CN111351689A - 一种细菌染色法的制片方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细菌染色法的制片方法及其应用，所述制片方法包括涂片，步骤如下：取干净载玻片，在相近两处分别滴加一滴无菌生理盐水，以无菌操作用接种环挑取少量植株细菌于其中一滴生理盐水中；然后用接种环划线引流至另一滴生理盐水，使菌体从第一滴生理盐水自由进入第二滴生理盐水，使菌体稀释，进而自由分散均匀；最后在两滴生理盐水中间划线水流断开，避免造成两滴生理盐水的水液来回流动。本发明方法使菌体分散的更加均匀，能够防止涂片固定过厚出现菌体重叠现象，同时干燥固定时间短，便于操作，降低了假阳性和假阴性现象，可大大提高染色观察的准确度。
Description
技术领域
本发明涉及微生物染色领域，具体涉及一种细菌染色法的制片方法及其应用。
背景技术
细菌属于原核生物，因其菌体小要想清楚的观察其大小和形态，需经染色和显微镜放大后才能看到。常用的细菌染色法有单染法、复染法和鉴别染色法。而鉴别染色法主要有革兰氏染色、美蓝染色、抗酸染色、瑞氏染色和姬姆萨染色等方法。在对细菌进行涂片、染色、制片中，主要分为传统人工操作与利用仪器设备自动操作。由于传统人工操作涂片、染色、制片，其所需设备仪器少，投资小。故应用较为广泛与普遍，如学校教学。
以革兰氏染色法为例，它是微生物学技术中，尤其是细菌检测、分类与鉴定的一种众所周知的、普遍的染色法。革兰氏染色法常规的方法步骤主要有：制片、结晶紫初染、碘液媒染、乙醇脱色与番红复染。该染色法由于细菌细胞壁成分和结构的差异，可以将阳性细菌染成紫色，而阴性细菌染成红色。而在革兰氏染色操作中经常会出现假阳性和假阴性的结果，其原因主要是假阳性可能是由于涂片过厚或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；另外，细胞培养时间太长，可能已经有部分细胞发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。在操作方面造成假阳性或假阴性结果的往往是初学者或者不熟练操作者。因此，对革兰氏染色法进行改进，使操作简单化并能提高结果正确性显得十分重要。
在常规革兰氏染色法中，对于初学者，制片步骤若菌体涂抹分散不均匀，会导致涂片固定过厚，则容易造成假阳性与影响菌体形态观察；干燥步骤中采用自然风干则浪费等待时间，加长了整个染色操作时间；若采用酒精灯微热干燥与固定，对初学者容易出现玻片断裂或加热固定过度造成假阴性，且鞭毛染色与伴孢晶体染色不能使用加热固定。而本发明可以很好的解决上述问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种细菌染色法的制片方法及其应用，该方法使菌体分散的更加均匀，能够防止涂片固定过厚出现菌体重叠现象，同时干燥固定时间短，便于操作，降低了假阳性和假阴性现象，可大大提高染色观察的准确度。
本发明是这样实现的：
一种细菌染色法的制片方法，所述制片方法包括涂片，步骤如下：取干净载玻片，在相近两处分别滴加一滴无菌生理盐水，以无菌操作用接种环挑取少量植株细菌于其中一滴生理盐水中；然后用接种环划线引流至另一滴生理盐水，使菌体从第一滴生理盐水自由进入第二滴生理盐水，使菌体稀释，进而自由分散均匀；最后在两滴生理盐水中间划线水流断开，避免造成两滴生理盐水的水液来回流动。
进一步地，所述制片方法还包括干燥固定，步骤如下：涂片完成后，采用电吹风把载玻片上的菌悬液水吹干，以达到干燥、固定效果。
进一步地，所述吹干具体操作为：将载玻片持平，菌悬液面朝上，用电吹风从载玻片下方、垂直从下往上吹热风，直至水滴干掉为止，避免风直吹菌悬液。
进一步地，所述制片方法可以运用于细菌简单染色、革兰氏染色、细菌芽孢染色与鞭毛染色。
本发明具有如下优点：
1.本发明采用划线引流操作方式，使待染色菌体稀释，提高其分散性和均匀性，菌体均为单个存在，避免出现菌体重叠现象影响染色观察与结果。
2.本发明采用电吹风干燥与固定菌体，不仅比传统的自然风干节省时间，且省去传统的加热固定步骤，可以避免初学者应操作不当使载玻片断裂而伤手或出现被酒精灯烫伤事故，以及能够避免使用酒精加热不易掌握，容易出现固定过度而出现假阴性。
总之，本发明与传统的相比，具有过程简单、易于操作，且操作准确率高等优点，对操作者的操作能力要求较低，尤其适用于初学者的操作。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明实施例的枯草芽孢杆菌的染色法镜检图（放大倍数10*100）。
图2为本发明实施例的啤酒酵母菌的染色法镜检图（放大倍数10*100）。
具体实施方式
本发明涉及一种细菌染色法的制片方法，所述制片方法包括涂片，步骤如下：取干净载玻片，在相近两处分别滴加一滴无菌生理盐水，以无菌操作用接种环挑取少量植株细菌于其中一滴生理盐水中，即带菌接种环在生理盐水中轻蘸几下；然后用接种环轻触含菌悬液水滴边缘，划线引流至另一滴生理盐水，使菌体从第一滴生理盐水自由进入第二滴生理盐水，使菌体稀释，进而自由分散均匀；最后在两滴生理盐水中间划线水流断开，避免造成两滴生理盐水的水液来回流动。
所述制片方法还包括干燥固定，步骤如下：涂片完成后，采用电吹风把载玻片上的菌悬液水吹干，以达到干燥、固定效果。
所述吹干具体操作为：将载玻片持平，菌悬液面朝上，用电吹风从载玻片下方、垂直从下往上吹热风，直至水滴干掉为止，避免风直吹菌悬液。
所述制片方法可以运用于细菌简单染色、革兰氏染色、细菌芽孢染色与鞭毛染色。
以下结合具体实施例对本发明作进一步地说明。
下述实施例中所使用的染色实验方法步骤，如无特殊说明，均为常规传统方法步骤；所使用的材料、染色试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径采购得到。
实施例
实验染色所涉及菌种：培养18-24h的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、屎肠球菌与培养48h的啤酒酵母菌。
传统的革兰氏染色法操作的步骤为：取干净载玻片，滴一小滴生理盐水，挑取菌于水滴中作涂片（注意涂片且不可过于浓厚），于室温中自然干燥，通过火焰1-2次进行固定。
采用本发明制片方法的染色法操作的步骤为：在涂片步骤中，取干净玻片，在相邻两处分别滴加一滴无菌水，以无菌操作用接种环挑取少量某株细菌，放入其中一滴无菌水中，涂抹均匀；然后用接种环划线引流至另一滴无菌水，使菌体从第一滴无菌水进入第二滴无菌水，使菌体稀释并分散均匀；再用电吹风从下至上把玻片上的菌悬液水滴吹干，以达到干燥、固定效果，其余操作与传统革兰氏染色法一致。
比较各菌株镜检的菌体分散性、结果正确性，具体见下表1和图1-2。
表1 本发明与传统的革兰氏染色法结果比较
备注：1. “良好”指菌分布均匀为单个菌体；“较好”为菌分布大部分为单个菌体；“不好”指菌分布少有单个菌体。
2. “假阴性”系在革兰氏染色结果观察判断时，在显微镜下本来是紫色（革兰氏阳性菌）而呈现出红色（革兰氏阴性菌）；“假阳性”即在显微镜下本来是红色（革兰氏阴性菌）而呈现出紫色（革兰氏阳性菌）。
图1为枯草芽孢杆菌的染色法镜检图（放大倍数10*100），图1中A是采用传统方法制片的镜检图，从图中可看出菌叠加成片，少有单个菌体；图1中的B采用的是本发明制片方法的镜检图，从图中可以看出菌分布均匀，均为单个菌体，基本无菌体重叠现象。
图2啤酒酵母菌的染色法镜检图（放大倍数10*100），图2中A是采用传统方法制片的镜检图，从图中可以看出菌密集成片；图2中B采用的是本发明制片方法的镜检图，从图中科院看出菌均匀分散为单个菌体。
由上述结果对比可知，采用传统方法对菌种进行染色，一般会挑取菌量过多，尤其是新手，而导致出现菌体分散不均匀，菌体重叠现象，往往会出现假阳性。传统方法采用酒精灯加热固定，固定过度，往往会出现假阴性。而本发明改进后的革兰氏染色法操作能达到使菌体分散均匀，易于染色观察，且可节省时间，避免固定过度，因此具有操作简单，结果准确性高的优势。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (4)
1.一种细菌染色法的制片方法，其特征在于：所述制片方法包括涂片，步骤如下：取干净载玻片，在相近两处分别滴加一滴无菌生理盐水，以无菌操作用接种环挑取少量植株细菌于其中一滴生理盐水中；然后用接种环划线引流至另一滴生理盐水，使菌体从第一滴生理盐水自由进入第二滴生理盐水，使菌体稀释，进而自由分散均匀；最后在两滴生理盐水中间划线水流断开，避免造成两滴生理盐水的水液来回流动。
2.根据权利要求1所述的一种细菌染色法的制片方法，其特征在于：所述制片方法还包括干燥固定，步骤如下：涂片完成后，采用电吹风把载玻片上的菌悬液水吹干，以达到干燥、固定效果。
3.根据权利要求2所述的一种细菌染色法的制片方法，其特征在于：所述吹干具体操作为：将载玻片持平，菌悬液面朝上，用电吹风从载玻片下方、垂直从下往上吹热风，直至水滴干掉为止，避免风直吹菌悬液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种细菌染色法的制片方法，其特征在于：所述制片方法可以运用于细菌简单染色、革兰氏染色、细菌芽孢染色与鞭毛染色。
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