CN112945680A - 一种无苯酚的抗酸性菌染色液及其染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学检测技术领域，公开了一种无苯酚的抗酸性菌染色液及其染色方法。所述抗酸性菌染色液主要由初染液、脱色液和复染液组成；所述初染液包括以下组分：碱性品红染料、乙醇、芳香醇、表面活性剂和水。本发明通过用芳香醇取代苯酚，可避免因染色液中含有苯酚而对人体和环境所造成的危害问题，并且其染色效果不逊色于常规的含苯酚的抗酸性菌染色液。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，尤其涉及一种无苯酚的抗酸性菌染色液及其染色方法。
背景技术
抗酸杆菌又名分枝杆菌，是一类细长的杆菌，因繁殖时有分枝生长趋势而得名。抗酸杆菌的菌体表面有一层类脂或脂质的皮膜而不易着色，但一经着色后，就连酸性的酒精溶液也不易将其脱色。例如常见的结核分枝杆菌就是分枝杆菌的一种，当其感染肺部时会引发肺结核病，会给人们的健康带来极大威胁。因此，临床上可靠的抗酸杆菌鉴定方法对疾病的诊断具有重要意义。
目前世界卫生组织(WHO)推荐的抗酸性菌染色的标准方法有两种，一种是碱性复红法，又称热染法；另一种是荧光染料法，包括金胺O法和金胺O-罗丹明B法，但荧光染料法会受到荧光设备和技术的限制，因而热染法仍是当前涂片染色的首选方法。
热染法主要由初染液(碱性复红染液)、脱色液(酸性酒精溶液)和复染液(亚甲蓝染液)组成，其中碱性复红染液里含有苯酚，苯酚在染液中不仅起到杀菌的作用，还起到了渗透剂和助染剂的作用，是促进碱性复红进入菌体并使染料在菌体内而不易被酸性酒精脱色的关键成分。当加入碱性复红染液并通过加热促染后，碱性复红染料-抗酸菌体就形成了一个牢固的复合物，呈现红色，再用酸性酒精溶液对其进行脱色，除抗酸性菌体以外其他细菌和组织细胞以及背景就会被脱至无色或淡色，最后用亚甲蓝染液进行复染，其他细菌和组织细胞以及背景就会被染上亚甲蓝的蓝色，红色的抗酸菌和蓝色的背景形成了鲜明的对比，以此用来鉴别抗酸性菌。
而苯酚(又名石炭酸、羟基苯)是一种最简单的酚类有机物，呈弱酸，常温下为一种无色晶体，有毒，对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可致人体灼伤，吸入可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。对环境有严重危害，可对水体和大气可造成污染。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，苯酚在3类致癌物清单中。
基于以上原因，本领域人士迫切希望开发一种无苯酚添加，具有毒性小和染色效果良好特点的抗酸性菌染色液。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种无苯酚的抗酸性菌染色液及其染色方法，通过用芳香醇取代苯酚，可避免因染色液中含有苯酚而对人体和环境所造成的危害问题，并且其染色效果不逊色于常规的含苯酚的抗酸性菌染色液。
一种无苯酚的抗酸性菌染色液，主要由初染液、脱色液和复染液组成；所述初染液包括以下组分：碱性品红染料、乙醇、芳香醇、表面活性剂和水。
众所周知，苯酚属于酚类化合物，其官能团为酚羟基，该羟基与苯环直接相连，苯酚表现为弱酸性；而芳香醇中的羟基为醇羟基，该羟基与苯环侧链碳原子相连，不呈酸性。因此苯酚和芳香醇虽然在结构上有所类似，但其化学性质存在较大差别，两者不可等同替换，在现有技术中也并无将芳香醇取代苯酚应用于染色液中的先例。
而本发明创造性的发现：当在抗酸性菌染色液中采用芳香醇替代苯酚，使所制得的碱性复红染液可起到同样的杀菌和助染作用，其染色效果等同于含苯酚的碱性复红染液。同时，相比于会对人体和环境造成严重危害的苯酚，芳香醇的毒性明显更小，消除了传统染液对人体的毒害因素和致癌性，还大大降低了染液对环境和水体的危害。
优选的，按重量百分数计，所述初染液包括以下组分：碱性品红染料1-3％，乙醇25-35％，芳香醇3-13％，表面活性剂1.5-7.5％，余量为蒸馏水。
优选的，所述表面活性剂为非离子表面活性剂。所述非离子表面活性剂选自Tergitol-TMN-3、Tergitol-TMN-6或Tergitol-TMN-10。
优选的，所述芳香醇选自苯甲醇、苯乙醇中的至少一种。
优选的，所述脱色液为酸性酒精溶液，按重量百分数计，所述酸性酒精溶液包括以下组分：盐酸3-6％，乙醇94-97％。
优选的，所述复染液为亚甲蓝染液，按重量百分数计，所述亚甲蓝染液包括以下组分：亚甲蓝染料0.03-0.08％，乙醇8-15％，余量为蒸馏水。
一种抗酸性菌的染色方法，采用上述抗酸性菌染色液进行染色，包括以下步骤：
(1)将待测菌涂布至玻片上，自然干燥后进行加热固定，在玻片上滴加初染液并加热以进行初染，以初染液覆盖或淹没全部待测菌为准；
(2)用流水冲去玻片上的初染液后，在玻片上滴加脱色液进行脱色，脱色至待测菌无可视颜色为止；
(3)用流水冲去玻片上的脱色液后，在玻片上滴加复染液进行复染；
(4)用流水冲去玻片上的复染液后，在显微镜下进行观察。
显微镜下观察的结果为：除抗酸性菌呈红色外，其他细菌、组织细胞及背景均呈蓝色。
优选的，步骤(1)中在玻片上滴加初染液后，通过加热至玻片上出现蒸气，保持染色5-10min。
优选的，步骤(3)中复染的时间为30-60s。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明在抗酸性菌染色液中采用芳香醇以替代苯酚，使所制得的碱性复红染液可起到同样的杀菌和渗透作用，其染色效果等同于含苯酚的碱性复红染液。同时，相比于会对人体和环境造成严重危害的苯酚，芳香醇的毒性明显更小，消除了传统含苯酚的抗酸性菌染色液对人体的毒害因素和致癌性，还大大降低了染液对环境和水体的危害。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种无苯酚的抗酸性菌染色液，主要由初染液、脱色液和复染液组成，其中：
初染液(以重量百分数计)：碱性品红染料2％，乙醇25％，苯甲醇5％，非离子表面活性剂Tergitol-TMN-3 3％，余量为蒸馏水；
脱色液(以重量百分数计)：盐酸5％，乙醇95％；
复染液(以重量百分数计)：亚甲蓝染料0.06％，乙醇10％，余量为蒸馏水。
实施例2
本实施例提供一种无苯酚的抗酸性菌染色液，主要由初染液、脱色液和复染液组成，其中：
初染液(以重量百分数计)：碱性品红染料3％，乙醇35％，苯乙醇13％，非离子表面活性剂Tergitol-TMN-6 7％，余量为蒸馏水；
脱色液(以重量百分数计)：盐酸4％，乙醇96％；
复染液(以重量百分数计)：亚甲蓝染料0.05％，乙醇12％，余量为蒸馏水。
实施例3
本实施例提供一种抗酸性菌的染色方法，采用实施例1或实施例2中抗酸性菌染色液进行染色，包括以下步骤：
(1)将待测菌涂布至玻片上，自然干燥后，置于染色架上，玻片间距保持10mm以上的距离；进行加热固定(5秒内将玻片来回过火焰4次)，在玻片上滴加初染液进行初染(通过加热至玻片上出现蒸气，保持染色5-10min)，以初染液覆盖或淹没全部待测菌为准；
(2)用流水自玻片一端轻缓进行冲洗，冲去玻片上的初染液后，沥干，在玻片上滴加脱色液进行脱色，脱色1-2min；若脱色不彻底，则需用流水洗去脱色液后，再次进行脱色步骤，直至待测菌无可视颜色为止；
(3)用流水自玻片一端轻缓进行冲洗10-20s，冲去玻片上的脱色液后，沥干，在玻片上滴加复染液进行复染，复染时间30-60s；
(4)用流水自玻片一端轻缓进行冲洗，冲去玻片上的复染液后，在显微镜下进行观察。
显微镜下观察的结果为：除抗酸性菌呈红色外，其他细菌、组织细胞及背景均呈蓝色。
产品效果测试
1.苯酚与芳香醇毒性的比较
以芳香醇中的苯甲醇为例，与苯酚的毒性进行比较，结果如表1所示：
表1苯酚和苯甲醇的毒性对比
由表1可知，苯酚是一种高毒性、腐蚀性、致癌性的有机化合物，会对人体及环境造成较大危害；当以苯酚作为抗酸性菌染色液的组成成分时，在抗酸性菌染色液的使用过程中，不可避免地会吸入苯酚蒸气，特别是加热之后产生的气溶胶，危害人体健康。而苯甲醇只是一种低毒的有机化合物，可用于香料、医药原料和圆珠笔油，这些都是人们日常可能接触到的物质，表明其安全性是得到充分验证的，不会对人体和环境造成明显不良影响。因此本发明将芳香醇作为抗酸性菌染色液中苯酚的替代物，大大降低了传统含苯酚的抗酸性菌染色液对人体的毒害因素和致癌性，还大大降低了染液对环境和水体的危害。
2.染色效果测试
可行性测试
分别选取一株金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和一株大肠埃希氏杆菌(ATCC25922)，采用本发明实施例3中的染色方法进行涂片染色，结果表明两株细菌均呈抗酸阴性，证明了本发明中抗酸性菌染色液的染色结果不会产生假阳性。
再取一株偶发分枝杆菌(ATCC 6841)，采用同样的方法进行涂片染色，结果显示该菌呈阳性。
以上结果表明采用本发明中抗酸性菌染色液进行染色，的确能用于抗酸性菌的染色和检测鉴定，证实了其可行性。
检出率测试
通过与中国疾病控制中心结核病预防控制中心国家结核病参比实验室合作，选取其实验室内的200份肺结核及疑似肺结核患者的痰标本，分别使用传统的抗酸染液(热染法)和本发明实施例3中的染色方法进行染色，对比两种染液在相同显微镜倍数下对抗酸性菌的检出率。其中检出标准如下所示：
抗酸菌阴性(—)：连续观察300个不同视野，未发现抗酸菌；
报告抗酸菌菌数(＜1+)：1-8条/300视野；
抗酸菌阳性(1+)：3-9条/100视野，连续观察300个视野；
抗酸菌阳性(2+)：1-9条/10视野，连续观察100个视野；
抗酸菌阳性(3+)：1-9条/每视野；
抗酸菌阳性(4+)：≥10条/每视野。
使用传统的抗酸染液(热染法)的检测结果为：检出阳性98例，阳性率为49％，其中(＜1+)、(1+)、(2+)、(3+)、(4+)阳性率分别占10.5％、10％、17％、6.5％、5％。
使用本发明实施例3中的染色方法进行染色的检测结果为：检出阳性95例，阳性率为47.5％，其中(＜1+)、(1+)、(2+)、(3+)、(4+)阳性率分别占11.5％、9.5％、15％、6.5％、5％。
上述结果显示：本发明所采用抗酸性菌染色液的染色效果基本等同于含苯酚的常规染液，同样具有良好的检出效果，并无显著性差别。
Claims (9)
1.一种抗酸性菌染色液，其特征在于，主要由初染液、脱色液和复染液组成；所述初染液包括以下组分：碱性品红染料、乙醇、芳香醇、表面活性剂和水。
2.根据权利要求1所述的抗酸性菌染色液，其特征在于，按重量百分数计，所述初染液包括以下组分：碱性品红染料1-3％，乙醇25-35％，芳香醇3-13％，表面活性剂1.5-7.5％，余量为蒸馏水。
3.根据权利要求1或2所述的抗酸性菌染色液，其特征在于，所述表面活性剂为非离子表面活性剂。
4.根据权利要求1或2所述的抗酸性菌染色液，其特征在于，所述芳香醇选自苯甲醇、苯乙醇中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的抗酸性菌染色液，其特征在于，所述脱色液为酸性酒精溶液，按重量百分数计，所述酸性酒精溶液包括以下组分：盐酸3-6％，乙醇94-97％。
6.根据权利要求1所述的抗酸性菌染色液，其特征在于，所述复染液为亚甲蓝染液，按重量百分数计，所述亚甲蓝染液包括以下组分：亚甲蓝染料0.03-0.08％，乙醇8-15％，余量为蒸馏水。
7.一种抗酸性菌的染色方法，其特征在于，采用权利要求1-6中任一项所述的抗酸性菌染色液进行染色，包括以下步骤：
(1)将待测菌涂布至玻片上，自然干燥后进行加热固定，在玻片上滴加初染液并加热以进行初染，以初染液覆盖或淹没全部待测菌为准；
(2)用流水冲去玻片上的初染液后，在玻片上滴加脱色液进行脱色，脱色至待测菌无可视颜色为止；
(3)用流水冲去玻片上的脱色液后，在玻片上滴加复染液进行复染；
(4)用流水冲去玻片上的复染液后，在显微镜下进行观察。
8.根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于，步骤(1)中在玻片上滴加初染液后，通过加热至玻片上出现蒸气，保持染色5-10min。
9.根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于，步骤(3)中复染的时间为30-60s。
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