CN116716329A - 一种无标签野生型bkv vp1蛋白质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种无标签野生型BKV VP1蛋白质的制备方法。本发明公开了一种无标签野生型BKV VP1蛋白质的制备方法，能够高效的表达带有6x His和GST标签的BKV VP1蛋白，通过TEV酶剪切能够将多余的标签切除,每升自诱导培养基可收获纯度达90％以上的蛋白10mg以上，能够获得仅对BKV VP1蛋白有结合活力对GST、6x His标签无结合活力的抗体，为后续BKV POCT式抗原抗体检测试剂盒提供关键的原料抗体。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种无标签野生型BKV VP1蛋白质的制备方法。
背景技术
BK病毒(BK Virus)，又名人多瘤病毒1(Human Polyomavirus 1)，是乙型多瘤病毒的成员，很少引起疾病，但通常与进行过肾移植的患者有关。由于器官移植患者术后长期应用免疫抑制剂，潜伏的BKV被激活，造成BKV尿症(BKV viruria)；随着病程进展，BKV持续复制，导致BKV血症(BKV viremia)；BKV在血液中持续高表达，进一步破坏移植肾组织，导致肾小管萎缩和间质纤维化，即BKV相关性肾病(BK virus nephropathy，BKVN)；BKVN已成为移植肾失去功能的重要原因之一。
BKV是具有5153个碱基对的环状基因组的无包膜双链DNA病毒。基因组包装在直径约40至50纳米的病毒衣壳中，其形状为二十面体(T＝7对称)。衣壳由称为VP1的72个五聚体衣壳构成，能够自组装成封闭的二十面体；VP1的每个五聚体与另外两个衣壳蛋白之一VP2或VP3相关联。目前，BKV病毒的检测方法有很多种：如组织穿刺活检、尿液荧光定量PCR法检测、尿液Decoy细胞检测等手段，但是这些检测手段专业性较强、操作麻烦、出结果时间较长等劣势导致器官移植的病人必须到医院才能够接受检测。试纸条式抗原抗体法检测就能够很好地满足病人居家就能够快速、准确且方便地检测，据居家检测结果，病人可以选择性地去医院进一步复查来确定是否需要调整免疫抑制剂的使用量、是否需要针对BKV病毒进一步治疗等。BKV VP1蛋白及抗体是现有BKV免疫检测的主要生物标志物，但因BKV VP1蛋白表达量极少且不易可溶性表达，市场上能够买到的抗体都是带有GST标签、Sumo标签等的VP1蛋白质免疫动物获得的抗体，而这些标签都具有一定的免疫原性，免疫动物后所获得的的抗体特异性无法确定，导致检测特异性不佳。因此急需一种无标签野生型BKV VP1蛋白质的制备方法，以制备出无标签野生型BKV VP1蛋白质及抗体，提高BKV VP1免疫检测试剂的特异性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无标签野生型BKV VP1蛋白质的制备方法，以制备出无标签野生型BKV VP1蛋白质，以便后续免疫小鼠筛选获得仅对BKV VP1蛋白有抗性而对GST蛋白标签无抗性的抗体。
本发明公开了一种无标签野生型BKV VP1蛋白质的制备方法，包含下列步骤：
S1.克隆或合成获得含野生型BKV VP1序列的重组核酸片段；
S2.重组核酸片段和表达载体构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；
S3.发酵培养：所述基因工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；
S4.蛋白纯化；
S5.酶切表达标签；
S6.分子筛纯化，收集无标签的野生型BKV VP1蛋白；
步骤S1中重组核酸片段含有His标签，其位于BKV VP1核酸序列的N端，且含有酶剪切位点的核酸序列，其位于His标签序列和BKV VP1核酸序列中间。
在一优选实施例中，所述重组核酸片段含有6x His和GST标签，其位于BKV VP1核酸序列的N端，以便于BKV VP1蛋白高可溶性表达和后期纯化中镍亲和层析的使用。
在一优选实施例中，所述重组核酸片段含有TEV酶剪切位点的核酸序列，其位于His标签序列和BKV VP1核酸序列中间，以便于重组蛋白纯化后，通过TEV酶剪His标签。
在一优选实施例中，所述重组核酸片段序列如SEQ ID NO.2所示。
在一优选实施例中，所述表达载体为pET-21a(+)、pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-30a(+)或pET-Duet。
在一优选实施例中，所述宿主细胞为BL21(DE3)或ArcticExpress(DE3)pRare2BL21，其中优选为ArcticExpress(DE3)pRare2 BL21。
在一优选实施例中，所述步骤S4中，所述蛋白纯化步骤：
a.菌体称重；
b.按照1g湿菌体加入50ml Buffer A的量重悬菌体并使用均质机破碎细胞；
c.使用AKTA Pure蛋白纯化仪和His trap HP预装柱纯化蛋白；
d.透析和超滤浓缩蛋白；
所用溶液如下：
裂解液：50mM KH2PO4,300mM KCl,20mM咪唑,0.8M尿素,pH8.0；
洗脱液：50mM KH2PO4,300mM KCl,500mM咪唑,0.8M尿素,pH8.0；
透析液：50mM KH2PO4,300mM KCl,1mM DTT,0.8M尿素,1mM EDTA,1mM PMSF,pH8.0。
在一优选实施例中，所述步骤S5酶切表达标签条件为：步骤S4说收集的目的蛋白经将咪唑透析至1mM以下，加入TEV酶，4℃酶切过夜。
在一优选实施例中，所述步骤S6分子筛纯化，所用分子筛柱为可分离10KD-100KD蛋白的分子筛柱，优选为HiPrep 26/60Sephacryl S-300HR。
另一方面，本发明还包含上述制备方法所获得的无标签野生型BKV VP1蛋白。
本发明所述方法能够高效的表达带有6x His和GST标签的BKV VP1蛋白，通过TEV酶剪切能够将多余的标签切除,每升自诱导培养基可收获纯度达90％以上的蛋白10mg以上，能够获得仅对BKV VP1蛋白有结合活力对GST、6x His标签无结合活力的抗体，为后续BKV POCT式抗原抗体检测试剂盒提供关键的原料抗体。
附图说明
图1.pET28a-BKV VP1方案1重组质粒结构示意图。
图2.pET28a-BKV VP1方案2重组质粒结构示意图。
图3.pET28a-BKV VP1方案3重组质粒结构示意图。
图4.低温自诱导蛋白表达SDS-PAGE电泳鉴定。
图5.带有GST、His标签的BKV-VP1纯化后的蛋白电泳图。
图6.TEV酶切后的SDS-PAGE电泳图。
图7.TEV酶切后再次分子筛纯化的BKV VP1 SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
重组核酸分子和宿主载体系统
本发明提供核酸分子，如编码野生型BKV VP1的DNA分子(rDNA)。如本文所述，rDNA分子是一种DNA分子，在体外经过分子操作：产生rDNA分子的方法在本技术领域中是众所周知的，如参见Sambrook等人，分子克隆(1989)。
本发明的核酸分子可以是重组分子，每个重组分子包含野生型BKV VP1核苷酸序列，例如，野生型BKV VP1核苷酸序列可以连接到表达载体以生成重组表达载体。
术语“表达载体”(Expression vectors)或重组表达载体就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体，包括但不限于病毒载体和非病毒载体(质粒，粘粒)。首选表达载体还包括一个表达控制元件，例如启动子序列，该元素可以启动插入的IMPDH核苷酸序列的转录，在适当的宿主细胞中，例如大肠杆菌，可用于调节IMPDH序列的表达(转录和/或翻译)。原核表达控制元件，但不限于诱导型启动子，构型启动子，分泌信号，增强子，转录终止剂和其他转录调节元件，以及与翻译有关的其他表达控制元件。
优选的表达载体还包括至少一个可选择标记基因，该基因编码具有耐药性的基因产物，如对氨苄西林、四环素或卡那霉素的耐药性。通常，载体还包括多个内切酶限制位点，可以方便地插入外源DNA序列。
优先的表达载体是与原核宿主细胞兼容的表达载体。
本技术领域中众所周知的，原核细胞表达载体可以从多方商业来源获得，典型的载体如pET-21a(+)、pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-30a(+)或pET-Duet表达载体，它用于表达大肠杆菌中的外源基因。
融合基因是重组核酸分子的另一个例子，该分子包含融合野生型BKV VP1核苷酸序列，如，野生型BKV VP1核苷酸序列可以融合His标签，以促进表达BKV VP1的分离和/或纯化的标签序列。
本发明还提供了含有本发明公开的核酸分子的宿主细胞。本发明提供了一种宿主-载体系统，该宿主-载体系统包括引入该载体、质粒、噬菌体或cosmi的合适宿主细胞，该宿主细胞包含编码BKV VP1的核苷酸序列。
宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞。例如，许多市售的大肠杆菌菌株对外源蛋白的表达特别有用。适合的真核寄主细胞的例子包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞，如哺乳动物细胞。一种优选实施例提供了一种宿主载体系统，该宿主载体系统包括重组pET28+载体，该载体包括引入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞的BKV VP1核苷酸序列。
本发明的重组DNA分子可以通过通常依赖所使用的载体类型和所使用的宿主系统的已知方法引入到适当的细胞宿主中。例如，通常采用电穿孔和盐处理方法转化原核宿主细胞，见，例如，Cohen等人，Proc Acad Sci USA(1972)69:2110；和Maniatis等人，(1989)在:分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约。
所选的载体可能是用于在细菌宿主细胞中表达和生产BKV VP1的表达载体。例如，直接高水平表达易于纯化的融合蛋白的载体；还可能需要特定的启动信号来有效地翻译改良的BKV VP1序列。这些信号包括ATG启动密码子和相邻序列。
在一些优选实施例中，BKV VP1序列包含启动密码子和上游序列被插入适当的表达载体，不需要其他翻译控制信号。但是，如果仅插入仅编码序列或部分编码序列或部分，则必须提供包括ATG启动密码子在内的外源转录控制信号。此外，启动密码子必须处于正确的阅读框架中，以确保整个插入物的转录。外源转录元件和起始密码子可以具有自然和合成的各种起源。通过包含适合使用细胞系统的增强剂，可以提高表达效率。
对于长期、高产的重组蛋白生产，稳定表达是首选。例如，稳定表达BKV VP1的细胞系可以使用包含病毒复制源或内源性表达元件和可选择标记基因的表达载体进行转化。引入载体后，细胞可以在富培养基中生长1-2天，然后切换到选择性培养基。可选择标记的目的是赋予选择抗性，它的存在使细胞的生长和恢复成功。
任何选择系统都可以用于恢复转化的细胞系，其中包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler,M.et al.,1977Cell 11:223-32)和腺嘌呤磷脂蛋白基转移酶(Lowy,I.etal.,1980，Cell 22:817-23)分别用于TK-Minus或APRT-Minus细胞的基因。同样，抗代谢物，抗生素或除草剂耐药性可用作选择的基础。例如，赋予甲氨蝶呤的抗性的DHFR(Wigler,M.et al.,1980Proc NatlAcad Sci 77:3567-70)；NPT赋予对氨基糖苷新霉素和G-418的耐药性(Colbere-Garapin,F.et al.,1981J Mol Biol 150:1-14)和ALS或ALS或PAT，它们分别赋予对氯磺磺化和磷酸蛋白乙酰基转移酶的耐药性。
另外的选择基因也可被考虑，例如trpB，它允许细胞利用吲哚代替色氨酸，或hisD，它允许细胞利用组氨酸代替组氨酸(Hartman，S.C.和r.c.Mulligan 1988Proc NatlAcad Sci 85:8047-51)。最近，使用可见标记物已经获得了普及，例如花青素、B-葡糖苷酸酶及其底物、GUS和荧光素酶及其底物、荧光素等标记物被广泛用于不仅鉴定转化体，而且定量归因于特定载体系统的瞬时或稳定蛋白表达量(Rhodes，C.A.，et al.，1995MethodsMol Biol 55:121-131)。
2、BKV VP1蛋白制备
本发明野生型BKV VP1可通过重组方法或化学合成方法产生。
如果希望高产率，优选重组方法。一般而言，重组修饰BKV VP1的生产将涉及使用宿主/载体系统，该系统通常包括以下步骤。
首先，获得编码野生型BKV VP1的核酸分子，然后如上所述，优选将编码BKV VP1的核酸分子插入与合适的表达控制序列可操作连接的表达载体中，以产生包含经BKV VP1的序列的重组表达载体。
然后通过标准转化方法将表达载体导入合适的宿主中，并在允许体内产生野生型BKV VP1蛋白的条件下培养所得转化的宿主。例如，如果BKV VP1基因的表达受诱导型启动子的控制，那么合适的生长条件将包括合适的诱导剂。重组载体可以将BKV VP1序列整合到宿主基因组中。或者，重组载体可以在染色体外保持BKV VP1序列，作为自主复制载体的一部分。如此产生的BKV VP1蛋白从生长培养基中分离或直接从细胞中分离。
本领域熟练的技术人员可以容易地使本领域已知的合适的宿主/表达系统适应与野生型BKV VP1编码序列一起使用以产生野生型IMPDH2(Cohen et al.,1972Proc.Acad.Sci.USA 69:2110；and Maniatis et al.,1989Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY))。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1.野生型BKV VP1重组表达载体构建
1.1实验材料
| 序号 | 品名 | 品牌 | 备注 |
| 1 | 商业公司合成的含有BKV VP1基因的质粒 | ||
| 2 | NcoI限制性内切酶 | NEB | |
| 3 | Xho I限制性内切酶 | NEB | |
| 4 | T4连接酶 | Thermo | |
| 5 | LB液体培养基 | 自配 | |
| 6 | LB-kan固体培养基 | 自配 | |
| 7 | Kan抗生素 | ||
| 8 | 胶回收试剂盒 | Qiagen | |
| 9 | 质粒小抽试剂盒 | Axygen | |
| 10 | pET28a质粒 | ||
| 11 | E.coil Top10感受态细胞中 | 上海生工 | |
| 12 | ArcticExpress(DE3)pRare2 BL21感受态细胞中 |
1.2基因设计合成
方案1：
NcoI酶切位点-6×His标签-GST蛋白标签-TEV酶切位点-BKV VP1-XhoI酶切位点，表达元件按照此序列排列组合，如图1。
方案2：
NcoI酶切位点-BKV VP1-TEV酶切位点-GST蛋白标签-6×His-Xho I酶切位点，表达元件按照此序列排列组合，如图2。
方案3：
NcoI酶切位点-GST蛋白标签-TEV酶切位点-BKV VP1-6×His标签，表达元件按照此序列排列组合，如图3。
将以上三种表达元件的组合方案提交到基因合成公司，合成的基因连接到pUC57质粒载体上，合成重组基因seq1、seq2、seq3，其表达产物包括四个部分(如图1、图2、图3所示)：6x His标签，GST蛋白标签、TEV酶剪切位点和BKV VP1蛋白质。重组基因seq1如序列SEQID NO.1所示，重组基因seq2如序列SEQ ID NO.2所示，重组基因seq3如序列SEQ ID NO.3所示。将合成重组基因seq1、seq2、seq3各自插入到质粒pET28a(+)的Nco I和Xho I限制性内切酶之间获得各自的重组载体。
1.3酶切连接转化
a.收到合成的含有BKV VP1基因的质粒载体，使用限制性内切酶Nco I和Xho I酶切，获得含有野生型BKV VP1基因序列，使用同样的限制性内切酶切割pET28a+空载，使用胶回收试剂盒回收基因片段和双酶切线性化的线性质粒；
b.使用T4连接酶将目的基因片段连接到pET28a+质粒载体上；
c.将连接产物通过42℃热激的方法转化到E.coil Top10感受态细胞中，涂布在含有卡那抗生素的固体LB平板上，37℃过夜培养；
d.挑取单克隆于含有卡那抗生素的3ml液体LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养,使用质粒抽提试剂盒抽取质粒，将质粒送测序公司测序；
e.将测序正确的pET28a(+)-BKV VP1质粒通过42℃热激的方法转化到ArcticExpress(DE3)pRare2 BL21感受态细胞中,涂布在含有卡那抗生素的固体LB平板上，37℃过夜培养；
f.挑取单克隆于含有卡那抗生素的3ml液体LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养后保存菌种。
实施例2.表达、纯化条件优化
2.1表达达鉴定：
a.分别接种50ul BKV-VP1 BL21(DE3)三种质粒构建方案的甘油菌于含有50ug/ml的kan 50ml自诱导培养基中，37℃，220rpm过夜培养；
b.从过夜培养的菌种接种10ml于1L灭菌的含有含有50ug/ml的kan1L自诱导培养基中20℃诱导表达7天；
c.7天之后，取1ml菌液，离心后直接菌体裂解做SDS-PAGE鉴定，分别稀4倍，鉴定结果显示，三种方式构建的质粒均有表达，如图1-3。
2.2 1L表达纯化：
a)在进行纯化之前的头一天下班前，将在-40℃冻存的细胞转移到4℃，让细菌过夜融化；
b)向收获的菌体中加入裂解液，共加入400ml,在磁力搅拌器上将菌体通过搅拌的方式打散，确保没有块状物存在，避免堵塞匀质机；
c)用均质机将菌体裂解：
首先打开循环冷凝系统，依次按下“开关”，“冷凝”，和“循环”三键，确保看到在显示屏上看到“制冷”，“循环”的提示。待温度降到4℃后，准备破菌。均质机设置为：1000Pa，5℃,破碎4次；
d)离心：
将细菌裂解液在4℃下，12000RPM离心60min，取上清20ul，记为S1，加入20ul 4Xloading buffer,95C煮沸2min，留待SDS-PAGE电泳分析；
e)AKTA纯化：
设置打开AKTA Pure蛋白纯化仪，按照下列信息设置“A29L Ni柱纯化；
1)先用去离子水清洗系统，因为机器现在是在20％的乙醇中保存；
2)将样品泵的S1管路，PumpA的A1管路，PumpB的B1管路分别放入BufferA，BufferA和Buffer B中，按照5ml/min的流速，用相应的Buffer清洗样品泵，PumpA和PumpB，每个泵清洗至少20ml体积；
3)将Histrap HP预装柱连接到柱位-2上，注意不要引入气泡。然后用PumpA,管路A1，以2ml/min的流速平衡该Hitrap HP柱子，体积为20ml；
4)设置纯化程序：
溶液管路设置：
S1：待纯化样品；
S2：Buffer A；
Buff:去离子水；
A1：Buffer A；
A2：去离子水；
B1：Buffer B；
B2：20％的乙醇；
调用程序“A29L Ni柱纯化柱纯化方法”，该方法的主要设置为：
a.柱位:Pos2；
b.系统流速2ml/min,上样流速2ml/min,45ml/管收集流穿液；
c.上样时流穿的收集，45ml/管，60mM清洗时，15ml/管，150mM清洗时，15ml/管，300mM清洗时，2ml/管，500mM清洗时，2ml/管；
步骤分布收集体积清洗总体积备注
上样45全部上完样品
Buffer A+3％ Buffer B 15 100ml
Buffer A+6％ Buffer B 15 100ml
Buffer A+9％ Buffer B 15 100ml
Buffer A+12％ Buffer B 15 100ml
Buffer A+15％ Buffer B 15 100ml
Buffer A+30％ Buffer B 15 100ml
Buffer A+30％ Buffer B 15 100ml
Buffer A+60％ Buffer B 2 80
Buffer A+100％ Buffer B 2 80
用去离子水和酒精清洗
纯化程序完成后根据峰图合并收集管中收集到的各组分，然后使用SDS-PAGE鉴定，将纯度较高的目标蛋白收集起来，最后SDS-PAGE鉴定，结果如图4，低温诱导7天后分别取原培养液稀释4倍1ml离心收获菌体裂解、裂解的电泳条带图4中的1-4、5-7、8-10分别为方案1、方案2、方案3重组质粒构建的表达检测情况，在70KD左右位置有较为明显的蛋白质条带。
图5：条带1、2、3分别为质粒构建方案1、2、3的蛋白纯化最优结果，结果显示方案3和2表达纯化结果较好方案1好，方案3表达出来的BKV VP1蛋白带有His标签，会对下游免疫实验造成影响，故最终选择方案2进行TEV酶切。
实施例3.TEV酶切和ELISA抗原活力鉴定
3.1实验关键材料
3.2TEV酶切
在TEV蛋白切割之前，先使用3KD的超滤管，将咪唑透析至1mM以下，然后按照TEV酶的使用说明书，直接向透析浓缩过的BKV-GST-VP1蛋白中加入足量的酶和Buffer，置于4℃层析柜中，过夜酶切，酶切后通过SDS-PAGE鉴定，鉴定结果如图6，图中条带1为酶切纯化的GST蛋白，条带2～4为不同浓度的咪唑洗脱下来的条带，由于切割后的BKV-VP1蛋白纯度不算高，需再次分子筛纯化。
酶切完成后，在AKTA上使用Tris-HCl Buffer通过分子筛二次纯化，根据AKTA上的UV吸光值的峰图，收集各组分，然后将峰图相同的组分浓缩后SDS-PAGE电泳检测，最后测浓度，电泳图如图7，纯化出纯度较高的BKV-VP1，浓度1mg/ml,体积16ml。
3.3外购抗体检测
将酶切前的BKV-VP1抗原以及酶切后的抗原和酶切过程中得到的GST标签蛋白，分别使用ELISA的包被液按照5倍梯度稀释，稀释后包被到ELISA板上，分别使用两种外购的抗体检测，检测数据如下：
结果表明，纯化到的BKV VP1抗原与外购的Anti-BKV-VP1抗体具有很好的结合活力，而与GST单独蛋白的结合活力较差，表明纯化得到了不带有任何标签的BKV VP1蛋白，且与对应的抗体有较强的结合活力，可用于下游免疫实验，获得仅对于BKV VP1的抗体。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。
Claims (10)
1.一种无标签野生型BKV VP1蛋白质的制备方法，其特征在于，包含下列步骤：
S1.克隆或合成获得含野生型BKV VP1序列的重组核酸片段；
S2.构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；
S3.发酵培养：所述基因工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；
S4.蛋白纯化；
S5.酶切表达标签；
S6.分子筛纯化，收集无标签的野生型BKV VP1蛋白；
步骤S1中重组核酸片段含有His标签，其位于BKV VP1核酸序列的N端，且含有酶剪切位点的核酸序列，其位于His标签序列和BKV VP1核酸序列中间。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述重组核酸片段含有6x His和GST标签，其位于BKV VP1核酸序列的N端。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述重组核酸片段含有TEV酶剪切位点的核酸序列，其位于His标签序列和BKV VP1核酸序列中间。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述表达载体为pET-21a(+)、pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-30a(+)或pET-Duet。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述宿主细胞为BL21(DE3)或ArcticExpress(DE3)pRare2 BL21。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述蛋白纯化步骤：
a.菌体称重；
b.按照1g湿菌体加入50ml Buffer A的量重悬菌体并使用均质机破碎细胞；
c.使用AKTA Pure蛋白纯化仪和His trap HP预装柱纯化蛋白；
d.透析和超滤浓缩蛋白；
所用溶液如下：
裂解液：50mM KH2PO4,300mM KCl,20mM咪唑,0.8M尿素,pH8.0；
洗脱液：50mM KH2PO4,300mM KCl,500mM咪唑,0.8M尿素,pH8.0；
透析液：50mM KH2PO4,300mM KCl,1mM DTT,0.8M尿素,1mM EDTA,1mM PMSF,pH8.0。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S5酶切表达标签条件为：步骤S4说收集的目的蛋白经将咪唑透析至1mM以下，加入TEV酶，4℃酶切过夜。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S6分子筛纯化，所用分子筛柱为可分离10KD～100KD蛋白的分子筛柱。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述分子筛柱为HiPrep26/60SephacrylS-300HR。
10.权利要求1-9所述制备方法而制备的无标签野生型BKV VP1蛋白质。
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|---|---|---|---|
| CN202310639858.1A CN116716329A (zh) | 2023-06-01 | 2023-06-01 | 一种无标签野生型bkv vp1蛋白质的制备方法 |
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| CN (1) | CN116716329A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117447561A (zh) * | 2023-10-26 | 2024-01-26 | 四川大学华西医院 | 人乳头病毒16型e7蛋白的制备及其应用 |
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2023
- 2023-06-01 CN CN202310639858.1A patent/CN116716329A/zh active Pending
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