CN109370950A - 一种轻质石油烃降解肠杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN109370950A CN201811447262.7A CN201811447262A CN109370950A CN 109370950 A CN109370950 A CN 109370950A CN 201811447262 A CN201811447262 A CN 201811447262A CN 109370950 A CN109370950 A CN 109370950A
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Abstract

本申请公开了的一种轻质石油烃降解肠杆菌及其制备方法和应用，肠杆菌为肠杆菌HJ‑06，且所述肠杆菌HJ‑06保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16465。本申请公开的轻质石油烃降解肠杆菌对石油烃类物质有很好的降解能力，该菌株15天内对石油烃类物质的降解率为30.67％，且同样适用于对土壤中石油烃类物质的降解。本申请公开的肠杆菌源于含油污染物，因此该菌株进入含油污染物后很快成为优势菌群，有效促进石油烃类物质的降解；本申请公开的肠杆菌是以单一菌种实现石油烃类物质的降解，减少混合菌剂制备过程中的复杂步骤。

Description

一种轻质石油烃降解肠杆菌及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及微生物石油烃降解技术领域，尤其涉及一种轻质石油烃降解肠杆菌及其制备 方法和应用。
背景技术
自20世纪以来，石油已经成为人类最重要的能源之一，而在被大量开采和使用的同时， 石油及其加工品对环境及人类造成的危害也日趋严重，我国石油类污染程度远高于发达国家， 且呈逐年累积加重态势。
石油烃类物质的主体物质是由占比70％-80％的脂肪烃和占比20％-30％的芳香烃构成，其 余物质是微量的含硫、含氮有机组分。按挥发性划分，石油烃类物质包含大量的挥发性有机 物(Volatile Organic Compounds，VOCs)和半挥发性有机物(Semi-VolatileOrganic Compounds， SVOCs)，因此具有很高的迁移性，污染面积广，生物有效性高，能够直接影响生物体。而且， 石油烃类物质的长链部分因其分子质量大，结构紧密，所以其乳化性能较低，在土壤中有很 强的滞留性，将对土壤结构以及生物种群造成严重影响，并如同重金属污染物质一样，富集 于积累性植物中，进入食物链，对人们的健康造成威胁。因此，石油烃污染场地的修复处理， 不仅对我们当代人而且对子孙后代的健康生活乃至今后的社会发展都是一项必须重视的责 任。
生物降解石油烃的方法分为两类，一是向油污泥中投加营养物质，曝气，促进污泥土著 微生物生长增殖，从而实现对污染物的降解；二是向油污泥中投加高效降解石油烃的微生物 菌剂；但是目前的微生物降解菌剂以复合微生物菌剂为主，多种菌株需要单独培养活化后按 一定比例混合，再进行第二次培养活化后作为降解复合菌剂对污染物进行降解，培养工艺操 作频繁。现有技术中也并没有使用单一的菌种实现较为优异的含油污泥中石油烃类的降解的 方案；同时，目前对石油烃降解微生物的研究大多集中于沿海港口或是油田区域，所研究的 石油烃类物质多是以原油或航运重油为目标，但这样的研究以及所培育的菌种能否适用在内 陆地区的工业石油烃类物质污染还是未知数。
发明内容
本申请提供了一种轻质石油烃降解肠杆菌及其制备方法和应用，运用单一菌种降解石油 烃，以解决复合菌剂降解石油烃工艺繁杂的问题。
为了解决上述技术问题，本申请实施例公开了如下技术方案：
本申请提供了一种轻质石油烃降解肠杆菌，所述轻质石油烃降解肠杆菌为肠杆菌HJ-06， 且所述肠杆菌HJ-06已于2018年9月12日保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号 为CGMCC NO.16465，且分类命名为：肠杆菌Enterobacter sp.。
优选地，所述肠杆菌HJ-06为兼性厌氧发酵型革兰氏阴性菌；
所述肠杆菌HJ-06进行二乙酰试验及吲哚试验时呈阴性，所述肠杆菌HJ-06进行氧化酶 及硝酸盐还原试验时呈阳性；
所述肠杆菌HJ-06进行生理活动产生H2S；
所述肠杆菌HJ-06可利用枸橼酸且具有H2O2触媒。
本申请还提供了一种轻质石油烃降解肠杆菌的制备方法，包括如下步骤：
称取原始场地污染物质并溶于无机盐培养液中，得到含土著菌种的培养液，并将所述含 土著菌种的培养液震荡培养，得到土著菌悬浊液；
称取所述土著菌悬浊液至备有无机盐培养液的锥形瓶中，并向所述锥形瓶中加入目标单 种石油烃物质后震荡培养，得到初筛菌种悬浊液；
称取所述初筛菌种悬浊液至备有无机盐培养液的锥形瓶中，并向所述锥形瓶中加入目标 混合石油烃物质后震荡培养，得到复筛菌种悬浊液；
称取所述复筛菌种悬浊液并涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，恒温培养5天后检测所述目标 混合石油烃物质的降解率，并淘汰所述降解率为5％以下的菌种，得到纯化菌落；
将所述纯化菌落涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，恒温培养5天后检测所述目标混合石油烃 物质的降解率，选择降解率最高的为肠杆菌HJ-06；
将所述肠杆菌HJ-06进行环境驯化，所述环境驯化包括液基驯化和土基驯化。
优选地，所述液基驯化包括：
将所述肠杆菌HJ-06接种于牛肉膏蛋白胨培养基制作第一种子液，将所述第一种子液恒 温培养并备用；
将所述目标混合石油烃物质加入无机盐培养液中作为驯化培养液；
涂布蘸取所述第一种子液并将所述种子液轻触所述驯化培养液的液面，将所述肠杆菌 HJ-06接种于所述驯化培养液的液面后依次进行恒温培养和震荡培养.
所述土基驯化包括：
将所述肠杆菌HJ-06接种于盛有无机盐培养基及所述目标混合石油烃物质的锥形瓶中后 震荡培养制作第二种子液，将所述第二种子液恒温培养并备用；
将搅拌均匀的土样及无机盐培养液均加入锥形瓶中，将所述第二种子液接种于所述锥形 瓶中进行恒温培养和震荡培养。
优选地，所述将所述含土著菌种的培养液震荡培养包括：
震荡温度为37℃，震荡转速为180r/min，震荡周期为24h。
优选地，所述向所述锥形瓶中加入目标单种石油烃物质后震荡培养包括：
震荡温度为37℃，震荡转速为180r/min，震荡周期为5天。
优选地，所述向所述锥形瓶中加入目标混合石油烃物质后震荡培养包括：
震荡温度为37℃，震荡转速为180r/min，震荡周期为5天。
优选地，所述目标单种石油烃物质包括齿轮油、废液压油或重载柴油中的一种。
优选地，所述目标混合石油烃物质包括齿轮油、废液压油及重载柴油；
所述齿轮油、废液压油及重载柴油的质量比为5:3:2。
本申请还提供了一种轻质石油烃降解肠杆菌的应用，所述轻质石油烃降解肠杆菌按照上 述制备方法制备，所述轻质石油烃降解肠杆菌用于降解石油烃类物质。
与现有技术相比，本申请的有益效果为：
(1)本申请公开的肠杆菌源于含油污染物，因此该菌株进入含油污染物后很快成为优势 菌群，占据一定生态优势，有效促进石油烃类物质及土壤中石油烃类物质的降解。
(2)本申请公开的肠杆菌是以石油烃物质无碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖 过程中可改变含油污泥中石油烃类物质的性质，使含油污泥中石油烃类物质的组分发生变化。
(3)本申请公开的肠杆菌是以单一菌种实现石油烃类物质的降解，减少混合菌剂制备过 程中的复杂步骤，且单一菌种可以避免降解后的反应产物复杂，可融合其他方法进一步降解 石油烃。
(4)本申请提供的肠杆菌能够适用鱼内陆地区的工业石油烃类物质污染的治理。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制 本申请。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介 绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根 据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌HJ-06的显微镜下40x的镜检示意图；
图2为本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌HJ-06的显微镜下100x的镜检示意图；
图3为本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌HJ-06接种于液体培养基18h后的状态示意 图；
图4为本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌HJ-06接种于混合油后的状态示意图；
图5为本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌HJ-06降解前石油烃的气相色谱图；
图6为本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌HJ-06降解石油烃5d后的气相色谱图；
图7为本发明提供的轻质石油烃降解肠杆菌HJ-06的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中 的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅 是本申请一部分实施例，而不是全部实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员 在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
本申请提供了一种轻质石油烃降解肠杆菌，所述轻质石油烃降解肠杆菌为肠杆菌HJ-06， 且所述肠杆菌HJ-06已于2018年9月12日保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号 为CGMCC NO.16465，且分类命名为：肠杆菌Enterobacter sp.。
优选地，所述肠杆菌HJ-06为兼性厌氧发酵型革兰氏阴性菌；
所述肠杆菌HJ-06进行二乙酰试验及吲哚试验时呈阴性，所述肠杆菌HJ-06进行氧化酶 及硝酸盐还原试验时呈阳性；
所述肠杆菌HJ-06进行生理活动产生H2S；
所述肠杆菌HJ-06可利用枸橼酸且具有H2O2触媒。
本申请还提供了一种轻质石油烃降解肠杆菌的制备方法，具体方法参考图7为本发明提 供的轻质石油烃降解肠杆菌的制备方法的流程示意图，包括如下步骤：
S01：称取原始场地污染物质并溶于无机盐培养液中，得到含土著菌种的培养液，并将所 述含土著菌种的培养液震荡培养，得到土著菌悬浊液；这一步骤属于原始污染物菌种富集分 离；具体地，震荡温度为37℃，震荡转速为180r/min，震荡周期为24h。
其中本发明进行原始污染物菌株分离的污染物来自重庆市九龙坡区某装配厂储油车间的 收集池污泥沉积物；以状态可选取膏状污泥、废油、油浸土壤等。
S02：称取所述土著菌悬浊液至备有无机盐培养液的锥形瓶中，并向所述锥形瓶中加入目 标单种石油烃物质后震荡培养，得到初筛菌种悬浊液；具体地，震荡温度为37℃，震荡转速 为180r/min，震荡周期为5天，同时震荡重复3次，以减少悬浊液悬浮物质的量。
这一步骤目的是以三种石油烃物质作为微生物利用的唯一碳源进行微生物的初步淘汰， 减少微生物种类。37℃，180r/min连续震荡培养，周期5d，重复7次，转管保存。此试验， 得到有降解力菌株36株。
S03：称取所述初筛菌种悬浊液至备有无机盐培养液的锥形瓶中，并向所述锥形瓶中加入 目标混合石油烃物质后震荡培养，得到复筛菌种悬浊液；具体地，震荡温度为37℃，震荡转 速为180r/min，震荡周期为5天。
S04：称取所述复筛菌种悬浊液并涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，恒温培养5天后检测所述 目标混合石油烃物质的降解率，并淘汰所述降解率为5％以下的菌种，得到纯化菌落。
在单种油初筛完成以后，针对剩余菌株进行混合油复筛，目的是得到能在试验用样本环 境下生存且有较高降解能力的降解菌株，此试验，得到菌株7株。
具体过程包括：量取1ml的含菌培养悬浊液至备有100ml无机盐培养液的锥形瓶中，并 加入0.5ml的目标混合油，37℃，180r/min连续震荡培养，周期5d，重复7次，周期结束后， 取成熟菌液，稀释为千分之一，以平板划线法，取0.2ml涂布于固体牛肉膏蛋白胨培养基， 37℃恒温培养箱培养，进行菌落挑选。16～18h后选菌落转管保存，备用，检测轻质石油烃降 解率，以5d降解率5％为下限进行二次淘汰。本申请中采用的平板划线法为本领域常用的技 术手段，故在此不再赘述，该过程的状态图参考图4，图4为本申请提供的轻质石油烃降解 肠杆菌接种于混合油后的状态示意图。
S05：将所述纯化菌落涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，恒温培养5天后检测所述目标混合石 油烃物质的降解率，选择降解率最高的为肠杆菌HJ-06。
从7株菌株中选择降解率最高的即为肠杆菌HJ-06。
S06：将所述肠杆菌HJ-06进行环境驯化，所述环境驯化包括液基驯化和土基驯化。
液基驯化和土基驯化的目的是为了使所述肠杆菌HJ-06对液基和土基具备较高的降解能 力。
进一步，所述液基驯化包括：
S0611：将所述肠杆菌HJ-06接种于牛肉膏蛋白胨培养基制作第一种子液，将所述第一种 子液恒温培养并备用。
S0612：将所述目标混合石油烃物质加入无机盐培养液中作为驯化培养液。
S0613：涂布蘸取所述第一种子液并将所述种子液轻触所述驯化培养液的液面，将所述肠 杆菌HJ-06接种于所述驯化培养液的液面后依次进行恒温培养和震荡培养。
具体地，刮取已筛选菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基制作种子液，37℃恒温培养箱 培养，周期18-24h(以OD600判断种子液成熟度)，在液体无机盐培养基100ml加入0.5ml 轻质石油烃物质作为驯化培养液，用涂布棒蘸取种子液，轻触驯化培养液液面，将菌株接种。
接种后，37℃恒温培养箱静态培养，时间18h，静态时间结束，放入震荡培养器，130r/min 连续震荡培养，时间6h，之后循环，整个培养周期为5d；之后减少无机盐培养基为100ml， 加入1ml轻质石油烃物质重复上述过程，至3ml为限，具体形态参考图3，图3为本申请提 供的轻质石油烃降解肠杆菌接种于液体培养基18h后的状态示意图。
所述土基驯化包括：
S0614：将所述肠杆菌HJ-06接种于盛有无机盐培养基及所述目标混合石油烃物质的锥形 瓶中后震荡培养制作第二种子液，将所述第二种子液恒温培养并备用。
S0615：将搅拌均匀的土样及无机盐培养液均加入锥形瓶中，将所述第二种子液接种于所 述锥形瓶中进行恒温培养和震荡培养。
具体地，刮取菌株加入盛有无机盐培养基以及轻质石油烃物质的锥形瓶中，以28℃恒温 水浴，180r/min进行震荡培养，周期24h，测定菌液在600nm处的OD值并以此菌液作种子 液接种筛选培养基。
称量搅拌均匀的实验用土样10g至250ml锥形瓶中，以10：1液固比加入灭菌后的无机 盐培养液，并接种1ml种子液，培养周期为5d，28℃恒温水浴，180r/min进行震荡培养；第二次降低泥浆液固比至5：1，重复上述过程；之后至3：1为环境下限，重复上述过程，并 将周期重复7次。
具体地，所述目标单种石油烃物质包括齿轮油、废液压油或重载柴油中的一种。
具体地，所述目标混合石油烃物质包括齿轮油、废液压油及重载柴油；
所述齿轮油、废液压油及重载柴油的质量比为5:3:2。
本申请中涉及的培养基均为本领域常用的培养基，关于培养基的组分在此不再赘述。
本申请还提供了一种轻质石油烃降解肠杆菌的应用，所述轻质石油烃降解肠杆菌按照上 述制备方法制备，所述轻质石油烃降解肠杆菌用于降解石油烃类物质。
本发明对本发明实施例提供的菌株进行了鉴定，该鉴定包括以下内容：
实施例1：形态学鉴定
将肠杆菌HJ-06稀释1000倍并接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中生长18h后，观察菌落 大小、形状、颜色以及边缘等形态，同时于显微镜下进行40x和100x镜检观察。其中，菌落 形态学特征见表1，镜检图分别参考图1和图2，图1为本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌 的显微镜下40x的镜检示意图；图2为本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌的显微镜下100x 的镜检示意图。
表1本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌的形态学特征
实施例2：生理生化鉴定
本实施例对本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌进行生理生化活性鉴定，将菌种接种于 特定的鉴别培养基，按时间需求进行培养，完成后，依照反应现象鉴别生理生化活性情况。
具体的试验包括如下：
(1)对氧耐受性试验
原理：细菌因在不同含氧状态下的生长情况不同，而形成的菌落量不同。
方法：穿刺接种于厌氧培养基，最适温度下培养3d～7d，仅在表面生长者为好氧菌，沿 穿刺线生长者为兼性厌氧菌，底部生长者为厌氧菌。
(2)耐酸耐碱性试验
原理：细菌因在不同酸碱环境下的生长情况不同，而形成的菌落量不同。
方法：接种于调配pH后的牛肉膏蛋白胨培养基，最适温度下培养24h～48h，检测OD600 反应生长情况。
(3)生长温度
原理：细菌因在不同温度环境下的生长情况不同，而形成的菌落量不同。
方法：接种于牛肉膏蛋白胨培养基，调节生长温度，培养24h～48h，检测OD600反应生 长情况。
(4)糖类发酵(分解)试验
原理：细菌含有分解不同糖类的酶，因而分解各种糖类的能力也不一样。有些细菌分解 某些糖(醇、苷)产酸、产气，培养基由蓝变黄(指示剂溴麝香草酚蓝由蓝遇酸变黄的结果)， 并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类，培养基仍为蓝色。
a：适用于需氧菌的方法
培养基：用邓亨氏(Dunham)蛋白胨水溶液，每100ml加入1.2ml的0.2％溴麝香草酚蓝作指示剂。在培养基中加入琼脂0.5～0.7％，成半固体，则省去倒立的小发酵管。
方法：从琼脂斜面的纯培养物上，用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中(如 为半固体，应穿刺)，在37℃培养，一般观察2d～3d。
b：适用于厌氧菌的方法
方法：将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于厌氧培养基的深部，于37℃培养。结果观 察同需氧菌。
(5)V-P试验(二乙酰试验)
原理：某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→2，3-丁烯二醇，在有碱存在时氧 化成二乙酰，后者和精氨酸中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。
培养基：常规培养基。
试剂：6％α-奈酚酒精溶液为甲液，40％氢氧化钾为乙液。
方法：Baritt’s法：同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4ml， 摇振混合。试验时强阳性者约于5min后，可产生粉红色反应)，次日不变者为阴性。
(6)甲基红(M.R.)试验
原理：某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳 酸等，而不是生成V-P试验中的二乙酰，从而使培养基的pH下降至4.5或以下(V-P试验的 培养物pH常在4.5以上)，故加入甲基红试剂呈红色。本试验常与V-P试验一起使用，因为 前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。
培养基：常规培养基。
方法：接种细菌于培养液中，37℃培养2d～7d后，于培养物中加入几滴甲基红指示剂， 变红色者为阳性反应。
(7)淀粉水解试验
原理：细菌如产生淀粉酶可将淀粉分解为糖类，在培养基上滴加碘液，可在菌落周围出 现透明区。
培养基：可溶性淀粉琼脂。
方法：将细菌划线接种于上述平板上，在37℃培养24h。生长后取出，在菌落处滴加革 兰氏碘液少许，培养基变为深蓝色，细菌及其菌落周围有透明的环呈阳性。
(8)枸橼酸盐利用试验
原理：当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐 培养基上生长，生成碳酸钠，并同时利用铵盐生成氢，使培养基呈碱性。
将被检细菌少量接种到Simmons枸橼酸盐培养基中，37℃培养2d～4d，培养基变蓝色者 为阳性，不变者为阴性。
培养基：Simmons枸橼酸盐培养基。
(9)吲哚试验
原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，经与试剂中的对位二甲基氨基苯甲醛作 用，生成玫瑰吲哚。
方法：以接种环接种待试细菌的新鲜斜面培养物于吲哚亚硝酸盐培养基中，37℃培养 24h～48h后(可延长4d～5d)。于培养基中加入戊醇或二甲苯2～3ml，摇匀，静置片刻后， 沿试管壁加入欧立希氏试剂2ml。在戊醇或二甲苯下面的液体变红色者，细菌涂印周围呈蓝 色者为阳性反应。细菌涂印周围无色泽变化或淡黄色者为阴性。
培养基：吲哚亚硝酸盐培养基。
(10)硫化氢试验
原理：有些细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢(H2S)，H2S会使培养基中的醋酸铅或 氯化铁形成黑色的硫化铅或硫化铁。
方法：将三种成份分别高压灭菌，前二者混合后待凉至60℃，加入醋酸铅溶液，混合均 匀，无菌分装试管5～6cm高，立即浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。用接种针蘸取纯培养 物，沿管壁作穿刺，孵育于37℃1d～2d后观察，必要时可延长5d～7d。培养基变黑色者为阳性。
(11)硝酸盐还原试验
原理：有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用生成对 重氮基苯磺酸，且对重氮基苯磺酸与α-萘胺作用能生成红色的化合物N-α-萘胺偶氮苯磺酸
试剂：甲液：对位氨基苯磺酸0.8g与5mol/l醋酸溶液100ml；乙液：α—萘胺0.5g与5mol/l 醋酸溶液100ml
培养基：硝酸盐培养基。
方法：接种于硝酸盐培养基后37℃培养4d(厌氧菌培养1d～2d即可)，沿管壁少量加入 加入等量的甲液与乙液，即时观察。呈红色为阳性。
(12)触酶试验
原理：触酶又称过氧化氢酶，能将过氧化氢分解为水和氧气：2H2O2＝2H2O+O2↑
培养基：常规培养基。
方法：用清洁小试管中加入少量的H2O2(30％)，再用清洁无菌的细玻捧蘸细菌少许， 插入于H2O2液面下，有气泡产生者为阳性。
(13)氧化酶试验
原理：氧化酶及细胞色素氧化酶。做氧化酶试验时，此酶并不直接与氧化酶试剂起反应， 而是首先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
培养基：常规培养基。
方法：如细菌在固体培养基上长出菌落，可将盐酸二甲基对苯二胺水溶液直接滴在细菌 的菌落上，菌落呈玫瑰红色然后到深紫色者为氧化酶阳性。
综上，生理生化鉴定结果如表2，具体如下：
表2本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌的生理生化鉴定结果
其中，+表示为本菌株有反应或可以利用，-表示本菌株没有反应或不可以利用。
实施例3：
本实施例中，为了评价本申请中提供的轻质石油烃降解肠杆菌对石油烃类物质的降解能 力，取混合油3ml添加至灭菌后的无机盐液体培养基，制成降解培养基。
经过环境驯化后，菌株5d降解率较原始水平提升达46.26％，将菌株接种于液体牛肉膏 蛋白胨培养基，培养18h制成种子液并取1.2ml接种于降解培养基，恒温培养箱培养24h，然 后140r/min，恒温震荡5d，10d，15d。国标称重法测量宏观降解率，气相色谱检测微观变化， 气相色谱结果具体参考图5和图6，图5为本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌降解前石油 烃的气相色谱图；图6为本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌降解石油烃5d后的气相色谱图。 由图可知，驯化后菌株的石油烃色谱图6在同区域峰面积上较未处理的原始土壤石油烃色谱 图5下降明显，其中C15～C28区域峰面积降幅约值40000，末端区域下降10000，说明驯化 后菌株对石油烃类物质有很好的降解能力，具体降解率实验结果参考表3。
表3本申请提供的轻质石油烃降解肠杆菌对石油烃类物质的降解率结果
从表3中可以看出，随着时间的延长本申请提供的肠杆菌对石油烃类物质的降解率在逐 步上升。
实施例4：
本实施例中，为了评价本申请中提供的轻质石油烃降解肠杆菌对土壤中石油烃类物质的 降解能力，配合固液比5：1。将菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基，培养18h制成种子液 并取3ml于烧杯中，加入去离子水至10ml成混合液。称取受污染土壤50g，加入混合液搅拌 成泥浆。自然状态下培养5d，然后送检，实验结果如表4。
在本实施例中，分别测试菌株对碳原子数在C10-C14、C15-C28及C29-C40的轻质石油 烃的降解，除C10-C14外经菌株处理后的土壤明显比未经菌株处理的原始土壤石油烃含量低， 说明菌株对土壤中的石油烃物质具备良好的降解能力。
由于以上实施方式均是在其他方式之上引用结合进行说明，不同实施例之间均具有相同 的部分，本说明书中各个实施例之间相同、相似的部分互相参见即可。在此不再详细阐述。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本申请的其他实施 方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应 性变化遵循本申请的一般性原理并包括本请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手 段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由权利要求的内容指出。
以上所述的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。
序列表
<110> 重庆工商大学
<120> 一种轻质石油烃降解肠杆菌及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1294
<212> DNA
<213> 石油烃肠杆菌(Enterobacter菌株HJ-06的16s rDNA序列)
<400> 1
gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgt ggcattctga tccacgatta 60
ctagcgattc cgacttcatg gagtcgagtt gcagactcca atccggacta cgacgcactt 120
tatgaggtcc gcttgctctc gcgaggtcgc ttctctttgt atgcgccatt gtagcacgtg 180
tgtagcccta ctcgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc ctccagttta 240
tcactggcag tctcctttga gttcccggcc taaccgctgg caacaaagga taagggttgc 300
gctcgttgcg ggacttaacc caacatttca caacacgagc tgacgacagc catgcagcac 360
ctgtctcaga gttcccgaag gcaccaaagc atctctgcta agttctctgg atgtcaagag 420
taggtaaggt tcttcgcgtt gcatcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 480
cccgtcaatt catttgagtt ttaaccttgc ggccgtactc cccaggcggt cgacttaacg 540
cgttagctcc ggaagccacg cctcaagggc acaacctcca agtcgacatc gtttacggcg 600
tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctg agcgtcagtc 660
tttgtccagg gggccgcctt cgccaccggt attcctccag atctctacgc atttcaccgc 720
tacacctgga attctacccc cctctacaag actctagcct gccagtttcg aatgcagttc 780
ccaggttgag cccggggatt tcacatccga cttgacagac cgcctgcgtg cgctttacgc 840
ccagtaattc cgattaacgc ttgcaccctc cgtattaccg cggctgctgg cacggagtta 900
gccggtgctt cttctgcggg taacgtcaat cgacaaggtt attaacctta tcgccttcct 960
ccccgctgaa agtactttac aacccgaagg ccttcttcat acacgcggca tggctgcatc 1020
aggcttgcgc ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctggaccgtg 1080
tctcagttcc agtgtggctg gtcatcctct cagaccagct agggatcgtc gcctaggtga 1140
gccgttaccc cacctactag ctaatcccat ctgggcacat ccgatggcaa gaggcccgaa 1200
ggtccccctc tttggtcttg cgacgttatg cggtattagc taccgtttcc agtagttatc 1260
cccctccatc aggcagtttc ccagacatta ctca 1294

Claims (10)

1.一种轻质石油烃降解肠杆菌，其特征在于，所述轻质石油烃降解肠杆菌为肠杆菌HJ-06，且所述肠杆菌HJ-06保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.16465。
2.根据权利要求1所述的轻质石油烃降解肠杆菌，其特征在于，所述肠杆菌HJ-06为兼性厌氧发酵型革兰氏阴性菌；
所述肠杆菌HJ-06进行二乙酰试验及吲哚试验时呈阴性，所述肠杆菌HJ-06进行氧化酶及硝酸盐还原试验时呈阳性；
所述肠杆菌HJ-06进行生理活动产生H2S；
所述肠杆菌HJ-06可利用枸橼酸且具有H2O2触媒。
3.一种轻质石油烃降解肠杆菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
称取原始场地污染物质并溶于无机盐培养液中，得到含土著菌种的培养液，并将所述含土著菌种的培养液震荡培养，得到土著菌悬浊液；
称取所述土著菌悬浊液至备有无机盐培养液的锥形瓶中，并向所述锥形瓶中加入目标单种石油烃物质后震荡培养，得到初筛菌种悬浊液；
称取所述初筛菌种悬浊液至备有无机盐培养液的锥形瓶中，并向所述锥形瓶中加入目标混合石油烃物质后震荡培养，得到复筛菌种悬浊液；
称取所述复筛菌种悬浊液并涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，恒温培养5天后检测所述目标混合石油烃物质的降解率，并淘汰所述降解率为5％以下的菌种，得到纯化菌落；
将所述纯化菌落涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，恒温培养5天后检测所述目标混合石油烃物质的降解率，选择降解率最高的为肠杆菌HJ-06；
将所述肠杆菌HJ-06进行环境驯化，所述环境驯化包括液基驯化和土基驯化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述液基驯化包括：
将所述肠杆菌HJ-06接种于牛肉膏蛋白胨培养基制作第一种子液，将所述第一种子液恒温培养并备用；
将所述目标混合石油烃物质加入无机盐培养液中作为驯化培养液；
涂布蘸取所述第一种子液并将所述种子液轻触所述驯化培养液的液面，将所述肠杆菌HJ-06接种于所述驯化培养液的液面后依次进行恒温培养和震荡培养.
所述土基驯化包括：
将所述肠杆菌HJ-06接种于盛有无机盐培养基及所述目标混合石油烃物质的锥形瓶中后震荡培养制作第二种子液，将所述第二种子液恒温培养并备用；
将搅拌均匀的土样及无机盐培养液均加入锥形瓶中，将所述第二种子液接种于所述锥形瓶中进行恒温培养和震荡培养。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述将所述含土著菌种的培养液震荡培养包括：
震荡温度为37℃，震荡转速为180r/min，震荡周期为24h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述向所述锥形瓶中加入目标单种石油烃物质后震荡培养包括：
震荡温度为37℃，震荡转速为180r/min，震荡周期为5天。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述向所述锥形瓶中加入目标混合石油烃物质后震荡培养包括：
震荡温度为37℃，震荡转速为180r/min，震荡周期为5天。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述目标单种石油烃物质包括齿轮油、废液压油或重载柴油中的一种。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述目标混合石油烃物质包括齿轮油、废液压油及重载柴油；
所述齿轮油、废液压油及重载柴油的质量比为5:3:2。
10.一种轻质石油烃降解肠杆菌的应用，其特征在于，所述轻质石油烃降解肠杆菌按照权利要求1-9中任意权利要求的制备方法制备，所述轻质石油烃降解肠杆菌用于降解石油烃类物质。
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