する。具体的に言えば、ポンプ30のそれぞれに連結された単一蠕動ポンプモータMにより、複数の流動チャネルの注入動作が得られるため、緑液汁を複数のカラム内に同時に流動させることができる。また、給送リザーバ5それぞれが、単一アイスバス内に浸されている。蠕動ポンプモータの操作により所望のカラム滞留時間が得られる。これにより、上述したように、緑液汁がカラム50内を一定速度で流動することにより緑液汁から目的タンパク質を高い信頼性で捕捉できる。流動速度が遅いため、許容範囲の目的タンパク質の精製を得るにはかなりの時間がかかる可能性がある。図5に示した装置の流動チャネルのように流動チャネルが1つのみであれば、複数種類のタンパク質精製には膨大な時間がかかる。したがって、単一装置内に複数の流動チャネルを平行に設けることにより、複数種類のタンパク質を同時に抽出することができ、タンパク質精製工程に大きな利点となる。
As shown in FIG. 12, a computer is provided to automatically control each embodiment of the apparatus according to the present invention shown in FIGS. Specifically, the computer is connected to the device pump and various valves. It should be understood that the above description regarding the operation of the system shown in FIGS. 5 and 8-11 is also applicable to the apparatus of FIG. 6 and the apparatus of FIG.
The apparatus of FIG. 7 shows a system having a dedicated
図12に示すコンピュータは、ポンプ30のモータMに、または別法として単一ポンプ30、バルブ20、40、60、90および115に接続される。このコンピュータをさらに、温度センサTおよび圧力センサ(図示せず)に接続して、多チャンバシステムを制御させることができる。あるいは、圧力センサを、カラム50の下流および上流にて装置上に設けて、これらの間の流体流動を制御させることも可能である。さらに、図6および図9に示す代替実施形態では、バルブ44、48および200にコンピュータを接続して、これらの制御を行うこともできる。
The computer shown in FIG. 12 is connected to the motor M of the
図12に示すコンピュータは、図1のブロック線図に示すLIMS(実験室情報管理システム)の一部であり、LAN(ローカルエリアネットワーク)により図2に示すサーバに接続されている。図1に示すように、LIMSは、本発明による工程の統合部分であり、遺伝子配列、タンパク質の発現に使用するDNA配列、発現したタンパク質、各タンパク質の生成量、こうしたタンパク質の生成に使用する発現系、プレスクリーニング工程に関連する全データ、探索したデータベース情報の相関関係、および目的タンパク質を産生および精製するために実行されるさまざまなステップなどの生物学的材料すべてについて追跡するためのソフトウェアを含んでいる。LIMSは、図2に示すコンピュータシステムおよび図12に示すコンピュータを含み、図12に示したコンピュータはさらに、このコンピュータで、さまざまなバルブ20、40、60、90および115と任意のバルブ44、48および200を制御して、上述したように目的タンパク質を単離および溶出させられるようにするプログラミングを含んでいる。
The computer shown in FIG. 12 is a part of the LIMS (laboratory information management system) shown in the block diagram of FIG. 1, and is connected to the server shown in FIG. 2 by a LAN (local area network). As shown in FIG. 1, LIMS is an integrated part of the process according to the present invention, gene sequence, DNA sequence used for protein expression, expressed protein, amount of each protein produced, expression used for production of such protein. Includes software to track all biological materials such as systems, all data related to the prescreening process, correlation of searched database information, and various steps performed to produce and purify the protein of interest It is out. The LIMS includes the computer system shown in FIG. 2 and the computer shown in FIG. 12, which further includes
本発明によれば、コストパフォーマンスおよび効率がともに良い方法で、ミリグラム単位のタンパク質を大量に精製することができる。他の方法および装置を用いれば、極めて大量(100g〜Kg単位)または極めて少量(μg単位)の精製が可能であることから、本発明による方法および装置は1つの要望を満たすものである。
実施例1:抗体生成を目的とする複数種類のタンパク質の発現および精製
発現が肺または脳に限定されている標識に重点をおいたタンパク質のサブセットを、並行して行われるGENEWARE(登録商標)系の発現およびそれに引き続く精製用に選択した。ヒトタンパク質指数(HPI)およびスイススポットなどのタンパク質データベースを、企業内および市販されている遺伝子コレクションからの全長クローンの利用可能性に基づいて選択される、可能性のあるタンパク質およびサブセットについて調べた。各全長クローンに1つの配列IDを割り振り、そのDNA配列および得られたタンパク質を、ベクター生成から確認まで(図1)、実験室情報管理システム(LIMS)内で追跡できるようにした。DNA配列に相補的なプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、各標的の読みとり枠を、増幅させてから精製して、適切なGENEWARE(登録商標)発現ベクター内にライゲーションした。このベクターを、ヒスチジンタグ配列を含むように改変し、これにより、発現したタンパク質がN末端にタグを持つようした。得られたベクターをスクリーニングして、挿入の完全性および配位を確認した。成功したクローン事象をタンパク質の発現について評価し、失敗した事象を、クローン化ワークフローに再導入した。
According to the present invention, it is possible to purify a large amount of protein in milligram units by a method having both good cost performance and efficiency. The method and apparatus according to the present invention fulfills one need because other methods and apparatus can be used to purify very large amounts (100 g to Kg units) or very small amounts (μg units).
Example 1: Geneware (registered trademark) system in which a subset of proteins with an emphasis on labeling in which expression and purification of multiple types of proteins for antibody production are restricted to the lung or brain are performed in parallel Was selected for expression and subsequent purification. Protein databases such as the Human Protein Index (HPI) and Swiss Spot were examined for potential proteins and subsets selected based on the availability of full-length clones from in-house and commercial gene collections. One sequence ID was assigned to each full-length clone so that the DNA sequence and the resulting protein could be tracked in the laboratory information management system (LIMS) from vector generation to confirmation (FIG. 1). Using the polymerase chain reaction (PCR) containing primers complementary to the DNA sequence, the reading frame of each target was amplified and purified and ligated into an appropriate GENEWARE® expression vector. This vector was modified to include a histidine tag sequence, so that the expressed protein had a tag at the N-terminus. The resulting vector was screened to confirm insertion integrity and coordination. Successful cloning events were evaluated for protein expression, and failed events were reintroduced into the cloning workflow.
スクリーニングに関して、21日齢のタバコ植物3本を接種するため、各クローンについて十分なin−vitro転写を生成した。接種後12〜14日してから、接種した葉より上方に位置する植物材料を採取し、重量を測り、組織解離して、緑液汁を得た。ディープウェルブロック(96ウェル)で、1容量の緑液汁を2容量の抽出緩衝液(25mMのトリスpH8.0、500mMのNaCl、2nMのPMSF、7mMの6−メルカプトエタノール)と組み合わせて、4%(w/v)のPEG(最終容量は1500μl)に調節して、タンパク質産生時に得られた抽出物を刺激した。4℃にて1時間半保存した後、この緑液汁に20分間、3000×Gにて遠心処理を施して、標的タンパク質を含む、浄化した緑液汁を得た。標的タンパク質を捕捉するため、700μlの浄化した緑液汁を、96ウェルフィルタプレートで25μlのアフィニティ樹脂(QiagenNi−NTA)と組み合わせて、室温にて1時間インキュベートした。浄化した緑液汁を保持できるほどに十分に疎水性であるフィルタを使用して緑液汁をインキュベート後に取り出し、5分間1000×Gにて遠心処理を施した。捕捉したタンパク質と組み合わされたアフィニティ樹脂をフィルタで保持し、700μlの洗浄緩衝液(16mMのトリスpH8.0、330mMのNaCl、5mMのイミダゾール)で2回洗浄した。この洗浄と洗浄との間で、5分間1000×Gにて遠心処理を施した。アフィニティ樹脂からの標的タンパク質の回収は、60μlの溶出緩衝液(16mMのトリスpH8.0、150mMのNaCl、および200mMのイミダゾールまたは200nMのEDTA)内で5分間この樹脂をインキュベートし、遠心処理(1000×Gにて5分間)を施してその溶出物を回収することにより行った。この溶出ステップを繰り返して、120μlの最終産生物を得た。各標識タンパク質の発現レベルを評価するため、各精製から得た溶出物をSDS−PAGEで解析した。クーマシー染色を行った後に正確な分子量とほぼ同じタンパク質バンドが見られ(±20%)、陰性対照で共遊走するバンドが見られなければ、標的タンパク質がうまく発現したと予想された。このタンパク質レベルを、ウシ血清アルブミン標準を用いて濃度測定により定量した。この変数を、記録した植物量と共にLIMSシステムに入力し、標的タンパク質の産生に必要な植物数を決定した。
For screening, sufficient in-vitro transcription was generated for each clone to inoculate three 21-day-old tobacco plants. 12 to 14 days after inoculation, plant material located above the inoculated leaves was collected, weighed, and dissociated to obtain green juice.
タンパク質の産生に関して、タバコ野生種植物を9組植えた。追跡および接種を容易にするため、各標的タンパク質に必要な植物数を、最も近い9の倍数に切り上げた。各タンパク質の発現レベルは大幅に変化して、その結果、所与タンパク質レベルの実現に必要な植物数も大幅に変化するものである。したがって、9本から96本の21日齢植物を典型的に用い、これにしたがってin−vitro転写反応をスケールアップした。接種後12〜14日してから、接種した葉より上方に位置する植物材料を採取し、重量を測り、冷却した2容量の抽出緩衝液と組み合わせた。この抽出緩衝液を、緩衝液/植物材料が均等に分配されるように植物材料内に真空浸潤させた。その後、市販の液汁抽出機を用いて、緑液汁を得た。PEGを4%(w/v)まで添加し、緑液汁を4℃にて1時間半放置して、この抽出物のクロロフィル含有成分を凝集および沈降させた。4%(w/v)のパーライトを濾過助剤として用いて濾過することにより、緑液汁を浄化した。浄化した緑液汁を10%(w/v)グリセロールに調節して、アフィニティ樹脂との疎水性タンパク質の相互作用を最小限に抑え、抽出量を抽出緩衝液で正規化した。予備平衡化精製装置の各チャネルに、特定の標的タンパク質を含む、浄化した緑液汁を装填した。所与標的タンパク質に対する緑液汁の量が他の標的タンパク質に対するより実質的に多い場合には、浄化した緑液汁を2つ以上のチャネルに分けた。精製タンパク質をアフィニティ樹脂から溶出した後、貯留した。浄化した緑液汁をアフィニティ樹脂に通過させ、ヒスチジン−標識タンパク質をNi−NTAアフィニティ樹脂上に滞留させた。このカラムに10カラム容量の洗浄緩衝液を通過させて、汚染性植物タンパク質を除去し、200nMのEDTAを含む溶出緩衝液で、標的タンパク質を回収した。この抽出緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液の組成は、スクリーニングステップで用いたものと同じにした。各溶出物のアリコットを、SDS−PAGEとクーマシー染色を行ったタンパク質バンドの濃度測定とにより解析して、タンパク質の濃度を決定した。必要に応じてこのタンパク質を限外濾過により濃縮し、全タンパク質を燐酸緩衝生理食塩水内に透析した。その後、これを20℃にて保管した。濃縮および透析を行った最終タンパク質についてSDS−PAGEを実施してタンパク質の純度を決定し、トリプシンMALDIを実施してタンパク質の同定を確認した。 Nine sets of wild tobacco plants were planted for protein production. To facilitate tracking and inoculation, the number of plants required for each target protein was rounded up to the nearest multiple of 9. The expression level of each protein varies significantly, resulting in a significant change in the number of plants required to achieve a given protein level. Therefore, 9 to 96 21 day old plants were typically used and the in-vitro transcription reaction scaled up accordingly. After 12-14 days after inoculation, plant material located above the inoculated leaves was collected, weighed and combined with 2 volumes of cooled extraction buffer. This extraction buffer was vacuum infiltrated into the plant material so that the buffer / plant material was evenly distributed. Thereafter, green juice was obtained using a commercially available juice extractor. PEG was added to 4% (w / v) and the green juice was left at 4 ° C. for 1 hour and a half to flocculate and settle the chlorophyll-containing component of the extract. The green juice was purified by filtering using 4% (w / v) perlite as a filter aid. The clarified green juice was adjusted to 10% (w / v) glycerol to minimize the interaction of the hydrophobic protein with the affinity resin and the extraction volume was normalized with the extraction buffer. Each channel of the pre-equilibration purifier was loaded with clarified green juice containing a specific target protein. When the amount of green juice for a given target protein was substantially higher than for other target proteins, the clarified green juice was divided into two or more channels. The purified protein was eluted from the affinity resin and stored. The purified green juice was passed through the affinity resin, and the histidine-labeled protein was retained on the Ni-NTA affinity resin. 10 column volumes of wash buffer were passed through the column to remove contaminating plant proteins and the target protein was recovered with an elution buffer containing 200 nM EDTA. The composition of this extraction buffer, wash buffer, and elution buffer was the same as that used in the screening step. An aliquot of each eluate was analyzed by SDS-PAGE and densitometry of the protein band subjected to Coomassie staining to determine the protein concentration. If necessary, the protein was concentrated by ultrafiltration and the total protein was dialyzed into phosphate buffered saline. Thereafter, this was stored at 20 ° C. SDS-PAGE was performed on the final protein that had been concentrated and dialyzed to determine protein purity, and trypsin MALDI was performed to confirm protein identification.
表1A及び表1Bは、5〜15種類の特有タンパク質がGENEWARE(登録商標)を用いて発現し、並行して精製された、産生工程の結果をまとめたものである。スクリーニングに基づいて、標的タンパク質当たり最小限の9本の植物に抑え、1.5mgの精製タンパク質を得るように十分な量の植物を接種した。産生モードにおいて、27種類の標的中10種類で、必要なタンパク質レベル以上を実現した。11種類の場合で、植物数を適切に調節して、タンパク質要件を満たすように2回目の産生を行ったところ、6種類の標的でタンパク質が回収されなかった。この結果を、GENEWARE発現系を植物9組に対して行い、確認した。この精製後にタンパク質が回収されない場合、その配列IDをGENEWARE不適合として区別し、哺乳動物発現系などの別の発現系で評価する。 Tables 1A and 1B summarize the results of the production process, in which 5-15 unique proteins were expressed using GENEWARE® and purified in parallel. Based on the screening, a sufficient amount of plants was inoculated to obtain a minimum of 9 plants per target protein and 1.5 mg of purified protein. In production mode, 10 out of 27 targets achieved more than the required protein level. In the case of 11 types, when the number of plants was appropriately adjusted and the second production was performed so as to satisfy the protein requirement, no protein was recovered with 6 types of targets. This result was confirmed by performing the GENEWARE expression system on 9 sets of plants. If the protein is not recovered after this purification, its sequence ID is distinguished as GENEWARE incompatible and evaluated with another expression system such as a mammalian expression system.
Claims (20)
第1の所定の有機体を用いて第1の標識タンパク質を発現させるステップと、
第2の所定の有機体を用いて第2の標識タンパク質を発現させるステップと、
第1の緑液汁を形成するために、前記第1の所定の有機体から前記第1の標識タンパク質を採取するステップと、
第2の緑液汁を形成するために、前記第2の所定の有機体から前記第2の標識タンパク質を採取するステップと、
前記第1の標識タンパク質を抽出するために、前記第1の緑液汁を第1のアフィニティカラム内に注入するのと同時に、前記第2の標識タンパク質を抽出するために、前記第2の緑液汁を第2のアフィニティカラム内に通過させるステップと
を含む方法。 A method for purifying multiple types of proteins,
Expressing a first labeled protein using a first predetermined organism;
Expressing a second labeled protein using a second predetermined organism;
Collecting the first labeled protein from the first predetermined organism to form a first green juice;
Collecting the second labeled protein from the second predetermined organism to form a second green juice;
In order to extract the first labeled protein, the second green juice is extracted in order to extract the second labeled protein simultaneously with injecting the first green juice into the first affinity column. Passing through a second affinity column.
前記第2のアフィニティカラムを通過させた後の前記第2の緑液汁を収集するステップと、
前記第1の収集した緑液汁を前記第1のアフィニティカラム内に循環させるのと同時に、前記第2の収集した緑液汁を前記第2のアフィニティカラム内に循環させるステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 Collecting the first green juice after passing through the first affinity column;
Collecting the second green juice after passing through the second affinity column;
Circulating the second collected green juice into the second affinity column simultaneously with circulating the first collected green juice into the first affinity column. The method according to 1.
前記第2のアフィニティカラムから前記第2の標識タンパク質を回収するステップと
をさらに含み、
前記回収された第1の標識タンパク質が、1μgから100mg台の範囲の量で測定可能であり、前記回収された第2の標識タンパク質が、1μgから100mg台の範囲の量で測定可能である、請求項1に記載の方法。 Recovering the first labeled protein from the first affinity column;
Recovering the second labeled protein from the second affinity column,
The recovered first labeled protein can be measured in an amount ranging from 1 μg to 100 mg, and the recovered second labeled protein can be measured in an amount ranging from 1 μg to 100 mg. The method of claim 1.
少なくとも2種類のタンパク質標的を選択するステップと、
前記タンパク質標的の正確なタンパク質配列を発現する適した組換えベクターを選択するステップと、
前記被選択組換えベクターのそれぞれを、それぞれの組換えタンパク質を産生するために、別々の所定の有機体内で発現させるステップと、
前記組換えタンパク質それぞれに対応する少なくとも2種類の緑液汁を形成するために、前記有機体を採取するステップと、
前記組換えタンパク質を抽出するために、前記複数種類の緑液汁をそれぞれのアフィニティカラム内に同時に注入するステップと、
を含む方法。 A method for producing and purifying multiple types of proteins, comprising:
Selecting at least two protein targets;
Selecting a suitable recombinant vector that expresses the exact protein sequence of the protein target;
Expressing each of the selected recombinant vectors in a separate predetermined organism to produce a respective recombinant protein;
Collecting the organism to form at least two types of green juice corresponding to each of the recombinant proteins;
Injecting the plurality of types of green juice into each affinity column simultaneously to extract the recombinant protein;
Including methods.
前記複数種類の緑液汁を、前記複数のアフィニティカラム内に同時に循環させるステップと
をさらに含む、請求項7に記載の方法。 Collecting the plurality of types of green juice in separate containers after passing through the plurality of affinity columns;
The method of claim 7, further comprising circulating the plurality of types of green juice in the plurality of affinity columns simultaneously.
前記回収された組換えタンパク質が、1μgから100mg台の範囲の量で測定可能である、請求項7に記載の方法。 Recovering the recombinant protein from the affinity column;
The method according to claim 7, wherein the recovered recombinant protein can be measured in an amount ranging from 1 μg to 100 mg.
種類の異なる緑液汁をそれぞれに入れた複数のリザーバと、
前記リザーバのそれぞれに1つずつ接続される複数のポンプと、
対応する前記ポンプの1つずつに接続され、タンパク質保持材料を中に配置した複数のカラムと、
前記タンパク質を前記カラムから取り出すための手段と、
を含む装置。 An apparatus for purifying multiple types of proteins,
Multiple reservoirs each containing different types of green juice,
A plurality of pumps, one connected to each of the reservoirs;
A plurality of columns connected to each one of the corresponding pumps and having protein-retaining material disposed therein;
Means for removing the protein from the column;
Including the device.
第1の緑液汁を入れた第1のリザーバと、
前記第1のリザーバが接続された第1のポンプと、
前記第1のポンプに接続され、タンパク質保持材料を中に配置したカラムであって、前前記第1の緑液汁が前記ポンプにより押し出されて前記カラム内を通過するようになっているカラムと、
前記装置を自動制御するために、前記ポンプに接続されたコンピュータと
を含む装置。 An apparatus for purifying multiple types of proteins,
A first reservoir containing a first green juice;
A first pump to which the first reservoir is connected;
A column connected to the first pump and having a protein holding material disposed therein, wherein the first green juice is pushed out by the pump and passes through the column;
A computer connected to the pump for automatically controlling the device.
第1の溶液を入れた第1のリザーバと、
第2の溶液を入れた第2のリザーバと、
前記第1のリザーバを接続した第1のバルブと、
前記第2のリザーバを接続した第2のバルブと、
生物学的物質保持材料を中に配置した第1のカラムであって、前記第1のバルブと流体連通して前記第1の溶液を前記第1のカラム内に方向付けるように接続された第1のカラムと、
生物学的物質保持材料を中に配置した第2のカラムであって、前記第2のバルブと流体連通して前記第2の溶液を前記第1のカラム内に方向付けるように接続された第2のカラムと、
前記装置を自動制御するために前記第1のバルブおよび前記第2のバルブと接続されたコンピュータと
を含み、前記第1のカラムを通過する流路と前記第2のカラムを通過する流路とが互いに隔離されており、前記第1のカラムおよび前記第2のカラム内に同時に前記溶液を流動させることのできる装置。 An apparatus for purifying multiple types of biological materials,
A first reservoir containing a first solution;
A second reservoir containing a second solution;
A first valve connected to the first reservoir;
A second valve connected to the second reservoir;
A first column having a biological material-retaining material disposed therein and connected in fluid communication with the first valve to direct the first solution into the first column; 1 column,
A second column having a biological material-retaining material disposed therein and connected in fluid communication with the second valve to direct the second solution into the first column; Two columns;
A computer connected to the first valve and the second valve for automatically controlling the apparatus, and a flow path passing through the first column and a flow path passing through the second column; Are isolated from each other and are capable of flowing the solution simultaneously into the first column and the second column.
前記第2のカラムを出る流体流を制御するための、前記第2のカラムから下流に位置する第4のバルブと
をさらに含み、
前記コンピュータで前記第3のバルブおよび前記第4のバルブの動作を制御できるように、前記第3のバルブおよび前記第4のバルブが前記コンピュータに接続されている、請求項16に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。 A third valve located downstream from the first column for controlling fluid flow exiting the first column;
A fourth valve located downstream from the second column for controlling fluid flow exiting the second column;
The plurality of types according to claim 16, wherein the third valve and the fourth valve are connected to the computer so that the computer can control the operations of the third valve and the fourth valve. For the purification of biological material.
前記第2のバルブの上流に位置する第2のポンプと、
をさらに含み、
前記コンピュータで前記第1および第2のポンプの動作を制御できるように、前記第1および第2のポンプが前記コンピュータに接続されている、請求項17に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。 A first pump located upstream of the first valve;
A second pump located upstream of the second valve;
Further including
18. The biological material of claim 17, wherein the first and second pumps are connected to the computer so that the computer can control the operation of the first and second pumps. Equipment for purification.
前記第2のリザーバ、前記第2のバルブ、前記第2のカラム、前記第2のカラムの下流に位置する前記第4のバルブ、および前記第2のポンプのすべてが、前記第1の流路とは別個に設けられた第2の流路を画成し、
前記第1の流路および前記第2の流路と並行して別の生物学的物質を精製するために、前記装置が、前記第1の流路および前記第2の流路とは別個に設けられた第3の流路をさらに含む、請求項18に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。 The first reservoir, the first valve, the first column, the third valve located downstream of the first column, and the first pump all define a first flow path. And
The second reservoir, the second valve, the second column, the fourth valve located downstream of the second column, and the second pump are all in the first flow path. A second flow path provided separately from the
In order to purify another biological substance in parallel with the first flow path and the second flow path, the device is separate from the first flow path and the second flow path. The apparatus for purifying a plurality of types of biological substances according to claim 18, further comprising a third flow path provided.
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---|---|
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007500262A (en) * | 2003-07-29 | 2007-01-11 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | Polymer composition |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7482169B2 (en) * | 2002-07-15 | 2009-01-27 | Phynexus, Inc. | Low dead volume extraction column device |
CN107474104A (en) * | 2017-09-21 | 2017-12-15 | 浙江绿创生物科技有限公司 | A kind of multistage Protein Separation collecting device of improved structure |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63251095A (en) * | 1987-03-10 | 1988-10-18 | エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー | Novel fused protein and purification thereof |
JPH06166698A (en) * | 1991-04-19 | 1994-06-14 | Rohm & Haas Co | Hybrid polypeptide |
JPH06505624A (en) * | 1990-07-16 | 1994-06-30 | バイオネブラスカ、インコーポレイテッド | Purification and directional cloning of peptides |
WO1999046288A2 (en) * | 1998-03-10 | 1999-09-16 | Large Scale Biology Corporation | A process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4775943A (en) * | 1985-10-16 | 1988-10-04 | The Dow Chemical Company | Method and apparatus for determining polymer molecular weight distribution parameters |
CA1304886C (en) * | 1986-07-10 | 1992-07-07 | Heinz Dobeli | Metal chelate resins |
IL87004A (en) * | 1988-07-06 | 1992-08-18 | Technion Res & Dev Foundation | Method and apparatus for bioaffinity separation |
US5096594A (en) * | 1990-12-20 | 1992-03-17 | Israel Rabinowitz | Chromatographic method of purifying cyclitols |
ATE151880T1 (en) * | 1991-06-26 | 1997-05-15 | Perseptive Biosystems Inc | METHOD AND DEVICE FOR DETECTING TRACES OF CONTAMINATION |
NO173757C (en) * | 1991-08-15 | 1994-01-26 | Dydahl Bjoern | Vaeskeproeveanalysator |
AU5809594A (en) * | 1992-12-23 | 1994-07-19 | Novo Nordisk A/S | An enzyme with polygalacturonase activity |
US5332484A (en) * | 1993-08-02 | 1994-07-26 | Hi-Tech Bio-Tech, Inc. | Apparatus and process for the large scale separation and retrieval of proteins from cellular extracts |
US5450743A (en) * | 1994-01-10 | 1995-09-19 | Zymark Corporation | Method for providing constant flow in liquid chromatography system |
US5603899A (en) * | 1995-04-12 | 1997-02-18 | Pharmacia Biotech, Inc. | Multiple column chromatography assembly |
US5824779A (en) * | 1996-04-26 | 1998-10-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Phytase-protein-pigmenting concentrate derived from green plant juice |
US6080318A (en) * | 1996-09-25 | 2000-06-27 | Analyticon Ag Biotechnologie Pharmazie | HPLC-based device and method for separating high complex substance mixtures |
DE19704477A1 (en) * | 1997-02-06 | 1998-08-13 | Solvay Pharm Gmbh | Device and method for parallel chromatography |
US6906172B2 (en) * | 1998-03-10 | 2005-06-14 | Large Scale Biology Corporation | Flexible processing apparatus for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources |
US6054047A (en) * | 1998-03-27 | 2000-04-25 | Synsorb Biotech, Inc. | Apparatus for screening compound libraries |
US6019897A (en) * | 1998-08-20 | 2000-02-01 | Dyax Corporation | System for simultaneously pumping solvent for a plurality of chromatography columns |
US6309541B1 (en) * | 1999-10-29 | 2001-10-30 | Ontogen Corporation | Apparatus and method for multiple channel high throughput purification |
US6214221B1 (en) * | 1999-02-22 | 2001-04-10 | Henry B. Kopf | Method and apparatus for purification of biological substances |
US6296771B1 (en) * | 1999-04-02 | 2001-10-02 | Symyx Technologies, Inc. | Parallel high-performance liquid chromatography with serial injection |
JP4045475B2 (en) * | 1999-09-06 | 2008-02-13 | 東洋紡績株式会社 | Nucleic acid / protein purification equipment |
US20020102617A1 (en) * | 2000-08-03 | 2002-08-01 | Macbeath Gavin | Protein microarrays |
US6705784B2 (en) * | 2000-09-29 | 2004-03-16 | Seiko Epson Corporation | Tape printing apparatus |
US6743356B1 (en) * | 2000-10-27 | 2004-06-01 | Johnson & Johnson | High throughput high performance chromatography system |
US6755074B2 (en) * | 2001-02-27 | 2004-06-29 | Isco, Inc. | Liquid chromatographic method and system |
-
2002
- 2002-12-04 AU AU2002363961A patent/AU2002363961A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-04 WO PCT/US2002/038490 patent/WO2003050540A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-12-04 JP JP2003551542A patent/JP2005511755A/en active Pending
- 2002-12-04 US US10/309,756 patent/US20030104571A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-04 CA CA002467736A patent/CA2467736A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-04 EP EP02798479A patent/EP1461620A4/en not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-06-29 US US10/880,243 patent/US20040253687A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-12-16 US US11/303,548 patent/US20060134604A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63251095A (en) * | 1987-03-10 | 1988-10-18 | エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー | Novel fused protein and purification thereof |
JPH06505624A (en) * | 1990-07-16 | 1994-06-30 | バイオネブラスカ、インコーポレイテッド | Purification and directional cloning of peptides |
JPH06166698A (en) * | 1991-04-19 | 1994-06-14 | Rohm & Haas Co | Hybrid polypeptide |
WO1999046288A2 (en) * | 1998-03-10 | 1999-09-16 | Large Scale Biology Corporation | A process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
GENOME RES., vol. 11, JPN6008011257, September 2001 (2001-09-01), pages 1730 - 1735, ISSN: 0000996204 * |
PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 15, JPN6008011253, 1999, pages 34 - 39, ISSN: 0000996202 * |
PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 22, JPN6008011255, 2001, pages 359 - 366, ISSN: 0000996203 * |
新村出編, 広辞苑, vol. 第五版, JPN6008011258, 1998, pages 2709, ISSN: 0000996205 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007500262A (en) * | 2003-07-29 | 2007-01-11 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | Polymer composition |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20040253687A1 (en) | 2004-12-16 |
WO2003050540A3 (en) | 2003-12-04 |
CA2467736A1 (en) | 2003-06-19 |
EP1461620A4 (en) | 2005-02-02 |
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US20030104571A1 (en) | 2003-06-05 |
WO2003050540A2 (en) | 2003-06-19 |
AU2002363961A1 (en) | 2003-06-23 |
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