WO1999057262A2 - An metallionen bindendes peptid - Google Patents

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WO1999057262A2
WO1999057262A2 PCT/EP1999/003076 EP9903076W WO9957262A2 WO 1999057262 A2 WO1999057262 A2 WO 1999057262A2 EP 9903076 W EP9903076 W EP 9903076W WO 9957262 A2 WO9957262 A2 WO 9957262A2
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Jörn GLÖKLER
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GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • the present invention relates to peptide sequences which, in conjunction with recombinant proteins, enable specific affinity purification of these by means of immobilized metal ions.
  • affinity tags Today, recombinant proteins are preferably expressed and purified using so-called affinity tags. These tags mostly consist of protein domains or peptides which have a high specific affinity for a chromatography material and are fused to either the amino or the carboxyl terminus of the recombinant protein.
  • the advantage of such a fusion is the high selective affinity of the tag, which enables purification to homogeneity of up to 95% of the protein with the aid of a single separation step.
  • His-Tag a sequence of 6 histidine residues
  • GST glutthione-S-transferase
  • thioredoxin thioredoxin
  • MBP maltose binding protein
  • proteins and peptides containing histidine in particular are bound by metal ions, such as Cu (II), Ni (II), Co (II) and Zn (II) immobilized on carrier materials.
  • metal ions such as Cu (II), Ni (II), Co (II) and Zn (II) immobilized on carrier materials.
  • the affinity of the His-Tag offered by Quiagen and other companies is based on this principle.
  • the great advantage of this method is the ability to separate and even renaturate His-Tag fusion proteins even under denatured conditions.
  • the disadvantage of the His tag may be poor expression or a large background from other binding proteins.
  • the immobilized heavy metals can also be washed out during the separation process and thus contaminate the purified protein. Such a method is therefore not suitable for the purification of clinically relevant proteins.
  • One embodiment of the invention relates to a peptide which binds to Fe (III) and has an amino acid sequence from the following group of sequences: (i) Arg Pro Thr Lys Lys Phe Thr Leu Thr His Lys His Ser Lys Arg where this sequence can be deleted N-terminally by 1, 2 or 3 amino acids and / or C-terminally by one amino acid,
  • a further embodiment of the invention relates to a peptide which binds to Cu (II), Ni (II) and / or Zn (II) and / or in particular Co (II) and has an amino acid sequence from the following group of sequences:
  • Another embodiment of the invention relates to a peptide which binds to Co (II), Ni (II) and / or Zn (II) and / or in particular Cu (II) and has an amino acid sequence from the following group of sequences:
  • Another embodiment of the invention relates to a peptide which binds to Co (II), Cu (II) and / or Zn (II) and / or in particular Ni (II) and has an amino acid sequence from the following group of sequences:
  • Amino acids can be deleted, (iv) Ala Pro Ser His His Thr His Ser His His Leu Thr Gin
  • Amino acids may be deleted, and (v) His His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr
  • a further embodiment of the invention relates to a peptide which binds to Co (II), Cu (II) and / or Ni (II) and / or in particular Zn (II) and has the following amino acid sequence: His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr Ala Trp, this sequence being C-terminally deleted by 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 amino acids.
  • the disadvantages of the existing methods mentioned above can be improved.
  • the expression and solubility of the peptides that bind heavy metals is improved by biological selection.
  • Fe (III) binding peptides have been found which, under certain conditions, can contribute very specifically to the separation of a fusion protein with only little background.
  • the peptides with affinity for Co (II), Ni (II), Cu (II) and Zn (II) primarily contain up to 6 histidine residues, but they do not all follow continuously as in the known His day. The list of these peptides is given in the Appendix.
  • a further embodiment of the invention relates to a fusion protein, which is characterized in that it is a recombinant protein whose N-terminus or C-terminus for the purification of the protein and / or for its detection by a peptide or an amino acid sequence (affinity tag ) is formed according to one of the preceding claims.
  • the fusion protein according to the invention can be characterized by a linkage of recombinant protein and affinity tag, which can be released after purification and / or detection of the recombinant protein.
  • the fusion protein according to the invention can be characterized in that the linkage is a protease interface or an intein.
  • the peptides according to the invention described above can therefore be fused to recombinant proteins for purification and / or detection.
  • Metal ions immobilized on enzymes such as alkaline phosphatase (INDIA-HRP from Pierce) and fluorescent dyes linked to metal chelates (P (1) 97 11 796.1 AI) can be used to detect the recombinant proteins.
  • the fusion proteins can also be separated under denaturing conditions (for example 6 M urea) and are therefore on a par with the His tags currently used.
  • the invention further relates to an oligonucleotide which is characterized in that it encodes a fusion protein according to the invention.
  • the invention further relates to an expression vector with an oligonucleotide according to the invention for expressing a fusion protein according to the invention.
  • the invention further relates to a bacterial expression strain, in particular Escherichia coli strain, with an expression vector according to the invention.
  • the invention relates to a process for obtaining a peptide which binds to Co (II), Cu (II), Ni (II) and / or Zn (II), characterized in that (a) a peptide
  • the invention further relates to a method for obtaining a peptide which binds to Fe (III), characterized in that
  • the method according to the invention can be characterized by p (III) as phage coat protein.
  • p (III) as phage coat protein.
  • phage display Using a novel method called phage display, the peptides that make up the binding to the chromatography material (metal chelates) were first identified.
  • the phage library M13LP67 (Devlin, J.J. et al. (1990) Science 249, 404-406) was used. The respective properties could then be analyzed using the model of the fused phage coat protein pIII, which was to be purified as a model.
  • a fusion protein is purified with the Fe (III) binding peptide Arg Pro Thr Lys Lys Phe Thr Leu Thr His Lys His Ser Lys Arg (FIG. 1).
  • Fusion protein (uppermost thick band) and the main coat protein pVIII (large spot on the bottom left) were detected with antibodies.
  • the iron binding peptide bearing phage were denatured min at 65 ° C for 20 and then treated with the respective attached ⁇ added amount of urea.
  • Quiagen's NTA-Sepharose loaded with Fe (III) served as the affinity material.
  • elution was carried out with EDTA, the Fe (III) ions together with the fusion protein being detached from the material (elution 1) . Since the plll protein is sometimes very hydrophobic, the remaining protein could be detached from the affinity material with 1% SDS in elution 2. It is important that no pVIII coat protein can be detected after the purification. Other background proteins are also not to be seen here, not even by silver nitrate staining of an SDS polyacrylamide gel with an identical application.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein an Fe(III) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen: (i) Arg Pro Thr Lys Lys Phe Thr Leu Thr His Lys His Ser Lys Arg, wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren und/oder C-terminal um eine Aminosäure deletiert sein kann, (ii) Gly Ile Pro Ala His Glu Gln His Thr Lys Lys Leu Trp Leu Leu, wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2, 3 oder 4 und/oder C-terminal um 1, 2, 3 oder 4 Aminosäuren deletiert sein kann, und (iii) Ile Ser Leu Ser Asn His Arg Met Gln Trp His His Asn Tyr Ser, wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuren und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren deletiert sein kann.

Description

AN METALLIONEN BINDENDES PEPTID
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidsequenzen, die in Verbindung mit rekombinanten Proteinen eine spezifische Affinitätsaufreinigung dieser mittels immobilisierter Metallionen ermöglichen.
Rekombinante Proteine werden heute vorzugsweise mit Hilfe von sogenannten Affinitäts-Tags exprimiert und aufgereinigt . Diese Tags bestehen zumeist aus Proteindomänen oder Peptiden, welche eine hohe spezifische Affinität zu einem Chromatographiematerial besitzen, und sind entweder mit dem Amino- oder dem Car- boxylterminus des rekombinanten Proteins fusioniert. Der Vorteil einer solchen Fusion ist die hohe selektive Affinität des Tags, wodurch eine Aufreinigung zur Homogenität von bis zu 95 % des Proteins mit Hilfe eines einzigen Trennungsschritts ermöglicht wird. Die gebräuchlichsten sind das sogenannte His-Tag (eine Abfolge von 6 Histidinresten) , GST (Glutathion-S-Transferase) , Thioredoxin und MBP (Maltose bindendes Protein) . Mit Hilfe von spezifischen Proteasen oder eines Inteins (selbst entfernende Proteindomäne; Protein Fusion & Purification (pMAL™) System & IMPACT™ T7 System, vertrieben von New England Biolabs) ist es möglich, das Affinitäts-Tag nach oder während der Aufreinigung wieder zu entfernen. Dadurch kann das aufgereinigte Protein auch für klinische Zwecke eingesetzt werden.
Es ist bekannt, daß insbesondere Histidin enthaltende Proteine und Peptide von an Trägermaterialien immobilisierten Metallionen wie Cu(II), Ni(II), Co(II) und Zn(II) gebunden werden. Auf diesem Prinzip beruht die Affinität des von Quiagen und auch anderen Firmen angebotenen His-Tags. Der große Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, His-Tag-Fusionsproteine auch unter denaturierten Bedingungen trennen und sogar renaturieren zu können. Der Nachteil des His-Tags ist unter Umständen eine schlechte Expression, beziehungsweise ein großer Hintergrund durch andere bindende Proteine. Des weiteren können auch die immobilisierten Schwermetalle während des Trennungsvorgangs ausgewaschen werden und damit das aufgereinigte Protein kontaminieren. Somit eignet sich ein solches Verfahren nicht zur Aufreinigung von klinisch relevanten Proteinen.
Es ist bekannt, daß Phosphoaminosäuren, Histidin und auch Glutamat eine Bindung von Proteinen an immobilisierten Fe(III)- Ionen bei niedrigem pH ermöglichen. Da der Hintergrund hier sehr hoch ist, gibt es keine Ansätze für eine Entwicklung von Affinitätstags für Fe(III). Es gibt einen Hinweis auf ein Lysin- haltiges Protein, welches bei pH 8 zurückgehalten wird, jedoch bei 300 mM NaCl eluiert. Dieser Salzgehalt wird bei den meisten Aufreinigungen überschritten und führt sonst ebenfalls zu einem zu hohen Hintergrund.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft ein an Fe(III) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen: (i) Arg Pro Thr Lys Lys Phe Thr Leu Thr His Lys His Ser Lys Arg wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren und/oder C-terminal um eine Aminosäure deletiert sein kann,
(ii) Gly Ile Pro Ala His Glu Gin His Thr Lys Lys Leu Trp Leu Leu, wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2, 3 oder 4 und/oder C-terminal um 1, 2, 3 oder 4 Aminosäuren deletiert sein kann, und
(iii) Ile Ser Leu Ser Asn His Arg Met Gin Trp His His Asn Tyr Ser wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuren und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren deletiert sein kann.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein an Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere Co(II) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:
(i) Ala His Gin Gin Thr His His Tyr Phe Thr His His Leu Asn Trp wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren deletiert sein kann, und (ii) Val Ala His His Trp Trp His Asp Gly Tyr Lys His Pro Leu Asn wobei diese Sequenz N-terminal um 1 oder 2 Aminosäure und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren deletiert sein kann. Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung betrifft ein an Co(II), Nι(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere Cu(II) bindendes Peptid mit einer Aminosauresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:
(I) Ala His Pro His Arg His Hxs Ser Asp Ser Met Leu Val Thr His wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure deletiert sein kann,
(II) His Arg Ser Trp Thr Ser Pro His Asn His Pro His Thr His His,
(m) Lys His His Leu His His Glu His Ala Tyr Pro Thr Leu Lys Asn wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure und/oder C-termmal um l, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann, und
(IV) His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr Ala Trp wobei diese Sequenz C-termmal um 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann.
Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung betrifft ein an Co(II), Cu(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere Nι(II) bindendes Peptid mit einer Aminosauresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:
( ) Ala Tyr Pro His Phe His Ser Asn Ser His Leu Ile His Ser His wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren deletiert se n kann, (ii ) Tyr His Thr Ser Ile His His His His Pro Val Asp His Leu Ala wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure und/oder C-terminal um eine oder zwei Aminosäuren deletiert sein kann, (iii) Leu Asp His Thr Tyr Arg Ala His Ser Lys Val His His
His His wobei diese Sequenz N-terminal um eine oder zwei
Aminosäuren deletiert sein kann, (iv) Ala Pro Ser His His Thr His Ser His His Leu Thr Gin
Met Arg wobei diese Aminosäuresequenz N-terminal um 1, 2 oder
3 Aminosäuren und/oder C-terminal um 1, 2, 3, 4 oder 5
Aminosäuren deletiert sein kann, und (v) His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr
Ala Trp wobei diese Aminosäuresequenz C-terminal um 1, 2, 3,
4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein an Co(II), Cu(II) und/oder Ni(II) und/oder insbesondere Zn(II) bindendes Peptid mit der folgenden Aminosäurensequenz: His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr Ala Trp, wobei diese Sequenz C-terminal um 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann.
Mit den experimentell gefundenen Peptiden können die Nachteile der oben genannten bestehenden Methoden verbessert werden. Zum einen wird die Expression und Löslichkeit der Schwermetalle bindenden Peptide durch biologische Selektion verbessert. Zum anderen sind Fe(III) bindende Peptide gefunden worden, die bei bestimmten Bedingungen sehr spezifisch mit nur geringem Hintergrund zur Trennung eines Fusionsproteins beitragen können. Dabei enthalten die Peptide mit Affinität zu Co(II), Ni(II), Cu(II) und Zn(II) in erster Linie bis zu 6 Histidinreste, die aber nicht sämtlich kontinuierlich wie im bekannten His-Tag abfolgen. Die Liste dieser Peptide wird im Anhang angegeben.
Die Peptide, die Fe(III) spezifisch bei beispielsweise pH 7,4 binden, enthalten beispielsweise nur 2 Histidine und 4 Lysinreste .
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um ein rekombinantes Protein handelt, dessen N-Terminus oder C-Terminus zur Aufreinigung des Proteins und/oder zu seinem Nachweis durch ein Peptid bzw. eine Aminosäuresequenz (Affinitätstag) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche gebildet wird.
Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann gekennzeichnet sein durch eine Verknüpfung von rekombinantem Protein und Affinitätstag, die nach Aufreinigung und/oder Nachweis des rekombinanten Proteins lösbar ist.
Ferner kann das erfindungsgemäße Fusionsprotein dadurch gekennzeichnet sein, daß es sich bei der Verknüpfung um eine Protease-Schnittstelle oder ein Intein handelt.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Peptide können also zur Aufreinigung und/oder Nachweis an rekombinante Proteine fusioniert werden. Dies sollte auch in Kombination mit einem Intein oder einer Protease-Schnittstelle möglich sein, damit das Affinitäts-Tag nach der Trennung aus dem Kontext des nativen Proteins entfernt werden kann. Zum Nachweis der rekombinanten Proteine können an Enzymen wie Alkalische Phosphatase immobilisierte Metallionen (INDIA-HRP von Pierce) sowie an Metallchelate geknüpfte fluoreszente Farbstoffe (P (1)97 11 796.1 AI) dienen.
Die Fusionsproteine können auch unter denaturierenden Bedingungen (beispielsweise 6 M Harnstoff) noch getrennt werden und sind somit den gegenwärtig angewendeten His-Tags ebenbürtig.
Ferner betrifft die Erfindung ein Oligonucleotid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein codiert .
Ferner betrifft die Erfindung einen Expressionsvektor mit einem erfindungsgemäßen Oligonucleotid zur Expression eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.
Ferner betrifft die Erfindung einen bakteriellen Expressionsstamm, insbesondere Escherichia coli-Stamm, mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines an Co(II), Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) bindenden Pep- tids, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) ein Peptid
- mit 6 bis 15 Aminosäureresten und
- mit 4 bis 6 und gegebenenfalls mehr His-Resten als Aminosäurereste,
- von denen bis zu 4 His-Reste unmittelbare aufeinanderfolgen können, als Fusionsprotein mit einem Phagen-Hüllprotein in einem Phagen- Display exprimiert, (b) das exprimierte Fusionsprotein auf ein mit Co(II), Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) beladenes Chromatographie-Material aufgibt und die Affinität des Peptids zu dem mit den Metallionen beladenen Chromatographie-Material testet,
(c) das Peptid, sofern es bindet, identifiziert, aus dem Fusionsprotein löst oder synthetisch herstellt und isoliert.
Zum Stand der Technik sei verwiesen auf Patwardhan et al . in J. Chromatography, A 787 (1997) 91 - 100.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines an Fe(III) bindenden Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) ein Peptid
- mit 7 bis 15 Aminosäureresten, und
- mit 0 bis 2 und gegebenenfalls mehr Arg-Resten als Aminosäurereste,
- mit 0 bis 4 und gegebenenfalls mehr Lys-Resten als Aminosäurereste und
- mit 2 bis 3 und gegebenenfalls mehr His-Resten als Aminosäurereste als Fusionsprotein mit einem Phagen-Hüllprotein in einem Phagen- Display exprimiert,
(b) das exprimierte Fusionsprotein auf ein mit Fe(III) beladenes Chromatographie-Material aufgibt und die Affinität des Peptids zu dem mit den Metallionen beladenenen Chromatographie-Material testet,
(c) das Peptid, sofern es bindet, identifiziert, aus dem Fusionsprotein löst oder synthetisch herstellt und isoliert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann gekennzeichnet sein durch p(III) als Phagen-Hüllprotein. Beispiel 1
Durch ein neuartiges Verfahren genannt Phage-Display konnten zunächst die Peptide, welche die Bindung zum Chromatographiematerial (Metallchelaten) ausmachen, identifiziert werden. Benutzt wurde die Phagen-Bank M13LP67 (Devlin, J. J. et al. (1990) Science 249, 404 - 406) . Anschließend konnten die jeweiligen Eigenschaften am Modell des fusionierten und modellhaft aufzureinigenden Phagenhüllproteins pIII analysiert werden.
Als Beispiel ist ein Fusionsprotein mit dem Fe(III) bindenden Peptid Arg Pro Thr Lys Lys Phe Thr Leu Thr His Lys His Ser Lys Arg aufgereinigt werden (Fig. 1) .
Es handelt sich hier um einen estern-Blot , bei dem das pIII-
Fusionsprotein (oberste dicke Bande) und das Haupthüllprotein pVIII (großer Fleck links unten) mit Antikörpern nachgewiesen wurden.
Spalte 1 = Ausgangsmaterial der Aufreinigung
2 = Molekulargewichtsstandard
3 = 2 M Harnstoff behandelt, Elution 1 mit EDTA
4 = 4 M Harnstoff behandelt, Elution 1 mit EDTA
5 = 6 M Harnstoff behandelt, Elution 1 mit EDTA
6 = 2 M Harnstoff behandelt, Elution 2 mit EDTA+SDS
7 = 4 M Harnstoff behandelt, Elution 2 mit EDTA+SDS
8 = 6 M Harnstoff behandelt, Elution 2 mit EDTA+SDS
Die das eisenbindende Peptid tragenden Phagen wurden bei 65 °C für 20 min denaturiert und anschließend mit der jeweilig ange¬ gebenen Menge Harnstoff behandelt. Als Affinitätsmaterial diente mit Fe(III) beladene NTA-Sepharose von Quiagen. Nach einem Waschschritt wurde mit EDTA eluiert, wobei die Fe ( III) -Ionen samt Fusionsprotein von dem Material abgelöst werden (Elution 1) . Da das plll-Protein teilweise sehr hydrophob ist, konnte mit 1 % SDS bei der Elution 2 das restliche Protein von dem Affinitätsmaterial gelöst werden. Wichtig ist, daß nach der Aufreinigung kein pVIII-Hüllprotein mehr nachweisbar ist. Auch andere Hintergrundproteine sind hier nicht zu sehen, auch nicht durch eine Silbernitratfärbung eines SDS-Polyacrylamidgels mit identischem Auftrag. Dafür bleibt ungefähr 1/5 des Fusionsproteins bei der Elution erhalten. Eine Trennung eines mit dem Affinitätspeptid fusionierten rekombinanten Proteins, auch unter denaturierenden Bedingungen, ist somit prinzipiell möglich. Ähnliche Ergebnisse lassen sich auch für die anderen Peptide zeigen.

Claims

Patentansprüche
1. An Fe(III) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:
(i) Arg Pro Thr Lys Lys Phe Thr Leu Thr His Lys His Ser Lys Arg wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren und/oder C-terminal um eine Aminosäure deletiert sein kann,
(ii) Gly Ile Pro Ala His Glu Gin His Thr Lys Lys Leu Trp Leu Leu, wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2, 3 oder 4 und/oder C-terminal um 1, 2, 3 oder 4 Aminosäuren deletiert sein kann, und
(iii) Ile Ser Leu Ser Asn His Arg Met Gin Trp His His Asn Tyr Ser wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuren und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren deletiert sein kann.
2. An Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere
Co(II) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:
(i) Ala His Gin Gin Thr His His Tyr Phe Thr His His Leu Asn Trp wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren deletiert sein kann, und
(ii) Val Ala His His Trp Trp His Asp Gly Tyr Lys His Pro Leu Asn wobei diese Sequenz N-terminal um 1 oder 2 Aminosäuren und/oder C-terminal um 1 , 2 oder 3 Aminosäuren deletiert sein kann.
3. An Co(II), Ni(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere
Cu(II) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:
(i) Ala His Pro His Arg His His Ser Asp Ser Met Leu Val Thr His wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure deletiert sein kann,
(ii) His Arg Ser Trp Thr Ser Pro His Asn His Pro His Thr His His,
(iii) Lys His His Leu His His Glu His Ala Tyr Pro Thr Leu Lys Asn wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure und/oder C-terminal um l, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann, und
(iv) His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr Ala Trp wobei diese Sequenz C-terminal um l, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann.
4. An Co(II), Cu(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere
Ni(II) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:
(i) Ala Tyr Pro His Phe His Ser Asn Ser His Leu Ile His Ser His wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2 oder 3 Ami¬ nosäuren deletiert sein kann,
(ii) Tyr His Thr Ser Ile His His His His Pro Val Asp His Leu Ala wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure und/oder C-termmal um eine oder zwei Aminosäuren deletiert sein kann, (m) Leu Asp His Thr Tyr Arg Ala His Ser Lys Val His His
His His wobei diese Sequenz N-termmal um eine oder zwei
Aminosäuren deletiert sein kann, (iv) Ala Pro Ser His His Thr His Ser His His Leu Thr Gin
Met Arg wobei diese Aminosauresequenz N-terminal um 1, 2 oder
3 Aminosäuren und/oder C-terminal um 1, 2, 3, 4 oder 5
Aminosäuren deletiert sein kann, und (v) His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr
Ala Trp wobei diese Aminosauresequenz C-termmal um 1, 2, 3,
4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann.
5. An Co(II), Cu(II) und/oder Nι(II) und/oder insbesondere Zn(II) bindendes Peptid mit der folgenden Ammosaurensequenz: His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr Ala Trp, wobei diese Sequenz C-termmal um 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann.
6. Fusionsprotein, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein rekombinantes Protein handelt, dessen N-Termmus oder C- Termmus zur Aufreinigung des Proteins und/oder zu seinem Nachweis durch ein Peptid bzw. eine Aminosauresequenz (Af- fmitatstag) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche gebildet w rd.
7. Fusionsprotein nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch eine Verknüpfung von rekombmantem Protein und Affmitatstag, die nach Aufreinigung und/oder Nachweis des rekombinanten Proteins lösbar ist.
8. Fusionsprotein nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Verknüpfung um eine Protease-Schnittstelle oder ein Intein handelt.
9. Oligonucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 codiert.
10. Expressionsvektor mit einem Oligonucleotid gemäß Anspruch 9 zur Expression eines Fusionsproteins gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8.
11. Bakterieller Expressionsstamm, insbesondere Escherichia coli-Stamm, mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 10.
12. Verfahren zur Gewinnung eines an Co(II), Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) bindenden Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) ein Peptid mit 6 bis 15 Aminosäureresten und
- mit 4 bis 6 und gegebenenfalls mehr His-Resten als Ami¬ nosäurereste, von denen bis zu 4 His-Reste unmittelbare aufeinander¬ folgen können, als Fusionsprotein mit einem Phagen-Hüllprotein in einem
Phagen-Display exprimiert,
(b) das exprimierte Fusionsprotein auf ein mit Co(II), Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) beladenes Chromatogra¬ phie-Material aufgibt und die Affinität des Peptids zu dem mit den Metallionen beladenen Chromatographie-Material testet, (c) das Peptid, sofern es bindet, identifiziert, aus dem Fusionsprotein löst oder synthetisch herstellt und isoliert .
13. Verfahren zur Gewinnung eines an Fe(III) bindenden Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) ein Peptid mit 7 bis 15 Aminosäureresten, und mit 0 bis 2 und gegebenenfalls mehr Arg-Resten als Aminosäurereste, mit 0 bis 4 und gegebenenfalls mehr Lys-Resten als Aminosäurereste und mit 2 bis 3 und gegebenenfalls mehr His-Resten als Aminosäurereste als Fusionsprotein mit einem Phagen-Hüllprotein in einem
Phagen-Display exprimiert,
(b) das exprimierte Fusionsprotein auf ein mit Fe(III) beladenes Chromatographie-Material aufgibt und die Affinität des Peptids zu dem mit den Metallionen beladenenen Chromatographie-Material testet,
(c) das Peptid, sofern es bindet, identifiziert, aus dem Fusionsprotein löst oder synthetisch herstellt und isoliert .
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, gekennzeichnet durch p (III) als Phagen-Hüllprotein.
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